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Desde a descoberta da dupla fita de DNA surgiram diversas ciências, entre elas a genética e a biologia molecular.
Os estudos surgiram com o objetivo de conhecer o funcionamento de uma célula ou organismo, além de conhecer possíveis doenças e tentar encontrar a cura.
Para que isso fosse possível foram descobertos várias técnicas, entre elas o sequenciamento do genético, afim de descobrir a sequência das bases nitrogenadas do DNA.
O primeiro método de sequenciamento de DNA surgiu em meados dos anos 70 e ficou conhecido como método químico ou Maxam – Gilbert, método no qual foi amplamente aplicável na época.
Alguns anos depois, em 1977, Frederick Sanger propõe um método diferente e mais eficiente chamado de método enzimático ou de Sanger. Esse método logo se tornou altamente replicável e é utilizado até os dias de hoje.
Frederick Sanger nasceu em 1918 e faleceu em 2013 aos 95 anos em Cambridge, onde era pesquisador no laboratório de biologia molecular da Universidade de Cambridge.
Ganhador de 2 prêmios Nobel.
1977: Sanger desenvolve seu método de sequenciamento de DNA.
A partir daí sequencias com até 96% de similaridade puderam ser diferenciadas.
O DNA é formado por duas fitas antiparalelas de nucleotídeos complementares formando uma dupla hélice.
Sanger descobriu que se conseguisse interromper a replicação de um mesmo DNA em pontos diferentes ele poderia juntar essas fitas menores e formar a sequência completa do DNA.
O método consiste em adicionar didesoxiribonucleotídeos (ddNTP’s), que são nucleotídeos modificados que não possuem o grupo OH livre no carbono 3’ da pentose.
Existem quatro tipos de ddNTP’s, um para cada base nitrogenada (A,T,G,C).
Quando os ddNTP’s tentam se ligar com a fita de DNA, com a ausência do OH, o próximo nucleotídeo não têm onde se ligar e a replicação para.
Assim é possível obter fitas do mesmo DNA com número de resíduos diferentes.
A reação é realizada em 4 tubos de ensaio.
Cada tudo contêm:
DNA;
DNA polimerase;
Primer;
Nucleotídeos;
E um tipo de ddNTP diferente.
Após isso ocorre a replicação em todos os tubos.
Dentro de cada tubo a replicação acontece e termina em lugares diferentes.
No final do processo temos fragmentos da fita de DNA de diferentes tamanhos.
O conteúdo desses tubos é aplicado em gel de poliacrilamida e separado por tamanho (eletroforese).
Os fragmentos menores ficaram mais em baixo e os maiores mais em cima.
Para obter a sequência do DNA, a leitura é feita de baixo para cima, resultando em fragmentos que se sobrepõem, e formam a fita completa de DNA.
Proposto por Mostafa Ronaghi (1996);
Instituto Real Tecnológico da Suécia;
Pesquisador na Universidade de Stanford;
Vice-presidente da Illumina Company;
Primeira alternativa ao método de Sanger para sequenciamento do DNA.
Detecção através da Luz;
Liberação de Pirofosfato na adição de um nucleotídeo;
Ação de 4 diferentes enzimas:
DNA polimerase;
ATP sulfurilase;
Luciferase;
Apirase;
Substratos utilizados:
Adenosina 5’ fosfossulfato (APS);
Luciferina;
Resultados obtidos rapidamente.
Passo 1
Extração do DNA.
Passo 2
Adição do Desoxirribonucleotídeo Trifosfato (dNTP);
DNA polimerase catalisa a incorporação do dNTP na fita;
Complementar à fita molde;
Liberação de pirofosfato (PPi);
Quantidade equivalente à de nucleotídeos incorporados.
Passo 3
ATP sulfurilase converte PPi para ATP;
Presença de adenosina 5’fosfossulfato (APS);
Conversão de luciferina em oxiluciferina (pela luciferase);
Luz visível;
Proporcional à quantidade de ATP;
Detcção é feita por um chip ;
Gera um pico na saída de dados do software;
Cada pico (sinal de luz) é proporcional ao número de nucleotídeos.
Passo 4
Apirase degrada nucleotídeos não incorporados e ATP;
Após degradar, mais nucleotídeos são adicionados.
Passo 5
Adição de dNTP é realizada sequencialmente;
Cadeia complementar de DNA é construída;
Sequência nucleotídica é determinada a partir dos picos.
• Identificação de bactérias;
• Tipagem fúngica e viral;
• Detectar mutações;
• Análises de metilação do DNA;
• Sequências múltiplas;
• Verificações de clones;
• Sequenciamento do genoma humano.
Vantagens:
Processo automatizado
Tempo de análise curta;
Resposta instantânea do sequenciamento;
Alto rendimento;
Preparo rápido da amostra;
Desvantagens:
Custo elevado;
Grande conhecimento de bioinformática;
Taxa de erro considerada alta (0,0098)
Sequenciamento de DNA da nova
geração;
Pesquisadores de Connecticut, USA;
Pretendem democratizar o
sequenciamento
Desejam chegar em US$ 1000;
Parecido com o pirosequenciamento;
Utiliza microchip para deterctar a incorporação do dNTP;
Chip mede a diferença de pH;
Evolução acompanha informática;
DNA é fragmentado;
Adição de marcadores;
Cada fragmento liga-se a um “bead”;
“Beads” são posicionados em poços;
Ocorre replicação do fragmento;
Cobre o “bead”;
Poços individuais;
Banho de dNTP;
Caso dNTP ligue-se, libera H+;
Variação do pH detectada pelo chip;
Análises rápidas ~2h; Elevada sensibilidade;
Ideal para DNA pequeno a médio; Baixo custo;
Localiza prontamente sítios específicos no DNA;
Altamente recomendado para avaliação de fragmentos específicos;
Biologia molecular Sequenciamento é utilizado no estudo de
genes e quais proteínas codificam;
Assim, o que levam trocas nos genes?
Biologia evolutiva O sequenciamento do DNA é útil para
entender como diferentes organismos estão relacionados;
Medicina Pacientes podem saber se apresentam
doenças genéticas;
Ciência forense Identificação;
Teste de paternidade;