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FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS

VARIAÇÕES DE

SEQUÊNCIA DO

GENE CFTR NA

POPULAÇÃO

PEDIÁTRICA

PORTUGUESA

Liliana Cristina Santos Gonçalves Mestrado em Biologia Celular e Molecular

Departamento de Biologia – Faculdade de Ciências

Universidade do Porto

2013

Orientador

Ana Grangeia, PhD

Faculdade de Medicina – Universidade do Porto

Coorientador

Filipa Carvalho, PhD

Faculdade de Medicina – Universidade do Porto

FCUP FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA

II

Todas as correções determinadas

pelo júri, e só essas, foram efetuadas.

O Presidente do Júri,

Porto, ______/______/_________


III

FACULDADE DE CIÊNCIAS – UNIVERSIDADE DO PORTO

MESTRADO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO

GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA

Liliana Cristina Santos Gonçalves

Dissertação submetida à Faculdade de

Ciências da Universidade do Porto como

requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Biologia Celular e Molecular

Orientador – Doutora Ana Grangeia

Docente Voluntária

Departamento de Genética

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Coorientador – Prof. Doutora Filipa Carvalho

Professora Auxiliar com Agregação

Departamento de Genética

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

PORTO

2013


IV

"Sejam quais forem os resultados com êxito ou não,

o importante é que no final cada um possa dizer: 'fiz o que pude'."

Louis Pasteur


V

AGRADECIMENTOS

Ao terminar mais esta etapa do meu percurso académico, não posso deixar de

agradecer a todos aqueles que contribuíram para a realização desta dissertação de

mestrado, em especial:

Ao Professor José Pissarra, Diretor do Mestrado em Biologia Celular e

Molecular, pelo trabalho efetuado nestes 2 anos de vida inicial do mestrado, sem

dúvida complicados. Obrigado também ao corpo docente do mestrado por todos os

ensinamentos transmitidos.

Ao Professor Doutor Alberto Barros, Diretor do Departamento de Genética da

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, pela disponibilização de todos os

equipamentos e materiais necessários para a realização deste trabalho.

À Doutora Ana Grangeia, orientadora desta dissertação, pela orientação

científica, apoio e disponibilidade. Por me incentivar a apresentar o meu trabalho em

inglês e não me deixar desistir. Obrigado pela amizade, pela confiança e carinho

durante esta minha estadia. És um grande exemplo para mim.

À Professora Doutora Filipa Carvalho, co-orientadora desta dissertação, pela

oportunidade que me deu, por acreditar na minha capacidade e por toda a orientação

científica, apoio disponibilizado e exemplo de trabalho transmitido durante esta

passagem pelo departamento.

A todos os elementos do Departamento de Genética, em especial à equipa da

genética molecular, pela ajuda e esclarecimento de muitas dúvidas que foram surgindo

durante este tempo.

Aos meus colegas de mestrado, por todos os momentos de alegria,

companheirismo, estudo e trabalho que passamos. Iremos ser sempre os primeiros

mestres em BCM no Porto.

À Marta, Ana Paula, Tânia, Pedro e Francisco. Obrigado pelas pessoas que são

e por todos os momentos que vivemos e iremos com certeza continuar a viver. Cada

um à sua maneira, contribuíram muito para a minha vida durante este ciclo. Sois uns

queridos!


VI

À Raquel, companheira inseparável desta jornada pelo Departamento de

Genética, por toda a ajuda laboral. Obrigado pela amizade, pela paciência e por todos

os momentos vividos e outros tantos por viver. Sem dúvida que as tuas palavras foram

muito importantes para mim durante os tempos bons e menos bons e serão sempre

recordadas. És uma sweet!

A todos os meus amigos, em especial ao Pedro e a todos os outros que

achavam que os PCRs nunca mais tinham fim, pela amizade, carinho e apoio

demonstrado ao longo deste tempo.

À Inês, longe mas sempre presente nos momentos cruciais. Obrigado por toda a

tua amizade ao longo destes anos e por todas as sábias palavras de carinho e apoio

nos momentos mais complicados.

À Sara, a minha irmã de coração, por estar sempre ao meu lado em todos os

momentos da vida, dando-me aquela forcinha para chegar mais além. Obrigado por

todas as palavras, carinhos e puxões de orelhas. Obrigado por seres a pessoa que és!

Aos meus pais e ao meu irmão, por todo o apoio e carinho que sempre tiveram

para comigo, nos bons momentos e principalmente nos maus, por toda a formação

que me proporcionaram e pelo seu apoio em todas as decisões que fui tomando ao

longo desta vida.

A TODOS um sincero OBRIGADO!


VII

ÍNDICE

Agradecimentos………………………………………………………………………………..V

Índice…………………………………………………………………………………………..VII

Lista de Figuras………………………………………………………………………………..IX

Lista de Tabelas……………………………………………………………………………….XI

Lista de Abreviaturas…………………………………………………………………………XII

Resumo………………………………………………………………………………………….1

Abstract………………………………………………………………………………………….3

1. Introdução............................................................................................................ 6

1.1. Fibrose Cística ......................................................................................... 6

1.1.1. Perspetiva Histórica ......................................................................... 6

1.1.2. Incidência ......................................................................................... 7

1.1.3. Manifestações Clínicas..................................................................... 9

1.1.4. FC Clássica .................................................................................... 11

1.1.5. CFTR-Related Disorders (CFTR-RD) ............................................. 11

1.2. Gene CFTR ............................................................................................ 12

1.2.1. Identificação ................................................................................... 12

1.2.2. Estrutura e Organização ................................................................. 13

1.2.3. Espetro de Mutações ..................................................................... 14

1.2.4. Classes das Mutações CFTR ......................................................... 15

1.2.5. Polimorfismos CFTR ...................................................................... 18

1.2.6. Alelos Complexos ........................................................................... 19

1.2.7. Correlação Genótipo-Fenótipo ....................................................... 20

1.3. Proteína CFTR ....................................................................................... 23

1.3.1. Classe, Estrutura e Função ............................................................ 23

1.4. Diagnóstico e Rastreio de FC ................................................................. 24

1.4.1. Teste do Suor ................................................................................. 25

1.4.2. Diferença de Potencial Nasal ......................................................... 25


VIII

1.4.3. Análise do Gene CFTR .................................................................. 25

1.4.4. Rastreio Neonatal ........................................................................... 26

1.5. Tratamento e Novas Terapias ................................................................ 27

2. Objetivos ........................................................................................................... 30

3. Materiais e Métodos .......................................................................................... 32

3.1. Amostras ................................................................................................ 32

3.2. Extração de ADN .................................................................................... 32

3.3. Quantificação de ADN ............................................................................ 32

3.4. Análise Completa da Sequência do Gene CFTR .................................... 32

3.4.1. Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................ 33

3.4.2. Eletroforese Capilar ........................................................................ 36

3.4.3. Purificação ..................................................................................... 37

3.4.4. Reação de Sequenciação .............................................................. 37

3.4.5. Precipitação ................................................................................... 38

3.4.6. Sequenciação ................................................................................ 39

3.5. Análise Bioinformática das Sequências .................................................. 39

4. Resultados......................................................................................................... 41

4.1. Variações de Sequência CFTR .............................................................. 42

4.2. Genótipos CFTR .................................................................................... 46

5. Discussão e Conclusão ..................................................................................... 49

6. Bibliografia ......................................................................................................... 55

Anexos…………………………………………………………………………………………61


IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Número de pessoas com FC. O número de adultos com FC é

crescente, em relação ao número de crianças. Os dados mostram que atualmente

existem mais pessoas com FC em idade adulta. Em 2001, a pessoa mais velha com

FC tinha 74 anos de idade, enquanto em 2011, a pessoa mais velha tinha 81 anos.

Adaptado de (Cystic Fibrosis Fundation, 2012). ............................................................ 6

Figura 2 – Incidência mundial da FC. Adaptado de (WHO, 2004). ...................... 8

Figura 3 - Idade média de sobrevida de doentes com FC. Adaptado de (Cystic

Fibrosis Fundation, 2012). .......................................................................................... 11

Figura 4 – Representação esquemática do gene e da proteína CFTR. O gene

CFTR é transcrito num ARN mensageiro de 6.5 kb que por sua vez é traduzido numa

proteína com 1480 aminoácidos que se localiza na membrana apical das células

epiteliais. Adaptado de (Tsui & Durie, 1997). .............................................................. 13

Figura 5 – Mecanismos mutacionais que alteram o normal funcionamento da

proteína CFTR. Adaptado de (Lubamba et al., 2012).................................................. 18

Figura 6 – Representação esquemática da proteína CFTR. Adaptado de (Prasad

et al., 2010). ................................................................................................................ 24

Figura 7 – Processo de separação das amostras e resultados. Adaptado de

http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Automated-Solutions/Detection-and-

Analysis/QIAxcel-Advanced-System#orderinginformation (Qiagen, 2013). ................. 36

Figura 8 – Esquema do processo de purificação: 1. Reação de PCR; 2. Ligação

das partículas magnéticas aos amplicões; 3. Separação dos amplicões ligados às

partículas magnéticas dos restantes contaminantes; 4. Lavagem dos amplicões com

etanol; 5. Eluição dos amplicões; 6. Transferência dos amplicões purificados para um

novo tubo. Adaptado de https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-

discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-

xp-pcr-purification/index.htm (Beckman Coulter, 2013a). ............................................ 37

Figura 9 – Esquema do processo de precipitação: 1. Adição do reagente

Agencourt CleanSEQ e etanol aos produtos de sequenciação; 2. Ligação das

partículas magnéticas aos produtos de sequenciação; 3. Separação dos produtos de

sequenciação dos contaminantes; 4. Lavagem com etanol; 5. Eluição dos produtos de

sequenciação; 6. Transferência dos produtos precipitados para um novo tubo.

Adaptado de https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-


X

discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-cleanseq-

dye-terminator-removal/index.htm (Beckman Coulter, 2013b). ................................... 38

Figura 10 – Imagem virtual de um gel correspondente à amplificação dos 27

exões do gene CFTR de uma amostra em estudo. As duas bandas observadas para o

exão 6b e para o exão 10 correspondem à variação de sequência c.744-31TTGA[3_7]

e à mutação F508del, respetivamente. ....................................................................... 41

Figura 11 – Sequência forward do exão 1 e respetivas regiões intrónicas. O

exão 1 começa no codão ATG (codão de iniciação – Metionina) e termina em CAG. . 42


XI

LISTA DE TABELAS

Tabela I – Incidência Mundial da FC. .................................................................. 8

Tabela II – Manifestações clínicas da FC. ......................................................... 10

Tabela III – Diferentes classes de mutações do gene CFTR. ............................ 16

Tabela IV – Correlações genótipo-fenótipo CFTR. ............................................ 21

Tabela V – Critérios de diagnóstico da FC. ....................................................... 24

Tabela VI – Componentes da PCR.................................................................... 33

Tabela VII – Condições da PCR. ....................................................................... 33

Tabela VIII – Componentes da PCR com Type-it. ............................................. 34

Tabela IX – Condições da PCR com Type-it. .................................................... 34

Tabela X – Primers utilizados na amplificação dos exões do gene CFTR. ........ 35

Tabela XI – Componentes da reação de sequenciação. .................................... 37

Tabela XII – Condições da reação de sequenciação. ........................................ 38

Tabela XIII – Frequências genotípicas e alélicas das variações de sequência

detetadas nas 194 amostras em estudo. .................................................................... 44

Tabela XIV – Genótipos dos quarenta e três indivíduos heterozigóticos para uma

ou duas variações de sequência no gene CFTR. ........................................................ 46


XII

LISTA DE ABREVIATURAS

ABC ATP-Binding Cassete

ACMG American College of Medical Genetics

ACOG American College of Obstetricians and Gynecologists

ADN Ácido desoxirribonucleico

ATP Adenosine Triphosphate

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CBAVD Congenital Bilateral Absence of Vas Deferens

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

CFTR1 Cystic Fibrosis Mutation Database

CFTR2 Clinical and Functional Translation of CFTR

CFTR-RD CFTR-Related Disorders

Cl- Anião cloreto

DP Diferença de Potencial

DPN Diferença de Potencial Nasal

FC Fibrose Cística

IP Insuficiência Pancreática

IRT Teste do tripsinogénio imunorreativo

mARN Ácido ribonucleico mensageiro

MLPA Multiplex Ligation dependent Probe Amplification

MSD Membrane Spanning Domains

Na+ Catião sódio

NBD Nucleotide Binding Domains

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR Polymerase Chain Reaction

PKA Protein Kinase A

PKC Protein Kinase C

QF-PCR Quantitative Fluorescence - PCR

R Regulatory Domain

RE Retículo Endoplasmático

SP Suficiência Pancreática


1

RESUMO

A Fibrose Cística (FC) é a doença genética autossómica recessiva mais comum

na população Caucasiana, afetando aproximadamente 1 em cada 2500 nascimentos,

com significativas variações de acordo com o grupo étnico e localização geográfica. A

FC é causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane

conductance Regulator), que resultam na perda ou diminuição do transporte de iões,

nomeadamente Cl-, mediado por este canal, através da membrana apical das células

epiteliais. Após a identificação do gene CFTR, em 1989, esperava-se que apenas um

número limitado de mutações causadoras de doença pudessem causar FC, contudo,

estão atualmente descritas cerca de 2000 variações de sequência no gene CFTR. No

entanto, é importante realçar que as consequências moleculares e funcionais de

muitas destas variações estão ainda por definir e que a maioria das mutações

identificadas são raras. De facto, menos de 10 mutações ocorrem com uma frequência

maior que 1%, sendo a mutação mais comum, F508del, responsável por

aproximadamente 66% dos pacientes com FC. Em Portugal, a prevalência da FC é

ainda desconhecida. Assim, o objetivo deste trabalho é avaliar o tipo e a frequência

das variações identificadas no gene CFTR detetadas durante o rastreio da população

portuguesa, bem como a prevalência de FC. Este estudo foi realizado a partir de

amostras de ADN, extraídas de células da mucosa bucal de 194 crianças

Portuguesas, seguido de amplificação por PCR e sequenciação direta dos 27 exões e

regiões intrónicas flanqueantes do gene CFTR. Foram identificadas 39 diferentes

variações de sequência, das quais 17 correspondem a variações de sequência

associadas a FC ou CFTR-RD e as restantes 22 a polimorfismos. A variação de

sequência mais comum foi a variante IVS8T5, com uma frequência alélica de 3,1%,

seguida do alelo complexo G576A-R668C com uma frequência alélica de 1,5% e das

variações de sequência V754M e L997F com uma frequência alélica de 1,3%. A

mutação causadora de FC, F508del, foi encontrada em duas amostras, apresentando

uma frequência alélica de 0,5%. Foram ainda observadas cinco amostras com duas

variações de sequência: uma criança do sexo masculino com o genótipo

F508del/F1052V, que em heterozigotia composta pode resultar num fenótipo de FC

clássica e quatro crianças, três do sexo masculino e uma do sexo feminino com os

genótipos G576A-R668C/L997F, R297Q/E725K, IVS8T5(TG)12/S1235R e

IVS8T5(TG)12/L967S, respetivamente, que em heterozigotia composta pode resultar

num fenótipo de CFTR-RD. De acordo com os resultados obtidos, a frequência de

portadores de uma mutação é de 18,6% (36/194) e a prevalência de FC, nesta


2

população em estudo, é de 0,5% (1/194). Com o presente trabalho esperamos

determinar a prevalência de FC, bem como contribuir para um melhor conhecimento

do espetro de variações de sequência na população Portuguesa, com vista a melhorar

o diagnóstico de FC.

Palavras-chave: Fibrose Cística, CFTR, CFTR-Related Disorders, Variações de

Sequência.


3

ABSTRACT

Cystic Fibrosis (CF) is the most common autossomal recessive genetic disease

in the Caucasian population, affecting approximately 1 in every 2500 births, with

significant variations according to ethnic group and geographical location. CF is caused

by mutations in the CFTR gene (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance

Regulator), that result in loss or reduction in ion transport, in particular Cl-, mediated by

the CFTR channel across the apical membrane of epithelial cells. After the CFTR gene

identification in 1989, it was expected that only a limited number of mutations could

cause CF, however, almost 2000 different sequence variants have already been

reported in the CFTR gene. Nonetheless, the molecular and functional consequences

of many of these sequence variations are still unknown and the majority of mutations

identified are rare. In fact, less than 10 mutations occur with a frequency greater than

1%, being the most common mutation, F508del, responsible for approximately 66% of

patients with CF. In Portugal, the prevalence of CF is still unknown. So, the aim of this

work is to investigate the type and frequency of sequence variations in the CFTR gene,

by screening a random sample of the pediatric Portuguese population and to determine

the prevalence of CF. This study was performed in DNA samples, extracted from

buccal mucosa cells of 194 children of the Portuguese population, followed by PCR

amplification and direct sequencing of 27 exons and flanking intronic regions of the

CFTR gene. We identified 39 different sequence variations, of which 17 correspond to

sequence variations associated with CF or CFTR-RD and the remaining 22

corresponds to polymorphisms. The most frequent sequence variation was IVS8T5,

with an allelic frequency of 3,1%, followed by the G576A-R668C complex allele with an

allelic frequency of 1.5% and V754M and L997F sequence variations with an allelic

frequency of 1.3%. The F508del mutation was found in two samples, with an allelic

frequency of 0.5%. It was also detected five samples with two sequence variations: a

boy with the genotype F508del/F1052V, that in compound heterozygosity can lead to a

classic CF and four children, three boys and one girl, with the genotypes G576A-

R668C/L997F, R297Q/E725K, IVS8T5(TG)12/S1235R and IVS8T5(TG)12/L967S,

respectively, that in compound heterozygosity can lead to a CFTR-RD. According to

the results obtained, the carrier’s frequency is 18,6% (36/194) and the prevalence of

CF, in the studied population, is 0,5% (1/194). With the present results we expect to

determine the CF prevalence, as well as to contribute for a better knowledge of the

spectrum of the CFTR gene sequence variations in Portuguese population, which will

improve the CF diagnosis in these patients.


4

Key-words: Cystic Fibrosis, CFTR, CFTR-Related disorders, Sequence

variations.

INTRODUÇÃO


6

1. INTRODUÇÃO

1.1. FIBROSE CÍSTICA

A Fibrose Cística (FC, MIM 219700) é a doença genética autossómica recessiva

mais frequente e grave na população Caucasiana. Esta doença conduz a uma

significativa morbidade e mortalidade, em que a idade média de sobrevida é cerca de

37 anos (Collaco & Cutting, 2008, Cystic Fibrosis Fundation, 2012). De acordo com

diversos estudos efetuados, a FC afeta 1 em cada 2500 recém-nascidos e 1 em cada

25 indivíduos é portador assintomático de uma mutação no gene da FC (Thompson et

al., 2002, Walters & Mehta, 2007) (Figura 1).

Figura 1 - Número de pessoas com FC. O número de adultos com FC é crescente, em relação ao número de

crianças. Os dados mostram que atualmente existem mais pessoas com FC em idade adulta. Em 2001, a

pessoa mais velha com FC tinha 74 anos de idade, enquanto em 2011, a pessoa mais velha tinha 81 anos.

Adaptado de Cystic Fibrosis Fundation, 2012.

1.1.1. PERSPETIVA HISTÓRICA

No século XIX, Carl von Rokitansky descreveu um caso de morte fetal com

peritonite meconial, uma complicação do íleo meconial associado com FC. O íleo

meconial foi descrito pela primeira vez em 1905 por Karl Landsteiner (Busch, 1991).

Em 1936, Guido Fanconi descreveu uma ligação entre a doença celíaca, a FC do

pâncreas e bronquiectasias (Fanconi et al., 1936).

Em 1938, Dorothy Hansine Andersen publicou o artigo "A Fibrose Cística do

Pâncreas e a sua Relação com a Doença Celíaca: um Estudo Clínico e Patológico", no

American Journal of Diseases of Children. Andersen foi a primeira médica a

caracterizar a FC do pâncreas e a relacioná-la com a doença pulmonar e intestinal


7

característica da FC. Foi também a primeira pessoa a propor a FC como uma doença

recessiva e a utilizar a reposição enzimática pancreática no tratamento de crianças

afetadas (Andersen, 1938, Welsh et al., 2001). Farber, em 1945, reconheceu a

implicação do muco viscoso na manifestação dos sintomas, denominando-o como

mucoviscidose. A perda aguda de sal causada por uma excessiva sudorese em bebés

com FC, durante as ondas de calor em 1953, foi demonstrada por Di Sant’Agnese

permitindo o posterior desenvolvimento do teste de suor, ainda hoje utilizado no

rastreio de FC (Di Sant'Agnese et al., 1953, Welsh et al., 2001).

Em 1985, foi descrita a localização do gene responsável pela FC no braço longo

do cromossoma 7 (Knowlton et al., 1985, Tsui et al., 1985). Francis Collins, Lap-Chee

Tsui e John R. Riordan, em 1988, identificaram a primeira mutação no gene da FC -

F508del. Em 1989, Lap-Chee Tsui e colaboradores descobriram o gene responsável

pela FC e aperceberam-se que a proteína resultante constituía um canal de Cl- ou um

regulador deste eletrólito, sendo denominado de Cystic Fibrosis Transmembrane

conductance Regulator (CFTR).

1.1.2. INCIDÊNCIA

A FC é a patologia genética autossómica recessiva mais comum em populações

descendentes do Norte da Europa, ocorrendo em aproximadamente 1 em cada 2500

nascimentos e 1 em cada 20-30 são portadores assintomáticos de uma mutação no

gene CFTR. No entanto, a prevalência de FC varia de acordo com a localização

geográfica e antecedentes étnicos (Tabela I; Figura 2). Por exemplo, a doença

manifesta-se em cerca de 1 em 3000-3500 na população branca americana, 1 em

4000-10000 em latino-americanos e 1 em 15000-20000 nos afro-americanos (Walters

& Mehta, 2007, O'Sullivan & Freedman, 2009, Salvatore et al., 2011).

Não existem dados concretos relativamente à prevalência da doença no norte de

África, contudo alguns estudos reportam a presença de mutações frequentes na

Europa, o que sugere uma elevada influência geográfica. No sul de África, estima-se

uma frequência de portadores de 1 em 42 indivíduos e que 1 em 7056 apresentem FC.

A incidência da FC no Médio Oriente varia de acordo com os antecedentes étnicos e

grau de consanguinidade da população, contudo, estima-se que 1 em 2500-15800

sejam diagnosticados com a doença. A FC é normalmente rara na Ásia, com uma

prevalência de 1 em 4000-100000 nascimentos na Índia e 1 em 100000-350000 no

Japão. Na Oceânia, a elevada prevalência desta patologia está relacionada com a

emigração de europeus para esta região (WHO, 2004, Walters & Mehta, 2007).


8

Figura 2 – Incidência mundial da FC. Adaptado de WHO, 2004.

Tabela I – Incidência Mundial da FC.

Adaptado de WHO, 2004, Walters & Mehta, 2007, Farrell, 2008, Salvatore et al., 2011.

Continente País Incidência

Europa

Finlândia 1:25000

Polónia 1:6000

Holanda 1:4750

Dinamarca 1:4700

França 1:4600

Suécia 1:2200-4500

Itália 1:4200

Espanha 1:3500

Portugal 1:3000

Reino Unido 1:2500

Irlanda 1:1800

América do Norte Estados Unidos

1:3000-3500 (Caucasianos)

1:4000-10000 (Latino-americanos)

1:15000-20000 (Afro-americanos)

Canadá 1:3600

América do Sul

Equador 1:11252

México 1:8500

Brasil 1:6900

Cuba 1:3900

África África do Sul 1: 2000 (Brancos)

1:12000 (Cor)

Ásia

Japão 1:100000-355000

Índia 1:40000-100000

(Judeus Asknazi e árabes) 1:1800-4000

Oceânia Austrália 1:2900

Nova Zelândia 1:3200


9

Em Portugal, estima-se que 1 em cada 3000 recém-nascidos apresente FC e

que 1 em 25 seja portador assintomático de uma mutação. No entanto, Lemos et al.

(2010) descreveram uma prevalência de 1 em 14000 indivíduos com a doença na

região centro do país, de acordo com os registos de pacientes obtidos entre 1970 e

2008 nos dois centros de diagnóstico dessa região (Lemos et al., 2010). Entre 1992 e

1995, foi realizado um rastreio pré-natal experimental pelo teste do tripsinogénio

imunorreativo (IRT), verificando-se uma incidência da doença de 1 em 10000 recém-

nascidos nos distritos do Porto e Coimbra (Vilarinho et al., 2006).

1.1.3. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

A FC conduz a alterações patológicas de órgãos que expressam a proteína

CFTR nas células epiteliais, nomeadamente as vias respiratórias (incluindo os seios

nasais e os pulmões), o trato gastrointestinal (incluindo o pâncreas e o sistema biliar),

as glândulas sudoríparas e o sistema geniturinário (Huffmyer et al., 2009).

A elevada morbilidade e mortalidade resultam do comprometimento do sistema

de defesa pulmonar, conduzindo a infeções crónicas e inflamações das vias aéreas.

Infeções persistentes, nomeadamente com Pseudomonas aeruginosa e

Staphylococcus aureus, causam uma produção crónica de expetoração, obstrução das

vias aéreas e eventualmente, bronquiectasias e destruição pulmonar. A insuficiência

pancreática exócrina, que ocorre em aproximadamente 85% dos pacientes, conduz a

uma má absorção de gordura, esteatorreia e défice ponderal. Ao nível gastrointestinal,

o íleo meconial, presente em aproximadamente 10 a 20% dos recém-nascidos, é

muitas vezes marcador de diagnóstico da doença. No que diz respeito à fertilidade,

quase todos os homens com FC são inférteis devido a malformações congénitas no

sistema reprodutor. Outras características da doença incluem cirrose biliar, reduzida

fertilidade nas mulheres, formação de pólipos nasais e diabetes (Welsh et al., 2001,

Huffmyer et al., 2009, O'Sullivan & Freedman, 2009). Estas manifestações clinicas da

FC encontram-se sumarizadas na Tabela II.


10

Tabela II – Manifestações clínicas da FC.

Adaptado de Huffmyer et al., 2009.

De acordo com os dados do relatório anual da Fundação Fibrose Cística, a idade

média de sobrevida dos pacientes aumentou de 25 anos em 1985 para 37 anos em

2011 (Figura 3) (Cystic Fibrosis Fundation, 2012). Este aumento observado prende-se

com uma melhor visão do curso natural da doença, conduzindo a tratamentos que

visam as infeções respiratórias, inflamações e estado nutricional (Cohen-Cymberknoh

et al., 2011).

Pulmões

Hipertrofia das células calciformes, secreções mucosas viscosas com

transporte mucociliar

Atelectasia, inflamação das vias aéreas, e hipoxia crónica

Colonização com Pseudomonas, Staphylococcus aureus, Haemophilus

influenza e outros

Doença obstrutiva das vias aéreas

Vias aéreas superiores Pólipos nasais

Hipertrofia e hiperplasia da mucosa nasal

Pâncreas

Deficiência pancreática exócrina: redução do volume e pH das secreções,

retenção de enzimas digestivas, autodigestão pancreática conduz a má

absorção de gordura e de proteínas

Doença pancreática endócrina: CF-related diabetes mellitus (CFRD)

Fígado/Bílis

Testes de função hepática anormais

Infiltração de gorduras no fígado

Cirrose

Associação com carcinoma hepatocelular

Colelitíase e colecistite

Alteração do metabolismo hepático

Trato Gastrointestinal

Síndrome de obstrução intestinal distal (DIOS): episódios recorrentes de

obstrução intestinal, dor abdominal, distensão, náuseas, vómitos e

obstipação

Doença Óssea Baixa densidade mineral óssea

Aumento da incidência de fraturas

Sistema Geniturinário

Início tardio da puberdade em homens e mulheres

Infertilidade masculina, devido à ausência congénita bilateral dos canais

deferentes e azoospermia obstrutiva

Anatomia feminina normal, mas o muco cervical persistente pode resultar

em diminuição da fertilidade

Ciclos menstruais normais ou quase normais


11

Figura 3 - Idade média de sobrevida de doentes com FC. Adaptado de Cystic Fibrosis Fundation, 2012.

1.1.4. FC CLÁSSICA

A maioria das crianças com FC apresenta infeções pulmonares crónicas e

recorrentes, esteatorreia e défice de crescimento. A insuficiência pancreática encontra-

se presente em aproximadamente 85% dos indivíduos afetados. O diagnóstico é

confirmado tipicamente por um teste de suor elevado (> 60 mmol/L) bem como pela

identificação de duas mutações CFTR. Aproximadamente 70% dos indivíduos

afetados apresentam uma cópia da mutação F508del, sendo que cerca de 25% são

homozigóticos para esta mutação (Paranjape & Zeitlin, 2008).

1.1.5. CFTR-RELATED DISORDERS (CFTR-RD)

Os indivíduos que apresentam um fenótipo de FC monossistémica e um teste de

suor normal (< 40 mmol/L) ou no limite (40-60 mmol/L), são descritos como tendo uma

forma não clássica da doença. Esta condição é agora descrita como uma doença

associada a alterações da proteína CFTR (CFTR-RD). Geralmente, estes pacientes

têm suficiência pancreática (SP) e alterações pulmonares variáveis (comparativamente

com a forma clássica de FC) e são portadores de duas mutações CFTR, sendo que

pelo menos uma delas resulta numa expressão e função parcial da proteína. Os

sintomas de CFTR-RD normalmente apresentam-se com menor gravidade durante a

infância, tornando-se clinicamente mais significativos após a primeira década de vida e

durante a idade adulta. Os pacientes podem apresentar, alternativamente, apenas

sintomas monossistémicos, tais como cirrose biliar, pancreatites recorrentes, sinusites

crónicas, pólipos nasais ou infertilidade secundária devido à ausência congénita

bilateral de canais deferentes (CBAVD) (WHO, 2004, Paranjape & Zeitlin, 2008).


12

A CBAVD ocorre com uma frequência aproximada de 1-2% nos homens inférteis

e é responsável por cerca de 6% dos casos de azoospermia obstrutiva. A variante

IVS8T5 pode ser considerada uma mutação causadora de CBAVD apresentando no

entanto uma penetrância variável (Grangeia et al., 2005). Esta variante apresenta uma

frequência de 5% na população caucasiana, aumentando para 25% em pacientes com

CBAVD. Quando detetada em combinação com outra ou outras variantes que

reduzam a quantidade de proteína funcional pode causar um fenótipo de CFTR-RD

(WHO, 2004).

Doença pulmonar moderada e bronquiectasias idiopáticas em pacientes mais

velhos podem sugerir um fenótipo de CFTR-RD sendo assim necessária a realização

de um teste de suor, avaliação da função da proteína CFTR e análise genética,

particularmente para mutações moderadas no gene CFTR (Paranjape & Zeitlin, 2008).

1.2. GENE CFTR

1.2.1. IDENTIFICAÇÃO

Como não foram encontradas anomalias cromossómicas estruturais envolvidas

na FC, foi efetuada clonagem posicional usando o mapeamento genético posicional

para localizar e clonar o gene envolvido nesta doença. Assim, procedeu-se ao estudo

de amostras de ADN de quase 50 famílias com FC para análise da ligação entre a FC

e centenas de marcadores espalhados pelo genoma, até que finalmente foi

identificada uma ligação entre a FC e os marcadores existentes no braço longo do

cromossoma 7 (Thompson et al., 2002). Estes marcadores foram os primeiros

utilizados no diagnóstico molecular da FC (Estivill et al., 1988).

Em 1989, foi efetuada a identificação do gene responsável pela FC, o gene

CFTR, bem como da principal mutação responsável pela doença, F508del, através da

combinação das técnicas de chromossome jumping, mapeamento físico, isolamento

das sequências exónicas e análise genética ( Kerem et al., 1989, Riordan et al., 1989,

Rommens et al., 1989, Cutting, 1997). A sequência de ADN complementar do gene

CFTR foi posteriormente determinada, em 1991, juntamente com a localização dos

limites intrão/exão (Zielenski et al., 1991).

A FC representa a primeira doença genética estritamente explicada pelo

processo de clonagem posicional, anteriormente denominado de genética reversa,

(Buchwald et al. 1989, Kerem et al., 1989, Riordan et al., 1989, Rommens et al.,

1989).


13

1.2.2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO

O gene CFTR está localizado na região q31.2 do cromossoma 7 e engloba

250kb de ADN genómico. É constituído por 27 exões (sequências que codificam para

uma proteína) intercalados por longas sequências intrónicas (sequências não

codificantes). Os exões eram numerados do 1 ao 24, com as subdivisões “a” e “b” para

os exões 6, 14 e 17, visto terem sido reconhecidos só depois da publicação original do

gene (Zielenski et al., 1991), contudo, atualmente, esta numeração é feita do 1 ao 27

(Cystic Fibrosis Mutation Database, 2011). O gene CFTR é transcrito num ARN

mensageiro com 6.5 kb que por sua vez é traduzido numa proteína com 1480

aminoácidos e com um peso molecular de aproximadamente 170 kDa (Figura 4)

(Riordan et al., 1989) .

Figura 4 – Representação esquemática do gene e da proteína CFTR. O gene CFTR é transcrito num ARN mensageiro de 6.5 kb que por sua vez é traduzido numa proteína com 1480 aminoácidos que se localiza na membrana apical das células epiteliais. Adaptado de Tsui & Durie, 1997.

A proteína CFTR funciona como um canal de transporte de Cl- localizado na

membrana apical das células epiteliais, regulando o movimento transepitelial de água

e solutos devido à translocação mediada de Cl- através da membrana plasmática

(Riordan et al., 1989).


14

1.2.3. ESPETRO DE MUTAÇÕES

A FC é uma doença autossómica recessiva, resultando de mutações num único

gene. Desde a descoberta do gene CFTR e da mutação F508del, em 1989, foram

encontradas cerca de 2000 outras variações de sequência neste gene (Cystic Fibrosis

Mutation Database, 2011). Investigações anteriores evidenciam que as mutações

causadoras de FC existem desde o período Paleolítico (50000 anos), e muitas estão

fortemente associadas com populações derivadas da Europa (Morral et al., 1994).

Estas mutações encontram-se localizadas ao longo de toda a região codificante do

gene e também na região do promotor. No entanto, existem regiões onde as mutações

são mais comuns, tais como os domínios de ligação de nucleótidos (NBD) e o domínio

regulador (R) e que correspondem a domínios ou aminoácidos importantes ao nível

funcional e estrutural da proteína (Rowntree & Harris, 2003).

A maior parte das variações de sequência estão associadas a doença, enquanto

as restantes são classificadas como polimorfismos. A grande maioria destas variações

associadas a doença correspondem a variações pontuais que afetam apenas um ou

poucos nucleótidos. E apenas 1% corresponde a rearranjos genómicos, como

deleções e inserções que afetam centenas ou milhares de pares de bases (Welsh et

al., 2001). Do total de mutações, 40,26% são missense (conduzem à substituição de

um aminoácido), 15,88% são frameshift (pequenas deleções ou inserções que alteram

a grelha de leitura), 11,65% são mutações que afetam o local de splicing e 8,3% são

nonsense (originam codões de terminação prematuros). Das restantes alterações no

gene CFTR, 13,87% correspondem a variações de sequência (polimorfismos), 1,96%

corresponde a inserções/deleções in frame, 0,77% são ao nível da região promotora e

4,79% correspondem a alterações ainda desconhecidas (Cystic Fibrosis Mutation

Database, 2011). Embora extremamente raros, têm existido alguns casos reportados

de FC associados a uma dissomia uniparental do cromossoma 7 (Hehr et al., 2000, Le

Caignec et al., 2007).

Em todo mundo, menos de 20 mutações CFTR apresentam uma frequência

superior a 0,1%, sendo que estas frequências variam entre diferentes regiões

geográficas e grupos étnicos (Bobadilla et al., 2002). A mutação F508del é a mutação

CFTR mais comum na população caucasiana, sendo encontrada em

aproximadamente dois terços dos indivíduos diagnosticados com FC. Esta mutação

está virtualmente ausente nas populações nativas de África e Ásia, embora exista com

uma frequência considerável em populações mistas, tais como os afro-americanos. Na

Europa, esta mutação apresenta um evidente gradiente na sua frequência, sendo mais

elevada a noroeste (88% na Dinamarca) e mais reduzida a sudeste (25% na Turquia)


15

tal como se verifica na prevalência da FC e demonstrado em estudos anteriores

(Estivill et al., 1997, Welsh et al., 2001, Bobadilla et al., 2002). A mutação F508del

consiste na deleção de 3 nucleótidos CTT na posição 1521 do gene CFTR e envolve

os aminoácidos Isoleucina (Ile) e Fenilalanina (Phe) nas posições 507 e 508,

respetivamente. Esta alteração conduz à deleção do aminoácido Phe e à substituição

sinónima da Ile, alterando a função do domínio NBD1 e por conseguinte o misfolding

da proteína, levando à sua degradação (Bartoszewski et al., 2010).

A maioria das outras mutações CFTR é muito rara ou restrita a uma área

geográfica especifica. Apenas 4 mutações, G542X, G551D, N1303K e W1282X,

apresentam uma frequência superior a 1%. Muitas das outras mutações são

exclusivas de um indivíduo ou família em particular ou então encontradas em apenas

alguns casos em todo o mundo (Rowntree & Harris, 2003). Mutações de novo no gene

CFTR são extremamente raras (Cremonesi et al., 1996).

Segundo Lemos et al. (2010), em Portugal, a frequência da mutação F508del é

de 69%, aproximando-se da frequência encontrada em países da Europa do Norte e

Central, enquanto a mutação R334W, a segunda mais comum no nosso país,

apresenta uma frequência de 12,8% (Lemos et al., 2010).

1.2.4. CLASSES DAS MUTAÇÕES CFTR

Os efeitos das mutações CFTR são expressos sob vários mecanismos

moleculares que incluem a ausência de produção da proteína CFTR, a produção de

uma proteína mutante com uma atividade reduzida ou não funcional na membrana

apical das células epiteliais (Welsh et al., 2001). Assim, foi possível classificar as

diferentes mutações de acordo com o impacto quantitativo e/ou qualitativo que

apresentam ao nível celular. Inicialmente, Zielenski e Tsui, (1995) propuseram 5

classes de mutações CFTR, contudo, atualmente são consideradas 6 classes

(Zielenski & Tsui, 1995, Kreindler, 2010) (Tabela III; Figura 5).

Classe I: pertencem a esta classe todas as mutações que afetam a biossíntese

da proteína CFTR e inclui as mutações que causam os fenótipos de FC mais graves.

Estas mutações são normalmente nonsense, frameshift, mutações que alteram o local

de splicing ou mutações que alteram o codão de iniciação da tradução. Resultam na

produção de uma proteína pouco estável ou truncada devido à presença de um codão

de terminação prematuro. As proteínas truncadas são, normalmente, instáveis e

reconhecidas por proteínas chaperones no retículo endoplasmático (RE) que as

degradam rapidamente. Desta forma, não se observa proteínas CFTR na membrana


16

celular (Zielenski, 2000, Rowntree & Harris, 2003, Culling & Ogle, 2010, Kreindler,

2010, Rogan et al., 2011).

Tabela III – Diferentes classes de mutações do gene CFTR.

Classe Efeito Efeito na

proteína CFTR

Exemplos de

mutações

Mecanismo

mutacional

I Ausência de proteína CFTR na

membrana apical

Síntese anormal

de proteína

c.1624G>T (G542X)

c.3846G>A (W1282X)

c.1585-1G>A

Nonsense

Frameshift

Splice

II Ausência de proteína CFTR na

membrana apical

Processamento e

tráfego anormal

F508del

c.3909C>G (N1303K)

c.3773_3774insT

Missense

Deleção de

aminoácidos

III

Quantidades normais de

proteína CFTR não funcional na

membrana apical

Regulação

defetiva

c.1652G>A (G551D)

c.1679G>C (R560T)

c.1475C>T (S492F)

Missense

IV

Quantidade normal de proteína

CFTR com função residual na

membrana apical

Redução da

condutância

c.350G>A (R117H)

c.1040G>C (R347P)

c.1000C>T (R334W)

Missense

V

Quantidade reduzida de

proteína CFTR funcional na

membrana apical

Redução de

síntese/tráfego

IVS8T5

c.1364C>A (A455E)

c.3717+12191C>T

Missense

Splice

VI Proteína CFTR funcional mas

instável na membrana apical

Diminuição da

estabilidade

c.4234C>T (Q1412X)

c.4196_4197delTC

c.4147_4148insA

Nonsense

Frameshift

Adaptado de O'Sullivan & Freedman, 2009, Culling & Ogle, 2010, Rogan et al., 2011.

Classe II: as mutações que pertencem a esta classe estão associadas com um

processamento anormal da proteína devido a um misfolding incorreto. As proteínas

imaturas traduzidas ficam retidas no RE e como tal não passam para o aparelho de

Golgi para serem glicosiladas, havendo uma falha de proteínas funcionais na

membrana. Estas proteínas anormais saem diretamente do RE para o citosol para

serem degradadas no proteossoma. Devido à ausência de proteínas na membrana, as

mutações desta classe estão associadas a fenótipos de FC graves ( Zielenski, 2000,

Rowntree & Harris, 2003, Culling & Ogle, 2010, Kreindler, 2010).

Classe III: mutações que causam uma regulação anormal do canal de Cl-. As

mutações no gene CFTR pertencentes a esta classe estão localizadas nos domínios

NBD1 e NBD2 da proteína, impedindo a ligação de ATP a estes domínios e a sua

hidrólise, necessária para a ativação do canal. Estas mutações podem ainda afetar a

regulação de outros canais (como o canal de potássio ROMK2). Este é um exemplo de

um mecanismo mutacional que afeta algumas funções reguladoras do gene CFTR

para além da sua função de transporte de cloro. Estas mutações têm sido associadas

a fenótipos graves de FC (Zielenski, 2000, Rowntree & Harris, 2003, Culling & Ogle,

2010, Kreindler, 2010, Rogan et al., 2011).


17

Classe IV: as mutações associadas a esta classe incluem os casos em que o

gene codifica uma proteína CFTR que é corretamente traduzida, processada,

transportada e inserida na membrana apical e que responde a estímulos, contudo, a

condutância de Cl- é reduzida. Estas mutações (geralmente missense) estão

localizadas nos domínios transmembranares (Membrane-spanning domains – MSD)

que participam na formação do canal iónico. Assim, quando existe uma mutação desta

classe, há uma diminuição do fluxo iónico. O fenótipo de FC associado a esta classe é

moderado com suficiência pancreática (Zielenski & Tsui, 1995, Zielenski, 2000,

Rowntree & Harris, 2003, Culling & Ogle, 2010, Kreindler, 2010).

Classe V: as mutações pertencentes a esta classe conduzem a uma produção

de proteínas normais mas em níveis reduzidos devido a uma desregulação da

transcrição e estão associadas a um fenótipo de FC moderado. Incluem-se aqui as

mutações no promotor que reduzem a transcrição, splicing alternativo e uma

maturação ineficiente da proteína. Um splicing anormal pode resultar em ausência de

ARN mensageiro normal ou em níveis muito baixos, variando entre pacientes e

mesmo entre órgãos de um mesmo paciente (Zielenski & Tsui, 1995, Zielenski, 2000,

Culling & Ogle, 2010, Rogan et al., 2011).

Classe VI: esta classe inclui as mutações que diminuem a estabilidade da

proteína CFTR, tais como mutações nonsense ou frameshift que causam a deleção

dos últimos 70-98 bp da zona C-terminal da proteína, e mutações que afetam a

regulação de outros canais. As mutações desta classe estão associadas a um fenótipo

grave de FC (Haardt et al., 1999, Zielenski, 2000, Kreindler, 2010).

As classes I, II, III e VI estão associadas a um fenótipo de insuficiência

pancreática (IP), enquanto os pacientes com mutações das classes IV e V apresentam

SP (Ratjen & Doring, 2003). Até agora, o conhecimento da mutação genética era de

utilidade clínica limitada, contudo, esta perspetiva foi alterada devido ao recente

desenvolvimento de novas terapias focadas em aspetos específicos da disfunção da

proteína CFTR. A compreensão detalhada das anomalias genéticas subjacentes é,

portanto, essencial para definir os melhores alvos para terapias (Ratjen, 2007, Ratjen,

2009).


18

Figura 5 – Mecanismos mutacionais que alteram o normal funcionamento da proteína CFTR. Adaptado de Lubamba et al., 2012.

1.2.5. POLIMORFISMOS CFTR

Polimorfismos são definidos como variações de sequência que não conduzem a

uma patologia e que ocorrem com uma frequência superior a 1% na população geral.

Até à data, encontram-se descritos mais de 250 polimorfismos no gene CFTR

(Castellani et al., 2008, Cystic Fibrosis Mutation Database, 2011). Cerca de 55%

destes polimorfismos ocorrem em regiões codificantes do gene CFTR, metade dos


19

quais resultam em substituições de aminoácidos. Contudo, alguns polimorfismos no

locus CFTR poderão potenciar alterações na expressão/função do gene CFTR (Welsh

et al., 2001, Rowntree & Harris, 2002). Por exemplo, alguns polimorfismos podem

estar localizados em regiões que regulam a expressão do gene CFTR, podendo

modificar a ligação de fatores de transcrição a estes locais, alterando a gravidade do

fenótipo da FC. Os indivíduos saudáveis podem tolerar estes polimorfismos pois

apresentam um alelo normal que produz proteína CFTR funcional. Contudo, um

individuo que seja portador de uma mutação causadora de FC num alelo, produzindo

proteína CFTR não funcional, e um polimorfismo relevante no outro alelo, encontra-se

sujeito a uma redução da atividade transcricional do alelo não mutado, podendo

apresentar um fenótipo moderado ou atípico de FC (Rowntree & Harris, 2002,

Rowntree & Harris, 2003).

Os polimorfismos IVS8(TG) e M470V, localizados no intrão 8 e exão 10,

respetivamente, influenciam a penetrância da variante IVS8T5 no splicing do exão 9.

Um maior número de repetições TG no intrão 8 ou/e a variante V470 estão associados

a um aumento da proporção de transcritos sem o exão 9 (Cuppens et al., 1998, de

Meeus et al., 1998, Grangeia et al., 2004, Groman et al., 2004).

1.2.6. ALELOS COMPLEXOS

Os alelos complexos são constituídos por duas ou mais variações de sequência

do gene CFTR presentes no mesmo alelo, ou seja em cis (CFTR2@Johns Hopkins,

2013). Embora a maioria dos alelos complexos representem a associação, no mesmo

cromossoma, de uma variação de sequência polimórfica e uma mutação causadora de

doença, existem alguns casos em que o polimorfismo pode modular o efeito da

mutação principal e consequentemente a gravidade clínica do fenótipo. Um exemplo é

o polimorfismo S912L que altera o efeito da mutação G1244V quando combinados em

cis (Clain et al., 2005). Noutros casos, pode ocorrer a associação em cis de duas ou

três mutações moderadas, como R347H-D979A, em que ocorre a combinação do

efeito das duas mutações, conduzindo a uma drástica diminuição no transporte de Cl-

(Clain et al., 2001) e D443Y-G576A-R668C, característica de pacientes com CFTR-

RD, nomeadamente CBAVD (El-Seedy et al., 2012). Os alelos complexos contribuem

para a dificuldade na determinação das mutações causadoras de FC, visto que os

investigadores não podem ter a certeza de qual das variações de sequência causa a

doença (CFTR2@Johns Hopkins, 2013).


20

1.2.7. CORRELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO

A FC é uma doença altamente heterogénea, com uma considerável variabilidade

na gravidade e velocidade de progressão nos diferentes órgãos (Castellani et al.,

2008). A maior variabilidade verifica-se ao nível do sistema respiratório, seguido da

função pancreática, envolvimento das glândulas sudoríparas e infertilidade masculina

(Culling & Ogle, 2010).

As classes de mutações apresentadas na Tabela III fornecem uma útil

informação sobre a gravidade da mutação, contudo não funcionam como uma

ferramenta para previsão de prognósticos individuais. Normalmente, os pacientes

homozigóticos ou heterozigóticos compostos para mutações pertencentes às classes I,

II, III e VI (também denominadas de mutações graves) tendem a apresentar IP,

elevada frequência de íleo meconial, mortalidade prematura, deterioração precoce e

grave da função respiratória, maior incidência de desnutrição e doença hepática grave.

Os indivíduos portadores de pelo menos uma mutação pertencente às classes IV e V

(denominadas de mutações moderadas) apresentam, normalmente, doença pulmonar

moderada, SP, vivendo até uma idade mais avançada (McKone et al., 2003, McKone

et al., 2006). Normalmente, as mutações das classes IV e V são fenotipicamente

dominantes quando ocorrem em combinação com as mutações das classes I a III e VI

(Castellani et al., 2008).

Por exemplo, doentes heterozigóticos compostos para as mutações

F508del/A455E apresentam uma melhor função pulmonar que os indivíduos

homozigóticos F508del/F508del. Em indivíduos com uma ou duas mutações R117H, a

gravidade da doença pulmonar é afetada pela presença de variações na sequência

poly-T do intrão 8. Assim, indivíduos com a variante 5T, presente em cis com a

mutação R117H num dos alelos, e com outra mutação causadora de FC, no outro

alelo, desenvolvem doença pulmonar; enquanto que os indivíduos com a variante 7T,

em cis com a mutação R117H num dos alelos, e com outra mutação causadora de FC,

no outro alelo, apresentam um fenótipo muito variável, desde a ausência de sintomas,

a doença pulmonar moderada (Tabela IV). Como as mutações A455E e R117H estão

associadas a SP, a presença de doença pulmonar menos grave, em indivíduos com

estas mutações, pode ser consequência de um melhor estado nutricional (Moskowitz

et al., 2008).


21

Tabela IV – Correlações genótipo-fenótipo CFTR.

Alelo 1 Alelo 2 Variedade de Fenótipos

Gravea

Grave Clássico >> Não clássico

Moderadoa

Grave ou moderado Não clássico > Clássico

R117H/5T Grave ou moderado Não clássico > Clássico

R117H/7T Grave ou moderado Mulheres assintomáticas ou CBAVD > Não clássico

5T/TG13 ou TG12 Grave ou moderado CBAVD ou Não clássico >> Portador assintomático

5T/TG11 Grave ou moderado Assintomático > CBAVD

7T ou 9T Grave ou moderado Assintomático

7T ou 9T 7T ou 9T Assintomático

aGrave refere-se às classes de mutações I-III e VI; moderado refere-se às classes de mutações IV e V, excluindo a

mutação R117H e a variante 5T. Adaptado de Moskowitz et al., 2008.

O impacto dos genótipos CFTR tem sido também analisado para outros órgãos,

como as glândulas sudoríparas, através da medição da concentração de Cl- no suor,

em pacientes com diferentes mutações CFTR. Os pacientes foram analisados de

acordo com as classes de mutações ou genótipos específicos, o que revelou que

determinados alelos com mutações moderadas (R117H, A455E, 3849+10kb C>T)

pertencentes às classes IV e V, tendem a ser associados a níveis significativamente

mais baixos de Cl- no suor do que os alelos com mutações mais graves (F508del,

621+1 G>T, G542X, R553X). No entanto, observa-se que estas concentrações, apesar

de elevadas, variam conforme a mutação em causa (Wilschanski et al., 1995,

Zielenski, 2000). Relativamente à CBAVD, esta resulta, geralmente, da combinação de

uma mutação CFTR grave com uma mutação moderada ou com a variante 5T no

outro alelo. Contudo, pode existir uma sobreposição entre o fenótipo de CBAVD e um

fenótipo moderado de FC, com uma pequena fração de indivíduos com CBAVD a

apresentarem problemas respiratórios. A variante 5T pode também estar associada a

doença pulmonar em mulheres adultas com sintomas semelhantes a FC (Moskowitz et

al., 2008).

A heterogeneidade fenotípica da FC, observada em indivíduos com genótipos

semelhantes, sugere que existem mais fatores envolvidos na determinação do fenótipo

para além do fator genótipo CFTR, como por exemplo fatores ambientais (estado

socioeconómico, tabaco e outros poluentes, exposições infeciosas, autogestão da

doença e timing de diagnóstico) e outros modificadores genéticos (Rowntree & Harris,

2003, Wolfenden & Schechter, 2009).


22

Estudos anteriores têm demonstrado a ligação entre genes modificadores e a

suscetibilidade para o desenvolvimento de íleo meconial, tanto em modelos de ratinho

como em humanos, contudo, não foi reportada a influência na obstrução intestinal

verificada numa fase mais adulta do paciente (Blackman et al., 2006). Outros estudos

envolvendo gémeos e irmãos com FC, evidenciam um impacto genético significativo

na gravidade da doença pulmonar, independentemente do genótipo CFTR (Wolfenden

& Schechter, 2009).

Diversos grupos têm investigado os genes envolvidos na defesa imunológica

(inata e adquirida) e no processo de inflamação, como modificadores da doença

pulmonar em pacientes com FC (Rowntree & Harris, 2003). Um polimorfismo na região

promotora do gene tumour necrosis factor α (TNF-α) está associado a um aumento no

nível de transcrição deste gene, tendo sido demonstrada a sua associação com a

doença pulmonar grave em pacientes com FC (Hull & Thomson, 1998). Um outro

estudo, com o gene transforming growth factor β1 (TGF-β1) mostrou que uma

mutação no exão 10 deste gene está associada a um rápido declínio da função

pulmonar (Arkwright et al., 2000). Enquanto um polimorfismo localizado na região

enhancer do gene α1-antitrypsin (AAT) está associado a uma doença pulmonar

moderada (Henry et al., 2001). Variantes alélicas do gene mannose-binding lectin 2

(MBL2) estão também relacionadas com a gravidade da doença pulmonar em

pacientes com FC (Garred et al., 1999, Rowntree & Harris, 2003).

Ainda se desconhece a relevância clinica e as implicações terapêuticas dos

genes modificadores, portanto não é aconselhável a realização de testes de rotina

para os mesmos (Castellani et al., 2008).


23

1.3. PROTEÍNA CFTR

1.3.1. CLASSE, ESTRUTURA E FUNÇÃO

A proteína CFTR funciona, principalmente, como um canal de Cl- regulado por

cAMP (3’,5’-adenosina monofosfato cíclico) e a sua sequência aminoacídica, revela

uma homologia significativa com a família de transportadores ABC (ATP-Binding

Cassette) (Lubamba et al., 2012).

Após a identificação da sequência de aminoácidos da proteína CFTR, Riordan et

al, (1989) propuseram uma estrutura composta por duas unidades repetidas, cada

uma consistindo num domínio transmembranar (MSD) composto por seis hélices

transmembranares hidrofóbicas, seguido de um domínio de ligação de nucleótidos

(NBD) que interage com o ATP (Figura 6). Dez das doze hélices transmembranares

contêm um ou mais aminoácidos carregados, e nas hélices 7 e 8 encontram-se dois

potenciais locais de glicosilação. As duas unidades são ligadas por um domínio

regulador (R) que contém nove dos dez motivos consenso para a fosforilação pela

PKA (proteína cinase A) e sete locais de fosforilação da PKC (proteína cinase C). O

domínio R é exclusivo da proteína CFTR, não estando presente nos outros membros

da superfamília ABC (Riordan et al., 1989, Prasad et al., 2010, Lubamba et al., 2012).

O terminal carboxilo (composto por Treonina, Arginina e Leucina (TRL)) está

ancorado, através de interações do tipo PDZ, com o citoesqueleto e é mantido em

estreita aproximação com várias proteínas importantes (Short et al., 1998).

Os MSD são responsáveis pela formação do poro do canal através do qual o

fluxo de Cl- atravessa a membrana plasmática. Acredita-se que o fluxo de aniões é

controlado pela fosforilação do domínio R pela PKA e pela interação do ATP com os

locais NBDs, induzindo alterações de conformação da proteína, resultando na abertura

e fecho do canal (Lubamba et al., 2012). A proteína CFTR pode ter também outras

funções, como por exemplo, no transporte de bicarbonato e na interação com outras

moléculas, incluindo o canal epitelial de sódio ENaC, o que sugere um papel regulador

da proteína CFTR neste canal (Rowntree & Harris, 2003).

A proteína CFTR encontra-se, principalmente, localizada na membrana apical

das células epiteliais polarizadas, embora seja também encontrada em tecidos não

epiteliais, como os miócitos cardíacos, músculo liso e macrófagos (Lubamba et al.,

2012).


24

Figura 6 – Representação esquemática da proteína CFTR. Adaptado de Prasad et al., 2010.

1.4. DIAGNÓSTICO E RASTREIO DE FC

O diagnóstico de FC deve ser estabelecido rapidamente de forma a providenciar

aconselhamento e tratamento apropriado aos doentes. A FC é diagnosticada pela

presença de pelo menos uma manifestação fenotípica (como doença pulmonar

crónica, manifestações gastrointestinais e nutricionais ou CBAVD), história familiar de

FC ou rastreio neonatal positivo, acompanhado de provas laboratoriais de disfunção

da proteína CFTR – teste de suor positivo ou diferença de potencial nasal (DPN)

positivo – ou pela identificação de duas mutações causadoras de FC em heterozigotia

composta ou homozigotia (Tabela V) (Rosenstein, 1998, Rosenstein & Cutting, 1998,

Dalcin & Abreu, 2008).

Tabela V – Critérios de diagnóstico da FC.

Manifestações de FC Prova bioquímica de disfunção CFTR

≥ 1 Manifestação fenotípica Teste de suor positivo

ou ou

Rastreio neonatal positivo mais DPN positiva

ou ou

História familiar de FC 2 mutações causadoras de FC

Adaptado de Rosenstein & Cutting, 1998.


25

1.4.1. TESTE DO SUOR

A maioria dos casos de FC pode ser diagnosticada com base nas características

fenotípicas da doença e num teste de suor aumentado. A medida de concentração de

eletrólitos no suor tornou-se o esteio do diagnóstico de FC desde o momento que o

procedimento padrão foi estabelecido por Gibson e Cooke, em 1959. A perda de

função da proteína CFTR em pacientes com FC conduz a níveis elevados de Na+ e Cl-

no suor devido à má reabsorção destes eletrólitos nos ductos sudoríparos (Dalcin &

Abreu, 2008, Farrell et al., 2008, Voter & Ren, 2008).

Este método consiste na estimulação da produção de suor, por iontoforese com

pilocarpina, sendo de seguida recolhido e analisada a sua concentração em Cl-. Os

indivíduos normais apresentam uma concentração de Cl- < 40 mmol/L. Valores entre

40 e 59 mmol/L são considerados valores intermédios, sendo necessária a sua

confirmação. Uma concentração de Cl- > 60 mmol/L é considerada elevada, sendo

diagnóstico de FC. Em crianças, este pode ser considerado positivo quando superior a

40 mmol/L, devendo ser realizado só após as primeiras 48h de vida (Voter & Ren,

2008).

1.4.2. DIFERENÇA DE POTENCIAL NASAL

O conhecimento adquirido através do estudo da função CFTR pode ser aplicado

a testes de diagnóstico como a medição do fluxo de iões transepiteliais na mucosa

nasal. O transporte de iões através da mucosa nasal gera uma diferença de potencial

(DP), que pode ser medida in vivo, apresentando os pacientes com FC um padrão

distintamente diferente dos indivíduos normais. A linha de base da DP nasal

representa um equilíbrio entre o fluxo de Na+ e Cl- através da membrana. Em

pacientes com FC, esta DP basal é muito mais elevada do que o normal, o que reflete

a impermeabilidade relativa da membrana celular ao fluxo de iões característico da

FC. A medição da DP nasal pode ser útil quando o teste de suor não é conclusivo e a

análise genética não revelou mutações (Knowles et al., 1995, Voter & Ren, 2008).

1.4.3. ANÁLISE DO GENE CFTR

A análise molecular assenta principalmente em métodos de análise direta do

gene CFTR, isto é, a deteção de mutações causadoras de doença. São utilizadas uma

grande variedade de técnicas para a identificação de variações na sequência do gene

CFTR, não havendo um padrão estabelecido. Assim, todos os métodos exigem um


26

grande conhecimento e experiência na sua execução e interpretação por parte de

cada laboratório (Dequeker et al., 2009).

Os kits comerciais disponíveis permitem detetar as mutações causadoras de FC

mais frequentes na população caucasiana. O estudo da maioria destas mutações é

recomendado pelo American College of Medical Genetics (ACMG) e pelo American

College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) (Anexo I). No caso de nenhuma

ou apenas uma mutação ser detetada através do kit comercial, pode recorrer-se a um

estudo molecular completo do gene CFTR. Normalmente, a sequenciação completa do

gene permite a análise da zona promotora e de todos os exões e regiões intrónicas

flanqueantes. Adicionalmente, pode ser também efetuada a pesquisa de rearranjos do

gene CFTR, como grandes deleções, inserções ou duplicações, pela técnica de MLPA

(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) e QF-PCR (Quantitative

Fluorescent multiplex PCR) (De Boeck et al., 2005, Dequeker et al., 2009, Culling &

Ogle, 2010).

No entanto, o uso combinado de todas estas técnicas não garante a deteção das

duas mutações causadoras de doença (em trans) de todos os pacientes; 1-5% das

mutações permanecem indeterminadas em pacientes com FC clássica e ainda mais

em pacientes com CFTR-RD. As mutações não detetadas podem estar em regiões

que não são normalmente analisadas, como os intrões ou regiões reguladoras, ou

então dever-se a mutações em genes modificadores (Dequeker et al., 2009, Culling &

Ogle, 2010).

1.4.4. RASTREIO NEONATAL

O rastreio neonatal é realizado através da medição do tripsinogénio

imunorreativo (IRT) em amostras de sangue de recém-nascidos. Uma concentração

muito elevada de IRT é sugestiva de lesões pancreáticas consistentes (mas não

especificas) de FC. Este marcador está aumentado mesmo em crianças com

mutações pertencentes às classes IV ou V e associadas a suficiência pancreática

(O'Sullivan & Freedman, 2009). Este protocolo apresenta duas fases: na primeira,

realiza-se o IRT numa amostra de sangue seco; na segunda, repete-se o IRT numa

amostra de sangue fresca recolhida após 1-2 semanas de idade (IRT/IRT), ou realiza-

se um teste de ADN para a mutação F508del (IRT/ADN). Os recém-nascidos com um

rastreio positivo são referenciados para realização de outros testes de diagnóstico

(teste de suor e/ou teste molecular do gene CFTR) (Moskowitz et al., 2008, Culling &

Ogle, 2010).


27

Vários estudos têm demonstrado que o rastreio neonatal de FC conduz a

melhores resultados nutricionais (Farrell et al., 1997, Farrell et al., 2001). Existem

ainda dados que suportam a hipótese de que o aumento do crescimento na infância,

como resultado do rastreio neonatal, conduz a uma melhoria da função pulmonar ao

longo da vida (McKay et al., 2005, O'Sullivan & Freedman, 2009). Num futuro próximo,

a junção do rastreio neonatal com as terapias génicas permitirá uma qualidade de

vida, para os doentes com FC, muito próxima da população geral.

1.5. TRATAMENTO E NOVAS TERAPIAS

Sendo a FC uma doença complexa, exige uma abordagem holística para o seu

tratamento. Contudo, apesar do grande avanço no conhecimento da doença, o

tratamento da FC continua a basear-se num tratamento sintomático e na correção das

disfunções orgânicas (Dalcin & Abreu, 2008).

Reposição enzimática pancreática: aproximadamente 90% dos pacientes com

FC apresentam graves defeitos proteicos e má absorção de gordura devido à

insuficiência pancreática que apresentam. Com a utilização de enzimas pancreáticas

exógenas, há uma melhor nutrição logo desde o início da doença. As dosagens e

formulações das enzimas pancreáticas têm sido alteradas ao longo dos anos, contudo

o princípio permanece o mesmo: a substituição da amilase, lipase e protease que um

doente com FC é incapaz de produzir adequadamente. A administração de

bloqueadores de acidez do estômago e ingestão de vitaminas lipossolúveis, proteínas

e calorias são também fundamentais para uma boa nutrição essencial a longo prazo

(Davis, 2006, Moskowitz et al., 2008, Kreindler, 2010).

Doença pulmonar: a doença pulmonar na FC é descrita como um ciclo vicioso de

retenção de muco, infeção, inflamação e lesões nos tecidos, existindo diversas

terapias para cada fase deste processo. O muco produzido nos doentes com FC é

mais viscoso, bloqueando os pulmões e criando um ambiente propício a infeções.

Para tratar a acumulação de muco, existem diversos métodos mecânicos (como o

método de Ketchup-bottle ou dos coletes mecânicos) bem como terapias

farmacológicas, que passam pela administração de broncodilatadores que ajudam na

desobstrução das vias aéreas; ou DNase humana recombinante que funciona como

um agente mucolítico, degradando o ADN libertado pelos neutrófilos nas vias aéreas.

Para os doentes com FC em condições mais saudáveis é recomendada a prática de

exercício aeróbico. Relativamente às infeções bacterianas, existe uma administração


28

constante de antibióticos orais e/ou intravenosos (nomeadamente azitromicina em

pacientes infetados com Pseudomonas), anti-inflamatórios e corticosteroides com o

objetivo de aumentar a função pulmonar dos doentes com FC. Está descrito que uma

intensa terapia supressiva na infância, antes de estar estabelecida uma infeção

crónica, permite uma qualidade de vida muito superior. Quando a lesão é irreversível e

os pulmões colapsam, a única hipótese é o transplante pulmonar (Davis, 2006, Dalcin

& Abreu, 2008, Moskowitz et al., 2008, Kreindler, 2010).

Novas terapias: existem em desenvolvimento duas abordagens principais para o

tratamento da FC. A primeira, a terapia génica que assenta na inserção de uma cópia

funcional do gene CFTR nas células epiteliais dos tecidos mais afetados pela FC.

Diversos estudos efetuados descrevem esta transferência através de vetores virais,

nanopartículas de ADN ou lípidos catiónicos complexados com ADN plasmídico. No

entanto, esta abordagem ainda não alcançou os resultados espectáveis (Kreindler,

2010). Assim, surgiu o desenvolvimento da segunda abordagem terapêutica, a

administração de compostos farmacológicos para corrigir ou potenciar a proteína

CFTR anormal. Estes fármacos são desenvolvidos para atuar de acordo com as

consequências funcionais causadas por cada classe mutacional presente no doente

com FC (Lubamba et al., 2012).

OBJETIVOS


30

2. OBJETIVOS

Em Portugal, a prevalência da FC é ainda desconhecida, bem como a frequência

e o tipo de variações de sequência do gene CFTR característicos da população

portuguesa. Como tal, os objetivos deste trabalho foram:

- Avaliar o tipo e a frequência das variações identificadas no gene CFTR

detetadas durante o rastreio da população portuguesa;

- Avaliar a prevalência da FC na população Portuguesa.

Posteriormente, será necessário uma avaliação clínica dos pacientes

identificados com diferentes genótipos CFTR, incluindo os pacientes com FC, bem

como os pacientes com CFTR-related disorders, para se estabelecer associações

entre fenótipo e genótipo identificados.

Assim, para cada paciente, será necessário identificar a evolução clínica das

diferentes conjugações de mutações do gene CFTR ao longo do tempo,

nomeadamente: sintomatologia, idade do aparecimento e correlação

genótipo/fenótipo; e estabelecer as manifestações fenotípicas associadas a estados

de heterozigotia do gene CFTR de forma a poder definir protocolos de avaliação e

seguimento clínico.

MATERIAIS E MÉTODOS


32

3. MATERIAIS E MÉTODOS

O material necessário à realização deste trabalho prático encontra-se descrito

em anexo (Anexo II).

3.1. AMOSTRAS

O ADN genómico foi recolhido a partir de células da mucosa bucal de 912

crianças representativas da população Portuguesa. Estas crianças estão integradas no

projeto Geração XXI (implementado pelo Departamento de Epidemiologia da

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto). Este projeto consiste no

acompanhamento, desde 2005, de um conjunto de quase 8700 crianças e as suas

respetivas famílias, constituindo um trabalho ímpar em Portugal que busca o

acompanhamento da saúde deste grupo de crianças desde o seu nascimento até à

idade adulta, gerando conhecimento fundamental para retratar a realidade da saúde

no nosso país e para projetar o seu futuro (Geração 21, 2013).

Todas as análises genéticas foram efetuadas após consentimento informado dos

pais e confirmação da origem parental portuguesa (Anexo III).

Neste trabalho foram analisadas 194 amostras de ADN, de 98 crianças do sexo

masculino e 96 crianças do sexo feminino.

3.2. EXTRAÇÃO DE ADN

A extração de ADN das células do epitélio bucal foi efetuada com o kit comercial

JETQUICK Blood & Cell Culture (Genomed), de acordo com o protocolo fornecido pelo

kit. Depois de extraídas, as amostras foram conservadas a 4°C.

3.3. QUANTIFICAÇÃO DE ADN

As amostras de ADN foram quantificadas num espetrofotómetro

NanoDrop2000C (ThermoScientific). A medição da absorvância no comprimento de

onda de 260 nm permitiu calcular a concentração de ADN em ng/µL.

3.4. ANÁLISE COMPLETA DA SEQUÊNCIA DO GENE CFTR

A pesquisa de variações de sequência nos 27 exões e nas regiões intrónicas

flanqueantes do gene CFTR foi efetuada através da amplificação do ADN genómico


33

por Polymerase Chain Reaction (PCR), seguida de eletroforese capilar, purificação e

sequenciação do ADN amplificado.

3.4.1. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

A PCR foi efetuada num volume final de 20,0 µL, com as seguintes quantidades:

5,8 µL de H2O destilada (B/Braun), 2,0 µL de Buffer Taq com KCl (10x), 1,0 µL de

MgCl2 (25mM), 2,0 µL de mix de dNTPs (0,5 µL de cada dNTP) (10mM), 2,0 µL de

cada par de primers (10mM), 0,2 µL de enzima Taq DNA Polymerase (5U/µL)

(Fermentas) e 5,0 µL de amostra de ADN (Tabela VI).

Tabela VI – Componentes da PCR.

ADN 5,0 µL

H2O 5,8 µL

Buffer Taq 2,0 µL

MgCl2 1,0 µL

dNTPs 2,0 µL

Primer Forward 2,0 µL

Primer Reverse 2,0 µL

Enzima Taq DNA Polymerase 0,2 µL

Volume total 20,0 µL

As condições de PCR utilizadas foram as seguintes: 10 min a 94°C; 40 ciclos de

30 seg a 94°C, 30 seg à temperatura de annealing respetiva de cada par de primers e

30 seg a 72°C; seguidos de 10 min de extensão final a 72°C (Tabela VII).

Tabela VII – Condições da PCR.

Temperatura (°C) Tempo Ciclos

Desnaturação Inicial 94 3 min

Desnaturação 94 1 min

40 Annealing a

50/55/65 1 min

Extensão 72 1 min

Extensão Final 72 10 min

4 ∞

a Temperatura variável de acordo com a sequência de cada par de primers.


34

Para amplificação de alguns exões, de amostras com uma concentração muito

reduzida de ADN, foi utilizado Type-it® Microsatellite PCR Kit. Os componentes da

reação bem como as condições da PCR encontram-se descritas na Tabela VIII e

Tabela IX respetivamente.

Tabela VIII – Componentes da PCR com Type-it.

ADN 3,0 μL

H2O 6,0 μL

Reaction Mix (Type-it Multiplex PCR Master Mix) 10,0 μL

Primer Forward 0,5 μL

Primer Reverse 0,5 μL

Volume Total 20,0 μL

Tabela IX – Condições da PCR com Type-it.



Desnaturação 95 48 seg

35 Annealing a

50/55/65 48 seg

Extensão 72 1 min

Extensão Final 72 30 min

4 ∞

a Temperatura variável de acordo com a sequência de cada par de primers.

Para cada exão e respetivas zonas intrónicas adjacentes foi utilizado um par

especifico de primers, cujas sequências se encontram descritas na Tabela X.


35

Tabela X – Primers utilizados na amplificação dos exões do gene CFTR.

Exão Tamanho do

Fragmento (bp) Sequência dos Primers

Temperatura de Annealing (°C)

1 243 F: TTG AGC GGC AGG CAC CCA G R: ACA CGC CCT CCT CTT TCG TG

55

2 240 F: CCA AAT CAA GTG AAT ATC TG R : TAA TAA TAT GAA TTT CTC TCT T

50

3 323 F: TTG GAT ATA CTT GTG TGA AT R: TTC GTA GTC TTT TCA TAA TC

56

4 438 F: TCA CAT ATG GTA TGA CCC TC R: TTG TAC CAG CTC ACT ACC TA

55

5 215 F: TAT TTG TAT TTT GTT TGT TG R: TAA AAG ATT AAA TCA ATA GG

50

6a 345 F: TGG AAG ATA CAA TGA CAC CTG R: GCA TAG AGC AGT CCT GGT TT

55

6b 417 F: TGG AAT GAG TCT GTA CAG CG R: GAG GTG GAA GTC TAC CAT GA

55

7 390 F : CAT CCT GAA TTT TAT TGT TA R : ATC ATA GTA TAT AAT GCA GC

55

8 225 F: ATT AAT GCT ATT CTG ATT CT R: AGT TAG GTG TTT AGA GCA AA

55

9 561 F:TGA AAA TAT CTG ACA AAC TC R: ACA GTG TTG AAT GTG GTG CA

55

10 341 F: TCC TGA GCG TGA TTT GAT AA R: ATT TGG GTA GTG TGA AGG G

55

11 229 F: CAG ATT GAG CAT ACT AAA AGT G R: ATT TAC AGC AAA TGC TTG CTA G

55

12 306 F: ATG ACC AGG AAA TAG AGA GG R: GCT ACA TTC TGC CAT ACC AA

55

13 906 F: TGC TAA AAT ACG AGA CAT ATT GC R: TAC ACC TTA TCC TAA TCC TAT

50

14a 291 F: GGT GGC ATG AAA CTG TAC TG R: TGT ATA CAT CCC CAA ACT ATC T

50

14b 174 F: GGG AGG AAT TAG GTG AAG AT R: TAC ATA CAA ACA TAG TGG ATT

50

15 401 F: TGT ATT GGA AAT TCA GTA AGT AAC TTT GG R: AGC CAG CAC TGC CAT TAG AAA

55

16 338 F: TCT GAA TGC GTC TAC TGT GA R: GCA ATA GAC AGG ACT TCA AC

55

17a 288 F: TGC AAT GTG AAA ATG TTT AC R: CTC TTA TAG CTT TTT TAC AA

50

17b 452 F: TTC AAA GAA TGG CAC CAG TGT R: TGC AGC ATT TTA TTC ATT GA

55

18 277 F: TAG GAG AAG TGT GAA TAA AG R: ATA CTT TGT TAC TTG TCT GA

50

19 449 F: GTG AAA TTG TCT GCC ATT CT R:ACT CCA TAT AAT AAA ACA TGT GTG

50

20 260 F: TAT GTC ACA GAA GTG ATC CC R: AAA ACT GGC TAA GTC CTT TT

50

21 477 F: AAT GTT CAC AAG GGA CTC CA R: CAA AAG TAC CTG TTG CTC CA

55

22 322 F: GCC CGC TGT GGT ATC TGA ACT ATC TT R: TGT CAC CAT GAA GCA GGC AT

50

23 227 F: CTG TTC TGT GAT ATT ATG TG R: ATG AGA TCT TAA GTA AAG TT

50

24 329 F: TCC CTG CTC TGG TCT GAC CTG C R: CAT GAG GTG ACT GTC CCA CGA G

65


36

3.4.2. ELETROFORESE CAPILAR

A confirmação e a determinação dos tamanhos dos produtos amplificados foram

realizadas através de eletroforese capilar no aparelho QIAxcel, com o kit QIAxel DNA

Screening e com o software BioCalculatorTM (Quiagen).

Ao contrário da tradicional electroforese em gel de agarose, a separação das

moléculas de ácidos nucleicos é realizada num capilar preenchido com gel. As

amostras são automaticamente carregadas em capilares individuais e é aplicada uma

voltagem específica. Como as moléculas dos ácidos nucleicos são carregadas

negativamente migram através do capilar em direção ao terminal com carga positiva,

passando por um detetor que mede o sinal de fluorescência. Tal como acontece com a

eletroforese em gel de agarose, as moléculas de baixo peso molecular migram mais

rapidamente do que as moléculas de alto peso molecular. De seguida, um

fotomultiplicador converte o sinal de fluorescência em dados eletrónicos, os quais são,

então, transferidos para um computador para processamento adicional usando o

software BioCalculatorTM (Quiagen).Os resultados são apresentados sob a forma de

um eletroferograma e numa imagem virtual de um gel (Figura 7).

Figura 7 – Processo de separação das amostras e resultados. Adaptado de http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Automated-Solutions/Detection-and-Analysis/QIAxcel-Advanced-

System#orderinginformation - Qiagen, 2013.


37

3.4.3. PURIFICAÇÃO

A purificação dos produtos amplificados foi efetuada numa placa magnética

utilizando o kit Agencourt®AMPure®XP PCR Purification de acordo com o protocolo

fornecido (Protocol 000387v001 - BeckmanCoulter) (Figura 8).

Figura 8 – Esquema do processo de purificação: 1. Reação de PCR; 2. Ligação das partículas magnéticas aos amplicões; 3. Separação dos amplicões ligados às partículas magnéticas dos restantes contaminantes; 4. Lavagem dos amplicões com etanol; 5. Eluição dos amplicões; 6. Transferência dos amplicões purificados para um novo tubo. Adaptado de https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm - Beckman Coulter, 2013a.

3.4.4. REAÇÃO DE SEQUENCIAÇÃO

A reação de sequenciação foi realizada com o kit ABI PRISM BigDye Terminator

v3.1 Cycle Sequencing (AppliedBiosystems). Para um volume final de 10,0 µL,

adicionou-se: até um máximo de 6,5 µL de produto de PCR purificado (dependendo da

intensidade dos produtos de PCR), 2,0 µL de Terminator Ready Reaction Mix (2,5x),

1,0 µL de Sequencing Buffer (5x), 0,5 µL de primer forward ou reverse (10 mM) e

perfez-se o volume com H2O destilada (B/Braun) (Tabela XI).

Tabela XI – Componentes da reação de sequenciação.

Produto Purificado até 6,5 µL

H2O a

Sequencing Buffer 1,0 µL

Terminator Ready Reaction Mix 2,0 µL

Primer 0,5 µL

Volume Total 10,0 µL

a Ajustar o volume de H2O para um volume final de reação de 10,0 μL.


38

Os primers utilizados nesta reação foram os mesmos utilizados na PCR (Tabela

X), com exceção do primer forward do exão 9, em que se utilizou o primer 9i2F: 5’-

GGG GAA TTA TTT GAG AAA GC-3’. As condições da reação encontram-se descritas

na Tabela XII.

Tabela XII – Condições da reação de sequenciação.



Desnaturação 96 10 seg

24 Annealing 50 5 seg

Extensão 60 4 min

4 ∞

3.4.5. PRECIPITAÇÃO

A precipitação dos produtos para sequenciação foi executada numa placa

magnética utilizando o kit Agencourt®CleanSEQ® Dye-Terminator Removal (Protocol

000600v032 - BeckmanCoulter®) (Figura 9).

Figura 9 – Esquema do processo de precipitação: 1. Adição do reagente Agencourt CleanSEQ e etanol aos produtos de sequenciação; 2. Ligação das partículas magnéticas aos produtos de sequenciação; 3. Separação dos produtos de sequenciação dos contaminantes; 4. Lavagem com etanol; 5. Eluição dos produtos de sequenciação; 6. Transferência dos produtos precipitados para um novo tubo. Adaptado de https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-cleanseq-dye-terminator-removal/index.htm - Beckman Coulter, 2013b.


39

3.4.6. SEQUENCIAÇÃO

Para a sequenciação, foi transferido 10 µL de cada produto precipitado para uma

placa de sequenciação e estes foram sequenciados num sequenciador automático ABI

Prism 3500, com o polímero POP-7.

3.5. ANÁLISE BIOINFORMÁTICA DAS SEQUÊNCIAS

A análise das sequências foi realizada com o programa bioinformático

Sequencing Analysis (AppliedBiosystems) e com o programa Basic Local Alignment

Search Tool (BLAST - NCBI) o que permitiu efetuar o alinhamento das sequências das

amostras em estudo com a sequência de referência do gene CFTR (Cystic Fibrosis

Mutation Database). As alterações detetadas foram identificadas recorrendo às bases

de dados Cystic Fibrosis Mutation Database (CFTR1) e Clinical and Functional

Translation of CFTR (CFTR2).

RESULTADOS


41

4. RESULTADOS

Neste trabalho foram analisados os 27 exões e respetivas regiões intrónicas

flanqueantes do gene CFTR, a partir do ADN extraído de 194 amostras da população

portuguesa. Para tal, foi efetuada a técnica de PCR seguida de sequenciação direta do

ADN amplificado. Após a extração do ADN, as amostras foram quantificadas, sendo

que o valor médio de concentração de ADN foi de 10,0 ng/μL. Seguidamente, foram

amplificados todos exões do gene CFTR das 194 amostras, utilizando-se um par

especifico de primers para cada exão. A amplificação dos produtos de PCR foi

confirmada por eletroforese capilar (Figura 10).

Figura 10 – Imagem virtual de um gel correspondente à amplificação dos 27 exões do gene CFTR de uma amostra em estudo. As duas bandas observadas para o exão 6b e para o exão 10 correspondem à variação de sequência c.744-31TTGA[3_7] e à mutação F508del, respetivamente.


42

Depois de confirmada a amplificação dos produtos de PCR, correspondentes

aos 27 exões e regiões intrónicas flanqueantes do gene CFTR das 194 amostras,

foram efetuadas as suas purificações e respetivas sequenciações. As sequências

resultantes (Figura 11) foram de seguida analisadas, com recurso ao programa

bioinformático Sequencing Analysis (AppliedBiosystems), ao programa BLAST e às

bases de dados CFTR e CFTR2.

Figura 11 – Sequência forward do exão 1 e respetivas regiões intrónicas. O exão 1 começa no codão ATG (codão de iniciação – Metionina) e termina em CAG.

4.1. VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA CFTR

No total, foram detetadas 39 diferentes variações de sequência nas 194

amostras analisadas, tal como se descreve na Tabela XIII. Não foram observadas

quaisquer alterações nos exões 1, 2, 4, 6a, 6b, 14b, 16, 18, 22, e 23, bem como nas

regiões flanqueantes correspondentes dos intrões 1, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14a,

14b, 16, 18, 19, 21, 22, 23 e 3’UTR.

As variações de sequência c.1521-1523delCTT (p.F508del), no exão 10, e

c.3154T>G (p.F1052V), no exão 17b, foram observadas em duas amostras. A variante

IVS8T5, no intrão 8, foi detetada em doze amostras, correspondendo a uma

frequência alélica de 3%. Estas variações de sequência são classificadas como

mutações causadoras de FC pela base de dados CFTR2 (CFTR2@Johns Hopkins,

2013). A penetrância da variante IVS8T5 no splicing do exão 9, é dependente do

número de repetições IVS8(TG)m, estando as variantes IVS8(TG)11, 12 ou 13

associadas a um fenótipo de CBAVD. A variante IVS8T5 está associada à variante

IVS8(TG)11 em sete amostras e à variante IVS8(TG)12 em cinco amostras.

A variação de sequência c.224G>A (p.R75Q), no exão 3, foi detetada numa

amostra; a variação de sequência c.3705T>G (p.S1235R), no exão 19, foi observada

em duas amostras; as variações de sequência c.2260G>A (p.V745M), no exão 13, e


43

c.2991G>C (p.L997F), no exão 17a, foram observadas em cinco amostras; a variação

de sequência c.1727G>C (p.G576A), no exão 12, foi observada em sete amostras; e a

variação de sequência c.2002C>T (p.R668C), no exão 13, foi detetada em nove

amostras. Estas variações de sequência são classificadas como mutações que não

causam FC quando combinadas com uma mutação causadora de FC clássica, pela

base de dados CFTR2 (CFTR2@Johns Hopkins, 2013), no entanto estão associadas

a fenótipos de CFTR-RD.

As variações de sequência c.509G>A (p.R170H), no exão 5, c.890G>A

(p.R297Q), no exão 7, c.1327G>T (p.D443Y), no exão 9, c.2173G>A (p.E725K), no

exão 13, c.2900C>T (p.L967S), no exão 15, c.3041A>G (p.Y1014C), no exão 17a e

c.3322G>C (p.V1108L), no exão 17b, foram detetadas numa amostra e a variação de

sequência c.1052C>G (p.T351S), no exão 7, foi observada em duas amostras. Estas

variações de sequência não constam da base de dados CFTR2, não havendo assim

um consenso relativo à sua classificação como mutação, contudo são encontradas em

indivíduos com CFTR-RD.

Considerando as dezassete diferentes variações de sequência associadas a FC

ou a CFTR-RD, quinze (88,2%) são alterações missense conduzindo à alteração de

um aminoácido, uma (5,9%) altera o local de splicing e uma (5,9%) provoca a deleção

de um aminoácido.

As restantes vinte e duas diferentes variações de sequência, detetadas nas 194

amostras analisadas, são consideradas como polimorfismos, isto é, variações de

sequência não causadoras de FC ou de CFTR-RD.

Foram identificadas três variações de sequência pela primeira vez,

c.273+35C>T, no intrão 3, c.744-31TTGA(3), no intrão 6a e c.1614T>C (p.A538A), no

exão 11, que não conduz à alteração de aminoácido. Estas variações de sequência

foram analisadas através dos programas bioinformáticos MutationTaster, PMut e SIFT

tendo sido consideradas como polimorfismos.

As frequências genotípicas e alélicas de cada variação de sequência estão

apresentadas na Tabela XIII.


44

Tabela XIII – Frequências genotípicas e alélicas das variações de sequência detetadas nas 194 amostras em estudo.

Localização Efeito Nome

(Proteína) Nucleótido Frequência Genotípica Frequência Alélica

Promotor Variação de sequência c.-8G>C G/G = 178 G/C = 16 C/C = 0 G = 0,959 C = 0,041

Exão 3 Substituição de aa p.R75Q c.224G>A G/G = 193 G/A = 1 A/A = 0 G = 0,997 A = 0,003

Intrão 3 Variação de sequência c.273+35C>Ta

C/C = 193 C/T = 1 T/T = 0 C = 0,997 T = 0,003

Exão 5 Substituição de aa p.R170H c.509G>A G/G = 193 G/A = 1 A/A = 0 G = 0,997 A = 0,003

Intrão 6a

Variação de sequência c.743+40 A>G A/A = 180 A/G = 14 G/G = 0 A = 0,964 G = 0,036

Variação de sequência c.744-31TTGA[3_7]

3/5 = 1

5/5 = 2

5/6 = 62

6/6 = 127

6/7 = 2

3 = 0,003

5 = 0,173

6 = 0,819

7 = 0,005

Intrão 6b Variação de sequência c.869+11C>T C/C = 158 C/T = 36 T/T = 0 C = 0,907 T = 0,093

Exão 7 Substituição de aa p.R297Q c.890 G>A G/G = 193 G/A = 1 A/A = 0 G = 0,997 A = 0,003

Substituição de aa p.T351S c.1052C>G C/C = 192 C/G = 2 G/G = 0 C = 0,995 G = 0,005

Exão 8 Substituição de aa p.T388M c.1163C>T C/C = 193 C/T = 1 T/T = 0 C = 0,997 T = 0,003

Intrão 8

Variação de sequência IVS8(TG)mb

c. 1242-35_1242-12TG[9_13]

TG10TG10 = 23

TG10TG11 = 73

TG10TG12 = 6

TG11TG11 = 73

TG11TG12 = 17

TG12TG12 = 2

TG10 = 0,322

TG11 = 0,608

TG12 = 0,070

Splicing anormal IVS8(T)n c. 1210-12T[5_9]

T5/T7 = 11

T5/T9 = 1

T7/T7 = 126

T7/T9 = 53

T9/T9 = 3

T5 = 0,031

T7 = 0,814

T9 = 0,155

Exão 9 Substituição de aa p.D443Y c.1327G>T G/G =193 G/T = 1 T/T = 0 G = 0,997 T = 0,003

Exão 10 Substituição de aa p.M470V c.1408A>G A/A = 27 A/G = 124 G/G = 43 A = 0,459 G = 0,541

Deleção de aa p.F508del c.1521_1523delCTT CTT/CTT = 192 CTT/- = 2 -/- = 0 CTT = 0,995 - = 0,005


45

Substituição de aa p.F508C c.1523T>G T/T = 191 T/G = 3 G/G =0 T = 0,992 G = 0,008

Variação de sequência p.E528E c.1584G>A G/G = 180 G/A = 14 A/A = 0 G = 0,964 A = 0,036

Exão 11 Variação de sequência p.A538A c.1614T>Ca

T/T = 193 T/C = 1 C/C = 0 T = 0,997 C = 0,003

Exão 12 Substituição de aa p.G576A c. 1727G>C G/G = 187 G/C = 7 C/C = 0 G = 0,982 C = 0,018

Exão 13

Substituição de aa p.R668C c.2002C>T C/C = 185 C/T = 9 T/T = 0 C = 0,977 T = 0,023

Substituição de aa p.E725K c.2173G>A G/G = 193 G/A = 1 A/A = 0 G = 0,997 A = 0,003

Substituição de aa p.V754M c.2260G>A G/G = 189 G/A = 5 A/A = 0 G = 0,988 A = 0,012

Exão 14a Variação de sequência p.T854T c.2562T>G T/T = 84 T/G = 95 G/G = 15 T = 0,678 G = 0,322

Exão 15 Variação de sequência p.T966T c.2898G>A G/G = 192 G/A = 2 A/A = 0 G = 0,995 A = 0,005

Substituição de aa p.L967S c.2900T>C T/T = 193 T/C = 1 C/C = 0 T = 0,997 C = 0,003

Intrão 15 Variação de sequência c.2909-71G>C G/G = 192 G/C = 2 C/C = 0 G = 0,995 C = 0,005

Exão 17a Substituição de aa p.L997F c.2991G>C G/G = 189 G/C = 5 C/C = 0 G = 0,988 C = 0,012

Substituição de aa p.Y1014C c.3041A>G A/A = 193 A/G = 1 G/G = 0 A = 0,997 G = 0,003

Intrão 17a Variação de sequência c.3140-92T>C T/T = 183 T/C = 11 C/C = 0 T = 0,972 C = 0,028

Exão 17b

Substituição de aa p.F1052V c.3154T>G T/T = 192 T/G = 2 G/G = 0 T = 0,995 G = 0,005

Variação de sequência p.T1095T c.3285A>T A/A = 191 A/T = 3 T/T = 0 A = 0,992 T = 0,008

Substituição de aa p.V1108L c.3322G>C G/G = 193 G/C = 1 C/C = 0 G = 0,997 C = 0,003

Intrão 17b Variação de sequência c.3367+37G>A G/G = 192 G/A = 2 A/A = 0 G = 0,995 A = 0,005

Exão 19 Substituição de aa p.S1235R c.3705T>G T/T 0 192 T/G = 2 G/G = 0 T = 0,995 G = 0,005

Exão 20 Variação de sequência p.P1290P c.3870A>G A/A = 177 A/G = 17 G/G = 0 A = 0,956 G = 0,044

Intrão 20 Variação de sequência c.3874-200G>A G/G = 192 G/A = 2 A/A = 0 G = 0,995 A = 0,005

Exão 21 Variação de sequência p.T1299T c.3897A>G A/A = 193 A/G = 1 G/G = 0 A = 0,997 G = 0,003

Exão 24 Variação de sequência p.Y1424Y c.4272C>T C/C = 191 C/T = 3 T/T = 0 C = 0,992 T = 0,008

Variação de sequência p.Q1463Q c.4389G>A G/G = 93 G/A = 93 A/A = 8 G = 0,719 A = 0,281

a Variação de sequência descrita pela primeira vez;

b A variação IVS8(TG)m condiciona a penetrância da variante IVS8T5.


46

4.2. GENÓTIPOS CFTR

Relativamente aos genótipos CFTR identificados nas amostras analisadas,

foram detetados quarenta e um indivíduos heterozigóticos para uma ou duas variações

de sequência no gene CFTR, associadas a FC clássica ou CFTR-RD (Tabela XIV).

Destes alelos mutados, sete correspondem a alelos complexos, um D443Y-G576A-

R668C e seis G576A-R668C. Foram ainda identificadas cinco crianças com duas

variações de sequência: uma criança do sexo masculino com as mutações p.F508del

e p.F1052V e quatro crianças, três do sexo masculino e uma do sexo feminino, com as

variações de sequência p.R297Q/p.E725K, G576A-R668C/p.L997F,

IVS8T5(TG)12/p.S1235R e IVS8T5(TG)12/p.L967S, respetivamente.

Assim, a taxa de portadores de uma variação de sequência CFTR é de 18,6%

(36/194) e a prevalência de FC clássica ou CFTR-RD é de 2,6% (5/194).

Tabela XIV – Genótipos dos quarenta e três indivíduos heterozigóticos para uma ou duas variações de sequência no gene CFTR.

Genótipo Genótipo IVS8Tn(TG)m Nº amostras

p.R75Q / - T7(TG)11 T7(TG)11 1

p.R170H / - T7(TG)10 T7(TG)11 1

p.R297Q / p.E725K T7(TG)11 T7(TG)11 1

p.T351S / - T7(TG)10 T9(TG)11 2

D443Y-G576A-R668C / - a

T7(TG)10 T7(TG)10 1

G576A-R668C / - a

T7(TG)10 T7(TG)11 3

G576A-R668C / - a

T7(TG)11 T7(TG)11 1

G576A-R668C / - a

T7(TG)10 T7(TG)10 1

G576A-R668C / p.L997F

T7(TG)10 T9(TG)10 1

p.R668C / - T7(TG)10 T7(TG)12 1

p.R668C / - T7(TG)10 T7(TG)11 1

p.F508del / - T7(TG)10 T9(TG)11 1

p.F508del / p.F1052V T7(TG)10 T9(TG)10 1

p.F1052V / - T7(TG)10 T7(TG)11 1

p.V754M / - T7(TG)11 T9(TG)10 3

p.V754M / - T9(TG)10 T9(TG)10 1

p.V754M / - T7(TG)11 T9(TG)11 1

p.L967S / - T5(TG)12 T7(TG)11 1

p.L997F / - T7(TG)10 T9(TG)10 1

p.L997F / - T7(TG)10 T9(TG)11 2

p.L997F / - T7(TG)11 T9(TG)10 1

p.Y1014C / - T7(TG)11 T9(TG)11 1

p.V1108L / - T7(TG)11 T7(TG)11 1


47

p.S1235R / - T7(TG)11 T7(TG)12 1

p.S1235R / - T5(TG)12 T7(TG)12 1

- / - T5(TG)11 T7(TG)11 6

- / - T5(TG)12 T7(TG)11 1

- / - T5(TG)12 T7(TG)12 1

- / - T5(TG)11 T9(TG)11 1

- / - T5(TG)12 T7(TG)10 1

a Alelos complexos: mutações no mesmo alelo

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO


49

5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

A FC é a doença genética autossómica recessiva mais frequente na população

Caucasiana com uma incidência de 1:2500 nascimentos e uma frequência de

portadores de 1:25 (Walters & Mehta, 2007). Esta doença é causada por mutações no

gene CFTR, estando descritas até à data cerca de 2000 variações de sequência

diferentes (Cystic Fibrosis Mutation Database, 2011) com frequências e distribuições

que variam geograficamente (Salvatore et al., 2011). Este facto conduz à necessidade

de determinar a frequência e distribuição das variações de sequência do gene CFTR

nas diferentes populações e, consequentemente, a prevalência de FC, de modo a

melhorar o diagnóstico efetuado.

Na genética da FC, existe uma grande heterogeneidade relativamente às

variações de sequência, o que dificulta a sua classificação. Zielenski e Tsui, em 1995,

propuseram uma classificação em 5 classes de acordo com os efeitos provocados

pelas mutações na proteína CFTR (Zielenski & Tsui, 1995). Castellani et al, em 2008,

dividiram as diferentes variações de sequência em 4 grupos: mutações causadoras de

FC, mutações que resultam em CFTR-RD, mutações sem consequências clínicas e

mutações com relevância desconhecida (Castellani et al., 2008). A base de dados

CFTR1 também fornece uma classificação, baseada nos termos polimorfismo e

mutação, para as variações de sequência descritas (Cystic Fibrosis Mutation

Database, 2011).

Contudo, devido à ausência de consenso quanto à classificação de grande parte

destas variações de sequência, foi criada a base de dados CFTR2 por forma a

uniformizar todos estes dados (CFTR2@Johns Hopkins, 2013). Esta nova base de

dados engloba informações sobre os pacientes com FC a nível mundial. Para

determinar se uma variação de sequência em particular causa FC, são utilizados três

critérios diferentes:

a) Características clínicas dos pacientes com a mutação em questão em

heterozigotia composta com uma mutação conhecida por causar FC. Nestes pacientes

são efetuados testes funcionais (teste de suor), é analisada a função pulmonar e a

função pancreática e efetuada a análise microbiológica ao muco para determinar se os

indivíduos com a mutação em estudo têm FC;

b) Testes funcionais in vitro, através da avaliação da disfunção celular

provocada pela mutação em causa;

c) Algoritmos de previsão da patogenicidade da mutação.


50

No entanto, até à data apenas estão incluídas na base de dados CFTR2 as 160

variações de sequência mais comuns, estando esta base de dados em constante

atualização.

O presente estudo consistiu na análise de todos os exões e respetivas regiões

intrónicas flanqueantes do gene CFTR em 194 amostras de ADN. No total, foram

identificadas trinta e nove diferentes variações de sequência, em que dezassete

correspondem a variações de sequência associadas a FC ou CFTR-RD e as restantes

vinte e duas a polimorfismos.

Das dezassete variações de sequência identificadas, a mais comum foi a

variante IVS8T5, com uma frequência alélica de 3,1% (12/388), estando de acordo

com a frequência já descrita previamente para a população Portuguesa (3,5%)

(Grangeia et al., 2004) e com a frequência de 5% na população Caucasiana,

aumentando para 25% em pacientes com CBAVD (Chillon et al., 1995, WHO, 2004).

Esta variante pode estar associada a diversos fenótipos, desde o assintomático a

CBAVD, ou mesmo FC moderada (Cuppens et al., 1998).

A penetrância da variante IVS8T5 no splicing normal do exão 9 pode ser

condicionada pelas variantes IVS8(TG)m e pelo polimorfismo p.M470V (Groman et al.,

2004). Neste estudo, a variante IVS8T5 está associada a IVS8(TG)11, em sete

amostras e a IVS8(TG)12, em cinco amostras. Relativamente ao polimorfismo

p.M470V, o alelo V (54,1%) apresentou uma frequência superior ao alelo M (45,9%), o

que já está descrito para a população caucasiana (Huang et al., 2008). Este

polimorfismo afeta a atividade intrínseca de Cl- (afetando a função da proteína CFTR)

e aumenta a penetrância da variante IVS8T5 (diminuindo o nível de mARN normal)

(Cuppens et al., 1998).

As variações de sequência p.L997F e p.V754M foram identificadas em cinco

amostras, apresentando uma frequência alélica de 1,2% (5/388). A variação de

sequência p.L997F encontra-se localizada no exão 17a e é considerada rara em

doentes com FC. Consiste na substituição do aminoácido Leucina pelo aminoácido

Fenilalanina e é normalmente associada a doença pulmonar, bronquiectasias

disseminadas, pancreatites recorrentes e CBAVD (Castellani et al., 2001, Conklin et

al., 2008, Lucarelli et al., 2010). A variação de sequência p.V754M está localizada no

exão 13 e consiste na substituição do aminoácido Valina pelo aminoácido Metionina.

Está associada a FC moderada quando combinada com as variações de sequência

1812-1G>A ou p.G542X (Loumi et al., 1999).


51

Foram identificados dois alelos complexos neste trabalho: G576A-R668C, em

seis amostras, e D443Y-G576A-R668C, numa amostra. Dados epidemiológicos

evidenciam que o alelo complexo G576A-R668C é uma variante frequente na

população geral (El-Seedy et al., 2012).

De acordo com publicações anteriores, estes alelos complexos, quando em trans

com uma mutação causadora de FC, estão associados a fenótipos moderados (CFTR-

RD), em particular CBAVD. A variação de sequência p.D443Y, localizada no exão 9,

apresenta efeitos ao nível da maturação da proteína CFTR, e as variações de

sequência p.G576A e p.R668C, localizadas nos exões 12 e 13 respetivamente, têm

efeitos na atividade do canal de Cl-. Apesar da observação de uma associação entre a

diminuição da função de CFTR com o alelo complexo D443Y-G576A-R668C

(provavelmente devido ao efeito combinado das três variações de sequência), a

proteína apresenta uma função residual, correspondente a fenótipos moderados e

CFTR-RD (El-Seedy et al., 2012).

Esta associação das variações de sequência p.D443Y, p.G576A e p.R668C em

alelos complexos foi feita com base em publicações anteriores (Pignatti et al., 1995,

Abramowicz et al., 2000), no entanto é necessário, nestas amostras, a avaliação dos

progenitores para confirmar se as variações de sequência estão de facto em cis, ou

seja, que são alelos complexos.

De acordo com os resultados obtidos, foram identificadas cinco amostras com

duas variações de sequência. Uma criança do sexo masculino com as mutações

p.F508del e p.F1052V e quatro crianças, três do sexo masculino e uma do sexo

feminino, com as variações de sequência p.R297Q/ p.E725K, G576A-R668C/ p.L997F,

IVS8T5(TG)12/ p.S1235R e IVS8T5(TG)12/ p.L967S, respetivamente. Estas variações

de sequência serão estudadas nos progenitores de forma a confirmar se se encontram

em cis ou em trans.

A associação, em heterozigotia composta, das variações de sequência p.R297Q/

p.E725K, G576A-R668C/ p.L997F, IVS8T5(TG)12/ p.L967S e IVS8T5(TG)12/

p.S1235R pode corresponder a um fenótipo de CFTR-RD, nomeadamente

bronquiectasias (Pignatti et al., 1995, Bombieri et al., 1998) e, no caso das crianças do

sexo masculino, CBAVD (WHO, 2004, Grangeia et al., 2007). Contudo, é necessária

uma avaliação clínica precisa pois não é possível prever qual o fenótipo que cada

individuo manifesta baseado exclusivamente no genótipo.


52

Relativamente à amostra com as variações de sequência p.F508del/ p.F1052V,

em heterozigotia composta, pode resultar num fenótipo de FC clássica. Esta

classificação é baseada na informação da base de dados CFTR2 (CFTR2@Johns

Hopkins, 2013). Porém, devido à heterogeneidade da doença, não é possível prever o

fenótipo deste individuo apenas com a informação genotípica de que dispomos

(apesar da mutação F508del causar FC clássica), sendo necessária a sua avaliação

clinica para realização de outros estudos, nomeadamente o teste de suor, para

confirmação do diagnóstico e corelação genótipo/fenótipo. É também necessária,

nestes cinco casos, a avaliação dos progenitores por forma a confirmar a segregação

destas alterações.

Assim, a prevalência de FC ou CFTR-RD, na população em estudo, é de 2,6%

(5/194), sendo que podemos considerar a prevalência de FC clássica em 0,5%

(1/194), um valor muito superior ao reportado para a população Portuguesa (1/14000)

(Lemos et al., 2010) e para a população Caucasiana (1/2500). Com os resultados

obtidos, podemos também estimar uma frequência de portadores de uma variação de

sequência de 18,6% (36/194), um valor cerca de cinco vezes superior ao reportado

para outras populações (1/25) (Welsh et al., 2001). Contudo, este é apenas uma

abordagem inicial de um estudo epidemiológico da população Portuguesa, que prevê

incluir a análise das 912 amostras.

Em conclusão, existe uma urgente necessidade de determinar a frequência e a

distribuição das mutações do gene CFTR para cada população, para que seja possível

oferecer um diagnóstico mais adaptado e uma melhor interpretação fenotípica de

acordo com a população em estudo (Salvatore et al., 2011, Farjadian et al., 2013).

Com este trabalho, ao estudar a população Portuguesa, foi obtida uma

frequência e uma distribuição de mutações CFTR muito diferente das já descritas para

outras populações. Sendo os kits comerciais a primeira linha de diagnóstico da FC, é

necessário perceber que estes necessitam de ser adaptados ao espetro de mutações

mais frequente em cada população para assim, otimizar este diagnóstico e

consequentemente melhorar a terapêutica da doença.

Foi ainda discutida a difícil correlação genótipo-fenótipo, devido à grande

heterogeneidade das diferentes variações do gene CFTR, o que dificulta a

determinação de um diagnóstico de FC ou CFTR-RD. Portando, é de todo o interesse

realizar um levantamento de todos os dados dos pacientes no sentido de determinar e


53

fundamentar os efeitos que cada variação exerce na proteína CFTR, diretamente ou

através da sua capacidade de modificar o efeito de outras variações.

O trabalho futuro consiste na otimização de um protocolo para prosseguir este

projeto através da técnica de Sequenciação de Nova Geração (NGS – Next

Generation Sequencing). Após a sequenciação das restantes amostras, é necessário

avaliar o espectro de mutações identificado, de modo a obter um painel de mutações

específico da população Portuguesa que permita validar o diagnóstico e,

eventualmente, o estabelecimento de uma correlação genótipo-fenótipo imediata.

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55

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ANEXOS

FCUP Fibrose Cística: Estudo das Variações de Sequência do gene CFTR na População Pediátrica Portuguesa

61

ANEXO I

Tabela 1 – Mutações do gene CFTR detetadas com o kit comercial Devyser CFTR

Mutação Core Denominação Localização

711+1G>T c.579+1G>T Intrão 5

3120+1G>A c.2988+1G>A Intrão 18

621+1G>T c.489+1G>T Intrão 4

1717-1G>A c.1585-1G>A Intrão 11

CFTRdele2,3(21kb) c.54-5940_273+10250del21kb Intrão 1 a Exão 3

3849+10kbC>T c.3717+12191C>T Intrão 22

2789+5G>A c.2657+5G>A Intrão 16

1898+1G>A c.1766+1G>A Intrão 13

G542X c.1624G>T Exão 12

G85E c.254G>A Exão 3

Y1092X(C>A) c.3276C>A Exão 20

G551D c.1652G>A Exão 12

R553X c.1657C>T Exão 12

3659delC c.3528delC Exão 22

N1303K c.3909C>G Exão 24

R560T c.1679G>C Exão 12

R117H(350G>A) c.350G>A Exão 4

R1162X c.3484C>T Exão 22

L1077P c.3230T>C Exão 20

R117C(349C>T) c.349C>T Exão 4

R1066C c.3197G>A Exão 20

L1065P c.3194T>C Exão 20

W1282X c.3846G>A Exão 23

R347H c.1040G>A Exão 8

I507del c.1519_1521delATC Exão 11

T338I c.1013C>T Exão 8

F508del c.1521_1523delCTT Exão 11

I336K c.1007T>A Exão 8

1677delTA c.1545_1546delTA Exão 11

R334W c.1000C>T Exão 8

3272-26A>G c.3140-26A>G Intrão 19

1078delT c.948delT Exão 8

2183AA>G c.2051_2052delAAinsG Exão 14

2184insA c.2052_2053insA Exão 14

2143delT c.2012delT Exão 14

5T(TGn) c.1210-34TG[9_13]T[5] Intrão 9

Adaptado de Devyser, Palex Medical SA, Barcelona, Espanha.


62

ANEXO II

Tabela 2 – Lista de materiais

Reagentes Marca

Água destilada estéril B-Braun

dNTPs Invitrogen

Etanol 70% e 85% Merck Millipore

Kit ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Applied Biosystems

Kit Agencourt®AMPure®XP PCR Purification Beckman Coulter

Kit Agencourt®CleanSEQ® Dye-Terminator Removal Beckman Coulter

Kit JETQUICK Blood & Cell Culture Genomed

Kit QIAxel DNA Screening Qiagen

Kit Taq Polymerase Fermentas

Kit Type-it® Microsatellite PCR Qiagen

Primers Thermo Lab e Frilabo

Polímero POP-7 Applied Biosystems


63

ANEXO III

e studo das variaÇÕes de s gene cftr populaÇÃo … · fcup fibrose cÍstica: estudo das...

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