UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MIRELLE SOUZA LEÃO VASCONCELOS
“DINÂMICA DA IgA SECRETORA ESPECÍFICA NA LÁGRIMA EM PACIENTES
PORTADORES DE UVEÍTE POSTERIOR ATIVA PRESUMIVELMENTE POR
Toxoplasma gondii DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA DOENÇA.”
RECIFE - PE
2009
MIRELLE SOUZA LEÃO VASCONCELOS
“DINÂMICA DA IgA SECRETORA ESPECÍFICA NA LÁGRIMA EM PACIENTES
PORTADORES DE UVEÍTE POSTERIOR ATIVA PRESUMIVELMENTE POR
Toxoplasma gondii DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA DOENÇA.”
Dissertação apresentada ao colegiado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de mestre em Medicina Tropical. Área de Concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Orientadora: Profª. Drª. Elizabeth Malagueño de Santana
Co-orientadora: Profª. Drª. Maria Isabel Lynch de Moraes
RECIFE - PE
2009
Vasconcelos, Mirelle Souza Leão
Dinâmica da IgA secretora específica na lágrima empacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por Toxoplasma gondii durante o primeiro trimestre da doença / Mirelle Souza Leão Vasconcelos. – Recife : O Autor, 2009.
88 folhas: il., fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Medicina Tropical, 2009.
Inclui bibliografia, anexos e apêndices.
1. Toxoplasmose ocular. 2. IgA secretora dalágrima. 3. Imunodiagnóstico ocular. I. Título.
617.721.6 CDU (2.ed.) UFPE 717.72 CDD (22.ed.) CCS2009-064
DEDICO
Aos meus pais, Homero e Iranete, pelo
exemplo de amor e doação, todas as minhas
conquistas são graças a vocês.
Aos meus irmãos, Millena e Hermann,
pela atenção e carinho dispensados em todos
os momentos.
A Leuzinger pelo amor, carinho e
compreensão.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus pelo dom da vida e pela força nos momentos difíceis.
Aos anjos especiais que tenho ao meu lado: Mainha, Painho, Millena e Hermann.
Sempre presentes, atenciosos, amáveis e carinhosos durante toda minha vida, nos melhores e
piores momentos, não deixando de estar comigo nessa nova etapa.
À profª. Drª. Maria Isabel Lynch pela sua orientação, dedicação, carinho e atenção que
vem de muito antes dessa dissertação. Por seu jeito doce de ensinar, por sua humildade e
competência que tanto admiro. É um exemplo a ser seguido.
À profª. Drª. Elizabeth Malagueño pela orientação e confiança em mim depositada na
realização deste trabalho.
À profª Silvana pelas sugestões e colaboração na elaboração da dissertação.
À Narjara e Felipe por sempre estarem dispostos a ajudar nas horas mais complicadas
nessa nossa fase de “mestrandos”.
Aos meus irmãos Millena e Hermann, meu noivo Leuzinger, minhas amigas Maria
Antonieta e Rafaela e ao meu cunhado Marco André que fizeram parte da “equipe de
salvamento” nessa reta final de percalços.
A todos os profissionais do laboratório de Imunologia Keizo Azami (LIKA), pelo
estímulo e colaboração irrestrita, em especial à Narjara e aos estagiários Wheverton Ricardo e
Rodrigo.
Aos meus colegas, oftalmologistas e residentes, do serviço de oftalmologia do
Hospital das Clinicas da Universidade Federal de Pernambuco e Serviço Oftalmológico de
Pernambuco (SEOPE), que participaram deste trabalho, direta ou indiretamente.
À Jupira Pinho e Walter Leite, funcionários da Secretaria do Departamento de Pós-
graduação em Medicina Tropical pela presença, sempre solícita e gentil nestes anos de
trabalho.
A todos os colegas oftalmologistas, que, enviando seus pacientes, viabilizaram este
estudo.
“Confiar em Deus como se tudo dependesse
Dele mas, entretanto, trabalhar como se tudo
dependesse de nós”.
Santo Inácio de Loyola
RESUMO
O Toxoplasma gondii (T. gondii) é a principal causa de uveíte posterior e a retinocoroidite
toxoplásmica é considerada a infecção mais comum da retina. Os testes sorológicos
constituem uma importante ferramenta para o diagnóstico da toxoplasmose, porém na
toxoplasmose ocular, geralmente não há correlação entre os níveis de anticorpos séricos e a
sintomatologia ocular do paciente. Assim, nos casos do diagnóstico da doença ocular, os
testes sorológicos pouco ajudam. Alguns estudos têm demonstrado que a quantificação de
títulos de anticorpos no humor aquoso pode ser esclarecedora, todavia é um exame que
necessita punção da câmara anterior, tratando-se de um procedimento invasivo. Porém, outros
estudos concluíram que através da determinação da imunoglobulina A secretora (IgAs) anti-T.
gondii na lágrima é possível diferenciar pacientes portadores de uveíte posterior ativa por
toxoplasmose ocular de pacientes portadores de uveíte causadas por outras etiologias. O
presente estudo objetivou avaliar a dinâmica da produção da IgAs anti-T .gondii na lágrima
em pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii durante o
primeiro trimestre da doença. Um total de 16 pacientes que apresentavam a forma clássica da
doença ocular, ou seja, lesões de uveíte posterior ativa com lesão satélite cicatrizada, foram
divididos em dois grupos em relação ao início da sintomatologia: grupo I (dia 0) e grupo II
(dia 30). As coletas de lágrima foram feitas com intervalo de 15 em 15 dias e a última com 30
dias até completar o primeiro trimestre, totalizando seis amostras. A dosagem da IgG e IgM
séricas foi feita pelo método de imunofluorescência descrita por Camargo (1964). Para
pesquisa de IgAs anti-T. gondii na lágrima foi utilizado o método descrito por Lynch et al.
(2004) e a dosagem pela técnica de enzima imunoensaio (ELISA). Todos os pacientes tiveram
IgG sérica positiva e IgM sérica negativa. Exceto um, todos os pacientes apresentavam IgAs
anti-T. gondii no dia 15°, começando a negativar após 60 dias do início dos sintomas. Os
níveis do anticorpo assim como o perfil deste, foram diferentes para cada paciente. Não foi
visto diferença estatisticamente significante entre os intervalos estudados. Houve reatividade
também do olho sadio, que na sua maioria acompanhou a produção de IgAs dos olhos
doentes. Podemos concluir que a dinâmica da IgA secretora anti-T. gondii na lágrima, no
primeiro trimestre da doença ativa, ocorre de forma variável para cada indivíduo.
Palavras-chave: toxoplasmose ocular; imunoglobulina A; lágrima; imunodiagnóstico.
ABSTRACT
Toxoplasma gondii (T.gondii) is the main cause of posterior uveitis and toxoplasmic
retinochoroiditis is considered the most common infection of the retina. Serological tests are
important tools for the diagnosis of toxoplasmosis, but in ocular toxoplasmosis, usually there
is no correlation between levels of serum antibodies and eye symptoms in the patient. Thus, in
the case of ocular toxoplasmosis, the serological tests are of little help. Some studies have
shown that the quantification of antibodies in the aqueous humor can be enlightening,
however they are tests that require puncture of anterior chamber, this is an invasive
procedure. However, other studies have concluded that through the determination of the
secretory immunoglobulin A (sIgA) anti-T.gondii in tears, it is possible to differentiate
patients with active uveitis caused by toxoplasmosis, from patients with uveitis caused by
other etiologies. This study aimed to evaluate the dynamics of the production of anti-sIgA
T.gondii in tears in patients with posterior uveitis presumably by T.gondii active during the
first quarter of the disease. Sixteen patients who had the classic form of eye disease, or
lesions of posterior uveitis with active satellite lesion healed, were divided into two groups at
the start of the symptoms: Group I (day 0) and group II (30th). Tears were collected every
15th day and the last sample with 30 days to complete the first quarter. The determination of
IgG and IgM serum was done by the immunofluorescence method described by Camargo
(1964). To search for tear anti T.gondii sIgA, was used the method described by Lynch et al.
(2007) through technique of enzyme immunoassay (ELISA).. All patients had serum IgG
positive and serum IgM negative. Except one, all the patients showed positive IgAs at the
15th. day Negativation was observed in few of them around the 60th day. Antibody levels so
their profile was individually different although not statistically significant. No statistically
significant difference was seen between the ranges studied. There was also reactivity of the
healthy eye, which mostly followed the production of sIgA eye patients. We can conclude that
the momentum of anti-secretory IgA T.gondii in tears in the first quarter of the active disease,
occurs in a variable for each individual.
Keywords: ocular toxoplasmosis; immunoglobulin A; tear; immunodiagnosis.
LISTA DE TABELAS
ARTIGO
Tabela 1. Distribuição numérica e percentual por sexo, faixa etária e procedência dos
portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii atendidos no HC
da UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008.
Tabela 2. Distribuição qualitativa numérica da reatividade da IgAs anti-T. gondii da
lágrima nos olhos doentes, dos grupos 1 e 2*, de pacientes portadores de uveíte
posterior ativa presumivelmente por T. gondii atendidos no HC da UFPE, no período
de janeiro a outubro de 2008.
Tabela 3. Médias, valor de “p” e desvio padrão dos níveis de absorbância da IgAs
anti-T. gondii da lágrima nos olhos doentes e sadios, dos grupos 1 (A) e 2 (B), dos
pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii
atendidos no HC da UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008, de acordo com
os dias que foram realizadas as coletas*.
Tabela 4. Comparação entre as médias, valor de “p” e desvio padrão dos níveis de
absorbância da IgAs anti-T. gondii da lágrima nos olhos doentes e sadios, entre os
grupos 1 (A) e 2 (B), dos pacientes portadores de uveíte posterior ativa
presumivelmente por T. gondii atendidos no HC da UFPE, no período de janeiro a
outubro de 2008, relacionadas de acordo com o início dos sintomas*.
LISTA DE ABREVIATURAS
c. capítulo
CCS Centro de Ciências da Saúde
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
DNA ácido desoxirribonucléico
EALT tecido linfático associado ao olho
ELISA Enzime-Linked Imunosorbent Assay
et al. e outros
GALT gut associated lymphoid tissue
HC Hospital das Clinicas
IFA imunofluorescência indireta
IgA imunoglobulina A
IgAs imunoglobulina A secretora
IgAp imunoglobulina A dimérica
IgE imunoglobulina E
IgG imunoglobulina G
IgM imunoglobulina M
INF interferon
INFγ interferon gama
IL-4 interleucina 4
IL-10 interleucina 10
IL-12 interleucina 12
ISAGA Imununosorbent Agglutination Assay
LIKA Laboratório de imunologia Keizo-Asami
MALT mucosa associated lymphoid tissue
n. número
nm nanômetros
NO óxido nítrico
NK natural killer
p. página
PCR Polymerase Chain Reaction
PE Pernambuco
SC componente secretor
SIDA Síndrome de imunodeficiência adquirida
T. gondii Toxoplasma gondii
TGFα fator transformador de crescimento
TGI trato gastrointestinal
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
v. volume
μL microlitros
μm micrômetro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 15
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 18
2.1 Aspectos gerais da toxoplasmose .......................................................................... 19
2.2 Aspectos gerais da toxoplasmose ocular ............................................................... 20
2.3 Aspectos imunológicos da toxoplasmose .............................................................. 21
2.4 Aspectos imunológicos do olho .............................................................................. 23
2.5 Diagnóstico da toxoplasmose ................................................................................. 26
2.6 Diagnóstico da toxoplasmose ocular ..................................................................... 29
3 QUESTÃO DA PESQUISA ...................................................................................... 32
4 OBJETIVOS .............................................................................................................. 34
4.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 35
4.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 35
5 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................ 36
5.1 Desenho do estudo .................................................................................................. 37
5.2 Pacientes da pesquisa ............................................................................................. 37
5.2.1 Critérios de inclusão .............................................................................................. 37
5.2.2 Critérios de exclusão ............................................................................................. 37
5.2.3 Formação dos grupos da pesquisa ......................................................................... 38
5.3 Definição e categorização das variáveis ............................................................... 38
5.3.1 Definição de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma
clássica ........................................................................................................................... 38
5.3.2 Definição do teste de IgA secretora anti-T. gondii ................................................ 39
5.3.3 Categorização das variáveis biológicas e sociais .................................................. 39
5.3.3.1 Idade ................................................................................................................... 39
5.3.3.2 Sexo .................................................................................................................... 40
5.3.3.3 Procedência ........................................................................................................ 40
5.4 Método de coleta de dados ..................................................................................... 40
5.4.1 Dados clínicos ....................................................................................................... 40
5.4.2 Processamento dos dados ...................................................................................... 41
5.5 Método de coleta das amostras ............................................................................. 41
5.6 Análise laboratorial ................................................................................................ 42
5.6.1 Determinação da IgA secretora anti-T. gondii ...................................................... 42
5.6.2 Determinação de IgM e IgG anti-T. gondii no soro .............................................. 43
5.7 Análises estatísticas ................................................................................................ 43
5.8 Considerações éticas ............................................................................................... 43
6 ARTIGO ..................................................................................................................... 44
ARTIGO: DINÂMICA DA IgA SECRETORA ESPECÍFICA NA LÁGRIMA
EM PACIENTES PORTADORES DE UVEÍTE POSTERIOR ATIVA
PRESUMIVELMENTE POR Toxoplasma gondii DURANTE O PRIMEIRO
TRIMESTRE DA DOENÇA ....................................................................................... 45
RESUMO ....................................................................................................................... 46
ABSTRACT ................................................................................................................... 46
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 47
2. PACIENTES E MÉTODOS ....................................................................................... 48
3. RESULTADOS........................................................................................................... 50
4. DISCUSSÃO............................................................................................................... 52
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 55
TABELAS ...................................................................................................................... 58
FIGURA... ...................................................................................................................... 62
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................... 63
8 SUGESTÕES ............................................................................................................. 65
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 67
10 APÊNDICES ............................................................................................................ 76
APÊNDICE N° 1 – Questionário específico ............................................................... 77
APÊNDICE N° 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ......................... 81
11 ANEXOS .................................................................................................................. 83
ANEXO N° 1 – Aprovação pela Comissão de Ética em Pesquisa da Universidade
Federal de Pernambuco – CEP/CCS/UFPE 84
ANEXO N° 2 – Instrução aos autores......................................................................... 85
16
1 INTRODUÇÃO.
Na atualidade, é aceito que o Toxoplasma gondii (T. gondii) constitui a principal causa
de uveíte posterior, e a retinocoroidite toxoplásmica é considerada a infecção mais comum da
retina (JAIN; UPPAL; METHA, 1998; HOLLAND; LEWIS; O’CONNOR, 2002). No Brasil,
a toxoplasmose é responsável por aproximadamente 80% dos casos de uveíte (ORÉFICE;
OLIVEIRA, 2005).
A lesão clássica da toxoplasmose ocular é uma retinocoroidite granulomatosa, focal e
necrosante (HOGAN, 1958), podendo apresentar consideráveis variações nas formas clínicas,
descritas na literatura como atípicas (SMITH; CUNNINGHAM, 2002; FARDEAU et al.,
2002; LIEB et al., 2004), o que dificulta o seu diagnóstico.
O diagnóstico laboratorial da toxoplasmose ocular é de fundamental importância, uma
vez que há uma pluralidade de apresentações clínicas compatíveis com outras doenças. O
diagnóstico definitivo depende da identificação do parasito nos líquidos orgânicos
(KAWAZOE, 1988) ou através da identificação do DNA (ácido desoxirribonucléico) do
mesmo em fluidos oculares ou secções da retina (KASUMI et al., 1996; JONES et al.2000).
Os testes sorológicos constituem uma ferramenta significativa para o diagnóstico da
toxoplasmose, todavia, na toxoplasmose ocular, geralmente não há correlação entre os níveis
de anticorpos séricos e a sintomatologia ocular do paciente, sendo comum a ocorrência de
títulos baixos de IgG. A pesquisa de IgM, na maioria das vezes, é negativa (ORÉFICE;
OLIVEIRA, 2005). Sendo assim, pode-se concluir que os testes sorológicos pouco ajudam no
diagnóstico da doença ocular, principalmente nos casos de lesões atípicas. Alguns estudos têm
demonstrado que a quantificação de títulos de anticorpos no humor aquoso pode ser
esclarecedora (GARGEW et al., 2005; GARGEW; BOEHNKE, 2006), contudo, é um exame
que necessita punção da câmara anterior, tratando-se de um procedimento invasivo.
Também foi verificada a resposta imune das mucosas contra o T.gondii detectando IgA
secretora (IgAs) específica na lágrima. Mack e Mcleod (1992) demonstraram que IgAs anti-T.
gondii está presente no colostro de mulheres com infecção crônica e aguda, indicando que a
infecção aguda efetivamente coincide com uma resposta imunitária das mucosas. Segundo
Meek et al. (2000), as lágrimas de indivíduos cronicamente expostos apresentam anticorpos
específicos IgAs anti-T.gondii.
Em 2004, Lynch et al. verificaram a existência de intensa associação entre uveíte
posterior ativa presumivelmente por T.gondii e IgAs específica na lágrima. Em 2007, esses
17
mesmos autores concluíram que através da determinação da IgAs anti-T. gondii na lágrima é
possível diferenciar pacientes portadores de uveíte posterior ativa por toxoplasmose ocular de
pacientes portadores de uveíte causadas por outras etiologias.
Deste modo, é possível diagnosticar pacientes com uveíte posterior ativa por
toxoplasmose ocular através de um método não invasivo, de fácil execução e de baixo custo.
Vale ressaltar, que não foram encontradas descrições na literatura consultada, no que diz
respeito à dinâmica da imunoglobulina específica da lágrima. Assim sendo, justifica-se o
presente estudo que tem como objetivo descrever o comportamento da IgAs específica anti-T.
gondii na lágrima no período ativo e de resolução imediata da doença ocular, o que pode
contribuir para definir adequadamente o estágio evolutivo da mesma.
19
2 REVISÃO DA LITERATURA.
2.1 Aspectos gerais da toxoplasmose
O termo toxoplasmose é utilizado para descrever os aspectos clínicos ou patológicos
de uma infecção parasitária, cujo agente etiológico é o T. gondii, desde uma infecção primária
assintomática até persistência crônica do mesmo nos tecidos.
O T. gondii pertence à classe Sporozoa. É um protozoário monoxênico e intracelular
obrigatório, que mede de 2 a 5μm. Possui três formas evolutivas: taquizoíta, bradizoíta e
esporozoíta (KAWAZOE, 1988). A forma taquizoíta apresenta rápida multiplicação e é
responsável pela fase aguda da infecção. A forma bradizoíta é encontrada no interior de cistos
teciduais, multiplica-se lentamente e é responsável pela forma crônica da infecção. A forma
esporozoíta se desenvolve no esporocisto, dentro do oocisto, que é eliminado nas fezes dos
felinos, únicos hospedeiros definitivos do parasito. Cada oocisto contém dois esporocistos,
altamente infectantes para aves, mamíferos e o homem. Oocistos são formados somente no
intestino dos felídeos sendo excretados pelas fezes por um período de 15 a 20 dias. Todas as
formas evolutivas são infectantes, tanto para os hospedeiros definitivos, quanto para os
hospedeiros intermediários (KASPER, 2002).
Em geral, a transmissão ocorre pela via oral e pode ser atribuída à ingestão de oocistos
maduros a partir do solo contaminado ou de bradizoítos na carne mal cozida. Hoje, sabe-se
que a água é um importante meio de transmissão pelo transporte de oocistos. Há ainda a
transmissão transplacentária, que é expressiva, pois um terço das mulheres que adquirem a
infecção pelo T. gondii durante a gravidez transmitem o parasito para o feto (KASPER, 2002).
Existem relatos também de transmissão através de transplantes, transfusões sanguíneas e
acidentes com material de laboratório (MONTOYA; LIESENFELD, 2004).
Após a ingestão de cistos teciduais contendo bradizoítos ou de oocistos contendo
esporozoítos, os parasitos são liberados dos cistos por um processo digestivo. Os bradizoítos
são resistentes ao efeito da pepsina e invadem o trato gastrointestinal (TGI) do hospedeiro. A
partir do TGI, os parasitos disseminam-se para vários órgãos, como tecido linfático,
musculatura esquelética, miocárdio, retina, placenta e sistema nervoso central (KASPER,
2002).
20
A toxoplasmose é uma doença amplamente difundida em nosso meio e pode-se
afirmar que essa zoonose apresenta uma distribuição universal. O T. gondii pode infectar
diversos mamíferos e aves. Sua distribuição depende de fatores geográficos, idade da
população e condições sócio-econômicas (KASPER, 2002; ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005).
No homem, a doença pode se manifestar de duas formas: congênita e adquirida. A
infecção adquirida após o nascimento pode ser assintomática, porém, com freqüência, resulta
na persistência crônica de cistos nos tecidos do hospedeiro (KASPER, 2002). Pode ainda
apresentar-se com sintomas similares a um resfriado comum (SILVEIRA et al., 1988) ou
gerar quadros graves, especialmente em hospedeiros imunossuprimidos (GIRARD et al.,
1997; LANJEWAR et al., 1998). A toxoplasmose congênita resulta da transferência
transplacentária dos parasitos da mãe infectada para o feto, sendo a gravidade das seqüelas
inversamente proporcional ao estágio da gestação (KASPER, 2002).
Assim, pode-se classificar clinicamente a toxoplasmose em cinco categorias de
infecção: adquirida em pacientes imunocompetentes, adquirida durante a gravidez, congênita,
adquirida ou reativada em pacientes imunodeficientes e a infecção ocular. Cada categoria
clínica nem sempre tem um quadro clínico exclusivo para toxoplasmose, sendo necessário
diagnóstico diferencial (MONTOYA, 2002).
2.2 Aspectos gerais da toxoplasmose ocular.
A toxoplasmose ocular é a principal causa de uveíte posterior no mundo e uma
importante causa de perda da visão (MC CAMMEL et al., 1996; MONTOYA;
REMINGTON, 1996; ROTHOVA et al., 1996) tanto em pacientes imunocompetentes como
imunodeprimidos. Na Colômbia, a toxoplasmose ocular representa 4% das consultas
oftalmológicas (VARELA, 1996).
A prevalência da toxoplasmose ocular é variável entre as áreas estudadas. Nos Estados
Unidos, é a principal causa de prejuízo visual, correspondendo entre 30 e 50% de todos os
casos de uveíte posterior (ROBERTS; McLEOD, 1999). No Brasil, é responsável por
aproximadamente 80% dos casos de uveíte (ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005). Os estados do Rio
Grande do Sul, Paraná e Rio de Janeiro apresentam alta incidência de toxoplasmose ocular.
Destaca-se que a cidade de Erechim, no Rio Grande do Sul, apresentou um índice elevado,
21
alcançando 17,7% em uma população estudada de pouco mais de mil pessoas (GLASSNER et
al., 1992).
A toxoplasmose ocular pode ocorrer tanto na forma adquirida, como na congênita. Esta
aparentemente é a mais frequente, podendo ser subdividida em forma neonatal, quando a
lesão está presente ao nascimento, e a forma tardia, que pode acontecer em qualquer época da
vida, em geral entre a segunda e terceira décadas. A toxoplasmose ocular adquirida pode ser
subdividida em concomitante, quando ocorre junto com a doença sistêmica, e tardia, quando
há um intervalo entre o acometimento sistêmico e ocular. (ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005)
O T. gondii apresenta neurotropismo e por essa razão, a localização ocular inicial é a
retina, alcançando a mesma pela circulação retiniana ou mais raramente, pela circulação
coroidea (TABBARA, 1990). A proliferação de taquizoítos provoca necrose celular
resultando em retinite necrosante, o que pode levar ao comprometimento das estruturas
subjacentes, sendo chamadas de retinocoroidite toxoplásmica.
A toxoplasmose ocular é uma doença de caráter recidivante. Estas recidivas podem
ocorrer nas margens das lesões ou até mesmo em áreas longe do foco primário, que podem ser
causadas pela liberação de parasitas dos cistos na retina, enquanto que a reação inflamatória
(uveíte) e suas complicações associadas seriam respostas de hipersensibilidade aos antígenos
do toxoplasma (O'CONNOR, 1970).
2.3 Aspectos imunológicos da toxoplasmose.
A infecção pelo Toxoplasma provoca uma cascata de respostas imunes protetoras no
hospedeiro, induzindo resposta celular e humoral. A infecção primária pelo Toxoplasma induz
a resposta celular, a qual é considerada a principal defesa do hospedeiro contra o parasito.
Durante esta fase, neutrófilos e macrófagos através da fagocitose e células natural killer (NK)
através da citotoxicidade compõem a principal resposta do hospedeiro, como também a
produção de INF-gama pelas células NK. Macrófagos e células dendríticas apresentam o
antígeno às células T CD4+ e CD8+, induzindo uma resposta Th1 através da produção de IL-
12. O TNF-alfa e o óxido nítrico são produzidos por macrófagos ativados para atuarem na
destruição do parasito. A resposta Th2 também participa da defesa do hospedeiro através da
produção de IL-4 e IL-10 (CORREA et al., 2007; DAWSON et al., 2005). Este conjunto de
ativações pode levar a morte do parasito. Quando o parasito não é fagocitado e entra no
22
macrófago por penetração ativa, ele continuará a se replicar e esta replicação pode representar
o mecanismo de transporte e disseminação para órgãos distantes. O Toxoplasma infecta todo
tipo de células por meio de um processo ativo (KASPER, 2002). A sobrevida do taquizoíto é
devida à formação de um vacúolo parasitóforo que o protege contra fusão lisossomal
(SIBLEY et al., 1985).
Os anticorpos são produzidos em resposta a infecção, os quais têm a capacidade de
lisar os taquizoítos extracelulares através da ativação do Sistema Complemento. O
aparecimento dos anticorpos traduz a resposta humoral à infecção recém adquirida
(CAMARGO; LESER; LESER, 1977).
Assim, ainda na vigência de parasitemia, é observado que nas primeiras semanas da
primoinfecção, surgem anticorpos específicos representados pelos isotipos IgM, IgA, IgE e
principalmente IgG, caracterizando o perfil da toxoplasmose recente. A IgG neste estágio
apresenta baixa avidez (CAMARGO, 2001).
Na evolução da infecção configura-se o perfil sorológico de transição, com níveis
elevados de IgG, de avidez crescente. Os níveis dos anticorpos IgA, IgE e IgM vão
decrescendo, podendo de forma ocasional, serem encontrados em baixos títulos.
Progressivamente, esse quadro dá lugar ao perfil de infecção latente ou crônica, que se
mantém por toda a vida com anticorpos IgG de baixos títulos e de alta avidez, podendo ainda
ser encontrados resíduos de IgM. A transição do perfil sorológico de infecção recente para o
perfil de infecção latente pode ter duração de semanas ou meses, dependendo do estado
imunitário dos pacientes. Os anticorpos IgM nem sempre significam infecção ativa.
(CAMARGO, 2001).
A IgA específica no soro aparece, em regra geral, duas a quatro semanas após a
primoinfecção, com pico em redor do segundo ou terceiro mês, desaparecendo após sete a
nove meses. Pode ser encontrada elevada até um ano após a infecção se os métodos utilizados
forem sensíveis (FRANCIS; JOYNSON, 1993).
A IgA corresponde apenas 10 a 15% de todas as imunoglobulinas séricas, porém é a
imunoglobulina que predomina nas secreções mucosas.
A IgA é produzida pelos plasmócitos que migram para a porção subepitelial dos tecidos.
A IgA produzida é secretada como um dímero, diferentemente da IgA sérica, que é
monomérica. Esse dímero está ligado por uma proteína chamada cadeia J, que também é
sintetizada pelos plasmócitos. Esse complexo constitui a IgA dimérica (IgAp). O transporte
transepitelial é feito através de uma glicoproteína conhecida como “componente secretor”
23
(SC), que é expresso no epitélio acinar, e possui alta afinidade com o complexo formado,
permanecendo ligada formando a IgAs (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2007).
Após a descoberta da produção de imunoglobulinas nas membranas mucosas por Little
(1969), muitos estudos vêm evidenciando a presença de anticorpos de mucosa na saliva,
fluidos intestinais, colostro e lágrima.
Sen e Sarin (1979) demonstraram que a IgA secretora é a principal imunoglobulina
produzida na mucosa ocular durante um processo de doença ocular. Esta imunoglobulina
corresponde a 70% das proteínas secretadas na lágrima (BRANDTZAEG; JOHANSEN,
2005).
Em 1990, Chardès et al. descreveram que as membranas mucosas do organismo são
induzidas a produzir IgAs durante a infecção com os cistos de T. gondii.
Estudos têm demonstrado que a IgAs está presente no colostro de mulheres com
infecção crônica e aguda, indicando que a infecção aguda verdadeiramente coincide com uma
resposta imunitária das mucosas (MACK; MCLEOD, 1992).
Em 1994, foram identificadas IgG, IgM e IgA anti-T. gondii na saliva de pacientes com
infecção aguda (HAJJER et al., 1994). Loyola et al. (1997) mostraram que a IgAs da saliva,
diferentemente da IgG, reflete os níveis da IgA sérica.
A presença de anticorpos IgG, IgM e IgA intraocular vem sendo relatada desde a década
de 60 e, em alguns estudos, tem sido demonstrada sua síntese no próprio olho (TURUNEN,
1983; RISS, 1995; KLAREN, 1998).
2.4 Aspectos imunológicos do olho.
A superfície ocular, do ponto de vista imunológico, é composta pela conjuntiva,
glândula lacrimal e pelo sistema de drenagem lacrimal. Essas estruturas compõem o tecido
linfático associado ao olho (EALT-eye associated lymphoid tissue), conhecido como o mais
novo componente do sistema imune de mucosa (KNOP; KNOP, 2002; MEEK et al., 2003).
Os linfócitos e plasmócitos formam a principal população de leucócitos na superfície
ocular, constituindo o tecido linfóide que é distribuído por toda conjuntiva, principalmente na
região tarsal. A superfície ocular apresenta características em comum com o sistema imune de
mucosa: linfócitos T CD8+ em maior quantidade que linfócitos T CD4+ no epitélio (camada
basal) e no nível da lâmina própria ocorre o inverso. Os plasmócitos, em geral, são
24
encontrados na lâmina própria, onde principalmente é produzida a IgAs (KNOP; KNOP,
2000).
Esta estrutura básica da conjuntiva se estende para todo sistema de drenagem lacrimal,
como canalículo nasolacrimal, saco e ducto nasolacrimal (KNOP; KNOP, 2001; MEEK et al.,
2003).
Macrófagos, células dendríticas e mastócitos também são encontradas na conjuntiva e
participam da imunidade da mucosa, juntamente com proteínas do sistema complemento. Os
mastócitos atuam produzindo vários fatores, incluindo citocinas, que recrutam outros
leucócitos e organizam a reação inflamatória contra destruição do patógeno.(STAHL et al.,
2002)
A glândula lacrimal está intimamente relacionada com a conjuntiva através de 10 a 12
ductos excretores. Apresenta uma maior quantidade de plasmócitos que linfócitos
intraepiteliais. Os linfócitos T CD8+ são mais frequentes que os linfócitos T CD4+ na
glândula, em contraste com a conjuntiva. O complexo IgAs (complexo secretor) formado é
transportado por endocitose até a superfície apical onde, o componente secretor protege a
imunoglobulina da ação das enzimas presentes no filme lacrimal e não fixa complemento
(WIECZOREK et al., 1988; FRANKLIN; KENYON;TOMASI, 1973).
Existem dois estimuladores do recrutamento da IgAs que permitem sua saída da
glândula lagrimal: o fator transformador de crescimento alfa (TGFα), produzido pelas células
T e macrófagos, e a interleucina-5 produzida pelos linfócitos T CD4+ ativados (DE LA
TORRE; NUÑEZ, 2002).
O filme lacrimal também contribui com a defesa imune da superfície mucosa ocular,
apresentando vários componentes, entre os quais podemos citar diversas proteínas que
possuem propriedades antiinflamatórias e antimicrobianas, como a lactoferrina, lisozima,
fosfolipase A2 e IgAs. O filme lacrimal é produto do sistema secretor lacrimal, composto pela
glândula lacrimal principal e acessórias, estas distribuídas na substância própria da conjuntiva.
Ainda participam da produção do filme lacrimal, glândulas produtoras de lipídeos e células
produtoras de mucina. A mucina também contribui para a proteção da superfície ocular,
formando uma camada sobre o epitélio corneano resistente a degradação enzimática,
limitando a adesão de microorganismos na córnea (SACK et al, 2005).
Assim, este extenso componente do sistema imune de mucosas, o EALT, juntamente
com uma rede de vasos linfáticos que drenam para os linfonodos pré-auriculares e
submandibulares, representam o sistema de defesa da superfície ocular (KNOP; KNOP,
2002).
25
Esse mecanismo imunológico, combinado com um ativo sistema fagocitário e de
lisozimas no filme lacrimal, forma a primeira linha de defesa do bulbo ocular contra a invasão
microbiana e estabelecimento de processos infecciosos dos quais, a IgA secretora parece ser o
anticorpo mais importante (SETTIPANE; CONNEL; SHERMAN, 1965; JAN et al., 2002).
Além da superfície ocular, existe o compartimento intraocular, que é composto por
todas as estruturas intraoculares, juntamente com os fluidos intraoculares (humor aquoso e o
vítreo), separados do sangue através de tight junctions (zônula ocludens) que se encontram
entre as células epiteliais e endoteliais. Os capilares da circulação vascular retiniana e o
epitélio pigmentar da retina contêm zônulas ocludens. Eles constituem uma efetiva barreira
para moléculas solúveis e contribuem para constituição do humor aquoso e vítreo. Tanto a
ausência de linfáticos intraoculares, quanto a barreira sanguínea ocular oferecem importante
contribuição anatômica para a existência do imunoprivilégio (KAUFMAN; ALM, 2003;
MEEK et al., 2003; KAPLAN, 2007).
Diversos fatores condicionam o imunoprivilégio, como: receptores de superfície das
células parenquimatosas oculares com função imunomodulatória, fatores imunomoduladores
solúveis presentes no humor aquoso, regulação do sistema complemento dentro do olho,
células apresentadoras de antígeno promotoras de tolerância antigênica e como já descrita, a
barreira sanguínea ocular e a não convencional via linfática existente no olho (KAPLAN;
NIEDERKORN, 2007).
O imunoprivilégio depende da integridade anatômica de todas essas estruturas, e do
adequado funcionamento bioquímico, que em conjunto minimizam o dano visual que pode ser
causado pelas respostas imune celular principalmente, e humoral contra potenciais patógenos.
Acreditava-se que o imunoprivilégio e a inflamação não podiam coexistir e que a inflamação
intraocular o eliminaria. Porém, após vários estudos, sabe-se que o olho desenvolve múltiplos
mecanismos compensatórios para mantê-lo. (MO; WANG; KAPLAN, 2007).
O estímulo antigênico na mucosa ocular é semelhante à de outras mucosas. Os
linfócitos após entrarem em contato com antígenos sofrem diferenciação em células efetoras
com atividade celular ou humoral, sendo neste caso a IgAs mais frequente. Esses linfócitos
ativados, através dos vasos linfáticos chegam à circulação sanguínea e, após contato com
outras mucosas, retornam para circulação linfática, o que é chamado de recirculação
linfocitária. Este fato caracteriza a superfície ocular como parte do tecido linfocitário
associado de mucosa (MALT), o que pode esclarecer a presença de anticorpos na lágrima
(McCLELLAN; FRACO; FRACS, 1997; KNOP; KNOP, 2007).
26
Sapse et al. (1967) relataram que a aplicação de antígenos na conjuntiva resulta em
produção local de células com memória específica que respondem a posteriores aplicações
tópicas do mesmo antígeno. Experimentos mostram que animais imunizados por via sistêmica
a um antígeno específico produzem anticorpos circulantes contra o antígeno, os quais podem
ser recuperados no filme lacrimal.
Pu et al. (1983) descreveram que a imunização intestinal não resulta em imunização
conjuntival, porém parece estimular a conjuntiva através de células específicas com memória,
que migram para os folículos linfáticos conjuntivais.
Estudos realizados por Meek et al. (2000), em toxoplasmose ocular, concluíram que as
lágrimas de muitos indivíduos cronicamente expostos apresentam anticorpos IgAs anti-T.
gondii como resultado de respostas imunes passadas.
Lynch et al. (2004) estudaram associação entre uveíte posterior ativa presumivelmente
por T. gondii e IgA secretora específica na lágrima, constatando que os pacientes com a
doença tinham 18 vezes mais chances de apresentar IgA secretora da lágrima positiva quando
comparado com os controles sadios.
Assim, inibição da aderência de patógenos, neutralização de vírus, enzimas e toxinas,
inibição da absorbância de antígenos, bem como diagnóstico de doenças oculares, são
algumas das funções da IgAs. Porém, a dinâmica da produção desta imunoglobulina, frente ao
T. gondii, em pacientes portadores de toxoplasmose ocular ainda não está bem esclarecida.
2.5 Diagnóstico da toxoplasmose.
O diagnóstico laboratorial da toxoplasmose pode ser feito a partir de diversos métodos
e baseados nas diferentes variedades clínicas que apresenta a partir da infecção pelo T gondii.
O diagnóstico da toxoplasmose aguda pode ser definido por isolamento do parasito a
partir do sangue ou de outros líquidos corporais, através da subinoculação da amostra na
cavidade peritoneal de um camundongo. O isolamento do T gondii no líquido peritoneal
reflete infecção aguda. É possível o isolamento do mesmo na biópsia de tecidos, porém a
presença de cistos teciduais não deve ser interpretada como toxoplasmose aguda (KASPER,
2002).
Na fase aguda da doença é possível detectar material antigênico do parasito ou
complexo imune de antígenos parasitários no soro do paciente (VAN KNAPEN;
27
PANGGABEN; VAN LEUSDEN, 1985). No entanto, pela transitoriedade e inconstância da
antigenemia, é um método de pouco valor diagnóstico, tendo contudo boa sensibilidade nos
casos de neurotoxoplasmose (FACHADO et al., 1994).
Na fase crônica, o parasito pode ser encontrado de forma esporádica em cortes
histológicos corados pela hematoxilina ou evidenciar antígenos por imuno-histoquímica,
utilizando anticorpos específicos e marcação imunofluorescente ou imunoenzimática
(CAMARGO, 2001).
A utilização da PCR (“Polymerase Chain Reaction”) permite a identificação de
segmentos característicos de ácidos nucléicos do parasito depois de ampliados pela reação em
cadeia da polimerase. Ou seja, é um método utilizado para detectar o DNA do T. gondii nos
fluidos corporais (sangue, líquido cerebroespinhal, humor aquoso, humor vítreo e lavado
broncoalveolar) e tecidos. Para identificação do toxoplasma, também podem ser amplificados
segmentos do DNA, que correspondem a diferentes genes, como P30, TRG1 e B1 ou DNA
ribossomal (CAMARGO, 2001).
Os procedimentos já mencionados possuem expressivo valor diagnóstico, porém são
limitados por dificuldades encontradas no crescimento de parasitos in vivo ou na identificação
de taquizoítos por métodos histológicos ou por frações proteicas no PCR (KASPER, 2002).
Por estas razões, a pesquisa de anticorpos anti-T gondii utilizando os testes sorológicos
transformaram-se num método rotineiro de diagnóstico.
Descrito por Sabin e Feldman (1948), a reação do corante que leva seu nome, conhecido
também como “dye test”, possui boa sensibilidade e especificidade. Mede principalmente
anticorpos IgG, que geralmente aparecem uma a duas semanas após o início da infecção,
apresentando pico entre a sexta e oitava semana, e diminuindo lentamente em um a dois anos
(ANDERSON; REMINGTON, 1975). Os títulos, geralmente baixos, podem persistir por toda
a vida. O teste é pouco usado por utilizar microorganismos vivos na reação.
O teste de imunofluorescência indireta (IFA) permite a identificação de anticorpos IgG,
IgM (REMINGTON; MILLER; BROWNLEE, 1968) e demais imunoglobulinas, sendo um
método prático. Através dos soros reagentes são realizadas diluições crescentes, que após
incubação com toxoplasmas fixados, são novamente incubadas com conjugado fluorescente e
o resultado é fornecido pela maior diluição reagente (CAMARGO, 2001).
Nos testes imunoenzimáticos (Enzime-Linked Imunosorbent Assay - ELISA), extratos
ou frações antigênicas do toxoplasma fixados em placas inertes são incubados com diluições
dos soros a testar. É adicionado o conjugado anti-anticorpo (IgG, IgM, IgA ou IgE)
enzimático, que ao acrescer o substrato desenvolve cor nos casos positivos, cuja intensidade,
28
lida no espectrofotômetro, é proporcional à quantidade de anticorpos no soro (CAMARGO,
2001).
Através dos testes de Immunoblot a reatividade de anticorpos para diferentes
componentes antigênicos do toxoplasma pode ser evidenciada. Tiras de nitrocelulose com
esses componentes, distribuídos como bandas de pesos moleculares crescentes, são incubadas
com soros ou outros líquidos orgânicos (líquor, humor aquoso). A reação é revelada por um
conjugado imunoenzimático (anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA) que origina perfis de reatividade,
que têm sido utilizados com fins diagnósticos, inclusive pela boa sensibilidade, que permite
evidenciar reações contra bandas específicas, por vezes insuficientes para originar um sinal
detectável em testes como ELISA (CAMARGO, 2001).
A captura dos anticorpos IgM anti-toxoplasma pode ser confirmada pela aglutinação de
suspensão de toxoplasmas, incubadas após o soro nas cavidades da placa, revestida por
anticorpos anti-IgM. Este é o teste ISAGA (Imununosorbent Agglutination Assay), que
possibilita a avaliação quantitativa dos graus de aglutinação resultantes. Também pode ser
utilizado para identificação de anticorpos IgA e IgE (DESMONTS ; NAOT; REMINGTON,
1981) e considerado útil como um indicador de infecção recente (STEPICK-BIEK et
al.,1990).
Foi introduzido o teste de avidez do anticorpo IgG, no qual a ligação ao seu respectivo
antígeno é avaliada pela maior ou menor facilidade da quebra da mesma (CAMARGO, 2001),
utilizada para diferenciar infecção recente da crônica (LIESENFELD et al., 2001). Esse
método se apóia no fato de que durante a infecção recente, os anticorpos fixam fracamente o
antígeno (baixa avidez), enquanto na fase crônica da doença a fixação é forte (avidez alta).
Estudos têm mostrado que os anticorpos de baixa afinidade podem persistir por meses após a
infecção aguda, não sendo utilizados para diagnóstico de infecção recente (PELLOUX et al.,
1998; COZON et al., 1998). Em sentido contrário, parece consenso que o teste de afinidade da
IgG é de utilidade para descartar infecção recente (LIESENFELD et al., 2001).
Foi realizado estudo que comparou o soro de 23 pacientes portadores de infecção por T.
gondii recentemente adquirida com o soro de 19 pacientes portadores de toxoplasmose com
até seis meses de duração, utilizando o teste de avidez da IgG. Concluíram que a baixa avidez
da IgG nem sempre identifica um caso de infecção recente, mas IgG com avidez alta, pode
excluir infecção primária com menos de cinco meses de evolução (PAUL, 1999).
29
2.6 Diagnóstico da toxoplasmose ocular.
Atualmente, o reconhecimento clínico das lesões fundoscópicas clássicas, aceitas
como padrão ouro (GARGEW, 2005; LYNCH et al., 2008) constitui o principal elemento
para o diagnóstico da retinocoroidite toxoplásmica. As lesões consideradas típicas são lesões
cicatrizadas, de margens definidas, com graus variáveis de hipertrofia do epitélio pigmentar
da retina e atrofia retinocoroidea, acompanhadas de uma lesão de corioretinite granulomatosa
focal necrosante, isolada ou múltipla, associada com vitreíte, tendo presença ou não de
vasculite dos vasos retinianos e comprometimento ou não das estruturas do pólo anterior.
Porém, quando há ocorrência de lesões atípicas, o diagnóstico, nestes casos, torna-se mais
difícil. Balansard et al. (2005) relataram que a retinocoroidite toxoplásmica pode simular a
necrose retiniana aguda.
Gargew et al. (2004) descreveram que a confirmação laboratorial em pacientes
portadores do quadro clínico considerado padrão ouro foi feita numa proporção que varia de
50 a 80%, dependendo do centro envolvido, bem como do método utilizado na determinação
dos anticorpos.
Van der Venn e Polak (1980) relataram que muitos adultos da Europa continental,
infectados pelo T gondii, apresentavam níveis de IgG insuficientes para diagnóstico de
toxoplasmose ocular.
Na toxoplasmose ocular, geralmente não há correlação entre os níveis de anticorpos
séricos e a sintomatologia ocular do paciente. É comum a ocorrência de títulos baixos de IgG,
e a pesquisa de IgM, na maioria das vezes é negativa (ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005).
Entretanto, os testes sorológicos ainda são os mais utilizados.
Nos casos de lesões atípicas, a sorologia negativa pode excluir a toxoplasmose, mas a
IgG positiva faz apenas o diagnóstico presuntivo da doença, devido à alta prevalência de
anticorpos na população.
Nos casos em que o diagnóstico diferencial se impõe, a determinação dos títulos de IgG
específica no humor aquoso pode fornecer esclarecimentos. Quando comparados os níveis de
anticorpos no soro com os encontrados no humor aquoso, é possível definir se há produção
intraocular de anticorpos, o que indica toxoplasmose ocular ativa. Isto constitui o Coeficiente
de Goldmann-Wittmer (GOLDMANN; WITTMER, 1954), assim calculado:
30
(Título de anticorpos no humor aquoso) x (IgG total no soro.)
÷
(Títulos de anticorpos no soro) x (IgG total no humor aquoso)
O resultado maior que três é considerado evidência de produção de anticorpo
intraocular.
Para a realização desse exame é necessária a punção da câmara anterior para coleta de
humor aquoso. Embora, a paracentese da câmara anterior do olho seja considerada um
procedimento com baixo risco, trata-se de um método invasivo que não está isento de
complicações, sendo algumas descritas na literatura, dentre as quais, a endoftalmite
(HELBIG et al. , 1995; CHEUNG; DURRANI; MURRAY, 2004).
Em 1997, Bornard e Gottrau analisaram soro e humor aquoso de 90 pacientes, medindo
o coeficiente de Goldmann-Wittmer, a fim de avaliar a produção local de anticorpos e
confirmar o diagnóstico clínico de toxoplasmose ocular. O resultado foi positivo em 41.1%
dos casos, incerto em 13.3% e negativo em 54.6% dos casos.
No estudo realizado por Quentin e Reiber (1997) foram analisados o soro e o humor
aquoso de pacientes portadores de uveíte grave com a técnica de ELISA. Nesta análise, os
anticorpos intraoculares mostraram-se mais eficientes para diagnóstico da toxoplasmose
ocular.
Gargew et al. (1998) avaliaram o humor aquoso e soro de 27 pacientes através da
dosagem de IgG, IgM, IgA e Coeficiente de Goldmann-Wittmer. A avidez também foi
testada, bem como a detecção de DNA do toxoplasma por PCR. Encontraram sensibilidade de
41% para o índice de Goldmann-Wittmer, 28% para PCR, 22% para a determinação de IgA e
15% para avidez de IgG. Concluíram que nenhum dos métodos foi o suficientemente sensível
para estabelecer o diagnóstico, mas a combinação dos quatro métodos atinge uma
sensibilidade alta como para justificar a análise do humor aquoso como método rotineiro.
Ronday et al. (1999) demonstraram que a dosagem da IgA intraocular aumenta a
sensibilidade do diagnóstico de toxoplasmose ocular. Este estudo foi realizado com 155
pacientes portadores de uveíte e foram verificadas as concentrações de IgA no humor aquoso
de anti-T.gondii IgG, IgA e DNA e no soro de IgG, IgA, IgM.
31
Outros estudos corroboram que a medida da IgA específica para T. gondii no humor
aquoso pode contribuir para o diagnóstico da doença ocular (KATINA; OREFICE; MINEO,
1992; GARWEG ; JACQUIER; FLUCKIGER, 1998; GARWEG ; JACQUIER; BOEHNKE,
2000).
Recentemente, Lynch et al. (2007) concluíram que através da determinação da IgA
secretora anti-T. gondii na lágrima é possível diferenciar pacientes portadores de uveíte
posterior ativa por toxoplasmose ocular de pacientes portadores de uveíte causada por outras
etiologias. Cabe salientar que este teste apresentou uma sensibilidade de 65,9% e
especificidade de 71,6% para diagnóstico da toxoplasmose ocular, sendo considerado válido,
merecedor de destaque por ser um método não invasivo, de baixo custo e fácil realização,
oferecendo ao oftalmologista clínico um parâmetro que pode reforçar a suspeita diagnóstica.
Conhecer o comportamento do anticorpo durante a evolução da doença constitui outro
elemento importante de apoio no manejo clinico da toxoplasmose ocular, razão que motivou a
presente pesquisa.
33
3 QUESTÃO DA PESQUISA.
Qual é a dinâmica da IgA secretora específica na lágrima em pacientes portadores de
uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica durante o primeiro
trimestre da doença?
35
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
-Descrever a dinâmica da IgA secretora específica na lágrima em pacientes
portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica.
4.2 Objetivos específicos
-Descrever os níveis de IgA secretora específica na lágrima nos portadores de
uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica no momento do
diagnóstico.
-Descrever os níveis de IgA secretora específica na lágrima nos portadores de
uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica em diversos períodos
após o diagnóstico clínico até o final do primeiro trimestre de acompanhamento.
37
5 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Desenho do estudo.
Considerando que o objetivo do trabalho é descrever o comportamento da IgA
secretora anti-toxoplasma na lágrima dos indivíduos portadores de uveíte posterior ativa
presumivelmente por T. gondii na forma clássica durante o primeiro trimestre, um estudo
descritivo do tipo série de casos com componente prospectivo foi considerado o mais
adequado, caracterizando-se pelo acompanhamento dos doentes selecionados através da
dosagem da imunoglobulina em questão.
5.2 Pacientes da pesquisa.
5.2.1 Critérios de inclusão.
Foram definidos como pacientes da pesquisa os indivíduos portadores de uveíte
posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica, maiores de 10 anos,
atendidos no Hospital das Clínicas (HC), da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE),
provenientes do Estado de Pernambuco (PE), no período de janeiro a outubro de 2008.
5.2.2 Critérios de exclusão.
Foram excluídos do estudo aqueles indivíduos que informaram fazer uso de
imunossupressores ou corticóides nos últimos dois meses, bem como aqueles que referiam ser
portadores de SIDA ou transplantados.
38
5.2.3 Formação dos grupos da pesquisa.
Foram atendidos 16 pacientes que apresentavam a forma clássica da uveíte posterior
presumivelmente por T. gondii. Os pacientes foram divididos em grupos de acordo com o
início dos sintomas relacionados à doença em questão. Desses, 12 relataram aparecimento da
sintomatologia com menos de três dias, sendo considerados como grupo 1. Os outros quatro
pacientes relataram 30 dias do início da sintomatologia, sendo agrupados no grupo 2.
5.3 Definição e categorização das variáveis.
5.3.1 Definição de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica.
Uveíte é um termo utilizado para designar inflamação da úvea (TOLEDO; RITCHER,
2002). A úvea é a camada média vascular do olho, composta pela íris, corpo ciliar e coróide,
protegida externamente pela córnea e esclera (VAUGHAN; ASBURY, 1982). A uveíte pode
ser classificada de diversas maneiras, sendo as mais utilizadas as que fazem referência à
localização anatômica das estruturas acometidas, ao comprometimento de um ou ambos os
olhos (uni ou bilaterais) e ao agente etiopatogênico.
Segundo a localização anatômica do processo inflamatório podem ser divididas em
uveíte anterior, posterior, intermediária ou difusa.
Uveíte anterior é aquela que aborda predominantemente o segmento anterior do olho:
íris e o corpo ciliar. A uveíte posterior acomete retina e coróide, podendo ser focal ou
multifocal. Intermediária é aquela que atinge primariamente o vítreo e retina periférica. A
uveíte difusa afeta todos os segmentos do olho, causando freqüentemente significativa baixa
visual.
Em geral, segundo o agente etiológico, pode ser dito que há agentes infecciosos
(bactérias, vírus, fungos, protozoários e helmintos), e não infecciosos, onde se incluem
fenômenos imunológicos, traumáticos, tóxicos e síndromes mascaradas (MEIRA; ROCHA;
ORÉFICE, 2005).
39
A uveíte posterior pode se apresentar de várias formas clínicas, porém, no presente
estudo só foi considerada a forma clássica, padrão-ouro, que pode ser definida pela presença
de lesões cicatrizadas, de margens bem definidas, graus variáveis de hipertrofia do epitélio
pigmentar da retina e atrofia retinocoroidea, acompanhadas de lesão satélite em atividade
inflamatória e vitreíte, presença ou não de vasculite retiniana, com ou sem comprometimento
das estruturas do pólo anterior ou do nervo óptico (STANFORD et al., 2002; GARWEG,
2005; ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005).
Também foram utilizados parâmetros laboratoriais, como a presença, no exame
sorológico, de IgM anti-T. gondii positiva (título de 1/16 ou maior) ou IgG anti- T. gondii
positiva (título de 1/16 ou maior) pelo método de imunofluorescência (CAMARGO, 1964;
ORÉFICE; OLIVEIRA, 2005).
5.3.2 Definição do teste de IgA secretora anti-T. gondii.
A presença na lágrima de IgA secretora anti-T. gondii, analisada por método
imunoenzimático (ELISA), utilizando antígeno bruto da cepa RH de T. gondii, em níveis
superiores aos definidos pelo ponto de corte, foi considerada como positiva ou indicativa de
atividade da doença.
5.3.3 Categorização das variáveis biológicas e sociais.
Observaram-se as variáveis biológicas idade e sexo, bem como procedência para
caracterização da amostra.
5.3.3.1 Idade.
A categorização dos grupos etários foi realizada de acordo com a distribuição descrita:
40
1 - de 10 a 19
2 - de 20 a 30
3 - de 31 a 40
4 - de 41ou mais
5.3.3.2 Sexo.
1- feminino
2- masculino
5.3.3.3 Procedência.
Corresponde ao lugar onde o paciente registrou seu domicílio. Utilizou-se a
classificação do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2006) que determina
como área metropolitana a capital, Recife, e 14 municípios adjacentes. Foram considerados os
170 municípios restantes da Zona da Mata, Agreste e Sertão como interior de Pernambuco.
1 - área metropolitana
2 - interior
5.4 Método de coleta de dados.
5.4.1 Dados clínicos.
Após anamnese e aferição da acuidade visual, foi realizado exame biomicroscópico,
com lâmpada de fenda marca Zeiss®, das estruturas do pólo anterior, bem como porção
41
anterior do vítreo. A biomicroscopia do vítreo e pólo posterior do globo ocular foi feita com
lente de não contato, de 78 dioptrias. Foi realizada também oftalmoscopia binocular indireta
com lente asférica de 20 dioptrias. Com os exames descritos, definiu-se o diagnóstico de
uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii na forma clássica.
Os pacientes foram examinados, no mínimo, por dois oftalmologistas do setor de
uveíte do HC/UFPE e, nos casos de discordância, por um terceiro oftalmologista.
5.4.2 Processamento dos dados.
Para processamento dos dados elaborou-se um formulário específico para coleta dos
dados, em consonância com os objetivos estabelecidos, o qual foi aplicado a todos os
participantes do projeto que aceitaram participar voluntariamente do mesmo (APÊNDICE 1).
Nesse protocolo foram anotadas as informações obtidas por meio da anamnese e do exame
clínico, bem como os resultados dos exames laboratoriais e evolução do paciente.
5.5 Método de coleta das amostras.
Após o exame clínico, foi realizada a coleta da amostra da lágrima utilizando fita de
papel filtro nº. 4A, marca Toyo®, de 5.0cm de comprimento e 0,5cm de largura, previamente
esterilizado. O papel foi dobrado 0.5cm antes da porção proximal, para ser inserido no terço
externo da pálpebra inferior, sinalizando o extremo terminal, correspondente ao dedo do
examinador. Tal precaução teve por objetivo facilitar a extração posterior da lágrima no
laboratório. Quando a coluna de lágrima molhou no mínimo 3.0cm da fita de papel, a mesma
foi retirada e colocada em papel não absorvente, sendo imediatamente refrigerada em
reservatório apropriado para transporte. Todos os pacientes tiveram lágrimas coletadas de
ambos os olhos separadamente, sendo especificado o olho comprometido na amostra de cada
paciente.
As amostras de lágrimas foram realizadas a partir do primeiro dia da consulta de cada
paciente, seguindo um intervalo de 15 em 15 dias, junto ao acompanhamento clínico, sendo a
42
última coleta realizada com intervalo de 30 dias. No total, foram seis coletas de amostras para
cada paciente.
Coleta da amostra de sangue: foi coletada uma amostra de 10ml de sangue venoso de
todos os participantes no estudo, no laboratório do HC, para obtenção do soro, que foi
congelado a -20º para posterior análise no laboratório do setor de Imunologia do Laboratório
de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA), o que foi utilizado para determinação de IgM e IgG
anti-toxoplasma.
5.6 Análise laboratorial.
As análises das amostras de lágrimas e soro foram efetuadas no setor de Imunologia
do LIKA-UFPE. Foram realizadas dosagens de imunoglobulinas séricas específicas (IgM e
IgG) e IgA secretora específica na lágrima.
5.6.1 Determinação da IgA secretora anti-T. gondii.
A determinação da IgAs seguiu o que foi descrito por Lynch et al. (2004), na qual foi
feita a preparação do antígeno, a partir da cepa RH do T. gondii mantida em camudongos
Swiss, os quais tiveram o líquido ascítico submetido à centrifugação e posterior ruptura do
parasita por congelamentos sucessivos, para obter extrato bruto de T. gondii, o que foi
coletado e armazenado a -4ºC.
Ensaio imunoenzimático (ELISA): para pesquisa dos anticorpos IgAs anti–T. gondii
na lágrima, foi utilizado o ELISA como descrito por Lynch et al. (2004). Para leitura da
densidade óptica foi utilizado leitor de ELISA BIORAD, com filtro de 492nm.
Em todos os ensaios foram incluídas amostras de referência de três lágrimas controles
negativos e três controles positivos, para controle da variação inter-ensaios. O valor do ponto
de corte, para cada ensaio realizado, foi determinado pela média aritmética mais dois desvios
padrões das densidades ópticas das amostras das lágrimas dos controles negativos.
43
A partir dos valores obtidos foram calculadas médias referentes a cada dia e grupo.
Assim, os dados apresentados representam o valor das médias e desvio padrão de cada grupo
tanto dos olhos doentes, quanto dos olhos sadios.
5.6.2 Determinação de IgM e IgG anti-T. gondii no soro.
Para a determinação do nível de imunoglobulinas no soro, foi utilizado o método de
imunofluorescência, segundo técnica descrita por Camargo em 1964.
5.7 Análises estatísticas.
Foi realizada uma análise descritiva e a apresentação das variáveis estudadas foi feita
através de tabelas. Para testar a suposição de normalidade dos dados foi aplicado o teste de
Kolmogorov-Smirnov. Para análise entre grupos foram aplicados o teste t-Student (grupo 1) e
o teste não-paramétrico de Mann-Whitney (grupo 2). Para a análise intragrupos foram
aplicados os testes de Análise de Variância (ANOVA) para dados pareados (grupo 1) e o teste
não-paramétrico de Friedman (grupo 2) (JEROLG, 1996). Nos testes estatísticos, foram
considerados significativos valores de ρ<0,05. Os programas utilizados para obtenção dos
cálculos estatísticos foram o Excel 2000 e o SPSS v8.0.
5.8 Considerações éticas.
O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da
Saúde da UFPE – CEP/CCS/UFPE com o registro N° 387/07 (ANEXO 1). Os voluntários
assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (APÊNDICE 2).
45
*Endereço para correspondência:
Elizabeth Malagueño de Santana
Campus Universitário, Cidade Universitária, Recife-PE-Brasil. CEP: 50670-901.
Tel.: + 55 81 2101 2515; Fax: + 55 81 2126 8485. E-mail: [email protected]
ARTIGO ORIGINAL
DINÂMICA DA IgA SECRETORA ESPECÍFICA NA LÁGRIMA EM PACIENTES
PORTADORES DE UVEÍTE POSTERIOR ATIVA PRESUMIVELMENTE POR
Toxoplasma gondii DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA DOENÇA.
DYNAMICS OF SPECIFIC SECRETORY IgA IN TEARS OF PATIENTS WITH ACTIVE
POSTERIOR UVEITIS PRESUMABLY BY Toxoplasma gondii ALONG THE FIRST
QUARTER OF THE DISEASE.
Mirelle Souza Leão Vasconcelos1 Luiz Felipe Lynch1 Narjara Tiane L. de Melo2 Silvana
Ferreira2 Wheverton Ricardo C.do Nascimento2 Maria Isabel Lynch1 Elizabeth Malagueño2*
1Setor de Oftalmologia do Hospital das Clínicas (HC) - Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE) – Brasil.
2Setor de Imunologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, Universidade Federal
de Pernambuco-LIKA/UFPE - Brasil.
46
RESUMO
Avaliou-se a dinâmica da produção da IgA secretora (IgAs) anti- Toxoplasma gondii na
lágrima em pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T.gondii.
Dezesseis pacientes foram divididos em dois grupos relacionados ao início da sintomatologia:
grupos 1 (dia 0) e 2 (dia 30). A lágrima foi coletada com intervalo de 15 dias e por último 30
dias até o final do primeiro trimestre. A dosagem da imunoglobulina G (IgG) e IgM séricas
anti-T.gondii foi pelo método de imunofluorescência e a da IgAs pelo Elisa. Todos os
pacientes tiveram IgG sérica positiva e IgM sérica negativa. A IgAs na lágrima foi positiva
em todos os pacientes, apresentando comportamento diferente em cada paciente. Não foi visto
diferença estatisticamente significante entre os intervalos estudados. Houve reatividade
também nos olhos sadios semelhante aos doentes. Conclui-se que a dinâmica da IgAs anti-
T.gondii na lágrima ocorre de forma variável para cada indivíduo.
Palavras-chave: toxoplasmose ocular; imunoglobulina A; lágrima; imunodiagnóstico.
ABSTRACT
To evaluate the dynamics of the anti-T.gondii secretory IgA (sIgA) production in tears of
patients with active posterior uveitis presumably by T. gondii. Sixteen patients were divided
into two groups related to the onset of symptoms: group 1 (day 0) and 2 (day 30). Tear
samples were collected with an interval of 15 days and finally 30 days until the end of the first
quarter. The determination of sera IgG and IgM anti- T. gondii was done by
immunofluorescence method and the sIgA by enzyme immunoassay technique. All patients
were IgG positive and IgM negative. The sIgA in tears showed up positive in all patients,
showing different concentrations along the time in each patient. No statistically significant
difference was seen between the ranges studied. There was also similar reactivity in healthy
47
eyes. We conclude that the dynamics of sIgA anti-T. gondii in tears shows an individual
variability.
Key-words: ocular toxoplasmosis; lacrimal secretory IgA; tear; immunodiagnosis.
1. INTRODUÇÃO.
O Toxoplasma gondii (T.gondii) constitui a principal causa de uveíte posterior, e a
retinocoroidite toxoplásmica é considerada a infecção mais comum da retina12 13. No Brasil, a
toxoplasmose é responsável por aproximadamente 80% dos casos de uveíte posterior19.
A lesão clássica da toxoplasmose ocular é uma retinocoroidite granulomatosa, focal e
necrosante10, podendo apresentar consideráveis variações nas formas clínicas, descritas na
literatura como atípicas4 14 24, o que dificulta o seu diagnóstico.
Os testes sorológicos constituem uma ferramenta significativa para o diagnóstico da
toxoplasmose, todavia na toxoplasmose ocular, geralmente não há correlação entre os níveis
de anticorpos séricos e a sintomatologia ocular do paciente, sendo comum a ocorrência de
títulos baixos de IgG. A pesquisa de IgM, na maioria das vezes, é negativa21. Alguns estudos
têm demonstrado que a quantificação de títulos de anticorpos no humor aquoso pode ser
esclarecedora7 8, porém, através de um exame que necessita punção da câmara anterior.
Embora, a paracentese da câmara anterior do olho seja considerada um procedimento com
baixo risco, trata-se de um método invasivo que não está isento de complicações, sendo
algumas descritas na literatura, dentre as quais, a endoftalmite3 9.
Foi verificada a resposta imune das mucosas contra o T.gondii detectando IgA secretora
(IgAs) específica na lágrima. Segundo Meek et al.17, as lágrimas de indivíduos cronicamente
expostos apresentam anticorpos específicos IgAs anti-T.gondii.
Lynch et al.15 verificaram a existência de intensa associação entre uveíte posterior ativa
presumivelmente por T.gondii e IgAs específica na lágrima e que através da determinação da
48
IgAs anti-T.gondii na lágrima é possível diferenciar pacientes portadores de uveíte posterior
ativa por toxoplasmose ocular de pacientes portadores de uveíte causadas por outras
etiologias16.
Não foram encontradas descrições na literatura sobre a dinâmica de produção da IgA da
lágrima. Assim sendo, justifica-se o presente estudo que tem como objetivo descrever o
comportamento da IgAs específica anti-T.gondii da lágrima no período ativo e de resolução
imediata da doença ocular, o que pode contribuir para definição diagnóstica da doença em
questão.
Foi realizado um estudo descritivo do tipo série de casos com componente prospectivo.
2. PACIENTES E MÉTODOS.
Pacientes: Foram incluídos no estudo 16 pacientes portadores de uveíte posterior ativa
presumivelmente por T.gondii na forma clássica, maiores de 10 anos, não usuários de
imunossupressores ou corticóides nos últimos dois meses, nem portadores de SIDA ou
transplantados. Foram atendidos no ambulatório de oftalmologia do Hospital das Clínicas
(HC) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), no período de janeiro a outubro de
2008. Os pacientes foram divididos em grupos de acordo com o início dos sintomas
relacionados à doença em questão: grupo 1, composto por 12 pacientes que relataram
aparecimento da sintomatologia com menos de três dias e grupo 2, com quatro pacientes que
relataram início da sintomatologia havia 30 dias.
Definição de uveíte posterior ativa presumivelmente por T gondii na forma clássica: É a
inflamação da úvea, que é a camada média vascular do olho, em sua região posterior, que
compreende a retina e a coróide26. É considerada forma clássica, conhecida também como
padrão ouro, quando há presença de lesões cicatrizadas, de margens bem definidas, com graus
variáveis de hipertrofia do epitélio pigmentar da retina e atrofia retinocoroidea, acompanhada
49
de lesão satélite em atividade inflamatória e vitreíte, presença ou não de vasculite retiniana,
com ou sem comprometimento das estruturas do pólo anterior7 20 25.
Coleta de dados: Após aplicação de questionário específico, foi realizada anamnese e exame
oftalmológico completo a fim de ser definido o diagnóstico de uveíte posterior ativa
presumivelmente por T.gondii na forma clássica. O exame oftalmológico foi realizado por
dois oftalmologistas e, nos casos de discordância, por um terceiro oftalmologista.
Amostras da lágrima: Realizada de acordo com a técnica descrita por Lynch et al.15. Todos
os pacientes tiveram lágrimas coletadas de ambos os olhos separadamente. A obtenção da
primeira amostra coincide com a primeira consulta e também com o tempo de sintomatologia
referido pelo paciente. Foi considerado como primeiro dia (Dia 0) a amostra daqueles
pacientes que relatavam sintomatologia menor que três dias. As coletas seguintes foram
realizadas num intervalo de 15 em 15 dias, junto ao acompanhamento clínico, sendo a última
coleta realizada com intervalo de 30 dias. No total, foram realizadas seis coletas de amostras
em cada paciente (Dias 0, 15, 30, 45, 60 e 90, em relação ao início dos sintomas, como dito
anteriormente).
Amostras do sangue: Foram coletados 10ml de sangue através de punção
venosa, para obtenção do soro, que foi congelado a -20º para posterior análise no laboratório
do LIKA, o que foi utilizado para determinação de IgM e IgG anti-toxoplasma.
Determinação da IgA secretora anti-T.gondii na lágrima: Foi realizada segundo descrito
por Lynch et al.15 Em todos os ensaios foram incluídas amostras de referência de três lágrimas
controles negativos e três controles positivos, para controle da variação inter-ensaios. O valor
do ponto de corte, para cada ensaio realizado, foi determinado pela média aritmética mais dois
desvios padrões das densidades ópticas das amostras das lágrimas dos controles negativos. Os
níveis superiores aos definidos pelo ponto de corte foram considerados como positivos.
50
Determinação de IgM e IgG anti-T.gondii no soro: Realizada segundo o método de
imunofluorescência descrita por Camargo2. Foi considerada IgM anti-T.gondii positiva (título
de 1/16 ou maior) e IgG anti- T.gondii positiva (título de 1/16 ou maior)21.
Análises estatísticas: Foi realizada uma análise descritiva e a apresentação das variáveis
estudadas foi feita através de tabelas. Para testar a suposição de normalidade dos dados foi
aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov. Para análise entre grupos foram aplicados o teste t-
Student (grupo 1) e o teste não-paramétrico de Mann-Whitney (grupo 2). Para a análise
intragrupos foram aplicados os testes de Análise de Variância (ANOVA) para dados pareados
(grupo 1) e o teste não-paramétrico de Friedman5 (grupo 2). Nos testes estatísticos foram
considerados significativos valores de ρ<0,05. Os programas utilizados para obtenção dos
cálculos estatísticos foram o Excel 2000 e o SPSS v8.0.
Considerações éticas: O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa do Centro
de Ciências da Saúde da UFPE – CEP/CCS/UFPE com o registro N° 387/07. Os voluntários
assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
3. RESULTADOS.
Entre os 16 pacientes estudados, oito (50%) pertenciam ao sexo masculino e oito
(50%) ao feminino. Em relação à idade, a maior freqüência esteve entre 21 e 30 anos (50%),
seguida por pacientes entre 31 a 40 anos (37,5%), um paciente entre 11 e 20 anos (6,25%) e
outro com idade superior a 41 anos (6,25%). Quanto à análise da procedência, foi visto que
seis (37,5%) pacientes registraram seu domicílio na área metropolitana de Recife, enquanto o
restante, 10 (62,5%), foi proveniente do interior do Estado de Pernambuco.
(Tabela 1)
A freqüência do olho afetado mostrou que 10 (62,5%) pacientes tiveram o olho direito
doente, sendo que seis (37,5%) apresentaram comprometimento do olho esquerdo. Não
51
ocorreu nenhum caso de doença bilateral. Dois pacientes relataram ter apresentado episódio
anteriormente.
Todos os indivíduos estudados apresentaram reação de fluorescência positiva para
anticorpos séricos IgG em títulos que variam entre 1/16 e 1/712 (dois pacientes). A maioria
(nove pacientes) apresentou níveis de IgG em títulos abaixo de 1/32. Todos apresentaram
resultado negativo para IgM sérica.
Qualitativamente, todos os pacientes tiveram níveis de IgAs positivos em algum
momento do acompanhamento (acima do porte de corte), o que pode ser observado na Tabela
2, em relação aos olhos doentes. No grupo 1, três pacientes vieram positivar com 30 dias de
evolução. Neste mesmo grupo, no dia 60, um paciente apresentou nível de IgAs negativo,
permanecendo assim até o final do acompanhamento, enquanto mais um paciente também
negativou no dia 90. No grupo 2, todos os pacientes permaneceram com níveis de IgAs
positivos durante todo o tempo de acompanhamento, apenas um paciente apresentou nível
negativo na última coleta (dia 120). Os níveis de IgAs nos olhos sadios acompanharam os dos
olhos doentes.
(Tabela 2)
Quando realizamos uma análise quantitativa das médias de IgAs nos grupos 1 e 2,
separadamente, em relação aos dias de acompanhamento, vimos que não houve diferença
estatisticamente significante, tanto no grupo 1 (ρ=0,215) quanto no grupo 2 (ρ=0,684) dos
olhos doentes ou no grupo 1 (ρ=0,60) e grupo 2 (ρ=0,51) dos olhos sadios.
(Tabelas 3)
Quando realizada comparação entre os grupos, relacionando-os com o tempo de
sintomatologia, não foi visto diferença estatística, tanto para olhos doentes quanto para olhos
sadios. Comparando o dia da primeira coleta do grupo 1 (dia 0) com a última do grupo 2 (dia
52
120), também não foi visto diferença estatisticamente significante para os olhos doentes
(ρ=0,674) e nem para os olhos sadios (ρ=0,654).
(Tabela 4)
Houve grande variabilidade na produção de IgAs tanto nos olhos sadios como nos
olhos doentes durante o acompanhamento realizado, sem existir diferença estatisticamente
significante entre as médias dos grupos, seja relacionado ao dia da coleta, seja relacionada ao
início da sintomatologia. (Figura 1).
(Figura 1)
4. DISCUSSÃO.
O diagnóstico da toxoplasmose ocular através dos sinais clássicos na fundoscopia
ainda é considerado o padrão ouro para o diagnóstico, levando em conta certa proporção de
resultados falso-negativo e falso positivo que está relativamente relacionada com a
experiência do oftalmologista.
Apesar de, na toxoplasmose ocular, não existir correlação entre os níveis de anticorpos
e a clínica21, os testes sorológicos ainda são os mais utilizados.
Ongkosuwito et al.18, em estudo realizado com pacientes portadores de toxoplasmose
ocular recorrente, demonstraram a positividade de IgA intraocular em apenas 23% dos
pacientes. Gargew et al.6 obtiveram índices de 24,5% de pacientes com mesmo estágio de
toxoplasmose ocular.
Lynch et al.16 concluíram que através da determinação da IgA secretora anti-T.gondii na
lágrima é possível diagnosticar casos de toxoplasmose ocular ativa (sensibilidade de 65,9% e
especificidade de 71,6%).
No presente estudo, durante todo o acompanhamento, cada paciente apresentou uma
dinâmica de produção da IgAs diferente, apesar de não haver diferença estatisticamente
53
significante entre os níveis de IgAs apresentados. Pode ser visto que o desvio padrão se
apresentou alargado, o que mostra uma variação importante entre as médias dos níveis de
IgAs, refletindo o comportamento individual diferente de cada paciente.
Os mecanismos que levam a esta diferença interindividual ainda são pouco
conhecidos. Gargew et al.6 sugerem que a possível causa destas diferenças possa ser devido à
ativação dos mecanismos imunológicos e eventualmente por conta de mecanismos
imunogenéticos1 11 22. Diferenças relacionadas entre distintas populações étnicas também são
relatadas, sugerindo diferença no quadro clínico, virulência da cepa envolvida e fatores
relacionados à imunidade do hospedeiro7.
Alguns autores relatam que há um aparecimento tardio das IgA intraocular na vigência
de uveíte em atividade6 18 23. No presente estudo, utilizando a IgAs da lágrima, foi visto que
pacientes se apresentavam positivos, na sua maioria, desde o início dos sintomas e os que
ainda não tinham IgAs no dia da primeira coleta, positivaram com 30 dias.
Esta situação nos leva a pensar que pode existir uma diferença na velocidade de
ativação da resposta imune entre os dois compartimentos oculares. No nível da mucosa
ocular, existem os linfócitos de memória, uma vez que estamos tratando de pacientes com
toxoplasmose ocular recorrente (padrão ouro), que rapidamente podem ser ativados pelo
estímulo antigênico do parasito e localmente formarem a IgAs. Enquanto no nível do
compartimento intraocular, esse estímulo antigênico, através da circulação sistêmica também
vai promover a ativação dos linfócitos. Porém, este compartimento tem a proteção do
imunoprivilégio, que assim pode vir atrasar a produção de IgA intraocular, razão pela qual
parece justificar o retardo no aparecimento da IgA intraocular em relação a IgAs da lágrima.
Em particular, dois pacientes que referiram apresentar o segundo episódio de uveíte,
iniciaram com níveis de IgAs menores, vindo apresentar aumento dos níveis mais
54
tardiamente(45 dias), porém um dos pacientes manteve níveis menores quando comparado
com todo o grupo. O que parece confirmar o papel protetor da IgAs contra possíveis recidivas.
Qualitativamente os resultados sugerem uma maior elevação da IgAs entre os dias 30
e 45, o que coincide com início de resolução clínica e com a suspensão do corticóide tópico
no grupo 1, o qual começou o tratamento no início dos sintomas. No grupo 2, que começou o
tratamento após trinta dias do início dos sintomas, a IgAs também se eleva ao redor do dia 45.
Sugerindo que o uso do corticóide tópico não estaria alterando a resposta imune do olho.
Também parece não sugerir uma relação entre a fase sintomática da doença e os níveis da
IgAs.
Em relação à análise por olho, foi constatado que o olho sadio também apresentou
resultados positivos em relação à IgAs, sem haver diferença estatística entre eles. A situação
descrita leva a pensar que a presença do anticorpo na lágrima responde realmente a um
fenômeno sistêmico e que a imunidade de mucosa do olho (EALT) é ativada independente do
olho afetado. É possível que a ruptura da barreira hematoretiniana e/ou hematoaquosa leve à
estimulação antigênica da mucosa contralateral e desencadeie a produção da IgAs da lágrima.
Esperava-se que o comportamento da IgAs seguisse um padrão de decrescimento,
acompanhando o quadro clínico ou até mesmo apresentasse um pico ao redor do segundo ou
terceiro mês, como acontece com a IgA sérica. No presente estudo, foi realizado um
seguimento precoce da resposta imune de mucosa através da lágrima durante 90 dias, porém,
não foi possível observar variações na dinâmica da IgAs, o que talvez venha acontecer após
um período mais longo de resposta ao T. gondii.
Conclui-se que cada paciente apresentou uma dinâmica de produção de IgAs diferente.
55
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58
Tabela 1. Distribuição numérica e percentual por sexo, faixa etária e procedência dos
portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii atendidos no HC da
UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008.
Variáveis biológicas N % Sexo Masculino 8 50 Feminino 8 50 Idade 11-20 anos 1 6,25 21-30 anos 8 75 31-40 anos 6 12,5 >41 anos 1 6,25 Procedência Recife 6 12,5 Interior 10 87,5 Total 16 100
59
Tabela 2. Distribuição qualitativa numérica da reatividade da IgAs anti-T. gondii da lágrima
nos olhos doentes, dos grupos 1 e 2*, de pacientes portadores de uveíte posterior ativa
presumivelmente por T. gondii atendidos no HC da UFPE, no período de janeiro a outubro de
2008:
OLHOS DOENTES
Grupo 1 Pacientes Positivo
PacientesNegativo Grupo 2 Pacientes
Positivo Pacientes Negativo
Dia 0 9 3 Dia 30 4 0 Dia 15 11 1 Dia 45 4 0 Dia 30 12 0 Dia 60 4 0 Dia 45 12 0 Dia 75 4 0 Dia 60 11 1 Dia 90 4 0 Dia 90 10 2 Dia 120 3 1 * ver material e métodos
60
Tabela 3. Médias, valor de “p” e desvio padrão dos níveis de absorbância da IgAs anti-T.
gondii da lágrima nos olhos doentes e sadios, dos grupos 1 (A) e 2 (B), dos pacientes
portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii atendidos no HC da
UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008, de acordo com os dias que foram realizadas
as coletas*:
A B
Grupo 1 Grupo 2 N Média DP p-valor N Média DP p-valor
Olhos Doentes Olhos Doentes Dia 0 12 0,19 0,20 Dia 30 4 0,40 0,45 Dia 15 12 0,29 0,30 Dia 45 4 0,50 0,16 Dia 30 12 0,35 0,20 Dia 60 4 0,41 0,11 Dia 45 12 0,41 0,35 Dia 75 4 0,24 0,11 Dia 60 12 0,41 0,38 Dia 90 4 0,29 0,13 Dia 90 12 0,32 0,26 0,215 Dia 120 4 0,35 0,33 0,684
Olhos Sadios Olhos Sadios
Dia 0 12 0,30 0,26 Dia 30 4 0,30 0,32 Dia 15 12 0,31 0,32 Dia 45 4 0,39 0,22 Dia 30 12 0,43 0,39 Dia 60 4 0,49 0,07 Dia 45 12 0,34 0,26 Dia 75 4 0,29 0,09 Dia 60 12 0,37 0,30 Dia 90 4 0,24 0,19 Dia 90 12 0,23 0,23 0,600 Dia 120 4 0,33 0,36 0,510
* ver material e métodos, N = número de pacientes, DP = desvio padrão, p >0,05 = não estatisticamente significante.
61
Tabela 4. Comparação entre as médias, valor de “p” e desvio padrão dos níveis de
absorbância da IgAs anti-T. gondii da lágrima nos olhos doentes e sadios, entre os grupos 1
(A) e 2 (B), dos pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por T. gondii
atendidos no HC da UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008, relacionadas de acordo
com o início dos sintomas*:
Olhos Doentes Olhos Sadios N Média DP p-valor Média DP p-valor Dia 0 12 0,19 0,20 0,30 0,26 Dia 30 4 0,40 0,45 0,212 0,30 0,32 1,000 Dia 15 12 0,29 0,30 0,31 0,32 Dia 45 4 0,50 0,16 0,203 0,39 0,22 0,642 Dia 30 12 0,35 0,2 0,43 0,39 Dia 60 4 0,41 0,11 0,616 0,49 0,07 0,619 Dia 45 12 0,41 0,35 0,34 0,26 Dia 75 4 0,24 0,11 0,354 0,29 0,09 0,540 Dia 60 12 0,41 0,38 0,37 0,30 Dia 90 4 0,29 0,13 0,557 0,24 0,19 0,444 Dia 90 12 0,32 0,26 0,23 0,23 Dia 120 4 0,35 0,33 0,88 0,33 0,36 0,525 Dia 0 12 0,19 0,20 0,30 0,26 Dia 120 4 0,35 0,33 0,674 0,33 0,36 0,654 * ver material e métodos, N = número de pacientes, DP = desvio padrão, p >0,05 = não estatisticamente significante.
62
A
Olhos Doentes
0,00,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,21,4
IgA
s (ab
sorb
ânci
a 49
2nm
)
Dia 0 Dia 15 Dia 30 Dia 45 Dia 60 Dia 75 Dia 90 Dia 120
B
Olhos Sadios
0,00,20,40,60,81,01,21,4
IgA
s (ab
sorb
ânci
a 49
2nm
)
Dia 0 Dia 15 Dia 30 Dia 45 Dia 60 Dia 75 Dia 90 Dia 120
Figura 1. Distribuição dos níveis de absorbância da IgAs anti-T. gondii na lágrima dos olhos
doentes(A) e sadios(B) dos 16 pacientes portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente
por T. gondii atendidos no HC da UFPE, no período de janeiro a outubro de 2008.
) .médias dos níveis de absorbância da IgAs anti-T. gondii da lágrima (־
64
7 CONCLUSÃO.
Após o acompanhamento dos níveis de IgAs anti-T. gondii durante o período de três
meses nos portadores da forma clássica de uveíte posterior presumivelmente por Toxoplasma
gondii, conclui-se que a IgAs específica anti-T. gondii permanece positiva durante o primeiro
trimestre da doença ocular, mostrando variações individuais, sem demonstração de um perfil
característico.
66
8 SUGESTÕES.
Manter o acompanhamento dos níveis da IgAs dos pacientes, envolvidos no presente
estudo, semestralmente até o final do terceiro ano (estudos após este período já estão sendo
realizados), a fim de abarcar um maior tempo de conhecimento do comportamento da IgAs.
Pois assim, através do conhecimento do comportamento da IgAs, poderemos melhorar
a sensibilidade e especificidade do teste utilizado o que poderá trazer ao médico
oftalmologista um teste diagnóstico com capacidade de auxiliar no difícil diagnóstico
diferencial das uveítes.
68
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77
10 APÊNDICES.
APÊNDICE Nº 1 – Questionário específico
Ficha Nº
Registro:_________________ Data:________________________
Nome:_______________________
Sexo: Masc Fem
Idade (anos): 10-19 20-30 31-40 41-50 >/= 51
Cor: Branca preta morena.
Estado civil: casada solteira viúva.
Procedência: :Área metropolitana Interior
Profissão: ___________________________________
Domicílio: ____________________________________
Telefone ______________.Fax _____________E-mail_________
Queixa principal _______________________________________
História atual __________________________________________
______________________________________________________
Antecedentes Pessoais: ___________________________________
Medicações:
Lentes de contato? Sim Não
Teve episódios de uveíte posteriores? Sim Não
Quantos? 1 2-3 4-5 6ou ↑
Antecedentes familiares _________________
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Quanto tempo demorou em consultar médico, desde que começaram os
sintomas? (semanas).
< 1 1 a 2 3 a 4 4 a 6 > 6
AV sc: OD= cc: OD= Perto: OD
sc OE= cc: OE= OE=
Baixa da AV/ olho comprometido cc:
conta dedos entre 20/200 e 20/100 entre 20/80 e 20/60
entre 20/40 e 20/30 entre 20/25 e 20/20
Refração: sob ciclo dinâmica
OD... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . OD:.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
OE:.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . OE:.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Biomicroscopia:
Conjuntiva: normal injeção superficial injeção ciliar
Córnea: clara edema setorial edema difuso pp endoteliais finos
pp tipo “mutton-fat” Outros (descrever)____________________
Humor Aquoso: transparente; células por campo: 0 raras = 1-2
ocasionais=3-7; 7-10 10-15 15-20 20-50 50+
“flare” 0 ; discreto 1+/4+ moderado 2+/4+ importante 3+/4+
intenso 4+/4+
hipópio linear hipópio meia câmara
Íris: edema estromal nódulos de Koeppe nódulos de Busacca
sinéquias anteriores sinéquias posteriores
Cristalino: transparente fibrina na pupila seclusão catarata
Tonometria: OD às horas OE às horas
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Vítreo: 0-1 célula/ sem opacidades 2- 20 cel/ poucas opacidades
21-50 cel/opacidades esparsas 51- 100 cel/ opacidades moderadas
101- 250 cel/ muitas opacidades
Presença ou não de cicatrizes retinocoroideas e características da lesão.
Um foco ativo/ exsudativo Múltiplos focos exsudativos
Cicatriz retinocoroidea antiga Papilite
Vasculopatia:
Ausente Embainhamento perivascular difuso
Embainhamento perivascular segmentário Perivasculite em “rosário”
Obstruções de ramos arteriais neovascularização coroideana
Localização da lesão: macular perimacular máculo-discal
justa-discal periférica
Número das lesões:
Única satélite duas múltiplas
Tamanho das lesões:
Puntiforme 1 diâmetro discal 2 diâmetro > 2 diâmetros
Observações: _____________________________________________
Hipótese Diagnóstica: _______________________________________
Exames:
ELISA: IgG IgM
Títulos: IgG =
IgM =
IgAs lágrima =
Outros:
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Tratamento:
Pirimetamida Sulfadiazina ácido folínico Prednisona
Clindamicina Espiramicina Trimetroprim + sulfametoxazol
outros
Evolução:
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APÊNDICE Nº2 – Termo de consentimento
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Dinâmica da IgA secretora da lágrima em pacientes portadores de uveíte posterior
ativa presumivelmente por Toxoplasma gondii durante o primeiro trimestre da doença.
Investigadora: Mirelle Souza Leão Vasconcelos
Rua Antônio Gomes de Freitas, 191- Ilha do Leite- Recife-PE. Tel: 34234166
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Eu, .................................................................. responsável pelo (a) menor
....................................................................................... concordo que ele (a) participe / em
participar da pesquisa sobre a Dinâmica da cinética da IgA secretora da lágrima em pacientes
portadores de uveíte posterior ativa presumivelmente por Toxoplasma gondii na forma
clássica durante o primeiro trimestre da doença, mediante o qual virá a ser possível o
esclarecimento diagnóstico da doença em questão.
Sendo assim autorizo a realização do exame oftalmológico completo, (refração,
biomicroscopia, tonometria, fundoscopia) no ambulatório de oftalmologia do Hospital das
Clínicas da UFPE, assim também como a retirada de amostra de sangue venosa (10ml), e
algumas lágrimas, para exames laboratoriais. Esses exames não significam qualquer risco para
a saúde, podendo trazer benefícios na medida que permitam o esclarecimento da doença.
Declaro que fui esclarecido (a) que utilizando algumas lágrimas virão a ser feitos
dosagens de anticorpos para saber se o olho tem ou não toxoplasmose, e que entendi todas as
informações que me foram fornecidas. Por este motivo, dou o meu consentimento livre e
voluntário para participar do mesmo, e para que os dados obtidos sejam utilizados, desde que
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minha identidade seja mantida em sigilo, não podendo ser divulgada em nenhuma hipótese, a
não ser que assim eu decida e autorize. Assinando este termo de consentimento concordo em
participar deste estudo, tendo a liberdade de me retirar em qualquer fase da pesquisa sem
penalização alguma e sem prejuízo aos cuidados e acompanhamento da doença.
Recife,.... de ........... de 200...
Nome do pesquisador responsável _______________________________
Nome do pai ou responsável ________________________________________
Nome do menor ________________________________________________
1ª Testemunha ________________________________________________
2ª Testemunha ________________________________________________
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ANEXO Nº2 – INSTRUÇÃO AOS AUTORES
(http://www.scielo.br/revistas/rsbmt/pinstruc.htm)
INSTRUCTIONS TO AUTHORS
• Aim and editorial policy • Presentation of originals
ISSN 0037-8682 printed version ISSN 1678-9849 online version
Aim and editorial policy
The Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical publishes scientific papers related to infectious and parasitic diseases, preventive medicine, public health and related subjects.
The journal appears six times a year and accepts papers from Brazilian or foreign workers which conform with these regulations and are approved by referees selected by the Editors.
1. As weel as full papers the journal publishes short communications indicating the results of therapeutics trials, preliminary studies, new techniques, case reports, letters to the editor, historical events, bibliographic abstracts and summaries of theses. Literature reviews and editorials will be published only when requested by the Editorial Board.
2. The papers must be original and unedited, typed on A4 paper, in double spacing with a margin of 3 cm on the left side of the page. Three copies must be sent to the address given below, one of which must be the original.
Presentation of originals
3. The articles should be sent through diskettes together with three printed copies of the reviewed version, once observed the following requirements:
a) compatible 3 1/2" or 5 1/4" MS-DOS diskettes can be used. Macintosh diskettes in the format 3 1/2" will also be accepted. Eliminate from the diskettes any file not related to the paper which is being sent, including previous versions, back-ups and temporary files. The diskette label should contain: title of the article, author's name, file name, text editor utilized, and the accessory files names (style, sheets, graphics, tables, etc.);
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b) the author is asked to send works compatible with the following text processings: Word for Windows (6.0 or prior version), Word for Macintosh (6.0 or prior version). Other formats can be accepted but under previously agreement. Articles in ASCII (text only) format should never be sent;
c) when editing the text, the "enter" command may exclusively be used in the end of the paragraphs. Do not add extra spaces of "tabs" to the text in order to get first line backing nor title centralization in the page. Neither use additional backspacers ("enters") to space the paragraphs. To obtain these results, just use the paragraph format commands avaiable in all the above mentioned text editors;
d) tables can be included since they are set up in the text editor itself. Notes and footnotes should preferably appear after the end of the article duely numbered and referenced as well;
e) illustrations, tables and graphs produced in other programs and "imported" for inclusion in the text should be sent in attached files, in easily compatibile universal formats (TIFF, BMP, PICT, GIF, etc.). Avoid not-standardized formats (EPS, WMF, etc.) and files that only can be opened by specific programs. Anyway, always send a well printed copy of the graph, table or illustration for reproduction if necessary.
4. Although Portuguese is the preferred language, papers in English and Spanish are also accepted. Written in a clear precise manner, the text should be sufficiently concise to normally not exceed twelve type-written pages for papers and six for short communications.
5. The following sequence should be observed:
a) title of the paper (the original and translated one) and name of the authors in small letters. In the bottom of the page, the title of the institution where the work was done, affilliation of the authors, source of financial support (if any) and complete address for correspondence, including telephone and fax numbers, and e-mail;
b) abstract: 150 words long for articles and 50 for communications and case reports. This should summarise the objective of the work presented, how it was carried out, the results achieved and the conclusion reached. Abbreviations or bibliographic citations should not be included. Cite four or five key-words for indexing;
c) resumo: just after the summary in the language of the paper must be a faithful translation of the abstract, followed by the key-words;
d) introduction: clearly and objectively the purpose of the research, with information justifying the work, relating to previous paper in this field; reducing the citations to a minimum;
e) material and methods: in a precise manner the techniques necessary to understand and reproduce the works should be cited. Established methods should be referenced;
f) results: always when necessary should be accompanied by tables, figures or illustrations which present the data in such a clear manner so that only commentary and not duplication is necessary in the text, which should complement
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this data organization. When indicated, the data must be subjected to statistical analysis. This section should be informative, and not an interpretation;
g) discussion: the results are interpreted in the light of present understanding of the problem with the necessary references. Caution should be exercised with reference to hypotheses and speculations include only those that clarify the thinking behind the line of discussion;
h) acknowledgements: limited to those considered essential;
i) references: typed in small letters, without full stop between the abbreviations, in double spacing, numbered in alphabetical order using the last surname of the author; all authors must be cited. When there is more than one citation from the same author, a chronological order is followed. The citations, whose numbers come above the corresponding word without neither comma nor parenthesis, in the text must refer to the numeration in the reference list which has the following style and punctuation:
Articles in periodicals (the titles of the periodicals must appear in full as below):
Coura JR, Conceição MJ. Estudo comparativo dos métodos de Lutz, Kato e Simões Barbosa no diagnóstico da esquistossomose mansoni. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 8:153-158, 1974.
Books:
Chandra RK, Newberne PM. Nutrition, immunity and infection: mechanisms of interactions. Plenum, New York, 1977.
Book chapters:
Fulton JD. Diagnosis of protozoal diseases. In: Gell PGH, Coombs RRA (ed) Clinical aspects of immunology, 2nd edtition, Blackwell, Oxford, p.133-136, 1968.
Abstract from meeting:
Brener Z. Variações intra-específicas do Trypanosoma cruzi e patogenia da doença de Chagas. In: Resumos do XIII Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, Brasília p.371, 1977.
Theses:
Tavares W. Contaminação do solo do Estado do Rio de Janeiro pelo Clostridium tetani. Contribuição ao conhecimento da distribuição natural do bacilo tetânico. Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, 1975.
Only published papers or papers in press can be cited in the reference list. Unpublished data or personal communications should be mentioned in the text as (AB Figueiredo: personal communication, 1980) or (CD Dinis, EF Oliveira: unpublished data).
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6. Tables: should be numbered in Arabic numerals with a short descriptive title. Try to keep tables to a minimum, and remember that large tables are difficult to understand. They must be typed on separate sheets, with no vertical lines, with units referred to at the head of each column. Tables' data, including the title, must be written in small letters, except the abbreviations.
7. Illustrations: should be of good quality and consecutively numbered in Arabic numerals. Beside the photographies, graphics, pictures, etc. must be referred in the text as Figures. Note on the reverse in pencil the number of the figure and the name of the author and paper. The titles should be listed on a separate sheet using the reference numbers. The minimum number of illustrations should be submitted.
8. Ethics committee: research work on human beings must present the name of the Ethics Committee that had approved it.
9. Authors agreement: a written statement of all authors giving permission for publication of the paper is required.