efeito da talidomida e da pentoxifilina na produÇÃo de ... otavio correa te… · patogênese da...
TRANSCRIPT
EFEITO DA TALIDOMIDA E DA PENTOXIFILINA NA PRODUÇÃO DE MEDIADORES
INFLAMATÓRIOS E NA PATOGÊNESE DA ENCEFALOMIELITE AUTOIMUNE EXPERIMENTAL
(EAE)
JOSÉ OTÁVIO DO AMARAL CORRÊA
Niterói 2008
Dissertação / tese apresentado ao
curso de Pós-graduação em Patologia
da Universidade Federal Fluminense
JOSÉ OTÁVIO DO AMARAL CORRÊA
EFEITO DA TALIDOMIDA E DA PENTOXIFILINA NA
PRODUÇÃO DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E NA PATOGÊNESE DA ENCEFALOMIELITE AUTOIMUNE
EXPERIMENTAL (EAE)
Orientador: Dr. Fernando Monteiro Aarestrup
Niterói 2008
Pentoxifilina 4. Talidomida. I. Universidade Federal Fluminense. II. Efeito
da talidomida e da pentoxifilina na produção de mediadores inflamatórios e na
patogênese da Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE).
3. 1. ENCEFALOMIELITE AUTOIMUNE EXPERIMENTAL 2. TNF-
95 f
Tese de Doutorado (Patologia Investigativa – Programa de Pós-Graduação
em Patologia) – Universidade Federal Fluminense
Orientador: Fernando Monteiro Aarestrup
Bibliografia: f. 78 – 91
Corrêa, José Otávio do Amaral
Efeito da talidomida e da pentoxifilina na produção de mediadores
inflamatórios e na patogênese da Encefalomielite Autoimune Experimental
(EAE). / José Otávio do Amaral Corrêa. – Niterói 2008.
CDD
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Patologia como requisito para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração:
Patologia Investigativa.
JOSÉ OTÁVIO DO AMARAL CORRÊA
EFEITO DA TALIDOMIDA E DA PENTOXIFILINA NA PRODUÇÃO DE
MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E NA PATOGÊNESE DA ENCEFALOMIELITE
AUTOIMUNE EXPERIMENTAL (EAE).
Aprovado em 30 de abril de 2008
BANCA EXAMINADORA
Profª. Dr(a). Beatriz Julião Vieira Universidade Federal de Juiz de Fora
Profª. Dr(a). Eliane Pedra Dias Universidade Federal Fluminense
Prof. Dr. Rodrigo de Oliveira Moreira Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro / Instituto
Estadual de Diabetes e Endocrinologia
Prof. Dr(A). Rosângela Maria de Castro Cunha Universidade Federal de Juiz de Fora
Profª. Dr(a). Thereza Fonseca Quírico dos Santos Universidade Federal Fluminense
Aos meus pais, irmã e sobrinha,
Pelo incentivo e apoio incondicional em todos os caminhos desta jornada.
AGRADECIMENTOS
Gostaria, inicialmente, de agradecer a Capes pelo suporte e apoio
financeiro a este trabalho.
Agradecer a meu orientador Dr. Fernando Monteiro Aarestrup que
esteve presente em todos os momentos, mostrando ser muito mais do que
orientador. Foi o verdadeiro professor e foi amigo.
Agradeço a todos os Professores do Departamento de Patologia da UFF
e aos que ministraram as disciplinas do Programa. Sua presteza e dedicação
foram cruciais.
Aos meus familiares, em especial meu Pai e amigo, minha Mãe (e que
mãe!), minha irmã, que sempre me apoiaram nessa luta.
A Aline Guidine pela paciência, companheirismo e dedicação a mim
conferidos, mesmo nos momentos em que eu estava mais ausente.
A meus amigos, Helvécio, e Luciana que juntos trabalhamos no CBR-
UFJF e várias vezes dividimos nossas dúvidas e “desesperos” de uma tese.
A meu amigo Ivo Malta pela ajuda incansável na realização deste
trabalho.
A Dra. Thereza Quírico pela excelente orientação, e imprescindível
apoio, sem os quais este trabalho não seria possível .
A Dra. Beatriz Julião que sempre esteve presente e contribuiu de forma
primordial e decisiva para a realização este trabalho. Meu eterno
agradecimento.
A Dr(a) Priscila Faria pelo apoio na realização da técnica de ELISA.
Aos meus amigos da UNIPAC e da UFJF, que foram os melhores
incentivadores por todo o tempo.
E por último e mais importante, a Deus por ter me dado força e saúde
para suportar as pressões dos momentos mais difíceis desta jornada.
RESUMO
A Encefalomielite autoimune (EAE) em ratos Lewis é um modelo experimental de doença desmielinizante e inflamatória do sistema nervoso central (SNC) humano. EAE é amplamente aceita como estudo de mecanismos imuno- inflamatórios no SNC relacionados com a esclerose múltipla (EM) devido a
alterações clínicas similares. O Fator necrose tumoral alfa (TNF-) tem sido implicado como um mediador chave na fisiopatologia e no processo inflamatório do CNS. No presente estudo duas drogas (talidomida e pantoxifilina) foram utilizados durante o desenvolvimento da EAE por serem
conhecidas como inibidoras de TNF- em ratos Lewis. A EAE foi induzida com inoculação de homogeneizado medular de cobaia em adjuvante completo de Freunds no coxim plantar no dia 0 e ratos tratados durante 15 dias, com talidomida injectada por via subcutânea ou pentoxifilina injetada intraperitonial. Avaliação clínica foi realizada diariamente e a análise histológica (colorações de Hematoxilina e Eosina e Weigert Pal Russel) do tecido cerebral e da medula espinhal realizada no final do experimento. O método de Griess foi escolhido para a determinação do NO e ensaio imunoenzimático (ELISA) utilizado para
medir os níveis das citocinas e interferon gama (IFN- e TNF- plasmáticos. A Talidomida causou uma redução significativa na neuroinflamação e da
desmielinização no SNC. Níveis plasmáticos de NO, IFN- e TNF- também apresentaram acentuada redução. Esses achados foram correlacionados com a melhoria dos sintomas clínicos. Em 90% dos ratos tratados com a talidomida não desenvolveram EAE. Nossos experimentos mostraram que a pentoxifilina não foi efetiva na modulação da EAE. O resultado ainda sugere que a talidomida interfere fortemente com a patogenia EAE e nos mecanismos de desenvolvimento e produção de mediadores inflamatórios. Tal droga pode também ser considerado um importante instrumento para a utilização em esquemas terapêuticos de doenças inflamatórias desmielinizantes do SNC como a esclerose múltipla.
ABSTRACT
Autoimmune encephalomyelitis (EAE) in Lewis rats is an experimental model of demyelinating inflammatory disease of the human central nervous system (CNS). EAE is widely accepted for study immune-inflammatory mechanisms in the CNS related to multiple sclerosis (MS) due to similar clinic. Tumor necrosis
factor alpha (TNF-) has been reported as a key mediator implicated in the physiopathology of CNS inflammatory process. In the present study two drugs
(Thalidomide and pantoxifylline) known as TNF- inhibitors were used during EAE development in Lewis rats. EAE was induced with inoculation of guinea pig spinal cord homogenate in complete Freunds adjuvante in the footpad on day 0 and rats treaties during 15 days with Thalidomide injected subcutaneous or pentoxifylline injected intraperitoneally. Clinical evaluation was carried out daily and histological analysis (staining with hematoxylin and eosin and Weigert Pal Russel) of brain tissue and spinal cord performed at the end of experiment. Griess method was chosen for determination of NO and enzyme immunoassay
(ELISA) for TNF- and interferon gamma (IFN-) cytokine plasma levels. Thalidomide caused a significant reduction in neuroinflammation and
demyelination within the CNS. Plasma levels of NO, IFN- and TNF- also showed marked reduction. Such findings were correlated with improvement of clinical symptoms. 90% of rats treated with thalidomide did not develop EAE. Our experiments showed that pentoxifylline was not effective in the modulation of EAE. The results until suggest that thalidomide interfere strongly with pathogenetic mechanisms of EAE development and production of inflammatory mediators. Such drug may also be considered an important tool for use in the therapeutic schemes of inflammatory demyelinating diseases of the CNS Such as multiple sclerosis.
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS
FIGURA 1 Preparo da emulsão ................................................................... 40
FIGURA 2 Inoculação e marcação auricular ............................................... 40
FIGURA 3 Coxim plantar de rato Lewis inoculado com GPSC-CFA ........... 41
FIGURA 4 Esquema Elisa direto para pesquisa de antígenos (TNF- e
IFN-) .........................................................................................
47
FIGURA 5 A Corte histológico de medula espinhal do grupo controle ........... 62
FIGURA 5 B Corte histológico de medula espinhal do grupo EAE.................. 62
FIGURA 5 C
FIGURA 5 D
FIGURA 6 A
FIGURA 6 B
FIGURA 6 C
FIGURA 6 D
FIGURA 7 A
FIGURA 7 B
FIGURA 7 C
FIGURA 7 D
FIGURA 8 A
FIGURA 8 B
FIGURA 8 C
FIGURA 8 D
Corte histológico de medula espinhal do grupo EAE + Pentoxifilina ................................................................. Corte histológico de medula espinhal do grupo EAE + Talidomida ................................................................................. Corte histológico da substância branca do cérebro do grupo controle....................................................................................... Corte histológico da substância branca do cérebro do grupo EAE ............................................................................................ Corte histológico da substância branca do cérebro do grupo EAE + pentoxifilina ..................................................................... Corte histológico da substância branca do cérebro do grupo EAE + talidomida ....................................................................... Corte histológico da substância branca do cerebelo do grupo controle....................................................................................... Corte histológico da substância branca do cerebelo do grupo EAE ........................................................................................... Corte histológico da substância branca do cerebelo do grupo EAE + pentoxifilina .................................................................... Corte histológico da substância branca do cerebelo do grupo EAE + talidomida ....................................................................... Corte histológico da substância branca da medula espinhal do grupo controle ............................................................................ Corte histológico da substância branca da medula espinhal do grupo EAE.................................................................................. Corte histológico da substância branca da medula espinhal do grupo EAE + Pentoxifilina .......................................................... Corte histológico da substância branca da medula espinhal do grupo EAE + Talidomida ............................................................
62
62
63
63
63
63
64
64
64
64
65
65
65
65
LISTA DE GRÁFICOS, TABELAS E QUADROS
QUADRO 1 Escore clínico dos ratos Lewis com EAE ..................................... 42
TABELA 1 Efeito da pentoxifilina e da talidomida no escore clínico por
animal (n=10)................................................................................ 51 GRÁFICO 1 Cinética da avaliação do efeito da pentoxifilina e da talidomida
no escore clínico da EAE.............................................................. 50 GRÁFICO 2 Efeito da pentoxifilina e da talidomida sobre o escore clínico da
EAE no 15°dia pós-indução.......................................................... 52 GRÁFICO 3 Efeito do tratamento com pentoxifilina e talidomida na produção
de NO. .......................................................................................... 55 GRÁFICO 4 Efeito do tratamento com pentoxifilina e talidomida na produção
de IFN-. ....................................................................................... 56 GRÁFICO 5 Efeito do tratamento com pentoxifilina ou talidomida na
produção de TNF- ............................................................. 57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS - Síndrome da imunodeficiência adquirida
AMPc - Adenosina monofosfato cíclica
CFA - Adjuvante Completo de Freund
d.p.i. - Dias pós-inoculação
EAE - Encefalomielite autoimune experimental
ELISA - Enzima imunoensaio
GPSC - Homogeneizado de medula de cobaio
HE - Hematoxilina e eosina
IFA - Adjuvante Incompleto de Freund
i.p. - Intraperitoneal
IFN- - Interferon beta
IFN- - Interferon gama
IL - Interleucina
Il-r - Interleucina recombinante
KO - nocaute
LT - Linfócito T
MAG - glicoproteína associada à mielina
MHC - Complexo principal de histocompatibilidade
MOG - Glicoproteína associada ao oligodendrócito
NO - Óxido Nítrico
PBM - proteína básica de mielina
PETOX - pentoxifilina
PLP - proteolipideo da mielina
PBS - Salina tamponada com fosfato
s.c - Sub-cutâna
TAL - talidomida
TNF- - Fator de Necrose Tumoral alfa
UNIPAC - Universidade presidente Antônio Carlos
UFJF - Universidade Federal de Juiz de Fora
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 16
2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 21
2.1- Possibilidades terapêuticas na Esclerose Multipla .......................... 21
2.2- Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) como
modelo experimental da Esclerose Múltipla ................................... 25
2.3- Drogas inibidoras de TNF- 32
3 OBJETIVOS........................................................................................... 36
3.1- OBJETIVO GERAL ......................................................................... 36
3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................... 36
4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 37
4.1- ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO ................................................. 37
4.2- CONDIÇÕES DE CRIAÇÃO E MANEJO DOS ANIMAIS ................ 37
4.3- GRUPOS EXPERIMENTAIS ........................................................... 38
4.4- INDUÇÃO DA EAE .................................................................... 39
4.5- TRATAMENTO APÓS A INDUÇÃO DE EAE .................................. 41
4.6- AVALIAÇÃO DOS SINAIS CLÍNICOS ............................................. 42
4.7 -OBTENÇÃO DE PLASMA E DE TECIDO NERVOSO ................ 42
4.8- COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS ................................................... 43
4.8.1- Hematoxilina e Eosina ........................................................... 44
4.8.2- Hematoxilina Férrica de Weigert – Pal – Russel ................... 44
4.9- PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) ......................................... 45
4.10- DOSAGEM DE IFN- e TNF- POR ELISA ................................. 46
4.11- ANALISE ESTATÍSTICA ............................................................... 47
5 RESULTADOS ..................................................................................... 48
5.1- CURSO CLÍNICO DA EAE ....................................................... 48
5.2- EFEITO DA PENTOXIFILINA E DA TALIDOMIDA NOS
NÍVEIS PLAMATICOS DE NO, TNF- e IFN- ...................................53
5.3- ANÁLISE HISTOPATOLÓGICAS DO SNC DE RATOS COM
EAE TRATADOS COM PENTOXIFILINA OU TALIDOMIDA......... 58
6 DISCUSSÃO ........................................................................................ 66
7 CONCLUSÕES ........................................................................................... 80
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................... 82
1- INTRODUÇÃO:
Entre as doenças cujas causas ainda não foram identificadas, a
Esclerose Múltipla (EM) é das mais insidiosas pelos obstáculos que opõe ao
diagnóstico, dada à variedade e indefinição de seus sintomas, e a
impossibilidade de prever seu curso (MOREIRA, 2000; PUGLIATI, 2006). A EM
é uma doença autoimune de etiologia desconhecida que afeta o cérebro e a
medula espinhal causando a lesões na bainha de mielina, provocando a
interrupção temporária ou a transmissão desordenada desses impulsos. As
manifestações clínicas mais freqüentes são entorpecimento, falta de
coordenação, perda de equilíbrio, fraqueza muscular, paralisia, distúrbios
visuais e do tato. Nos casos mais graves, pode levar à paralisia permanente e
morte (TILBERY, 2005). As primeiras manifestações da doença costumam
ocorrer no início da vida adulta, com picos de incidência ao redor dos trinta
anos. No início, ela pode não ser alarmante com leve formigamento e
entorpecimento nas pernas e discreta incordenação de movimentos. Nos casos
mais sérios, o distúrbio se anuncia com fortes sinais de disfunção medular
aguda, inclusive paralisia das pernas e incontinência urinária. Os sintomas
tendem a desaparecer temporariamente (remissão) em questão de dias ou
17
semanas, podendo voltar (surto) a intervalos de meses ou anos, com
intensidade gradualmente maior (MOREIRA, 2000).
Repetições de surtos são características marcantes desta doença. O
termo esclerose múltipla é decorrente das múltiplas áreas de cicatrização
(esclerose) que representam muitos focos de desmielinização no sistema
nervoso. Os sinais e sintomas neurológicos da EM são tão diversos que o
médico pode não diagnosticá-la quando os primeiros sintomas ocorrem.
Como a doença freqüentemente piora lentamente com o decorrer do tempo,
os indivíduos afetados apresentam períodos de saúde relativamente boa
(remissões) alternados com períodos de fraqueza (exacerbações)
(CATELAN, 2004).
MOREIRA et al (2000), estudos epidemiológicos mostram que a EM é a
enfermidade neurológica crônica mais freqüente em adultos jovens. Na Europa
e América do Norte acredita-se que a existência de um fator ambiental seria
imprescindível para o aparecimento da doença, provavelmente na forma de
uma infecção inaparente ou de caráter banal ou associado à existência de um
fator genético de susceptibilidade para a doença. A EM afeta mais mulheres
que homens. Estima-se que no mundo, são dois milhões de pessoas afetadas.
No Brasil estima-se que afete de 25 mil a 30 mil pessoas Porém o último
trabalho significativo, realizado em 1997, mostra que a prevalência da doença
no estado de São Paulo era de 15 casos por 100 mil habitantes, contra 4,3
casos por 100 mil habitantes registrados em 1992 (CALLEGARO, 2001).
18
As respostas imunológicas na EM estão baseadas nos estudos de
subpopulações dos linfócitos denominadas de Th1 e Th2. A ativação resposta
imune ocorre devido à ativação das interleucinas pró-inflamatórias (TNF-alfa,
IFN-gama, IL-12 e IL-18) e mediadoras (IL-4, 5, 10 e TGF-beta),
respectivamente (TYLBERY, 2005; YANYING, et al., 2007).
Na EM foi observado que as lesões produzidas na bainha de mielina são
mediadas principalmente por uma resposta imune específica do tipo (Th1),
onde macrófagos ativados por linfócitos T específicos contra proteínas e
lipídeos da bainha de mielina modulam uma potente resposta imunológica com
grande produção de TNF- IFN- ( YANYING, et al., 2007).
Os tratamentos atuais procuram diminuir a morbidade dando uma melhor
qualidade de vida ao paciente, já que não existe cura. Os primeiros tratamentos
tinham como base o uso de corticosteroídes, com intuito de promover redução
da resposta autoimune através de estimular uma potente atividade
antiinflamatória. Os corticosteroídes, porém, apresentam uma série de efeitos
adversos como edema, hipertensão arterial sistêmica, fraqueza muscular,
proteólise, maior risco de diabetes por ser antagonista da insulina e maior
predisposição dos pacientes a infecções oportunistas em decorrência da queda
imunitária. Em virtude destes efeitos adversos graves, as buscas por novas
alternativas terapêuticas mais seguras prosseguiram e em meados da década
de 90 estudos com imunomoduladores tornaram-se promissores (TYLBERY,
2005).
19
Atualmente, os imunomoduladores se tornaram parte do arsenal
terapêutico no tratamento de pacientes com EM, oferecendo real possibilidade
de modificação do curso e da progressão da doença. Os primeiros resultados
publicados com o uso do interferon beta 1-a em mais de 350 pacientes,
demonstraram redução no número e gravidade dos surtos, prolongando o
tempo de remissão entre eles e reduzindo o número e volume de lesões na
ressonância magnética nuclear, e retardando a progressão da doença. Nos
últimos anos outros imunomoduladores têm sido empregados no tratamento da
EM. Os imunomoduladores mais empregados são: o interferon beta 1-a
(REBIF® e AVONEX®), o interferon beta 1-b (BETAFERON®), e o acetato de
glatiramer (COPAXONE®) (BAYAS & GOLD, 2003; BRUNO, 2006). Entretanto,
há pacientes onde os imunomoduladores não surtem efeito, e o tratamento
com interferon apresenta uma série de efeitos adversos, além do alto custo do
tratamento. O tratamento da EM é por tempo indeterminado, mas o paciente
tem o direito de interrompê-lo depois de alguns anos sem crises. Há
medicamentos que têm um custo mensal altíssimo (R$ 2.400,00 a R$ 5.600,00)
Em Minas Gerais a Secretaria de Saúde gastou no ano de 2001 R$
4.683.780,00 em medicamentos imunomoduladores para EM (8,54% do
orçamento para compra dos 38 itens de Medicamentos Excepcionais - Portaria
SAS/MS No 341 de 22/08/2001) (PEIXOTO, 2002).
Em decorrência dos fortes efeitos adversos dos corticosteroídes e do
alto custo dos tratamentos com os imunomoduladores estudos têm sido
feitos no sentido de se encontrar uma terapêutica eficaz e ao mesmo tempo
segura e de baixo custo.
20
Encefalomielite autoimune experimental (EAE) tem sido comumente
usada como um modelo para estudos da EM e possíveis terapias para a
mesma, devido à semelhança clínica e de aspectos imunológicos
correlacionados (ALVORD, 1979; LEADBETTER, 1998). Neste modelo,
animais como ratos Lewis, Dark Aboud, camundongos SJL, Balb/C e C57BL6
são freqüentemente utilizados para induzir a EAE.
Nosso trabalho se propôs a testar o efeito das drogas Talidomida e a
Pentoxifilina na produção de mediadores inflamatórios e na patogênese da
EAE. Pentoxifilina e a talidomida têm sido utilizadas em estudos experimentais
como eficientes inibidores da produção de TNF- em resposta a
lipopolissacarideos (NOEL et al., 1998). A pentoxifilina é um medicamento
usado no tratamento de doenças veno oclusivas e possui ótima tolerabilidade
(RIENECK 1993). Já a talidomida embora apresente efeito teratogênicos têm
sido utilizadas em várias condições inflamatórias tais como Lupus Eritematoso
Sistêmico, artrite reumatoíde e vários tumores (TEO et al., 2004).
Por serem drogas de ação sobre o TNF- e não causarem os efeitos
adversos em demasia como os corticosteroídes e nem apresentarem os custos
elevados do interferon beta, acetato de glatiramer e o novo tratamento com
Natalizumab acreditamos que Talidomida e/ou a Pentoxifilina podem ser uma
nova alternativa terapêutica para inibição da neuroinflamação.
2- REVISÃO DE LITERATURA
2.1- Possibilidades terapêuticas na Esclerose Múltipla
A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune órgão específico do
SNC, caracterizada um processo seletivo de inflamação local com
desmielinização envolvendo mecanismos celulares e humoral. Esta
enfermidade acomete principalmente adultos jovens com idade entre 20 e 40
anos, sendo uma das doenças neurológicas de maior incapacitação física do
adulto jovem (PUGLIATI et al., 2006). A maioria dos pacientes (85%) inicia seu
quadro clínico com a forma surto-remissão, e em cerca de 10 anos, evoluem
para a forma clínica crônica progressiva secundária. Os sintomas da esclerose
múltipla são; incontinência urinária, sensação de paralisia e perda de
sensibilidade no braço ou na perna; perda do equilíbrio; perda parcial da visão
depois recuperada; incoordenação motora. O paciente pode ainda sentir
cansaço, alterações do humor, depressão e alterações da libido e na fase mais
avançada, a EM pode ocasionar lapsos curtos de memória (REIBER, 1998).
22
A EM acomete mais as mulheres (PAPENFUSS et al., 2004) - a
proporção é de três mulheres para dois homens com a doença podendo chegar
até a proporção de 10 mulheres para um homem (PAPAIS-ALVARENGA,
1997; PUGLIATI et al., 2006). A etiologia ainda é desconhecida, afetando
principalmente caucasianos. Vários fatores podem estar relacionados com a
sua causa como, fatores ambientais, genéticos, infecções virais associados a
Herpes vírus, vírus da caxumba, sarampo, HERV-W (nova família de retrovirus
humano) e até mesmo fatores climáticos (KIM & CROW, 1999; LASSMANN et
al., 2005, FROHMAN et al., 2006). Sabe-se que países frios apresentam
incidência maior da doença em alguns países da Europa a proporção é de cem
doentes para 100 mil habitantes (PUGLIATI et al., 2006). No Brasil, a
proporção é de 15 a 20 doentes para 100 mil habitantes (PAPAIS-
ALVARENGA, 1997, LASSMANN et al., 2005).
Os estudos nas áreas de imunologia e patologia sustentam a hipótese
de um evento central orquestrado por linfócitos T CD4+ auto-reativos no início
das lesões da EM. A presença desses linfócitos no parênquima cerebral após
atravessarem a barreira hematoencefálica em contato com os antígenos,
desencadeia uma cascata de eventos que culminará com a formação de placas
desmielinizantes agudas (FROHMAN et al., 2006).
Nesta doença autoimune do SNC células T apresentam severa
reatividade contra proteínas da bainha de mielina, incluindo a proteína básica
de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP) e glicoproteína oligodendrócito
da mielina (MOG), esta última implicada na manutenção do processo
23
(LEADBETTER et al., 1998). A EM apresenta lesões desmielinizantes
principalmente provocadas por linfócitos Th1, com altos níveis de IFN- e
potente ativação de macrófagos (YANYING, et al., 2007).
O tratamento para EM consistia inicialmente na aplicação de
corticosteroídes como predinisona em doses crescentes de acordo com a
intensidade e freqüência das remissões. O uso de corticosteroídes por
períodos prolongados pode causar uma série de prejuízos a outras funções do
organismo como, edema, hipertensão arterial, fraqueza muscular e até
diabetes (TILBERY, 2005). Devido ao efeito adverso dos corticosteroídes
interferon beta 1a e 1b e acetato de glatiramer vêm sendo utilizado no
tratamento da EM embora o mecanismo preciso e ação clínica ainda não esteja
totalmente claro (SCHMIDT et al., 2001; BRUNO, 2006).
O interferon beta e acetato de glatiramer são esquemas terapêuticos
aprovados pelo FDA nos Estados Unidos, estes medicamentos são
administrados de forma contínua (GOODIN et al., 2002), mas que não têm
conseguido inibir completamente a progressão da doença, embora diminuam a
ocorrência das lesões e os surtos da doença (De JAGER & HAFFLER, 2007).
Durante o tratamento podem aparecer reações inflamatórias no local das
injeções e aumento das enzimas hepáticas. Estas tendem a normalizar em
poucos meses, mas em alguns pacientes podem complicar (RIZVI & AGIUS,
2004). Entre os desconfortos clínicos são relatados, náuseas, vômitos e perda
de peso e, alguns pacientes podem produzir anticorpos que neutralizam o
24
interferon, com significante redução na eficácia terapêutica. Anticorpos são
produzidos mais frequentemente contra interferon beta 1b do que contra
interferon beta 1a (ROSSMAN, 2007). Outro fator limitante destas drogas é seu
elevado custo, levando algumas vezes à falhas no tratamento que deve ser
interrompido (APRIL et al., 2007).
Outra droga promissora é o Natalizumab, um anticorpo monoclonal
contra -4-integrina que bloqueia a migração de linfócitos para o parênquima
cerebral. Entretanto, efeitos adversos como, fadiga, reações alérgicas,
ansiedade e edema periférico foram observados quando associado com
interferon beta, além de infecções freqüentes, reações de hipersensibilidade e
colelitíases, quando a droga é utilizado isoladamente. Além disso, o custo
elevado limita o uso deste tratamento (GIOVANNONI et al., 2007, HORGA &
HORGA, 2007).
25
2.2- Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) como
modelo experimental da Esclerose Múltipla.
Encefalomielite autoimune experimental (EAE) tem sido comumente
usada como um modelo para estudos de estratégias terapêuticas inovadoras
na EM devido à semelhança clínica e de aspectos imunológicos
correlacionados entre elas (LEADBETTER et al., 1998). Neste modelo animais
como ratos Lewis, Dark Aboud, camundongos SJL, Balb/C e C57 são
freqüentemente utilizados para induzir a EAE.
A EAE é uma doença autoimune do SNC, que serve como modelo de
estudo para doenças desmielinizantes dos humanos como a EM (RAINE, 1976,
YANYING et al., 2007). O curso clínico da EAE é caracterizada por ataxia,
progressiva e ascendente paralisia com recidivas espontâneas podendo levar à
morte. Isto coincide com uma resposta inflamatória do SNC que é
caracterizada por infiltração de células T e macrófagos e ativação da micróglia
e astrócitos (OHMORI, 1992; SHIN, 1995). O óxido nítrico proveniente de
macrófagos parece ter um papel central na EAE (SEUNGJOON et al., 2000).
Óxido nítrico (NO) é um gás apolar sintetizado a partir do metabolismo
da L-arginina pela via da óxido nítrico sintase (NOS) (XIE & NATHAN, 1994).
Existem duas isoformas da enzima: (1) A via da NOS dependente e constitutiva
de cálcio e (2) a NOS induzida independente de cálcio. A constitutiva forma de
NOS inclui a NOS neuronal (nNOS) e a NOS endotelial (eNOS) as quais são
26
rapidamente ativadas por agonistas que elevam o cálcio intracelular. A forma
induzida da NOS é elevada horas após um estímulo imunológico (MONCADA
et al., 1991; XIE et al., 1992; ANNIE-JEYACHRISTY et al, 2008). No SNC a
forma constitutiva de NOS sintetiza NO, o qual tem um papel importante na
sinalização intracelular, neurotransmissão e vaso regulação (BREDT et al.,
1992; MURPHY et al., 1993). Entretanto, a eNos não é expressa por células
cerebrais pouco ativadas (MURPHY et al., 1993; LEE et al., 1993; SUN et al.,
1998). No SNC a geração local de NO por nNOS e/ou iNOS tem sido implicada
em injúrias tóxicas incluindo injúria neuronal citotóxica (nNOS) (DAWSON et
al., 1991; DAWSON et al., 1993), dano cerebral hipo-isquêmico (nNOS, iNOS)
(BUISSON et al., 1992; HUANG et al., 1994; IADECOLA et al., 1995), injuria
cerebral traumática (nNOS) (SHARMA et al., 1996), e desordens autoimunes
(iNOS) (LIN et al., 1993; MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1993; HOOPE et al.,
1995; SHIN et al., 1998; SEUNGJOON et al., 2000, ANNIE-JEYACHRISTY et
al, 2008).
O papel do NO em doenças auto-imunes parece bastante controverso,
apresentando efeitos reguladores e ao mesmo tempo efetores. Vários estudos
têm mostrado que a iNOS é uma importante mediadora de inflamações no SNC
por geração de NO no curso da EAE (MACMICKING et al., 1992; ZHAO et al.,
1996; BRENNER et al., 1997; CROSS et al., 1997; OKUDA et al., 1997; TRAN
et al., 1997; SEUNGJOON et al., 2000; PONOMAREV, et al., 2007) e lesões na
EM (De GROOT et al., 1997; PONOMAREV, et al., 2007). Ao contrário destes
achados, alguns pesquisadores mostraram que NO e suas enzimas incluindo
iNOS parecem exercer um papel benéfico no curso da EAE porque iNOS
27
consegue inibir o agravamento da inflamação (RUULS et al., 1996; GOLD et
al., 1997; OKUDA et al., 1998; COWDEN et al., 1998; PONOMAREV, et al.,
2007) e porque EAE foi exacerbada em camundongos nocautes do gene
NOS2. Animais com EAE produzindo altos níveis de NO e iNOS recuperam da
paralisia (OKUDA et al., 1997), sugerindo que iNOS tem a capacidade de inibir
atividade das células inflamatórias no SNC na EAE. Gonzalez-Hernandez &
Rustioni (1999), reportaram que 3 isoformas de NOS, incluindo nNOS, eNOS e
iNOS exercem um efeito benéfico na regeneração de nervos periféricos.
Entretanto, nos estudos de SEUNGJOON et al. (2000) foi demonstrado que NO
produzido por ambas as vias constitutivas nNOS e eNOS (mas não de iNOS)
no cérebro, tem um papel benéfico na remoção de células inflamatórias através
do bloqueio da proliferação de células T e eventualmente por indução da
apoptose de células inflamatórias na EAE. Nos estudos de O’BRIEN et al.
(1999) ratos Lewis apresentaram remissão clínica da EAE quando tratados
com acetato de N-metil-L-arginina um inibidor de NOS.
Citocinas tem um papel importante na diferenciação das células T e
direcionarmento de precursores de células T (Th0) para linhagens Th1, Th2 e
Th3. A IL-4 direciona células T para linhagens Th2, enquanto IL-12 direciona
Th0 a secretar IFN- por células Th1 (LE GROS et al., 1990; HSIEH et al.,
1992; FARIA & WEINER, 2006). Macrófagos ativados por linfócitos T CD4
apresentam alta produção de IFN- produzem H2O2, NO e TNF- em resposta
a esta ativação (CARLIN et al., 1989; FARIA & WEINER, 2006). Na EAE a
inflamação é mediada por células Th1 (LASSMANN & WISNIEWSKI, 1979;
28
PONOMAREV, et al., 2007) ativadas por IL-12 (LEONARD et al., 1996)
produzem, IL-2, IFN- e TNF- (FALCONE & BLOOM, 1997).
A IL-12 é uma citocina também produzida por células apresentadoras de
antígenos (APC). É um heterodímero de subunidades p35 e p40, que induz
produção de IFN- por células T e NK . IL-12 está envolvida na indução da fase
aguda da EAE. Foi demonstrado por CRIS et al. (1998) que a administração de
anti-IL-12 previne ativamente a EAE induzida e a EAE transferida por células
imunes.
Em ambas EM e EAE ocorre auto-reatividade de células T direcionadas
neuroantígenos como a PBM. As células T envolvidas são do tipo Th1, mas a
citocina TNF- é um dos principais mediadores da EAE (LAFAILLE et al.,
1997).
O TNF- é uma citocina pleiotrópica, produzida em grande escala por
monócitos e macrófagos, sendo considerado um mediador primário da resposta
inflamatória e comumente associado a uma ampla variedade de condições
patológicas (OLD, 1985). Segundo FURLAN et al. (2004) a IL-12r induz
produção de IFN-, óxido nítrico e TNF- exacerbando a EAE. Sendo claro o
envolvimento de TNF- e IFN- em inflamações desmielinizantes como a EAE.
RNA mensageiro para TNF- e IFN- tem sido identificado no SNC na fase
aguda da EAE (ISSAZADEH et al., 1995). TNF- é produzido em grande
quantidade por astrócitos de ratos Lewis susceptíveis a EAE, mas não em ratos
29
Brown-Norway resistentes à mesma (CHUNG et al., 1991). Injeções de TNF-
prolongam a EAE ou induzem recorrência em camundongos susceptíveis SJL
que pareciam ter se recuperado parcial ou completamente da fase aguda da
EAE (KURODA et al., 1991; CRISI et al., 1995). Entretanto, FREI et al. (2001)
relata que camundongos C57BL/6 e SJL knockout para TNF- e linfotoxinas
desenvolveram EAE indicando que estas citocinas não são essenciais para a
indução da EAE. Mas, a importância, da resposta Th1 fica demonstrada
quando na tentativa de tratar pacientes de EM com IFN- mostrou-se não só
ineficaz, mas também levou a piora clínica drástica dos pacientes. Isto deve-se
ao fato de o IFN- aumentar a expressão de moléculas de complexo de
histocompatibilidade principal de classe ll e, portanto, aumenta a apresentação
de antígenos. Além disso, induz a diferenciação de Th0 a células tipo Th1, as
quais estão envolvidas na patogênese e manutenção da desmielinização tanto
da EM quando da EAE (SHEVACH, 2000).
No entanto, tem sido mostrado que administração oral e via mucosa de
auto-antígenos e de IL-10 suprime resposta Th1 na EAE com menor produção
de IFN, TNF- e aumento na produção de TGF- e IL-10. Camundongos SJL
após administração por via nasal com PBM e IL-10 reduziram resposta
proliferativa de linfócitos e produção de IFN-. Foi observado em adição
aumento da produção de IL-10 e TGF-, conferindo proteção contra a EAE
(SLAVIN et al., 2001; FARIA & WEINER, 2006). O tratamento com IL-10 leva a
mudança de isotipos de IgG2a para IgG1 que marcam a mudança de resposta
Th1 para Th2 e proteção contra a EAE. O mecanismo no qual a IL-10 reduz a
30
indução de IFN-, TNF- e a EAE talvez esteja baseado no fato de esta
citocina diminuir a expressão de receptores de TNF- ..(WEINER, 1997).
Entretanto, tentativas terapêuticas utilizando PBM via oral em alguns pacientes
com EM não tiveram sucesso. Isso sugere que intervenções terapêuticas que
induzem tolerância oral podem não ser efetivas em todos os pacientes com
EM.
Como salientado anteriormente IL-10 aumenta a produção de TGF-
(SLAVIN et al., 2001; FARIA & WEINER, 2006) de fato, muitas células,
incluindo as células T produzem TGF- na forma latente. Estudos de imuno –
histoquímica mostram dados pouco conclusivos sobre o papel do TGF-
produzidos por infiltrados de EAE, porque a diferenciação entre forma ativa e
latente de TGF- não foi feita nestes estudos. Portanto, não está claro o papel
do TGF- endógeno na proteção de doenças autoimunes. Mas, tratamento com
TGF- ativo tem mostrado ser efetivo contra doenças autoimunes locais e
sistêmicas. O grande problema é que tratamento sistêmico com TGF- induz
fibrose no fígado e glomeruloesclerose além de ser teratogênico em
camundongos. Outro caminho possível é o uso de TGF- de forma latente e
localizada ao local do infiltrado inflamatório, suprimindo assim este processo
(CHEN et al., 1998).
O tratamento tanto da EAE quanto da EM é bastante eficaz quando
usado corticosteroídes e ciclofosfamida que inibem a proliferação de células T,
31
interferindo, assim, na secreção de citocinas que conduzem à inflamação e
posterior ativação de células T (DAYNES et al., 1990).
Costicosterona mostrou-se efetivo na redução de resposta Th1 murina,
mas não de Th2, isto tanto in vitro quanto in vivo (DAYNES & ARANEO, 1988;
DAYNES et al., 1990). Usando células T CD4+ de ratos foi demonstrado que
dexametasona sintética favoreceu o desenvolvimento de células Th2
(RAMIREZ et al., 1996). Foi demonstrado em culturas de células de sangue
periférico que IL-12 (p40) e TNF- são de 10 a 100 vezes mais sensíveis ao
efeito da dexametasona que IL-10. Estes achados suportam que drogas que
atuam modulando o balanço Th1 X Th2 ou que possam inibir respostas por
estas citocinas podem favorecer a recuperação de doenças como a EAE e
talvez a EM (SHEVAC, 2000).
Embora o uso de corticosteróide e imunossupressores leve à melhora do
quadro clínico, os efeitos adversos destas classes de medicamentos, por
vezes, tornam-se tão deletérios quanto os da própria EM. Efeitos estes que
incluem, além da depressão da imunidade do paciente, risco de diabetes,
edema, hipertensão arterial, fraqueza muscular, dificuldade de cicatrização,
hipoproteinemia entre outros (SCHMIDT et al., 2001; TILBERY, 2005; DAVEY
& BUCHBINDER, 2008).
Como já foi mencionado o uso de IFN- tem proporcionado também
melhora terapêutica nos pacientes com EM, porém, estes medicamentos
apresentam como problema o elevado custo do tratamento e vários efeitos
32
adversos que por vezes leva a dificuldade na terapêutica do paciente (APRIL et
al., 2007).
Como a cura ainda não foi possível, torna-se, portanto, importante as
pesquisas que busquem alternativas terapêuticas eficazes tanto clinicamente
como economicamente e que forneçam além de efeitos farmacológicos
esperados menores efeitos adversos, características que devem nortear
sempre que possível uma terapêutica ideal.
33
2.3- Drogas inibidoras de TNF-
TNF- é um mediador crucial envolvido na comunicação entre
imunidade e SNC em condições fisiológicas e sua importância é ampliada
durante doenças inflamatórias. Foi demonstrado que, IL-12r induz produção de
IFN-, óxido nítrico e TNF- exacerbando a EAE (FURLAN et al., 2004).
Camundongos tratados com PBM via oral antes da imunização ficaram
protegidos e apresentaram menor nível de TNF-, mostrando mais uma vez a
importância desta citocina na patogênese da EAE.
A pentoxifilina é uma metilxantina inibidora de fosfodiesterases usada no
tratamento de doenças venosas oclusivas que aumenta a perfusão em tecidos
pouco vascularizados (STREITER, 1988, RIENECK 1993). Alguns autores
relatam o efeito anti-tumoral da pentoxifilina (TEICHER et al., 1991; RIENECK
1993). Quando a pentoxifilina é administrada com 4 -ácido acético 5,6-
dimetilxantenona aumentou o efeito anti-tumoral desta droga suprimindo a
produção de TNF-˜. (CHING et al., 1998).
Pentoxifilina também apresenta propriedades antiinflamatórias
exercendo efeitos inibitórios sobre interleucina-1 (IL-1b), IL-6, IL-8 (NEUNER,
et al., 1994), IFN- e IL-2 (RIENECK, 1993), e um forte efeito inibidor na
produção de NO em camundongos (VADIEI et al., 1996). Pentoxifilina aumenta
os níveis intracelulares de AMPc em macrófagos um efeito inibidor na produção
de TNF- por estas células (SZTRYMF et al., 2004). Segundo BESSLER et al,
34
(1986) a pentoxifilina inibe não só a capacidade fagocítica de monócitos e
também, a produção de superóxido.
Além de aumentar AMPc intracelular a pentoxifilina também diminui os
níveis de RNAm para a produção de TNF- afetando a transcrição para a sua
síntese (HEN-I, et al., 2004). Contudo, a administração de pentoxifilina não
apresentou melhora dos sintomas da EAE, mas quando tratada com IL-1r e
pentoxifilina o camundongo Dark About houve melhora clínica (POLAK, 2003).
Assim como a Pentoxifilina, a Talidomida, um derivado racêmico do
ácido glutâmico, tem sido utilizada em vários modelos experimentais como
inibidora da produção de TNF- em resposta a lipopolissacarídeos (NOEL et
al., 1998). Esta droga foi sintetizada e designada para pesquisas em 1953 por
pesquisadores da Química Grunenthal no oeste da Alemanha. Na época, este
novo agente falhou no controle de crises epiléticas, entretanto, apresentou
potente efeito hipnótico e sedativo. Porém, entre 1961 e 1962 foi retirada do
mercado devido à severa teratogenicidade (MELLIN & KATZENSTEIN, 1962;
HASHIMOTO, 2002).
Vários anos depois a talidomida atraiu o interesse dos pesquisadores
devido ao potencial para o tratamento de várias doenças, incluindo hanseníase,
AIDS, mieloma múltiplo e vários tipos de cânceres e outras desordens
dependentes de angiogênesis (HASHIMOTO, 2002).
Em julho de 1998 foi aprovada nos Estados Unidos pela FDA (Food and
Drug Administration) para emprego terapêutico em pacientes com eritema
35
nodoso leproso e complicações da hanseníase (Collin et al., 2001). Também
tem sido utilizada em várias condições inflamatórias tais como Lupus
eritematoso sistêmico, artrite reumatoíde e vários tumores (TEO et al., 2004).
SAMPAIO et al. (1991), demonstraram que talidomida inibe
seletivamente síntese de TNF- em sangue periférico humano estimulado por
micobactérias em cultura. Esta ação parece ser mediada por aumento na
degradação de RNAm resultando em uma redução do mesmo (MOREIRA et
al., 1993). Devido a este efeito sobre o TNF- a talidomida é usada em muitas
doenças inflamatórias nos qual esta citocina exerce um papel central na
patogênese (GUTIERREZ-RODRIGUES et al., 1989; GRAU, 1991; SARNO et
al., 1991; VOGELSANG et al., 1992).
A EAE é uma doença inflamatória desmielinizante do SNC mediada por
linfócitos T CD4+ onde os episódios da doença se correlacionam com
infiltração de leucócitos ativados no SNC e iniciação de funções efetoras por
uma rede de citocinas liberadas, o que resulta em lesões histológicas na
mielina levando a deficiência neurológica (ALVORD et al., 1979; YANYING et
al., 2007). As células T específicas que migram para o SNC na EM e na EAE
apresentam um padrão Th1 de resposta levando a elevados níveis de IFN-
(MUSTAF et al., 1991) e TNF- YANYING et al., 2007)
Diante do exposto é relevante estudar-se o possível efeito
antiinflamatório da pentoxifilina e da talidomida para modular a resposta
inflamatória e o curso clínico da EAE induzida em ratos Lewis.
3- OBJETIVOS:
3.1- OBJETIVO GERAL:
Avaliar os efeitos da pentoxifilina e da talidomida sobre a evolução
clínica e alguns mediadores inflamatórios no modelo da EAE em ratos Lewis.
3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
A) Verificar os efeitos da pentoxifilina e da talidomida sobre o curso clínico
da EAE induzidas nos ratos Lewis.
B) Avaliar também os efeitos da pentoxifilina e da talidomida sobre os
níveis séricos dos mediadores IFN-, TNF- e NO;
C) Investigar os efeitos dos inibidores de TNF- sobre as alterações
histológicas no SNC.
4- MATERIAL E MÉTODOS:
Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal do Centro de Biologia da Reprodução – Universidade Federal de Juiz
de Fora.
4.1- ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Ratos Lewis isogênicos, fêmeas com idade variando de 6 a 8 semanas,
pesando 120 –150g foram obtidos do CEMIB – UNICAMP – SP - Brasil.
4.2- CONDIÇÕES DE CRIAÇÃO E MANEJO DOS ANIMAIS
O alojamento dos ratos, no Biotério do Centro de Biologia da
Reprodução – UFJF é provido de amplos basculantes telados e de dois
exaustores, além de aquecedores de meio ambiente. A temperatura é mantida
ao redor de 22 ºC, pela ventilação natural no verão e, no inverno, com ajuda de
aquecedores. A iluminação é mista – luz natural e lâmpadas fluorescentes –
sendo as últimas controladas automaticamente para acenderem às 6h e
38
apagarem às 18h. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno,
providas de camas de maravalha selecionada, mas não esterilizada,
mamadeira para água e cocho para ração do tipo peletizada (PETERS &
GUERRA, 1996).
Os animais foram alimentados com ração e água ad libitum.
4.3- GRUPOS EXPERIMENTAIS
Ao todo foram utilizados 40 animais, destes 10 foram utilizados como
controle negativo e não receberam qualquer tipo de tratamento e foram
sacrificados para análises padrão de clínica, histologia e análises sorológicas
normais. Os demais foram, divididos em três grupos como mostrado abaixo e
sacrificados no 15°dia pós-indução da EAE:
a) Grupo controle negativo – 10 animais
b) Grupo EAE (animais injetados com Macerado de cobaia e Adjuvante
completo de Freund + 4 mg de Mycobacterium tuberculosis) – 10 animais
c) Grupo EAE e Tratados via intra-peritoneal com 100 mg/Kg de
pentoxifilina ininterruptamente durante 15 dias – 10 animais
d) Grupo EAE e Tratados via subcutânea com 30 mg/Kg de talidomida
ininterruptamente durante 15 dias – 10 animais
39
4.4- INDUÇÃO DA EAE (adaptado de COLIGAN et al., 1996;
CARVALHO, 1999)
As medulas espinhais de cobaia (GPSC) e a cepa de Mycobacterium
tuberculosis (ATCC H37 RA, Difco, Detroit, Ml) utilizadas para indução da EAE
foram gentilmente cedidas pela Dra. Thereza Fonseca Quírico do Santos da
UFF.
Para preparar a emulsão antigênica completa (GPSC-CFA) foram feitas
homogeneizações de uma parte de macerado de GPSC em duas partes de
Adjuvante Incompleto de Freund (IFA) acrescido de 4 mg de Mycobacterium
tuberculosis (MBT H37 RA, Difco, Detroit, Ml) por mililitro de adjuvante,
formando assim o Adjuvante Completo de Freund (CFA).
Inoculo completo – GPSC-CFA
GPSC
+
IFA
+
MTB H37 RA
750l 1500L 6 mg
A emulsão foi preparada (Fig. 1) à temperatura ambiente, através da
aspiração e ejeção continuada dos componentes por aproximadamente 20
minutos. Foram utilizados frascos e seringas plásticas estéreis e agulhas 25 x
12 mm. A emulsão foi considerada pronta quando ao se pingar uma gota sobre
a água esta se mantinha íntegra. A emulsão foi preparada imediatamente antes
do uso (Carvalho, 1999).
40
Os animais foram inoculados 100 L de emulsão antigênica, sendo
injetadas no coxim plantar da pata traseira e feita à marcação auricular dos
grupos (Fig. 2). Os animais foram observados diariamente quanto ao
aparecimento dos sinais clínicos (Quadro I) sendo sacrificados 15 dias após a
inoculação.
FIGURA 1. Carvalho, 1999. (A) Aspiração e ejeção dos componentes da emulsão em frasco e seringa estéril durante cerca de 15 minutos. A emulsão vai tornando-se grossa e homogênea. (B) Para verificar se a emulsão está pronta, pinga-se uma gota em frasco com água gelada, devendo a gota permanecer íntegra.
FIGURA 2. Adaptada de Carvalho, 1999. (A) Inoculação de 100 L no coxim plantar da pata traseira do rato Lewis. (B) Código de marcação auricular utilizado que permite marcar até 100 animais.
41
Figura 3: Coxim plantar de rato Lewis inoculado com GPSC-CFA
4.5- TRATAMENTO APÓS A INDUÇÃO DE EAE
Após a indução da EAE os animais foram tratados durante 15 dias
ininterruptos com pentoxifilina ou com talidomida sobre condições assépticas.
Os ratos receberam injeções subcutâneas com 30 mg/Kg de talidomida
(Grunenthal GMBH, Stolberg, Alemanha). A talidomida foi dissolvida em dimetil
sulfoxido (DMSO) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) e salina estéril e a
concentração final de DMSO foi de 2% (AARESTRUP et al., 1995) e a
concentração final de talidomida ficou em 90 mg/mL.
A pentoxifilina (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) foi dissolvida em
salina estéril para uma concentração de 150mg/mL. Cada rato recebeu a dose
42
de 100 mg/Kg (CHING et al., 1998) intraperitoneal de forma ininterrupta durante
os 15 dias da EAE.
4.6- AVALIAÇÃO DOS SINAIS CLÍNICOS
Depois da inoculação os animais foram observados diariamente por
duas horas por um período de 15 dias ininterruptos e os sinais clínicos foram
registrados de acordo com LEADBETTER (1998) e MOHAMED et al (2004).
(Quadro 1)
ESCORE
SINAIS CLÍNICOS
0 SADIO
1 PERDA DE TÔNUS DA CAUDA
2 PARALISIA PARCIAL MEMBROS POSTERIORES
3 PARALISIA SEVERA MEMBROS POSTERIORES
4 TETRAPLEGIA
5 MORTE
Quadro I: Escore clínico dos ratos Lewis com EAE.
4.7 - OBTENÇÃO DE PLASMA E DE TECIDO NERVOSO
Após anestesia com xilasina (20mg/Kg) e quetamina (50 mg/kg)
(TERUYA et al., 2008) os animais foram sangrados pelo plexo oftálmico com
auxílio de pipeta Pasteur heparinizada o plasma isolado foi aliquotado em
43
microtubos tipo “eppendorf” e imediatamente armazenados em “freezer” a –
70ºC para posterior análise das moléculas imunomoduladoras.
Os animais foram então sacrificados com KCl (MORESCHI JUNIOR et
al., 1999) para retirada do encéfalo e da medula por dissecção e os materiais
do SNC foram mantidos imersos em soluções fixadoras de formol tamponado a
10% (4g de fosfato de sódio monobásico, 6,5 g de fosfato de sódio dibásico,
100mL de formol P.A e 900 mL de água destilada).
Após dissecção os fragmentos foram desidratados em concentrações
crescentes de etanol (70%, 90% e 100%) em banhos de 1 hora cada, sendo
feitos 3 banhos em álcool absoluto. Posteriormente, foram clarificados em 3
banhos em xilol de 1 hora cada e finalmente feita à impregnação em parafina
em estufa a 58°C e a inclusão na parafina a temperatura ambiente. Os blocos
foram então cortados em micrótono modelo ”820” Spencer com espessura de 6
m para colorações de hematoxilina – eosina e Hematoxilina Férrica de
Weigert – Pal – Russel.
4.8- COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS
Os cortes foram desparafinados em três trocas de xilol (dois minutos
cada) e hidratados em soluções de etanol com concentrações decrescentes
com duas trocas a 100%, uma a 90% e uma a 70% (dois minutos em cada
troca) e lavados em água destilada.
44
4.8.1- Hematoxilina e Eosina (Luna, 1968; Carvalho, 1999)
Coloração de rotina tanto para tecidos normais quando para tecidos
patológicos. Os núcleos coram-se em azul escuro (basofílicos) e o citoplasma
em róseo (eosinofílicos).
Após a hidratação dos tecidos, estes foram corados durante 15 minutos
pela Hematoxilina de Harris: 5 g de hematoxilina dissolvidos em 50 mL de
álcool absoluto e 100 g de alúmen de amônio ou potássio em 1000 mL de água
destilada aquecida misturaram-se as duas soluções, deixou ferver, em seguida
foi adicionado 2,5 g de óxido de mercúrio, reaquecido até tornar-se púrpuro
escuro; foi retirada do aquecimento e esfriada rapidamente. Foram adicionados
2 a 4 mL de ácido acético glacial por 100 mL de solução, filtrado antes do uso e
o material foi lavados e azulados em água corrente por 5 minutos e água
amoniacal (200mL de água destilada com 3 gotas de hidróxido de amônio),
corados pela solução de eosina aquosa 1% durante 2 minutos e diferenciados
em etanol a 70%.
4.8.2- Hematoxilina Férrica de Weigert – Pal – Russel (Behmer,
2003)
Técnica utilizada para visualização geral do tecido nervoso e
principalmente da bainha de mielina. Nesta coloração a bainha é corada em
azul-negro, as células nervosas em variações de amarelo-palha a cinzento, os
nucléolos e os eritrócitos em negro e o fundo incolor.
45
Após desparafinar as lâminas, estas foram lavadas em água corrente
por 3 minutos e tratadas em solução aquosa de sulfato férrico amoniacal a 4%
por 3 minutos. Após isto foram lavadas rapidamente em água corrente. Em
seguida, foi corada pela hematoxilina férrica de Weigert – Pal – Russel
(Hematoxilina a 10% em álcool absoluto 20 mL, carbonato de lítio 1g em 80 mL
de água corrente) por 15 minutos e lavada por várias passagens em água
corrente, secada e montada.
4.9- PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (Ding et al, 1988)
100 L de plasma de cada animal foi colocado nos poços de
microplacas de ELISA com fundo chato tipo Corning. O plasma foi incubado por
5 minutos à temperatura ambiente com 100l do Reativo de Griess (Ding et al,
1988). Este reativo foi obtido misturando-se a solução A (50ml de sulfanilamida
1%) com a solução B (50ml de 0,1% dihidro-cloreto de naftiletilenodiamina
diluído em 2,5% de H3PO4- Sigma Co., St. Louis), volume a volume. A
absorbância foi medida, utilizando-se um filtro de 540 nm em um leitor
automático de ELISA (SPECTRAMAX 250, Molecular Devices) e a produção de
NO foi quantificada através de comparação com uma curva padrão de Nitrito
em concentrações variando de 3,12 a 100M, sendo os resultados expressos
em moles/mL.
46
4.10- DOSAGEM DE IFN- E TNF- POR ELISA
Placas de ELISA foram sensibilizadas com um primeiro anticorpo (2
g/ml de anticorpo anti-TNF- Rat 900-K73 e 1 g/ml de anticorpo anti-IFN-
Rat 900-K109) (PeProtech Inc, New Jersey), diluídos em PBS, incubadas
durante 16 horas a 4ºC e bloqueadas com PBS- Tween 20 (PBST) + 10% SFB,
por 2 horas. Após este período, as placas foram lavadas quatro vezes em PBS-
T e, em seguida, adicionados o padrões de TNF- e IFN- recombinante de
rato (PeProtech Inc, New Jersey) e as amostras dos animais utilizados no
modelo experimental. As placas foram então incubadas por mais 2 horas à
temperatura ambiente. Terminada a incubação as placas foram lavadas quatro
vezes em PBS-T e o segundo anticorpo biotinilados (anti-TNF- 1 g/mL e anti-
IFN- 0,5 g/mL PeProtech Inc, New Jersey) foram adicionados e incubados
por mais 1 hora à temperatura ambiente. A seguir mais quatro lavagens com
PBS-T foram feitas e adicionado o conjugado enzimático constituído do
complexo streptoavidina-peroxidase, na diluição de 1/400 (SIGMA - Co, St.
Louis), seguido de incubação por mais 1 hora. Após este período, a reação foi
revelada pela adição do substrato contendo Tampão Citrato (pH 5,5),
cromógeno OPD (1mg/mL) e água oxigenada 30% (1g/mL). A reação foi
bloqueada com ácido sulfúrico 4N e a leitura feita em leitor de ELISA
(SPECTRAMAX 250, Molecular Devices) a 440 nm. As amostras foram
quantificadas por comparação com as curvas padrões de TNF- e IFN
recombinantes (1 pg - 10 ng). (Fig. 4)
47
Figura 4 – Esquema Elisa direto para pesquisa de antígenos (TNF- e IFN-).
4.13- ANÁLISE ESTATÍSTICA
Dados são expressos em média e + desvio padrão e analise estatística
realizada pelo programa Graphpad Instat e o teste de Dunn’s com Kruskal –
Wallis utilizado, sendo considerado P<0,05 para indicar uma estatística
significantemente diferente.
5.0- RESULTADOS
5.1- Curso clínico da EAE
Os 40 ratos utilizados foram acompanhados clinicamente durante todo o
experimento. Os grupos se comportaram de maneira diferente durante a
realização do experimento. Para o grupo controle foram utilizados dez ratos e
em nenhum momento foi observado qualquer sinal clínico neurológico da EAE,
tais como perda do tônus da calda (escore 1), paralisia parcial dos membros
posteriores (escore 2), paralisia severa dos membros posteriores (escore 3),
tetraplegia e animais moribundos (escore 4) ou morte dos animais (escore 5).
Os ratos Lewis inoculados com GPSC – CFA começaram a apresentar
os sintomas da EAE em torno do sexto dia após a inoculação. Neste estágio
dois animais apresentavam flacidez e atonia caudal (escore 1). No oitavo dia
após a indução todos os animais já apresentavam queda da cauda (escore 1),
porém a maioria dos animais ainda apresentavam os movimentos dos
membros anteriores e posteriores preservados exceto um animal com paralisia
parcial dos membros posteriores (escore 2). Em torno do 10° dia pós
49
inoculação os animais apresentavam-se agitados e com certa dificuldade de
movimentar-se. Neste dia sete animais apresentavam paralisia parcial de
membros posteriores (escore 2) e dois animais já apresentavam paralisia
severa de membros posteriores (escore 3). Do 13° ao 14° dia de experimento
os animais continuavam todos com sintomas da EAE, sendo que, sete animais
apresentavam paralisia severa dos membros posteriores (escore 3), dois
animais apresentavam tetraplegia e estado moribundo (escore 4) e um animal
paralisia parcial dos membros posteriores (escore 2). (gráfico 1). A tabela 1
representa o escore clínico da EAE dia no sacrifício dos animais, ou seja, no
15°dia pós-indução da EAE.
Resultado diferente foi observado nos ratos Lewis inoculados com
GPSC – CFA e tratados durante os 15 dias intraperitonealmente com 100
mg/Kg de pentoxifilina. Nestes animais somente um animal apresentou perda
de tônus da calda (escore 1) no 6° dia e seis animais no 8° dia. No 10° dia pós-
inoculação oito animais apresentavam os sintomas da EAE, estando bastante
agitados na gaiola. Desses oito animais (seis) apresentavam paralisia parcial
de membros posteriores (escore 2) e dois ainda apresentavam perda de tônus
da calda (escore 1). No 14° dia pós-inoculação somente seis animais
apresentaram os sintomas neurológicos da EAE. Sendo que três animais
evoluíram para paralisia severa dos membros posteriores (escore 3), um
apresentava tetraplegia e estado moribundo, um apresentava paralisia parcial
dos membros posteriores e um apenas queda de tônus da cauda (escore 1),
dois animais que apresentavam sintomas da EAE no 10° dia não os
apresentavam no 14°/15°dia (tabela 1 e gráfico 1).
50
Os animais inoculados com GPSC – CFA e tratados durante os 15 dias
por via subcutânea com 30 mg/Kg de talidomida apresentaram resultado
completamente diferente dos demais grupos. Apenas um animal (A)
apresentou sintomas neurológicos da EAE. Sintoma este que se iniciou em
torno do 7° dia com perda de tônus da cauda (escore 1), passou a apresentar
paralisia parcial dos membros posteriores (escore 2) no 10° dia pós-inoculação
e finalmente paralisia severa dos membros posteriores no dia do sacrifício (15°
dia pós-inoculação) (tabela 1).
Os gráfico 1 mostra a evolução do escore clínico dos animais com EAE
e dos animais com EAE e tratados com pentoxifilina ou com Talidomida
durante os 15 dias de evolução da fase aguda doença.
Gráfico 1: Cinética da avaliação do efeito da pentoxifilina e da talidomida no escore clínico da EAE. Os resultados estão expressos em média e desvio padrão por grupo. . ***p<0,001 entre grupo EAE e grupo EAE + talidomida.
***
***
51
A tabela 1 mostra o escore clínico apresentado pelos dez animais de
Cada grupo no dia do sacrifício (15° dia pós-inoculação) e a média do escore
apresentada pelos animais dos grupos EAE, sem e com tratamento. O gráfico 2
mostra o escore clínico médio apresentado na tabela 1 e através dele podemos
avaliar que o grupo doente (EAE) apresentou no 15° dia um escore clínico
significantemente maior do que o grupo tratado com talidomida (p<0,001). Não
foi observada nenhuma diferença estatisticamente significante entre os animais
doentes (EAE) e os animais doentes e tratados intraperitonealmente com a
pentoxifilina. Podemos observar também que entre os grupos tratados com
pentoxifilina e tratados com talidomida o escore clínico não foram significantes
quando comparados entre si (p<0,01).
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
MÉDIA
15°dia
I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
II 3 3 3 3 4 3 4 3 3 2 3,1
III 3 3 3 4 2 1 0 0 0 0 1,4
IV 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,3
Tabela 1: Efeito da pentoxifilina e da talidomida no escore clínico por animal (n=10). I = Controle; II = EAE; III = EAE + pentoxifilina e IV = EAE + talidomida, Letras = animais e números na tabela = escore clínico.
52
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Controle
EAE
Animais
EAE + Pentoxifilina EAE + Talidomida
Gráfico 2: Efeito da pentoxifilina e da talidomida no escore clínico da EAE no 15° dia
pós-indução. ***p<0,0001 entre o Grupo EAE e o Grupo Controle e **p<0,001 entre
grupo EAE e grupo EAE + talidomida.
*** **
**
***
E s
c o
r e
c lí
n ic
o
53
5.2- Efeito da pentoxifilina e da talidomida nos níveis plasmáticos de
NO, TNF- e IFN- no 15°dia pós-indução.
No 15° dia do experimento, após a indução da EAE com macerado de
medula espinhal de cobaias (GPSC-CFA) como descrito em material e
métodos, os animais foram sacrificados e a amostra do plasma de cada animal
foi obtida nos 4 grupos (controle, EAE, EAE + pentoxifilina e EAE + talidomida)
para a quantificação da produção de NO, IFN-. e TNF-.
A produção do NO (gráfico 3) mostra que os animais controle
praticamente não apresentaram níveis detectáveis de NO, mantendo um valor
basal muito baixo (< 2 Mol/mL) quando comparado aos animais com EAE (±
33 Mol/mL) (p<0,0001).
Os animais com EAE apresentaram uma produção significativamente
maior de NO que o grupo tratado com talidomida (p<0,05). Vale ressaltar, que
não houve diferença significativa entre o grupo EAE e o grupo que recebeu
tratamento com a pentoxifilina.
Analisando os resultados referentes à produção de IFN-, (Gráfico 4),
observamos que os animais doentes apresentavam uma alta produção de IFN-
, sendo significativamente maior que os valores encontrados no grupo controle
(p<0,0001). Nos animais doentes, a produção de IFN- manteve o mesmo perfil
daquela observada para NO. Ratos doentes e tratados com a talidomida a
54
produção foi menor (p < 0,05) quando comparada ao grupo de animais apenas
com EAE, novamente não sendo observado nenhum efeito estatisticamente
significante no grupo tratado com a pentoxifilina frente ao grupo EAE.
Observando finalmente os resultados referentes à produção de TNF-,
(gráfico 5), verifica-se que os animais com EAE apresentaram uma alta
produção de TNF-, em relação ao grupo controle (p<0,0001). Nos animais
doentes a produção de TNF- manteve o mesmo perfil daquela observada para
NO e o IFN-. Nos ratos doentes e tratados com a pentoxifilina embora tenham
apresentado redução nos níveis desta citocina esta não foram estatisticamente
significantes (p>0,05) frente ao grupo EAE. O grupo tratado com a talidomida, a
produção foi significantemente menor (p<0,01) que no grupo com EAE.
55
Gráfico 3: Efeito do tratamento com pentoxifilina e talidomida na produção de NO. Grupo controle (n=10); grupo EAE (n=10); grupo EAE + pentoxifilina (n=10) e grupo EAE + talidomida (n=10). Os dados estão apresentados em media +\- SD. ***P<0,0001 Grupo EAE comparado ao grupo controle, ** P < 0,05 Grupo EAE comparado ao grupo EAE + Talidomida.
56
Gráfico 4: Efeito do tratamento com pentoxifilina e talidomida na produção de IFN-
. Grupo controle (n=10); grupo EAE (n=10); grupo EAE + pentoxifilina (n=10) e grupo EAE + talidomida (n=10). A produção foi medida com filtro de 440nm através do método de ELISA. Os dados estão apresentados em media +\- SD. ***P<0,0001 Grupo EAE comparado ao grupo controle, ** P < 0,05 Grupo EAE comparado ao grupo EAE + Talidomida.
57
Gráfico 5: Efeito do tratamento com pentoxifilina ou talidomida na produção
de TNF-. Grupo controle (n=10); grupo EAE (n=10); grupo EAE + pentoxifilina (n=10) e grupo EAE + talidomida (n=10). A produção foi medida com filtro de 440nm através do método de ELISA. Os dados estão apresentados em media +\- SD. ***P<0,001 Grupo EAE comparado ao grupo controle, **p<0,01 comparando grupo EAE ao grupo EAE + Talidomida.
58
5.3- Análise histopatológicas do SNC de ratos com EAE tratados com
pentoxifilina ou talidomida.
Foram analisadas amostras de tecido de medula espinhal, cérebro e
cerebelo, de todos os animais do experimento, observando-se as
características corticais particulares de cada órgão, bem como as
características da substância branca. Morfologia neuronal, presença e estrutura
de fibras, celularidade do neurópilo, bem como intensidade, localização e
composição de infiltrados inflamatórios foram os aspectos observados na
avaliação. A análise histológica das amostras da substância branca de todos os
órgãos do grupo controle, coradas por hematoxilina e eosina (HE) revelou
características compatíveis com as descritas na literatura (CARVALHO, 1999;
FABIS, et al., 2007).
A avaliação da substância branca da medula espinhal do grupo controle,
coradas por HE revelou neurópilo típico, com grande emaranhado de
prolongamentos celulares gliais e provenientes de corpos de neurônios das
áreas corticais. Em meio ao neurópilo, núcleos das células da neuroglia, com
morfologia sugestiva de astrócitos, oligodendrócitos, intensamente basofílico e
com halo perinuclear resultante de vacuolização citoplasmática típica do
processamento histológico, conferindo a estas células aparência semelhante a
“ovo frito”. Não foram constantemente identificadas na extensão dos cortes
células com morfologia sugestiva de micróglia, normalmente menos numerosas
no parênquima cerebral normal no animal controle (Figura 5. A).
59
As amostras do grupo EAE, coradas por HE, apresentaram em diversas
áreas corticais e da substância branca, intenso infiltrado inflamatório
perivascular, composto predominantemente por células mononucleares, com
núcleos redondos intensamente basofílicos e citoplasma escasso. Associadas
ao infiltrado, acúmulos de células com núcleo achatado fusiforme bem corado,
associado à microgliose (setas). O neurópilo, especialmente na substância
branca medular, apresentou esparsamento entre os prolongamentos e maior
celularidade glial quando comparado ao grupo controle (Figura 5. B).
No grupo EAE tratado com pentoxifilina, foram observados numerosos
capilares circundados por infiltrado inflamatório mononuclear, em menor
intensidade em relação ao grupo EAE, bem como neurópilo com esparsamento
entre os prolongamentos e discreta celularidade glial associadas às células
com morfologia sugestiva de micróglia e astrócitos. (Figura 5. C).
Em ambos os grupos – EAE e EAE e pentoxifilina, as características
histológicas referentes à reação inflamatória observadas no cérebro e no
cerebelo foram correlatas com os achados medulares, sendo que em todas as
áreas o infiltrado focal se localizava perivascular e mais intenso na substância
branca.
A avaliação das amostras provenientes do grupo tratado com a
talidomida apresentou ora áreas de reação inflamatória focal escassa, com
discreto infiltrado tecidual composto por células mononucleares, ora ausência
de reação inflamatória. Em diversas áreas foram observadas fibras mielínicas
60
pouco numerosas, porém bem estruturadas, envolvidas por neurópilo
eosinofílico. (Figura 5. D).
A avaliação da substância branca do cérebro e cerebelo do grupo
controle, coradas por HE revelou muitas fibras mielínicas, bem organizadas,
em orientações transversal e longitudinal, em toda a extensão das amostras.
Nos cortes transversais observa-se mais facilmente axônio central envolvido
por estrutura mielinizada delicada discretamente corada pela eosina. (Figura 6
A e 7. A).
A observação das amostras da substância branca do cérebro, do
cerebelo do grupo EAE e do grupo EAE + pentoxifilina, coradas por HE,
apresentou (Figuras 6 B, C e 7 B, C) em comparação com o grupo controle,
menor quantidade de fibras mielinizadas no estroma. De modo interessante,
observamos que nas regiões menos vascularizadas, principalmente em cérebro
e cerebelo, que não se encontravam adjacentes ao infiltrado inflamatório, o
neurópilo se apresentou mais denso e mais celular, com núcleos sugestivos de
micróglias, astrócitos e oligodendrócitos.
Para avaliação da bainha de mielina a coloração de hematoxilina férrica
Weigert – Pal - Russell mostrou, nas amostras do grupo controle, muitos
envoltórios em cor azul-negro bem estruturados, por toda a extensão dos
cortes nas áreas de substância branca. Tais estruturas se tornaram facilmente
visíveis devido ao contraste com o neurópilo, incolor, ao fundo (Figura 8. A). No
grupo EAE, as bainhas mielínicas se apresentaram delicadas e irregulares, e,
61
em diversas regiões nos campos focalizados, ausentes (Figura 8B). De
maneira distinta, as amostras do grupo EAE + pentoxifilina apresentaram
coloração azul-negra um pouco mais intensa em conseqüência da quantidade
discretamente maior de estruturas mielínicas, porém as mesmas se mostraram
desorganizadas e irregulares (Figura 8C). No grupo talidomida foram
observadas grande densidade de bainhas de mielina em orientação longitudinal
e transversal, fortemente coradas em azul (Figura 8D).
62
Figura 5: A: Corte histológico de medula espinhal do grupo controle. Vaso sanguíneo em corte longitudinal, sustentado por neurópilo típico, células gliais com morfologia sugestiva de astrócitos (seta) e de oligodendrócitos. Coloração HE. Aumento original 400X. Em detalhe: a: célula com morfologia sugestiva de oligodendrócito; b: fibra mielínica em corte transversal.Coloração HE. Aumento original 1000X. B: Corte histológico de medula espinhal do grupo EAE. Vaso sanguíneo em corte transversal (asterisco azul), intenso infiltrado inflamatório perivascular composto predominantemente por células mononucleares, microgliose (setas) e celularidade glial. Coloração HE. Aumento original 400X.C: Corte histológico de medula espinhal do grupo pentox\EAE. Diversos capilares sanguíneos (asteriscos azuis) circundados por infiltrado inflamatório mononuclear. Discreta celularidade glial associada a células com morfologia sugestiva de micróglia (setas).Coloração HE. Aumento original 400X. D: Corte histológico de medula espinhal do grupo talidomida. Trajeto vascular parcial (asteriscos azuis) com escassas células mononucleares em rolamento através do endotélio vascular (seta azul) e fibras mielínicas em orientação transversal (cabeças de setas). O espaço perivascular observado provavelmente se associa á contração do tecido com expansão dos pés vasculares dos astrócitos durante o processamento – ambos artefatos comuns nas preparações de rotina. Coloração HE. Aumento original 400X.
A B
C D
63
Figura 6: A: Corte histológico da substância branca do cérebro do grupo controle. Inúmeras fibras mielínicas em corte transversal (setas envolvidas por estroma típico. Coloração HE. Aumento original 400X. B: Corte histológico da substância branca do cérebro do grupo EAE. Fibras mielínicas em orientação transversal (seta) e longitudinal, celularidade glial e neurópilo. Coloração HE. Aumento original 400X. C: Corte histológico da substância branca do cérebro do grupo pentox\EAE. Escassez de estruturas mielinizadas. Fibra irregular em corte longitudinal ao centro do campo e fibra mielínica em corte transversal (seta). Coloração HE. Aumento original 400X. D: Corte histológico da substância branca do cérebro do grupo talidomida. Fibras mielínicas em corte transversal (setas), celularidade glial com morfologia sugestiva de astrócitos (setas azuis). Coloração HE. Aumento original 400X.
A B
C D
64
Figura 7: A: Corte histológico da substância branca do cerebelo do grupo controle. Oligodendróglia disposta tipicamente entre fascículos de axônios mielinizados (setas). Coloração HE. Aumento original 400X. B: Corte histológico da substância branca do cerebelo do grupo EAE. Escassas fibras mielínicas em orientação transversal e longitudinal que se confundem com os prolongamentos celulares delicados do neurópilo. Intensa celularidade glial. Coloração HE. Aumento original 400X. C: Corte histológico da substância branca do cerebelo do grupo pentox\EAE. Ausência de estruturas mielinizadas típicas e numerosas células com morfologia sugestiva de astrócitos (setas) e oligodendrócitos (cabeças de seta). Coloração HE. Aumento original 400X. D: Corte histológico da substância branca do cerebelo do grupo talidomida. Fibras mielínicas bem definidas morfologicamente em corte longitudinal e oligodendróglia associada (setas), celularidade glial com morfologia sugestiva de micróglia (setas azuis). Coloração HE. Aumento original 400X.
A B
C D
65
Figura 8: Marcação histoquímica para bainha de mielina. A: Corte histológico da substância branca da medula espinhal do grupo controle apresentando bainhas de mielina dispostas na orientação longitudinal em sua maioria em cor azul-negro contrastando com o neurópilo incolor ao fundo. Em detalhe: nódulos de Ranvier (setas azuis). Aumento 1000X. Coloração Hematoxilina férrica - Weigert. Aumento original 400X. B: Corte histológico da substância branca da medula espinhal do grupo EAE apresentando bainhas mielínicas delicadas e irregulares evidenciadas pela coloração azul-negra. Coloração Hematoxilina férrica - Weigert. Aumento original 400X. C: Corte histológico da substância branca da medula espinhal do grupo pentox\EAE apresentando coloração azul pouco intensa em conseqüência da escassez de estruturas mielínicas. Coloração Hematoxilina férrica - Weigert. Aumento original 400X. D: Corte histológico da substância branca da medula espinhal do grupo talidomida apresentando numerosas bainhas de mielina em orientação longitudinal coradas em azul-negro. Coloração Hematoxilina férrica - Weigert. Aumento original 400X.
A B
C D
6.0- DISCUSSÃO
A EAE representa um modelo clínico experimental para a esclerose
múltipla, doença desmielinizante e crônica do SNC dos homens, esta afeta
principalmente adultos jovens do sexo feminino, caracterizando-se por
períodos de recaída e remissão clínica que provocam incapacitações
temporárias ou mesmo permanentes (PANITCH, 1996; MOREIRA, et al.,
2000; CATELAN, 2004; PUGLIATI et al., 2006). Repetições dos surtos são
características marcantes desta doença. O termo esclerose múltipla é
decorrente das múltiplas áreas de cicatrização (esclerose) que representam
muitos focos de desmielinização no sistema nervoso central. Como a
doença, freqüentemente, piora lentamente no decorrer do tempo, os
indivíduos afetados apresentam períodos de saúde relativamente normal
(remissões) alternados com períodos de exacerbações (CATELAN, 2004).
Estudos de ressonância magnética nuclear mostraram que áreas novas e
recorrentes de inflamações e desmielinizações continuam a ocorrer mesmo
durante os períodos de remissões clínicas, indicando uma atividade contínua
da doença (PANITCH, 1996). Os estudos nas áreas de imunologia e
patologia de pacientes com EM, sustentam a hipótese de que um evento
67
central no início das lesões da EM trata-se de um processo orquestrado por
linfócitos T CD4+ auto-reativos. Uma vez que estes penetram no parênquima
cerebral atravessando a barreira hematoencefálica e após o contato com os
antígenos, desencadeiam uma cascata de eventos que culminará com a
formação de placas desmielinizantes agudas (FROHMAN et al., 2006).
A EAE nos ratos Lewis, apesar de apresentar poucas
desmielinizações e ser uma doença monofásica aguda, é um importante
modelo da EM (OWENS & SRIRAM, 1995). Nesta doença autoimune do
sistema nervoso central células T apresentam severa reatividade contra
proteínas da bainha de mielina, incluindo a proteína básica de mielina (MBP),
proteína proteolipídica (PLP) e glicoproteína oligodendrócito da mielina
(MOG) (LEADBETTER et al., 1998). A EM apresenta lesões
desmielinizantes principalmente provocadas por linfócitos Th1, com altos
níveis de IFN- e potente ativação de macrófagos (YANYING, et al., 2007).
Em nosso experimento a EAE foi induzida em ratos Lewis e separados em
tratamentos com pentoxifilina ou talidomida.
Os sinais clínicos desenvolvidos pelos animais com EAE durante os
experimentos mostraram um curso semelhante ao descrito na literatura:
perda de tonicidade da cauda, paralisia da cauda, perda de movimentos
parciais de membros posteriores, paralisia total dos membros posteriores e
até tetraplegia e estado moribundo (MOHAMED et al., 2004). Os animais não
apresentaram, pelo menos até o 15° dia, nenhum óbito, como é descrito por
68
alguns autores na indução da EAE (LEADBETTER, 1998). Em nosso
trabalho, os animais do grupo EAE iniciaram os sintomas em torno do sexto
e sétimos dias, semelhante ao mostrado na literatura (YANYING, 2007).
Apresentando queda de tônus da cauda e uma evolução progressiva dos
sintomas evoluindo na sua maioria para paralisia severa dos movimentos dos
membros posteriores (sete animais) a até tetraplegia e estado moribundo
(dois animais) em torno do 15° dia. Salientando ainda que todos os animais
(n=10) apresentaram sintomas da EAE. Na fase final do curso clínico (15°
dia) os animais apresentaram um escore clínico médio (3,1) compatível com
paralisia severa dos membros posteriores.
Devido a EM ainda não apresentar possibilidade de cura, vários
trabalhos vêm tentando novas alternativas terapêuticas para a EM usando a
EAE como modelo. Estudos com sinonemina, um alcalóide com efeito anti-
reumático, foi testado em ratos Lewis tratados com 200 mg/Kg via i.p.
durante cinco dias, este adiou o início dos sintomas que surgiram mais
tardiamente (próximo ao 9° dia) e apresentando ainda sintomas menos
intensos que o grupo controle doente (YANYING, 2007).
Em nosso trabalho também testamos o feito da pentoxifilina e da
talidomida no curso clínico da EAE. Animais que sofreram a indução da EAE
e foram tratados ininterruptamente com pentoxifilina (100 mg/Kg i.p) não
tiveram uma redução significativa dos sintomas quando comparados aos
animais com EAE (p>0,05) no 15° dia. Nesta fase, onde os sintomas são
mais intensos, mesmo quatro animais não apresentando sequer os sintomas
69
clínicos da EAE e o escore clínico médio do grupo ficando em 1,6 esta
diferença não foi estatisticamente significante ao grupo doente (escore médio
3,1). Nossos dados corroboram com os estudos de POLLAK e colaboradores
(2003), estes observaram que tratamento de camundongos SJL com 100
mg/Kg de pentoxifilina também não levou a redução dos sintomas clínicos da
EAE. Quando o tratamento foi realizado com 30 mg/Kg de talidomida
ininterruptamente via s.c. o resultado mostrou-se muito interessante, neste
grupo tivemos apenas um animal apresentou sintomas neurológicos da EAE,
mostrando uma forte ação desta droga na prevenção dos sintomas
desenvolvidos no curso clínico da EAE.
Na EAE é sabido que durante o curso da doença, os animais
apresentam uma forte resposta específica Th1 contra componentes da
bainha de mielina (LASSMANN & WISNIEWSKI, 1979; LAFAILLE et al.,
1997; YANYING, 2007). Os animais doentes apresentam níveis elevados de
IFN- em
valores elevados promove a ativação dos macrófagos no SNC que quando
ativados passam a produzir grandes quantidades de NO (MACMICKING et
al., 1992; ZHAO et al., 1996; BRENNER et al., 1997; CROSS et al., 1997;
OKUDA et al., 1997; TRAN et al., 1997; SEUNGJOON et al., 2000) e de
TNF- (ISSAZADEH et al., 1995; FURLAN, et al., 2004; YANYING, 2007).
Segundo FURLAN et al. (2004) ratos Lewis tratados com IL-12 recombinante
produziram níveis elevados de IFN-, óxido nítrico e TNF- exacerbando a
EAE, mostrando que estes fatores exercem um papel central na patogênese
da doença.
70
A importância, da resposta Th1 fica demonstrada quando a tentativa
de tratar pacientes de EM com IFN- mostrou-se não só ineficaz, mas
também levou à piora drástica dos pacientes, pois, o IFN- a
expressão de moléculas de MHC de classe ll e, portanto, aumenta a
apresentação de antígenos. Além disso, conduz a diferenciação do tipo Th1,
perfil celular envolvido na patogênese tanto da EM quanto da EAE
(SHEVACH, 2000). Como foi relatado anteriormente, esta claro o papel dos
mediadores IFN-, óxido nítrico e TNF-. na evolução tanto da EM quanto na
EAE. Nosso trabalho avaliou, não só como estavam estes medidores em
ratos Lewis com a EAE, mas também o efeito da pentoxifilina e da talidomida
sobre a produção destes mediadores.
Nossos dados corroboram com os achados citados acima no que se
refere aos animais com a EAE. Nos experimentos realizados os ratos Lewis
apresentaram níveis significantemente elevados de IFN-, óxido nítrico e
TNF- quando comparados aos animais do grupo controle. Estes achados
foram encontrados no 15° dia após a indução, quando de acordo com o
discutido acima, os animais apresentaram os sintomas clínicos da doença
em sua fase mais grave.
Segundo FURLAN e colaboradores, (2004), produção elevada de IFN-
, óxido nítrico e TNF- estão relacionados com a exacerbação do quadro
clínico na EAE. Nossos experimentos procuraram também avaliar os efeitos
da pentoxifilina e da talidomida sobre produção de IFN-, NO e TNF-. Isto
71
devido ao fato de que, estes fatores, quando elevados relacionam-se com
agravamento da doença. Utilizamos estas drogas porque vários trabalhos
demonstram que pentoxifilina (CHING et al., 1998; RIENECK, 1993; VADIEI
et al., 1996) e a talidomida (SAMPAIO, et al., 1991; HASHIMOTO, 2002)
exercem efeito sobre estes mediadores levando a uma menor produção
destes.
Ao analisarmos o gráfico 3 observamos que os animais doentes
apresentaram elevados níveis de NO quando comparados ao grupo controle.
Analisando agora os animais doentes e tratados com a pentoxifilina ou com
a talidomida observamos que os grupos tiveram uma redução na produção
de NO. Porém esta redução foi somente significativa (p<0,05) quando
comparamos o grupo tratado com a talidomida e o grupo controle positivo
(EAE). Como relatado, mesmo o grupo tratado tendo com pentoxifilina tendo
uma redução nos níveis de NO frente aos animais EAE esta não foi
significante (p>0,05).
Quando observamos o resultado do IFN- mostrado no gráfico 4
vemos um perfil muito semelhante ao mostrado com o óxido nítrico, ou seja,
redução significante desta citocina no grupo tratado com a talidomida
(p<0,01) e novamente nenhum efeito significante da pentoxifilina sobre esta
citocina quando comparado ao grupo EAE. Como observado o grupo EAE
apresentou elevados níveis (p<0,001) de IFN- comparado ao grupo
controle.
72
Ao chegarmos ao resultado da produção de TNF- vimos novamente
que o grupo EAE apresentou elevados níveis desta citocina no 15° dia pós
indução. Foi observado novamente que os animais tratados com a talidomida
tiveram valores significantemente menores de TNF- do que o grupo com a
EAE. Os animais tratados com a pentoxifilina não apresentaram redução
significativa de TNF- em relação aos animais doentes (P.0,05). Estes
achados, vão de encontro aos escores clínicos apresentados pelos ratos,
onde, os animais doentes e tratados com pentoxifilina não tiverem uma
redução dos sintomas da EAE e menor produção de IFN-, óxido nítrico e
TNF- embora, esta não tenha sido esta não tenha sido estatisticamente
significativa. No grupo tratado com talidomida isto fica evidente, pois, os
animais praticamente não apresentaram sintomas neurológicos da EAE e foi
o grupo com menores produções de IFN-, óxido nítrico e TNF-˜.
Os resultados de nossos experimentos corroboram com vários
trabalhos que usaram sinonemina (YANYING, 2007), estatinas (WEBER, et
al., 2006) e copolimero (ILLES, et al., 2005). Nestes trabalhos foi
demonstrando que a redução.na produção de IFN-, levou a uma menor
expressão de moléculas de classe II do MHC e proliferação de linfócitos T,
conseqüente menor ativação de macrófagos e produção de NO e TNF-
melhorando o curso clínico da EAE. O trabalho de YANYING e
colaboradores (2007) realizaram o tratamento de ratos Lewis fêmeas com
sinonemina, como citado acima, em seus experimentos os sinais clínicos
neurológicos da EAE apareceram mais tardiamente e em menor intensidade,
73
embora ainda estivessem presentes em todos os animais. Foi observado
também no mesmo experimento que a sinonemina reduziu os níveis de TNF-
em 33,1% e o IFN- em 58,3%, mostrando novamente que a redução
destas citocinas leva a uma melhora do quadro clínico. Associado aos
elevados níveis de TNF- e IFN- foi observado por HE que nos animais
doentes apresentaram ruptura da integridade da barreira hematoencefálica e
infiltração de grande quantidade de células mononucleares para a medula
espinhal. Quando os animais foram tratados com a sinonemina o infiltrado
inflamatório foi menor. Nosso resultado foi comparativamente mais
expressivo do que o apresentado com a sinonemina. Pois, a pentoxifilina
reduziu os níveis de TNF- em 38% e o IFN- estatisticamente
significante) já a talidomida TNF- em 62% e o IFN- em 43%
(estatisticamente significante), mostrando novamente forte efeito inibitório da
talidomida sobre o TNF- e menor ativação dos macrófagos.
As pesquisas de FABIS e colaboradores (2007), também corroboram
com nossos dados. Em seus experimentos eles utilizaram camundongos
B6.129 com deleção de genes para TNF- (n=82) e em comparação com
animais controles (n=195) a EAE (induzida com a MOG) foram menos severa
nos animais KO. Pois, estes animais apresentaram redução dos sinais
clínicos, e menores infiltrados inflamatórios mononucleares tanto no cérebro
quanto na medula. A despeito destes infiltrados inflamatórios eles realizaram
RT PCR e de acordo com os marcadores presentes (CD4 e CD11b)
concluíram que as células predominantes neste infiltrado eram
respectivamente linfócitos T CD4 e macrófagos em grande quantidade nos
74
animais controle. Outro achado interessante destes pesquisadores foi que
nos animais KO para TNF- as áreas de desmielinização presentes foram
significantemente menores que os animais controle e o infiltrado inflamatório
próximo a estas áreas desmielinizadas eram também formados por linfócitos
T CD4 e macrófagos.
Existe uma relação estreita entre severidade da doença e ruptura de
integridade da barreira hematoencefálica levando a um aumento do infiltrado
mononuclear no SNC e edema associado (YANYING, et al., 2007, FABIS, et
al., 2007). Com a finalidade de investigar o desenvolvimento da reação
inflamatória e o processo de desmielinização do SNC foram feitas colorações
histológicas com HE e hematoxilina férrica de Weigert – Pal – Russell em
amostra de cérebro e medula espinhal.
Observando lâminas preparadas pela coloração com HE, foi
constatado que os animais doentes apresentavam grande infiltrado
inflamatório mononucleares no cérebro e principalmente na medula espinhal.
Estes dados corroboram com achados da literatura citados anteriormente
que apresentam um grande infiltrado inflamatório mononuclear (CARVALHO,
1999) nos ratos Lewis com EAE, infiltrado estes formado principalmente por
macrófagos e linfócitos T CD4 (KANEKO, et al., 2006; YANYING, et al.,
2007, FABIS, et al., 2007). Pudemos observar também na coloração com HE
a menor presença de infiltrado inflamatório nos animais controle negativo. O
fato que nos chamou bastante atenção é que nos animais tratados com
75
talidomida a presença do infiltrado inflamatório mononuclear na medula foi
muito menos intensa. No grupo tratado com pentoxifilina esta redução não foi
tão drástica, mais ainda sim esteve presente. Fica evidente então que o
tratamento com pentoxifilina e principalmente com a talidomida reduz o
infiltrado inflamatório mononuclear no cérebro e na medula de ratos Lewis
com EAE, lembrando que achados semelhantes foram observados no estudo
com sinonemina (YANYING, et al., 2007) e nos animais KO para TNF-
(FABIS, et al., 2007). Inclusive sendo observado que nos animais KO para
TNF- as áreas de desmielinizações próximas aos infiltrados foram
significantemente menores que nos animais controle que apresentavam
muitas áreas desmielinizadas, principalmente na medula espinhal (FABIS, et
al., 2007).
Desmielinizações estão presentes tanto no cérebro quanto na medula
espinhal de ratos Lewis com EAE (CARVALHO, et al., 1999), e estas áreas
desmielinizadas estão normalmente próximas à presença de infiltrados
inflamatórios (CARVALHO, 1999; KANEKO, et al., 2006; YANYING, et al.,
2007). Estas áreas de desmielinizações estão presentes não somente em
ratos Lewis (CARVALHO, 1999; YANYING, et al., 2007) como também em
outros animais como camundongos C57Bl/6 e SJL (KANEKO, et al., 2006).
Em nosso trabalho utilizamos coloração de hematoxilina férrica de
Weigert – Pal – Russell para analisar a integridade das fibras mielinicas.
Sendo evidenciada a presença de áreas de desmielinizações na substância
76
branca da medula espinhal dos animais com a EAE no 15º dia da doença.
Contrastando com a integridade das bainhas de mielina na medula espinhal
dos animais controle negativo. Também foi mostrada uma integridade
ligeiramente maior da bainha de mielina nos animais tratados com
pentoxifilina e integridade maior ainda nos animais tratados com a
talidomida. Isto mostra, um provável efeito protetor destas drogas,
principalmente, da talidomida influenciando os mecanismos de
desmielinizações. Um estudo realizado recentemente por KANEKO e
colaboradores (2006), camundongos C56Bl/6 tratados com nicotinamida
apresentaram também grande preservação da bainha de mielina. Neste
experimento, os animais tratados apresentaram também menor intensidade
nos sinais clínicos neurológicos da EAE.
Importância de resposta Th1, infiltrado inflamatório e desmielinizações
também foram evidenciados nos estudos de STUVE e colaboradores (2006).
Foram observados camundongos SJL/J com EAE induzida por MBP
apresentavam elevados níveis de IFN-, TNF-, grande infiltrado inflamatório
(HE) e áreas de desmielinização (Luxol faz blue) no cérebro e medula
espinhal. Quando realizaram tratamentos destes animais com acetato de
glatiramer (COPOLÍMERO) associado à atorvastatina reduziu os níveis de
IFN-, TNF- elevados níveis de IL-4 e IL-10 (resposta Th2), redução do
infiltrado inflamatório mononuclear e poucas áreas de desmielinizações na
medula espinhal.
77
Altas doses IFN- .e TNF- exercem um efeito deletério direto sobre os
oligodendrócitos de camundongos dificultando amplamente a remielinização
dos neurônios afetados na EAE (BALAVANOV, et al., 2006). Para confirmar
este efeito prejudicial sobre oligodendrócitos foram utilizados camundongos
C57BL/6 com EAE que após receberem IFN- apresentavam altos níveis de
TNF- e não apresentavam remielinização. Foi demonstrado também que
oligodendrócitos desses camundongos sofria apoptose quando estimulados
com IFN- in vitro. Entretanto, quando utilizaram camundongos PLP/SOCS1
transgênicos, resistentes a ação do IFN-., a remielinização esteve presente
após a fase aguda da EAE. Os trabalhos anteriores corroboram com nossos
achados, mostrando que inibindo a resposta Th1 os animais preservam mais
áreas mielinizadas.
Portanto, revendo nossos estudos, quando analisamos o perfil dos
mediadores inflamatórios (NO, IFN- e TNF-) constatamos que os animais
tratados com a talidomida apresentaram níveis menos elevados destes
mediadores quando comparados ao grupo doente (EAE). Ressaltamos que
os animais tratados com a pentoxifilina não apresentaram níveis
significantemente menores do NO, IFN- e TNF- no soro quando
comparados aos animais tratados com pentoxifilina. Portanto, os resultados
do presente experimento sugerem que a inibição do NO, IFN- e TNF- pela
talidomida pode explicar as diferenças entre o escore clínico, intensidade do
infiltrado inflamatório e incidência de desmielinização quando comparamos
os animais tratados com a talidomida frente ao grupo EAE.
78
Com relação à inibição do processo inflamatório o tratamento com a
talidomida apresentou um resultado extremamente significante comparado
ao grupo controle positivo para o desenvolvimento da EAE. Embora no grupo
tratado com a pentoxifilina também tenha ocorrido uma diminuição do
desenvolvimento do processo inflamatório, quando comparamos com o
grupo controle positivo EAE este achado não foi tão expressivo quanto ao
observado no grupo tratado com a talidomida. Adicionalmente, quando
analisamos a intensidade de desmielinização avaliada durante o estudo
histopatológico de rotina, como lâminas coradas pela HE ou pela coloração
histoquímica de Weigert – Pal – Russell, também foi observado que a
talidomida inibiu significativamente a desmielinização quando comparados
com o grupo EAE e também com o grupo tratado com a pentoxifilina.
Os dados do estudo histopatológico demonstram uma correlação
entre a intensidade de desenvolvimento do processo inflamatório e presença
de áreas de desmielinização. Os resultados de nosso estudo demonstram
que a pentoxifilina foi capaz de diminuir levemente a intensidade de infiltrado
inflamatório e também a presença de áreas de desmielinização. Entretanto,
ressaltamos que a talidomida foi significativamente mais eficaz que a
pentoxifilina quando analisamos capacidade de inibir processo inflamatório e
processo de desmielinização.
Analisados em conjunto os achados histopatológicos com o escore
clínico também trazem conclusões relevantes. Visto que, ocorreu uma
correlação entre escore clínico elevado, infiltrado inflamatório bem
79
desenvolvido no SNC e áreas de desmielinização. Em nosso experimento, o
fato de apenas um animal tratado com talidomida ter desenvolvido EAE
certamente está associado à capacidade da talidomida de inibir o infiltrado
inflamatório e a desmielinização.
Portanto, os resultados do presente experimento sugerem forte
evidência de efeito terapêutico da talidomida sobre a evolução clínica da
EAE. A correlação entre níveis menores de NO, IFN-, TNF-, poucas áreas
de infiltrado inflamatório mononuclear, processo de desmielinização menos
intensos e evolução clínica pouco expressiva da EAE nos animais tratados
suportam esta hipótese. Neste modelo observamos pentoxifilina na dose de
100 mg/Kg dia não foi estatisticamente eficaz na redução dos sintomas
clínicos neurológicos e nem na produção dos mediadores inflamatórios no
plasma dos ratos Lewis com a EAE.
Entretanto a talidomida mostrou-se uma droga promissora como
possível estratégia terapêutica nas doenças inflamatórias desmielinizantes
do SNC como a esclerose múltipla.
7- CONCLUSÕES
O presente estudo permitiu chegar a considerações sobre um efeito
modulador da pentoxifilina e da talidomida sobre o curso clínico da
Encefalomielite Autoimune Experimental.
7.1- Ratos Lewis com EAE apresentaram no 15° dia após a indução da
doença severos sintomas clínicos associados a elevados níveis séricos de NO,
IFN- e TNF-, vários focos de infiltrado inflamatório mononuclear no cérebro e
na medula espinhal e presença de áreas de desmielinização
7.2- Ratos Lewis tratados com pentoxifilina 100mg/Kg apresentaram
sintomas clínicos da EAE menores do que os animais doentes no 15° dia após
a indução, porém estes não foram estatisticamente significantes. Nestes
animais foram observados menores níveis dos mediadores NO, IFN-, TNF-
menor presença de infiltrado inflamatório no cérebro, cerebelo e na medula
espinhal e maior preservação das fibras mielínicas. Porém, esta redução não
foi estatisticamente significante.
81
7.3- Animais tratados com a talidomida praticamente não apresentaram
sintoma clínicos neurológicos da EAE, ficando restrito a apenas um animal.
Estes tiveram os menores níveis de NO, IFN-, TNF- praticamente não
apresentaram infiltrados mononucleares no SNC e tinham apenas escassas
áreas de desmielinizações em cérebro, cerebelo e medula espinhal.
7.4- Os dados deste estudo sugerem que a talidomida atua sobre o
mecanismo de desenvolvimento da EAE inibindo uma resposta imunológica do
tipo Th1.
7.5- A utilização desta droga (talidomida) pode ser uma importante
estratégia a ser empregada no esquema terapêutico utilizado no tratamento de
pacientes com Esclerose Múltipla e outras doenças que tenham
neuroinflamação presente.
8.0- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
AARESTRUP, F.M.; GONÇALVES-da-COSTA , S.C.; SARNO, E.N. The effect of thalidomide on BCG-induced granulomas in mice. Bras J Med Biol Res. 28: 1069 – 1076, 1995.
ALVORD, E.C.; Jr,; SHAW, C.M.; HRUBY, S. Approaches to the treatment of central nervous system autoimmune disease. Ann. Neurol. 6: 469 – 473, 1979.
ANNIE-JEYACHRISTY S, GEETHA A, SURENDRAN R. Changes in the level of cytosolic calcium,nitric oxide and nitric oxide synthase activity during platelet aggregation: an in vitro study in platelets from normal subjects and those with cirrhosis. J Biosci. 33(1):45-53, 2008
APRIL, M. K.; BRENT, W.G.;, PATRICK, P.G.; ALAN, H.H.; STEVEN, V.J. Utilization, cost trend and member cost-share for self-injectable multiple sclerosis drugs - Pharmacy and medical beneft spending from 2004 through 2007. J Manag Care Pharm. 13(9): 799 – 806; 2007.
BALABANOV, R.; STRAND, K.; KEMPER, A.; LEE, J.Y.; POPKO, B. Suppressor of Cytokine Signaling 1 Expression Protects Oligodendrocytes from the Deleterious Effects of Interferon- . J. Neurosci, 26(19):5143 - 5152, 2006.
BEHMER, Oswaldo Arruda. Manual de técnicas para histologia normal e patológica. 2ª ed. Manole, Barueri, SP, 2003.
83
BESSLER, H.; GILGAI, R.; DJALDETTI, M.; ZAHAVI, I. Effect of pentoxifylline on the phagocytic activity, cAMP levels, and superoxide anion production by monocytes and polymorphonuclear cells. J Leuk Biol. 40: 747 – 754, 1986.
BREDT, D. S.; & SNYDER, S. H. Nitric oxide, a novel neuronal messenger. Neuron , 8(1): 3-11, 1992.
BRENNER, T.; BROCKE, S.; SZAFER, F.; SOBEL, R. A.; PARKINSON, J. F.; PEREZ, D. H.; STEINMAN, L. Inhibition of nitric oxide synthase for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 158(6): 2940 – 2946, 1997.
BUISSON, A.; PLOTKINE, M.; BOULU, R. G. The neuroprotective effect of nitric oxide inhibitors in a rat focal model of cerebral ischemia. Br. J. Pharmacol. 106(4): 766-767, 1992.
CALLEGARO, D.; GOLDBAUM, M.; MORAIS, L.; TILBERY, C.P.; MOREIRA, M.A.; GABBAI, A.A.; SCAFF, M. The prevalence of multiple sclerosis in the city of São Paulo, Brazil, 1997. Acta Neurol Scand. 104(4):208-13, 2001.
CARLIN, J.M.; BORDEN, .C.; SONDEL, P.M.; BYME, G.I. Interferon-induced indolamine 2,3- dioxygenase activity in human mononuclear phagocytes. J Leukoc Biol. 45: 29 – 34, 1989.
CATTELAN, A. V.; MOTA, C. B. Analise Cinemática da Marcha em Portadores de Esclerose Múltipla – Um Estudo de Caso, 2003. Disponível em http://www.wgate.com.br/conteudo/fisioterapia/neuro/analise_cinematica [Acessado em: 03 /08/ 2004].
CARVALHO, Maria Clara Azevedo de. Encefalomielite Autoimune Experimental. Importância da expressão de fibronectina no desenvolvimento das lesões. 1999. 132 p. Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental) – Universidade Federal Fluminense.
CHEN, L.Z.; HOCHWALD, G.M.; HUANG, C.; DAKIN, G.; TAO, H.; CHENG, C.; SIMMONS, W.J.; DRANOFF, G.; THORBECKE, G.J. Gene therapy in allergic encephalomyelitis using myelin basic protein-specific T cells engineered to express latent transforming growth factor-β1. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (21): 12516– 12521, 1998.
84
CHING L.M.; BROWNE W.L.; TCHERNEGOVSKI, R.; GREGORY, T.; BAGULEY, B.C.; PALMER, B.D. Interaction of thalidomide, thalidomide analogues of thalidomide and pentoxifylline with the anti-tumor agent 5,6-dimethylxanthenone-4- acet acid: concomitant reduction of serum tumor necrosis factor-alpha and enhancement of anti-tumor activity. British J Cancer. 78(3): 336-343, 1998.
CHUNG, I.Y.; NORRIS , J.G.; BENVENISTE , E.N. Differential tumor necrosis factor expression by astrocytes from experimental allergic encephalomyelitis- susceptible and -resistant rat strains. J. Exp. Med. 173: 801-811, 1991.
Com texto. Web Jornal Laboratório. 05 de setembro de 2007, Londrina, PR. Disponívelem:http://www13.unopar.br/unopar/publicacao/manchete.action?m =537 [Acessado em: 09/03/2008].
COLIGAN, J.E.; KRUISBEEK, A.M.; MARGULIES, D.H.; SHEVACH, E.M.; STROBER, W. Curr pro immunol. USA:John Wiley & Sons Inc., 1996.
COLLIN, X.; ROBERT, J.; WIELGOSZ, G.; LE BAUT, G.; BOBIN-DUBIGEON, C.; GRIMAUD, N.; PETIT, J,Y. New antiinflammatory N-pyridinyl(alkyl)phtalimides acting as tumor necrosis factor-a production inhibitors. Eur J Med Chem. 36: 639 – 649, 2001.
COWDEN, W. B.; CULLEN, F. A.; STAYKOVA, M. A.; WILLENBORG, D. O. Nitric oxide in a potential down regulating molecule in autoimmune disease: inhibition of nitric oxide production renders PVG rats highly susceptible to EAE. J. Neuroimmunol. 88(1-2): 1 - 8, 1998.
CRISI, G.M.; SANTAMBROGIO, L.; HOCHWALD, G.M.; SMITH, S.R.; CARLINO, J.A.; THORBECKE, G.J. Staphylococcal enterotoxin B and tumor necrosis factor- - induced relapses of experimental allergic encephalomyelitis: protection by transforming growth factor- and interleukin-10. Eur. J. Immunol. 25: 3035 - 3040, 1995
CRIS S.; CONSTANTINESCU, B.; WYSOCKA, M.; BRENDAN, H.; VENTURA, E.S.; EHUD, L.; TRINCHIERI, G.; ROSTAMI, A. Antibodies Against IL-12 Prevent Superantigen-Induced and Spontaneous Relapses of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Immunol, 161: 5097-5104, 1998.
CROSS, A. H.; MANNING, P. T.; STERN, M. K.; MISKO, T.P.; Evidence for the production of peroxynitrite in inflammatory CNS demyelination. J. Neuroimmunol. 80(1-2): 121-130, 1997.
85
DAVEY, M.; BUCHBINDER, R. Glucocorticoids in early rheumatoid arthritis. Aust Fam Physician. 37(1-2):31-2, 2008.
DAWSON, V. L.; DAWSON, T. M.; BARTLEY, D. A.; UHL, G. R.; SNYDER, S. H. Mechanisms of nitric oxide mediated neurotoxicity in primary brain cultures. J. Neurosci. 13(6): 2651 - 2661, 1993.
DAWSON, V. L.; DAWSON, T. M.; LONDON, E. D.; BREDT, D. S.; SNYDER, S. H. Nitric oxide mediates glutamate neurotoxicity in primary cortical cultures. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88(14): 6328 - 6371, 1991.
DAYNES R.A.; & ARANEO BA. Contrasting effects of glucocorticoids on the capacity of T cells to produce the growth factors interleukin 2 and interleukin 4. Eur J Immunol, 19: 2319 - 2325, 1988.
DAYNES R.A.; ARANEO, B.A.; DOWELL, T.A.; HUANG, K.; DUDLEY, D. Regulation of murine lymphokine production in vivo. III. The lymphoid tissue microenvironment exerts regulatory influences over T helper cell function. J. Exp. Med, 171: 979 - 996, 1990.
DE CARVALHO, M.C.; CHIMELLI, L.M.; QUIRICO-SANTOS, T. Modulation of fibronectin expression in the central nervous system of Lewis rats with experimental autoimmune encephalomyelitis. Braz J Med Biol Res. 32(5):583-92, 1999.
DE GROOT, C. J.; RUULS, S. R.; THEEUWES, J. W.; DIJKSTRA, C. D.; VAN Der VALK, P. Immunocytochemical characterization of the expression of inducible and constitutive isoforms of nitric oxide synthase in demyelinating multiple sclerosis. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 56(1): 10 - 20, 1997.
DE JAGER, P.; & Haffler, D. New Therapeutic approaches for multiple sclerosis. Ann Review of Medicine. 58: 417 -432. 2007.
DING, A.; NATHAN, C.F.; STUER, D.J. Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages: comparison of activating cytokines and evidence for independent production. J. Immunol. 141:2407-2503, 1988.
FALCONE, M; BLOOM, B.R.A. T helper cell 2 (Th2) immune response against non self antigens modifies the cytokine profile of autoimmune T cells and protects against experimental allergic encephalomyelitis. J. Exp. Med. 185: 901, 1997.
86
FARIA AM, WEINER HL. Oral tolerance: therapeutic implications for autoimmune diseases. Clin Dev Immunol. 13(2-4):143-57, 2006.
FROHMAN, E.M.; RACKE, M.K.; RAINE, C.S. Multiple sclerosis – the plaque and its pathogenesis. N Engl J Med, 354: 942 – 55, 2006.
FURLAN, R.; VILLA, P.; SENALDI, G.; MARTINO, G. TNFalpha in experimental diseases of the CNS. Methods Mol Med. 98:171-90, 2004.
GIOVANNONI, G.; KINKEL, P.; VARTANIAN, T. Treating multiple sclerosis in the natalizumab era: risks, benefits, clinical decision making, and a comparison between North American and European Union practices. Rev Neurol Dis. Fall;4(4): 184 - 93, 2007.
GOLD, D. P.; SCHRODER, K.; POWELL, H. C.; KELLY, C. J. Nitric oxide and the immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis. Eur. J. Immunol. 27(11): 2863 - 2869, 1997.
GONZALEZ-HERNANDEZ, T. & RUSTIONI, A. Expression of three forms of nitric oxide synthase in peripheral nerve regeneration. J. Neurosci. Res. 55(2), 198-207, 1999.
GOODIN, D.S.; FROHMAN, E.M.; GARMANY, G.P. et al. Disease modifying therapies in multiple sclerosis. Report of therapeutics and thecnology assessment subcommittee of the American Academy of Neurology and the MS Council for Clinical Practice Guidelines. Neurol. 58: 169 -178, 2002.
GRAU, GE.; VESIN, C.; DE GROOTE, DELACROIX, D.; GYSLER, C.; PIGUET, P.F; LAMBER, PH. Prevention of human TNF-induced cutaneous Shwartzmann reaction and acute mortality in mice treated with anti-human TNF monoclonal antibodies. Clin. and Exp. Immunol, 84: 411 - 414, 1991.
GUTIERREZ-RODRIGUES, O.; STARUSTA-BACAL, P.; GUTIERREZ-MONTES, O. Treatment of refractory rheumatoid arthritis. The Thalidomide experience. J. of Rheumatol 162: 158 - 163, 1989.
HASHIMOTO, Y. "Structural development of biological response modifiers based on thalidomide." Bioorg Méd Chem. 10: 461 – 479, 2002.
87
HEN-I, L.; SHI-JYE, C.; WANG, D.; NAN-HSIUNG, F. Pharmacological modulation of TNF production in macrophages. J Microbiol Immunol Onfect . 37: 8 – 15, 2004
HOOPER, D. C.; OHNISHI, S. T.; KEAN, R.; NUMAGAMI, Y.; DIETZSCHOLD, B.; KOPROWSKI, H. Local nitric oxide production in viral and autoimmune disease of the central nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. 92(12): 5312 - 5316, 1995.
HORGA, A.; & HORGA, J.F. Natalizumab em el tratamiento de la esclerosis múltiple. Revista de Neurologia. 45(5): 293 – 303, 2007.
HSIEH, C.S.; HEIMBERGER, A. B.; GOLD, J. S.; O'GARRA, A.; MURPHY, K. M. Differential regulation of T helper phenotype development by interleukin 4 and 10 in ß T-cell-receptor transgenic system. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 6065, 1992.
HUANG, Z.; HUANG, P. L.,; PANAHIAN, N.; DALKARA, T.; FISHMAN, M.C.; MOSKOWITZ, M. A. Effects of cerebral ischemia in mice deficient in neuronal nitric oxide synthase. Sci 265(5180): 1883 - 1885, 1994.
IADECOLA, C.; ZHANG, F.; XU, X. Inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates cerebral ischemic damage. Am. J. Physiol. 268(1-2): 286 - 292, 1995.
ILLES, Z.; STERN, J.N.; KESKIN, D.B.; REDDY, J.; BROSNAN, C.F.; WALDNER, H.; SANTAMBROGIO, L.; KUCHROO, V.K.; STROMINGER, J.L. Copolymer effects on microglia and T cells in the central nervous system of humanized mice. Eur. J. Immunol. 35: 3683 – 3693, 2005.
ISSAZADEH, S.; LJUNGDAHL, A.; HÖJEBERG, b.; MUSTAFA, M.; OLSSON, T. Cytokine production in the central nervous system of Lewis rats with experimental autoimmune encephalomyelitis: dynamics of mRNA expression for interleukin10, interleukin-12, cytolysin, tumor necrosis factor and tumor necrosis factor . J. Neuroimmunol. 61: 205-212, 1995.
KARL, F.; HANS-PIETRO, E.; MARTIN, B.; CRIS, S.; CONSTANTINESCU, E.L.; FONTANA, A. Tumor Necrosis Factor and Lymphotoxin Are Not Required for Induction of Acute Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. of Immunol. Volume 185, Number 12, 16: 2177 - 2182, 1997.
KIM, H.; & Crow, TJ. Identification and phylogeny of novel human endogenous retroviral sequences belonging to the HERV-W family on the human X chromosome. Arch Virol. 144(12): 2403 -13, 1999.
88
KURODA, Y.; SHIMAMOTO, Y. Human tumor necrosis factor- augments experimental allergic encephalomyelitis in rats. J. Neuroimmunol. 34: 159 - 164, 1991.
LAFAILLE, J. J.; VAN De KEERE, F.; HSU, A. L.; BARON, J.L.; HAAS, W.; RAINE, C. S.; TONEGAWA, T. Myelin basic protein-specific T helper 2 (Th2) cells cause experimental allergic encephalomyelitis in immunodeficient hosts rather than protecting them from disease. J. Exp. Med. 186: 307, 1997.
LASSMANN, H.; SMITH, K.; WEKERLE, H.; COMPSTON, A. The pathogenesis of multiple -sclerosis: a pandect. Philadelphia: Churchill-livingstone; p. 661 – 668, 2005.
LASSMANN, H.; & WISNIEWSKI, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Arch. Neurol. 36: 490, 1979.
LE GROS, G.; BEN-SASSON, S; Z., SEDER, R.; FINKELMAN, F. D.; PAUL, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J. Exp. Med. 172: 921, 1990.
LEADBETTER, E.A.; BOURQUE, C.R.; DEVAUX, B. OLSON, C.D.; SUNSHINE, G.H.; HIRANI, S.; WALLNER, B.P.; SMILEK, D.E.; HAPP, M.P. Experimental autoimmune encephalomyelitis induced with a combination of myelin basic protein and myelin oligodendrocyte glycoprotein is ameliorated by administration of a single myelin basic protein peptide. J Immunol. 161(1): 504 -12, 1998.
LEE, S. C.; DICKSON, D.W.; LIU, W.; BROSNAN, C. F. Enhanced expression of constitutive and inducible forms of nitric oxide synthase in autoimmune encephalomelitis 17 Induction of nitric oxide synthase activity in human astrocytes
by interleukin-1beta and interferon-. J. Neuroimmunol. 46(1-2): 19-24, 1993.
LEONARD, J. P.; WALDBURGER, K.E.; GOLDMAN, S. J. Regulation of experimental autoimmune encephalomyelitis by interleukin-12. Ann. NY Acad. Sci. 795: 216, 1996.
LIN, R. F.; LIN, T. S.; TILTON, R. G.; CROSS, A. H. Nitric oxide localized to spinal cords of mice with experimental allergic encephalomyelitis: An electron paramagnetic resonance study. J. Exp. Med. 178(2), 643 - 648, 1993.
89
LUNA, L.G. Manual of histológic attaining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3 th ed. New York: McGraw- Hill Book Company, 258p. 1968.
MACMICKING, J. D..; WILLENBORG, D.O.; WEIDEMANN, M.J.; ROCKETT, K.A.; COWDEN, W.B. Elevated secretion of reactive nitrogen and oxygen intermediates by inflammatory leukocytes in hyperacute experimental autoimmune encephalomyelitis: enhancement by the soluble products of encephalitogenic T cells. J. Exp. Med. 176(1): 303 - 307, 1992.
MCCARTNEY-FRANCIS, N.; ALLEN, J. B.; MIZEL, D. E.; ALBINA, J. E.; XIE, Q.W.; NATHAN, C. F.; WAHL, S. M. Suppression of arthritis by an inhibitor of nitric oxide synthase. J. Exp. Med. 178(2): 749 - 754, 1993.
MELLIN, G.W.; KATZENSTEIN, M. Thalidomide neurotoxicity and rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 267: 1184 – 1193 e 1238 – 1244, 1962.
MOHAMED, A.; TARHUNI, H.; DUFAN, T.; BENGHUZZI, H.; TUCCI, M. The use of digital technology to asses the severity of the Experimental Allergic Encephalomyelitis (EAE) spinal cord lesion. Biomed Sci Instrum. 40:419-23, 2004.
MONCADA, S.; PALMER, R.M.J.; HIGGS, E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol. Rev. 43(2): 109 -142, 1991.
MOREIRA, L.A.; SAMPAIO, E.P, ZMUIDZINAS, A.; FRIND, P.; SMITH, K.A.;
KAPLAN, G. Thalidomide exerts its inhibitory action on tumor necrosis factor by enhacing mRNA degradation. J. Exp. Med, 177: 1675 - 1680, 1993.
MOREIRA, M. et al. Esclerose Múltipla – Estudo Descritivo de suas Formas Clinica em 302 Casos. Arq. Neurop., 58 (2-B): 460 – 466, 2000.
MORESCHI JUNIOR, D.; NIGRO, A.J.T.; BANDEIRA, C.O.P.; SEIDEL,
A.C.; TORMENA, E.B. Investigation of the use of regional heparinization during
temporary arterial ischemia performed in rabbits. Acta Cir. Bras., 14(2), 1999.
MURPHY, S.; SIMMONS, M. L.; AGULLO, L.; CARCIA, A.; FEINSTEIN, D. L.; GALEA, E.; REIS, D. J.; MINC-GOLOMB, D.; SCHWARTZ, J. P. Synthesis of nitric oxide in CNS glial cells. Trends. Neurosci. 16(8): 323 - 328, 1993.
90
MUSTAFA, M.I.; DIENER, P.; HOJEBERG, B.; VAN DER MEIDE, P.; OLSSON, T. T cell immunity and interferon-gamma secretion during experimental allergic encephalomyelitis in Lewis rats. J. Neuroimmunol. 31: 165, 1991.
NAGELKERKEN, L. Role of Th1 and Th2 cells in autoimmune demyelinating disease. Braz J Med Biol Res 31(1): 1998.
NEUNER, P.; KLOSNER, G.; SCHAUER, E.; et al. Pentoxifylline in vivo down
reglates the release of IL1, IL-6, IL-8 and tumor necrosis factor- by human peripheral blood mononuclear cells. Immunol. 83: 262, 1994.
NOEL, P.; NELSON, S.; BOKULIC, R.; BAGBY, G.; LIPPTON, H.; LIPSCOMB, G.; SUMMER, W. Pentoxifylline inhibts lipopolysacharide-induced serum tumor necrosis factor and mortality. Life Sci 47: 1023 - 1029, 1998.
O‘BRIEN, N. C.; CHARLTON, B.; COWDEN, W. B.; WILLENBORG, D.O. Nitric oxide plays a critical role in recovery of Lewis rats from experimental autoimmune encephalomyelitis and the maintenance of resistance to reinduction. J. Immunol. 163: 6841, 1999.
OHMORI, K.; HONG, Y.; FUJIWARA, M.; MATSUMOTO, Y. In situ demonstration of proliferating cells in the rat central nervous system during experimental utoimmune encephalomyelitis. Evidence suggesting that most infiltrating T cells do not proliferate in the target organ. Lab. Invest. 66(1): 54-62, 1992.
OKUDA, Y.; SAKODA, S.; FUJIMURA, H.; YANAGIHARA, T. Aminoguanidine, a selective inhibitor of the inducible nitric oxide synthase, has different effects on experimental allergic encephalomyelitis in the induction and progression phase. J. Neuroimmunol. 81(1-2): 201-210, 1998.
OKUDA, Y.; SAKODA, S.; FUJIMURA, H.; YANAGIHARA, T. Nitric oxide via an inducible isoform of nitric oxide synthase is a possible factor to eliminate inflammatory cells from the central nervous system of mice with experimental allergic encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 73(1-2): 107-116, 1997.
Old, L., J. Tumor necrosis factor (TNF) Sci. 230: 630 – 633, 1985.
OWENS, T & SRIRAM, S. The immunology of multiple sclerosis and its animal, model, experimental allergic encephalomyelitis. Neurol. Clin. 13 (1): 51 -73, 1995.
91
PANITCH, H.S. Investigational drug therapies for treatment of multiple sclerosis. Multiple Sclerosis, 2: 66 – 77, 1996)
PAPAIS-ALVARENGA, R.; LEON, A.S.; MIRANDA, C. et al. Characteristics of multiple sclerosis in Brazil: a multicentric study in a prevalence cohort -South Atlantic Project Phase I (abstract). J Neurol Sci 150(Suppl): S229, 1997.
PAPENFUSS, T.L.; ROGERS, C.J.; GIENAPP, I.; YURRITA, M.; Mcclain, M.; DAMICO, N.; VALO, J.; SONG, F.; WHITACRE, C.C. Sex differences in experimental autoimmune encephalomyelitis in multiple murine strains. J Neuroimmunol. 150(1-2): 59 - 69, 2004.
PICK, E.; & MIZEL, D. Rapid microassays for the measurement of superoxide and hydrogen peroxide production by macrophage in culture using an automatic enzime immunoassay reader. J. Immunol. Methods. 46: 211 - 226, 1981.
POLLAK, Y.; OVADIA, H.; ORION, E.; YIRMIYA, R. The EAE-associated behavioral syndrome: II. Modulation by anti-inflammatory treatments. J Neuroimmunol. 137(1-2): 100-8, 2003.
PONOMAREV ED, MARESZ K, TAN Y, DITTEL BN. CNS-derived interleukin-4 is essential for the regulation of autoimmune inflammation and induces a state of alternative activation in microglial cells. J Neurosci.3;27(40):10714-21, 2007.
PUGLIATI, M.; ROSATI, G.; CARTON, H.; RIISE, T.; DRULOVIC, J. et al. The Epidemiology of multiple sclerosis in Europe. Eur J Neurol. 13: 700 – 22, 2006.
RAINE, C.S. Experimental allergic encephalomyelitis and related conditions. Prog. Neuropathol. 3: 225-251, 1976.
RAMIREZ, F.; FOWELL, D.J.; PUKLAVEC, M.; SIMMONDS, S.; MASON, D. Glucocorticoids promote a Th2 cytokine response by CD4+ T cells in vitro. J. Immunol. 15: 2406 - 2412, 1996.
REIBER, H.; UNGEFEHR, S.; JACOBI, C. The intrathecal, polyspecific and oligoclonal immune esponse in multiple sclerosis. Multiple Sclerosis 4: 11 - 117, 1998.
92
RIENECK, K.; DIAMANT, M.; HAAHR, P.M.; SCHONHARTING, M.; BENDTZEN, K. In vivo immunomodulatory effects of pentoxifylline. Immunol Lett. 37: 131, 1993.
RIZVI, S.A.; & AGIUS, M.A. Current aproved options for treating patients with multiple sclerosis. Neurol. 63(12): S8 – S14, 2004.
ROSSMAN, H. Neutralizing antibodies to multiple sclerosis treatment. J Manag Care Pharm. 10(3) S12 – S17, 2004.
RUULS, S. R.; VAN DER LINDEN, S.; SONTROP, K.; HUITINGA, I.; DIJKSTRA, C.D. Aggravation of experimental autoimmune encephalomyelitis by administration of nitric oxide synthase inhibitors. Clin. Exp. Immunol. 103(3): 467 - 474, 1996.
SAMPAIO, E.P.; SARNO, E.M.; GALILLY, R.; COHN, Z.A.; KAPLAN, G.
Thalidomide selectively inhibits tumor necrosis factor production by stimulated human monocytes. J. Exp. Med. 173: 699 - 703, 1991.
SARNO, E.M.; GRAU, G.E.; VIEIRA, L.M.M.; NERY, A.C. Serum levels of TNF-and IL-1 beta during leprosy reactional states. Clin. Exp. Immunol. 84: 103-108, 1991.
SCHMIDT, J.; STURZEBECHER, S.; TOYKA, K.V.; GOLD, R. Interferon-beta treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis leads to rapid nonapoptotic termination of T cell infiltration. J Neurosci Res. 65(1): 59 - 67, 2001.
SEUNGJOON, Kim.; CHANGJONG, M.; MYUNG, B.W.; HYUNGMIN, K.; NAOYUKI, T.; YOH, M.; TAEKYUN, S. Enhanced expression of constitutive and inducible forms of nitric oxide synthase in autoimmune encephalomyelitis. J. Vet. Sci. 1(1): 11–17, 2000.
SHARMA, H.S.; WESTMAN, J.; OLSSON, Y.; ALM, P. Involvement of nitric oxide in acute spinal cord injury: an immunocytochemical study using light and electron microscopy in the rat. Neurosci. Res. 24(4): 373-384, 1996.
SHEVAC, E.M. Regulatory T cellsin autoimmunity. Annu. Rev. Immunol. 18: 423 - 449, 2000.
93
SHIN, T.; KOJIMA, T.; TANUMA, N.; ISHIHARA, Y.; MATSUMOTO, Y. The subarachnoid space as a site for precursor T cell proliferation and effector and T cell selection in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 56(2): 171-178, 1995.
SHIN, T.; TANUMA, N.; KIM, S.; JIN, J.; MOON, C.; KIM, K.; KOHYAMA, K.; MATSUMOTO, Y.; HYUN, B. An inhibitor of inducible nitric oxide synthase ameliorates experimental autoimmune myocarditis. J. Neuroimmunol. 92(1-2): 133-138, 1998.
SLAVIN, A.J.,, MARON, R.; WEINER, H.L. Mucosal administration of IL-10 enhances oral tolerance in autoimmune encephalomyelitis and diabetes. International Immunol, Vol. 13, No. 6, 825-833, 2001.
STREITER, R.M.; REMICK, D.G.; WARD, P.A. et al. Cellular and molecular regulation of tumor necrosis factor production by pentoxifylline. Biochem Biophys Res Comn 155: 1230, 1988.
STÜVE, O.; YOUSSEF, S.; WEBER, M.S.; NESSLER, S.; VON BÜDINGEN, H.C.; HEMMER, B.; PROD'HOMME, T.; SOBEL, R.A.; STEINMAN, L.; ZAMVIL, S.S. Immunomodulatory synergy by combination of atorvastatin and glatiramer acetate in treatment of CNS autoimmunity. J Clin Invest. 116(4):1037-44, 2006.
SUN, D.; COLECLOUGH, C.; CAO, L..; HU, X.; SUN, S. Reciprocal stimulation
between TNF- and nitric oxide may exacerbate CNS inflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 89(1-2): 122 - 130, 1998.
SZTRYMF, B.; RABILLER, A.; NUNES, H.; SAVALE, L.; LEBREC, D.; LEPAPE, A.; De MONTPREVILLE, V.; MAZMANIAN, M.; HUMBERT, M.; HERVE, P. Prevention of hepatopulmonary syndrome by pentoxyfilline in cirrhotic rats. Eur Respir J. 23: 752 – 758, 2004.
TEICHER, B.A.; HOLDEN, S.A.; HERMAN, T.S.; EPELBAUM, R.; PARDEE, A.B.; DEZUBE, B. Efficacy of pentoxifylline as a modulator of alkylating agent activity in vitro and in vivo. Anticancer Res. 11(4): 1555 - 60, 1991.
TEO, S.K.; COLBURN, W.A.; TRACEWELL, W.G.; KOOK, K.A.; STIRLING, D.I.; JAWORSKY, M.S.; SCHEFFLER, M.A.; THOMAS, S.D.; LASKIN, O.L. Clinical pharmacokinetics of thalidomide. Clin Pharmacokinet. 43(5): 311 - 27, 2004.
94
TERUYA, R.; FAGUNDES, D.J., OSHIMA, C.T.F., BRASILEIR, J.L., MARKS, M., YNOUYE, C.M., SIMÕES, M.J. The effects of pentoxifylline into the kidneys of rats in a model of unilateral hindlimb ischemia/reperfusion injury. Acta Cir. Bras. vol.23 (1), 2008
TILBERY, C. P. Esclerose Múltipla no Brasil: aspectos clínicos e terapêuticos. São Paulo: Atheneu, 2005
TRAN, E. H.; HARDIN-POUZET, H.; VERGE, G.; OWENS, T. Astrocytes and microglia express inducible nitric oxide synthase in mice with experimental allergic encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 74(1-2): 121-129, 1997.
TSUNODA, I.; TANAKA, T.; TERRY, E.J.; FUJINAMI, R.S. Contrasting Roles for Axonal Degeneration in an Autoimmune versus Viral Model of Multiple Sclerosis. When Can Axonal Injury Be Beneficial? Am J Pathol. 170(1): 214–226, 2007.
VADIEI, K.; TUCKER, S.D.; LOPEZBERESTEIN, G.; WASAN, K.M. Nephroprotective mechanism(s) of pentoxifylline-reduction of eytrocyte-mediated vascular congestion and inhibition of nitric oxide release. Pharmacol Toxicol. 78: 174, 1996.
VOGELSANG, G.B.; FARMER, E.R.; HESS, H.D.; ALTAMONTE, V.; BESCHORNER, W.E.; JABS, D.A.; CORIO, R.L.; LEVIN, L.S.; COLVIN, O.M.; WINGAR, J.R.; SANTOS, G.W. Thalidomide for the treatment of chronic graft- versus-host disease. New Eng. J. Med. 326: 1055 -1058, 1992.
XIE, Q.W.; NATHAN, C. The high-output nitric oxide pathway: role and regulation. J. Leuk. Biol. 56, 576- 582, 1994.
XIE, Q. W.; CHO, H. J.; CALAYCAY, J.; MUMFORD, R. A.; SWIDEREK, K. M.; LEE, T. D.; DIANG, A.; TROSO, T.; NATHAN, C. Cloning and characterization of inducible nitric oxide synthase from mouse macrophages. Sci. 256(5051): 225-228, 1992.
WEBER, M.S.; YOUSSEF, S.; DUNN, S.E.; PROD’HOMME, T.; NEUHAUS, O.; STUVE, O.; GREENWOOD, J.; STEINMAN, L.; ZAMVIL, S.S. J. Neuroimmunol. 178: 140 – 148, 2006.
95
WEINER, H.L. Oral tolerance for the treatment of autoimmune diseases. Annu. Rev. Med. 48:341-351, 1997.
YANYING, Z.; BINGJIE, G.; XIAOHUI, J.; XINSHENG, D.; CHUNJIE, S.; FEICHI, W. Sinomenime, an antirheumatic alkaloid, ameliorates clinical signs of disease in the Lewis rat model of acute Experimental Autoimune Encephalomyelitis. Biol. Pharm. Bull. 30(8): 1438 – 1444, 2007.
ZHAO, W.; TILTON, R. G.; CORBETT, J. A.; MCDANIEL, M. L.; MISKO, T. P.; WILLIAMSON, J.R.; CROSS, A.H; HICKEY, W.F. Experimental allergic encephalomyelitis in the rat is inhibited by aminoguanidine, an inhibitor of nitric oxide synthase. J. Neuroimmunol. 64(2): 123-133, 1996.