efeito dos agentes de maturação, aba, peg e maltose, na ... · 4.1.3. efeito do doador,...

Julia Bolanho da Rosa Andrade

Efeito dos agentes de maturação, ABA, PEG e

maltose, na produção de óxido nítrico e de espécies

reativas de oxigênio em culturas embriogênicas de

Araucaria angustifolia.

São Paulo 2010


Efeito dos agentes de maturação, ABA, PEG e

maltose, na produção de óxido nítrico e de espécies

reativas de oxigênio em culturas embriogênicas de


Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Mestre em Ciências Biológicas, na Área de Botânica.

Orientadora: Eny Iochevet Segal Floh

São Paulo 2010

Andrade, Julia Bolanho da Rosa Efeito dos agentes de maturação,

ABA, PEG e maltose, na produção de óxido nítrico e de espécies reativas de oxigênio em culturas embriogênicas de Araucaria angustifolia.

74p Dissertação (Mestrado) - Instituto de

Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Botânica.

1. Araucaria angustifolia 2. embriogênese

3. óxido nítrico Universidade de São Paulo. Instituto de

Biociências. Departamento de Botânica.


Efeito dos agentes de maturação, ABA, PEG e maltose, na produção de óxido nítrico e de espécies reativas de oxigênio em culturas embriogênicas de


Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade

de São Paulo em _______________de 2010, para a obtenção de Título de

Mestre em Ciências Biológicas, na Área de Botânica.

________________________ _______________________ Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

______________________

Profa. Dra. Eny Iochevet Segal Floh

Orientadora

Aos meus pais, Osvanir e Helena,

que sempre incentivaram e

patrocinaram meus estudos,

dedico.

L'homme se découvre quand il se mesure avec l'obstacle. Antoine de Saint-Exupéry, Terre des hommes

Agradecimentos

Agradeço a todos que conviveram comigo durante o período de realização

do mestrado, porque de alguma maneira me ajudaram a continuar.

Aos meus pais, Helena e Osvanir por tudo, e meus irmãos, Felipe e

Carolina, pela compreensão;

Ao Guilherme pelo apoio e por ser minha família em São Paulo;

À Claudete Santa-Catarina pela ajuda na elaboração do projeto, na

correção da dissertação;

Aos companheiros de almoço, Augusto e Thalita;

Aos colegas do laboratório BIOCEL e laboratórios associados, Leonardo Jo,

Yve, Ana Lúcia, Ludmila, Rosângela, Nídia, pela convivência e por tornarem o

laboratório um ambiente agradável,

À Fernanda Pieruzzi, por me escutar sempre que eu quis falar,

Ao André dos Santos por ceder as culturas, por escutar e responder minhas

perguntas,

À Amanda, por sempre estar presente, ela e todos os reagentes,

À Carminha, por manter tudo em ordem,

Ao Tiago Balbuena, Leonardo Dias e Vanildo pela ajuda e todo

ensinamento de bancada;

À Suzi, pelo bom humor diário das manhãs;

Ao Departamento de Botânica e à Secretaria de Pós-graduação do IB, pela

prestatividade;

Aos amigos da graduação, pelas risadas;

À Bia Burin, que aguentou morar comigo;

As amigas de Ana, Patrícia e Juliana pela compreensão da amiga ausente;

À Universidade de São Paulo pela oportunidade de realização do mestrado;

À FAPESP e Capes pelo apoio financeiro concedido; e

À Profª. Eny Iochevet Segal Floh, por quem eu poderia escrever a segunda

página de agradecimentos.

Sumário

1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 9 1.1. Embriogênese em Coníferas................................................................ 9 1.2. A etapa de maturação dos embriões somáticos ................................ 11 1.3. O óxido nítrico e as espécies reativas de oxigênio............................ 13 1.4. A Araucaria angustifolia como modelo de estudo para a embriogênese.................................................................................................................. 16

1.4.1. Aspectos bioquímicos e moleculares da embriogênese zigótica e somática ................................................................................................ 17

2. OBJETIVOS ............................................................................................. 21 2.1. Objetivo geral ..................................................................................... 21 2.2. Objetivos específicos ......................................................................... 21

3. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 22 3.1. Material vegetal.................................................................................. 22 3.2. Indução, manutenção e multiplicação das culturas ........................... 22

3.2.1. Estabelecimento das suspensões celulares ................................ 23 3.3. Avaliações bioquímicas, morfológicas e de crescimento ................... 24

3.3.1. Quantificação e visualização de NO e ROS................................. 24 3.3.2. Análises morfológicas .................................................................. 25 3.3.3. Determinação da morte celular.................................................... 25 3.3.4. Determinação da matéria seca.................................................... 26 3.3.5. Determinação da matéria fresca.................................................. 26 3.3.6. Curva de crescimento.................................................................. 26 3.3.7. Análises estatísticas .................................................................... 26

3.4. Estudo do efeito dos promotores de maturação na produção de NO em culturas embriogênicas da linhagem BM de A angustifolia................. 26

3.4.1. Efeito da concentração dos agentes de maturação no crescimento celular e na produção endógena de NO................................................ 26 3.4.2. Efeito do tempo de incubação no crescimento celular e na produção endógena de NO e ROS durante o período de cultura in vitro................................................................................................................ 27 3.4.3. Efeito do doador, sequestrador e inibidores da síntese de NO sobre o conteúdo endógeno de NO e ROS........................................... 28 3.4.4. Efeito do condicionamento do meio de cultura no conteúdo de NO e ROS .................................................................................................... 28

3.5. Estudo comparativo, entre duas linhagens (BM e MSG) com diferentes competências para maturação .................................................................. 29

4. RESULTADOS ......................................................................................... 31 4.1. Estudo do efeito dos promotores de maturação no crescimento e na produção de NO e ROS em culturas embriogênicas da linhagem BM de A angustifolia................................................................................................ 31

4.1.1. Efeito concentração dependente dos promotores de maturação no crescimento e no conteúdo de NO e ROS ............................................ 31 4.1.2. Efeito da adição dos agentes promotores de maturação, em diferentes períodos de cultura, na produção endógena de NO e ROS . 33

4.1.3. Efeito do doador, sequestrador e inibidores da síntese de NO sobre o conteúdo endógeno de NO e ROS em suspensões celulares cultivadas nos tratamentos com promotores de maturação. ................. 35 4.1.4. Efeito do condicionamento do meio de cultura no conteúdo de NO e ROS em suspensões celulares .......................................................... 37

4.2. Estudo comparativo, entre duas linhagens (BM e MSG) com diferentes competências para maturação .................................................................. 41

4.2.1. Aspectos morfológicos das suspensões celulares ...................... 41 4.2.2. Análises morfológicas das culturas embriogênicas ..................... 42 4.2.3. Determinação da morte celular.................................................... 45 4.2.4. Determinação da matéria seca.................................................... 46 4.2.5. Quantificação de NO e ROS........................................................ 47 4.2.6. Visualização intracelular de NO e ROS ....................................... 50

5. DISCUSSÃO............................................................................................. 52 5.1. Maturação das culturas embriogênicas ............................................. 52 5.2. Pomotores de maturação e produção de NO e ROS......................... 54

5.2.1. PEG ............................................................................................. 54 5.2.2. Maltose ........................................................................................ 56 5.2.3. ABA.............................................................................................. 57 5.2.4. ABA + PEG + Maltose ................................................................. 58

5.3. Doadores, sequestradores e inibidores de NO.................................. 59 5.4. Morte celular ...................................................................................... 60 5.5. Diferença entre linhagens .................................................................. 61

6. CONCLUSÃO........................................................................................... 62 7. RESUMO .................................................................................................. 64 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 65

9

1. INTRODUÇÃO

1.1. Embriogênese em Coníferas

Em gimnospermas, a embriogênese é iniciada e caracterizada, após a

fecundação, por uma etapa de núcleos livres (Singh, 1978; Kong et al., 1999;

Hakman & Oliviusson, 2002) onde são reconhecidas três fases distintas, descritas

como: a) fase pró-embrionária, que vai desde a fertilização até o rompimento do

arquegônio pelo pró-embrião (estádios anteriores ao alongamento do suspensor

primário); b) fase embrionária inicial, que compreende os estádios após o

alongamento do suspensor secundário e antes do estabelecimento dos meristemas;

e c) fase embrionária tardia, na qual a protoderme e o procâmbio são diferenciados, e

os meristemas apical e radicular são estabelecidos (Singh, 1978; Haines & Prakash,

1980). Assim como para as angiospermas, o desenvolvimento do embrião é

finalizado após a formação completa dos cotilédones, acúmulo de substâncias de

reserva (proteínas, lipídios e carboidratos), diminuição da atividade metabólica, e

aquisição da tolerância à dessecação (Bewley & Black, 1994; Cairney & Pullman,

2007).

A embriogênese somática é um processo em que, através da técnica de

cultivo in vitro, células isoladas ou um pequeno grupo de células somáticas dão

origem aos embriões, onde esse processo morfogenético, se aproxima da seqüência

de eventos representativos da embriogênese zigótica (Tautorus et al., 1991; Stasolla

et al., 2003; Palovaara & Hakman, 2008). As similaridades entre os dois processos

envolvem aspectos morfológicos, bioquímicos e moleculares, incluindo a expressão

protéica (Hakman, 1993; Hvoslef-Eide & Corke, 1997; Sghaier et al., 2008), gênica

(Thibaud-Nissen et al., 2003; Ikeda & Kamada, 2005; Cairney et al., 2006; Schmidt et

al., 2006) e diferentes metabólitos (Kormuták et al., 2006; Jiménez, 2005; Tereso et

al., 2007; Floh et al., 2007).

O emprego da embriogênese somática pode ter uma série de objetivos que

vão desde a obtenção de um modelo referência para estudos básicos em fisiologia e

bioquímica, até o uso visando a propagação em larga escala e a transformação

genética (von Arnold et al., 2002).

Como modelo para estudo de um processo morfogenético, a embriogênese

somática é ideal para investigar o processo de diferenciação em plantas, bem como a

expressão dos mecanismos da totipotencialidade da célula vegetal. Incluem-se aqui,

10

abordagens diferenciais da competência celular, que pode ser definida como o

potencial de reprogramação de uma célula, em resposta a sinais específicos, por

meio dos processos de desdiferenciação e rediferenciação (Floh et al., 2007).

Destaca-se que, estudos com esta abordagem em espécies arbóreas nativas e

recalcitrantes são escassos na literatura.

De acordo com von Arnold et al. (2002), a embriogênese somática em

coníferas, e que tem como seu principal modelo Picea abies, é composta de cinco

etapas, descritas a seguir:

Etapa 1- indução – nesta etapa normalmente são utilizados meios de cultura

contendo reguladores de crescimento vegetal, como auxinas e citocininas. A

frequência de indução de culturas embriogênicas em coníferas é afetada por vários

fatores e, dentre eles, destaca-se: a influência do genótipo, o efeito do estádio de

desenvolvimento do explante e o potencial indutivo do meio de cultura, a fonte de

carboidrato (sacarose, maltose, lactose), a composição e teores de nitrogênio, os

agentes geleificantes, o pH e a concentração e tipos de reguladores de crescimento

no meio de cultura (Li et al., 1998, Guerra et al., 2000);

Etapa 2 - multiplicação - pode ser realizada em meio de cultura líquido ou

semi-sólido. Esta etapa é caracterizada pela passagem do material por três estádios

de desenvolvimento consecutivos. Esses estádios são caracterizados por agregados

celulares definidos como massas pró-embriogênicas (MPE) de três tipos (MPE I, II e

III). As MPE I são formadas por um aglomerado de pequenas células, associadas a

uma célula altamente vacuolada. Um conjunto semelhante, mas com mais de uma

célula vacuolada, determina a MPE II. Na fase de MPE III, o conjunto de células com

citoplasma aumenta e fica rodeado pelas células vacuoladas (Filonova et al., 2000).

O embrião propriamente dito, é formado a partir das MPE III, através de uma

bipolarização (Filonova et al., 2000; Stassola & Yeung, 2003). O conjunto de células

pequenas e aglomeradas é denominado de pró-embrião, e as células altamente

vacuoladas são os suspensores. Durante a multiplicação, culturas embriogênicas de

coníferas são normalmente mantidas em meios de cultura similares àqueles utilizados

na fase de indução porém, com redução na concentração de fitorreguladores (von

Arnold et al., 2002);

Etapa 3- pré-maturação- nesta etapa, em meio de cultura sem a presença de

fitorreguladores, os embriões iniciam o desenvolvimento tornando-se individualizados.

A necessidade de um pré-tratamento, com a desidratação lenta, anterior à

germinação, foi verificada como fundamental para diferentes sistemas de coníferas

incluindo embriões somáticos de Castanea sativa (Corredoira et al., 2008) e para

11

Ocotea catharinensis (Viana & Mantel, 1999). Segundo Malabadi & Nataraja (2006), o

estresse hídrico poderia induzir proteínas que possuem participação fundamental na

tolerância ao estresse de água, e na promoção da maturação dos embriões

somáticos;

Etapa 4 – maturação – nesta etapa ocorre a maturação dos embriões

somáticos, frequentemente em meios de cultura suplementados com promotores de

maturação, como o ácido abscísico (ABA) e/ou agentes osmóticos. Nesta etapa, os

embriões somáticos apresentam mudanças morfológicas e bioquímicas, resultando

no acúmulo de substâncias de reserva, redução da atividade metabólica e aquisição

da tolerância à desidratação (Thomas, 1993; von Arnold et al., 2002; Stasolla et al.,

2003). Esta condição mimetiza o efeito do estresse hídrico, que ocorre naturalmente

nas sementes, durante os estádios finais da maturação, e que permite com que os

embriões sobrevivam ao processo de desidratação (Bewley & Black, 1994). Esta

etapa de cultura consiste em um dos principais gargalos para a ampla utilização dos

sistemas de embriogênese somática em arbóreas devido a baixa frequência de

maturação e conversão de embriões somáticos em plântulas nestes sistemas

vegetais (Stasolla & Yeung, 2003; Stasolla et al., 2003). Em embriões de diferentes

espécies de coníferas a maturação é estimulada pela dessecação lenta em uma alta

umidade relativa (maior ou igual a 95%), antes da transferência para o meio de

germinação (Malabadi & van Staden, 2005; Salaj et al., 2005; Tremblay et al., 2005;

Vágner et al., 2005).

Etapa 5 - conversão em plântulas – nesta etapa ocorre a germinação dos

embriões que passaram pela dessecação, geralmente em meio de cultura isento de

fitorreguladores, obtendo-se as plântulas. Quando o sistema radicular encontra-se

bem desenvolvido, com a presença de raízes laterais, as plantas provenientes de

embriões somáticos podem ser aclimatizadas ex vitro (Högberg et al., 2003).

1.2. A etapa de maturação dos embriões somáticos

Muitos avanços têm sido realizados para a compreensão e otimização da

embriogênese somática em coníferas (Jain & Ishii, 1998; von Arnold et al., 2002;

Breton et al., 2005; Maruma et al., 2009). Entretanto, a maturação dos embriões

somáticos, e a subsequente regeneração de plantas, ainda são etapas limitantes.

Assim, existem vários aspectos a serem elucidados para as diferentes espécies,

incluindo a Araucaria angustifolia (Steiner et al., 2008). A baixa taxa de germinação

12

dos embriões somáticos tem sido atribuída como sendo decorrente de problemas

existentes no processo de maturação, como acúmulo de substâncias de reserva,

danos durante a desidratação/reidratação, ou ainda uma insuficiente tolerância a

desidratação (Moon & Hildebrand, 2003; Durzan, 2008).

A tolerância à desidratação está relacionada com a lenta perda de água pelas

células, e inclui a capacidade destas, em reidratar-se novamente (Hoekstra et al.,

2001). Os mecanismos relacionados a esta tolerância baseiam-se na troca da água

por moléculas que possibilitam a saída lenta de água, protegendo a membrana

celular contra os danos ocasionados pela desidratação (Hoekstra et al., 2001), com a

presença de consideráveis quantidades de oligossacarídeos, e proteínas específicas.

Essas proteínas, incluindo-se as LEA (“late embryogenesis abundant”) são

armazenadas na fase final da embriogênese, durante o processo de maturação e na

desidratação de tecidos vegetativos de plantas (Bewley & Black, 1994; Hoekstra et

al., 2001; Boudet et al., 2006).

Culturas de embriões somáticos submetidas às condições de maturação

sofrem a influência de diferentes fatores. Dentre estes fatores destaca-se: genótipo

do explante, estádio de desenvolvimento das massas pró-embriogênicas, tipos e

concentrações de reguladores de crescimento, osmolaridade e composição do meio

de cultura, frequência de subcultivos, e idade das culturas (Bozhkov & von Arnold,

1998; Salaj et al., 2004).

Dentre as principais estratégias para maturação de culturas embriogênicas,

estão a suplementação do meio de cultura com determinados reguladores de

crescimento e agentes osmóticos, os quais permitem a progressão do

desenvolvimento normal dos embriões somáticos (Stasolla & Yeung, 2003; Stasolla et

al., 2003). Diversos estudos têm apresentado protocolos otimizados da maturação de

embriões somáticos em coníferas, com a utilização do ABA, agentes osmóticos e

carvão ativado (Langhansova et al., 2004;Jiménez et al., 2005, García-Martin et al.,

2005).

O ABA é um regulador de crescimento freqüentemente utilizado nessa fase de

maturação dos embriões somáticos em muitas espécies arbóreas (Mauri &

Manzanera, 2004; García-Martin et al., 2005; Prakash & Gurumurthi, 2010). O

metabolismo deste composto regula vários processos fundamentais, como a síntese

e deposição de proteínas de reserva (Dodeman et al., 1997), e a eliminação do

suspensor das massas pró-embriogênicas (Filonova et al., 2000; Steiner et al., 2008).

Tipicamente, nas sementes de várias gimnospermas e angiospermas, o nível

13

endógeno de ABA é baixo, durante as fases iniciais da embriogênese, aumentando

durante o crescimento de embrião, e decrescendo nas fases finais de

desenvolvimento (Stasolla & Yeung, 2003).

Diferentes agentes osmóticos, incluindo compostos com baixo peso molecular

(sais inorgânicos, aminoácidos e mono e dissacarídeos) e com alto peso molecular

(polietilenoglicol – PEG), são comumente utilizados para diminuir o potencial osmótico

do meio de cultura. Dentre estes compostos, o PEG, devido ao seu caráter não-

plasmolisante, é o agente osmótico preferido em relação aos agentes plasmolisantes

(Tautorus et al., 1991; Attree & Fowke, 1993; Stasolla & Yeung, 2003; Stasolla et al.,

2003).

A maltose, assim como outros carboidratos, atua como fonte de carbono e

como agente osmótico (Shoji et al., 2006). A sua quebra disponibiliza glicose, que é

prontamente assimilável pelas células vegetais (Salajova et al., 1999).

Frequentemente, a utilização de maltose é preferida em relação à sacarose, por

promover um aumento no número de embriões somáticos, conforme observado para

Pinus elliottii e em Pinus taeda (Salajova et al., 1999). Adicionalmente esta

substância mantém o potencial osmótico do meio negativo, e constante, por um longo

período, devido a sua quebra mais lenta em relação à sacarose (Yildirin, 2006; Shoji

et al., 2006).

A combinação do ABA com um ou vários agentes osmóticos, tem se mostrado

eficiente para o processo de maturação, em várias espécies florestais, incluindo-se

as coníferas (Tautorus et al., 1991; Attree & Fowke, 1993; Stasolla & Yeung, 2003;

Steiner et al., 2007; Steiner et al., 2008).

1.3. O óxido nítrico e as espécies reativas de oxigênio

O óxido nítrico (NO) e as espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas

que atuam nas respostas das plantas aos vários estresses ambientais, tais como:

hídrico, temperatura, ultravioleta, ozônio (Mittler et al., 2004; Delledonne, 2005, Zago

et al., 2006), e estresses bióticos (Delledonne et al., 2001). Ambas as moléculas

estão envolvidas em processos de desenvolvimento como a germinação de

sementes, o gravitropismo, a lignificação da parede celular, a morte celular

programada e o desenvolvimento de raízes (Neill et al., 2008). Assim, essas

substâncias possuem papel fundamental nas respostas das plantas aos sinais e

estímulos endógenos (Desikan et al., 2004; Zago et al., 2006; Liu et al., 2009).

14

O NO é um radical livre, gasoso e altamente difusível que tem sido descrito

como um mensageiro intra e intercelular para diferentes sistemas vegetais (Neill et

al., 2008). Essa substância é formada, principalmente em tecidos com crescimento

ativo, como o eixo embrionário e cotilédones, com níveis menores nos tecidos

maduros e órgãos senescentes (Leshem et al., 1998; Caro & Puntarulo, 1999).

Isoladamente, o NO é uma molécula não tóxica que mesmo em altas concentrações

não ocasiona morte celular (Pryor & Squadrito, 1995). Entretanto, na presença do

superóxido (O2-), o NO torna-se um potente radical livre, com a formação de um forte

oxidante, o peroxinitrito (ONOO-) (Ducrocq et al., 1999).

Diferentes estudos demonstraram que o NO pode promover a divisão celular e

a formação de células embriogênicas, na presença da auxina ácido 2,4-

diclorofenoxiacético (2,4-D), em culturas derivadas de protoplastos de folha de alfafa

(Ötvös et al., 2005). Nesse material foi verificado que os vários doadores de NO, que

promoveram a divisão celular dependente de presença de auxina, aumentaram a

freqüência de células viáveis, e a expressão do gene McSERK, o qual somente é

expresso em células com potencial embriogênico. Adicionalmente, esses doadores

inibiram o alongamento celular, favorecendo a formação de células esféricas com

citoplasma denso (Ötvös et al., 2005). Adicionalmente, relatos de atuação do NO na

transdução de sinal de citocininas favorecendo a divisão celular foram realizados

para culturas celulares de Arabidopsis thaliana, salsa (Petroselinum crispum) e

tabaco (Nicotiana tabacum) (Tun et al., 2001).

Estudos têm demonstrado que, quando o ABA é adicionado ao meio de

cultura, ocorre um aumento nos níveis endógenos de NO (Neill et al., 2002; Guo et

al., 2003) e de ROS (Pei et al., 2000; Zhang et al., 2001), indicando que estas

substâncias possam atuar como sinalizadoras intermediárias deste fitormônio (Pei &

Kuchitsu, 2005).

O papel protetor do NO no dano oxidativo causado pelo estresse osmótico do

PEG, quando adicionado ao meio de cultura em suspensões celulares de Phragmites

communis, foi recentemente demonstrado. Verificou-se que a aplicação de

nitroprussiato de sódio (SNP), um doador de NO, previne os efeitos causados pelo

PEG, enquanto a aplicação do sequestrador de NO, 2-phenyl-4,4,5,5-

tetramethylimidazoline-1,1-oxyl-3-oxide (PTIO), cancela o efeito protetor do doador

(Zhao et al., 2008).

A morte celular programada (MCP) em plantas tem sido estudada e

relacionada com o metabolismo do NO. A MCP está presente em todos os estádios

15

do ciclo de vida da planta, desde a fertilização até a senescência da planta, inclusive

durante o processo de embriogênese (Schwartz et al., 1994). Outras situações, como

a xilogênese (Minami & Fukuda, 1995) e a resposta de hipersensibilidade (Ryerson &

Heath 1996), são caracterizadas por eventos relacionados a esse processo de MCP.

Neste sentido, estudos citológicos e moleculares, durante a embriogênese

zigótica em milho (Zea mays) indicam que a MCP ocorre durante o desenvolvimento

embrionário, e é essencial para a formação do eixo central do embrião (Giuliani et al.,

2002). A degradação das células do suspensor de embriões zigóticos em coníferas,

que tem como função primordial a promoção do crescimento do embrião nos estádios

iniciais da embriogênese, tem sido frequentemente, referida como exemplo

característico de MCP em plantas (Filonova et al., 2000). De maneira similar, durante

a embriogênese somática em P. abies verifica-se a ocorrência da MCP com a

eliminação da célula do suspensor (Filonova et al., 2000). Neste sentido, a inibição da

MCP resulta na supressão da diferenciação de embriões somáticos e eliminação de

células do suspensor, causando a inibição na maturação (Helmersson et al., 2008).

Alguns trabalhos têm demonstrado a relação entre reguladores de

crescimento vegetal, NO e ROS com o processo de MCP. Carimi et al. (2005)

demonstraram que, em suspensões celulares de A. thaliana, a citocinina BA (6-

benzylaminopurine) induz ambos, a formação de NO e a MCP, e reduz o crescimento

celular das culturas. Zago et al. (2006) propuseram que o peróxido de hidrogênio

(H2O2) age juntamente com NO, quando em concentrações elevadas, na indução da

MCP. Posteriormente, De Michele et al. (2009), trabalhando com o sistema de

suspensões celulares de A. thaliana, confirmaram o envolvimento do NO na

promoção da MCP, o que foi relacionado com a hipótese de uma aceleração da

senescência.

As ROS, assim como o H2O2, são altamente reativas e causam distúrbios no

sistema redox da célula, influenciando as principais vias metabólicas, através de

alterações diretas nas atividades enzimáticas e nas propriedades de membrana, bem

como na estrutura do DNA (Inzé & van Montagu, 1995; Cassels & Curry, 2001;

Konieczny et al., 2008). Essas substâncias, na ausência de mecanismos efetivos de

proteção, podem causar sérios danos às plantas, como por exemplo, a degradação

de proteínas, oxidação lipídica, quebra de DNA, e a MCP (Beligni & Lamattina, 1999).

As ROS podem estar relacionadas com as propriedades osmóticas do meio

de cultura e a regeneração de plantas, via embriogênese somática. O aumento nos

níveis endógenos de H2O2 parece ser essencial para a formação de embriões

16

somáticos em culturas de girassol (Konieczny et al., 2008). Estudos tem mostrado

que a sua adição ao meio de cultura promove um aumento na frequência dos

embriões somáticos neoformados em Lycium barbarum (Kairong et al., 1999) e

Gladiolus hybridus (Gupta & Datta, 2004).

Adicionalmente, estudos recentes têm demonstrado, pela primeira vez, a

ocorrência da relação entre poliaminas (PAs) e NO em plantas, onde a adição

exógena de PAs, principalmente a espermidina (Spd) e a espermina (Spm), induzem

a biossíntese e a rápida liberação de NO em plântulas de A. thaliana (Tun et al.,

2006). Estudos nesta linha tem confirmado esta relação em diferentes sistemas

vegetais (Santa-Catarina et al., 2007; Silveira et al., 2006).

1.4. A Araucaria angustifolia como modelo de estudo para a embriogênese

A. angustifolia é uma conífera nativa do Brasil, pertencente à floresta

ombrófila mista. Originalmente as florestas com essa espécie ocupavam 20 milhões

de hectares, distribuídos nos Estados de São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Santa

Catarina e Rio Grande do Sul (Guerra et al., 2002). O intenso desmatamento, iniciado

a partir da década de 30, sem a preocupação com reflorestamento das áreas

exploradas, levou ao esgotamento das reservas naturais. Atualmente, as reservas

com exemplares desta espécie, estão limitadas a aproximadamente 3% da área

original (Farjon, 2006).

A. angustifolia é uma espécie heliófita e pioneira, considerada como sendo a

única conífera nativa do Brasil com importância econômica. Sua importância

econômica está relacionada com a alta qualidade da madeira, utilizada para

tabulados, vigamentos, caixas, móveis, instrumentos musicais, artigos de esporte,

ferramentas e fabricação de compensados (Guerra et al., 2002). Além disso, a

madeira da espécie contém 58% de celulose, 29% de lignina e fibras longas de alto

rendimento em celulose, tornando-a muito atraente para as indústrias de papel e

celulose (Guerra et al., 2008). Um outro produto deste material, muito utilizado por

populações locais é a sua semente, também conhecida como pinhão (Conforti &

Lupano, 2007) e que é uma fonte rica de amido, possuindo também, proteínas,

lipídios, açúcares, fibras, magnésio e cobre, e compostos polifenólicos (Cordenunsi et

al., 2004).

No Brasil, muitos estudos têm sido realizados visando conservação e a

manutenção da variabilidade genética dos pinheirais remanescentes. Para A.

17

angustifolia, a modalidade de conservação in situ, é aquela que apresenta maiores

dificuldades para ser executada, não apenas pela fragmentação das populações

naturais e pelo longo ciclo reprodutivo (a produção de sementes normalmente ocorre

após 15 a 20 anos de idade), mas, principalmente, pela pressão de ocupação do

meio rural.

1.4.1. Aspectos bioquímicos e moleculares da embriogênese zigótica e somática

A atuação e participação de diferentes reguladores de crescimento e

sinalizadores no processo de embriogênese zigótica e somática em A. angustifolia

têm sido objeto de estudo para várias pesquisas (Silveira et al., 2006; Santos et al.,

2008a, Steiner et al., 2008; Silveira et al., 2008; Balbuena et al., 2009).

Nas fases iniciais da embriogênese, O AIA (ácido indol-3-acético) é uma das

principais auxinas relacionadas com o estabelecimento do eixo ápice-base, e com a

simetria bilateral do embrião (Kong et al., 1997; Friml et al., 2003). Durante a

embriogênese zigótica em A. angustifolia foi demonstrado que conteúdos mais

elevados de AIA ocorrem nos estádios iniciais do processo, com um decréscimo

contínuo até o final do desenvolvimento embrionário, quando ocorre a diferenciação

dos cotilédones e o desenvolvimento da semente (Astarita et al., 2003a). Situação

inversa ocorre em relação ao ABA, ou seja, durante as fases iniciais da

embriogênese zigótica, foi identificado um conteúdo mais reduzido, aumentando

durante o desenvolvimento do embrião, e decrescendo nas fases finais de

desenvolvimento embrionário (Silveira et al., 2006).

Durante a embriogênese zigótica, o papel das PAs tem sido avaliado para o

sistema A. angustifolia (Astarita et al, 2003b; Silveira et al., 2006). Astarita et al.

(2003b) verificaram que a putrescina (Put) possui importância fundamental no início

da embriogênese, quando a taxa de divisão celular é alta. Elevados conteúdos de

espermidina (Spd) e espermina (Spm) são essenciais ao final do desenvolvimento do

embrião, quando o crescimento está associado, principalmente, com o alongamento

celular.

Estudos de proteômica comparativa também foram realizados para os

diferentes estádios da embriogênese zigótica de A. angustifolia (Silveira et al., 2008;

Balbuena et al., 2009). Foram identificadas proteínas estádio-específicas, as quais

podem ser utilizadas como marcadores bioquímicos. Destaca-se que, a síntese de

proteínas de reserva foi sugerida com sendo fundamental para o monitoramento do

desenvolvimento de embriões zigóticos e somáticos (Silveira et al., 2008). Balbuena

18

(2009), trabalhando com esse sistema, verificaram que, durante a fase inicial de

desenvolvimento do embrião zigótico, as proteínas mais expressas estão

relacionadas com o metabolismo do estresse oxidativo, enquanto nas fases tardias

ocorre uma ativação do metabolismo como um todo, resultando numa intensa

assimilação de carbono e acúmulo de compostos de armazenamento.

Dos Santos et al. (2006) realizaram análises qualitativas e quantitativas dos

mapas proteômicos obtidos por 2-DE de diferentes estádios do desenvolvimento de

sementes de A. angustifolia. Embora não tenham sido utilizadas técnicas de

espectrometria de massas para a identificação de proteínas, a presença de

arabinogalactanos e proteínas do tipo quitinases foram detectadas por coloração

imunológica e utilização de substratos específicos, em análises por eletroforese

unidimensional. Nesse trabalho, os pesquisadores utilizaram a estratégia de

identificação de proteínas por PMF (peptide mass fingerprinting) para a identificação

das proteínas e observadaram a ocorrência, exclusivamente no estádio maduro, da

enzima fosfoinositídeo fosfatase, de uma proteína LEA e de uma proteína de reserva

do tipo vicilina.

O primeiro relato da embriogênese somática em A. angustifolia foi realizado

por Guerra & Kemper (1992). Desde então, diversos grupos de pesquisa vêm

trabalhando no desenvolvimento de protocolos para indução, manutenção e

maturação de embriões somáticos nesta espécie (Astarita & Guerra, 1998, 2000;

Guerra et al., 2000; dos Santos et al., 2002; Silveira et al., 2002; Steiner et al., 2005;

Silveira et al., 2006; Steiner et al., 2007, 2008; Santos et al., 2008b). As condições

básicas para a indução de culturas e proliferação das culturas embriogênica, a partir

de embriões zigoticos imaturos foram estabelecidas (Astarita e Guerra, 1998; 2000;

Guerra et al., 2000; Silveira et al., 2002, dos Santos et al., 2002). Essas etapas da

embriogênese ocorrem em meios de cultura suplementados ou não com

fitorreguladores (Steiner et al., 2005; Steiner et al., 2007) e são influenciadas pela

fonte de carbono, utilizada no meio de cultura (Steiner et al., 2005).

As relações entre as PAs e o NO e as suas interações com as vias de

diferenciação e multiplicação das culturas embriogênicas, foram demonstradas no

processo de embriogênese somática, em A. angustifolia (Silveira et al., 2006; Steiner

et al., 2008; Osti et al., 2010). Durante a proliferação de culturas embriogênicas,

Steiner et al. (2005) verificou que a PA que ocorre em maior quantidade é a Put,

seguida pela Spd e Spm, o que favorece a manutenção da divisão celular. Quando

essas culturas foram suplementadas com Spm e Spd, ocorreu um maior acúmulo de

19

matéria seca e uma maior deposição de substâncias de reserva, como proteínas e

amido. Ao adicionar a Spd ao meio de cultura, ocorre um aumento no conteúdo

endógeno de ABA (Steiner et al., 2005).

Silveira et al. (2006) verificaram que as PAs, Spd e Spm, reduzem o

crescimento celular e o conteúdo endógeno de NO, além de promoverem a

progressão da morfologia dos pró-embriões. Adicionalmente, propuseram que as PAs

devem estar envolvidas no processo da maturação de culturas embriogênicas.

Sugeriram uma possível correlação entre a produção de NO, induzida ou não pelas

PAs, e a aquisição para a competência para a embriogênese. O efeito da aplicação

exógena de um doador de NO em culturas embriogênicas de A. angustifolia foi

avaliado por Osti et al. (2010), onde verificaram que a adição de NO interfere no

crescimento celular, dentro de um limite de concentração, quando suplementado ao

meio de cultura.

Como para a maioria das arbóreas, a maturação de embriões somáticos

constitui uma etapa crítica para o sucesso de protocolos de embriogênese somática

em A. angustifolia (Steiner et al., 2008). Vários estudos têm sido realizados,

objetivando a identificação do efeito do ABA, PEG e maltose durante a maturação

destas culturas embriogênicas (Steiner et al., 2005; Steiner et al., 2008). Nesse

sistema, a suplementação com ABA ao meio de cultura de maturação, após oitenta

dias, propiciou o desenvolvimento dos embriões nos estádios tardios, similarmente ao

observado para os embriões zigóticos. Contudo, esses embriões somáticos ocorrem

em baixa freqüência, e de maneira não sincronizada (Steiner et al., 2007). A adição

de PEG, ABA e maltose, revelaram variações no padrão de proteínas

diferencialmente expressas. Assim, culturas tratadas com PEG apresentaram maior

número de polipeptídios, enquanto aquelas tratadas com ABA, o menor número de

polipeptídios. Com relação à presença de maltose, verificaram uma maior

porcentagem de polipeptídios de alto peso molecular (Andrade et al., 2007) e um

incremento no conteúdo protéico, quando comparado com o controle suplementado

com sacarose (Steiner et al., 2005).

Embora os vários estudos acima relatados tenham sido realizados utilizando o

efeito dos agentes promotores da maturação, como ABA, PEG e maltose, sobre o

metabolismo bioquímico de PAs, proteínas e hormônios vegetais.

Até o presente momento, não foram conduzidos estudos no sentido de

verificar o efeito de agentes promotores de maturação (ABA, PEG e maltose), no

metabolismo endógeno de NO e ROS e no crescimento de culturas embriogênicas de

20

A. angustifolia. Estudos neste sentido são fundamentais para o entendimento dos

eventos bioquímicos associados à maturação na embriogênese somática dessa

espécie.

21

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Estudar o efeito dos agentes promotores da maturação no metabolismo de

NO e ROS, crescimento e evolução morfológica das culturas embriogênicas de A.

angustifolia.

2.2. Objetivos específicos

● Verificar o efeito dos promotores de maturação na produção de NO e ROS

em culturas embriogênicas da linhagem BM de A angustifolia;

● Realizar estudos comparativos entre duas linhagens (BM e MSG) com

diferentes competências para maturação, verificando o efeito dos promotores de

maturação na produção de NO e ROS e evolução morfológica em culturas

embriogênicas de A angustifolia.

22

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Material vegetal Como material vegetal foi utilizada a A. angustifolia, uma conífera nativa do

Brasil, pertencente à floresta ombrófila mista (Guerra et al., 2002). Para o início das

culturas, como fonte de explantes foram utilizados embriões zigóticos retirados de

sementes imaturas, obtidas a partir de cones femininos imaturos, coletados em

diferentes localidades. Assim, para a primeira linhagem, denominada BM, foram

utilizadas sementes imaturas coletadas entre dezembro de 2004 e janeiro de 2005,

provenientes do município de Epagri de Lages (SC). Para a segunda linhagem,

denominada MSG, foram coletadas sementes imaturas, no município de Canoinhas

(SC), em dezembro de 2008.

3.2. Indução, manutenção e multiplicação das culturas

Foram utilizadas duas linhagens distintas baseadas na competência para a

maturação dos pró-embriões somáticos. As condições de maturação foram

estabelecidas em experimentos prévios, e são consideradas a seguir:

a) Linhagem BM (fig. 1A): essa linhagem, considerada não competente para a

maturação, foi induzida e estabelecida de acordo com Steiner et al. (2005), no

Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal – LFDGV/UFSC em

2005, e mantidas no Laboratório de Biologia Celular de Planta, BIOCEL - Depto de

Botânica - IB/USP. A manutenção e multiplicação das culturas foram realizadas em

meio de cultura BM (Gupta & Pullmann, 1991) suplementado com sacarose (3%),

caseína hidrolisada (0,5 g.L-1), L-glutamina (1,0 g.L-1) e mio-inositol (0,1 g.L-1), 2 µM

de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacetico), 0,5 µM de BA (6-benzilaminopurina) e 0,5

µM de Kin (cinetina) com a adição de phytagel® (2%). O pH do meio de cultura foi

ajustado para 5,7, após a adição dos reguladores de crescimento, e antes da

autoclavagem à 121ºC, e 1,5 atm, por 15 min. A solução de glutamina foi

filtroesterilizada, e adicionada ao meio de cultura após a autoclavagem. A

manutenção e multiplicação das culturas foram realizadas através de repicagens

sucessivas, a cada 21 dias, mantidas no escuro, em temperatura controlada de

25±1ºC.

b) Linhagem MSG (fig. 1B): essa linhagem, considerada competente para a

maturação, foi induzida e estabelecida no BIOCEL, de acordo com a metodologia

23

descrita por Becwar et al. (1989). As culturas foram mantidas, em meio de cultura

MSG (Becwar et al., 1989), suplementado com Gelryte® (0,3%). O pH do meio de

cultura foi ajustado para 5,7, antes da autoclavagem a 121ºC, 1,5 atm, por 15 min. A

solução de glutamina foi filtroesterilizada, e adicionada ao meio de cultura após a

autoclavagem. A manutenção e multiplicação das culturas foram realizadas através

de repicagens sucessivas a cada 21 dias, mantidas no escuro, em temperatura

controlada de 25±1ºC.

5mm 0,5mm

A B

E

E5mm 0,5mm

A B

5mm 0,5mm5mm 0,5mm

A B

E

E

Figura 1: Aspecto das culturas embriogênicas de A.angustifolia durante a maturação em meio de cultura semi-solido. Linhagem BM (A) sem competência para maturação dos embriões somáticos, e linhagem MSG (B) com competência para maturação dos embriões somáticos. (E): embrião somático.

3.2.1. Estabelecimento das suspensões celulares

As suspensões celulares foram obtidas a partir das duas linhagens de culturas

embriogênicas (item 3.2). Os meios de cultura foram os mesmos utilizados para a

multiplicação das respectivas culturas, sem a adição do agente solidificante, e dos

reguladores de crescimento 2,4-D, BA e Kin.

Para iniciar as suspensões celulares, 500 mg de células mantidas no meio

semi-sólido (item 3.2), foram dissociadas e inoculadas em meio de cultura líquido, em

frascos de Erlenmeyer (250mL) contendo 50 mL de meio de cultura. Esses frascos

foram mantidos em agitador horizontal orbital (60 rpm) à temperatura de 25±1ºC, no

escuro, com subcultivos a cada 15 dias.

As suspensões celulares obtidas foram filtradas e as células retidas, em

peneira de dissociação celular (Sigma S-1145, malha 150 m), foram utilizadas para

os estudos de maturação dos embriões somáticos.

24

3.3. Avaliações bioquímicas, morfológicas e de crescimento

3.3.1. Quantificação e visualização de NO e ROS A quantificação e visualização do NO e ROS nas suspensões celulares foram

realizadas de acordo com as metodologias descritas por Silveira et al. (2006) e Laxalt

et al. (2007), respectivamente. A Figura 2 apresenta um esquema da metodologia

utilizada.

50mg

2 ml de meio de cultura

Incubação com:

DAR 4M (2,5 M)

DAR 4MAM (5 M)

H2DCFDA (25 M)

Fluorômetro

Microscópio de fluorescência

Agitação (100rpm)

Escuro

Tratamentos

Liberação e visualização de NO e ROS

50mg


Incubação com:

DAR 4M (2,5 M)

DAR 4MAM (5 M)

H2DCFDA (25 M)

Fluorômetro


Agitação (100rpm)

Escuro

Tratamentos


50mg


Incubação com:

DAR 4M (2,5 M)

DAR 4MAM (5 M)

H2DCFDA (25 M)

Fluorômetro


Agitação (100rpm)

Escuro

Tratamentos


50mg


Incubação com:

DAR 4M (2,5 M)

DAR 4MAM (5 M)

H2DCFDA (25 M)

Fluorômetro


Agitação (100rpm)

Escuro

Tratamentos


Culturasembriogênicas

Figura 2: Metodologia utilizada para a quantificação e visualização de NO e ROS, nas culturas embriogênicas de A. angustifolia.

Para as análises de NO e ROS, foram utilizadas 50 mg das células em

suspensão (item 3.2.1.), as quais foram inoculadas em 2 mL do respectivo meio de

cultura. Após 1h, adicionou-se o marcador de fluorescência, o reagente DAR-4M

(diaminorhodamine 4M), impermeável à membrana plasmática, para a quantificação

do NO extracelular liberado, e o reagente DAR-4M AM (diaminorhodamine-4M

acetoxymethyl ester), permeável à membrana plasmática, para quantificação

intracelular de NO. A quantificação das ROS foi realizada utilizando-se o reagente

H2DCFDA (2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate). As células foram mantidas em

cultivo, durante duas horas no escuro, sob agitação de 60 rpm, a 25°C ± 2.

A quantificação da fluorescência, após duas horas de incubação, foi

determinada, utilizando-se um fluorômetro (Victor 3TM - PerkinElmer), com excitação

em comprimentos de onda de 560 nm e emissão em 575 nm para o DAR 4M e DAR

4M AM. Para o H2DCFDA utilizou-se comprimento de onda de excitação em 502 nm e

de emissão em 523 nm.

25

As análises de microscopia de fluorescência foram realizadas após 1 hora de

incubação com os reagentes DAR-4M AM e H2DCFDA. Após esta incubação, as

células foram lavadas, montadas em lâminas e o material analisado utilizando-se

microscópio de fluorescência Axio Imager M2 (Zeiss) com o programa Axio Vision

Rel. 4.8 (Zeiss), e fotografado com câmera Axio Cam MR3 (Zeiss), obtendo-se

imagens em campo claro e fluorescência para efeito de comparação e identificação

do local de produção de NO e ROS. Foram utilizados os seguintes filtros: para o DAR

filtro de excitação 546/12 e emissão 575-640, e para H2DCFDA filtro de excitação

500/20 e emissão 535/30.

3.3.2. Análises morfológicas O aspecto morfológico das culturas embriogênicas nos diferentes tratamentos

foi monitorado através da dupla-coloração com azul de Evans e carmin acético,

segundo a metodologia descrita por Gupta & Durzan (1987). Esta dupla coloração

realizada permite uma visualização diferenciada dos tipos celulares uma vez que as

várias células que compõe o embrião somático possuem diferentes afinidades com

estes corantes. Assim, o carmim acético possui alta afinidade com o núcleo das

células da região embriogênica, que coram intensamente de vermelho, enquanto o

Azul de Evans cora as células vacuoladas dos suspensores, evidenciando o núcleo,

em azul escuro, e o citoplasma, em azul claro (von Arnold et al, 1995).

Os materiais corados foram montados em lâminas e lamínulas, e analisadas

utilizando-se um microscópio Axio Imager M2 (Zeiss), com o programa Axio Vision

Rel. 4.8 (Zeiss), e fotografado com o auxílio de uma câmera Axio Cam MR3 (Zeiss)

acoplada ao equipamento.

3.3.3. Determinação da morte celular A morte celular foi avaliada utilizando-se a metodologia descrita por Delledone

et al. (2001). Para tanto, as células foram incubadas em uma solução de corante de

azul de Evans (0,05%). Após lavagem, com água, e extração, a 50ºC com a solução

SDS (dodecilsulfato de sódio): metanol: água (1:50:50), a absorbância foi medida, em

comprimento de onda de 600 nm (espectrofotômetro Shimadzu UV-1601). A

diferença entre os valores obtidos, para o controle e para a maturação, foi

transformada em porcentagem, considerando o valor do controle como 100%, em

cada uma das linhagens.

26

3.3.4. Determinação da matéria seca Amostras dos vários tratamentos foram congeladas em nitrogênio líquido, e

armazenadas a -80ºC em todos os dias de coleta. Os materiais foram liofilizados por

aproximadamente 18h, em liofilizador (LABCONCO Freezone 4.5.), e a matéria seca

final foi avaliada obtendo-se a pesagem das amostras em utilizando-se balança

analítica (Mettler Toledo AB204).

3.3.5. Determinação da matéria fresca

O crescimento das culturas após 21 dias de cultivo foi avaliado após a

transferência do material, cultivado em placas de 12 poços, para tubos do tipo

eppendorf, seguido de centrifugação por 1 min, a 3000 rpm, para separação do meio

de cultura. As células isoladas foram pesadas utilizando-se balança analítica (Mettler

Toledo AB204) e a matéria fresca determinada.

3.3.6. Curva de crescimento

A curva de crescimento foi realizada utilizando-se a metodologia do volume

celular sedimentado, descrita por Osti et al. (2010), cada 2 dias de cultivo, durante 30

dias de incubação. Para tanto, foram utilizados frascos Erlemeyer (50 mL) adaptados

(Osti et al., 2010) contendo 6 mL de meio de cultura de maturação, e onde foram

inoculados 120 mg de células.

3.3.7. Análises estatísticas Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os dados obtidos foram

submetidos a análise da variância (ANOVA), e quando necessário foi aplicado o teste

de T Student, usando o programa BioEstat 5.0 desenvolvido pelo Instituto Mamirauá.

3.4. Estudo do efeito dos promotores de maturação na produção de NO em culturas embriogênicas da linhagem BM de A angustifolia

3.4.1. Efeito da concentração dos agentes de maturação no crescimento celular e na produção endógena de NO

Visando estudar o efeito dependente da concentração dos agentes de

maturação sobre a síntese de endógena e liberação de NO, bem como no

27

crescimento celular, foram utilizadas suspensões celulares mantidas no meio de

cultura BM líquido (item 3.2.). Ao meio de cultura foram adicionados diferentes

concentrações de ABA (0, 50, 100 e 200 µM), PEG (0, 4,5, 9 e 13,5%) e Maltose (0,

4,5, 9 e 13,5%), isoladamente ou em combinação, obtendo-se os seguintes

tratamentos:

1) Controle;

2) ABA 50 µM; 3) ABA 100 µM; 4) ABA 200 µM;

5) PEG 4,5%; 6) PEG 9%; 7) PEG 13,5%;

8) Maltose 4,5%; 9) Maltose 9%; 10) Maltose 13,5%;

11) APM1: ABA 50 µM + 4,5% PEG +4,5% Maltose;

12) APM 2: ABA 100 µM + 9% PEG + 9% Maltose;

13) APM 3: ABA 200 µM + 13,5% PEG + 13,5% Maltose;

14) APM 4: ABA 200 µM + 9% PEG + 9% Maltose.

O pH dos meios de cultura foram ajustados para 5,7, antes da autoclavagem

a 121ºC e 1,5 atm, por 15 min. O ABA foi adicionado ao meio de cultura após a

autoclavagem, por filtroesterelização, em câmara de fluxo laminar.

Para o inicio das culturas, 40 mg de células embriogênicas (item 3.1.2.) foram

transferidas para as placas de cultura contendo 12 poços. Cada um dos poços

recebeu 2 mL dos meios de cultura (tratamentos 1-14), descritos acima. Após 21 dias

de cultivo, foram analisados o conteúdo de NO intra e extracelular, em respectivos

novos meios de cultura, conforme descrito no item 3.3.1.

O crescimento das culturas foi realizado conforme descrito no item 3.3.5.

3.4.2. Efeito do tempo de incubação no crescimento celular e na produção endógena de NO e ROS durante o período de cultura in vitro.

Foi utilizado o meio de cultura BM líquido, ao qual foram adicionados os

agentes de maturação, constituindo os seguintes tratamentos:

1) Controle – sem adição de promotores de maturação;

2) ABA 200µM;

3) PEG 9%;

4) Maltose 9%;

5) APM = ABA 200µM + PEG 9% + Maltose 9%.

A seleção dessas concentrações dos agentes de maturação basearam-se nas

análises realizadas e descritas no item anterior (Item 3.4.1). O pH dos meios de

cultura foram ajustados para 5,7 antes da autoclavagem a 121ºC, e 1,5 atm por 15

min. O ABA foi adicionado ao meio de cultura após a autoclavagem, por

filtroesterilização, em câmara de fluxo laminar.

28

O crescimento foi avaliado através da realização de uma curva de crescimento

descrita no item 3.3.6.

Para as análises de NO e ROS, as células (700mg) foram cultivadas, em

frascos Erlemeyer, contendo 35ml dos meios de cultura de maturação. Após 21 dias

em cultura, o material foi filtrado e as células (50mg) retidas, em peneira de

dissociação celular (Sigma S-1145, malha 150 m), foram utilizadas para realização

da quantificação conforme descrito no item 3.3.1. As análises de NO e ROS foram

realizadas durante as 2h iniciais de incubação e após 21 dias de cultivo. A

quantificação foi realizada, em respectivos novos meios de cultura, durante um

período de 2 h, com intervalos de 5 min entre cada leitura no fluorômetro.

3.4.3. Efeito do doador, sequestrador e inibidores da síntese de NO sobre o conteúdo endógeno de NO e ROS

Os tratamentos utilizados foram os mesmos descritos no item 3.4.2. Para as

analises foram incorporados, ao meio de cultura 100µM das seguintes substancias:

um doador de NO, o nitroprussiato de sódio (SNP); um seqüestrador de NO, o 2-

phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1,1-oxyl-3-oxide (PTIO); e dois inibidores da

síntese de NO, o NG-nitro-L-arginine methyl ester (L- NAME), inibidor da enzima óxido

nítrico sintase (NOS); e o Tungstato, inibidor da enzima nitrato redutase (NR).

O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,7, antes da autoclavagem, a

121ºC, e 1,5 atm durante 15 min. Todos os compostos foram adicionados ao meio de

cultura após a autoclavagem, por filtroesterilização (membrana de 0,22 m), em

câmara de fluxo laminar.

Os materiais foram cultivados em placas de cultura de 12 poços e após 21

dias de cultivo, foram analisados os conteúdos de NO intra e extracelular e ROS

intracelular conforme metodologia descrita no item 3.3.1.

3.4.4. Efeito do condicionamento do meio de cultura no conteúdo de NO e ROS Celulas embriogênicas (700mg de células do item 3.2.1.), foram inoculadas

em frascos contendo 35ml de meio de cultura BM (item 3.2.1.), e nos seguintes

tratamentos: 1) Controle: sem a adição de promotores de maturação; 2) APM:

suplementado com ABA (200 µM), PEG (9%) e maltose (9%) (APM).

Após 21 dias de cultivo, as culturas foram filtradas conforme item 3.4.2. Em

placas de cultura foram adicionadas 50mg dessas células e 2 ml de meio de cultura

denominados acondicionado e fresco. Foi estabelecido como sendo o meio

acondicionado, aquele em que as células foram cultivadas, durante o período de 21

29

dias, e como meio fresco, um meio novo de mesma formulação. Foram realizadas

análises de NO intra e extracelular como descrito no item 3.3.1.

3.5. Estudo comparativo, entre duas linhagens (BM e MSG) com diferentes competências para maturação

O efeito dos agentes de maturação, na evolução morfogenética foi avaliado

pela utilização dos seguintes tratamentos :

Para a linhagem BM:

Tratamento 1- meio BM sem promotores de maturação (controle);

Tratamento 2- meio BM suplementado com PEG, maltose , durante todo o

período em cultura (60 dias) e ABA, após 30 dias de cultura;

Para a linhagem MSG:

Tratamento 3- meio MSG sem promotores de maturação (controle);

Tratamento 4- meio MSG suplementado com PEG, maltose , durante todo o

período em cultura (60 dias) e ABA, após 30 dias de cultura.

Nos tratamentos controle, sem os agentes de maturação (Tratamento 1 e 3),

as repicagens foram realizadas a cada 15 dias, até um período total de 60 dias, e

sempre para o meio de cultura de mesma formulação que o inicial (descrito no item

3.2.1). Para os tratamentos contendo os agentes promotores de maturação

(Tratamento 2 e 4), durante os primeiros 30 dias, as células foram incubadas em

meio de maturação (meio cultura descrito no item 3.2.1.) suplementado com PEG

4000 (7%) e maltose (9%). Nos últimos 30 dias de maturação além de PEG e

maltose, foi adicionado ao meio de cultura o ABA (120µM).

As soluções de ABA e glutamina foram filtroesterilizadas e adicionadas aos

meios de cultura após a autoclavagem.

A cada 15 dias de cultivo, nos diferentes tratamentos, as suspensões

celulares foram filtradas em uma peneira de dissociação celular (Sigma S-1145,

malha 150 m). Parte das células retidas na filtragem foi utilizada para as análises

bioquímicas e morfológicas. A outra parte das células retidas (1g) foi utilizada para

dar continuidade ao ciclo seguinte, em frascos contendo 100ml de meio de cultura

dos respectivos tratamentos. Após a inoculação, as suspensões celulares foram

mantidas em agitador horizontal orbital (60 rpm), à temperatura de 25±1ºC, no

escuro.

30

As analises realizadas a cada 15 dias foram: quantificação e visualização de

NO e ROS (item 3.3.1), avaliação morfológica (item 3.3.2), morte celular (item 3.3.3) e

matéria seca (item 3.3.4). A Figura 3 apresenta um resumo das avaliações realizadas

com as duas linhagens, nos diferentes tratamentos.

Quantificação NO

Peso Seco

Morte Celular

Visualização NO

Quantificação ROS

Visualização ROS

Aspectos Morfológicos

CélulasAvaliações a cada 15 dias

Quantificação NO

Peso Seco

Morte Celular

Visualização NO

Quantificação ROS

Visualização ROS

Aspectos Morfológicos

CélulasAvaliações a cada 15 dias

Figura 3: Avaliações realizadas, nas células das suspensões celulares das linhagens BM e MSG, nos diferentes tratamentos e analisadas a cada 15 dias de cultivo.

31

4. RESULTADOS

4.1. Estudo do efeito dos promotores de maturação no crescimento e na produção de NO e ROS em culturas embriogênicas da linhagem BM de A angustifolia

4.1.1. Efeito concentração dependente dos promotores de maturação no crescimento e no conteúdo de NO e ROS

A análise do crescimento após 21 dias de cultivo em diferentes concentrações

de ABA, PEG e maltose, demonstrou que ocorre um menor crescimento das culturas

embriogênicas mantidas nos tratamentos com agentes de maturação, quando

comparado ao controle, independentemente do tratamento utilizado (Fig. 4).

Verificou-se que o decréscimo no crescimento das culturas foi dose-dependente,

ocorrendo uma redução do crescimento com o aumento da concentração do agente

de maturação incorporado ao meio de cultura. Os menores valores para crescimento

foram observados nas culturas embriogênicas mantidas no meio contendo a

combinação de todos os agentes promotores de maturação (APM), e no tratamento

com 13,5% de maltose (Fig. 4).

0

10

20

30

40

50

60

Cre

scim

ento

(% re

lativ

a)

ABA PEG Maltose APM

50µM 100µM 200µM 4,5% 9% 13,5% 4,5% 9% 13,5% 1 2 3 4

aa

abab

bcab

bcbcd

dd

dd

cd

0

10

20

30

40

50

60

Cre

scim

ento

(% re

lativ

a)

ABA PEG Maltose APM

50µM 100µM 200µM 4,5% 9% 13,5% 4,5% 9% 13,5% 1 2 3 40

10

20

30

40

50

60

Cre

scim

ento

(% re

lativ

a)

ABA PEG Maltose APM

50µM 100µM 200µM 4,5% 9% 13,5% 4,5% 9% 13,5% 1 2 3 4

aa

abab

bcab

bcbcd

dd

dd

cd

Cre

scim

ento

(% re

lativ

a ao

con

trol

e)

ABA (µM) PEG (%) Maltose (%) APM50 100 200 4,5 9 13,5 4,5 9 13,5 1 2 3 4

0

10

20

30

40

50

60

Cre

scim

ento

(% re

lativ

a)

ABA PEG Maltose APM

50µM 100µM 200µM 4,5% 9% 13,5% 4,5% 9% 13,5% 1 2 3 4

aa

abab

bcab

bcbcd

dd

dd

cd

0

10

20

30

40

50

60

Cre

scim

ento

(% re

lativ

a)

ABA PEG Maltose APM

50µM 100µM 200µM 4,5% 9% 13,5% 4,5% 9% 13,5% 1 2 3 40

10

20

30

40

50

60

Cre

scim

ento

(% re

lativ

a)

ABA PEG Maltose APM

50µM 100µM 200µM 4,5% 9% 13,5% 4,5% 9% 13,5% 1 2 3 4

aa

abab

bcab

bcbcd

dd

dd

cd

Cre

scim

ento

(% re

lativ

a ao

con

trol

e)

ABA (µM) PEG (%) Maltose (%) APM50 100 200 4,5 9 13,5 4,5 9 13,5 1 2 3 4

Figura 4: Crescimento (% em relação ao controle) das suspensões celulares embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle e suplementados com diferentes concentrações de ABA, PEG e maltose. (APM 1: 50µM ABA + 4,5% PEG + 4,5% Maltose; APM 2: 100µM ABA + 9%PEG + 9%Maltose; APM3: 150µM ABA + 13,5%PEG + 13,5%Maltose; APM 4: 200µM ABA + 9%PEG + 9%Maltose). Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3).

Após 21 dias de incubação, verificou-se que o conteúdo intracelular de NO do

tratamento controle não diferiu dos tratamentos contendo ABA, independentemente

da concentração utilizada, similar ao verificado também para o tratamento PEG 4,5%.

Nos demais tratamentos de maturação foram quantificadas concentrações menores

32

de NO intracelular comparado-se ao controle (Fig. 5A). Os tratamentos contendo a

combinação dos três agentes de maturação (tratamento APM), apresentaram as

menores concentrações de NO intracelular em relação aos demais tratamentos

realizados. De uma forma geral, observou-se um decréscimo no conteúdo intracelular

de NO, com o aumento na concentração dos agentes de maturação utilizados (Fig.

5A).

Em relação ao conteúdo de NO extracelular liberado, verificou-se que a

adição do PEG resultou nos menores valores, enquanto os tratamentos APM 2 (100

µM ABA + 9% PEG + 9% Maltose), Maltose 13,5% e ABA 50 M apresentaram as

maiores concentrações de NO extracelular (Fig. 5B).

0

0.5

1

Controle ABA (µM) PEG (%) Maltose (%) APM

50 100 200 4,5 9 13,5 4,5 9 13,5 1 2 3 4

Con

teúd

o de

NO

(10

5U

A)

Aa

ab abbc bc

cdcde

de

cd

de de e e e

NO intracelular

0

0.5

1


50 100 200 4,5 9 13,5 4,5 9 13,5 1 2 3 4

Con

teúd

o de

NO

(10

5U

A)

Aa

ab abbc bc

cdcde

de

cd

de de e e e

0

0.5

1


50 100 200 4,5 9 13,5 4,5 9 13,5 1 2 3 4

Con

teúd

o de

NO

(10

5U

A)

Aa

ab abbc bc

cdcde

de

cd

de de e e e

NO intracelular

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Con

teúd

o de

NO

(10

5U

A)

B

bc abcbcd cde

g g fgdef

bcde

abcbc

a

cdeefg


50 100 200 4,5 9 13,5 4,5 9 13,5 1 2 3 4

NO extracelular

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Con

teúd

o de

NO

(10

5U

A)

B

bc abcbcd cde

g g fgdef

bcde

abcbc

a

cdeefg


50 100 200 4,5 9 13,5 4,5 9 13,5 1 2 3 4 0

0.5

1

1.5

2

2.5

Con

teúd

o de

NO

(10

5U

A)

B

bc abcbcd cde

g g fgdef

bcde

abcbc

a

cdeefg

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Con

teúd

o de

NO

(10

5U

A)

B

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Con

teúd

o de

NO

(10

5U

A)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Con

teúd

o de

NO

(10

5U

A)

B

bc abcbcd cde

g g fgdef

bcde

abcbc

a

cdeefg


50 100 200 4,5 9 13,5 4,5 9 13,5 1 2 3 4

NO extracelular

Figura 5: Conteúdo de NO intracelular (A) e extracelular (B) nas suspensões celulares embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle e suplementados com diferentes concentrações de ABA, PEG e maltose. (APM 1: 50µM ABA + 4,5% PEG + 4,5% Maltose; APM 2: 100µM ABA + 9%PEG + 9%Maltose; APM3: 150µM ABA + 13,5%PEG + 13,5%Maltose; APM 4: 200µM ABA + 9%PEG + 9%Maltose). Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3). : tratamento controle; : tratamentos de maturação. (UA= unidades de absorbância).

33

4.1.2. Efeito da adição dos agentes promotores de maturação, em diferentes períodos de cultura, na produção endógena de NO e ROS

A aplicação dos promotores de maturação, no início da incubação, promove

um aumento na quantidade de NO em todos os tratamentos, durante 2h de análise. A

maior produção endógena de NO, ocorreu para o tratamento contendo maltose (Fig.

6A). A menor quantidade foi identificada no tratamento APM, onde foram adicionados

todos os promotores de maturação (Fig. 6A).

Por outro lado, após 21 dias de incubação verificou-se uma alteração no

padrão de síntese de NO pelos promotores de maturação comparado à análise com 2

h. Foi verificada uma redução dos níves intracelulares de NO (Fig. 6B), em todos os

tratamentos, e com os menores valores no tratamento APM.

Para o tratamento APM observou-se uma redução nos níveis endógenos de

NO, em relação ao controle, já nas duas primeiras horas de incubação (Fig. 6A),

enquanto para a maltose, o processo se inicia com a promoção síntese de NO

durante as duas primeiras horas (Fig. 6A), seguido de uma redução após 21 dias de

incubação (Fig. 6B).

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

A

B

Con

teúd

o re

lativ

o de

NO

0h 30min 1h 1h30min 2h

Con

teúd

o re

lativ

o de

NO


0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

A

B

Con

teúd

o re

lativ

o de

NO


Con

teúd

o re

lativ

o de

NO


NO 0 dias

NO 21 dias

a

bbccdd

a

bb

c

d

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

A

B

Con

teúd

o re

lativ

o de

NO


Con

teúd

o re

lativ

o de

NO


0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

A

B

Con

teúd

o re

lativ

o de

NO


Con

teúd

o re

lativ

o de

NO


NO 0 dias

NO 21 dias

a

bbccdd

a

bb

c

dCon

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

A

B

Figura 6: Conteúdo de NO intracelular após 2 horas (A) e 21 dias (B) de incubação das suspensões celulares embriogênicas nos tratamentos controle, ABA (200 uM), PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose). Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo

34

com o Teste T (n=3). ( Controle/ ABA/ PEG/ maltose/ APM) (UA= unidades de absorbância).

A produção de ROS foi crescente nas suspensões celulares, durante as duas

horas após a aplicação dos promotores de maturação, em todos os tratamentos (Fig.

7A). As menores concentrações de ROS foram observadas nos tratamentos

suplementados com PEG, e com a combinação de todos os promotores (APM). Os

maiores conteúdos de ROS foram obtidos para as culturas controle, incubadas sem a

adição dos agentes de maturação (Fig. 7A).

Após 21 dias de incubação, ocorreu uma diferença acentuada no conteúdo de

ROS entre o controle e os demais tratamentos (Fig. 7B). As culturas mantidas no

controle, ou seja, sem a adição de promotores de maturação, apresentaram um

conteúdo crescente e alto de ROS, seguido pelo tratamento com ABA. Os demais

tratamentos apresentaram concentrações de ROS baixas e constantes.

0

5

10

15

20

25

30

0

2

4

6

8

10

12

14

16

A

B

Con

teúd

o re

lativ

o de

RO

S


Con

teúd

o re

lativ

o de

RO

S


0

5

10

15

20

25

30

0

2

4

6

8

10

12

14

16

A

B

Con

teúd

o re

lativ

o de

RO

S


Con

teúd

o re

lativ

o de

RO

S


a

b

ccc

ab

d

c

b

ROS 0 dias

ROS 21 dias

0

5

10

15

20

25

30

0

2

4

6

8

10

12

14

16

A

B

Con

teúd

o re

lativ

o de

RO

S


Con

teúd

o re

lativ

o de

RO

S


0

5

10

15

20

25

30

0

2

4

6

8

10

12

14

16

A

B

Con

teúd

o re

lativ

o de

RO

S


Con

teúd

o re

lativ

o de

RO

S


a

b

ccc

ab

d

c

b

ROS 0 dias

ROS 21 dias

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)C

onte

údo

de N

O (1

0 5

UA)

A

B

Figura 7: Conteúdo intracelular de ROS após 2 horas (A) e 21 dias (B) de incubação das suspensões celulares embriogênicas nos tratamentos controle, ABA (200 uM), PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose). Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3). ( Controle/ ABA/ PEG/ maltose/ APM) (UA= unidades de absorbância).

35

O crescimento celular, avaliado ao longo de 30 dias em cultura, demonstrou

um maior incremento para o tratamento controle e um menor crescimento no

tratamento APM, contendo a combinação dos três agentes de maturação (Fig. 8).

Verificou-se que a adição dos agentes de maturação, especialmente o ABA e a

Maltose, não estimulam o crescimento das suspensões celulares. Embora o PEG

tenha promovido um pequeno crescimento, a partir do 8O dia, este foi inferior ao

observado para o tratamento controle.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Dias de cultivo

Pes

o fre

sco

(g)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Dias de cultivo

Pes

o fre

sco

(g)

Mat

éria

fres

ca(g

)

Tempo de cultivo (dias)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Dias de cultivo

Pes

o fre

sco

(g)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Dias de cultivo

Pes

o fre

sco

(g)

Mat

éria

fres

ca(g

)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Dias de cultivo

Pes

o fre

sco

(g)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Dias de cultivo

Pes

o fre

sco

(g)

Mat

éria

fres

ca(g

)


Figura 8: Crescimento das suspensões celulares embriogênicas nos tratamentos controle, ABA (200 uM), PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose). Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3). ( Controle/ ABA/ PEG/ maltose/ APM).

4.1.3. Efeito do doador, sequestrador e inibidores da síntese de NO sobre o conteúdo endógeno de NO e ROS em suspensões celulares cultivadas nos tratamentos com promotores de maturação.

A adição de SNP, ao meio de cultura, estimulou o aumento de NO intracelular,

nos tratamentos suplementados com ABA e maltose (Fig. 9A). O mesmo ocorrendo

com adição do PTIO no tratamento com ABA.

Não foram verificadas alterações no conteúdo de NO intracelular ao utilizar-se

o inibidor L-NAME (Fig. 9C). A adição de tungstato ao meio de cultura, nos

tratamentos contendo ABA e PEG, promeveu um aumento no conteúdo de NO

intracelular nessas culturas (Fig. 9D).

36

0

25000

50000

75000

100000

Controle ABA PEG Maltose APM

A

c

c

cc

ab

bc

a

c

aa


SNP

0

25000

50000

75000

100000


B

bcd

ab

bcdcd

d

abcd

cd

a

abcabc


PTIO1

0,5

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

1

0,5

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

C

0

25000

50000

75000

100000


bcc

ab

c

cbc

a

c

bc

ab


L-name

0

25000

50000

75000

100000


D

c

d

cdc

a

cbc

a

c

ab


Tungstato1

0,5

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

1

0,5

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

Figura 9: Conteúdo de NO intracelular das suspensões celulares embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle, ABA (200 uM), PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose) suplementados com doador, sequestrador e inibidor da síntese de NO. : sem adição dos reagentes de NO. : com adição de SNP (A); PTIO (B); L-name (C) e Tungstato (D). Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3). (UA= unidades de absorbância).

37

Similarmente ao observado para o conteúdo de NO intracelular, observou-se

um aumento do conteúdo de NO extracelular nos tratamentos ABA e maltose quando

adicionado ao meio de cultura o SNP (Fig. 10A). O seqüestrador de NO, PTIO,

também promoveu um aumento no conteudo NO extracelular no tratamento ABA,

porém causou redução no tratamento APM (ABA, PEG e maltose) (Fig. 10B). Por

outro lado, a adição do inibidor L-NAME, não provocou mudança na liberação de NO

em nenhum dos tratamentos (Fig. 10C). A adição tungstato aumentou o NO liberado

nos tratamentos ABA e PEG, enquanto no tratamento APM foi observado uma

redução (Fig. 10D).

Culturas suplementadas com SNP, PTIO e inibidores, L-NAME e tungstato,

apresentam uma redução no conteúdo de ROS. Ao adicionar-se SNP e PTIO,

verifica-se uma diminuição nos níveis de ROS, nos tratamentos suplementados com

ABA e maltose (Fig. 11A e 11B). Verificou-se redução no conteúdo de ROS nos

tratamentos PEG e maltose quando suplementados com L-NAME (Fig. 11C). Nos

tratamentos com tungstato, apenas o tratamento APM não apresentou redução no

conteúdo de ROS (Fig. 11D).

4.1.4. Efeito do condicionamento do meio de cultura no conteúdo de NO e ROS em suspensões celulares

Na análise dos meios de cultura condicionados, não houve diferença na

produção de NO entre o controle e o tratamento APM. A produção de ROS, no

tratamento APM foi menor que o controle, tanto no meio condicionado (21 dias),

quanto no meio novo (Fig. 12C).

A transferência das células para o novo meio de cultura, no tratamento

controle (Figura 12), aumentou o conteúdo intra (Fig. 12A) e extracelular (Fig. 12B) de

NO, e reduziu o conteúdo de ROS (Fig. 12C). No tratamento APM, não houve

diferença em relação aos conteúdos de NO e ROS, quando da transferência para um

novo meio de cultura.

38

0

200000

400000

600000


A

b

a

c

a

c ccc c

aSNP

0

200000

400000

600000


B

b

c cc

c c cc

a

b

PTIO6

4

2

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

6

4

2

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

0

200000

400000

600000


D

bc

bb

aa

ccccc

Tungstato6

4

2

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

0

200000

400000

600000


Ca

a

bbbbb bbb

L-name6

4

2

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

Figura 10: Conteúdo de NO extracelular das suspensões celulares embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle, ABA (200 uM), PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose) suplementados com doador, sequestrador e inibidor da síntese de NO. : sem adição dos reagentes de NO. : com adição de SNP (A); PTIO (B); L-name (C) e Tungstato (D). Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3). (UA= unidades de absorbância).

39

A

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000


aa aaa

a

b bbb

SNP30

20

10

Con

teúd

o de

RO

S (1

0 5

UA

)

B

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000


ab

a

abab

bc

ab

bc

c

a

c

PTIO30

20

10

Con

teúd

o de

RO

S (1

0 5

UA

)

D

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000


aa

b

aa

b bb

b b

Tungstato

C

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000


a

a

ab ab

bc

abc

c

a

c c

L-name30

20

10

Con

teúd

o de

RO

S (1

0 5

UA

)

30

20

10

Con

teúd

o de

RO

S (1

0 5

UA

)

Figura 11: Conteúdo de ROS das suspensões celulares embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle, ABA (200 uM), PEG (9%) e Maltose (9%), e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose) suplementados com doador, sequestrador e inibidor da síntese de NO. : sem adição dos reagentes de NO. : com adição de SNP (A); PTIO (B); L-name (C) e Tungstato (D). Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3). (UA= unidades de absorbância).

40

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

Controle APM

b

a

bbb

A

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

6

4

2

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

Controle APM

a

b

b b

b

b

B

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)

6

4

2

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

Controle APM

a

b

c c

C

Con

teúd

o de

RO

S (1

0 5

UA)

6

4

2

Figura 12: Conteúdo de NO interno (A), externo (B) e ROS (C) das suspensões celulares embriogênicas, após 21 dias de cultivo, nos tratamentos controle e APM (200uM ABA + 9% PEG + 9% Maltose) transferidos ou não para um novo meio de cultura. : meio de cultura novo. : meio cultivado por 21 dias. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3). (UA= unidades de absorbância).

41

4.2. Estudo comparativo, entre duas linhagens (BM e MSG) com diferentes competências para maturação

4.2.1. Aspectos morfológicos das suspensões celulares As culturas das duas linhagens, MSG e BM, a partir do 15º dia de maturação,

apresentaram diferenças quanto à coloração. A linhagem BM (Fig. 13A), inicialmente

marrom escura, intensificou essa coloração, nos demais dias de cultivo, enquanto, a

linhagem MSG permaneceu com a coloração amarelada (Fig. 13B), durante todo o

período de cultura.

A BA B

Figura 13: Aspecto das linhagens de suspensões celulares BM (A) e MSG (B) de A. angustifolia, após 15 dias de incubação, no tratamento de maturação. Linhagem BM = sem competência para maturação; Linhagem MSG = com competência para maturação.

Observa-se, morfológicamente diferenças entre as duas linhagens quanto à

organização e ao padrão de diferenciação das células (Fig. 14). Células da linhagem

BM apresentaram-se mais compactas, pequenas e não-agrupadas (Figs. 14A e 14B)

enquanto a linhagem MSG, por sua vez, apresentou células translúcidas,

mucilaginosas e agrupadas, formando pequenos aglomerados de células (Figs. 14C

e 14D).

Adicionalmente, diferenças na morfologia foram observadas também nos

diferentes tratamentos de uma mesma linhagem. As culturas embriogênicas da

42

linhagem BM mantidas controle apresentaram-se com coloração amarela (Fig. 14A)

enquanto, culturas submetidas aos tratamentos de maturação, apresentaram

coloração marrom (Fig. 14B). A linhagem MSG mantida no controle, por sua vez,

apresentou culturas embriogênicas com uma coloração branca (Fig. 14C), e quando a

cultura foi submetida à maturação, apresentou coloração amarelada, com células

agrupadas em aglomerados densos (Fig. 14D).

Figura 14: Aspecto morfológico das células das linhagens BM e MSG, após 60 dias em cultura. (A) Linhagem BM, controle (B) Linhagem BM em meio de maturação; (C) Linhagem MSG, controle; (D) Linhagem MSG em meio de maturação (Barra= 3mm).

4.2.2. Análises morfológicas das culturas embriogênicas As células da linhagem BM, no tratamento controle, apresentaram massas de

pró-embriões, corados em vermelho, em grande quantidade, sem aparente

polarização. As células do suspensor, coradas em azul, localizaram-se ao redor da

massa de pró-embriões (Fig. 15). Esse tipo de organização estrutural foi mantido

durante as várias repicagens. Nesse material, puderam ser evidenciadas, células

tipicamente na primeira divisão assimétrica, características da formação do pró-

embrião (Fig. 15F – ponta de seta) e do suspensor (Fig. 15F – seta).

43

Figura 15: Aspecto das culturas embriogênicas da linhagem BM mantidas no controle, em diferentes períodos de cultivo (A) 0 dias; (B) 15 dias; (C) 30 dias; (D) 45 dias; (E) 60 dias; (F) detalhe da primeira divisão assimétrica na formação do pro-embrião (ponta de seta), e do suspensor (seta).

Nas culturas mantidas no tratamento controle, da linhagem MSG, também

foram observadas massas de pró-embriões, e uma grande quantidade de células do

suspensor (Fig. 16). Entretanto, a organização dessas células difere daquele

observado na linhagem BM. Neste caso, as células apresentam pró-embriões

caracteristicamente bipolares, com as células do suspensor acoplados na base da

massa pró-embriogênica (Fig. 16). Esta estrutura também é mantida, durante todo o

período de cultivo.

A linhagem BM, quando cultivada na presença dos promotores de maturação,

apresentou células desagregadas, e de menor tamanho, em relação ao controle. Não

foram identificadas as estruturas pró-embrionárias bipolares características. O padrão

de coloração verificado foi diferente daquele normalmente observado ao utilizar os

corantes azul de Evans e carmin acético. Neste caso, observou-se uma coloração

marrom, em todo o material, inclusive nas porções que normalmente teriam sido

coradas em vermelho devido a afinidade com o carmim acético (Fig. 17).

44

Figura 16: Aspecto das culturas embriogênicas da linhagem MSG, controle, em diferentes períodos de cultivo (A) 0 dias; (B) 15dias; (C) 30 dias; (D) 45 dias; (E) 60dias.

Figura 17: Aspecto das culturas embriogênicas da linhagem BM cultivadas em meio de maturação, durante diferentes períodos de cultivo (A) 0 dias; (B) 15 dias; (C) 30 dias; (D) 45 dias; (E) 60 dias.

45

As culturas embriogênicas, mantidas no meio MSG, suplementadas com

promotores de maturação, apresentaram estruturas definidas e características de pró-

embriões nos estádios iniciais de desenvolvimento (Fig. 18). Em vermelho foram

evidenciadas as células das massas pró-embrionárias, e em azul as células dos

suspensores. Esse tipo de organização pode ser observado nos materiais cultivados

durante 45 dias. Após esse período, não é mais possível a identificação desse

padrão. Culturas com 60 dias apresentam células isoladas, de menor tamanho, e de

coloração azul de menor intensidade. Após 30 dias em cultura, foram identificadas

estruturas bipolares (Fig. 18F), caracterizadas como embriões somáticos em estádios

iniciais de maturação.

Figura 18: Aspecto das células da linhagem MSG cultivadas em meio de maturação, em diferentes períodos de cultivo (A) 0 dias; (B) 15 dias; (C) 30 dias; (D) 45dias; (E) 60 dias; (F) pró-embrião bipolarizado após 30 dias de cultura(seta).

4.2.3. Determinação da morte celular A incubação de culturas embriogênicas da linhagem BM em meio de cultura

suplementado com promotores de maturação (PEG, maltose e ABA), provocou um

incremento da morte celular, a partir de 15 dias de cultivo. Essa resposta foi

intensificada com o decorrer do tempo de cultivo (Fig. 19). Após 60 dias de cultivo, a

morte celular nessas culturas superou em 200%, quando comparada com o controle

46

(Fig.19 A). Para a linhagem MSG observou-se uma menor diferença, cerca de 20%

de morte celular, ao comparar o os tratamentos controle e maturação (Fig. 19B).

0

50

100

150

200

250

15 30 45 60

a

b

b

b

Dias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

A

0

50

100

150

200

250

15 30 45 60

a

b

b

b

Dias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

0

50

100

150

200

250

15 30 45 60

a

b

b

b

Dias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

AM

orte

cel

ular

(% re

lativ

a ao

con

trol

e)

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

B

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

B

Mor

te c

elul

ar (%

rela

tiva)

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

B

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

B

Mor

te c

elul

ar (%

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tiva)

BM

MSG

Mor

te c

elul

ar

(% re

lativ

a ao

con

trol

e)



0

50

100

150

200

250

15 30 45 60

a

b

b

b

Dias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

A

0

50

100

150

200

250

15 30 45 60

a

b

b

b

Dias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

0

50

100

150

200

250

15 30 45 60

a

b

b

b

Dias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

AM

orte

cel

ular

(% re

lativ

a ao

con

trol

e)

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

B

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

B

Mor

te c

elul

ar (%

rela

tiva)

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

B

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

-20

-10

0

10

20

15 30 45 60

a

ab

ab

bDias de cultivo

Porc

enta

gem

rela

tiva

(%)

B

Mor

te c

elul

ar (%

rela

tiva)

BM

MSG

Mor

te c

elul

ar

(% re

lativ

a ao

con

trol

e)



Figura 19: Morte celular (porcentagem em relação ao controle) das suspensões celulares embriogênicas das linhagens BM (A) e MSG (B), durante 60 dias de cultivo, em meio de maturação. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3).

4.2.4. Determinação da matéria seca A figura 20 apresenta o crescimento em materia seca das duas linhagens, BM

e MSG, nos tratamentos controle e de maturação. Verifica-se que,

independentemente da linhagem utilizada, culturas submetidas à maturação

apresentam, ao longo de todo o período de cultura, valores de matéria seca sempre

inferior em relação ao controle. A avaliação entre as duas linhagens não revelou

diferenças significativas.

47

BM peso seco

0

50

100

150

200

250

300

0 15 30 45 60

b

d

ccd cd

ab a

c

abA

Mat

éria

sec

a (m

g/gM

F)

MSG peso seco

0

50

100

150

200

250

300

0 15 30 45 60

cdcc

cdd

aa

bab

B

Mat

éria

sec

a (m

g/gM

F)BM

MSG

maturação

controle

maturação

controle



BM peso seco

0

50

100

150

200

250

300

0 15 30 45 60

b

d

ccd cd

ab a

c

abA

Mat

éria

sec

a (m

g/gM

F)

MSG peso seco

0

50

100

150

200

250

300

0 15 30 45 60

cdcc

cdd

aa

bab

B

Mat

éria

sec

a (m

g/gM

F)BM

MSG

maturação

controle

maturação

controle


Tempo de cultivo (dias) Figura 20: Crescimento em materia seca (mg/g MF) das suspensões celulares embriogênicas das linhagens BM (A) e MSG (B) durante 60 dias de cultivo em meio de cultura controle e de maturação. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3) ( : controle) ( : maturação).

4.2.5. Quantificação de NO e ROS As linhagens BM e MSG mantidas nos tratamentos controle apresentaram um

padrão similar de liberação de NO durante todo período de cultivo. Ao serem

adicionados os três promotores de maturação (ABA, PEG e maltose), observou-se

um aumento na liberação de NO, quando comparadas com os tratamentos controle

nas duas linhagens. Verificou-se uma maior liberação de NO na linhagem MSG,

mantida em condições de maturação. Neste material, a maior quantidade de NO

ocorreu após 15 dias de incubação, em meio de maturação (Fig. 21B).

48

NO externo _ BM

0

1

2

3

4

5

0 15 30 45 60

a

bc

b

c

b

cb

b

a

A

Dias de cultivo

NO externo _ MSG

0

1

2

3

4

5

0 15 30 45 60

d

a

c

b

bc

d d d d

B

Dias de cultivo

BM

MSG

maturação

controle

maturação

controle

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)C

onte

údo

de N

O (1

0 5

UA)



Figura 21: Conteúdo de NO extracelular em suspensões celulares embriogênicas das linhagens BM (A) e MSG (B) durante 60 dias de cultivo em meio de cultura controle e de maturação. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3) (UA= unidades de absorbância) ( : controle) ( : maturação).

Verificou-se que os tratamentos controle, sem adição de promotores de

maturação, apresentaram níveis maiores de NO intracelular, quando comparado com

os tratamentos submetidos à maturação. A maior produção de NO ocorre após 15

dias, no tratamento controle da linhagem MSG (Fig. 22). Os menores valores são

observados para as linhagens BM, mantidas no tratamento maturação.

A incorporação do ABA ao meio de cultura a partir de 30 dias de incubação,

não alterou significativamente o conteúdo de NO intracelular, ao analisar os

diferentes tratamentos de maturação, nas duas linhagens estudadas (Fig. 22).

49

NO interno _ BM

0

0.5

1

1.5

0 15 30 45 60

a

b

b

c

ab ab ab

cc

c

A

Dias de cultivo

NO interno _ MSG

0

0.5

1

1.5

0 15 30 45 60

ab

c

abc

a

ababcab

bcbc

B


BM

MSG

maturaçãocontrole

maturação

controle

Con

teúd

o de

NO

(10

5 U

A)C

onte

údo

de N

O (1

0 5

UA)


Figura 22: Conteúdo de NO intracelular em suspensões celulares embriogênicas das linhagens BM (A) e MSG (B) durante 60 dias de cultivo em meio de cultura controle e de maturação. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3) (UA= unidades de absorbância) ( : controle; : maturação).

Em relação às espécies reativas de oxigênio (ROS), verificou-se que os

tratamentos controle das linhagens BM e MSG apresentaram maiores níveis de ROS

que os suplementados com os promotores de maturação (Fig. 23) durante todo o

período de cultura.

50

ROS _ BM

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 15 30 45 60

c

b

aababab

ddd

A

Dias de cultivo

ROS _ MSG

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 15 30 45 60

bcd

cd

bc

aaababab

dd

B

Dias de cultivo

BM

MSG

maturação

controle

maturação

controleC

onte

údo

de R

OS

(10

5 U

A)C

onte

údo

de R

OS

(10

5 U

A)



Figura 23: Conteúdo de ROS nas suspensões celulares embriogênicas das linhagens BM (A) e MSG (B) durante 60 dias de cultivo em meios de cultura controle e de maturação. Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si (P<0,01) de acordo com o Teste T (n=3) (UA= unidades de absorbância) ( : controle) ( : maturação).

4.2.6. Visualização intracelular de NO e ROS Através de análises por microscopia de fluorescência, verificou-se que a

produção de NO e ROS ocorre em maior intensidade nas células embriogênicas

(Figura 24), independentemente da linhagem e do tratamento utilizado. A figura 24,

realizada com observações em campo claro e em fluorescência, demonstra que não

houve produção de NO e ROS nas células do suspensor.

Verificou-se também que nos tratamentos suplementados com promotores de

maturação ocorre uma redução na fluorescência, em relação aos tratamentos

controle, para ambas as linhagens (Fig. 24). Esse resultado corrobora as avaliações

dos resultados de quantificação referentes ao conteúdo relativo de NO e ROS (Fig.

22 e 23) (item 4.2.5.).

51

Campo Claro ROS NO

Controle

Maturação

Controle

Maturação

A B C

D E F

G H I

J K L

Fluorescência

BM

MSG

Figura 24: Visualização intracelular de ROS e NO das suspensões celulares embriogênicas das linhagens BM e MSG cultivadas em meios de cultura controle (BM: A,B,C) (MSG: G,H,I) e de maturação (BM: D,E,F) (MSG: J,K,L) (barra = 200µM).

52

5. DISCUSSÃO

5.1. Maturação das culturas embriogênicas Durante o processo de embriogênese somática são definidas as fases de

indução, proliferação, maturação e germinação dos embriões somáticos (Warren,

1993). A maturação é uma fase crítica e limitante, para várias espécies arbóreas, o

que resulta em uma baixa taxa de conversão de embriões em plantas (Capuana &

Debergh, 1997; Stasolla & Yeung, 2003).

A remoção de auxinas e citocininas, usadas em meios de manutenção e

multiplicação, e a adição de ABA e agentes osmóticos (PEG e maltose), promovem

um aumento da osmolaridade do meio de cultura, resultando na produção de

embriões em estádios avançados de desenvolvimento, para várias espécies de

coníferas (Gupta & Pullman, 1991; Shoji et al., 2006). Essa estratégia tem se

mostrado bastante eficiente, nos diferentes sistemas vegetais, para a maturação dos

pró-embriões somáticos presentes nas culturas celulares.

Dependendo do sistema vegetal estudado, observam-se diferentes

necessidades de combinações dos vários agentes de maturação. Em P. taeda, o

meio de maturação, contendo PEG (6%), maltose (4%) e ABA (150 µM), foi o mais

eficiente para induzir a formação de embriões somáticos cotiledonares (Li et al.,

1998). Por outro lado, para de P. brutia a melhor combinação para a maturação

observada foi de 80 µM de ABA, com 6% de maltose e 3,75% de PEG, em culturas

de embriões somáticos mantidos em meio semi-sólido (Yildirim et al., 2006). Para A.

angustifolia,em estudos preliminares, foi demonstrado que o tratamento de

maturação, promovido pela adição de PEG (7%) e de maltose (9%) ao meio de

cultura, com ou sem adição de ABA (60 µM), promoveu a maturação de embriões

somáticos (dos Santos et al., 2002).

No presente trabalho a combinação de ABA (120µM), PEG (7%) e maltose

(9%), mostrou ser o tratamento mais eficiente para a maturação dos embriões

somáticos da linhagem MSG, de A. angustifolia. Observou-se que os pró-embriões

atingiram estádios avançados do desenvolvimento embrionário, evidenciado pela

formação das estruturas bipolares (Fig. 18). Contudo, não se observou a presença de

embrião maduro, ou seja, embrião no estádio cotiledonar. Provavelmente esse fato

esteja relacionado com a utilização de um meio de cultura líquido para a maturação.

Diversos estudos ressaltam que, a grande maioria das espécies de coníferas,

apresentam a maturação de pró-embriões e a evolução dos embriões somáticos para

53

maduros, em meio semi-sólido. Alguns autores sugerem que em meio semi-sólido, as

altas concentrações de agentes geleificantes estimulam a formação de embriões

somáticos, como observado para P. strobus (Klimaszewska & Smith, 1997;

Klimaszewska et al., 2000). Essa situação foi considerada como semelhante ao efeito

osmótico não plasmolizante do PEG (Yildirim et al., 2006) pela redução da

disponibilidade de água. No presente trabalho, embora não tenha sido utilizado o

meio semi-sólido para a maturação, mas sim o meio de cultura líquido por propiciar

uma melhor metodologia para os estudos de visualização e quantificação de NO,

pode-se visualizar que as culturas quando incubadas com os promotores de

maturação apresentaram vários aspectos similares aos observados para as culturas

embriogênicas mantidas no meio de maturação semi-sólido.

Verificou-se no presente trabalho que a adição de agentes promotores da

maturação (ABA, PEG e maltose) promoveu uma redução no crescimento celular, em

matéria seca, nas duas linhagens utilizadas de A. angustifolia (Fig. 8).

Adicionalmente, verificou-se uma redução no crescimento com o aumento na

concentração dos promotores de maturação ABA, PEG e maltose incorporados ao

meio de cultura (Fig.4). Conforme verificado em diferentes materiais, a redução no

crescimento e no conteúdo de água das culturas embriogênicas é uma característica

desejável para a obtenção de maturação dos embriões somáticos (Attree & Fowke,

1993; von Arnold et al., 2002). Durante a etapa de maturação observa-se uma

redução na atividade de divisão celular, e uma consequente evolução na

diferenciação do embrião, onde diferentes tipos de agentes promotores de maturação

atuam de forma individualizada (Attree & Fowke, 1993).

Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que, os agentes osmóticos, PEG

e maltose, diminuem a produção intracelular de ROS e NO, nas culturas

embriogênicas da linhagem MSG, ao mesmo tempo em que promovem a sua

maturação (Fig. 5-7 e 21-24). Essas observações levam a hipótese de que uma

redução na produção dessas substâncias (NO e ROS), associado à redução do

crescimento celular, seja fundamental para ocorrer o processo de maturação das

culturas embriogênicas em A. angustifolia. Essa hipótese está de acordo com

resultados observados por Silveira et al. (2006), que verificaram a redução nos níveis

de NO na presença das PAs Spd e Spm, as quais promoveram uma evolução das

culturas embriogênicas de A. angustifolia. Adicionalmente, Osti et al. (2010) também

mostraram que a adição de NO resulta num aumento do conteúdo endógeno de NO,

o qual está associado ao crescimento celular sem evolução morfogenética das

culturas embriogênicas de A. angustifolia em suspensão celular.

54

Verificou-se ainda neste trabalho, que a adição dos agentes promotores de

maturação resultou na evolução morfogenética das culturas embriogênicas somente

na linhagem MSG, a qual apresentou o desenvolvimento de embriões em estágios

avançados de maturação (Fig. 18). Entretanto, esta resposta na evolução

morfogenética não foi observada para a linhagem BM (Fig. 17), embora tenha sido

verificada resposta similar com relação ao crescimento celular e conteúdo endógeno

de NO e ROS entre as duas linhagens utilizadas. Estes resultados sugerem que,

embora os agentes promotores de maturação sinalizem resposta similar em relação

ao conteúdo de NO e ROS para as duas linhagens quando submetidas a maturação,

somente a que possui competência para a evolução é que efetivamente resultará na

evolução morfológica adequada. Estudos com diferentes sistemas experimentais

demonstram um aumento na qualidade e quantidade de embriões somáticos quando

o meio de cultura utilizado na maturação contém promotores de maturação, como

ABA, PEG e maltose (Attree & Fowke, 1993; Capuana & Debergh, 1997;

Klimaszewska & Smith, 1997; Guerra et al., 2000, Filonova et al., 2000). É importante

salientar aqui também, um possível efeito dos componentes dos meios de cultura

utilizados neste trabalho, comparando-se os meios BM e MSG possibilitando assim,

esta diferença na evolução morfológica das culturas embriogênicas em A.

angustifolia.

Os resultados iniciais obtidos neste trabalho são inéditos e fundamentais para

o entendimento do processo de sinalização celular durante a maturação das culturas

embriogênicas nesta espécie.

5.2. Pomotores de maturação e produção de NO e ROS

5.2.1. PEG

A adição de PEG nos meios de cultura tem como objetivo a indução de um

estresse osmótico simulando o estresse hídrico observado em embriões zigóticos,

sujeitos a condições de desidratação (von Arnold et al., 2002). Salienta-se que a

parede celular não é permeável às moléculas maiores de PEG, e desta maneira, a

célula sofre plasmólise sem que ocorra entrada do composto. Essa situação leva a

uma redução na pressão de turgor e a redução do potencial osmótico intracelular

(von Arnold et al., 2002). Em P. pinaster a adição de PEG reduziu o crescimento da

cultura embriogênica, essencialmente devido à redução da proliferação celular, e ao

mesmo tempo propiciou a maturação de embriões somáticos com morfologia

55

semelhante àquela observada durante a embriogênese zigótica (Ramarosandratana

et al., 2001).

Verificou-se no presente trabalho que a adição de PEG resultou numa

redução do crescimento celular (Figs. 4 e 8), associado a uma redução nos níveis de

NO (Figs. 5, 6) e ROS (Figs. 7), após 21 dias de cultivo em relação ao controle.

Entretanto, os resultados obtidos neste trabalho para o sistema A. angustifolia

diferem daqueles observados para outros sistemas vegetais, e que reportam,

frequentemente, um aumento de ROS nos tratamentos suplementados com agentes

osmóticos (Beligni & Lamattina, 1999; Wei, 2009). Exemplo desse tipo de resposta foi

descrito para grãos de cevada, onde o estresse osmótico causado pela adição de

PEG, induziu o aumento de ABA endógeno, diminuiu a matéria fresca e seca, e

aumentou a concentração de H2O2 em relação ao controle (Wei, 2009).

Adicionalmente, sob estresse osmótico, diversas espécies vegetais apresentaram

rápida formação de NO, como foi demonstrado em trigo, raízes de A. thaliana e

ervilha, tratados com PEG. Nesses sistemas ocorreu aumento da produção de NO

em relação ao controle até 36 h após o contato com o agente osmótico, enquanto no

período seguinte houve uma estabilização no conteúdo de NO produzido (Kolbert et

al., 2008).

A suplementação com PEG (8000) no cultivo in vitro de Deschampsia

antarctica foi responsável pela diminuição de H2O2. Foi demonstrado, nesse sistema

vegetal, que a tolerância ao estresse hídrico está associada com um aumento na

atividade de enzimas antioxidantes e com a capacidade de retirar radicais livres

(Zamora, 2010).

Em nosso trabalho, os resultados obtidos sugerem que algum mecanismo de

proteção contra o estresse oxidativo pode ter sido ativado após a suplementação de

PEG ao meio de cultura, impedindo o aumento no conteúdo de ROS e NO após 21

dias em incubação com este promotor de maturação. Neste sentido, diminuição no

conteúdo de NO e ROS em culturas tratadas com agentes osmóticos pode estar

associada ao aumento da atividade de enzimas antioxidantes. Análises de expressão

e atividade de enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase (SOD), catalase e

ascorbato peroxidase, durante o período de cultivo das células de A. angustifolia,

poderiam confirmar essa hipótese.

56

5.2.2. Maltose

A maltose, assim como outros carboidratos, atua como uma fonte de carbono

e como agente osmótico (Shoji et al. 2006). Sua quebra disponibiliza a glicose, que é

prontamente assimilável pelas células vegetais (Salajova et al., 1999).

Frequentemente, a utilização de maltose é preferida, em relação à sacarose, por

promover um aumento no número de embriões somáticos. Essa situação foi

observada para diferentes sistemas de coníferas como em P. elliottii e em P. taeda

(Salajova et al., 1999). Atualmente, poucos trabalhos relatam o efeito da maltose na

produção de NO e ROS, entretanto é conhecido que as fontes de carbono são

freqüentemente relacionadas com a atividade de enzimas antioxidantes (Couée et al.,

2006).

Os nossos resultados demonstraram que a adição de maltose ao meio de

cultura causou um aumento inicial na produção de NO (Fig. 6A). Após 21 dias de

cultivo, a produção de NO foi menor quando comparada com o controle, nas

diferentes concentrações testadas (Fig. 5 e 6B). Similarmente ao observado para NO,

o conteúdo de ROS, nos tratamentos suplementados com maltose, também foi

inferior ao controle após 21 dias de cultivo. Estes resultados sugerem que, algum

mecanismo de proteção contra o estresse oxidativo foi ativado após a suplementação

de maltose ao meio de cultura, impedindo que o conteúdo de ROS e NO

permanecessem altos.

Alguns trabalhos tem mostrado que a maltose também atua como uma

molécula sinalizadora (Couée et al., 2006; Bolouri-Moghaddam et al., 2010). Uma das

funções atribuída aos açúcares solúveis é a indução da expressão de enzimas

antioxidantes em resposta ao estresse oxidativo (Couée et al., 2006). Açúcares

solúveis podem estar envolvidos na via de produção metabólica de ROS, como na

respiração, mas também podem estimular a via de produção de NADPH, contribuindo

para a eliminação de ROS, através da ativação das enzimas antioxiantes(Couée et

al., 2006).

A maltose foi usada como fonte de carbono, no cultivo in vitro de Trifolium

repens, e o seu efeito na atividade de SOD foi avaliado (Ślesak et al., 2006), uma

enzima antioxidante envolvida na regulação do nível de ROS em plantas. Foi

demonstrado que os açúcares sacarose, frutose e maltose, aumentaram a atividade

da SOD nas culturas de T. repens.

A adição de maltose ao meio de cultura, além de atuar como promotor de

maturação, também é importante para a indução de culturas embriogênicas. A

57

indução da embriogenese somática em Hevea brasiliensis (Blanc et al., 2002) foi

uniforme, e duas vezes mais rápida, quando o meio foi suplementado com maltose

em substituição à sacarose. Ao final do cultivo, os autores observaram um aumento

da atividade de enzimas antioxidantes e proteínas de membrana na presença de

maltose, os quais associaram estas respostas com a organização do embrião

somático, e com a manutenção da integridade da membrana destes (Blanc et al.,

2002).Estudos com essa abordagem, visando quantificar a atividade das enzimas

antioxidantes no sistema de culturas embriogênicas de A. angustifolia, poderiam

elucidar diferentes aspectos relacionados à produção de NO e ROS durante a

maturação.

5.2.3. ABA Vários estudos indicam a importância do ABA na maturação de embriões

somáticos, sendo que a sua adição no meio de maturação promove o

desenvolvimento normal dos embriões e a sua conversão em plântulas em várias

espécies (Bertossi et al., 2001; Stasolla & Yeung, 2003).

Vários estudos têm mostrado em sistemas vegetais que a adição de ABA

resulta no aumento do conteúdo de NO e ROS. Em células-guarda de A. thaliana, foi

demonstrado que a adição do ABA ao meio de cultura aumentou os níveis

endógenos de ROS e de NO (Pei et al., 2000; Zhang et al., 2001, Neill et al., 2002;

Guo et al., 2003). Adicionalmente, trabalhos tem mostrado que o NO atua como

molécula chave na mediação de respostas ao ABA em ervilha (Neill et al., 2002),

Vicia faba (Garcia-Mata & Lamattina, 2002) e A. thaliana (Desikan et al., 2004). Em A.

thaliana, Bright et al. (2006) constataram que o ABA induz a formação de NO

dependente do aumento de H2O2. Liu et al. (2009) confirmaram que o aumento de

NO é essencial e responsável pela diminuição do conteúdo de ABA em sementes de

A. thaliana, para que ocorra a quebra de dormência.

Comparando-se o período de cultivo, verificou-se que a produção de ROS e

NO no meio de cultura suplementado com ABA foi maior no início, durante as

primeiras horas de incubação, quando comparada com sua adição após 21 de

cultivo. Porém, salienta-se que dentre os promotores de maturação testados, o ABA

foi o único que apresentou conteúdo crescente de ROS aos 21 dias de cultivo,

enquanto os demais tratamentos permaneceram constantes neste período de

avaliação (Fig. 7B). Neste sentido, pode-se sugerir que o ABA apresentou um

possível efeito protetor considerando-se os resultados obtidos no presente trabalho.

58

5.2.4. ABA + PEG + Maltose A combinação de ABA, PEG e maltose, utilizada nesse experimento

objetivando a maturação das culturas embriogênicas de A. angustifolia foram

estabelecidas em trabalhos anteriores para essa espécie (dos Santos et al., 2002) e

para outras coníferas, como P. taeda (Li et al., 1998). Para A. angustifolia os

tratamentos contendo, 9% de PEG e 9% de maltose no meio de cultura, com ou sem

adição de ABA, promoveram a maturação dos embriões somáticos (dos Santos et al.,

2002), enquanto para P. taeda o meio de maturação, contendo 6% de PEG, 4% de

maltose e 150 µM de ABA, induziu a formação de embriões somáticos cotiledonares

(Li et al., 1998).

Nossos resultados demonstraram que, a adição conjunta dos três promotores

de maturação, foi responsável pela diminuição do conteúdo de NO (Fig. 6, 21 e 22) e

ROS (7 e 23) em relação ao controle após 21 dias de cultivo. Durante as primeiras

duas horas de incubação das culturas embriogênicas com o meio APM, observou-se

um aumento no conteúdo de NO e ROS, que embora menor em relação aos outros

meios de cultura, foi maior quando comparado ao mesmo tratamento após 21 d

Observou-se para o tratamento APM, que a transferência das culturas

embriogênicas para um novo meio de cultivo de mesma composição, após 21 dias,

não causou aumento dos níveis de NO nem diminuição de ROS (Fig. 12). O aumento

nestes compostos foi observado somente para o tratamento controle, o que sugere

que algum mecanismo de proteção seja ativado durante a maturação, com os

promotores incorporados ao meio de cultura. Neste sentido, a análise da atividade de

enzimas antioxidantes pode ser um fator chave para elucidar o envolvimento do ABA

na produção de NO no processo de maturação de culturas embriogênicas de A.

angustifolia.

Adicionalmente, o tratamento combinando os três promotores de maturação

foi mais efeciente na maturação das culturas embriogênicas de A. angustifolia da

linhagem MSG, uma vez que resultou na evolução morfogenética destas culturas

(Fig. 18), apresentando embriões somáticos em estádios mais avançados de

desenvolvimento, concomitantemente a redução do crescimento (Fig. 20) e do

conteúdo endógeno de NO e ROS (Figs. 22 e 23).

59

5.3. Doadores, sequestradores e inibidores de NO

O NO tem sido descrito como um mensageiro intra e intercelular, podendo

participar de vários processos em plantas, incluindo a expressão de genes

relacionados com defesa e morte celular programada (Neill et al., 2003), respostas ao

estresse abiótico (Mackerness et al., 2001; Garcia-Mata & Lamattina, 2002; Gould et

al., 2003) e na regulação do crescimento e desenvolvimento vegetal, como

germinação (Beligni & Lamattina, 1999; Leshem & Pinchasov, 2000; Seregélyes et

al., 2003), expansão foliar (Zhang et al., 2003), senescência (Leshem & Haramaty,

1996), e organogênese (Correa-Aragunde et al., 2004).

Em células vegetais, entretanto, ainda não está bem elucidado o envolvimento

direto ou indireto do NO nos eventos de transdução de sinais relacionados ao ciclo de

divisão celular (Pagnussat et al., 2004). Recentemente, foi demonstrado por Ötvös et

al. (2005) que o NO pode estimular a sinalização e ativação da divisão celular e a

formação de células embriogênicas na presença de 2,4-D em culturas derivadas de

protoplastos de folha de alfafa (Medicago sativa).

Embora vários estudos tenham sido desenvolvidos em diferentes sistemas

vegetais, na embriogênese poucos estudo tem mostrado a relação do NO com este

processo morfogenético. Silveira et al. (2006) demonstraram que as PAs Spd e Spm

possibilitam a evolução morfogenética das culturas embriogênicas de A. angustifolia

mediante uma redução nos níveis endógenos de NO, sugerindo que a redução deste

composto é essencial para a maturação das culturas embriogênicas. Recentemente,

Osti et al. (2010) demonstraram que a adição de SNP permite um aumento no

crescimento celular sem uma redução na evolução morfogenética em culturas

embriogênicas de A. angustifolia.

Neste sentido, objetivou-se verificar se a adição do NO ao meio de cultura

reverteria o efeito dos promotores de maturação. Entretanto, no presente trabalho

não obteve-se uma resposta adequada neste experimento, possivelmente devido a

interação entre todos estes componentes com as demais rotas metabólicas neste

sistema.

Verificou-se que a adição de SNP estimulou o aumento de NO interno (Fig.

9A) e externo (Fig. 10A) somente nos tratamentos suplementados com ABA e

maltose, ao mesmo tempo em que reduziu os níveis de ROS, nesses mesmos

tratamentos (Fig. 11A). Por outro lado, a aplicação de PTIO, um sequestrador de

NO,ao meio de cultura das células embriogênicas de A. angustifolia, quando na

presença de todos os promotores de maturação (APM), ocasionou a redução na

60

liberação de NO (Fig 10B). Já nas culturas suplementadas com ABA, ocorreu um

aumento de NO interno e externo. Esse resultado pode ser utilizado no

aperfeiçoamento da maturação de embriões somáticos de A. angustifolia, uma vez

que sabemos que é necessária uma diminuição nos conteúdos de NO na promoção

da maturação. Entretanto, para melhor entendimento destes dados obtidos, uma

análise morfológica das culturas embriogênicas nestes diferentes tratamentos deveria

ser realizada, verificando analisar o padrão morfológico obtido nos diferentes

tratamentos e compará-los com os anteiores.

Em células guarda de ervilha foi observado que a síntese de NO induzida por

ABA pode ser parcialmente inibida pelo L-name, sugerindo o envolvimento da enzima

NOS na produção de NO. Por outro lado, em células da epiderme de A. thaliana

(Desikan et al.,2002), assim como nos nossos resultados, em culturas embriogênicas

de A. angustifolia, não ocorre alteração no conteúdo de NO quando adicionado o L-

name. Estes resultados sugerem que a produção de NO, nesses casos, não poderia

esta ocorrendo pela via da enzima Oxido Nítrico Sintase (NOS), e sim por outro

mecanismos.

Tungstato, por inibir a atividade da NR, inibiu ABA, a síntese de NO induzida

por nitrito e o fechamento de estômato em células guarda de A. thaliana (Bright,

2006). Em nossos resultados o tungstato foi o que mais alterou a produção de NO,

aumentando a produção e liberação quando adicionado nos tratamentos ABA e

PEG, a liberação no controle, maltose e APM, sugerindo que a produção de NO pela

via da enzima nitrato redutase estaria ativa nas culturas embriogênicas de A.

angustifolia.

5.4. Morte celular

O NO pode atuar como um antioxidante ou como promotor de morte celular

programada, na dependência da concentração, localização e associação com

espécies reativas de oxigênio (De Michele et al., 2009). Delledone et al. (2001),

investigaram as interações entre NO e ROS na resposta de resistência a doenças, e

propuseram que o balanço entre NO e ROS é o fator regulatorio da MCP. Em células

de soja, altos níveis de NO não afetam a viabilidade da célula a menos que seja

compensado por altos níveis de ROS (Delledone et al., 2001).

Para as células embriogênicas de A. angustifolia, verificou-se, no presente

trabalho, que a adição de agentes de maturação (ABA, PEG e maltose) resultaram

num aumento da MCP na linhagem BM, acompanhado de redução de ROS e do NO

61

intracelular. Esses resultados sugerem que a morte celular apresentada pela

linhagem BM quando da adição dos promotores de maturação, pode estar

relacionada com a MCP característica da embriogênese, onde a degradação das

células do suspensor tem como função a promoção do crescimento do embrião.

5.5. Diferença entre linhagens

Embriões somáticos apresentam variações morfológicas e genotípicas, e

algumas linhagens de células não são capazes de completar o processo de

maturação dos embriões somáticos, mesmo em condições consideradas favoráveis

para outras linhagens (Wang et al., 2009). Variações fisiológicas também foram

observadas em P.abies, ao comparar com diferentes capacidades para a maturação

(Wang et al. 2009). Nesse sistema, foi verificado que a linhagem sem a competencia

para a maturação apresenta conteúdo reduzido de ABA, quando comparada àquela

competente para a maturação (Wang et al., 2009).

A perda do potencial embriogênico da linhagem BM pode ter sido causada

pela variação somaclonal. Essa se manifesta em cultura de tecidos em vários níveis,

fenotipica, citológica, bioquímica, genética e epigeneticamente (Maruma et al., 2009).

Alguns fatores como de genótipo, fonte de explante, composição do meio de cultura,

e idade da cultura afetam a variação somaclonal (Brar & Jain, 1998). Os prováveis

mecanismos da variação incluem mudanças genéticas como mutações,

reorganização dos cromossomos, troca das cromátides irmãs e deleção, e mudanças

epigenéticas como amplificação de DNA, elementos de transposição e metilação de

DNA (Ahuja, 1998).

Embora as linhagens utilizadas no presente trabalho apresentem diferenças

relacionadas ao genótipo, e às condições iniciais de cultivo, elas respondem mesma

maneira em relação ao conteúdo de NO e ROS e promovem a formação de embriões

somáticos com diferentes competências para evoluírem no processo de maturação.

Nesse contexto elas podem ser avaliadas e comparadas.

62

6. CONCLUSÃO

Os sinais embriogênicos já foram intensamente estudados e hoje sabemos

que, em culturas de coníferas, a adição de ABA e agentes osmóticos promove os

sinais necessários para a ativação da embriogênese. Conforme já salientado, um

sério limitante da aplicação prática do processo de embriogênese somática, refere-se

a baixa taxa de germinação do embrião somático e sua conversão em plântula.

Neste contexto, o estudo das etapas finais do desenvolvimento embrionário

em sementes (maturação), e da germinação, além de permitir um melhor

entendimento das bases moleculares e fisiológicas envolvidas no processo

embriogênico, e germinativo, podem gerar informações importantes para a

manipulação e otimização da técnica de multiplicação in vitro por embriogênese

somática. Ressalta-se, novamente, que estudos nesta linha de pesquisa, envolvendo

espécies com sementes recalcitrantes são escassos, e a literatura existente referente

a maturação e germinação de sementes, é praticamente toda baseada em estudos

com espécies ortodoxas.

Vários estudos têm sido desenvolvidos visando a obtenção de embriões

somáticos com maior viabilidade (Stasolla & Yeung, 2003; Stasolla et al., 2003). Em

virtude das similaridades, vários estudos têm buscado marcadores comuns e a

interface dos diferentes estádios do desenvolvimento da embriogênese somática e

zigótica, inclusive permitindo que sejam estabelecidos parâmetros para o

monitoramento e a otimização dos protocolos de embriogênese somática (Pullman et

al., 2003; Misra, 2008).

A interface e as similaridades morfológica, bioquímicas e moleculares, da

embriogênese somática e zigótica tem sido foco de pesquisas desenvolvidas pelo

Laboratório de Biologia Celular de Plantas (BIOCEL), em associação com diferentes

grupos de pesquisa do país e do exterior (Astarita et al., 2003a, Astarita et al., 2003b;

Silveira et al., 2006; Steiner et al, 2008; Santos et al., 2008; Balbuena et al., 2009).

As principais linhas de pesquisa incluem o estudo dos parâmetros fisiológicos

(metabolismo hormonal), bioquímicos (metabolismo de poliaminas, óxido nítrico e

aminoácidos) e moleculares (proteômica comparativa e expressão gênica) durante o

desenvolvimento da embriogênese zigótica e somática em espécies arbóreas nativas.

A realização deste trabalho complementa os estudos existentes ao longo de vários

anos relativos à embriogênese zigótica e somática no sistema A. angustifolia.

O sistema A. angustifolia foi selecionado pelos seguintes motivos a) é uma

espécie arbórea nativa de importância econômica, e que está incluídas na lista de

63

espécies ameaçadas de extinção, na categoria de perigo crítico (IUCN – International

Union for Conservation of Nature and Natural Resources – www.iucnredlist.org); b)

possui sementes recalcitrantes e problemas de propagação vegetativa por

metodologias tradicionais; c) constitui excelente sistema para estudos de biologia

celular, fisiologia e bioquímica dos processos de desenvolvimento (embriogênese e

germinação); d) possui as suas condições básicas de cultivo in vitro, relativas à

indução da embriogênese somática, relativamente bem estabelecidas, e vem sendo

estudadas pelo nosso grupo de pesquisa.

De acordo com os resultados obtidos, pode-se observar que os agentes

promotores da maturação reduzem a síntese endógena de NO e ROS, e também o

crescimento celular. Nas culturas embriogênicas com capacidade de maturação

(linhagem MSG), esses promotores induzem a maturação, enquanto nas culturas

que não maturam (linhagem BM), promovem a morte celular programada. Mesmo não

sendo uma linhagem embriogênica e não respondendo aos estímulos dos promotores

de maturação com a evolução a embriões somáticos, a linhagem BM respondeu de

forma similar que a linhagem embriogênica MSG na produção de NO e ROS,

sugerindo que o bloqueio da resposta para formação de embriões pode acontecer

após a sinalização de NO.

Estes resultados são inéditos e fundamentais para uma melhor compreensão

do envolvimento e sinalização do NO e ROS na etapa de maturação durante o

processo da embriogênese somática. Trabalhos sobre a ativação de mecanismos de

defesa, como enzimas antioxidantes, são interessantes para complementar este

trabalho, visando identificar como as culturas embriogênicas equilibram a sintese

destes compostos quando submetidas a maturação.

64

7. RESUMO

Andrade, JBR. Efeito dos agentes de maturação, ABA, PEG e maltose, na

produção de óxido nítrico e de espécies reativas de oxigênio em culturas

embriogênicas de Araucaria angustifolia. 2010. 74p. Dissertação (Mestrado) –

Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo.

Araucaria angustifolia é uma conífera nativa do Brasil de importância econômica, que, após intenso desmatamento, possui sua distribuição limitada a aproximadamente 3% da área original. Atualmente está incluída na lista de espécies ameaçadas de extinção, na categoria de perigo crítico de acordo com a IUCN (International Union for Conservation of Nature). A embriogênese somática é um processo em que, através da técnica de cultivo in vitro, células isoladas ou um pequeno grupo de células somáticas dão origem a embriões. Este é um sistema com potencial de aplicação em conservação, reflorestamento, propagação em larga escala, e melhoramento vegetal em espécies arbóreas recalcitrantes e em risco de extinção. Um dos principais fatores limitantes, nos sistemas de embriogênese somática em arbóreas, é a baixa freqüência de maturação e conversão de embriões somáticos em plântulas. Durante a fase de maturação, os embriões somáticos acumulam substâncias de reserva, reduzem a atividade metabólica e adquirem tolerância à desidratação. A suplementação do meio de cultura com determinados reguladores de crescimento e agentes osmóticos, os quais permitem a progressão do desenvolvimento normal dos embriões somáticos, promove um estresse hídrico. Esta situação mimetiza aquela que ocorre durante a embriogênese zigótica quando do desenvolvimento da semente. O óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas que atuam nas respostas das plantas aos vários estresses ambientais e estão envolvidas em processos de desenvolvimento como embriogênese e germinação de sementes, gravitropismo, formação de raízes. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de promotores de maturação, ABA e os agentes osmóticos, PEG e maltose, no conteúdo de NO e ROS em culturas embriogênicas de A. angustifolia. Foi observado que os agentes promotores da maturação reduzem a síntese endógena de NO e ROS. Essa redução é dose dependente. Foram pesquisadas duas linhagens de células com diferentes capacidades de maturação. Para as culturas embriogênicas com competência de maturação esses promotores induzem a maturação e nas culturas que não maturam, promovem a morte celular programada.

Palavras-chave: Araucaria angustifolia, embriogênese, óxido nítrico.

65

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Ahuja MR. Somaclonal genetics of forest trees. In Jain, SM; Brar, DS; Ahloowalia, BS (Eds) : Somaclonal variation and induced mutations in crop improvement. Kluwer Academic Publishers; 105-121; 1998.

Andrade JBR, Dias LLC, Balbuena TS, Santa Catarina C, Floh EIS, Silveira S. Análise proteômica comparativa durante a maturação de culturas embriogênicas de Araucaria angustifolia. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental; 13: 12-12; 2007.

Astarita LV, Floh EIS, Handro W. Changes in IAA, tryptophan and activity of soluble peroxidase associated with zygotic embryogenesis in Araucaria angustifolia (Brazilian pine). Plant Growth Regulation; 39 (2): 113-118; 2003a.

Astarita LV, Floh EIS, Handro W. Changes in polyamines associated with zygotic embryogenesis in Brazilian Pine (Araucaria angustifolia). Revista Brasileira de Botânica; 26: 163-168; 2003b.

Astarita LV, Guerra MP. Conditioning of culture medium by suspension cells and formation of somatic proembryo in Araucaria angustifolia (Coniferae). In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant; 36: 194-200; 2000.

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efeito dos agentes de maturação, aba, peg e maltose, na ... · 4.1.3. efeito do doador,...

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