embriÃo de galinha -...

DESENVOLVIMENTO DO EMBRIÃO DE GALINHA

Guia do Professor

Desenvolvimentodo embrião de galinha

2

Guia do Professor

Nesta atividade os alunos observam diferentes estádios do desenvolvimento embrionário de vertebrados, recorrendo à galinha como organismo modelo.

NÍVEL ESCOLARSecundário (11º e 12º ano)

PALAVRAS-CHAVEDesenvolvimentoEmbriãoGalinhaMorfogénese

ÁREA CIENTÍFICABiologia do DesenvolvimentoEmbriologia

3


Guia do Professor

OBJETIVOS DA ATIVIDADE• Solidificar conceitos de desenvolvimento embrionário transmitidos

nas aulas (crescimento, morfogénese, diferenciação celular), através da

observação experimental de um modelo biológico.

• Integrar os alunos em contexto de laboratório, e desenvolver técnicas

experimentais.

• Desenvolver capacidades de observação, de registo, interpretação e

comunicação de resultados.

MATERIAL NECESSÁRIO• Ovos de galinha fertilizados• Suporte para ovos (p.ex., caixa em que são vendidos nos supermercados, ou

suporte de frigorífico)• Pinça de ponta fina (1/grupo)• Pinça de ponta grossa (1/grupo)• Fita-cola• Tesoura de pontas aguçadas (1/grupo)• Caixa de petri (1/grupo)• PBS (tampão fosfato, em inglês Phosphate Buffered Saline, à temperatura

ambiente)• Seringa com agulha (opcional)• Tinta-da-china (opcional)• Saco para recolha do lixo• Frigorífico (15 ºC)• Incubadora ou estufa (35-40,5 ºC, humidade relativa)• Lupas de disseção

DURAÇÃO PREVISTA*

Introdução da atividade aos alunos:20 - 30 minutos

Explorar30 - 40 minutos

Discussão dos Resultados e Conclusões:20 - 30minutos

Tempo total necessário:70 - 100 minutos

*Não inclui preparação prévia de material

Algumas escolas não dispõem do material ao lado referido. Nesse caso, encorajamos à improvisação desde que se mantenham as condições ótimas de armazenamento, incubação e manuseamento.


4

Guia do Professor

Questionar

5


Guia do Professor

Sugerimos que, anterior-mente ao início das experiên-cias, os alunos divididos em grupos elaborem uma tabela ou outra solução na qual pos-sam registar textualmente ou com imagens ou desenhos as diferentes fases do desen-volvimento embrionário do humano.

Seria este o mote para o início das experiências, sendo a nossa proposta estudar e conhecer as principais fases do desenvolvimento

da galinha onde são visíveis maiores diferenças, primeiro, e verificar se existem fases semelhantes anatómica e fisiologicamente no

desenvolvimento humano, depois.

Registe as respostas. Estas poderão ajudá-lo a, juntamente com os alunos, elaborar hipóteses passíveis de serem testadas com a atividade aqui proposta.

"Será que existe alguma semelhança entre nós e os outros vertebrados na forma como nos desenvolvemos?

Esta poderá ser a pergunta com a qual começará a envolver e a captar a atenção dos seus alunos para a temática a explorar. Registe as respostas e detete eventuais erros de conceito. Conhecer o nível de conhecimentos prévios na turma poderá guiá-lo na mediação das atividades experimentais e na adaptação das estratégias de integração de novos conceitos durante o processo de aprendizagem.

A seguir, introduza ou relembre conceitos gerais sobre o desenvolvimento em humanos, explorando em maior profundidade as fases mais precoces do desenvolvimento correspondentes ao embrião. Mostre ainda exemplos de outros vertebrados adultos, focando o caso da galinha doméstica.

Oriente a discussão de forma a que surjam as seguintes questões-problema:

Por quantas fases de desenvolvimento o embrião da galinha

passa até nascer? O que caracteriza cada uma

dessas fases?

Será que o embrião da galinha e o embrião humano

apresentam alguma semelhança entre si ao longo

do seu desenvolvimento?


6

Guia do Professor

Explorar

7


Guia do Professor

1. Antes de começar a experiência, contacte a quinta ou o aviário mais próximos da sua escola e encomende ovos de galinha fertilizados. Para saber a quantidade de ovos a comprar, deverá prever:a) o número de alunos para o qual a atividade será preparada;b) a possibilidade de aborto dos embriões;c) o número de estádios de desenvolvimento a observar.

Devido às condições climatéricas e/ou de transporte, quanto mais ovos encomendar, menor é o risco de perda da amostra experimental!

2. Uma vez entregues na sua escola, deve guardar os ovos no frigorífico a 15°C, durante todo o tempo até serem incubados.

Quanto maior for o tempo de armazenamento, menor é a probabilidade dos embriões se desenvolverem normalmente. Por isso, os ovos não devem

ser comprados muito tempo antes da primeira incubação prevista - recomendamos que sejam adquiridos na semana antes da observação.

Incubação & Observação

3. Retire os ovos do frigorífico e deixe-os à temperatura ambiente durante o tempo necessário para que a temperatura corporal normalize.

4. Prepare uma solução de 1L de PBS, usando 800 mL de água destilada à qual deverá adicionar a seguinte concentração de sais (tabela 1):

Tabela 1

Sal (fórmula química) Sal (Nome) Concentração (mmol/L) Concentração (g/L)

NaCl Cloreto de Sódio 137,00 8,00

KCl Cloreto de Potássio 2,70 0,20

Na2HPO4 Fosfato de Sódio 10,00 1,44

KH2PO4 Fostato de Potássio 1,76 0,24

Não se esqueça de acertar o pH = 7,4

As leis de experimen-tação em vertebrados são muito restritas quanto à uti-lização de embriões em es-tádios superiores ao último terço da gestação normal (i.e. depois dos 14 dias de in-cubação). Por isso, esta ativ-idade foi planeada apenas para estádios na primeira semana do embrião.

Não esquecer de iden-tificar sempre os ovos com a data da incubação e o es-tádio a observar. Usar uma caneta de feltro e marcar na própria casca do ovo.

PBS, do inglês Phos-phate Buffered Saline, é uma solução salina co-mummente usada na in-vestigação biológica por ser uma solução isotónica e não-tóxica para as célu-las, daí dizer-se que é uma solução tampão.


8

Guia do Professor

5. Divida a turma em vários grupos. Cada grupo deverá replicar os seguintes passos da experiência:

a. Incubar um conjunto de ovos, previamente identificado, numa incubadora a 37,5°C. Os ovos devem ser colocados de pé num suporte apropriado, com o pólo mais rombo virado para cima. Desta forma, o embrião desenvolver-se-á à superfície da gema, permitindo facilmente manipulá-lo, pois estará imediatamente por debaixo da superfície da casca que estiver virada para cima.

Para que a taxa de desenvolvimento do embrião seja normal, isto é, nem demasiado lenta nem demasiado rápida, a temperatura da incubadora deve manter-se entre os 35ºC e os

40,5ºC. É também importante manter os ovos numa atmosfera húmida (55% de humidade relativa), de forma a evitar a sua desidratação. Para tal, deve certificar-se de que a incubadora

(ou outro equipamento improvisado) inclui um recipiente com água.

Nesta atividade, propomos que os alunos observem o embrião de galinha durante a primeira semana do seu desenvolvimento, período durante o qual sofre maior

número de transformações num curto espaço de tempo. Assim, aconselhamos a observação dos seguintes estádios:

I) estádio 10, que corresponde a um tempo de incubação de 33 horas;

II) estádio 20, que corresponde a um tempo de incubação de 72 horas-3,5 dias.

b. Retirar os ovos da incubadora às 33 horas de incubação e às 72 horas-3,5 dias de incubação e, em ambos os casos, colocá-los num suporte apropriado para ovos.

c. Para cada uma das situações, fazer um pequeno furo no centro do pólo mais rombo, com a ajuda de uma pinça de pontas finas; a seguir, partindo do furo e com a ajuda de uma pinça de pontas grossas, abrir cuidadosamente a casca e fazer uma "janela" com o tamanho suficiente até se conseguir ver o embrião.

Definir o tamanho da janela guiando-se pelo tamanho da bolsa de ar que se forma entre a casca e a membrana externa do ovo (Figura 1). É importante ter cuidado para não romper

a membrana pois é ela que segura o embrião.

d. Usando a pinça de pontas finas, retirar a membrana esbranquiçada que está junto à membrana externa do saco amniótico.

e. Sem retirar o embrião de dentro do ovo, visualizar diretamente sob a luz de uma lupa de dissecção.

9


Guia do Professor

Para embriões com 33 horas de incubação, se se adicionar tinta da china possibilita-se um contraste melhor que permite visualizar com melhor nitidez a forma do embrião. Podem

fazê-lo, com a ajuda de uma agulha: injetar, com bastante cuidado, na região imediatamente abaixo do corpo do embrião, um pouco de tinta-da-china, previamente diluída de 1:5 em

PBS.

Embora não sejam tão bem observáveis certas funções fisiológicas (como os batimentos cardíacos), é possível estudar o embrião fora do ovo. Neste caso, corta-se a membrana à

volta do embrião assim como os vasos sanguíneos que o ligam ao ovo, segurando sempre o embrião com uma das pinças; depois, com a ajuda de uma colher, coloca-se o embrião

numa placa de Petri contendo PBS (tabela 1).

6. Cada grupo de alunos regista textualmente ou com imagens ou desenhos o que observou à lupa para cada um dos dois estádios de desenvolvimento do embrião.

7. Distribua a cada grupo um conjunto das ilustrações do embrIão de galinha fornecidas em anexo (correspondem a apenas alguns dos estádios). A partir dos desenhos, do que observaram à lupa e, possivelmente, com a ajuda de alguma pesquisa bibliográfica (já que esta atividade está adaptada para apenas dois estádios), os alunos poderão tentar recriar o desenvolvimento cronológico do embrião da galinha.

1 e 15 - Casca

2 - Membrana externa

3 - Membrana interna

4 e 13 - Calaza: 'cordas' de albumina, que prendem a gema às membranas do ovo.

5, 6 e 12 - Clara ou Albumina: fonte de água e alimento para o embrião.

7 - Membrana vitelina

8 - Núcleo Germinativo

9 - Disco Germinativo/ Blastoderme: o embrião propriamente dito.

10 - Gema amarela: contém proteínas, gorduras, vitaminas e minerais, essenciais ao

desenvolvimento do embrião.

11 - Gema branca

14 - Bolsa de ar

Figura 1: Interior do ovo da galinha


10

Guia do Professor

Descobrir

11


Guia do Professor

1. Cada grupo de alunos descreve à turma toda a representação textual ou imagética das duas fases de desenvolvimento observadas assim como a sua proposta de posicionamento cronológico das diferentes fases usando as ilustrações fornecidas (em anexo).

2. Compare os resultados e, se necessário, corrija o posicionamento dos desenhos (ver solução correta em anexo). Complete as respostas dos alunos com informação específica relativa a cada estádio e com imagens reais obtidas em laboratório (consultar anexo). Prossiga a discussão com os alunos e possibilite a comparação dos resultados obtidos com o desenvolvimento embrionário humano. Complemente a discussão com imagens de embriões de outros vertebrados (Consultar a bibliografia).

3. Oriente a discussão explicando, a partir das observações dos alunos, as conclusões finais:

O embrião de galinha passa por várias fases de desenvolvimento que são classificadas em função de determinadas marcas morfológicas que vão surgindo ou se alterando desde o início da incubação até ao nascimento do pinto.

4. Termine a aula, abordando a Biologia do Desenvolvimento como disciplina que estuda os mecanismos subjacentes à transformação do ovo fertilizado num organismo adulto e refira alguns modelos animais usados pela investigação científica nesta área e porquê, focando o caso da galinha doméstica (consultar informação em anexo).

Durante as fases mais precoces do desenvolvimento, o embrião de pinto e o embrião humano apresentam várias semelhanças morfológicas. O mesmo acontece com outros vertebrados.


12

Guia do Professor

Anexos

13


Guia do Professor

- PREPARE-SE PARA AS PERGUNTAS DOS ALUNOS! -

Aqui disponibilizamos os conceitos teóricos e científicos mais importantes para que possa realizar autonomamente as atividades propostas. No entanto, não exclui a consulta de

bibliografia adicional.

I. Biologia do Desenvolvimento

A Biologia do Desenvolvimento é uma disciplina que estuda os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à transformação do ovo fertilizado (uma única célula) num organismo adulto (constituído, no caso do Homem por 10 biliões de células, de 200 tipos diferentes).São vários os animais modelo utilizados em Biologia do Desenvolvimento: a mosca da fruta (Drosophila melanogaster), o verme (Caenarhabditis elegans), o sapo africano (Xenopus Laevis), o peixe-zebra (Danio rerio), a galinha doméstica (Gallus domesticus), o ratinho (Mus musculus). Cada modelo tem as suas vantagens. Alguns, como o ratinho e a mosca da fruta, são poderosos modelos genéticos, pois permitem manipulações na linha germinal transmissíveis de geração em geração. Outros, como o verme C. elegans e o peixe-zebra, pela transparência do embrião, permitem acompanhar o nascimento de novas células e as suas migrações no embrião, ao vivo. Já muitos dos mecanismos celulares e moleculares (i.e. genes) envolvidos nas primeiras fases do desenvolvimento embrionário (do ovo à mórula, e ao blastocisto), foram desvendados nos embriões gigantes do sapo Africano.

Descrevemos aqui apenas algumas utilizações de cada animal modelo em Biologia do Desenvolvimento, não sendo esta listagem de todo exaustiva: hoje são possíveis manipulações

genéticas em peixe-zebra e existem vários métodos de regular (aumentar ou diminuir) a expressão de genes em galinha, apesar destas alterações genéticas não serem ainda transmissíveis

de geração em geração. Na verdade, as potencialidades dos modelos sobrepõem-se, de modo que, em laboratórios de Biologia do Desenvolvimento, recorre-se muitas vezes a dois ou

mais modelos complementares (por exemplo: galinha e ratinho, ou mosca da fruta e peixe-zebra).

A espécie de galinha mais conhecida do ser humano, Gallus domesticus, tem sido frequentemente utilizada em estudos de embriologia de vertebrados, por várias razões:

1. Como as galinhas se reproduzem ao longo do ano, facilmente se obtêm ovos fertilizados em qualquer altura, sendo apenas necessário uma deslocação ao aviário mais próximo.2. Os embriões de galinha, por se desenvolverem fora do corpo da progenitora, são muito acessíveis (em comparação com mamíferos, por exemplo, que se desenvolvem no útero da progenitora).


14

Guia do Professor

3. A forma pela qual é possível obter embriões vivos de galinha em diferentes estádios de desenvolvimento é muito simples: consiste em armazenar os ovos fertilizados a 37,5-38 ºC, durante diferentes intervalos de tempo. Este processo, ao qual chamamos de incubação artificial, permite simular as condições de desenvolvimento do embrião de galinha na Natureza, desde a fertilização até ao nascimento do pinto - com a duração total de 21 dias.

De facto, o embrião de pinto tem muitas vantagens, principalmente em relação aos embriões de outros amniotas como o ratinho:- no início do desenvolvimento embrionário, o embrião de pinto é plano, ao contrário do de ratinho, que se enrola sobre si próprio;- o embrião de pinto é facilmente acessível dentro do ovo - basta fazer uma abertura na casca e o embrião fica logo visível e acessível para cirurgias e manipulações; o embrião de ratinho, pelo contrário, desenvolve-se dentro do saco uterino da mãe;- é possível crescer, em cultura, tecido dissecado do embrião de pinto, para a realização de estudos in vitro (estudar se duas populações diferentes de células se misturam ou não, por exemplo).

II. Descobertas científicas em Biologia do Desenvolvimento

A investigação que tem sido desenvolvida, utilizando a galinha como modelo animal, tem contribuído marcadamente para o conhecimento sobre o desenvolvimento dos vertebrados, incluindo mamíferos como o Homem. Alguns processos que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário, elucidados recorrendo ao embrião de pinto são (Wolpert, 2004):

- a distribuição assimétrica esquerda-direita dos órgãos do corpo; - a origem e desenvolvimento do sistema nervoso central e periférico; - a origem e formação do esqueleto do crânio; - os processos pelos quais são especificados e formados os músculos intercostais, dos membros e das costas;- a cartilagem entre as vértebras e entre as costelas e a parte superficial (a derme) da pele;- o desenvolvimento dos membros.

Desde os anos 90 que se realizam manipulações in utero de embriões de ratinho, e desde os anos 70 que se cultivam embriões de ratinho in vitro, durante as primeiras fases do desenvolvi-mento embrionário. Estes estudos têm permiti-do elucidar os processos celulares e moleculares que ocorrem durante as fases de gastrulação e fases iniciais da organogénese em ratinho.

15


Guia do Professor

Em alguns casos, entender como se desenvolve o embrião de galinha, tem contribuído para uma melhor compreensão de malformações em humanos, abrindo caminho ao desenvolvimento de terapias que as evitem.

Assimetria esquerda-direita no embrião

A aparência exterior de qualquer vertebrado é simétrica (com ligeiríssimas variações entre o lado esquerdo e direito de um indivíduo). No entanto, no interior, a distribuição é assimétrica: do lado esquerdo encontra-se o estômago, o pâncreas, o baço e grande parte do coração; do lado direito está grande parte do fígado e a vesícula biliar. Ademais, o pulmão esquerdo tem menos lóbulos que o direito, e o intestino enrola-se em sentido contrário ao dos ponteiros do relógio.Dentro de cada espécie, esta distribuição assimétrica é mantida entre indivíduos, de tal forma que desvios na distribuição (quer parcial quer de inversão total da posição dos órgãos) resultam em doenças e malformações graves. Compreender de que forma é estabelecida esta assimetria esquerda-direita durante o desenvolvimento embrionário é uma das questões base da biologia do desenvolvimento. Foi no embrião de galinha, em 1995, que se identificaram os primeiros genes que controlam a assimetria esquerda-direita (Levin, et al., 1996). Cientistas do grupo de Clifford Tabin (na Universidade de Harvard, EUA), mostraram que no embrião de estádio HH5 (com 19 a 22 horas de incubação), há uma distribuição assimétrica da expressão (atividade) de vários genes em torno do nó de Hensen, em relação ao eixo de simetria anterior-posterior: os genes sonic hedghog (Shh), Nodal e Pitx2 são expressos do lado esquerdo; FGF8 (Fibroblast Growth factor 8) e SNR (snail-related) do lado direito. A expressão assimétrica do gene Nodal é comum a todos os vertebrados estudados até ao momento (ratinho, peixe-zebra, coelho, sapos), como se mostrou em estudos posteriores. A distribuição assimétrica do gene Nodal estende-se depois a toda a parte esquerda do embrião (concretamente à placa lateral da mesoderme), despoletando cascatas de genes “de direita” e genes “de esquerda”, que transferem a informação esquerda-direita aos primórdios dos órgãos, assegurando que estes se desenvolvam apropriadamente: quer o tipo de órgão, quer a orientação do órgão (Raya e Belmonte, 2006).Desde a década de 90 que os estudos sobre os mecanismos que coordenam a assimetria esquerda-direita se têm multiplicado e os conhecimentos têm acumulado de forma espantosa. No entanto, falta ainda conhecer muito sobre este fenómeno biológico tão fundamental, nomeadamente qual o primeiro passo que quebra a simetria do embrião, antes do estabelecimento da distribuição assimétrica dos genes Shh e Nodal (isto é, que está a montante). Será um mecanismo comum a todos os vertebrados, com pequenas variações entre as

Nó de Hensen - estrutura embrionária transiente, localiza-da na extremidade anterior da linha primitiva em embriões de amniotas (aves, répteis e mamíferos). O nó funciona como um centro organizador do embrião, regulando o estabe-lecimento dos eixos de simetria do embrião: antero-posteri-or (A-P), dorso-ventral (D-V) e esquerda-direito (E-D).

Placa lateral da meso-derme - zona mais lateral da mesoderme no embrião em estádio de neurulação (for-mação do tubo neural, precur-sor do sistema nervoso central). Dá origem a várias estruturas, incluindo o coração, os vasos sanguíneos e células do sangue, o revestimento das cavidades internas do corpo e compo-nentes dos membros excluindo os músculos.


16

Guia do Professor

espécies, ou terá cada espécie adotado um mecanismo diferente, ‘desembocando’ todos na expressão assimétrica de Shh e Nodal? (Raya e Belmonte, 2006; Ibañes e Belmonte, 2009).

Desenvolvimento do sistema nervoso central

O sistema nervoso central (SNC) de vertebrados é constituído pela espinal medula, o cérebro, o nervo ótico e a retina. Desenvolve-se a partir do tubo neural - um epitélio derivado da ectoderme, constituído inicialmente por uma camada pseudo-estratificada de células com elevada capacidade proliferativa - são as células progenitoras dos neurónios e das células da glia do sistema nervoso central adulto. A formação de um SNC adulto, funcional, envolve uma série de etapas (que ocorrem sequencialmente, com alguma sobreposição):

1. Proliferação das células progenitoras;2. Migração das células progenitoras para regiões específicas do SNC;3. Diferenciação (maturação) das células progenitoras.

Estudos realizados no embrião de galinha têm elucidado os mecanismos celulares e moleculares subjacentes a cada uma daquelas etapas.

Durante o desenvolvimento embrionário, na espinal medula estabelece-se uma distribuição bem definida de subtipos de neurónios, ao longo do eixo antero-posterior e do eixo dorso-ventral. Este ‘mapa’ de neurónios reflete-se depois, e serve de base, à rede de projeções neuronais (nervos) que entram e/ou saem da espinal medula, enervando músculos e outros órgãos do corpo (Ulloa e Briscoe, 2007). Hoje sabe-se que a distribuição dos subtipos de neurónios ao longo do eixo dorso-ventral é estabelecido por ação de dois gradientes opostos de substâncias difusíveis: a proteína SHH (sonic hedgehog) libertado pela placa ventral do tubo neural induz a formação de neurónios ventrais (maioritariamente neurónios motores somáticos, que enervam músculos esqueléticos); as proteínas WNT e BMP, libertadas pela placa dorsal do tubo neural, induzem populações dorsais (maioritariamente neurónios sensoriais). A identificação destes gradientes foi feita, em grande parte, no embrião de galinha, em estudos realizados nos anos 90 (Price e Briscoe, 2004; Ulloa e Briscoe, 2007).

Ectoderme - uma das três folhas germinativas do embrião. No embrião forma a cama-da mais exterior. Dá origem à epiderme e aos nervos no adul-to. As outras folhas germinativas são a endoderme e a meso-derme.

Placa ventral do tubo neural - zona mais ventral do tubo neural. Tem proprie-dades sinalizadoras: é fonte de sonic hedgehog (SHH), uma das principais proteínas sinalizadoras no embrião. .

Placa dorsal do tubo neural - zona mais dorsal do tubo neural. Tal como a placa ventral do tubo neural, também tem capacidades sinalizadoras.

17


Guia do Professor

Formação dos membros (anteriores e posteriores)

Praticamente tudo o que hoje se sabe sobre o desenvolvimento dos membros provém de estudos feitos no embrião de galinha. Os primeiros sinais visíveis do desenvolvimento de membros são pequenas protuberâncias que surgem ao longo do eixo principal do corpo, no estádio 17 de desenvolvimento (52 - 64 horas de incubação) em posições correspondentes às futuras asas e patas (no caso da galinha). Estas protuberâncias, de origem mesodérmica , formam botões que se vão alongando, afastando-se do corpo. Na base dos botões começam-se a formar o esqueleto do membro, de forma sequencial: primeiro os ossos mais próximos do corpo como o húmero ou o fémur, e por fim os dígitos, nas extremidades. Também nos membros ocorrem as etapas de proliferação, migração (reduzida) e diferenciação celular. Estas etapas são coordenadas por sinais intrínsecos e extrínsecos às células, muitos destes provenientes de zonas sinalizadoras, que conferem informação posicional às células ao longo de três eixos: antero-posterior (do polegar ao dedo mindinho, numa mão humana), próximo-distal (do ombro à ponta dos dedos) e dorso-ventral (das costas à palma da mão). Tudo isto foi identificado no embrião da galinha, e depois estendido ao desenvolvimento embrionário de mamíferos. O membro embrionário foi um dos sistemas modelo em que foi descoberto o processo de morte celular programada (apoptose). A apoptose ocorre em várias fases do desenvolvimento do membro, sendo mais espetacular (por ser em grande escala) na eliminação das membranas interdigitais no embrião de galinha. No embrião de pato, a apoptose interdigital não ocorre, como seria de esperar.

Desenvolvimento das vértebras, dos músculos e da pele

No embrião de galinha no estádio 7, surgem dois blocos de tecido, um de cada lado do tubo neural - são os primeiros sómitos. À medida que o desenvolvimento progride, surge, em cada 1,5hrs, um novo par de sómitos, até se formarem 50 pares de sómitos, estendendo-se ao longo do eixo antero-posterior do corpo do embrião (não existem sómitos ao longo da cabeça do embrião). Os sómitos são blocos de tecido de origem mesodérmica, e dão origem à cartilagem das vértebras e costelas, à derme da pele, aos músculos intercostais, dos membros e das costas.

Mesoderme - uma das três folhas germinativas do embrião. No embrião, a mesoderme localiza-se entre a endoderme e a ectoderme. Dá origem ao sangue, osso, coração, rim, gónadas e teci-do conectivo.

Faça este pequeno exercício com os seus alunos.Observação: Os patos têm membranas interdigitais. As galinhas (e os humanos) não têm. Porque será? Os alunos respondem colo-cando uma hipótese testável.


18

Guia do Professor

Todo o processo pelo qual um bloco de tecido homogéneo, o sómito recém-formado, se diferencia de modo a produzir populações de células com funções diferentes foi elucidado em estudos realizados no embrião de galinha. Através de experiências de transplantação galinha-codorniz, identificaram-se regiões especializadas dentro do sómito maduro, em que se diferenciam determinadas populações de células que depois adotam o seu fenótipo final e/ou migram para os seus destinos finais. Foi também graças a estudos no embrião de galinha que se identificaram os genes envolvidos na regionalização dos sómitos: Shh (sonic hedgehog), produzido pelo placa ventral do tubo neural e pela notocorda, atua sobre a parte ventral do sómito; Wnt e BMP (Bone Morphogenetic Protein), expressos na zona dorsal do tubo neural, especificam as populações dorsais do sómito (Gilbert, 2000).

Bibliografia:

- Wolpert, L. (2004) Much more from the chicken’s egg than breakfast - a wonderful model system. Mech. Dev. 121: 1015-17

- Raya, A e Izpisúa Belmonte, JC. (2006) Left-right asymmetry in the vertebrate embryo: from early information to higher-level integration. Nature Reviews

Genetics. 7: 283-293.

- Ibañes, M e Izpisúa Belmonte, J C (2009) Left–right axis determination. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1: 210–219.

- Price, S e Briscoe, J. (2004) The generation and diversification of spinal motor neurons: signals and responses. Mech. Dev. 121: 1103-115

- Ulloa, F e Briscoe, J. (2007) Morphogens and the control of cell proliferation and patterning in the spinal cord. Cell Cycle 6:2640-2649

- Gilbert, SF (2000) Developmental Biology. Sinauer Associates. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK10085/)

III. O Ciclo de Vida da Galinha Desde que a galinha “põe o ovo” até que o pinto nasce, o embrião demora 21 dias a desenvolver-se. Logo após a fertilização do ovo, as células embrionárias dividem-se, crescem e diferenciam-se em vários tecidos. Tudo isto ainda dentro do oviducto da galinha-mãe e durante cerca de 20 horas. Quando a galinha “põe o ovo”, o embrião deixa de se desenvolver permanecendo num estado inativo até que se estabeleçam as condições favoráveis, características do processo de incubação. A partir daqui, e durante 21 dias, os diferentes tipos de células embrionárias dão origem às diferentes estruturas do pinto: umas dão origem aos diferentes órgãos vitais (p.ex., o coração), outras aos membros (isto é, asas e pernas), e outras estruturas do pinto. Ao fim de 3 semanas o pinto está pronto para nascer e, passados 2 meses, é já uma galinha adulta.

As múltiplas funções dos genes Shh, Wnt e BMP durante o desenvolvimento embri-onário: no sistema nervoso, nos membros, nos sómitos…são, de facto, atores centrais no desenvolvimento embri-onário de vertebrados e inver-tebrados, tendo sido sucessi-vamente recrutados, ao longo da evolução, para inúmeros processos de sinalização.

Consultar a Figura 1 para rever a organização interna do ovo da galinha.

19


Guia do Professor

IV. As Fases do Desenvolvimento Embrionário da Galinha

Dois cientistas, Victor Hamburger e Harold Hamilton, publicaram, em 1951, uma série de imagens de microscopia através da qual fizeram uma análise morfológica detalhada do embrião de galinha, em diferentes estádios de desenvolvimento. Este estudo tornou-se uma referência para os investigadores da área e ainda hoje a comunidade científica utiliza a notação por eles elaborada para classificar e estudar os embriões de galinha.

Segundo Hamburger e Hamilton, as fases de desenvolvimento embrionário classificam-se em função de determinadas marcas morfológicas que vão surgindo ou se alterando desde o início da incubação até ao nascimento do pinto. Analisemos a sequência de algumas alterações importantes na morfologia do embrião apenas durante a primeira semana de incubação, período durante o qual o embrião sofre maior número de transformações num curto espaço de tempo (acompanhar a leitura com a Figura 2, 3 e 4):

• Nos estádios mais precoces do embrião, a forma e tamanho da linha primitiva são usados para classificar desde o estádio 1 ao estádio 6 do embrião.

• A partir do estádio 5, começa a formar-se a notocorda ou corda dorsal, as pregas neurais e o tubo neural. Estas estruturas darão origem, ao longo do desenvolvimento, às várias partes que constituem o sistema nervoso.

• A formação de sómitos (blocos de tecido que se formam aos pares, um de cada lado do tubo neural), surge no estádio 7 com o aparecimento do primeiro par de sómitos. O número de sómitos é comummente usado para identificar os estádios 6 a 14: cada novo estádio corresponde à adição de 3 novos pares de sómitos. Por exemplo: um embrião no estádio 8 tem 4 pares de sómitos, no estádio 10 tem 10 pares de sómitos.

• No estádio 14, é já visível a flexão do tronco e a formação dos primeiros arcos branquiais (que darão origem às mandíbulas, faringe e laringe). Nesta altura, são já visíveis os vasos sanguíneos que ligam o embrião ao ovo e que tiveram origem nos ilhéus sanguíneos.

• As primeiras evidências da formação dos membros superiores (asas) e membros inferiores (patas) surgem no estádio 16 e, até ao final do desenvolvimento, são marcas morfológicas muitos importantes.

• No estádio 20, o embrião tem 40 pares de sómitos (dificilmente contáveis, pois o tecido do embrião é já demasiado denso e opaco), os maxilares estão a desenvolver-se e já completou a rotação; regiões específicas do cérebro estão também bastante diferenciadas e é notório o aparecimento da pigmentação do olho.


20

Guia do Professor

Figura 2: Fases de desenvolvimento embrionário de galinha, segundo Hamburger e Hamilton (0 horas – 3,5 dias de incubação).© Prof. Judy Cebra Thomas, Swarthmore College

12-13h 18-19h1 9-22h 23-25h

23-26h2 6h 26-29h2 9-33h

linha primitiva

pregas neurais pregas

neurais

tubo neural

1 par desómitos

3pares de sómitos

33-38h 40-45h4 5-49h 48-52h

50-53h 50-55h 51-56h 52-64h

10 pares de sómitos

coraçãoilhéus

sanguíneos

arcosbranquiais

olho

vasossanguíneos

medulaespinal

botão do membro

ventrículo

Figura 2.1: Estádios de 3 a 9 Figura 2.2: Estádios de 10 a 17

64h 72h 3-3,5 dias 3,5 dias

botões dos membros

ventrículo

olho

aurícula

Figura 2.3: Estádios de 17 a 21

21


Guia do Professor

Figura 3.1 : vista dorsal 1 - Vesículas ópticas que, como o nome indica, formarão mais tarde a lente do olho.2 - Infundibulum que posteriormente se diferenciará na neurohipófise, glândula responsável pelo armazenamento de hormonas importantes na absorção de água nos rins, contrações uterinas e libertação do leite em mamíferos.3 - Mesencéfalo é a região do tubo neural que, futuramente no cérebro, será responsável pelo processamento da informação visual e auditiva.4 - Metencéfalo é a região do tubo neural que irá formar o cerebelo, o coordenador da posição e movimento do corpo, e de outras estruturas responsáveis pelo envio de informação entre o cérebro e o cerebelo.5 - Mielencéfalo onde se desenvolvem nervos motores e sensoriais, ligando o cérebro à espinal medula, controlando sensações e movimentos.6 - Sómito ou os vários pares de sómitos que darão origem a estruturas como as vértebras e as costelas, os músculos dos membros e costas, e também à pele.7 - Espaço entre dois sómitos.8 - Notocorda ou corda dorsal é uma estrutura temporária (não existe no adulto), mas crucial na formação da espinal medula e da coluna vertebral.

9 - Área pelúcida

Figura 3: Morfologia do embrião com 33 horas de incubação (estádio 10)© imagens retiradas de Embryo Atlas da Lawrence University

Figura 3.21 - Proâmnio.2 - Área vascular.3 - Ilhéus sanguíneos que irão diferenciar-se nos vasos sanguíneos que ligam o embrião à cavidade vitelina.4 - Sómitos.5 - Espinal medula é a região posterior do tubo neural que, juntamente com o cérebro, formará o sistema nervoso.6 - Placas de segmentação onde se formam os blocos de sómitos. 7 - Pregas Neurais que se irão fundir ao longo das costas do embrião, formando o tubo neural. Nesta zona junto à cauda, o tubo neural transformar-se-à na espinal medula.8 - Linha primitiva é uma das primeiras estruturas que se formam durante as fases mais precoces do desenvolvimento embrionário tanto de aves, como répteis e mamíferos.

Figura 3.31 - Neuroporo anterior é uma abertura numa das extremidades do tubo neural e que fecha por volta do estádio 25 (no humano).2 - Vesículas ópticas.3 - Diencéfalo é a região do tubo neural que está na origem da formação das vesículas ópticas, do tálamo (região de integração sensorial), do hipotálamo (região secretora de hormonas), do coróide plexus (secretor de fluido no cérebro) e da glândula pineal (secretora de melatonina). 4 - Infundibulum.5 - Tecido precursor da pele (Ectoderme).6 - Tecido precursor da cabeça (Mesênquima).7 - Notocorda ou corda dorsal.8 - Intestino anterior que se diferenciará no esófago, estômago, duodeno, fígado, epitélio da traqueia, vesicular biliar e parte superior do pâncreas. 9 - Ventrículo do coração.10 - Região sinoatrial do coração.


22

Guia do Professor

Figura 4.11 - Sómito2. - Coração, sendo este o primeiro órgão vital a formar-se.3 - Botão da asa, que como o nome sugere dará origem a uma das asa.4 - Veia vitelina5 - Espinal medula6 - Botão da pata, que como o nome sugere dará origem a uma das patas.7 - Botão da cauda, que como o nome sugere dará origem à cauda.8 - Artéria Vitelina, por onde circulam, através do sangue, os nutrientes (e não só) entre o embrião e a cavidade vitelina .9 - Telencéfalo10 - Dielencéfalo11 - Olho12 - Mesencéfalo13 - Metencéfalo

Figura 4: Morfologia do embrião com 3-3,5 dias de incubação (estádio 20).© imagens retiradas de Embryo Atlas da Lawrence University

Figura 4.21 - Telencéfalo3 - Diencéfalo4 - Mesencéfalo6 - Metencéfalo7 - Mielencéfalo9 - Vesícula auditiva, que dará origem a um dos ouvidos.11 - Botão da asa13 - Botão da cauda14 - Artérias vitelinas17 - Ventrículo

Figura 4.35 - Aurícula7 - Botão da pata

Figura 4.41 - Mielencéfalo2 - Copo óptico3 - Lente, estrutura do olho.


Guia do Professor

- FOLHA DE REGISTO (GRUPO OU INDIVIDUAL) -

Nome da atividade:

Membros do grupo:

O que sabemos sobre este tema?

O que ainda não sabemos e queremos descobrir?

Como podemos descobrir?

O que observámos? O que aprendemos?


Folha de Registo - PÁG.1

Guia do Professor

FOLHA DE REGISTO (GRUPO e/ou INDIVIDUAL)Distribuição cronológica do desenvolvimento embrionário da galinha

Estádio nº_______________ Estruturas

Cabeça

Tronco

Botão da Asa

Botão da Pata

Cérebro

Olho

Coração

Nome do aluno/ grupo:

- Cola por ordem cronológica as diferentes fases de desenvolvimento do embrião da galinha, usando as ilustrações fornecidas. Em cada uma, assinala a presença (com um X) ou ausência das estruturas embrionárias em baixo sugeridas.

1Estádio nº_______________ Estruturas

Cabeça

Tronco

Botão da Asa

Botão da Pata

Cérebro

Olho

Coração


Cabeça

Tronco

Botão da Asa

Botão da Pata

Cérebro

Olho

Coração

3

Folha de Registo - PÁG.2


Guia do Professor

Estádio nº_______________ Estruturas

Cabeça

Tronco

Botão da Asa

Botão da Pata

Cérebro

Olho

Coração


Cabeça

Tronco

Botão da Asa

Botão da Pata

Cérebro

Olho

Coração

5


Guia do Professor

Distribuição cronológica das diferentes fases de desenvolvimento - RESULTADOS ESPERADOS

Estádio nº 6 Estádio nº 10 Estádio nº 14 Estádio nº 16 Estádio nº 20

Cabeça x x x

Tronco x (estrutura primária, a notocorda) x (estrutura primária, a notocorda) x (início da flexão) x

Botão da Asa x (primeiras evidências) x

Botão da Pata x (primeiras evidências) x

Cérebro x (regiões específicas bastante diferenciadas)

Coração x (primeiras evidências) x

Olho x x (aparecimento da pigmentação)

1 2 3 4 5

© Ciência em Três, Instituto Gulbenkian de Ciência

ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO PARA IMPRIMIR (para vários grupos)

© Ciência em Três, Instituto Gulbenkian de Ciência


Guia do Professor

Bibliografia

The stage series of normal

chick embryonic development

is one of the most frequently

cited and enduring biomedical

articles ever published, and set

the standards for amniote

species-specific stage series

that have followed. The

coauthor of this paper, Viktor

Hamburger, died in June, 2001,

just a few weeks prior to his

101st birthday. In recognition

of the tremendous importance

of this stage series to countless

research and teaching labora-

tories around the world, and in

tribute to Prof. Hamburger’s

many contributions to develop-

mental biology spanning seven

decades, the editors and

publisher of Developmental

Dynamics commissioned the

poster that accompanies this

issue. Stages 1-35 (incubation

days 0 through 9) were scanned

from the original 1951 publi-

cation. Embryos have been

resized and cropped for this

poster format, and digitally

enhanced to better highlight

key features of each stage.

Sketches of early limb bud and

branchial (pharyngeal) arch

development are also included;

keys for these are in the

original publication.

NORMAL STAGES OF CHICK EMBRYONIC DEVELOPMENT

*Reprinted in Developmental Dynamics 195, 231-72 (1992).Poster by Drew M. Noden, Cornell University; sponsored by the American Association of Anatomists; production by Wiley-Liss, Inc.

WWW.INTERSCIENCE.WILEY.COM/DEVELOPMENTALDYNAMICSDEVELOPMENTALDYNAMICS

In Memory of Viktor Hamburger:1900-2001

Hamburger V. Hamilton H.L. 1951. A series of normal stages in the development of the chick embyro. J Morph 88: 49-92.*

A SERIES O F NORMAL STAGES I N THE DEVELOPMENT O F THE

CHICK EMBRYO

VIKTOR HAMBURGER Department of Zoology, Washington University, S t . Louis, Missouri

HOWARD L. HAMILTON Depa?%n,ent of Zooloqy a d Entomology, Iowa State College, Ames

FORTY-FNE FIGURES

The preparation of a series of normal stages of the cliick embryo does not need justification at a time when chick embryos are not only widely used in descriptive and experimental embryology but are proving to be increasingly valuable in medical research, as in work on viruses and cancer. The present series was planned in connection with the preparation of a new edition of Lillie’s Deuelopiiaent of the Chick by the junior author. It is being published separately to make it accessible immediately to a large group of workers.

Ever since Aristotle “discovered” the chick embryo as the ideal. object for embryological studies, the embryos have been described in terms of the length of time of incubation, and this arbitrary method is still in general use, except for the first three days of incubation during which more detailed characteristics such as the numbers of somites are applied. The shortcomings of a classification based on chronological age are obvious to every worker in this field, for enormous variations may occur in embryos even though all eggs in a setting are placed in the incubator at the same time. Many factors are responsible €or the lack of correlation between chronological and structural age. -4mong these are : genetic differences in the rate of development of different breccls (e.g., the embryo of the White Leghorn breed develops more

49

50 V. HAMBURGER AND H. L. HAMILTON

rapidly than that of the Barred Plymouth Rock and hatches approximately a day earlier) ; seasonal differences in the viability and vigor of embryos; differences in the stage of development when incubation is started ; differences in the “freshness” of eggs, i.e., the lapse of time between laying and incubation; differences in the temperature of eggs when placed in the incubator, and in the size of individual eggs; differences in the temperature of incubation, and in type and size of incubator.

The wide variations in external form which occur a t any given chronological age are clearly seen in tables 1 and 2 which show the distribution of 296 embryos from the 4th day until hatching when classified according to our series of stages. F o r example, a “6-day” embryo may range anywhere from stage 27 + to stage 31 (table 1). It will also be noted that the data in table 1 are based on an illcubation-temperature of 103°F. (ca. 39.4”C.) whereas those in table 2 are based on a temperature of 375°C. This difference has resulted in the skipping of the “9-day” embryo altogether! It is not sur- prising, therefore, that the use of chronology with its lack of precision in the designation of embryos has actually led to misunderstandings and controversies which could readily have been avoided by the use of an adequate series of morphological stages.

Keibel and Abraham (1900) worked out a series of stages of the chick embryo based on morphological characters. This series never became popular and it has been rarely used aiid quoted. Among its shortcomings are its inadequate illustrations which often make the identification of an embryo difficult, the incomplete coverage of older stages, and perhaps also the format and relative inaccessibility of the Norrnenta- feln. M. Duval’s masterful Atlas d’Embryologie (1889) with its artistically perfect drawings is unfortunately incomplete in that it does not go beyond the 8th day of incubation.

Our owii work covers the entire period of incubation. I ts aim is to serve the practical purpose of identifying and desig- nating embryos on the basis of external characters. The un-

TA

BL

E

1 D

istr

ibut

ion

of c

hick

em

bryo

s sh

owin

g th

e re

lati

onsh

ip b

etw

een

stag

es o

f de

velo

pmen

t an

d da

ys o

f in

cuba

tion

at

103°

F.

(39.

4"C

.)

bTA

UE

S O

h' D

EV

EL

OP

ME

NT

-

22

23

24

2

4+

2

5

25

+

26

2

6+

2

7

27

+

28

2

X+

20

2

9+

30

3

0+

3

1

31

+ 3

2

32

+

:13

3:l

c

34

35

33

55

2

4 1

54

2

44

5 D

AY

S

53

OF

6 64

7 7:

INC

UB

AT

ION

35

47

11

3

28

64

1

32

5

13

72

42

32

2

14

22

21

4

25

1 4

33

1

8 1

88

8+

8

F

0 m

u)

0

TA

BL

E 2

r

H

The

om

issi

on o

f tl

ie 9

th d

ay i

s du

e to

a s

hift

in

iiicu

I~at

.ion-

teir

il,cr

,?tu

re be

t.wee

ii st

ages

35

:tnd

36 (

see

1'. 50

).

1Xrt

rib.

utio

n of

chi

ck e

nibr

yos

show

ing

the

rela

tion

ship

bet

wee

n st

ages

of

deve

lopn

rent

and

day

s of i

ncub

atio

n at

375

°C.

I3 0

ST

AG

ES

OF

YE

VP

LO

PM

EN

T

B 36

3

6+

37

- 37

35

+ 3

8-

38 38+ 3

9-

:lY

39

+ 4

0-

40

4

0+

41

- 4

1

41

+ 4

2-

42

4:

s 4:

) +

44

- 4

4

45

4

6

10

93

1

i? 11

8

51

12

8

5

2 13

1

38

11

D

AY

S

14

29

15

17

OF

IN cu

- H

AT

ION

11

11

7 1

36

1

10

-. 18

1

21

6

19

2u

52 1‘. HAMBURGER AND H. L. HAMILTON

excelled series of stages of AinbEystoma by Harrison has served as a model. Our series is independent of chronological age and of size of embryos, as is the AmbZystomu series. The photographs and drawings show most of the diagnostic criteria ; this, we hope, will facilitate a rapid identification. A brief text is added, in which the distinguishing criteria are listed for each stage.

We are aware of the complications which derive from the independent variations of different characters. For instance, the progress of differentiation in the visceral arches may lag behind that in the limb-buds, when compared with an average seqneiice. For this reason, the amnion and allantois, and the number of pairs of somites beyond 22 are of no diagnostic value. We have tried to establish average or “standard” types by comparing a considerable number of embryos in each stage, and we have selected for illustrations those embryos which appeared typical.

During the different phases of development, different characters become prominent, and therefore particularly useful for the diagnosis. F o r the second day of incubation we have adopted the conventional designatioii of embryos accordiiig to numbers of pairs of somites. We have chosen intervals of three somites as “stages”; this makes it possible to designate embryos with intermediate numbers of somites by a + or -. sign. Somites were not counted unless fully formed and completely separated by clefts from the adjacent mesoderm. The first somite was not included in the counts beyond stage 10 when it begins to dwindle away.

During the third day of incubation, or, more precisely, from the stage of 22 somites onward (stage 14), the rapid progress in development of the limbs provides the most con- venient diagnostic criteria. Preliminary work on these stages has been done by Hamburger (’38, ’42) and by Sannders (’48). Our stages 15 to 21 are identical with stages 1 to 7 of these authors. The original work was carefulmly rechecked and detailed descriptions of all characters were added. Stages 8 and 9 of Saunders are combined in o w stage 22;

NORMAL STAGES O F THE C H I C K 53

stage 10 of Saunders is identical with our stage 23. The developmental phase between 4 and 9 days of incubation is characterized by rapid changes in the wings, legs, and visceral arches. From the 8th to the 12th days, feather-germs and eyelids provide the most useful criteria. The designation of stages during the last phase of incubation is difficult because practically no new structures are formed and there is mainly just growth of what already exists. Hence, we have had to make use of measurements of the lengths of the beak and of the toes.

The senior author is responsible for stages 14 to 35 and the junior author for all the others.

A11 illustrations and descriptions are based on material fixed in Bouin's solution or formalin. It is possible that minor distortions have occurred due to differential shrink- age, for instance in the amnion. The embryos used for stages 14 to 35 came from a flock of White Leghorns at St. Louis. They were incubated in a small size Buckeye incubator (for 350 eggs) without forced draft, a t a temperature of 103°F. (ca. 39.4"C.). The embryos used for the other stages were of several breeds (White Leghorn, Barred Plymouth Rock, and R.hode Island Red) from the Iowa State Colcllege Poultry Farm, and were incubated in a forced-draft incubator at a constant temperature of 37.5"C. During the course of this work several hundred embryos have been examined and classified from the second day of incubation until hatching.

We wish to express our great appreciation of the expert advice and help which Dr. Mary E. Rawles, Johns Hopkins University, and Dr. Nelson T. Spratt, University of Minne- sota, have given us in the difficult mafter of selecting stages 1 to 6. Dr. Rawles has generously supplied data on the range of time within which a given stage may usually be obtained, based on records of 700 embryos incubated at 38°C. Her data are included in the text for stages 5-14 and 22. Dr. Spratt has supplied photographs and slides for illustrating

54 V. HAMBURGER A N D R. L. HAMILTON

the pre-somitic stages and has given estimates of incubation- time for stages 2-4.

The photographic work for stages 22 to 35 was done by 111.. L. Pinkers and Nr. D. Bucklin at Washington University, and that for the remaining stages by Mr. John Staby of the Iowa State College Experiment Station. All drawings were made by Nrs. Elsie Herbold Froeschner of Ames, Iowa. Additional assistance was given by Miss Thelma Dunnebacke and Miss Mary Lee Winkler, both of Washington University. We wish to thank all our helpers f o r their efficient and untiring cooper- ation. The work was supported, in part, by a Research Grant of the Rockefeller Foundation to the Department of Zoology of Washington University, and by the Industrial Science Research Institute of Iowa State College.

The description which follows should be used in conjunc- tion with the illrustrations (plates 1-14) which are numbered according to stages.

Slage 1. Pre-Streak: Prior to the appearance of the primitive streak. An “embryonic shield” may be visible, clue to the ac- cnmulation of cells toward the posterior half of the blastoderm. (See Spratt, ’42, pp. 71-72.)

8tage 2. Initial Streak: (‘ ‘ Short-broad beginning-streak” of Spratt, ’42). A rather transitory stage in which the primitive streak first appears as a short, conical thickening, almost as broad as long (0.3-0.5 mm in length), at the posterior border of the pellucid area. Usually obtained after 6-7 hours of incubation.

Slage 3. Intermediate Streak: (12-13 hrs.). The primitive streak extends from the posterior margin to approximately the center of the pellucid area. The streak is relatively broad throughout its length, and is flared out where it touches the opaque area. No primitive groove.

Stage 4. Definitive Streak: (18-19 hrs.). The primitive streak has reached its maximal length (average length = 1.88 mm, Spratt, ’46). The primitive groove, primitive pit, and Hensen’s node are present. The area pellucida has become pear-shaped and the streak extends orer two-thirds to three-fourths of its length.

Stage 5. Head-Process: (19-22 hrs.). The notochord or head- process is visible as a rod of condensed mesoderm extending

NORMAL STAGES O F THE CI-IICR 55

forward from the anterior edge of Hensen’s node. The head-fold has not yet appeared. Since the length of the notochord increases during this stage, it is suggested that the length of the notochord in millimeters be appended to the number of the stage for further precision ( e g , “Stage 5-0.2” would designate a notochordal blastoderm with notochord 0.2 mm in length).

Head-Fold: (23-25 hrs.) . A definite fold of the blastoderm anterior to the notochord now marks the anterior end of the embryo proper. No somites have yet appeared in the mesoderm lateral to the notochord. This is a transitory stage, since the head-fold and the first pair of somites develop rather closely in time.

Stages 7 to 14 are based primarily on the numbers of pairs of somites which are clearly visible. The number of somites appears to be the simplest criterion for staging this phase of development, and i t is sufficiently accurate for practical purposes. A stage is assigned to every third pair of somites which is added; embryos with in- between numbers of somites are designated by adding a + o r - sign to the appropriate stage. Thus, stage 7 designates an embryo with one pair of somites; stage 7 + = two pairs; stage 8 - = three pairs; stage 8 = four pairs; etc. (See plates 2 and 3.) Stage 7. One somite: (23-26 hrs.). This is actually the second

somite of the series; number one is not yet clearly defined. Neural folds are visible in the region of the head.

Stage 8. Pour smaites: (26-29 hrs.). Neural folds meet a t level of midbrain. Blood-islands are present in posterior half of blastoderm.

Stage 9. Reven soinites: ( 2 9 3 3 hrs.). Primary optic vesicles are present.. Paired primordia of heart begin to fuse.

Stage 10. Ten somites: (33-38 hrs.). The first somite is becoming dispersed; i t is not included in the counts for subsequent stages.‘ First indication of cranial flexure. Three primary brain-vesicles are clearly visible. Optic vesicles not constricted at bases. Heart bent slightly to right.

Stage 22. Thirteen sontites: ( 4 0 4 5 hrs.). Slight cranial flexure. Five neuromeres of hindbrain are distinct. Anterior neuropore is closing. Optic vesicles are constricted at bases. Heart bent to right.

fYrfage 6.

I I t is suggested tha t embryos which hare gained one somite beyond Stage 10, bu t have lost s. 1 in the meantime, be designated as Stage 10 5 ; Stage 10 + would then have 11 s., not counting the rudimentary one; stage 11 - = 12 s., not counting the rudimentary one, etc.


Stage 12. S ix teen sonzites: (45-49 hrs.). Head is turning onto left side. Anterior neuropore closed. Telencephalon indicated. Pri- mary optic vesicles and optic stalk well established. Auditory pit is deep, but wide open. Heart is slightly S-shaped. Head- fold of amnion corers entire region of forebrain.

Stage 13. Nineteen somites: (48-52 hrs.). Head is partly to fully turned to the left. Cranial and cervical flexures make broad curves. Distinct enlargement of telencephalon. Slight narrowing of opening to deep auditory pit. No 'indication of hp- pophysis. Atrio-ventricular canal indicated by constriction. Head-fold of amnion covers forebrain, midbrain, and anterior part of hindbrain.

Flexures and iotatiow. Cranial flexure: axes of forebrain and hindbrain form about a right angle. Cervical flexure a broad curve. Rotation of body back as far as somites 7-9. Behind this level, a slight flexure makes its appearance which will be referred to as " trunk-flexure.''

Visceral arches 1 and 2, and clefts 1 and 2 are distinct. Posterior arches not distinct.

Primary optic vesicle begins to invaginate ; lens-placode is formed. Opening of au&tory pit constricted. Rathke's pouch can be recognized. Ventricular loop of heart now ventral to atrio-ventricular canal. Anzm*on extends to somites 7-10.

Beyond stage 14 the number of somites becomes increasingly difficult to determine with accuracy. This is due in par t to the dis- persal of the mesoderm of the anteriormost somites, and, in later stages, to the curvature of the tail. Total somite-counts given for the following stages are typical, but sufficiently variable so as not to be diagnostic. For these reasons, the limb-buds, visceral arches, and other externally visible structures are used as identifying criteria from stage 15 onward. Stage 15. (Hamburger, '38 ; Saunders, '48, stage 1 ; ca. 50-55 hrs.) .

1. Lateral body-folds extend to anterior end of wing-level (somites 15-17).

2. Limb-primordia: prospective limb-areas flat, not yet demarcated. Inconspicuous condensation of mesoderm in wing-level.

3. Sovnites: 24-27. 4. A m n i o n extends to somites 7-14. 5. Flexures and rotation. Cranial flexure: axes of forebrain

and hindbrain form a n acute angle. The ventral contours of forebrain and hindbrain are nearly parallel. Cervical flexure

Stage 14. Twenty- two somifes: (50-53 hrs.).

NORMAL STAGES OF THE CHICK 5T

a broad curve. The trunk is distinct. Rotation extends to somites 11 to 13.

6. Visoeral arches: Visceral arch 3 and cleft 3 are distinct. The latter is shorter than cleft 2 and usually oral in shape.

7. E y e : Optic cup is completely formed; double contour distinct in region of iris.

Stage If?. 1. Lateral body-folds extend to somites 17-20, between levels

of wings and legs. 2. Limbs. Wing is lifted off blastoderm by infolding of lateral

body-fold. It is represented by a thickened ridge. Primordinm of leg is still flat; represented by a condensation of mesoderm.

(Hamburger-Saunders stage 2 ; ca. 51-56 hrs.).

3. Somites: 26-28. 4. Amnion extends to somites 10-18. 5. Flexures and rotattion: All flexures are more accentuated

6. Tail-bud a short, straight cone, delimited from blastoderni. 7. Visceral arches: Third cleft still oval in shape. 8. Forebraifi lengthened ; constrictions between brain-parts are

than in stage 15. Rotation extends to somites 14-15.

deepened. Epiphys is indistinct or not yet formed. Stage 17. (Hamburger-Saunders stage 3 ; ca. 52-61 hrs.).

1. Lateral body-folds extend around the entire circumference of the body.

2. Limb-buds: both wing- and leg-buds lifted off blastoderin by infolding of the body-folds. Both are distinct swellings of approximately equal size (see plate 5).

3. Xomites: 29-32. 4. Amnion: Considerable vasiability, ranging from a condition

in which posterior trunk and tail, from approximately somite 26, are uncovered, to complete closure except for an o ra l hole over somites 28-36. Intermediate stages with an anterior fold covering as fa r back as somite 25 and a posterior fold covering part of the tail are common.

5. Flexures aind rotation: Cranial flexure is unchanged. Cer- vical flexure is more sharply bent than in preceding stages, but its angle is still larger than 90". Trunk-flexure is distinct in brachial level. Rotation extends to somites 17-18.

6. Tail-bud bent ventrad. I ts mesoderm unsegmented. 7. Epiphysis: a distinct knob. Indication of nasal pits. 8. Allantois: not yet formed.


Ptagp 18. 1.

(Hamburger-Saunders stage 4 ; ca. 65-69 hrs.) . Limb-buds enlarged ; leg-buds slightly larger than wing-buds

(see plates 4 and 5 ) . L/W of wing = 6 or < 6 (L = length = anterior-posterior dimension as measured along the body-wall ; W = width = distance from body-wall to apex; see stage 20, plate 5).

2. 3.

4.

Somites: 30-36; extend beyond level of leg-bud. Amnion: Usually closed ; occasionally an oval hole in lumbar

region. Flexures a.nd rodation: At the cervical flexure, the axis of

the medulla forms approximately a right angle to the axis of the posterior trunk. The trunk-flexure has shifted to the lumbar region. The rotation extends now to the posterior part of the body ; hence, the leg-buds are no longer in the horizontal plane.

-5. The tail-bud is turned to the right, a t about an angle of 90" to the axis of the posterior trunk.

6. Visceral arches: Maxillary process absent or inconspicuous. Fourth visceral cleft in'distinct or absent.

7. Allantois: A short, thick-walled pocket ; not yet vesicular.

1. Limb-buds : Enlarged, symmetrical. Leg-buds slightly larger and bulkier than wing-buds (see plate 5). L/W of wing-

Sonaites: 3 7 4 0 ; extend into tail; but the end of the tail which is directed forward is unsegmented.

Flexures and rotation: I n the cervical flexure the axis of the medulla forms an acute angle with the axis of the trunk. The trunk-flexure has nearly or entirely disappeared due to the rotation of the entire body. The contour of the posterior part of the trunk is straight to the base of the tail.

Stage 19. (Hamburger-Saunders stage 5 ; ca. 68-72 hrs.).

buds = 4-6. 2.

3.

4. 5 .

Tail-bud curved, its tip pointing forward. Visceral arches: The maxillary process is a distinct swelling

of approximately the same length as the mandibular process. The first visceral cleft is an open narrow slit a t its dorsal part. It continues into a shallow furrow. The second arch projects slightly over the surface. The 4th cleft is a fairly distinct slit a t its dorsal par t and continues ventrally as a shallow groove. It docs not perforate into the pharynx as a true (open) cleft, but is, nevertheless, homologous to the other three clefts.

Alluntois: A small pocket of variable size ; not yet vesicular. 6. 7. E y e s nnpigmented.

XORMAL STAGES O F THE C H I C K 59

Singe 20. 1.

(Hamburger-Saunders stage 6 ; ca. 70-72 hrs.) Linzb-buds enlarged ; leg-buds are ~distiiictly larger from n o ~ v

on than wing-buds. The wing-buds are still approximately symmetrical ; the leg-buds are slightly asymmetrical (see plate 5 ) . L/W of wing = 3 4 . 9 ; L/W of leg = 3-2.3.

2. 3. Plexures and rotatiort : Cervical flexure more accentuated

than in stage 19. The bend in the tail-region begins to extend forward into the lumbo-sacral region. Contour of mid-trunk a straight line. Rotation completed.

4. Visceral arches: Maxillary process distinct, equals or ex- ceeds the mandibular process in length. Second arch projects over surface. Fourth arch less prominent and smaller than third arch. Fourth cleft shorter than third cleft; a narrow slit a t its dorsal part, continuing into a shallow groove.

5 . Allantois: Vesicular, variable in size; on the average of the size of the midbrain.

6. Eye-p igment . A faint grayish hue.

1. Limbs: Enlarged; both wing- and leg-buds are slightly asymmetrical ; their proxiino-distal axes are directed caudad, and the apex of the bud lies posterior to the midline bisecting the base of the bncl. The posterior contours of wing- and leg-buds are steeper than the anterior contours; they meet the baseline a t an angle of approximately 90". L/W of wing = 2.3-2.7 ; L/W of leg = 2.0-2.5.

Somites: 40-43 ; tip of tail still unsegmented.

Stage 21. (Saunders stage 7 ; ca. 3fr days).

2. 3.

Somites: 43-44; extreme tip of tail unsegmented. Flexures: The posterior curvature includes the lumbo-sacral

region. The dorsal contour of the trunk is straight or slightly bent.

Visceral arches: Maxillary process is definitely longer than mandibular process, extending approximately to the middle of the eye. The second arch extends distinctly over the surface and overlaps the third arch ventrally. Fourth arch distinot; 4th cleft visible as a slit.

Allantois: Variable, usually larger than in stage 20; may extend to head.

4.

3.

6. E y e p i g m e n t a t i o n : Faint. (Saunders stages 8 and 9 combined; ca. 34 days).

1. Limbs : Elongated buds, pointing caudad. The anterior and posterior contours are neasly parallel a t their bases (see plate 7). L/W of wing = 1.5-2; IJ/W of leg = 1.3-1.8.

Stage 22.

60 V. HAMBURGER AND I€. L. HAMILTON

2 . Sonaites: Extend to tip of tail. 3. Flexures: Little change. The dorsal contour of the trunk is

a straight line or curved. 4. Visceral arches: Little change compared with stage 21.

Maxillary process enlarged; 4th cleft distinct as a slit. 5. Allarttois: Variable in size; extends to head and may overlap

the forebrain. 6. Eye-pignienta’tion : Distinct.

1. Stage 23. (Saunders stage 10 ; ca. 3 4 4 days).

Limbs: Longer than in stage 22; particularly the proximal parts in which anterior and posterior contours run parallel are lengthened ; otherwise, little change in shape. Both wing- and leg-buds apprpximately as long as they are wide.

Visceral arches (see plates 7 and 8) : Maxillary process is lengthened further. The first visceral cleft is represented by a broken line. I ts dorsal part is a distinct slit. A slight protuberance ( “a ”) is iioticeable anterior to the dorsal slit. The caudal part of the second arch is distinctly elevated over the surface. Arches 3 and 4 are still completely exposed. Visceral cleft 3 is a distinct groove, and cleft 4 is reduced to a narrow oval pit at its dorsal end.

3. Flexures: The dorsal contour from hindbrain to tail is a curved line.

Stage 24. (ca. 4 days).

2.

1. Limbs : Wing- and leg-buds distinctly longer than wide. Digital plate in wing not yet demarcated. Toe-plate in leg-bud distinct. Toes not yet demarcated.

Visceral arches (see plates 7 and 8) : First visceral cleft a distinct curved line. Slight indication of two protuberances (‘ ‘ a, ” ‘ ‘ b ”) on mandibular process and of three protuberances (“d,” “e,” “ f ” ) on second arch. Part “ c ” of rr-andibular process is receding. Second arch longer ventrally (at “ f ”) and much wider than mandibular process. Third arch reduced and partly overgrown by second arch; 4th arch flattened. Both are sunk beneath the surface. Thind visceral cleft is an elongated groove. Fourth visceral cleft reduced to a small pit.

2.

Stage 25. (ca. 44 days). 1. Limbs: Elbow and knee-joints distinct (in dorsal or ventral

view). Digital plate in wing distinct, but no demarcation of digits. Indication of faint grooves demarcating the third toe on leg.

Visceral arches (see plates 7 and 8) : Maxillary process lengthened; it meets the wall of the nasal groove (notice the notch at

2.

NORMAL STAGES OF THE CHICK 61

point of fusion). Three protuberances on each side of first ris- ceral cleft (“a” to “ f ” ) . I n dorsal view, “a , ” “b,” and “ d ” appear as round knobs, and “c” as a flat ridge. Par t “ f ” is conspicuous and projects distinctly over the surface. It will be referred to as the “collar.” Dorsal par t of third arch still visible. Third and 4th visceral clefts reduced to small circular pits.

Stage 26. (ca. 44-5 days). I. Limbs: Considerably lengthened. Contour of digital plate

rounded. Indication of faint groove between second and third digit. Demarcation of the first three toes distinct.

Visceral arches (see plates 8 and 9) : Contour of maxillary process a broken line. Mandibular process lengthened ventrally. Protuberances “ a ” and “ b ” project over the surface. The middle protuberance (“b”) is subdivided by a shallow groore. A small knob is distinct a t the dorsal edge of “c.” On the second arch, protuberances “d” and “e” are only slightly elevated over the surfaoe. The “collarff (“f”) has broadened and overgrown visceral arches I11 and IV. A deep groove separates “ f ” from “c.” The two pits represent,ing the 3rd and 4th visceral clefts are no longer visible.

2.

Stage 27. (ca. 5 days). 1. Limbs: Contour of digital plate angular in region of first

digit. Grooves between first, second, and third digits indicated. G m v e s between toes are distinct on outer and inner surfaces of toe-plate. First toe projects over the tibia1 par t a t an obtuse angle. Tip of third toe not yet pointed.

Visceral arches (see plates 8 and 9 ) : Contour of maxillarj- process is a curved, broken line. Mandibular process has broadened ventrally (at “c”) and grown forward. Protuberances “ a ” and “ b ” project over the surface. Parts “d” and “e” are flat. Protuberances “ b ” and “e” are close to fusion, but a separating line is still distinct. The ‘( collar’ ’ (‘ ‘ f ”) has broadened and continued its growth backward. It rises conspicuouslp above the surface. The groove between “c” and “ f ” has widened.

2.

3. Beak: Barely recognizable.

1. Stage 28. (ca. 54 days).

Limbs: Second digit and third toe longer than others, which gives the digital and toe-plates a pointed contour. Three digits and 4 toes distinct. No indication of 5th toe.

Visceral arches (see plates 8 and 9 ) : Protuberance “ a ” still projects over the surface. Mandibular process has lengthened

2.


and grown forward. Parts “ b ” and “e” have fused; a fine suture line is occasionally still visible. Parts “b,” “d , ” and “el’ no longer project above the surface. External auditory opening is now very distinct between “a,” “b,” and “d.” “ Collar ’’ (‘ ‘ f ”) projects distinctly over the surface. The neck between “collar ” and mandible has lmgthened.

Beak: A distinct outgrowth is visible in profile. 3. Stage 29. (na. 6 days).

1. Limbs: Wing bent in elbow. Second digit distinctly longer than the others. Shallow grooves between first, second, and third digits. Second to 4t;h toes stand out as ridges separated by distinct grooves, and u-ith indications of webs betxeen them. Distal contours of W ~ J S are straight lines, occasionally with indication of convexity. Rudiment of 5th toe visible.

2. Visceral arches : Mandibular process lengthened (compare with stage 28). Mandibular process and second arch are broadly fused. Auditory meatus distinct at dorsal end of fusion. All protuberaiices have flattened. Neck between “collar” and mandibular process has lengthened. “Collar” stands out conspiouously.

3. Beak: More prominent than in stage 28. No egg-tooth visible as yet.

Stage 30. (ca. 63 days). 1. Limbs: The three major segments of wing and leg are

clearly demarcated. Wing bent in elbow-joint. Leg bent in knee-joint. Distinct grooves between first and second digits. Contours of webs between first two digits and between all toes are slightly curved concave lines.

2. Visceral arches: The mandibular process approaches the beak, but the gap between the two is still conspicuous. Lengthening of neck between “collar” and mandible is very conspicuous. ‘‘ Collar’’ begins to flatten.

Peather-gemas: Two dorsal rows to either side of the spinal cord a t the brachial level. Three rows a t the level of the legs; they are rather indistinct at thoracic level. None on thigh.

4. Scleral papillae: One on either side of choroid fissure; some- times indistinct but never more than two.

5 . Egg- tooth distinct, slightly protruding. Beak more pro- nounced than in previous stage.

3.

Stage 31. (ca . 7 days). 1. Limbs: Indication of a web between first and second digits.

Rudiment of 5th toe still distinct.

NORMAL STAGES OF T H E CHICK 63

2.

3.

Visceral a.rohes: The gap between mandible and beak has narrowed to a small notch. “Collar ” inconspicuous or absent.

Peather-germs: On dorsal surface, continuous from brachial to lumbo-sacral level. Approximately 7 rows at hxmbo-sacral level. Distinct feather papillae on thigh. One indistinct row on each lateral edge of the tail.

S c l e r d papdlae: Usually 6 ; 4 on the dorsal side near the choroid fissure, and two on the opposite side.

4.

Stage 32. (ca. 79 days). 1. Limbs: All digits and 4 toes have lengthened conspicuously.

Rudiment of 5th toe has disappeared. Webs between digits and toes are thin and their contours are concave. Differences in size of individual digits and toes become conspicuous.

Visceral arches: Anterior tip of mandible has reached the beak. “Collar’ ’ has disappeared or is faintly recognizable.

Peather-germs: Eleven rows o r more on dorsal surface a t level of the legs. One row on tail distinct, second row in- Idistinct. Scapular and flight feather-germs barely perceptible a t optimal illumination or absent.

S c l e r d p a p i h e : Six to 8, in two groups; one group on dorsal and one on ventral side. Circle not yet closed.

2.

3.

4.

Stage 33. (ca, 79-8 days). 1.

2.

Limbs: Web on radial margin of arm and first digit becomes discernible. All digits and toes lengthened.

Visceral arches: Mandible and neck have lengthened conspicuously. (Compare the ventral contour of body, from heart- region, along neck to tip of mandible, in this and the preceding stages.)

Peather-germs: Scapular and flight feather-germs not much advanced over stage 32. Tail: three rows distinct, the middle row considerably larger than the others.

4. Scleral papillae: Thirteen, forming an almost complete circle, with gap for one missing papilla a t a ventral point near the middle of the jaw.

3.

Stage 34. (cu. 8 (days). 1. Liwbs: Differential growth of second digit and third toe

conspicuous. Contours of webs between digits and toes are concave and arched.

Visceral arches: Lengthening of mandible and of neck continues (see previous stage).

Peather-germs: On scapula, on ventral side of neck, on pro- coracoid, and posterior (flight) edge of wing, feather-germs are visible under good illumination. Feather-germs next to

2.

3.


dorsal midline, particularly a t lumbo-sacral level, extend slightly over surface when viewed in profile. Feather-germs on thigh protrude conspicuously. One row on inner side of each eye. None around umbilioal cord.

4. 5.

Scleral papillae: Thirteen or 14. Nictitating membrane extends halfway between outer rim

of eye (eyelid) and scleral papillae. Stage 35. (ca. 8-9 days).

1. Limbs: Webs between digits and toes become inconspicuous. A transitory protuberance on the ulnar side of the second digit is probably a remnant of the web. Phalanges in toes are distinct.

2. Visceral arches: Lengthening of beak continues. Compare the distance between the eye and the tip of the beak, in this and the preceding stages.

3. Feather-germs: All are more conspicuous. Mid-dorsal line stands out distinctly in profile view. At least 4 rows on inner side of each eye. New appearance of feather-germs near mid- ventral line, cJose to sternum, and extending to both sides of umbilical cord.

4. Nictitating membrane has grown conspicuously and approaches the outer scleral papillae. Eyelids (external to nictitating membrane) have extended towards the beak and have begun to overgrow the eye-ball. The circumference of the eyelids has become ellipsoidal.

Xtage 36. (cal. 10 days). 1. Limbs: Distal segments of both wing and leg are proportion-

ately much longer. Length of third toe, from its tip to the middle of its metatarsal joint = 5.4 0.3 mm. Tapering primordia of claws are just visible on termini of the toes and on digit, 1 of the wing. Protuberance on posterior side of digit 2 of wing is missing.

Visceral arches: Primordium of the comb appears as a prominent ridge with slightly serrated edge along the dorsal midline of the beak. A horizontal groove (the “labial groove”) is clearly visible a t the tip of the upper jaw, but is barely indicated on the tip of the mandible. Nostril has narrowed to a slit. Length of beak from anterior angle of nostril to tip of bill = 2.5 mm.

Feather-gernas: Flight-feathers are conspicuous ; coverts are just visible in web of wing. Feather-germs now cover the tibio- fibular portion of the leg. A t least 9-10 rows of feather-germs between each upper eyelid and the dorsal midline. Sternal tracts prominent, with 3 4 rows on each side of ventral mid-

2.

3.

NORMAL STAGES O F THE C H I C K 65

line when counted in anterior part of sternum, merging into many rows around the umbilicus.

4. Eyelids : Nictitating membrane covers anteriormost scleral papillae and approaches cornea. Lower lid has grown upward to level of cornea. Circumference of lids is a narrowing ellipse with its ventral edge flattened.

Stage 37. (ca. 11 days). 1. Limbs: Claws of toes are flattened laterally and curved ven-

trally ; dorsal tips are opaque, indicating onset of cornification. Tip of claw on wing is also opaque. Pads on plantar surface of foot are conspicuous. Transverse ridges along t,he superior surfaoes of the metatarsus and phalanges are first indication of scales. Length of third toe = 7.4 0.3 mm.

Visceral arches: Labial groove on mandible is now clearly marked off. The comb is more prominent and clearly serrated. Length of beak from anterior angle of nostril to t ip of bill = 3.0 mm.

Feather-germs: Much more numerous, and in most-advanced tracts (e.g., along back and on tail) elongated into long, much-tapered cones. External auditory meatus is nearly surrounded by feather-germs. Circumference of eyelids is bor- dered by a single row of just-visible primordia; none on remainder of lids. Sternal tracts contain 5-6 prominent rows when counted a t anterior end of sternum.

4. Eyelids: Nictitating membrane has reached anterior edge of cornea. Upper lid has reached dorsal edge of cornea. Lower lisd has covered one-third to one-half of cornea. Circumference of lids now bounds a much-narrowed and ventrally-flattened biconvex area.

2.

3.

Stage 38. (ca. 12 days). 1. Limbs: Primordia of scales are marked off over entire sur-

face of leg; ridges have not yet grown out t o overlap surface. Tips of toes show a ventral center of cornification as well as the more extensive dorsal one. Main plantar pad is ridged when seen in profile. Length of third toe = 8.4 & 0.3 mni.

Visceral arches: Labial groove marked off by a deep furrow at the end of each jaw. Length of beak from anterior angle of nostril to tip of bill = 3.1 mm.

Feather-gernas: Coverts of: web of wing are becoming conical. External auditory meat.us is surrounded by feather-germs. Sternum is coi7ered with feather-germs except along midline. TJpper eyelid is covered with newly-formed feather-germs ; lower lid is naked except for 2-3 rows a t its edge.

2.

3.

66 V. HAMBURGER AND €1. L. HAMILTOK

4. Eyelids: Lower lid covers tw-0-thirds to three-fourths of cornea.. Opening between lids is much reduced.

Stage 39. (ca . 13 days). 1. Limbs: Scales overlapping on superior surface of leg. Major

pads of phalanges covered with papillae ; minor pads are smooth. Length of third toe = 9.8 k 0.3 mm.

2 . Visceral a.rches: Mandible and maxilla cornified (opaque) back as far as level of proximal edge of “egg-tooth.” The ohannel of the auditory meatus can be seen only a t the posterior edge of its shallow external opening. Length of beak from anterior angle of nostril to tip of bill = 3.5 mm.

Feather-germs: Coverts of web of wing are very long tapering cones. Note great increase in length of feather-germs in major tracts. Four to 5 rows of feather-germs a t edge of lower eyelid.

4. EyeZids: Opening between licls reduced t o a thin crescent. Stages 40 to 44 are based mainly on the length of the beak and on

the length of the third (longest) toe, since other external features have lost their diagnostic value. Of these two criteria, the length of the beak is the better, because it is more easily and accurately measured (with calipers) and shows less variability. &age 40. (ca. 14 days).

3.

1. Visceral arches: Length of beak from anterior edge of nostril t o tip of bill = 4.0 mm. The main channel of the auditory meatus is not visible in strictly lateral view of its external chamber.

Limbs : Length of third toe = 12.7 k 0.5 mm. Scales overlapping on inferior as well as superior surfaces of leg. Dorsal and ventral loci of cornification extend to base of exposed portion of toe-nail. Entire plantar surface of phalanges is covered with well-developed papillae.


bill = 4.5 mm.

2.

1.

2.

1.

2 .

1.

Beak: Length from anterior angle of nostril to tip of upper

T h i r d toe: Length = 14.9 t 0.8 mm.

Beak: Length from anterior angle of nostril to tip of upper

T h i r d toe: Length = 16.7 t 0 . 8 nim.

Beak: Length from anterior angle of nostril to tip of upper bill = 5.0 mm. “Labial grooves” are reduced to a white gran- ular crust a t the edge of each jaw; that of the lower jaw may be partially or completely sloughed off.

&age 42. (ca. 16 days).

bill = 4.8 mm.


NORMAL STAGES OF T H E CHICK 6T

2.

1.

T h i r d toe: Length =18.6 & 0.8 mm.

Beak: Length from anterior angle of nostril to tip of upper bill = 5.7 mm. The translucent peridermal covering of the beak is starting to peel off proximally.

Thi rd toe: Length = 20.4 r+ 0.8 mm.

Beak: Length is no longer diagnostic; in fact, the beak is usually shorter than in stage 44, due to a loss (by sloughing off) of its entire peridermal covering. As a consequence, the beak is now shiny all over and more blunt a t its tip. Both labial grooves have disappeared with the periderm.

2. T h i r d toe: Average length is essentially unchanged from that of stage 44, except in those breeds with a longer period of incubation (21 days) and a heavier build of body. For these latter, length of third toe = ca. 21.4 & 0.8 mm.

3. Extra-embryonic membranes: Yolk-sac is half-enclosed in body-cavity. Chorio-allantoic membrane contains less blood and is “sticky” in the living embryo.


2.

1. Stage 45. (ca. 19-20 days).

Stage 46. Newly-hatched chick (20-21 days).

REFERENCES

DUVAL, MATHIAS 1889 Atlas d’Embryologie. (116 pp., 40 plates). Paris. HAMBURGER, VIKTOR 1938 Morphogenetic and axial self-differentiation of

transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. J . Exp. Zool., 77: 379-399.

1942 A Manual of Experimental Embryology. 213 pp. Univerbity of Chicago Press.

KEIBEL, F., AND K. ABRAHAM 1900 Normentafel zur Entwicklungsgeschichte des Huhnes (Gallus domesticus). 132 pp. Jena.

SPRATT, NELSON T., JR. Location of organ-specific regions and their re- lationship to the development of the primitive streak in the early chick blastoderm. J. Exp. Zool., 89: 69-101. -, 1946 Formation of the primitive streak in the explanted chick

blastoderm marked with carbon particles.. J. Exp. Zool., 203: 259- 304.

SAUNDERS, JOHN W., JR. 1948 The proximo-distal sequence of origin of the parts of the chick wing and the role of the ectoderm. J. Exp. Zool., 108: 363-403.

1942

EXPLANATION O F PLATES

All numbers in the following plates refer to the corresponding stage numbers in the text. The description of each stage should be consulted for a more complete explanation of the figures.

PLATE 1

EXPLANBTION OF FIGURES

Stages 1-3+, illustrated by photographs provided by Dr. Nelson T. Spratt, Jr. (Stages 1 and 2 are published in J. Exp. Zool., 203: 265 and 274.) X 20.

68

NORMAL STAGES O F TIIE CHICK V. HA.\IBUROER .4SD H. L. HAAIILTOS

A9

PLATE 2

EXPLANATION O F FIGURES

Stages 4-9, x 20. Stage 10, x 12. (Stages 4, .5, and 8- were photographed froin slides provided by Dr. Nelson T. Spratt , J r . All others are f rom the Iowa State College collection.)

71

PLATE 2

72

PLATE 3

EXPLANATION OF FIGURES

Stages 11-14, x 12.

74

1’LATE 4

EXPLANAIION OF FIGUEES

Stages 15-18, X 12. Contours of limbs f o r stages 1 7 and 18 are shown in the drawings on plate 5.

76

NORMAL STAGES O F THE CHICK V. HAMBURGER AND H. L. HAMILTOX

77

NORMAL STAGES O F THE CHICK V. HAIIBCR(:ER .4SD H . 12. H.4ZIlLTOI\'

"i) .:.. . .... ... .\:

.... . ; t . . :: ..': ... .... ...

STAGE 17

WINGS

LEGS

WINGS ..... . .

..... ... LEGS

STAGE 18

STAGE 19 STAGE 20

PLATE 5

Drawings of the contours of the riglit limbs of stages 1i-20, ca. x 10. In stage 20 the dottetl lines indicate the leyels at nliicli tlie length (Li and \vitltli (W) are inensured (see text, stages 18-22).

Stages 19-21 (cleared eiiiltrjos), x 12. Stage 2 1 (opaque) , X 8, \\.it11 contours of linibs slioivn in the dm\viiigs below, cu. x 12.

PLATE i

ESPLASATION OF FIGURES

Stages 22-33, X 8. The liinhs for stage 2 2 are drawings, ca. x 12; all others are pliotogrnplis, X 8. For details of Tisrernl arches of stnges 23-25, see plate 8.

80

NORMAL ST-4GES OF THE CHICK V. HAMBURGER AND H . L. HAXILTON

PLATE 7

81

NORMAL STAGES OF THE C I I I C K Y . H A X B U R G R R A S D 11. 11. II .ZMILTOS

I'IATE 8

STAGE 23 STAGE 24

STAGE 25 STAGE 26

STAGE 27 STAGE 28 E-X-L-

Drawings of the rvgioii of the visceral arclies, made from camern 1ucid:i tracings. Stages 23-23, x T. Stages z(i-28, X 4.2. I-IV = visceral arches; nix., iiid. = i i ins i l ln r~ and nianclibu- lar processes of riscer.:rl arch I ; 4 = 4th visceral cleft. See test for ex1)l:iii:itioii of letters n-f.

NORlIAL ST.\GES OF TIIE C H I C K 1'. HAXI3URGER A N D H. 1,. HABIILTON

Stage 26, e m b r ~ o and limhs, X 5. Stages 2T-28, X 3 . 83

PLATE 10

ESPLAKATION OF F I G U R E S

Stages 29-30, x 5. Stages 31-32, X 4.

84

SORN.11, STAGES OF TIIE CHICK V. HAXUL‘RGER A S U H. L. IIAXILTON

I’L.iTE 10

m oa

PLATE 11

ESPLASATION OF FIGURES

Stages 33-33, x 4.

N@

RM

dL

ST

dGE

S O

F T

HE

CH

ICK

V. H

AM

BU

RG

ER

.4N

D H

. L

. H

AM

ILT

OX

PL

AT

E 1

1

NOR31A1, STAGES O F THE CHICK V. H A Y R U K ( . K R A S U H. L. HAMILTON

Stages 36-39, x 2. 89

SORM-iL STAGES O F THE: CHICK V. H.43IUURUER 9 S I ) H. L. l IA3IILTON

I’I,.\TK 13

NORMAL S

TA

GE

S O

F T

HE

CH

ICK

V. H

AM

BU

RG

ER

AN

D H

. L. H

AM

ILT

ON

PLATE 14

Sta

ges 44

45,

x 16.

embriÃo de galinha -...

Documents