efeitos da restriÇÃo alimentar e malnutriÇÃo … · estímulos do meio ambiente, luminosos por...
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Pedro Alberto da Graça Pereira
EFEITOS DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR E MALNUTRIÇÃO
PROTEICA NA IMUNOREACTIVIDADE DOS PEPTÍDEOS AVP
E VIP DO NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO DO RATO
Porto 2001
Pedro Alberto da Graça Pereira
EFEITOS DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR E MALNUTRIÇÃO
PROTEICA NA IMUNOREACTIVIDADE DOS PEPTÍDEOS AVP E
VIP DO NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO DO RATO
Trabalho complementar de investigação para obtenção do grau de licenciatura em Ciências da Nutrição apresentado à Faculdade de Ciências da Nutrição e Alimentação da Universidade do Porto
Porto
2001
Trabalho realizado no Instituto de Anatomia e Centro
de Morfologia Experimental da Faculdade de
Medicina da Universidade do Porto, no âmbito do
Projecto PRAXIS C/SAU/13186/1998 da Fundação
para a Ciência e a Tecnologia
Ao meu Pai
À minha Mãe
À minha Irmã
Para a Virgínia
AGRADECIMENTOS
Decorrido o período previsto para a realização do estágio académico e
execução do trabalho complementar de investigação a ele correspondente, exigidos
por lei para a obtenção do grau de licenciado em Ciências da Nutrição, é com imensa
satisfação e muita gratidão que presto homenagem a todos aqueles que contribuíram
para que eu atingisse aqueles fins.
Em primeiro lugar agradeço muito reconhecido ao Senhor Professor Doutor
Manuel Paula Barbosa a franca abertura com que autorizou a concretização
daquelas tarefas no Instituto de Anatomia da Faculdade de Medicina do Porto, de
que é Director, no âmbito das actividades de investigação do Centro de Morfologia
Experimental do qual é Coordenador Científico. Foi para mim uma honra ter passado
a integrar o grupo de elementos daquele Centro através da bolsa concedida pela
Fundação para a Ciência e a Tecnologia para nele trabalhar. Espero não ter
comprometido as expectativas do Senhor Professor Doutor Manuel Paula Barbosa
ao propôr-me, após concurso, para a atribuição daquela bolsa. Para além disto não
esquecerei os ensinamentos com que me enriqueceu, o apoio que me tem
dispensado e o rigor, empenho e entusiasmo com que acompanhou os meus
trabalhos.
i
Ao Professor Doutor José Paulo Andrade fico para sempre reconhecido pela
forma competente e dedicada como orientou a minha actividade investigacional da
qual resultou o presente trabalho. Como investigador responsável pelo Projecto
PRAXIS C/SAU/13186/1998 - Influência de factores neurotróficos nos fenómenos de
degenerescência e reorganização neuronal induzidos pela malnutrição, subsidiado
pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia, concedeu-me a possibilidade de
elaborar este trabalho complementar subordinado ao tema daquele projecto. Sem os
seus ensinamentos não teria sido possível ter-me adestrado na realização das
técnicas que utilizei nem na interpretação dos dados através delas obtidos. Espero
continuar a corresponder à amizade que demonstrou dispensar-me.
Aos restantes investigadores do Instituto de Anatomia e do Centro de
Morfologia Experimental da Faculdade de Medicina do Porto, em especial à
Professora Doutora Maria Dulce Madeira, Professor Doutor António Cadete Leite,
Doutor Nikolai Lukoyanov e Dra. Susana Silva que apoiaram e acompanharam as
actividades que conduziram a este trabalho, e com os quais criei relações de
amizade que espero se venham a manter, igualmente exprimo o meu
reconhecimento.
A todos os técnicos dos diferentes sectores do Instituto de Anatomia, sem o
apoio dos quais a execução das minhas tarefas teria sido muito difícil, os meus
reconhecidos agradecimentos também.
Ao Rui, meu amigo, colega de curso e companheiro de estágio, um
agradecimento especial pelo apoio que me concedeu na realização deste trabalho.
Agradeço por último a todos os meus familiares e amigos, em especial à
Carla, à Eduarda, à Liliana, à Sandra, ao Evandro, ao Hélder e ao Tiago, por toda a
amizade e apoio que me dispensam. Para a Márcia um agradecimento especial.
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA - Análise de variância.
AVP - Vasopressina.
C - Animais controlos.
GRP - Peptídeo libertador da gastrina.
HPA - Eixo hipotálamo-hipófise-suprarrenal.
NSQ - Núcleo supraquiasmático.
QO - Quiasma óptico.
RA - Animais submetidos a restrição alimentar.
RNAm -Ácido ribonucleico mensageiro.
RP -Animais submetidos a restrição proteica.
SNC - Sistema nervoso central.
3V - Terceiro ventrículo.
VIP - Polipeptídeo vasoactivo intestinal.
INDICE
Resumo
Introdução
Objectivos
Material e Métodos
1. Animais e dietas
2. Processamento do material
2.1. Fixação
2.2 Processamento imunocitoquímico
2.2.1. Controlo imunocitoquímico
3. Doseamento de corticosterona
3.1. Princípio do teste
4. Análise estereológica
5. Análise estatística
Resultados
1. Animais e dietas
2. Concentrações séricas de corticosterona
3. Número total de neurónios AVP-positivos
4. Número total de neurónios VIP-positivos
Discussão
Conclusões
Bibliografia
1 3 8 9 9 11 11 11 13 13 14 14 16 18 18 19 21 23 26 34 37
1
RESUMO
Existem fundadas evidências de que, nos roedores a malnutrição altera os
ritmos biológicos de várias funções orgânicas. Como o núcleo supraquiasmático
(NSQ) é amplamente reconhecido como sendo o regulador dominante dos sistemas
circadianos, neste trabalho pretendeu-se examinar os efeitos da malnutrição nas
principais características morfológicas deste núcleo hipotalâmico e nos ritmos
circadianos dele dependentes. Grupos de ratos adultos (dois meses de idade) foram
submetidos, durante sete meses a restrição alimentar (restrição calórica de 40%),
ingestão de dieta hipoproteica (8% de caseína) ou com acesso livre a dieta
normoproteica. O número total de neurónios imunoreactivos para a vasopressina
(AVP) e para o polipeptídeo vasoactivo intestinal (VIP) no NSQ foram estimados a
partir de cortes corados imunocitoquímicamente usando métodos estereológicos
adequados. Para o estudo dos ritmos circadianos foi determinada a variação da
concentração sanguínea de corticosterona durante as 24 horas de cada dia,
utilizando método de radioimunoensaio. A restrição alimentar induz redução
significativa do número de neurónios imunoreactivos para a AVP (23%) e para o VIP
(23%) e altera de forma marcada o ritmo circadiano de produção da corticosterona. A
ingestão de dieta hipoproteica acarreta redução (13%) do número de neurónios
imunoreactivos para o VIP, embora não significativa, não interfere com o número de
neurónios AVP-positivos e não provoca alterações na variação horária das
concentrações de corticosterona circulante. Podemos assim concluir que as
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alterações morfológicas induzidas pela restrição alimentar no NSQ podem explicar,
pelo menos em parte, os distúrbios dos ritmos circadianos.
Palavras-chave: malnutrição; núcleo supraquiasmático; vasopressina;
polipeptídeo vasoactivo intestinal; imunocitoquímica; estereologia; ritmos circadianos;
Rato.
3
INTRODUÇÃO
Uma das funções do Sistema Nervoso Central (SNC) é manter o meio interno
constante. Esta tendência para a estabilidade designa-se por homeostasia, um
conceito introduzido pelo fisiologista Walter Cannon em 1932 (1). Embora
virtualmente todo o cérebro esteja envolvido na homeostasia, os neurónios que
controlam o meio interno estão concentrados no hipotálamo, uma pequena área do
diencéfalo, que constitui menos de 1% do volume total do cérebro (1). Apesar de ser
uma região pequena, o hipotálamo integra um grande número de circuitos neuronais
que regulam várias funções vitais como temperatura, frequência cardíaca, pressão e
osmolaridade sanguíneas (1), comportamento alimentar e controlo do peso corporal
(2), comportamento sexual e actividade reprodutora, bem como a génese e controlo
dos ritmos circadianos (3).
Para a manutenção da homeostasia são fundamentais numerosos e variados
mecanismos de adaptação biológica, que se fazem sentir através da integração de
vectores de natureza endócrina, visceral e somatomotora. É na mediação desta
integração que o hipotálamo desempenha um papel preponderante, coordenando um
conjunto de estruturas e órgãos que, organizados hierarquicamente, constituem os
sistemas nervoso autónomo e endócrino. Por este motivo desde há muito que o
diencéfalo foi considerado o "centro superior" destes sistemas (4).
Os ritmos circadianos representam mecanismos de adaptação dos
organismos a um meio ambiente extremamente rotineiro (5), permitindo-lhes um
4
comportamento adequado e respostas fisiológicas próprias mesmo antes do estímulo
exterior ser desencadeado (6), processo resultante da informação genética do
indivíduo (7). Nos mamíferos, particularmente nos roedores, as características
morfológicas e funcionais dos ritmos circadianos estão parcialmente elucidadas,
havendo fundadas evidências de que o núcleo supraquiasmático (NSQ) do
hipotálamo está envolvido na génese e regulação deste fenómeno (6, 8-15).
Todos os organismos experimentam numerosas situações de stress ao longo
da vida, entre as quais a malnutrição é comum (16) e das que mais consequências
nefastas provoca nos organismos. A malnutrição afecta de forma marcada o SNC do
Rato adulto, ainda que não uniformemente em todas as áreas, quer sob a forma de
restrição alimentar (17) quer consequência de deficiência proteica (18). A restrição
alimentar, e portanto calórica, tem sido referida como contribuindo para o aumento da
esperança de vida e para o atraso no aparecimento de alterações metabólicas,
estruturais e fisiológicas habitualmente associadas ao envelhecimento (19 - 27). No
entanto a restrição calórica provoca também alguns efeitos deletérios (22, 24)
podendo causar um elevado número de alterações fisiológicas e comportamentais
(17). Quanto à restrição proteica consequente à ingestão de uma dieta contendo 8%
de caseína, valor que representa o limiar de aporte proteico para o estabelecimento
duma situação carencial de instalação insidiosa, embora os animais mantenham uma
aparência e características somáticas externas em tudo sobreponíveis às dos
animais que ingerem dietas nutricionalmente equilibradas (28, 29), está demonstrado
que acarreta alterações morfológicas e funcionais no SNC do Rato quer durante o
desenvolvimento (30 - 34) quer no estado adulto (18, 35).
5
A malnutrição pode também afectar a capacidade de ajustamento aos
estímulos do meio ambiente, luminosos por exemplo, e por isso interferir com os
ritmos circadianos (36). Conhecem-se poucos estudos morfológicos experimentais
sobre os efeitos da malnutrição no hipotálamo, nomeadamente no NSQ (6, 37), ao
contrário do que sucede em outras áreas do cérebro do Rato, como a formação do
hipocampo na qual diversas alterações morfológicas estão bem documentadas (17,
18,38-44).
Nos mamíferos o NSQ é responsável pelo controlo dos ritmos circadianos e
sua adaptação às condições de luminosidade (ciclos luz/escuridão) (8 - 14, 45 - 47).
Os ritmos circadianos gerados neste núcleo regulam numerosas funções orgânicas
como, entre outras, a temperatura corporal, a actividade locomotora, o sono e a
vigília, o ciclo éstrico, a utilização de oxigénio, a fome e a saciedade, a sede e a
produção de corticosterona pelas suprarrenais (48). No Rato, este núcleo está
localizado na divisão periventricular do hipotálamo, dorsalmente ao quiasma óptico e
adjacente à parte ventral do terceiro ventrículo (49, 50). Tem uma forma alongada
rostrocaudalmente e apresenta, em secção coronal, um perfil circular ou oval (11). É
um núcleo relativamente pequeno contendo cerca de 17000 neurónios
parvocelulares de tamanho uniforme (11) e irregularmente distribuídos ao longo do
núcleo, no qual apresentam diferenças regionais quer na sua densidade quer na sua
orientação (49). Tal facto conduziu ao reconhecimento de subdivisões anatómicas
nucleares distintas, a dorsomedial e a ventrolateral, que também diferem no que diz
respeito tanto às suas aferências e eferências (46, 51) como aos peptídeos que
produzem (52, 53). Os neurónios que sintetizam vasopressina (AVP) e somatostatina
estão concentrados na subdivisão dorsomedial (54, 55), enquanto que os que
6
produzem polipeptídeo intestinal vasoactivo (VIP) e peptídeo libertador de gastrina
(GRP) estão localizados na subdivisão ventrolateral (55, 56, 57), tal como os que
produzem neurotensina (58).
As subdivisões dorsomedial e ventrolateral do NSQ desempenham papéis
distintos na organização dos ritmos circadianos (10, 58). A primeira, onde se
encontram os neurónios que produzem a AVP, controla uma vasta população celular
do próprio NSQ (59, 60) e funciona como integrador da informação vinda da parte
ventrolateral, promovendo sinalização temporal para a maioria dos sistemas
efectores do NSQ (10, 58, 61). Uma diminuição do número dos neurónios AVP-
positivos pode conduzir a perda de sincronização dos neurónios do NSQ e levar à
redução das eferências deste núcleo e consequentes distúrbios dos ritmos
circadianos (62). O conteúdo de AVP (10, 63, 64) e os níveis do seu ácido
ribonucleico mensageiro (RNAm) (65 - 68) apresentam ritmo circadiano endógeno
com expressão máxima durante a fase de luz (10, 15, 55). A subdivisão ventrolateral,
onde se encontram os neurónios que produzem o VIP, recebe aferências vindas da
retina (10, 46, 69 - 72), e assim desempenha um papel crucial na transmissão de
informação das condições externas de luminosidade para o NSQ (10, 58), enviando-
a de seguida para a região dorsomedial e outras zonas do hipotálamo (10, 58, 73).
Desta forma, os neurónios VIP-positivos sincronizam os ritmos circadianos gerados
no NSQ com as condições de luz do meio exterior (58), pelo que uma diminuição
destes neurónios pode provocar uma deficiente regulação circadiana (62). O
conteúdo de VIP e seu RNAm é mínimo durante a fase luminosa e depende das
condições externas de luminosidade (10, 55, 57, 68, 74 - 76).
7
Vários estudos demonstraram que lesões experimentais no NSQ ou a sua
ablação bilateral provocam abolição dos ritmos normais de produção da
corticosterona (77), dos padrões de sono e vigília, dos padrões alimentares a da
actividade locomotora, e a eliminação total da produção rítmica de gonadotrofinas
(78, 79). Como os regimes alimentares hipocalóricos e/ou hipoproteicos podem
provocar alterações nos padrões rítmicos de funções orgânicas (80, 81), tentou-se
neste trabalho averiguar se tais alterações têm substracto morfológico. Para
caracterizar os efeitos da malnutrição nos mecanismos celulares subjacentes à
expressão dos ritmos circadianos e usando técnicas estereológicas precisas (11, 82,
83) estimou-se o número total de neurónios de duas das subpopulações do NSQ, os
neurónios imunoreactivos para a AVP e os neurónios imunoreactivos para o VIP.
Como o ritmo diário de secreção da corticosterona apresenta alterações bem
definidas durante as 24 horas do dia mostra-se ideal para o estudo de alterações do
ritmo circadiano no Rato. Por isso a sua concentração sanguínea ao longo do dia foi
determinada nos animais controlos, submetidos a regime alimentar hipocalórico e
alimentados com dieta hipoproteica.
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OBJECTIVOS
Com a realização deste estudo pretendeu-se encontrar fundamentos
morfológicos que permitam um conhecimento mais profundo dos efeitos da ingestão
prolongada das dietas de restrição calórica e deficiente em conteúdo proteico no
NSQ do Rato adulto. Para tal, procurou-se responder ás seguintes perguntas:
1. Qual o efeito das referidas dietas no número de neurónios
imunoreactivos para a AVP e imunoreactivos para o VIP?
2. Provocarão estes tipos de dietas alterações no ritmo circadiano do
Rato adulto, avaliado pelas variações horárias dos níveis circulantes
de corticosterona?
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MATERIAL E MÉTODOS
1. Animais e dietas
Este trabalho foi realizado em ratos machos da estirpe Wistar provenientes do
Biotério do Instituto Gulbenkian de Ciência (Oeiras, Portugal) ou seus descendentes
nascidos no Biotério do Instituto de Anatomia da Faculdade de Medicina do Porto. Os
animais foram mantidos em condições laboratoriais padrão, isto é, submetidos a um
ciclo de luz/escuridão (12:12horas), com início da fase de luz às 08.00 horas, e
mantidos à temperatura ambiente de 20-22° C. Até às 8 semanas de idade, todos os
animais tiveram livre acesso a água e a dieta normal para ratos de laboratório
(PANLAB, S.L., Espanha), cuja composição inclui grãos de cereais, sementes de
oleaginosas, produtos e subprodutos de grãos de cereais e de sementes de
oleaginosas, produtos de panificação e massas alimentícias, produtos de pescado e
sais minerais. Em termos analíticos esta composição possui 15,60% de proteínas,
2,80% de gorduras, 4,80% de celulose e 4,60% de sais minerais. Esta dieta é
suplementada com 7500 U.l. de vitamina A, 1500 U.l. de vitamina D3, 15 mg de
vitamina E ( alfa-tocoferol ) e 14,7 mg de cobre (sulfato cúprico penta hidratado) por
quilograma e fornece 376,4 Kcal/100 gramas.
Às 8 semanas de idade todos os animais foram colocados em gaiolas
individuais e, após selecção aleatória, agrupados do seguinte modo:
10
a) Animais controlos - Dez animais permaneceram com acesso livre a dieta
normal para ratos de laboratório e a água ao longo de todo o estudo. A quantidade
média de dieta ingerida por estes animais foi, durante todo o período experimental,
de 30,6 ±1,25 g/dia.
b) Animais submetidos a malnutrição proteica - Dez ratos foram
alimentados durante 7 meses com dieta hipoproteica (Low 8% Protein Diet, ICN
Biomedicals, EUA) a partir dos 2 meses de idade até ao final do estudo. Esta dieta
fornece 434 Kcal/100 g e apresenta a seguinte composição: 8,0% de caseína, 78,0%
de amido de milho, 10,0% de gorduras, 4,0% de mistura de sais minerais e 1% de
suplementos vitamínicos (ICN Vitamin Diet Fortification Mixture). Como a caseína é
pobre em alguns aminoácidos essenciais, esta dieta foi suplementada ainda com
0,7% de lisina e 0,5% de metionina e cistina. Estes animais tiveram acesso livre quer
à dieta quer à água de bebida.
c) Animais submetidos a restrição alimentar - Dez animais foram
submetidos a uma restrição alimentar de 40%, desde os 2 meses de idade até ao
final do estudo. Estes animais dispunham unicamente de 18-20 g diárias da dieta
normal para ratos de laboratório já referida, fornecida às 8.00 horas, embora com
acesso livre a água.
Durante todo o período experimental, todos os animais foram pesados
semanalmente, no mesmo dia da semana, à mesma hora.
11
2. Processamento do material
2.1. Fixação
No final do período experimental (9 meses de idade) cinco animais por grupo
foram anestesiados por injecção intraperitoneal de pentobarbital sódico (80 mg/Kg) e
perfundidos durante 15-20 minutos por via transcardíaca com 200 ml de tampão
fosfato 0,1 M como solução de lavagem, seguidos de 400 ml de solução fixadora
contendo 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,6. Todos os animais
foram perfundidos às 14.00 horas.
Terminada a perfusão procedeu-se à abertura da cavidade craniana e à
remoção do encéfalo que depois de isolado era pesado e codificado para permitir
análise cega sem identificação do animal. Os cérebros eram de seguida imersos na
solução fixadora durante 2 horas à temperatura ambiente e depois numa solução de
sacarose a 30% em tampão fosfato durante 15 horas à temperatura de 4aC.
Os pólos frontais e occipitais dos hemisférios cerebrais eram removidos
através de duas secções coronais: a anterior efectuada caudalmente ao bordo
posterior do quiasma óptico e a posterior imediatamente rostral ao pólo occipital. Os
blocos encefálicos assim obtidos foram seccionados seriadamente no plano coronal,
em cortes de 40 um de espessura utilizando um vibratomo. Os cortes foram
recolhidos para cavidades contendo solução crioprotectora e armazenados a -15°C
até ao processamento imunocitoquímico.
2.2. Processamento imunocitoquímico
Para o estudo imunocitoquímico foram utilizados anticorpos contra a AVP e
contra o VIP gentilmente cedidos pelo Dr. Ruud Buijs ( The Netherlands Institute for
12
Brain Research, Amsterdão, Holanda). Da totalidade dos cortes contendo o NSQ
seleccionou-se, utilizando um método de escolha simultaneamente aleatória e
sistemática (84), um conjunto mais pequeno para a realização das colorações
imunocitoquímicas e ulteriores análises estereológicas. Assim, com o auxílio de uma
tabela de números aleatórios, escolheu-se o primeiro corte a partir do mais rostral
conjunto de dois, nos quais o NSQ era identificável; os restantes cortes foram
seleccionados de modo sistemático, ou seja alternadamente ao longo de toda a
extensão rostro-caudal do NSQ. Deste modo, para cada um dos anticorpos,
seleccionaram-se em média doze cortes para tratamento imunocitoquímico e
consequente análise estereológica. A reacção imunocitoquímica foi realizada em
grupos de cinco cortes flutuantes em cada cavidade. Depois de submetidos a três
lavagens com tampão fosfato para retirar os resíduos de solução crioprotectora,
foram tratados com uma solução de peróxido de hidrogénio a 3% durante 7 minutos
para inactivar as peroxidases endógenas. O anticorpo contra a AVP foi diluído numa
concentração de 1:500 e o anti-VIP de 1:300, ambos numa solução de tampão
fosfato contendo 0,5% Triton X-100. Este detergente foi utilizado em todas as
reacções de modo a permitir uma permeabilização das membranas e possibilitar
melhor penetração dos anticorpos no tecido. Todos os cortes foram incubados
durante 18 horas com o respectivo anticorpo primário (anti-AVP ou anti-VIP), à
temperatura de 4°C e em agitação constante. Como anticorpo secundário foi utilizado
um anticorpo biotinilado anti-imunoglobulinas G de coelho proveniente de cordeiro
(Vector Laboratories, Inglaterra) na diluição de 1:400. Seguidamente, foram tratados
com um complexo avidina-biotina peroxidase (ABC) (Vector Laboratories) na diluição
de 1:800. Ambas as incubações ocorreram à temperatura ambiente e tiveram a
13
duração de 1 hora. Os cortes foram depois tratados com diaminobenzidina (DAB,
Sigma, EUA) durante 10 minutos, após o que foi feita a reacção com peróxido de
hidrogénio para revelar a coloração imunocitoquímica. Após lavagem em tampão
fosfato, foram montados seriadamente em lâminas gelatinadas e depois desidratados
em soluções alcoólicas de concentração crescente (50%, 70%, 90% e 100%, 1
minuto cada), passados por xilol para retirar o excesso de álcool e finalmente
cobertos com lamelas, utilizando como meio de montagem o Histomount.
2.2.1. Controlo imunocitoquímico
Para controlo imunocitoquímico, um corte por animal foi incubado no meio
utilizado (tampão fosfato contendo 0,5% Triton X-100) sem anticorpo primário, e
noutro foi omissa a incubação com o anticorpo secundário. Todo o resto do
processamento destes cortes foi idêntico ao dos restantes, tendo-se verificado que
após revelação nenhum deles mostrou marcação específica.
3. Doseamento de corticosterona
A determinação dos níveis séricos de corticosterona foi feita em cinco animais
por grupo. As colheitas de sangue, realizadas duas vezes por semana, tiveram início
aos 6 meses de idade e prolongaram-se por 2 meses. As amostras de sangue (500
pi) foram colhidas da veia dorsal da cauda às 02.00, 8.00, 14.00 e 20.00 horas para
tubos Eppendorf e o soro separado por centrifugação e armazenado a -20° C até ao
momento da realização dos doseamentos por radioimunoensaio utilizando para o
efeito um kit comercial (ICN Biomedicals, Costa Mesa, Califórnia, EUA).
14
3.1. Princípio do teste
Radioimunoensaio é o termo aplicado para a medição da concentração de
moléculas de antigénio usando um marcador radioactivo que o quantifica por
determinação da extensão com que se combina com o anticorpo. Neste ensaio, uma
quantidade limitada de anticorpo específico reage com a hormona correspondente
marcada com o 1 2 5 l . Pela adição de uma quantidade crescente de hormona verifica-
se uma correspondente diminuição da fracção de hormona marcada ligada ao
anticorpo. Após separação das fracções ligada e livre de hormona marcada a
quantidade de radioactividade numa ou em ambas as fracções é avaliada e usada
para construir uma curva padrão contra a qual as amostras desconhecidas são
medidas (85).
4. Análise estereológica
O número total dos neurónios AVP e VIP imunoreactivos foi estimado pelo
método do fractionator óptico (11, 55, 86 - 88) utilizando um sistema de análise
estereológica CAST-GRID (Olympus Danmark A/S, Dinamarca) e um microscópio
Olympus BH-2 acoplado a uma câmara de video Sony CCD-Iris MTV-3. Esta câmara
fazia interface com um monitor a cores, onde se visualizavam os cortes histológicos,
através de um adaptador de video Sony e um computador IBM. Os movimentos da
platina do microscópio ao longo dos eixos x e y eram controlados através de um
sistema motorizado e a medição dos movimentos verticais, isto é, ao longo do eixo z,
efectuada com o auxílio de um microcator digital Heidenhain MT-12 (Heidenhain
GmbH, Alemanha), igualmente conectado à platina do microscópio.
15
Em cada corte os neurónios foram contadas através do d/sector óptico (11, 55,
82, 83, 88). Este método consiste na contagem do número de partículas que pela
primeira vez aparecem em foco dentro dos limites de uma grelha rectangular, a área
do disector, e numa fracção fixa de espessura do corte, a altura do disector. As
contagens obedeceram à regra das linhas proibidas de Gundersen (89) que exclui as
partículas que são interceptadas pelos lados inferior e esquerdo da grelha
rectangular.
No caso presente a técnica do fractionator óptico consistiu no seguinte: a partir
de uma posição inicial aleatória, fora dos limites do NSQ, procedeu-se à deslocação
sistemática do corte de acordo com as amplitudes de deslocação atribuídas para os
eixos x e y. Para a contagem do número total de neurónios imunoreactivos para a
AVP e para o VIP x e y foram ambos de 50 im e a área da grelha usada de 900 ^m2.
Nas posições em que a grelha de contagem se sobrepunha ao NSQ, depois de focar
a superfície do corte avançavam-se 4 um através da sua espessura (eixo z); assim,
ficava definido o plano óptico a partir do qual se contavam os neurónios com
objectiva de imersão 100X (ampliação final de 2000X). Foram contados todos os
núcleos neuronais que, dentro da grelha de contagem, assumiam pela primeira vez o
melhor foco à medida que se aprofundava o mesmo, através das 10 ^m seguintes da
espessura do corte, ou seja ao longo da altura do disector. Para cada corte estudado,
registava-se o número de disectors efectuados (F) e o número de células contado em
cada disector (CT). O número total de neurónios (N) foi calculado segundo a fórmula:
N = I Q x1/ssf x1/asf xt/h
16
na qual ICT é o número total de neurónios efectivamente contados nos disectors que
caíam nos perfis de cada secção observada na amostragem, ssf representa a
fracção das secções considerada ou section sampling fraction, a asf (area sampling
fraction) corresponde à área total que é alvo da contagem (área da grelha de
contagem / área x x y), t a espessura real do corte e h a altura do disector. Para a
contagem do número total de neurónios imunoreactivos para a AVP e para o VIP, o
valor de ssf foi de 0,5, o de asf de 0,36, o da espessura real (t) dos cortes foi em
média de 16 um e a altura do disector de 10 um. Na contagem do número total de
neurónios imunoreactivos para a AVP e o VIP foram usados em média doze cortes
por núcleo. Usando este esquema de amostragem, foram contados em média por
núcleo 160 neurónios imunoreactivos para a AVP e 110 para o VIP.
O coeficiente de erro (CE) da estimativa do número total de neurónios,
calculado de acordo com Gundersen et ai. (90), foi de 0,08 no caso dos AVP-
positivos e de 0,10 no dos VIP-positivos.
5. Análise estatística
Os dados obtidos neste trabalho foram estatisticamente analisados através da
aplicação do teste de análise de variância (ANOVA) para um factor, o tratamento,
excepto os respeitantes ás variações do peso corporal e aos doseamentos de
corticosterona, em que um novo factor, o tempo de experiência e a hora da colheita,
respectivamente, também foram levados em consideração.
Para verificar se as médias obtidas nos diferentes grupos analisados diferiam
significativamente entre si, utilizou-se o teste post-hoc de Newman-Keuls.
17
Os resultados apresentados são expressos em média e respectivo desvio
padrão. As diferenças foram consideradas significativas para valores de p < 0,05.
18
RESULTADOS
1. Animais e dietas
Os pesos corporais médios dos animais controlos, submetidos a restrição
alimentar e alimentados com dieta pobre em proteínas estão representados
graficamente na Figura 1. A análise da variância (ANOVA) revelou efeito significativo
da dieta (F2,27 = 225,11; p < 0,0001) e interacção igualmente significativa entre o
tempo de experiência e o regime alimentar (F36,756 = 119,31; p < 0,0001), na evolução
do peso corporal dos animais dos diferentes grupos. O peso corporal dos ratos
submetidos a restrição alimentar era significativamente menor que o dos controlos e
dos sujeitos a dieta hipoproteica. Enquanto que o peso corporal médio dos ratos
submetidos a restrição alimentar permaneceu relativamente estável, o dos ratos
controlos e dos alimentados com dieta pobre em proteínas aumentaram
progressivamente ao longo do período experimental (Fig. 1).
No fim da experiência, o peso corporal médio dos ratos controlos e dos
alimentados com dieta hipoproteica era aproximadamente 100% mais elevado que o
peso dos submetidos a restrição alimentar. Não foram observadas diferenças
significativas entre os pesos corporais dos animais daqueles dois primeiros grupos.
A ANOVA mostrou não existir efeito significativo do regime alimentar no peso
cerebral médio dos ratos controlos (1,54 ± 0,05 g), submetidos a restrição alimentar
(1,54 ± 0,04 g) e alimentados com dieta deficiente em proteínas (1,53 ± 0,05 g).
19
E
03 i— O Q. O O O CO (D o_
8 12 16 20 24 28 32 36
Idade (semanas)
Figura 1. Evolução do peso corporal médio dos animais controlos (quadrados), dos
animais submetidos a restrição alimentar (círculos em branco) e animais sujeitos a restrição
proteica (círculos a cheio), durante todo o período experimentai.
2. Concentrações séricas de corticosterona
A ANOVA mostrou que a dieta não teve efeito na concentração sérica da
corticosterona, (F2,i5 = 2,62; p = 0,11) mas as suas variações dependiam da hora do
dia (F345 = 20,14; p < 0,0005); evidenciou ainda uma interacção significativa entre a
dieta a as variações diurnas da concentração de corticosterona (F6,45 = 9.46; p <
0,0005). A análise post-hoc revelou um aumento significativo às 08.00 horas nos
animais submetidos a restrição alimentar quer em relação aos controlos (p < 0,0002)
quer quando comparados com os alimentados com dieta hipoproteica (p < 0,0001)
(Fig. 2). A esta hora (início da fase de luz) o nível sérico de corticosterona nos
20
animais submetidos a restrição calórica atingia o seu máximo enquanto que nos
grupos de animais controlos e sujeitos a dieta hipoproteica atingia o seu mínimo.
(Fig. 2).
—D—Controlo (C)—O—Rest r . Alimentar (RA) — • — Restr. Proteica (RP)
Ç 300-*-•■»,
g 250-
L - ^ c 200-o }\ i S 150-õ \ \ fe^3
: "Î o 100-
\ \ fe^3 : "Î
t : :
1 fe^3 : "Î 8 50- : i fe^3 : "Î
o o o
o o o
o o
o o
o o
o o
o o
o o
o o
o ■t f
o CD O
00 O
O CM Tt" CD 00 O
Tempo
Figura 2. Variação horária média das concentrações séricas de corticosterona nos
diferentes grupos experimentais. Ás 08.00 horas: RA vs C, p < 0,0002; RA vs RP, p <
0,0001. Às 20.00 horas: RA vs C e RP, p < 0,005.
A análise post-hoc revelou igualmente a existência de uma redução
significativa às 20.00 horas nos animais sujeitos a restrição alimentar em relação aos
controlos e aos submetidos a restrição proteica (p < 0,005). A esta hora os animais
submetidos a restrição calórica apresentavam o nível sérico mínimo de
corticosterona. Verifica-se pois um ritmo bifásico nos animais submetidos a restrição
alimentar, existindo níveis máximos às 8.00 horas e às 02.00 horas mas nesta última
situação com valores mais baixos (Fig. 2).
21
A análise da Figura 2 permite ainda verificar que os ratos controlos e os
alimentados com dieta hipoproteica apresentavam níveis séricos máximos de
corticosterona às 02.00 horas. Também se pode observar que a magnitude das
variações diurnas nos ratos sujeitos a restrição calórica era maior que a verificada
nos animais controlos. No entanto, as concentrações médias de corticosterona eram,
semelhantes em todos os grupos experimentais.
3. Número total de neurónios AVP-imunoreactivos no NSQ
Os neurónios AVP-imunoreactivos estão concentrados na divisão dorsomedial
do NSQ, ao longo de toda a sua extensão rostrocaudal (Fig. 3A, B). A maioria destes
neurónios têm corpos celulares fusiformes com dendritos em forma de contas de
rosário estendendo-se dos pólos dos pericários. O plexo formado pelas fibras
imunoreactivas para a AVP é muito mais denso na divisão dorsomedial que na
divisão ventromedial do núcleo. Estas observações são concordantes com as
descrições prévias feitas no Rato (53, 55) e no Hamster (52).
22
Figura 3. Fotografias de cortes coronais do hipotálamo de um animal controlo (A, C)
e de um animal submetido a restrição alimentar (B, D), tratados imunocitoquimícamente com
anticorpos anti-AVP (A, B) e anti-VIP (C, D) nas quais o núcleo supraquiasmático (asterisco)
está assinalado. Os neurónios imunoreactivos para a AVP (A e B) estão localizados na
divisão dorsomedial do núcleo, enquanto os neurónios imunoreactivos para o VIP (C e D)
estão concentrados na divisão ventrolateral. Alguns neurónios VIP-positivos estendem-se
para dentro do quiasma óptico (QO). O número de neurónios imunoreactivos para cada
peptídeo é menor nos animais submetidos a restrição alimentar (B, D) que nos respectivos
controlos (A, C). 3V, terceiro ventrículo.
Barras = 80 ^m.
23
(/) o zzuu 2000 ->
'(/) 1800 n i
n 1600 -> < 1400 -o c 1200 u-QJ C
1000 -800 -
m o 600 -o d) 400 -E z 200
0 c RA RP
Figura 4. Representação gráfica do número total de neurónios AVP-positivos do NSQ
estimado nos animais controlos (C), submetidos a restrição alimentar (RA) e alimentados
com dieta hipoproteica (RP). C vs RA, p = 0,02; RA vs RP, p = 0,001.
A ANOVA mostrou que as variações encontradas no número total de
neurónios AVP-positivos eram dependentes do factor dieta (F2,15 = 8,84; p < 0,002). A
observação da Figura 4 permite concluir que o número total destes neurónios é
significativamente menor no grupo de ratos submetidos a restrição alimentar que nos
grupos de animais controlos (23%) e sujeitos a malnutrição proteica
4. Número total de neurónios VIP-imunoreactivos no NSQ
Os neurónios VIP-positivos do NSQ apresentam forma arredondada ou
alongada e dão origem a um ou dois dendritos; ocupam a divisão ventrolateral do
núcleo e os localizados mais ventralmente com frequência se estendem para o
interior do quiasma óptico (Fig. 3 C, D). Contudo, não se encontram corpos celulares
24
destes neurónios nas extremidades rostral e caudal do núcleo. A densidade das
fibras imuhoreactivas para o VIP é elevada em ambas as divisões do núcleo
supraquiasmático e podem ser visualizadas em toda a extensão. Estas observações
estão de acordo com as descrições anteriores feitas no Rato (53, 55) e no Hamster
(52).
1400
§ 1200
I DL
> g 'c '2 m c d)
1000
800
600
o 400 o
o z
200
0
i
RA RP
Figura 5. Representação gráfica do número total de neurónios VIP-positivos no NSQ
estimado nos animais controlos (C), submetidos a restrição alimentar (RA) e alimentados
com dieta hipoproteica (RP). C vs RA, p < 0,01.
A ANOVA revelou que as variações encontradas no número total de neurónios
VIP-imunoreactivos não eram dependentes do factor dieta (F2,15 = 5,71; p = 0,01). A
observação da Figura 5 permite verificar que o número total destes neurónios era
significativamente menor no grupo de ratos submetidos a restrição alimentar que nos
25
de animais controlos e submetidos a malnutrição proteica. Verifica-se uma redução
de 23% no número total de neurónios VIP-positivos no grupo de ratos submetidos a
restrição alimentar em relação ao grupo de animais controlos. O teste post-hoc
demonstrou ainda que embora o grupo de ratos alimentados com dieta hipoproteica
apresentasse uma redução de 13% no número total destes neurónios comparados
com o grupo de animais controlos, tal diferença não é estatisticamente significativa (p
= 0,08).
26
DISCUSSÃO
A vulnerabilidade das diferentes regiões cerebrais a agressões ambientais,
nas quais se incluem as deficiências nutricionais, não é semelhante. Vários estudos
têm revelado que a formação do hipocampo do Rato é talvez a mais vulnerável,
sofrendo várias alterações morfológicas e funcionais após exposição a dietas
hipoproteicas (17, 18, 38 - 44). A exposição prolongada a este tipo de dietas reduz,
de modo dramático o número total de neurónios da camada granular da faseia
denteada e das células piramidais das regiões CA3 e CA1 do hipocampo (38, 40,
44), induz marcadas alterações regressivas nas arborizações dendríticas nas duas
primeiras populações neuronais e reduz o número de sinapses entre os axónios das
células granulares e as excrescências dendríticas das células piramidais de CA3 e a
dimensão das suas áreas activas (38, 40, 44). Por outro lado, quer o córtex pré
frontal (91) quer o córtex entorrinal (92), mostram-se extremamente resistentes à
malnutrição proteica.
No que se refere aos efeitos da restrição alimentar na formação do hipocampo
foi demonstrado, no mesmo roedor, que não provoca alterações no número total de
células quer da camada granular da faseia denteada quer das células piramidais das
regiões CA3 e CA1 do hipocampo (17), não afecta a estrutura das árvores
dendríticas das pirâmides hipocampais destas regiões(17) e igualmente não altera o
número total de sinapses entre as fibras musgosas e as células piramidais de CA3
(17). Contudo, este regime alimentar provoca alterações ligeiras nas árvores
27
dendríticas das células granulares traduzidas por aumento do comprimento dos
segmentos terminais dos seus dendritos e ainda um aumento do número de sinapses
axo-espinhosas na camada molecular da faseia denteada (17).
Outra região do SNC onde provavelmente não existe morte neuronal após
períodos prolongados de restrição alimentar e malnutrição proteica é o NSQ do
hipotálamo, já que este núcleo é extremamente resistente a agressões neurotóxicas
como a alcoolização prolongada (55), a injecção de ácido caínico (93) e a aplicação
de ácido glutâmico em elevadas concentrações (94). O envelhecimento também não
afecta o número total de neurónios do NSQ (11). No entanto, para verificar se existe
morte neuronal como consequência da restrição alimentar e da malnutrição proteica
serão necessários estudos estereológicos mais completos, o que ultrapassa os
objectivos deste estudo.
O álcool, apesar de não induzir morte celular no NSQ, avaliada pela estimativa
do número total dos seus neurónios, provoca alterações no número total de
neurónios imunoreactivos para a AVP e para o VIP, bem como uma redução da
expressão do RNAm para os dois peptídeos (55, 95). Da mesma maneira, os
presentes resultados mostram que a restrição alimentar acarreta uma diminuição
(23%) do número de neurónios imunoreactivos para a AVP, bem como uma redução
dos neurónios VIP-positivos (23%). O número de neurónios imunoreactivos para o
VIP nos animais sujeitos a malnutrição proteica apresenta uma diminuição (13%)
quando comparado com o dos controlos, embora não estatisticamente significativa.
No entanto deve ser realçado que os neurónios imunoreactivos para a AVP e para o
VIP no seu conjunto representam apenas 17% da população neuronal total do NSQ
(55). Mais especificamente a população neuronal que contém AVP é de 10%,
28
enquanto a VIP-imunoreactiva é de 7% (55). Assim não existe razão para assumir
que os restantes neurónios do NSQ (83% do total) não possam ser vulneráveis aos
efeitos destas dietas. A redução dos peptídeos AVP e VIP pode reflectir a sua baixa
concentração neuronal, como consequência de alterações no metabolismo celular,
por diminuição da síntese ou por aumento do transporte axonal. Deste modo a
reduzida expressão destes peptídeos pode tornar os neurónios não detectáveis com
o procedimento imunocitoquímico utilizado. Embora seja a hipótese mais provável
terão de ser efectuados estudos de hibridização in situ nestes dois modelos
experimentais de malnutrição para confirmar se existe diminuição na síntese dos dois
peptídeos.
Vários mecanismos podem ser apontados para explicar a redução dos
neurónios imunoreactivos para a AVP e para o VIP nas presentes circunstâncias
experimentais. Assim, os animais sujeitos a restrição alimentar podem apresentar
elevados níveis de corticosterona circulante (80, 96 - 99) e por isso os
glucocorticóides poderiam influenciar e modular a síntese de AVP (100). No entanto,
as alterações encontradas neste trabalho não estão provavelmente relacionadas com
este mecanismo hormonal já que, embora existam alguns picos de natureza
circadiana, as concentrações médias de corticosterona são semelhantes nos animais
alimentados com dietas hipocalóricas, submetidos a carência de proteínas e
controlos. Por outro lado, para além de provavelmente os glucocorticóides não
interferirem com a síntese de AVP no NSQ (100), não existem neste núcleo
hipotalâmico receptores para a corticosterona (101).
Outro mecanismo a ter em conta para a redução da imunoreactividade para a
AVP e para o VIP no NSQ pode ser devido ao facto de a malnutrição afectar
29
virtualmente todos os sistemas de neurotransmissores conhecidos no cérebro (31 -
33). Esta hipótese é apoiada pela observação que a secção das fibras retino-
hipotalâmicas (102) e a destruição das aferências serotoninérgicas ao hipotálamo
(103), provocam redução do número de neurónios imunoreactivos para o VIP, o
principal alvo destas aferências (10, 46, 69 - 72). Por outro lado, ratos adultos que
foram sujeitos a um período de malnutrição proteica perinatal, apresentam reduções
de 25% e 15% nos neurónios imunoreactivos para o VIP e para a AVP,
respectivamente, e redução de 8% na densidade das fibras serotoninérgicas (6). Da
mesma maneira, tanto a malnutrição calórica como a proteica no Rato adulto podem
conduzir a alterações na interacção entre as diferentes populações neuronais do
NSQ e das suas ligações com as diferentes regiões do cérebro. A redução do
número de neurónios imunoreactivos para o VIP encontrada nos animais alimentados
com dietas hipocalórica e hipoproteica sugere que estes regimes alimentares podem
alterar o balanço entre as aferências excitatórias e inibitórias para a área que recebe
os aferentes retinianos do NSQ, em favor das aferências inibitórias (55). O facto de
também se encontrar diminuição do número de neurónios imunoreactivos para a AVP
nos animais submetidos a restrição alimentar não exclui esta possibilidade, porque
devido às complexas ligações intrínsecas do NSQ (51, 104) é provável que se houver
alterações nos neurónios da subdivisão ventrolateral possam existir interferências na
actividade dos neurónios na subdivisão dorsomedial.
A malnutrição pode ainda interferir com a síntese de proteínas, afectando a
disponibilidade de aminoácidos essenciais para a síntese proteica e para a
consequente quantidade de neurotrofinas disponíveis (105, 106). A quantidade de
proteínas fornecidas nos dois modelos, embora reduzida em ambos, não é
30
semelhante, e por isso os ratos submetidos a restrição calórica recebem maior
quantidade de proteínas por grama de peso corporal que os submetidos a privação
proteica (17). Existe pois a possibilidade de que estes regimes alimentares possam
levar a alterações no metabolismo celular normal do NSQ.
A interferência nos mecanismos moleculares dos neurónios do NSQ pode ser
a explicação para as alterações induzidas pela malnutrição nos ritmos circadianos.
Tal hipótese é apoiada pela demonstração da existência de alteração dos padrões
circadianos na imunoreactividade da proteína Fos-like no NSQ de ratos submetidos a
restrição calórica (107).
Finalmente, não pode ser posta de parte a possibilidade de que as alterações
encontradas na imunoreactividade dos neurónios no NSQ dos ratos submetidos à
restrição alimentar, possam resultar de modificações dos ritmos circadianos
induzidas pela própria exposição a esta dieta. De facto, os cérebros usados neste
estudo imunocitoquímico foram todos colhidos à mesma hora (14.00 horas), tendo-se
em conta que os peptídeos analisados sofrem significativas alterações circadianas
(10). Estas alterações são diferentes para cada peptídeo, e para cada um deles
também é diferente e específico o intervalo de tempo entre a máxima expressão do
seu RNAm e o máximo conteúdo do peptídeo (10). Parece pois legítimo avançar a
hipótese de que os animais submetidos a restrição alimentar possam ter alterações
no conteúdo dos peptídeos AVP e VIP no NSQ que levaram às diferenças
observadas no número total de neurónios imunoreactivos para a AVP e o VIP.
Neste estudo foi analisado um factor robusto do ciclo circadiano, a secreção
de corticosterona, para avaliar a extensão em que as diferentes dietas instituídas
influenciavam os ritmos diários do NSQ. Verificou-se que os dois tipos de dietas não
31
parecem afectar do mesmo modo os ritmos circadianos. Enquanto o grupo de ratos
submetidos a restrição alimentar apresentaram o nível sérico máximo da
corticosterona às 8.00 horas, os animais sujeitos a malnutrição proteica não
mostraram qualquer alteração do padrão de corticosterona sérica quando
comparados com os controlos. Aquela alteração parece dever-se não à diferente
composição de cada dieta mas ao facto de a disponibilidade dos alimentos funcionar
como um importante sincronizador do eixo hipotálamo-hipófise-suprarrenal (HPA)
(108). A secreção de corticosterona nos roedores é modulada por um complexo
mecanismo de retro-acção negativo envolvendo este eixo (109) que pode ser
activado pela restrição alimentar (110) devido à diminuição das reservas calóricas
que tal regime provoca (111).
Assim, além do regulador de ritmos circadianos localizado no NSQ e que
responde às condições de luminosidade, parece existir outro marcapasso circadiano
regulado pela ingestão de alimentos e horário das refeições (111 - 118). Para a
expressão deste segundo regulador circadiano é necessária a existência de um
estado catabólico (119) que é atingido na restrição alimentar devido ao facto de o
intervalo entre a apresentação diária de alimentos ser bastante longo. Assim,
verificamos que os animais submetidos a restrição alimentar apresentam níveis
máximos de corticosterona um pouco antes da apresentação diária dos alimentos
(98, 111, 113, 119). Outras experiências com animais submetidos a restrição calórica
comprovam este facto, já que também existe naquela ocasião aumento da actividade
locomotora (112, 117), da temperatura corporal e da actividade de certas enzimas
intestinais (113). No entanto, também a malnutrição proteica é capaz de induzir um
estado catabólico geral nos roedores (6) e portanto seria de esperar que os animais
32
sujeitos a este tipo de dieta apresentassem também alteração do ritmo circadiano de
produção da corticosterona, o que não se verificou. A razão para este facto pode
residir na presença constante de alimentos de que este grupo de animais dispõe. A
existência deste regulador circadiano dependente da alimentação parece ser
independente do NSQ, pois persiste mesmo após lesões bilaterais deste núcleo
(120). A presença de um regulador deste tipo é importante do ponto de vista
evolutivo pois impõe a existência de ritmos que ocorrem em horários pouco vulgares,
optimizando desta maneira a localização, ingestão e armazenamento de calorias
essenciais à vida (111, 115). A localização deste oscilador circadiano é críptica
embora vários núcleos (111, 117), com destaque para o núcleo ventromedial do
hipotálamo (111), tenham sido propostos como sua sede.
A produção de AVP pelos neurónios do NSQ exerce um efeito inibitório na
síntese de hormona libertadora da corticotrofina (121), já que elevados níveis de AVP
libertada dos terminais do NSQ durante o período de luz coincide com os níveis
basais de corticosterona (122). Estudos experimentais demonstraram que a
administração de antagonistas da AVP ou lesões no NSQ, resultam em níveis basais
de corticosterona elevados durante o dia, ou seja, durante o período em que a AVP é
sintetizada pelos neurónios do NSQ (121, 122). Tendo em conta estes dados, a
observação de que os níveis circulantes de corticosterona não foram influenciados
pela dieta hipoproteica não é surpreendente, dado que o estudo imunocitoquímico
não revelou diferenças significativas no número de neurónios imunoreactivos para a
AVP nestes animais. Contudo, é necessário ter em conta que a AVP libertada pelos
neurónios do NSQ não é o único factor que pode explicar os níveis de corticosterona
circulante, já que animais com lesões bilaterais do NSQ não apresentam
33
continuamente níveis plasmáticos elevados desta hormona (121). Desta forma,
durante a exposição dos animais a diferentes regimes alimentares podem ocorrer
alterações adaptativas do eixo hipotálamo-hipófise-suprarrenal, conduzindo ao
desenvolvimento de diferentes níveis de tolerância a estas situações de malnutrição.
Este mesmo mecanismo foi descrito na exposição crónica ao álcool (123, 124) que
leva também à diminuição dos neurónios imunoreactivos para a AVP e para o VIP
(55).
34
CONCLUSÕES
Concluindo, podemos afirmar que a restrição alimentar e a malnutrição
proteica induzem alterações a nível morfológico no núcleo supraquiasmático do Rato,
especificamente nos neurónios imunoreactivos para a AVP e para o VIP. No que
respeita à restrição alimentar, os animais sujeitos a este regime dietético apresentam
alterações do ritmo circadiano na produção de corticosterona. A persistência de
organização circadiana nestes animais malnutridos, embora diferente da dos animais
controlo, comprova a relevância deste processo para a sobrevivência e adaptação
dos organismos vivos ao meio ambiente. As alterações encontradas podem reflectir o
desenvolvimento de estratégias alternativas que permitam a sobrevivência dos
animais perante situações de carências alimentares, podendo representar também
uma actividade de antecipação no controlo do balanço energético. Tais estratégias
dependem da interacção de vários reguladores do ritmo circadiano cujas respostas
são dependentes do sistema de adaptação a vários estímulos do meio ambiente, tais
como os ciclos luz/escuridão e a disponibilidade de alimentos. As alterações
provocadas pela malnutrição calórica podem conduzir à manifestação de tais
estratégias que em condições normais seriam de relevância secundária para o
animal e gerar padrões fisiológicos e de comportamento adequados às novas
condições.
No Homem, por exemplo, a hipertensão primária é caracterizada por distúrbios
no ritmo circadiano de muitas funções orgânicas e estudos imunocitoquímicos
35
revelam que nestas situações o número de neurónios imunoreactivos para a AVP, o
VIP e a neurotensina estão diminuídos (62). É importante, no entanto, realçar o
cuidado que deve existir ao analisar os resultados obtidos em animais (onde a maior
parte das variáveis são controladas) e ao fazer a sua extrapolação para situações
humanas, onde as características da malnutrição se revestem de complexos
aspectos biológicos, psicológicos e sociais. Contudo, sem esquecer as diferenças
entre espécies, os estudos animais constituem a base para o conhecimento dos
efeitos da malnutrição no cérebro (31), sendo a única forma de mimetizar as
condições nutricionais a que estão sujeitos vários grupos populacionais humanos.
36
37
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ERRATA
Página 11, linha 15 e 16 - onde se lê "efectuada caudalmente ao bordo
posterior do quiasma óptico" deve ler-se "efectuada 5 mm rostralmente ao
bordo anterior do quiasma óptico".
Página 21, linha 13 - onde se lê "divisão ventromedial do núcleo" deve ler-se
"divisão ventrolateral do núcleo".
Página 24, linha 10 - onde se lê "não eram dependentes do factor dieta" deve
ler-se "eram dependentes do factor dieta".