ELETROFORESEELETROFORESE

Técnica de separação de partículas através de Técnica de separação de partículas através de corrente elétricacorrente elétrica

1-Identificação de substâncias1-Identificação de substâncias

2-Homogeneidade de sistemas biológicos2-Homogeneidade de sistemas biológicos

3-Determinação de pontos isoelétricos 3-Determinação de pontos isoelétricos

Pólo -

Pólo +

ELETROFORESE LIVREELETROFORESE LIVRE Arne Tiselus- Premio Nobel em 1948Arne Tiselus- Premio Nobel em 1948

Este método de solução livre, era bastante limitado devido á perturbações:

-ondas mecânicas -movimentos de convecção do líquido pelo aquecimento da solução causado pela aplicação da diferença de potencial

Perturbações fazem com que a eletroforese se torne processo muito pouco reprodutível , com as cargas de mesma natureza não migrando juntas, mas sim, dispersas.

Métodos para minimizar Métodos para minimizar estes problemas:estes problemas:

1-1-MATRIZES RÍGIDAS- SUPORTESMATRIZES RÍGIDAS- SUPORTES

papel de filtro, sílica gel, membranas de acetatopapel de filtro, sílica gel, membranas de acetato

de celulose, gel de agarose, amido oude celulose, gel de agarose, amido ou

poliacrilamida, entre outros.poliacrilamida, entre outros.

A eletroforese que utiliza suporte é também A eletroforese que utiliza suporte é também

conhecida como eletroforese de zona:conhecida como eletroforese de zona:

Iniciada por König em 1937 na separação de Iniciada por König em 1937 na separação de veneno de cobra recorrendo a papel de filtro veneno de cobra recorrendo a papel de filtro como meio-suporte, em 1946, Martin retomou como meio-suporte, em 1946, Martin retomou esta eletroforese. esta eletroforese.

.

Dependendo do suporte que utilizamos para a Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das macromoléculas, eletroforese e da natureza das macromoléculas, podemos separá-las: podemos separá-las:

1- com base na carga 1- com base na carga

2- com base em seu tamanho 2- com base em seu tamanho

Os suportes em gel apresentam grande Os suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as moléculas com base no capacidade de separar as moléculas com base no

tamanho molartamanho molar

Eletroforese em suporte de papel é muito Eletroforese em suporte de papel é muito eficiente no que diz respeito a separação de eficiente no que diz respeito a separação de partículas com grande diferenças de cargaspartículas com grande diferenças de cargas

Substâncias anfóteras indispensável manter Substâncias anfóteras indispensável manter constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo

uso de soluções-tampãouso de soluções-tampão..

Os principais tipos de eletroforese são: 1- Eletroforese capilar 2- Eletroforese em gel

ELETROFORESE EM GELELETROFORESE EM GEL

1.Separar partículas por diferença de 1.Separar partículas por diferença de carga e massacarga e massa

2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre 2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre o gelo gel

3.Isolar DNA RNA e proteínas3.Isolar DNA RNA e proteínas

Eletroforese em gel de Eletroforese em gel de agaroseagarose

1-Gel gelitificado de agarose1-Gel gelitificado de agarose

2-Separa fragmentos longos de DNA2-Separa fragmentos longos de DNA

3-Corrente elétrica sobre gel3-Corrente elétrica sobre gel

4-Partículas menores tem maior velocidade de 4-Partículas menores tem maior velocidade de chegar ate o pólo positivochegar ate o pólo positivo

Eletroforese em gel de Eletroforese em gel de policrilamidapolicrilamida

1-Fragmentos pequenos de DNA ou outra 1-Fragmentos pequenos de DNA ou outra moleculamolecula

2-Recupera e purifica amostras2-Recupera e purifica amostras

3-Em cubas de vidros3-Em cubas de vidros

4-Aplicacao de corrente4-Aplicacao de corrente

O gel de policrilamida pode O gel de policrilamida pode ser:ser:

1-Desnaturante : com presenca de 1-Desnaturante : com presenca de ureia, separa e purifica fitas simplesureia, separa e purifica fitas simples

2-Não desnaturante : separa e purifica 2-Não desnaturante : separa e purifica fitas duplas, sem presenca de ureiafitas duplas, sem presenca de ureia

ELETROFORESE CAPILAR EM ELETROFORESE CAPILAR EM ZONA OU EM SOLUÇÂO ZONA OU EM SOLUÇÂO

LIVRELIVRE

1- A ELETROFORESE CAILAR DE ZONA OU SOLUÇÂO LIVRE é o modo mais utilizado devido à simplicidade do equipamento e maior facilidade na otimização das condições experimentais.

2- o capilar e os reservatórios contendo os eletrodos são cheios com um tampão (denominado

eletrólito carreador), o qual conduz a corrente elétrica e fornece a capacidade

tamponante.

3-se introduz uma amostra contendo uma mistura iônica no capilar como uma banda de pequena espessura

4-Quando o campo elétrico é aplicado, forças elétricas atuam nas cargas da camada difusa.

5-os íons arrastam moléculas de água, formando um fluxo que é direcionado para o catodo, enquanto a parede do capilar permanecer negativa.

                                                                                                                             1-Para decifrar o código genético humano, os cientistas do Projeto Genoma tiveram de enfrentar a enorme tarefa de localizar as dezenas de milhares de genes que se encontram no DNA humano e em seguida fazer o seqüenciamento dos cerca de 3 bilhões de pares de bases contidas nos cromosomas

Eletroforese Capilar no Seqüenciamento Automático de DNA

2-Com a tecnologia normalmente usada no início dos anos 90, essa tarefa levaria bem mais de10 anos, com o custo de alguns bilhões de dólares. Foi o desenvolvimento da técnica de eletroforese capilar, combinada ao uso de radiação laser, que permitiu acelerar o processo, uma vez que essa técnica potencialmente é de 50 a 100 vezes mais rápida que o método tradicional.

3-A técnica tradicional para seqüenciamento de DNA é o método de Sanger, desenvolvida por Frederick Sanger, um dos ganhadores do prêmio Nobel de Química de 1980. Esse método utiliza enzimas especiais para sintetizar fragmentos de DNA que terminam quando uma determinada base (adenina, citosina, guanina ou timina) aparece ao longo da seqüência.

Na análise STR, os examinadores devem: 1.extrair o DNA das células da amostra quantificar o DNA

2. transformar o DNA utilizando a ténica de PCR

3. utilizar eletroforese capilar para extrair o DNA transformado

CURIOSIDADE:

4-A análise via Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica mais recente que pode transformar o DNA em uma amostra bem menor.

5-O banco de dados CODIS do FBI utiliza amostras que passaram pela análise STR examinando 13 locais. A probabilidade de duas pessoas possuírem perfis STR de 13-loci idênticos é de cerca de uma em um bilhão.

Eletroforese Capilar em Gel Eletroforese Capilar em Gel (ECG)(ECG)

1- Utilizada exclusivamente para separação de 1- Utilizada exclusivamente para separação de macromoléculasmacromoléculas

2- Quando a razão carga/raio dos analitos é tão 2- Quando a razão carga/raio dos analitos é tão próxima, que não é possível separá-los com o próxima, que não é possível separá-los com o uso da eletroforese de zona tradicional. uso da eletroforese de zona tradicional.

3- Íons menores migram mais rapidamente 3- Íons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores ficam mais tempo enquanto que solutos maiores ficam mais tempo retidosretidos..

Princípio da Eletroforese Princípio da Eletroforese Capilar em GelCapilar em Gel

4- 4- Teve início com a utilização de colunas Teve início com a utilização de colunas preenchidas com géis químicos.preenchidas com géis químicos.

5- Esse método foi descartado dado o grande 5- Esse método foi descartado dado o grande número de problemas que surgiram,como:número de problemas que surgiram,como:

- aparecimento de bolhas (perda de - aparecimento de bolhas (perda de condutividade),condutividade),

- retenção de fragmentos com alto peso molecular,- retenção de fragmentos com alto peso molecular,

- degradação do gel por hidrólise- degradação do gel por hidrólise. .

6- 6- Tais problemas levaram à formulação de novos Tais problemas levaram à formulação de novos sistemas, denominados géis físicos.sistemas, denominados géis físicos.

7- Géis físicos: matrizes poliméricas hidrofílicas, 7- Géis físicos: matrizes poliméricas hidrofílicas, dissolvidas em tampão apropriadodissolvidas em tampão apropriado

-eliminar o fluxo eletroosmótico através de uma -eliminar o fluxo eletroosmótico através de uma ligação covalente com os grupos da superfície ligação covalente com os grupos da superfície capilar capilar

-evitar a extrusão do gel durante operação do -evitar a extrusão do gel durante operação do sistema, através da ligação covalente com o gel sistema, através da ligação covalente com o gel

8- 8- Os géis são estruturas delicadas, sujeitas a Os géis são estruturas delicadas, sujeitas a mudanças de morfologia pela ação damudanças de morfologia pela ação da

temperaturatemperatura pHpH força iônica força iônica concentração do meio. concentração do meio.

9- 9- Uma das principais vantagens de realizar Uma das principais vantagens de realizar separações por ECG é que o formato do capilar, separações por ECG é que o formato do capilar, preenchido com gel possibilita a dissipação preenchido com gel possibilita a dissipação eficiente do calor gerado pelo efeito Joule, em eficiente do calor gerado pelo efeito Joule, em razão da geometria do capilar e das razão da geometria do capilar e das propriedades anti-convectivas do gel.propriedades anti-convectivas do gel.

Seqüenciamento do DNA

Diferentes sistemas de revelação dos géis: a) brometo de etídio; b) nitrato de prata; c) raio – X; d) quimiluminescência; e) coomasie blue e f) fast blue BB salt, a e ß naftil acetato.

AplicaçõesAplicações

1- 1- Identificação de pessoas: em testes deIdentificação de pessoas: em testes de

paternidade, comparando o DNA do suposto pai,paternidade, comparando o DNA do suposto pai,

da mãe e do filho; da mãe e do filho;

2- na identificação de criminosos.2- na identificação de criminosos.

3- Na Industria Farmacêutica (Vacinas, Reagentes3- Na Industria Farmacêutica (Vacinas, Reagentes

de diagnóstico);de diagnóstico);

4- Na Agropecuária (Animais e plantas4- Na Agropecuária (Animais e plantas

transgênicos).transgênicos).

Como é feito o exame de Como é feito o exame de paternidade? paternidade?

2. Extração do DNA 3. Amplificação do DNA 1. Coleta do sangue

3. Digestão do DNA

4. Eletroforese

5a. Southern Blotting

5b. Hibridização da membrana de nylon 6. Visualização

Figura Inclusão - Observe que um dos alelos (banda) do filho é proveniente da mãe e o outro alelo proveniente do suposto pai. Neste caso, a paternidade fica comprovada.

Figura Exclusão - Observe que um dos alelos (banda) do filho é proveniente da mãe. O outro alelo, no entanto, difere dos alelos do suposto pai. Neste caso, ocorreu uma exclusão de paternidade.