en zimas 2005

ENZIMAS

Engª. Química Gisanara DorsEstágio de Docência

2

ENZIMAS - HISTÓRICO

Catálise biológica início séc. XIX digestão da carne: estômago; digestão do amido: saliva.

Década de 50 Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do

açúcar em álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” = enzimas.

Eduard Buchner (1897) extratos de levedo podiam fermentar o açúcar

até álcool; enzimas funcionavam mesmo quando removidas

da célula viva.

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ENZIMAS - HISTÓRICO

James Sumner (1926) Isolou e cristalizou a urease; Cristais eram de proteínas; Postulou que “todas as enzimas são proteínas”.

John Northrop (década 30) Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas;

Década de 50 – séc. XX 75 enzimas isoladas e cristalizadas; Ficou evidenciado caráter protéico.

Atualmente + 2000 enzimas são conhecidas.

4

ENZIMAS

Definição:Catalisadores biológicos;Longas cadeias de pequenas moléculas

chamadas aminoácidos.Função:Viabilizar a atividade das células, quebrando

moléculas ou juntando-as para formar novos compostos.

Com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA com propriedades catalíticas, chamadas de RIBOZIMAS, todas as enzimas são PROTEÍNAS.

Aminoácidos:

H

R C* COOH

NH2

5

ENZIMAS – PROTEÍNA

Classificação proteínas

Proteínas globulares Proteínas fibrosas Estrutura das proteínas

Primaria Secundaria Terciária Quaternária

ENZIMAS

Proteínas globulares

Estrutura terciária

Proteínas com alto peso molecular, maioria entre 15 a 1000 Kilo Daltons Unit (KD)OBS: 1 Dalton = 1 unidade de peso molecular (AMU)

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ENZIMAS – ESTRUTURA

RNARNA

Estrutura Estrutura EnzimáticaEnzimática

RibozimasRibozimas

Se covalente

Apoenzima ouApoproteína

Grupo Prostético

Holoenzima

Cofator

Coenzima

Proteína

Pode ser:• íon inorgânico• molécula orgânica

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ENZIMAS – CARACTERÍSTICAS GERAIS

Apresentam alto grau de especificidade;São produtos naturais biológicos;Reações baratas e seguras;São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida);São econômicas, reduzindo a energia de ativação;Não são tóxicas;Condições favoráveis de pH, temperatura, polaridade do solvente e força iônica.

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ENZIMAS

Comparação das enzimas com catalisadores químicos.Característica Enzimas Catalisadores Químicos

Especificidade ao substrato alta baixa

Natureza da estrutura complexa simples

Sensibilidade à T e pH alta baixa

Condições de reação (T, P e pH) suaves drástica (geralmente)

Custo de obtenção (isolamento e purificação) alto moderado

Natureza do processo batelada contínuo

Consumo de energia baixo alto

Formação de subprodutos baixa alta

Separação catalisador/ produtos difícil/cara simples

Atividade Catalítica (temperatura ambiente) alta baixa

Presença de cofatores sim não

Estabilidade do preparado baixa alta

Energia de Ativação baixa alta

Velocidade de reação alta baixa

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ENZIMAS – NOMENCLATURA

Século XIX - poucas enzimas identificadas - Adição do sufixo ”ASE” ao nome do substrato:

* gorduras (lipo - grego) – LIPASE* amido (amylon - grego) – AMILASE

- Nomes arbitrários:* Tripsina e pepsina – proteases

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1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) nomear e classificar.

Cada enzima código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada:

1° dígito - classe2° dígito - subclasse3° dígito - sub-subclasse4° dígito - indica o substrato

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ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO

1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons) 1.1.atuando em CH-OH 1.2.atuando em C=O 1.3.atuando em C=O- 1.4.atuando em CH-NH2

1.5.atuando em CH-NH- 1.6.atuando em NADH, NADPH

2.Transferases (transferem grupos funcionais entre moléculas) 2.1.grupos com um carbono 2.2.grupos aldeído ou cetona 2.3.grupos acil 2.4.grupos glicosil 2.7.grupos fosfatos 2.8.grupos contendo enxofre

3.Hidrolases (reações de hidrólise) 3.1.ésteres 3.2.ligações glicosídicas 3.4.ligações peptídicas 3.5.outras ligações C-N 3.6.anidridos ácidos

Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.

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4.Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico) 4.1. =C=C= 4.2. =C=O 4.3. =C=N-

5.Isomerases (transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros)

5.1.racemases

6.Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré-existentes, sempre às custas de energia) 6.1. C-O 6.2. C-S 6.3. C-N 6.4. C-C

Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.

13


Subclasses

Exemplos deSubclasses

Tipo de reação catalisada Classe

Hidratases Adicionam H2O à ligas duplas LiasesQuinases Transferem fosforilas do ATP TransferaseMutases Movem fosforilas dentro da

mesma moléculaIsomerase

Sintases Síntese independente de ATP TransferasesSintetases Síntese dependente de ATP Ligases

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ADP + D-Glicose-6-fosfatoATP + D-Glicose

IUB - ATP:glicose fosfotransferase

E.C. 2.7.1.1E.C. 2.7.1.122 - - classe - Transferase7 - subclasse - Fosfotransferases 1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila como receptor1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato

Nome trivial: HexoquinaseNome trivial: Hexoquinase

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ENZIMAS – CATALISADORES

Aceleram reações químicas

Ex: Decomposição do H2O2

Condições da Reação Energia livre de AtivaçãoKJ/mol Kcal/mol

VelocidadeRelativa

Sem catalisador

Platina

Enzima Catalase

75,2 18,0

48,9 11,7

23,0 5,5

1

2,77 x 104

6,51 x 108

H2O2 H2O O2+Catalase

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Não são consumidos na reação

H2O2 H2O O2+Catalase

E E ++ SS EE ++ PP

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Atuam em pequenas concentrações

1 molécula de Catalase decompõe

5 000 000 de moléculas de H2O2

pH = 6,8 em 1 min

Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo.

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Não alteram o estado de equilíbrio•Abaixam a energia de ativação;•Keq não é afetado pela enzima.

Não apresenta efeito termodinâmico global G não é afetada pela enzima.

Diferença entrea energia livre

de S e P

Caminho da Reação

Energia de ativação com enzima

En

erg

ia

Energia de ativação sem enzima

SSPP

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ENZIMAS – COMPONENTES DA REAÇÃO

EE ++ SS EE SS P P + + EE

Substrato se liga ao SÍTIO ATIVOda enzima

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ENZIMAS – SÍTIO ATIVO

Região da molécula enzimática que participa da reação com o substrato.

Pode possuir componentes não protéicos:cofatores.Possui aminoácidos auxiliares e de contato.

HOLOENZIMA

Porção protéicaAPOENZIMA

Grupamento Grupamento prostéticoprostético

Ativador:Íons inorgânicos que condicionam a ação catalítica das enzimas. Fe²+CofatorCofator

Coenzima: molécula orgânica complexa.NAD+

HOLOENZIMA

Porção protéicaAPOENZIMA

Grupamento prostético

Ativador:Íons inorgânicos que condicionam a ação catalítica das enzimas. Fe²+Cofator

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ENZIMAS – COFATOR

Algumas enzimas que contêm ou necessitam de elementos inorgânicos como cofatores

ENZIMA COFATOR

PEROXIDASE Fe+2 ou Fe+3

CATALASE

CITOCROMO OXIDASE Cu+2

ÁLCOOL DESIDROGENASE Zn+2

HEXOQUINASE Mg+2

UREASE Ni+2

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ENZIMAS – COENZIMAS

Coenzima Abreviatura Reaçãocatalisada

Origem

Nicotinamida adeninadinucleotídio

NAD+ Oxi-redução Niacina ouVitamina B3

Nicotinamida adeninadinucleotídio fosfato

NADP+ Oxi-redução Niacina ouVitamina B3

Flavina adeninadinucleotídio

FAD Oxi-redução Riboflavina ouVitamina B2

Maioria deriva de vitaminas hidrossolúveis Classificam-se em:

- transportadoras de hidrogênio

- transportadoras de grupos químicos Transportadoras de hidrogênio

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ENZIMAS – COENZIMAS

Coenzima Abrev. Reação catalisada Origem Coenzima A CoA-SH Transferência de

grupo acil Pantotenato ou Vitamina B5

Biotina Transferência de CO2

Biotina ou Vitamina H

Piridoxal fosfato PyF Transferência de grupo amino

Piridoxina ou Vitamina B6

Metilcobalamina Transferência de unidades de carbono

Cobalamina ou Vitamina B12

Tetrahidrofolato THF Transferência de unidades de carbono

Ácido fólico

Tiamina pirofosfato

TPP Transferência de grupo aldeído

Tiamina ou Vitamina B1

Transportadoras de grupos químicos

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ENZIMAS – LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO

Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou Chave-Fechadura , que considera que a enzima possui sitio ativo complementar ao substrato.

25

ENZIMAS – LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO

Koshland (1958): Encaixe Induzido ,, enzima e o o substrato sofrem conformação para o encaixe. O substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição.

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ENZIMAS – ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Enzyme Commission: “uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micro mol de substrato ou a formação de 1 micro mol de produto por minuto”.

Expressa: U = micro moles produto/minuto Atividade específica = U/mg de proteína

Enzima pura, condições que permita a velocidade da reação seja máxima o substrato [S] de modo a permitir que toda a enzima [E] [ES].

V = K[E] = K[ES]

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ENZIMAS – ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Fatores que alteram a velocidade de reações enzimáticas:

- pH;- temperatura;- concentração das enzimas;- concentração dos substratos;- presença de inibidores.

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ENZIMAS – INFLUÊNCIA DO PH

O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. Enzimas grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização.

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ENZIMAS – INFLUÊNCIA DO PH

A estabilidade de uma enzima ao pH depende: - temperatura; - força iônica; - natureza química do tampão; - concentração de íons metálicos contaminantes; - concentração de substratos ou cofatores da enzima; - concentração da enzima.

ENZIMA pH ÓTIMO

Pepsina 1,5

Tripsina 7,7

Catalasa 7,6

Arginasa 9,7

Fumarasa 7,8

30

ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA

temperatura dois efeitos ocorrem:(a) a taxa de reação aumenta, como se observa na

maioria das reações químicas;(b) a estabilidade da proteína decresce devido a

desativação térmica.

Enzima temperatura ótima para que atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade cte. por um período de tempo.

31


O efeito da temperatura depende:- pH e a força iônica do meio;- a presença ou ausência de ligantes.

Acima desta temperatura, o velocidade de reação devido a temperatura é compensado pela perda de atividade catalítica devido a desnaturação térmica.

ENZIMA TEMPERATURA ÓTIMA (°C)

Pepsina 31,6

Tripsina 25,5

Urease 20,8

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Ea Lei de Arrehenius

ATRT

Eak

Aek RTEa

log1

3,2log

/

Ea pode ser determinada medindo-se a cte de velocidade da reação em ≠ temperaturas.

Curva A: gráfico usual.

Curva B: o gráfico mostra uma variação definida na inclinação, se em determinada temperatura, uma etapa ≠ se torna limitante da velocidade.

Curva C: uma queda brusca na curva indica inativação enzimática.

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ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA [E]

Velocidade de transformação do S em P qtidade de E.

Desvios da linearidade ocorrem:- Presença de inibidores na solução de enzima;- Presença de substâncias tóxicas;- Presença de um ativador que dissocia a

enzima;- Limitações impostas pelo método de análise.

Recomenda-se:- Enzimas com alto grau de pureza;- Substratos puros;- Métodos de análise confiável.

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ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA [S]

[S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P.

Medir Vo = velocidade inicial da reação.

vo

[S]

Vmax

[E] = cte.[S] pequenas Vo linearmente.[S] maiores Vo por incrementos cada vez menores.Vmax [S] Vo insignificantes.Vmax é atingida E estiverem na forma ES e a [E] livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não com de [S].

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ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA

Victor Henri (1903): E E ++ S S ES ES

1913 1913 Leonor Michaelis -EnzimologistaLeonor Michaelis -EnzimologistaMaud Menten - PediatraMaud Menten - Pediatra

E + SK1

K-1

ESKp

E + P

Etapa rápida Etapa lenta

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Cinética Enzimática

Determinar as constantes de afinidade do S e

dos inibidores;

Conhecer as condições ótimas da catálise;

Ajuda a elucidar os mecanismos de reação;

Determinar a função de uma determinada

enzima em uma rota metabólica.

37


v =Vmax [S]

Km + [S]Km + [S]

[S]

v

Vmax

2

v = Vmax

v = Vmax [S]Km

Km

11

22

33

1- [S] Km>>[S]

2- [S] [S]>>Km

3- v = Vmax

2

38


Afinidade da enzima ao substrato. Km depende:

aspectos específicos do mecanismo de reação; n° de passos da reação; velocidades relativas dos passos individuais.

ENZIMA SUBSTRATO Km (mM)

Catalase H2O2 25

Hexoquinase ATP 0,4

D-Glicose 0,05

D-Frutose 1,5

Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108

N-benzoiltirosinamida 2,5

39


Vmax:

EE + + SSK1

KK-1EESS

Kp EE + + PP Vmax = Kp[Et]

EE + + PPEE + + SSK1

KK-1

EESSK2

EEPPK3

K-2

Vmax = K3[Et]

VVmaxmax [E] [E]

VVmaxmax [2E] [2E]VV

[S][S]

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Enzimas – ordem da reação

Quando a formação de P for proporcional à [S] a velocidade da reação

é de 1a ORDEM

Quando a velocidade da reação independe da [S] a reação é de

ORDEM ZERO

V

[S]

[S] [S] <<Km

v = Vmax

v = Vmax [S] Km

v = K[S]

[S] [S]>>Km

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ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS

maxV

1

[S]maxVmK

v

1

Gráfico dos Recíprocos de Lineweaver-Burk

1[S]

1 v

-1Km

11VVmaxmax

Km

VmaxInclinação =

42


Gráfico de Eadie-Hofstee

[S]

vm

Kmax

Vv

Vmax

Km

v -KmInclinação =

v[S]

Vmax

43


Gráfico de Hanes-Woolf

[S]

[S] v

-Km

KKmm

VVmaxmax

1Vmax

Inclinação =

[S]max

V

1

maxV

mK

v

[S]

44


Gráfico da equação integrada de Michaelis-Menten

Vmax

Km

-1/KmInclinação =

([S]o-[S])t

Vmax

2,3log[S]o

t [S]

t[S])([S]

K1

KV

[S][S]

logt

2,3 o

mm

maxo

45

ENZIMAS – INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.

INIBIDORES

REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS

COMPETITIVOS NÃO COMPETITIVOS INCOMPETITIVOS

46

ENZIMAS – INIBIÇÃO COMPETITIVA

Inibidor competitivo concorre com o S pelo sitio ativo da E livre.

I análogo não metabolizável, derivado de um S verdadeiro, S substituto da E ou um P da reação.

[substrato] necessária para obter a mesma [ES]

afinidade da enzima pelo substrato

I compostos com estrutura molecular lembra S

Km aparente da enzima

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EE + + SS EESS EE + + PP

EEII

I I

+

+

K1

KI

K2

][

1)][

1(11

][)][

1(

][

][

]][[

maxmax

max

SK

I

V

K

Vv

SKI

K

SVv

EI

IEK

I

m

Im

I

Michaelis-Menten

Lineweaver-Burk

48


1- sem inibidor

2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

49

ENZIMAS – INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA

Inibidor não-competitivo se liga reversivelmente, aleatória e independentemente em um sítio que lhe é próprio.

I não tem semelhança estrutural com o S

[substrato] não diminui a

inibição

Km da enzima NÃO se altera

Vmax na presença do inibidor

50



EEII + + SS EEIISS

++II

++II

KS

KI

K2

KI

KS

)][

1(1

][

1)][

1(1

)][

1]([)][

1

][

][

]][[

][

]][[

maxmax

max

II

m

IIm

I

K

I

VSK

I

V

K

v

KI

SKI

K

SVv

EIS

IES

EI

IEK

Lineweaver-Burk

Michaelis-Menten

51


1- sem inibidor


52

ENZIMAS – INIBIÇÃO INCOMPETITIVA

Inibidor incompetitivo se liga reversivelmente, em um sítio próprio, ao complexo ES.

I não tem semelhança estrutural com o S

I favorece a formação do ES

Km e Vmax da enzima

53



EEIISS

++II

KSK2

KI

)][

1(1

][

11

][][

1

][][

1

][

]][[

maxmax

max

I

m

I

m

i

I

K

I

VSV

K

v

S

KI

K

S

KI

V

v

EIS

IESK

Lineweaver-Burk

Michaelis-Menten

54


1- sem inibidor.


55

ENZIMAS – INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL

I se combina com um grupo funcional, na molécula da E, que é essencial para sua atividade. Podem promover a destruição do grupo funcional Forma-se uma ligação COVALENTE entre o I e a E. Vmax parte da E é completamente removida do sistema e Km permanece a mesma.

K2

EE + + PPEE + + SS EESSK1

EEII

++II

56

ENZIMAS – INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL

Graficando Vmax vs a quantidade total de E adicionada ao meio de reação em presença de I.

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ENZIMAS – ENZIMAS REGULATÓRIAS

Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten. Controlam a etapa limitante em uma cadeia de reações enzimáticas. Tem sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais, moléculas sinalizadoras (pequenos metabólicos ou cofatores). Classes de enzimas reguladoras:

Enzimas alostéricas; Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível.

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Enzimas alostéricasFuncionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador chamado modulador;Moduladores podem ser inibidores ou ativadores;São maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas.

Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível

Grupos químicos são ligados covalentemente e removidos da enzima reguladora por enzimas ≠, podem ser: fosfato, adenosina monofosfato, grupos metil, etc.

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1- Comportamento tipo Michaelis-Menten.

2- Comportamento Alostérico.

60

Imobilizadas

Reutilização

Maior estabilidade (faixas mais amplas de pH e temperatura)

Menor interferência de inibidores e/ou ativadores

Livres

Instabilidade

Rápida perda da atividade catalítica

Não podem ser recuperadas

Enzimas Livres versus Enzimas Imobilizadas

ENZIMAS - IMOBILIZADAS

61


A enzima livre é imobilizada em um suporte inerte

como vidro poroso, bentonite, etc.

O principal interesse em imobilizar uma enzima é

obter um biocatalisador com atividade e

estabilidade que não sejam afetadas durante o

processo, em comparação à sua forma livre.

62


63


Vantagens da utilização de enzimas imobilizadas

- As enzimas podem ser reutilizadas

- Os processos químicos podem ser continuamente operados e prontamente controlados

- Os produtos podem ser facilmente separados

- Os problemas com elfuentes e manipulações de materiais são minimizados

- A reprodutibilidade do procedimento analítico pode ser aumentada

- Em alguns casos, as propriedades enzimáticas (atividade e estabilidade operacionais) podem ser alteradas

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Propriedades de Enzimas Imobilizadas

Efeitos sobre a atividade enzimática:

Modificação da estrutura tridimensional;

Modificação do microambiente;

Fenômenos de difusão no interior do complexo.

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Medida da atividade: Atividade da enzima imobilizada é mais fraca

que a das enzima nativa, mas a estabilidade é maior.

Influencia das condições operacionais: pH e temperatura desnaturação parcial ou

total da proteína; imobilizada resistem melhor a variações de pH

e tratamentos térmicos;

Obs: origem da enzima, suporte utilizado e método de fixação

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Aplicações de Enzimas Imobilizadas

Aplicações analíticas: Facilita automatização das cadeias de dosagem e

simplifica as manipulações. Biossensores:

Imobilização de colinesterase e anticorpos sobre cristal piezelétrico utilizadas na detecção de pesticidas organofosforados;

Reatores para análise cromatográfica; Kits para titulações e imunoensaios.

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Indústria de alimentos:

Glicose isomerase fixada para a produção de xaropes com alto teor de frutose;

Celulase Conversão de celulose em açúcares solúveis;

Imobilização de fermento de pão (Sacharomices cerevisae) álcoois enantiomericamente puros.

Uso Industrial: Fonte para produção de penicilinas sintéticas.

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Lipases imobilizadas:

Imobilizadas em organo-gel utilizadas na esterificação do ácido oléico com n-pentanol;

Imobilizadas em carvão de coco, bauxita e gel de ágar utilizadas na transformação de óleo de soja em biodisel.

Aplicações na medicina: Hidrogel contendo enzimas imobilizadas Substrato

presente - conversão enzimática - produto muda a conformação do hidrogel liberação da droga.

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Em desenvolvimento: Estudos de filtros que utilizam enzimas

imobilizadas na superfície do meio filtrante para o tratamento do ar dos ambientes.

Recentes avanços na imobilização de enzimas por argilas, utilizadas em bioremediação.

Estudos em desenvolvimento: imobilização, estabilização e aplicação da enzima esterase, de rim de porco, na síntese de produtos de interesse farmacêutico.

70

ENZIMAS – APLICAÇÕES

ENZIMA FONTE APLICAÇÃO

Papaína mamão Ajuda na digestão, Médica, bebidas, carnes

Bromelina abacaxi Ajuda na digestão, Médica, bebidas, carnes

Diastase malte Panificação, xarope

Pepsina mucosa gástricasuíno

Amaciamento de carne

Lipase Candida rugosa Tratamento de efluentes

Permitem às indústrias usarem processos mais econômicos, diminuindo o consumo de energia e recursos; mais confiáveis e que poluem menos. São eficientes; Muito específicas;Permite produção segura e ambientalmente amigável.

Origem vegetalOrigem animal Origem microbiana

71


Proteases

Leite: na preparação do leite de soja.

Carnes e Peixes: recuperação de proteínas do osso

ou espinha.

Vinhos: clarificação.

Queijo: coagulação da caseína.

72


Lactase

Sorvete: prevenção da cristalização da lactose.

Leite: estabilização das proteínas do leite em

leites congelados por remoção da lactose.

Hidrólise da lactose, permitindo o uso por

adultos deficientes na lactase intestinal e em

crianças com deficiência em lactase congênita.

Ração: conversão da galactose em lactose e

glicose.

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-amilase

Fermentados: conversão do amido a maltose por

fermentação. Remoção da turbidez do amido

Cereais: conversão do amido a dextrinas e

maltose.

Chocolate/cacau: liquefação do amido

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Peroxidase Deterioração - Frutas: contribui na reação de

escurecimento.

Polifenoloxidase

Chá/Café: desenvolvimento do escurecimento durante o amadurecimento e fermentação. Deterioração - Frutas e Vegetais: reação de escurecimento e perda de vitaminas.

75


Enzimas utilizadas em rações para aves.

Melhora a utilização de gorduras animais e vegetais Lipídios e ácidos graxos

Lipases

Remoção de Galactosídios Galactosídios Galactosidases

Melhora a utilização do fósforo dos vegetais. Remoção do ácido fítico.

Ácido fítico Fitase

Suplementação das enzimas endógenas. Degradação mais eficiente do amido.

Amido Amilases

Suplementação das enzimas endógenas. Degradação mais eficiente de proteínas.

Proteínas Proteases

Degradação da celulose e liberação de nutrientes Celulose Celulases

Redução da viscosidade da digesta. Pectinas Pectinases

Redução da viscosidade da digesta. Menor umidade na cama.

-glucanos Glucanases

Redução da viscosidade da digesta. Arabinoxilanas Xilanase

Efeitos Substrato Enzima

76


Tratamento de efluentes

Preocupação ambiental desencadeou uma

procura por outras alternativas, as chamadas

"tecnologias limpas“.

Enzimas substituir muitos componentes

químicos utilizados nos processos industriais atuais.

77


Enzimas utilizadas em tratamento de efluentes.

Enzima e fonte Poluentes e efluentes

Azorredutase (Pseudomonas luteola) Indústria de tinta

Catalase (Baccilus sp.) Remoção de H2O2 presente em efluentes de branqueamento de tecidos

-glicosidase e Manganês peroxidase Remoção de corantes azo na industria de alimentos e da industria têxtil

Polifosfatase e Fosfotransferase Remoção de fosfato biológico de efluentes

Protease pronase (Pseudomonas aeruginosa) Inativação de vírus bacteriófago Cox A9 de efluentes, para reutilização da água

Naftaleno-dioxigenase Remoção de naftaleno

Lipase (Penicillium P4) Remoção do teor de DQO de efluentes de óleo de oliva

(Candida rugosa) Redução do teor de lipídeos e DQO efluentes avícolas

(pâncreas de porco) Redução do teor de lipídeos e SS de efluentes da indústria de derivados lácteos

78


Industria de álcool;

Industria de detergentes;

Industria têxtil;

Industria de papel e celulose;

Curtumes;

Produção de ácido cítrico, ácido glutâmico, insulina, vacinas, esteroídes, vitaminas e antibióticos;

Bioremediação: de polímeros, de hidrocarbonetos e clorados.

79


Aplicação da Lipase no tratamento de águas residuárias com elevados teores de lipídeos

JUSTIFICATIVA

Efluentes com teores de gorduras e óleos e que utilizam o processo anaeróbio, a 1° etapa m.o. para degradar as gorduras é a produção de enzimas capazes de hidrolisar os triglicerídeos.

Etapa é lenta e nem sempre há m.o. específicos para a produção de lipase não consegue atingir bons resultados.

Gorduras se solidificam a baixas temperaturas: formação de uma camada gordurosa sobre as lagoas, caminhos preferenciais e arraste da biomassa.

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OBJETIVO

Viabilizar tecnicamente a aplicação de um pré-tratamento enzimático para remoção de gorduras, utilizando preparações de lipases pancreáticas fornecidas pelas empresas Kin Master (LKM) e Nuclear (LNU).

Caracterizar o efluente

Caracterizar as propriedades catalíticas das enzimas

Testar ≠ tempos de hidrolise na formação de ácidos graxos (2h, 4h, 8h, 12h e 24h)

Avaliar o impacto do tratamento enzimático por meio de testes de biodegradabilidade expressa pela formação de metano, DQO e atividade metanogênica.

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MATERIAIS E MÉTODOS

Determinação da Atividade Hidrolítica

Substrato:Controle = azeite de oliva Efluente = efluente de indústria de produtos avícolas

Tampão e solução enzimática (5mg/mL). Branco

Incubados em banho-maria sob agitação

Solução de etanol:acetona – parar a reação

Ácidos graxos liberados titulados com KOH (0,02M) e indicador fenolftaleína

t.m).M.10V(V

U6

ba (moles/mg.min)

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RESULTADOS

Influência do pH na atividade hidrolítica das lipases LNU e LKM

350

850

1350

1850

2350

2850

3350

3850

4350

5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5pH

Ati

vid

ade

(U)

100

120

140

160

180

200

220

240LNU - Controle

LNU - Efluente

83



50

550

1050

1550

2050

2550

3050

5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5pH

Ati

vid

ad

e (

U)

50

150

250

350

450

550LKM - Controle

LKM - Efluente

RESULTADOS

84


RESULTADOS


0

100

200

300

400

500

600

700

5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5pH

Ati

vid

ad

e (

U)

130

145

160

175

190

205

220

235LKM - Efluente

LNU - Efluente

85


RESULTADOS

750

1250

1750

2250

2750

3250

3750

25 31 37 43 49 55 61

Temperatura (°C)

Ati

vid

ad

e (

U)

210

260

310

360

410

460

510

560

610LNU - Controle

LNU - Efluente

Influência da Temperatura na atividade hidrolítica das lipases LNU e LKM

86



1000

1500

2000

2500

3000

25 30 35 40 45 50 55 60 65

Temperatura (°C)

Ati

vid

ad

e (

U)

250

300

350

400

450

500

550

600LKM - Controle

LKM - Efluente

RESULTADOS

87



200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

25 30 35 40 45 50 55 60 65Temperatura (°C)

Ati

vid

ad

e (

U)

250

300

350

400

450

500

550

600

LNU - Efluente

LKM - Efluente

RESULTADOS

88


RESULTADOS

10 20 30 40 50 60300

400

500

600

700

800

900

Lipase Pancreatina (LKM)

Lipase Pancreatina (LNU)

A

tivid

ad

e (

U)

concentração (%)

Influência da concentração de substrato na atividade hidrolítica das lipase LKM e LNU

en zimas 2005

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