Emissão de luz

•Luminescência•Fluorescência

•Fosforescência

•Quimioluminescência

•Bioluminescência

Luminescência é o termo que se usa quando a energia da excitação provém da absorção de fótons. Inclui a Fluorescência e a Fosforescência.

Quimiluminescência é um termo geral para produção de luz quando a energia de excitação é proveniente de uma reação química.

Bioluminescência é a denominação de um fenômeno de  quimiluminescência onde a reação química é realizada em um organismo, como o vaga-lume por exemplo.

Quimioluminescência

A fluorescência é uma forma de fotoluminescência em que a emissão de luz desaparece tão logo cessa a absorção da radiação excitadora. (O tempo de vida de uma fluorescência é da ordem de 10-8 s).

Fosforescência é semelhante a fluorescência sendo que o produto excitado é mais estável, de forma a demorar mais tempo (de um microsegundo até minutos) até que a energia seja liberada totalmente. Esse fenômeno está relacionado com o fato dos interruptores de tomada em sua casa brilharem no escuro. Em seu polímero, são colocados pigmentos de fósforo, um elemento que possui propriedades fosforescentes. Não é por nada que o nome "fósforo", elemento químico de número atômico 15, vem do grego, phosphoros, que significa "aquele que brilha", ou "o que conduz, traz a luz".

Absorção de um fóton e excitação de um elétron .

Inicialmente, os elétrons em átomos ou moléculas estão energeticamente em um nível “normal” de energia denominado de estado básico ou estado fundamental (“ground state”). A absorção de um fóton por uma molécula de clorofila excita um elétron, levando ele de um estado de baixa energia (não excitado) para um estado excitado.

Fluorescência - bases

Fura-2 Indicador de Ca2+

Moléculas Fluorescentes

Iodeto de Propídio Marcador de DNA

Fluorescência - espectros

Mecanismo

• 1o passo : Absorção (ou excitação)• 2o passo: Dissipação (VR, ISC, CI, NRET,

Complexação)• 3o passo: Emissão

– Fluor ou Fosforescência• Estacionária• Resolvida no tempo

– Polarizada ou não

h

Molécula no estado

fundamentalExcitação

Molécula no estado

excitado Emissão

hh

h

h h

hh

h

10-15 s 10-12 a 102 sVR, ISC, CI, CE,

NRET, complexação

Luminescência

Características Instrumentais

Mecanismo

• O elétron excitado primeiramente relaxa ao menor nível do estado excitado, emitindo radiação infravermelha, isto é calor. Após ele retorna ao estado fundamental, podendo neste retorno acontecer três processos: a) perda de calor; B) emissão de um fóton (fluorescência) ou c) transferência de energia a uma molécula adjacente, onde outro elétron é excitado. Este processo é conhecido como transferência por ressonância, conforme. Esse é o mecanismo pelo qual a energia coletada por dezenas ou centenas de moléculas de pigmento podem ser canalizadas a um centro de reação.

Absorção de um fóton e excitação de um elétron, com liberação de calor

Retorno do elétron excitado ao estado fundamental e os três processos que

podem ocorrer neste retorno.

A transferência por ressonância pode ser demostrada através de um pêndulo.

250 300 350 400 450 500

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

emissão excitação

Antrac eno em Tolueno - Em is s ão e Ex c itaç ão

Inte

nsid

ad

e (

u.a

.)

Comprimento de Onda (nm)

Sobreposição de absorção e emissão - antraceno

340 360 380 400 420 440 460 480 500 520

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

10-5 mol.L

-1

10-4 mol.L

-1

10-3 mol.L

-1

Ant r aceno em Tolueno a 2 x 10- 3

, 10- 4

e 10- 5

M ( ANTO Ln)

Inte

nsid

ade (

u.a

.)

Comprimento de Onda (nm)

Auto-absorção – antraceno

Moléculas Fluorescentes

• Geralmente aromáticas polianelares(rígidas)

• Não possuem grupos muito móveis(dispersam energia)

• Vários rendimentos quânticos(eficiência na produção de luz)

Rendimento Quântico

• Ф = no de fótons emitidos

• Aumenta com o número de anéis (<rotação)

• Diminui com o aumento da T e com a diminuição da viscosidade (>no colisões)

no de fótons absorvidos

360 370 380 390

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

nsi

dade (

u.a

.)

360 370 380 390

PA66PVAc

Temperaturas 020 K 120 K 220 K 280 K 300 K 320 K 410 K

360 370 380 390

PEAD

Comprimento de Onda (nm)

Picos do pireno

Anti--tubulina (Rabbit)

Tecido fixado

Anti-Rabbit IgG

Luz branca

Filtro de excitação

Microscópio de Fluorescência

Filtro de emissão

Molécula fluorescente

OHO

F F

O

OH

O

Método de “Polarização”Método de “Polarização”

• Lentes de um par de óculos polarizadores dão efeitos fantásticos a um microscópio básico

• Ex: Cristal entre o polarizador e o analisador. Gama de cores gravada rodando o polarizador.Técnica usada nas pesquisas mais caras

Outros métodos de melhoramento ópticoOutros métodos de melhoramento óptico

• Contraste diferencial

Organelos em 3D

Maior realidade

• Fluorescência (marcação de estruturas celulares e identificação de estruturas vivas)

Células endoteliais de artériaAC: anti--tubulinaAgente Fluorescente: Alexa Fluor 568exc: 500 - 600em: 580-660

Cromossomo humano em metáfaseIodeto de Propídio (complexado com o DNA)exc: 480 - 560em: 600-700

Quando o IP se interacala entre as bases do DNA a fluorescência aumente de 20 a 30 vezes e o pico de emissão é deslocado 40nm para o vermelho.

F-actina

em: 599

Mitocôndria

em: 520

Núcleo

em: 461

F-actina em: 520

Mitocôndria em: 599

Núcleo em: 461

Sobreposição micrótúbulos e mitocôndrias!

Vermelho: MicrotúbulosVerde: Fibras de actina

Mitochondrion-selective MitoTracker Red CMXRos Microtubules were labeled with mouse monoclonal anti–-tubulin antibody, biotin-XX goat anti–mouse IgG (H+L) antibody and Cascade Blue NeutrAvidin.

Bovine pulmonary arterial endothelial cells

Filamentous actin (F-actin) magenta.

Lipophilic regions of the cell, including intracellular membranes, were stained with green-fluorescent DiOC6(3).

Nuclei DAPI blue-fluorescent

0 30 90 210 s

Alexa Fluor

Fluorescein

Degradação foto-induzida (“Photobleaching”)

BCECF

Marcadores Funcionais - pH

O

O

O

OH

H OH

OH

O

OO

Incolor (pH<8,5) Violeta (pH>8,5)

Fenolftaleína

Fura-2

Marcadores Funcionais - Ca2+

GFP - Proteína Fluorescente VerdeViva as águas vivas!