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7/31/2019 Sebenta de Biologia Molecular Da Celula
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Faculdade de Medicina de Lisboa Mdulo I.I
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BBBBBBBBiiiiiiiioooooooollllllllooooooooggggggggiiiiiiiiaaaaaaaaMMMMMMMMoooooooolllllllleeeeeeeeccccccccuuuuuuuullllllllaaaaaaaarrrrrrrr
ddddddddaaaaaaaaCCCCCCCClllllllluuuuuuuullllllllaaaaaaaaIn Cooper 2 Edio
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Biologia Molecular da Clula Mod. I.I Faculdade de Medicina de Lisboa
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ndicendice ............................................................................................................................... 2Capitulo Um (pg. 27 44) Uma Viso Geral das Clulas e Pesquisa Celular ..... 8
Origem e Evoluo ....................................................................................................... 8Evoluo de Metabolismos ........................................................................................... 9Procariontes Actuais ..................................................................................................... 9Clulas Eucariticas ..................................................................................................... 9Evoluo dos Eucariontes .......................................................................................... 10Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares...................................................... 10
Captulo Um (pg. 52-57) ............................................................................................. 12Crescimento de Clulas Animais em Cultura ............................................................. 12Cultura de Clulas Vegetais ....................................................................................... 13Vrus ........................................................................................................................... 13
Captulo Dois A Qumica das Clulas ..................................................................... 14A composio Molecular das Clulas ........................................................................ 14Glcidos ....................................................................................................................... 14Lpidos ........................................................................................................................ 15cidos Nucleicos ........................................................................................................ 16Protenas .................................................................................................................... 17Enzimas ...................................................................................................................... 18Mecanismo de Catlise Enzimtica ........................................................................... 18Coenzimas .................................................................................................................. 19Regulao da Actividade Enzimtica ......................................................................... 19Energia Metablica ..................................................................................................... 19Membranas Celulares ................................................................................................ 19Transporte Atravs das Membranas Celulares .......................................................... 20
Captulo Trs (pg. 113 138) Fundamentos de Biologia Molecular .................. 22Hereditariedade, Genes e DNA .................................................................................. 22Genes e Cromossomas .............................................................................................. 22Genes e Enzimas ....................................................................................................... 24Replicao do DNA .................................................................................................... 24Expresso da Informao Gentica ........................................................................... 24Funo do RNA Mensageiro ...................................................................................... 24O Cdigo Gentico ..................................................................................................... 25Vrus de RNA e Transcrio Reversa ........................................................................ 25DNA Recombinante .................................................................................................... 25Endonucleases de Restrio ...................................................................................... 26
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Electroforese em Gel .................................................................................................. 26Gerar Molculas de DNA Recombinante ................................................................... 27Vectores para DNA Recombinante ............................................................................ 28Sequenciao do DNA ............................................................................................... 28Expresso dos Genes Clonados ................................................................................ 29Amplificao de DNA pela Reaco em Cadeia de Polimerase (PCR) ..................... 30Transferncia de Genes em Plantas e Animais ......................................................... 30Mutagnese de DNA Clonados .................................................................................. 31
Captulo Quatro A Organizao dos Genomas Celulares ..................................... 32A complexidade dos Genomas Eucaritas ................................................................ 32Intres e Exes ........................................................................................................... 32Famlias Gnicas e Pseudogenes .............................................................................. 32Sequncias de DNA Repetitivas ................................................................................ 33
Cromossomas e Cromatina ........................................................................................ 33Cromatina ................................................................................................................... 33Centrmeros ............................................................................................................... 34Telmeros ................................................................................................................... 34O Genoma Humano ................................................................................................... 34
Captulo Cinco Replicao, Manuteno e Rearranjos do DNA Genmico ........ 36DNA Polimerases ....................................................................................................... 36A Forquilha de Replicao ......................................................................................... 37Fidelidade da Replicao ........................................................................................... 38As Origens e a Iniciao da Replicao ..................................................................... 39Os Telmeros e a Telomerase ................................................................................... 39Reparao do DNA .................................................................................................... 40Reverso Directa de Leses do DNA ........................................................................ 40Reparao por Exciso .............................................................................................. 41Reparao Ps-Replicao ........................................................................................ 41Recombinao entre Sequncias Homlogas de DNA ............................................. 42Molculas de DNA Recombinam-se por meio de Quebras e Rejunes .................. 42Modelos de Recombinao Homloga ...................................................................... 42Enzimas Envolvidas na Recombinao Homloga .................................................... 43Rearranjos do DNA .................................................................................................... 44Recombinao Stio-Especifica .................................................................................. 44Transposio Atravs de Intermedirios de DNA ...................................................... 44Transposio Atravs de Intermedirios de RNA ...................................................... 45Amplificao Gnica ................................................................................................... 45
Captulo Seis Sntese e Processamento de RNA ................................................... 46Transcrio em Procaritas ........................................................................................ 46
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A RNA Polimerase e a Transcrio ............................................................................ 46Os Repressores e o Controlo Negativo da Transcrio ............................................. 46Controlo Positivo da Transcrio................................................................................ 47Atenuao da Transcrio .......................................................................................... 47As RNA Polimerases Eucaritas e os Factores Gerais de Transcrio .................... 47As RNA Polimerases Eucaritas ................................................................................ 47Os Factores Gerais da Transcrio e a Iniciao da Transcrio pela RNA
Polimerase II ............................................................................................................................ 48A Transcrio pelas RNA Polimerase I e III ............................................................... 49Regulao da Transcrio em Eucaritas ................................................................. 49Sequncias Regulatrias com Actuao em Cis: Promotores e Enhancers ............. 49Protenas Regulatrias Transcricionais ...................................................................... 50Estrutura e Funo dos Activadores Transcricionais ................................................. 50Repressores Eucaritas ............................................................................................. 51Relao entre Estrutura da Cromatina e a Transcrio ............................................. 51Metilao do DNA ....................................................................................................... 51Processamento e Reciclagem de RNA ...................................................................... 52Processamento do rRNA e do tRNA .......................................................................... 52Processamento do mRNA em Eucaritas .................................................................. 52Mecanismo de splicing ............................................................................................... 53Splicing Alternativo ..................................................................................................... 54Edio do RNA ........................................................................................................... 55Degradao de RNA .................................................................................................. 56
Captulo Sete (pg. 297 325) Sntese, Procesamento e Regulao Proteicos . 57Traduo do mRNA .................................................................................................... 57RNAs de Transporte ................................................................................................... 57O Ribossoma .............................................................................................................. 57A Organizao de mRNAs e Inicio da Traduo........................................................ 58O Processo de Traduo ............................................................................................ 58A Regulao da Traduo .......................................................................................... 59Dobramento e Processamento Proteicos ................................................................... 59Chaperonas e Dobramento Proteico .......................................................................... 59Enzimas e Dobramento Proteico ................................................................................ 59Clivagem Proteica ...................................................................................................... 60Glicolizao ................................................................................................................ 60Ligao de Lpidos ..................................................................................................... 60
Captulo Nove Seleco e Transporte de Protenas .............................................. 62Retculo Endoplasmtico ............................................................................................ 62O Retculo Endoplasmtico e a Secreo de Protenas ............................................ 62Direccionando Protenas para o Retculo Endoplasmtico ........................................ 62
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Insero de Protenas na Membrana do Retculo Endoplasmtico ........................... 63Dobramento de Protenas e Processamento no Retculo Endoplasmtico ............... 63O Reticulo Endoplasmtico ........................................................................................ 64Exportao de Protenas e Lpidos do Retculo Endoplasmtico .............................. 64O Complexo de Golgi ................................................................................................. 64Organizao do Complexo de Golgi .......................................................................... 64Distribuio de Protenas e Exportao do Complexo de Golgi ................................ 65Protenas de Revestimento e de formao de Vesculas .......................................... 65Fuso Vesicular .......................................................................................................... 65Lisossomas ................................................................................................................. 66Hidrolases Lisossomais cidas .................................................................................. 66
Captulo Dez (pg. 411-415) Bioenergtica e Metabolismo: Mitocondrias .......... 67Mitocndrias ............................................................................................................... 67
Organizao e Funo das Mitocndrias ................................................................... 67O Sistema Gentico das Mitocndrias ....................................................................... 67
Captulo Dez (pg. 437-441) Bioenergtica e Metabolismo: Peroxissomas ........ 68Peroxissomas ............................................................................................................. 68Funes do Peroxissomas ......................................................................................... 68
Captulo Onze O Citoesqueleto e o Movimento Celular ........................................ 69O Citoesqueleto .......................................................................................................... 69Microtbulos ............................................................................................................... 69Constituio dos Microtbulos.................................................................................... 69Transporte Celular e Protenas Motoras .................................................................... 70Protenas Associadas aos Microtbulos .................................................................... 70Drogas que Intreferem com os Microtbulos ............................................................. 71Filamentos Intermdios .............................................................................................. 71Diferentes Tipos de Filamentos Intermdios .............................................................. 72Formao dos Filamentos Intermdios ...................................................................... 72Filamentos de Actina .................................................................................................. 73Polimerizao/Despolimerizao ............................................................................... 73Protenas que Regulam a Polimerizao e Despolimerizao da Actina .................. 73Drogas que Afectam o Citosqueleto de Actina........................................................... 74Organizao do Citoesqueleto de Actina ................................................................... 74Miosina ....................................................................................................................... 75Contraco Muscular .................................................................................................. 75
Captulo Treze Sinalizao Celular .......................................................................... 76Sinalizao de Molculas e seus Receptores ............................................................ 76Modelos de Sinalizao Clula-Clula ....................................................................... 76
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Hormonas Esterides e Superfamlia de Receptores Esterides .............................. 76Hormonas Peptdeas e Factores de Crescimento ..................................................... 76Funes dos Receptores de Superfcie Celular ......................................................... 77Receptores Acoplados Protena G .......................................................................... 77Receptores de Protena-Tirosina Cinase ................................................................... 77Vias de Transduo de Sinal Intracelular ................................................................... 78A Via do cAMP: Segundo Mensageiro e Fosforilao de Protenas .......................... 78GMP Cclico ................................................................................................................ 79A Via das Ras, Raf e MAP Cinase ............................................................................. 79Regulao da Morte Celular Programada .................................................................. 79Caspases e Apoptose ................................................................................................ 80Receptores de Morte Celular e Activao de Caspases ............................................ 81Sinalizao de Sobrevivncia Celular ........................................................................ 81
Captulo Catorze (pg. 596-617) O Ciclo Celular .................................................... 83O Ciclo Celular dos Eucaritas................................................................................... 83Fases do Ciclo Celular ............................................................................................... 83Regulao do Ciclo Celular pelo Crescimento Celular e Sinais Extracelulares ........ 84Pontos de Verificao do Ciclo Celular ...................................................................... 84Ligao da Fase S para a Fase M ............................................................................. 85Reguladores do Curso do Ciclo Celular ..................................................................... 85MPF: Um Dmero de Cdc2 e Ciclina .......................................................................... 85Famlia das Ciclinas e Cinases Dependentes de Ciclinas ......................................... 85Factores de Crescimento e Ciclinas do Tipo D .......................................................... 86Inibidores do Curso do Ciclo Celular .......................................................................... 87
Correlaes Clnicas ............................................................................................. 88ndice ............................................................................................................................. 89Vrus e Cancro .............................................................................................................. 90
A Doena .................................................................................................................... 90Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 90Preveno e Tratamento ............................................................................................ 90
Fenilcetonria ............................................................................................................... 91A Doena .................................................................................................................... 91Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 91Preveno e Tratamento ............................................................................................ 91
HIV e SIDA ..................................................................................................................... 92A Doena .................................................................................................................... 92Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 92Preveno e Tratamento ............................................................................................ 92
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Terapia Gnica para a Deficiencia de Adenosina Desaminase ............................... 93A Doena .................................................................................................................... 93Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 93Preveno e Tratamento ............................................................................................ 93
Cancro do Clon e Reparao do DNA ...................................................................... 94A Doena .................................................................................................................... 94Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 94Preveno e Tratamento ............................................................................................ 94
Factor de Transcrio Pit-1 e a Deficincia da Hormona do Crescimento ............ 95A Doena .................................................................................................................... 95Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 95Preveno e Tratamento ............................................................................................ 95
Antibiticos e Sntese Proteica ................................................................................... 96A Doena .................................................................................................................... 96Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 96Preveno e Tratamento ............................................................................................ 96
Doena de Gaucher ...................................................................................................... 97A Doena .................................................................................................................... 97Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 97Preveno e Tratamento ............................................................................................ 97
Doenas das Mitocndrias: Neurapatias pticas Heredittia de Leber ................. 98A Doena .................................................................................................................... 98Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 98Preveno e Tratamento ............................................................................................ 98
Distrofia Muscular e Citoesqueleto ............................................................................ 99A Doena .................................................................................................................... 99Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 99Preveno e Tratamento ............................................................................................ 99
Fibrose Cstica ............................................................................................................ 100A Doena .................................................................................................................. 100Bases Celulares e Moleculares ................................................................................ 100Preveno e Tratamento .......................................................................................... 100
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Biologia Molecular da
Capitulo
Origem e EvoEucar
ClulasProc
citoplasmticos e citoes
Os mecanismosclulas so os mesmo,
Em seguida a seq
Atmosfer
Macrom
Polimero
Capacida
Proteina
Apenas o
RNA (Sist
1 Clula
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Um (pg. 27 44)
uoticas (com ncleo que armazena o D
riticas (menores, sem ncleueleto)
oleculares bsicos que controlam a vidque nos sugere a existncia de um anc
uncia de acontecimentos que levaram
a Primitiva
lculas
s
e de Auto-Replicarem-se
ou Acidos Nuncleicos ?
s acidos Nucleicos so capazes de controlar a sua aut
ma Gentico Inicial)
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NA)
o, organitos
a de ambas asstral comum.1 clula:
replicao
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A formao da primeira clula apenas foi possvel devido formao demembranas de fosfolpidos, que permitiram isolar do restante meio ambiente asmolculas com a capacidade de se auto-replicar e assim ter um metabolismoindependete, devido s suas propriedade fsicas e qumicas. Os fosfolpidosso compostos por uma cabea hidrfila e uma cauda hidrofbica:
Evoluo de Metabolismos
A capacidade de obter alimentos e energia directamente do meioambiente um dos factores limitadores para as clulas primordiais, foi assimnecessrio criar mecanismos de desenvolvimento prprio. Houve assim uma
evoluo da gliclise que permitiu a existncia de energia qumica (ATP),surgiram os primeiros organismos fotossintticos o que levou a um grandeaumento da quantidade de oxignio na atmosfera e desencadeou a evoluodos mecanismos oxidativos (Respirao Aerbia).
Procariontes Actuais
Os procariontes actuais podem dividir-se em:- Arqueobactrias (Bactrias em Ambientes Extremos)- Eubactrias (Bactrias Actuais)Os procariontes so constitudos pela membrana celular, alguns por uma
parede celular rgida, pelo nucloide (agregado de DNA) e pelos ribossomas.
Clulas Eucariticas
So mais complexas, possuem ncleo limitado por uma membranaporosa, vrios organitos citoplasmticos e citoesqueleto.
Clula
Eucaritica
Lisossomas e
Peroxissomas: digestoe reaces oxidativas
Retculo
Endoplasmtico:
organizao etransporte de
proteinas, sintese delpidos
Complexo de Golgi:
organizao e transportede protenas, sintese de
lpidos e alguns
polissacarideos (emplantas)
Mitocndrias: respirao
aerbia
Cloroplasto: fotossntese
Citoesqueleto: rede defilamentos proteicos que
se estende pelocitoplasma
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Biologia Molecular da
O citoesqueleto,desempenha uma imposeu formato, gera orresponsvel pelo transp
outras estruturas.
Evoluo dos
A Hiptese Enddas clulas eucaritas,bactrias aerbias queoriginaram cloroplastosapoiada pelos seguintes
- Mitocndrias e- Estes reproduze- Contm o seu p- Tm ribossoma- O seu cdigo
nuclear;- Os seus Ribos
que dos eucariticas.
Estas relaesseleccionadas e porevoluo, originando-se
Desenvolvime
Com uma cadaaumento da rea de conaumento da clula noentre clulas de organis
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apesar de no ser um organito prortante funo, fornece estrutura clulanizao celular, responsvel pelorte intracelular e pelo posicionamento
Eucariontes
ssimbitica a que melhor explicae que se baseia na relao endossiieram a originar as mitocndrias e cian
quando ingeridas por outras clulas.factos:loroplastos so similares a bactrias;m-se por diviso binrias;prio DNA;prprios;entico diferente do usado pelo
omas e rRNA so mais prximo do d
ndossimbiticas foram vantajosas eisso perduraram, permitindo assimclulas eucariticas.
nto dos Organismos Multicelul
ez maior necessidade de nutrientestacto com o exterior, tornou-se evidenteera eficaz, iniciou-se assim uma srie
os idnticos, de forma a permitir uma
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priamente ditoa, determina o
movimentos,os organitos e
aparecimentombitica entreobactrias questa hiptese
enoma celular
s bactrias do
positivamenteue houvesse
res
consequenteque o simplese associaesaior rea sem
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que para isso aumentassem o seu volume. Desta associao surgiram ascolnias que apesar de serem clulas independentes eram favorecidas pelofacto de estarem agrupadas. Progressivamente comeou a existir umadiferenciao e especializao de determinados grupos de clulas e que maistarde viriam a originar os seres pluricelulares. Nestes existem grupos de clulas
com diferente funes, mas todos eles interdependentes e fazendo parte domesmo organismos.
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Captulo Um (pg. 52-57)
O microscpio electrnico no permite estudar as vrias funes dos
inmeros componentes da clula eucaritica e por isso necessrio isolar osorganelos (por tamanho e densidade) atravs da centrifugao diferencial.Inicialmente feita a ruptura da membrana plasmtica que pode ser feita
por exposio a ultra-sons, triturao com homogeneizadores mecnicos ouatravs de liquidificadores; de seguida a suspenso de clulas rompidas,lisado ou homogenato, sujeita a uma srie de centrifugaes de velocidadecrescente, em cada uma possvel separarmos determinado componente.
Existem outros mtodos para obter de forma isolada os organelos:- Centrifugao em gradiente de concentrao: separados por
sedimentao atravs de uma substncia densa (ex. sacarose);
- Centrifugao por velocidade: o material colocado no topo dogradiente de sacarose, partculas de tamanhos diferentes sedimentam atravsdo gradiente em taxas diferentes, permitindo separar organitos com tamanhossemelhantes;
- Centrifugao de Equilbrio: pode ser usada para separar organitoscom base nas suas densidades de flutuao, independentemente do seutamanho ou forma.
Crescimento de Clulas Animais em Cultura
Este processo mais complexo do que em bactrias e leveduras, noentanto atravs dele que podemos estudar o crescimento e a diferenciaocelular. Permite-nos ainda manipulaes genticas necessrias para acompreenso da estrutura e funo dos genes.
O processo consiste em retirar uma clula de um tecido, coloca-la nummeio de cultura nutritivo numa placa de cultivo, algumas das clulas aderem ecrescem formando colnias, a placa de cultivo assim preenchida dandoorigem a uma cultura primria, desta retirado um conjunto de clulas que socolocadas noutra placa de cultivo, dando origem a uma cultura secundria, esteprocesso repete-se at cerca de 50 a 100 vezes, aps isto as clulas perdem acapacidade de se duplicarem.
frequente o uso de tumores ou clulas de embries como material departida, j que contm clulas de crescimento rpido, e no caso dos tumoresno possuem limitaes quanto ao nmero de duplicaes que possvelrealizar. Um dos inconvenientes deste processo que ele muito maisdemorado, cerca de 10x, do que quando realizado em bactrias e leveduras.
Meio de Cultura Nutritivo no caso da cultura de clulas animais bastante mais complexo do que para as bactrias e leveduras, pois necessrio incluir factores de crescimento e de regulao, aminocidosessenciais no sintetizados pelo organismo, e os habituais nutrientes.
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Cultura de Clulas Vegetais
As clulas vegetais podem ser cultivadas desde que no seu Meio deCultura Nutritivo sejam adicionados os factores de crescimento adequados.
O processo iniciado com a recolha de uma clula que por divisesmitticas ir originar um conjunto de clula, o calo; contrariamente ao queocorre nos animais, as clulas restauram a totipotncia, sendo assim possveloriginar de uma s clula toda uma planta nova.
Vrus
Os vrus no considerados seres-vivos, so parasitas intracelulares quenecessitam de uma clula hospedeira para originarem descendncia, fazendo
uso dos mecanismos dessa mesma clula.
Existem retrovrus cujo material gentico no , como seria de esperar,o DNA, mas sim o RNA. Este vrus fazem uso da transcriptase reversa paraoriginarem cDNA que possa ser incorporado no genoma da clula hospedeira,visto que esta enzima menos eficiente, os vrus tm elevadas taxas demutao.
Os bacterifagos so altamente eficientes chegando em apenas 20 a 30minutos, infectada apenas uma clula, a originarem cerca de 200 novaspartculas virais.
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Captulo Dois
A composio Molecular das Clulas
As clulas so genericamente compostas por gua, ies inorgnicos emolculas orgnicas, sendo a molcula de gua a mais abundante (cerca de70% da massa da clula).
A interaco entre a gua e as restantes molculas de elevadaimportncia: destaca-se o facto de ser uma molcula polar, podendo formarpontes de hidrognio e interagir com ies carregados electricamente. Assimsendo as molculas polares (hidrfilas) so muito solveis em gua, enquantoas molculas apolares (hidrofbicas) so fracamente solveis em gua.
Devido ao facto de serem fracamente solveis, as molculas apolares
tendem a associar-se entre si de modo a minimizar o contacto com a gua efeito hidrofo.
Os ies inorgnicos (sdio, potssio, magnsio, clcio, cloro ebicarbonato) constituem 1% ou menos da massa da clula e esto envolvidosem vrios aspectos do metabolismo e funes da clula.
As molculas orgnicas podem ser na sua maioria divididas da seguinteforma:
- Protenas (Aminocidos);- Glcidos (Oses);
- Lpidos (cidos Gordos);- cidos Nucleicos (Nucletidos).
So macromolculas formadas por polimerizao dos seus monmerose que constituem entre 80% a 90% da massa restante da clula, de seguidairemos falar individualmente de cada um dos grupos anteriormente referidos.
Glcidos
Os seus monmeros so as oses, a mais conhecida a glicose, e tm
como funo o consumo no organismo, enquanto os polmeros, como ocaso do glicognio, tm uma funo de armazenamento.
Os glcidos associados a outras macromolculas, como exemplo asprotenas, podem funcionar como marcadores em vrios processos dereconhecimento celular.
Dentro dos glcidos destaca-se a glicose pois a principal fonteenergtica das nossas clulas, esta pode ocorrer na sua forma linear ou na souforma cclica. Quando se encontra na sua forma cclica pode encontrar-se emconformaes diferente ou (respectivamente trans ou cis) que
dependem da conformao do carbono um. Estas diferentes conformaes vo
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ter implicaes ao nvel da sua interaco com outras molculas,nomeadamente nos metabolismos celulares.
Os vrios monossacardeos so unidos por intermdio de uma reacode desidratao e ficam unidos por uma ligao glicosdica. Quando onmero de monossacardeos unidos reduzido denomina-se oligassacardeos,se forem cadeias muito longas denominam-se polissacardeos. A ligaoocorre geralmente entre C1---C4, mas pode ocorrer esporadicamente entre C1---C6; a ligao denomina-se ou dependendo da conformao do carbonoanumrico que intervm na ligao.
LpidosAs principais funes dos lpidos so:- Armazenamento de Energia;- Sinalizao Celular (Hormonas);- Principais componentes das membranas.
Os lpidos mais simples so os cidos gordos, mais frequentes ascadeias com 16 ou 18 carbonos, estes podem ser insaturados (uma ou maisligaes duplas entre carbonos) ou saturados (sem ligaes duplas entrecarbonos).
A natureza hidrofbica das cadeias de cidos gordos responsvel pelo
comportamento dos lpidos mais complexos, nomeadamente na formao de
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membranas, como o caso das membranas plasmticas formadas por umabicamada fosfolipdica.
Os lpidos so armazenados sob a forma de triacilglicerois e constituema forma mais eficiente de armazenar energia pois quando degradados, pela oxidao, originam mais do dobro de energia (ATP) do que os glcidos.
Os fosfolpidos so os principais componentes da membrana, no entantoencontramos ainda glicolpidos e colesterol.
Ao grupo fosfato de um fosfolpido pode estar ligada outra molculapolar, como o caso da colina, em cima na imagem, que pode ser um glcido efuncionar como receptor de membrana ou marcador. Existe ainda umaexcepo em que o fosfolpido no contm glicerol, a esfingomielina.
cidos Nucleicos
Existem dois tipos de cidos nucleicos, o DNA (desoxirribonucleico) e oRNA (ribonucleico), que diferem entre si apenas no acar (ose), que num caso
a desoxiribose e noutro a ribose, respectivamente.Existem vrios tipo de RNA:- mRNA (RNA mensageiro)- rRNA (RNA ribossmico)- tRNA (RNA transferncia)- RNAs envolvidos no processamento e transporte de protenas
Os monmeros dos cidos nucleicos so o nucletidos, que soconstitudos por uma base purina ou pirimidina, um acar (ose) e um fosfato.
As bases purinas so a:
Adenina e a Guanina; e as pirimidinasa: Citosina e a Timina/Uracilo. importante referir que a Adenina e aTimina/Uracilo se ligam por apenasduas pontes de hidrognio, enquantoa Guanina e a Citosina se ligam portrs pontes de hidrognio.
A polimerizao feito porintermdio de ligaes fosfodisterentre o grupo fosfato no C5 e grupo
hidroxilo no C3 da base que se segue,no esquecer que este processo
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ocorre sempre no sentido 5 3 e por isso mesmo, por conveno, se escrevesempre nesse mesmo sentido.
Os nucletidos so importantes para a formao os cidos nucleicos, noentanto eles intervm noutros processos de elevada importncia, como o
caso do ATP (adenosina 5 trifosfato), usada como energia qumica daclula, ou do AMPc, que um dos sinalizadores intracelulares.
Protenas
Os cidos nucleicos guardam a informao, as protenas tm comoprincipal funo executar as tarefas contidas nessa informao, e aindafunes de estrutura, de transporte e armazenamento de pequenas molculas,transmisso de informao, defesa e em situaes extremas podem serutilizadas para produzir energia.
A principal capacidade das protenas a de agirem como enzimas,catalisando as reaces nos sistemasbiolgicos.
As protenas so polmeros deaminocidos, existem cerca de 20aminocidos, e cada um deles possuicaractersticas especiais. Osaminocidos podem ter diversasconformaes, dependendo da posiorelativa do grupo amina em relao ao
carbono , como verificamos na imagemao lado. Estando acadeia laterallocalizada inferiormentee o grupo amina ehidroxilo no mesmoplano, se o grupoamina estiver esquerda, temos um Laminocido, so os
nicos encontrados nasprotenas humanas; seo grupo amina estiver direita do carbono ,temos um Daminocido (ter emconta que esteraciocnio apenas vivel se o radical seencontrar representadoinferiormente).
O aminocido cistena importante
pois atravs do seu grupo lateral, maisespecificamente do grupo SH conseguemcom outro resduo do mesmo aminocidoformam pontes dissulfeto.
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Os aminocidos podem ser divididos quanto s suas caractersticasqumicas, como sendo cidos/bsicos ou polares/apolares, estas estodependentes da sua cadeia lateral.
Os aminocidos formam protenas ligando-se entre si por intermdio de
ligaes peptdicas, e so sempre sintetizados no sentido de um grupo aminapara um grupo hidroxilo.
A sequncia de aminocidos apenas o primeiro elemento da estruturadas protenas, estas adaptam estruturas tridimensionais que so crticas para asua funo. Assim sendo existe uma estrutura primria que consiste numasequencia linear de aminocidos; a estrutura secundria pode dividir-se emduas estruturas:
- Folha Pregueada, quando duas cadeias esto lado a lado formam-se pontes de hidrognio entre elas, geram-se fitas paralelas ou anti-paralelas;
- Hlice, a cadeia de aminocidos gira em torno de si mesma e o
grupo carboxilo de um resduo de aminocido liga-se por ponte de hidrognioao grupo amina do resduo de aminocido localizado 4 posies abaixo nacadeia.
A associao de estrutura -hlice e -pregueada, conectados pelacadeia lateral dos seus resduos de aminocidos, leva formao de estruturasglobulares, denominadas de domnios, formando a unidade bsica daestrutura terciria. Na estrutura terciria os aminocidos hidrofbicosencontram-se no interior. Por fim temos a estrutura mais complexa,denominada porestrutura quaternria, que consiste na interaco de cadeiaspolipeptdicas de diferentes protenas, originando protenas constitudas pordiversos domnios.
Enzimas
As enzimas catalisam,aumentam a velocidade, dasreaces que ocorrem no interiordas nossas clulas. Estaspossuem duas caractersticasque as tornam adequadas para asua funo, aumentam a
velocidade da reaco sem seconsumirem e sem alterar oequilbrio qumico da mesma.
O princpio de funcionamento das enzimas consiste em diminuir aenergia de activao, aumento a velocidade da reaco tanto no sentidodirecto como no sentido inverso.
Mecanismo de Catlise Enzimtica
A ligao Enzima + Substrato muito especifica, existindo para explicar
esta especificidade dois modelos:
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- Modelo Chave-Fechadura, onde o substrato encaixa perfeitamentecom o centro activo da enzima que catalisa a reaco;
- Encaixe Induzido, a conformao da enzima e do substrato somodificados pela ligao do substrato, a conformao de tal forma alteradaque idntica do estado de transio, o que pode facilitar a sua converso
no produto final.
Coenzimas
Para que o complexo enzima e substrato posso estar activo necessriaa ligao de um grupo prosttico enzima, que pode ser uma vitamina ouies metlicos. Uma das diferenas das coenzimas que estas so alteradasdurante a reaco, no entanto so recicladas de modo a poderem serutilizadas de novo.
Regulao da Actividade Enzimtica
Existem diversos tipos de regulao enzimtica, destacando-se osseguintes:
- Inibio por retroalimentao, o produto de uma das reaco da viametablica, geralmente o produto final, vai se ligar enzima que catalisa aprimeira reaco desta via de forma a que esta fique inibida. assim possvelque haja um controlo dos gastos energticos e de substrato, pois havendomuito produto no necessrio que haja continuao da produo, podendo osubstrato ser utilizado para outra via;
- Regulao Alostrica, a enzima regulada pela ligao de pequenasmolculas ao seu centro alostrico, inibindo-a ou activando-a, no entanto estasubstncia pode ou no ser um produto da via metablica em questo;
- Fosforilao, a adio de grupos fosfato activa ou inibe a actividadeenzimtica.
Energia Metablica
Este tema referido no nosso programa de bioqumica e por isso no ovou referir aqui devido sua extenso e no ser muito relevante para aBiologia Molecular da Clula, mas aqui ficam algumas palavras-chaves centraisdeste tema:
- ATP- Gliclise- Respirao Aerbia- Fotossntese- Oxidao- Sntese de Protenas, Glcidos e Lpidos
Membranas Celulares
As membranas so barreiras entre o meio intracelular e o extracelular;dentro da clula definem os diversos compartimentos existentes. A sua origem
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e estrutura deriva das propriedades doslpidos, em grande parte dos fosfolpidos.Todas as membranas possuem umaestrutura comum composta por umabicamada fosfolipdica e protenas, que
podem desempenhar funo de transporte,receptoras e de controlo. A percentagem delpidos e de protenas aproximadamenteequitativa, dentro dos lpidos destaca-seainda a presena de colesterol e deglicolpidos. Esta estrutura em bicamadapermite que molculas individuais estejamlivres para girarem e se moverem emdireces laterais, pois uma estruturafluida.
A fluidez depende da temperatura, mas tambm da composio lipdicada membrana. As cadeias de cidos gordos insaturados juntamente comcadeias curtas de cidos curtos contribuem para uma maior fluidez, por sua vezo colesterol torna-a menos fluida, no entanto permite que a fluidez seja mantidamesmo a temperaturas baixas.
As protenas de membrana tm um papel diminuto na estrutura damembrana, sendo a sua actividade executar funes especficas de cadamembrana. Podemos distinguir dois tipos de protenas nas membranas:
- Protenas Transmembranares ou Integrais, que esto includasdentro da bicamada fosfolipdica;
- Protenas Perifricas, no esto inseridas na membrana, masassociadas bicamada fosfolipdica perifericamente, geralmente ligadas aprotenas integrais.
As pores que atravessam a bicamada so geralmente de estrutura em-hlice de 20 a 25 aminocidos no polares e esto geralmente associadas aglcidos, permitindo a interaco entre clulas. importante referir que existemainda estruturas denominadas de Barris , que consistem em vrias protenascom estrutura de folha -pregueada de forma a formarem um poro namembrana permitindo a entrada de diversas molculas.
Transporte Atravs das Membranas Celulares
As membranas possuem permeabilidadeselectiva, o que permite clula manter e controlara sua composio interna. Apenas as molculaspequenas e apolares atravessam prontamente amembrana; as que no o conseguem por si sfazem-no por intermdio de protenastransmembranares especificas que agem comotransportadores, o que origina a permeabilidade
selectiva das membranas.
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As protenas de transporte podem ser divididas em protenas de canal,consistem em poroso abertos selectivamente, ou em protenas transportadoras,que se ligam e transportam selectivamente, facilitam a passagem por elasmudando a sua conformao.
O transporte pode ser feito de forma passiva, a favor do gradiente deconcentrao, ou de forma activa, com gasto energtico e contra o gradientede concentrao, permitindo o controlo da composio interno da clula.
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Captulo Trs (pg. 113 138)
Hereditariedade, Genes e DNA
Todos os organismos herdam dos seus progenitores a informaogentica especificando estrutura e funo das suas clulas. Visto que todas asclulas so originadas de outras pr-existentes, o material gentico replicadoe passado da clula parental para a descendente em cada diviso.
Genes e Cromossomas
Os princpios bsicos genticos foram deduzidos por Gergor Mendel em1865:
Alelo cpia de um gene, que especifica uma determinada
caracterstica. Existem dois alelos para cada gene, sendo que um herdado dopai e outro da me.
Dominante demonstra-se sempre, quer em homozigotia, quer emheterozigotia.
Recessivo expressa-se apenas quando em homozigotia.Gentipo constituio de um indivduo em genes.Fentipo caractersticas fsicas que advm do seu gentipo.Cromossomas so como que carregadores de genes.Diploide (2n) existem no organismo duas cpias do genoma, existem
cromossomas homlogos.Haploides (n) apenas existe uma cpia do genoma.
Existem dois tipos de diviso celular, sendo que uma a mitose e outraa meiose. Na mitose existe uma conservao numrica do material gentico
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da clula, onde uma clula diploide origina duas igualmente diploides. Nameiose encontramos duas divises, sendo que a primeira reducional, ou seja,de uma clula diploide originam-se duas haploides, que por sua vez se irodividir, mantendo a quantidade de genoma, originando-se assim quatro clulashaploides. Apenas na formao dos gmetas existe a diviso meitica, pois
necessrio que estes sejam haploides, para que a quando da fecundao sepossa formar uma clula diploide e por divises mitticas, que conservaro onmero de cromossomas, surgir um individuo diploide.
Durante a meiose ocorrer recombinao entre os genes, sendo maisfrequente entre genes distantes do que prximos.
Ao longo da nossa vida ocorrem
alteraes nosso genoma, que podem serchamadas num contexto biolgico demutaes, no entanto no ponto de vistaclnico apenas as que originam umapatologia, e se encontram sob uma
presso selectiva negativa e por isso ocorrem numa percentagem menor dapopulao, so designadas de mutaes; as restantes e que ocorremgeralmente numa percentagem entre 1% a 3% da populao, no sendoprejudiciais, no sofrem uma presso selectiva negativa e por isso sotransmitidas descendncia, designam-se por polimorfismos. Atravs doestudo dos polimorfismos possvel estudar migraes, e relaes entre
pessoas ao longo de muitas geraes, como identificar corpos ou realizartestes de paternidade.
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Genes e Enzimas
Atravs de vrias experiencias chegou-se concluso que umadeterminada mutao alterava uma determinada via metablica, logo alteravauma enzima, e que diferentes mutaes em genes diferentes afectavam
diferentes vias ou diferentes pontos de uma mesma via e dai conclui-se quecada gene correspondia a uma protena.
Este princpio de que a cada gene corresponde uma protena umdos grandes pilares da actual gentica.
Replicao do DNA
A descoberta das cadeias duplas de DNA originou uma soluo para aquesto de como o material gentico se replicaria, as duas cadeias poderiamseparar-se e servir de molde para a sntese de uma nova cadeia atravs dacomplementaridade de bases hiptese semiconservativa.
A replicao do DNA na clula mediada pela enzima DNA polimerasee ocorre sempre no sentido de 5 para 3.
Expresso da Informao Gentica
Os genes determinam a estrutura (sequncia de aminocidos) dasprotenas, as quais so responsveis por direccionar o metabolismo; estasactuam como enzimas e tornam as reaces na clula possveis, no sentidoem que aumentam a sua velocidade. As protenas so polmeros deaminocidos, cuja sequncia determina a sua estrutura e funo.
Funo do RNA Mensageiro
Apesar de ser o DNA que determina a sequencia de aminocidos, no ofaz directamente, o que se prova pelo facto do DNA se localizar no ncleo e asntese proteica se realizar no citoplasma, logo preciso uma molcula quetransporte a informao para os ribossomas mRNA.
O RNA similar ao DNA, apenas difere no facto de ser uma cadeiasimples, o seu acar ser a ribose e possuir uracilo no lugar de timina. Apesar
das diferenas possvel sintetizar uma molcula de RNA a partir de um moldede DNA, logo o RNA mensageiro originado tendo como molde o DNA num
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processo denominado transcrio. A transcrio catalisada pelo RNApolimerase, no entanto para a sntese proteica ainda importante o RNAribossomal e o RNA de transferncia.
O Cdigo Gentico
Como que a sequncia de nucletidos do mRNA traduzida numasequncia de aminocidos?
Visto que os aminocidos e nucletidos no so estruturalmenterelacionados, no possvel o emparelhamento directo entre o mRNA e osaminocidos. Assim sendo o tRNA serve de adaptador, permitindo a relaoentre o mRNA e os aminocidos.
Cada aminocidos ligado a um tRNA especfico, que tem umasequncia (anticodo) que emparelha com uma sequncia do mRNA (codo),permitindo desta forma direccionar correctamente a sntese de protenas.
Atravs da determinao da sequncia de nucletidos que originadeterminado aminocido foi criado o cdigo gentico. Todos os organismostm o mesmo cdigo gentico, sendo que os dois primeiros nucletidosiniciais so mais especficos do que o 3, ou seja, uma alterao no 3nucletido menos propcia a provocar uma mutao patognica. UAA, UAG eUCGA so codes de finalizao, indicam ao ribossoma que a traduo deveterminar. Existem apenas 4 nucletidos, que se agrupam 3 a 3 (tripletos), o queorigina 43 combinaes possveis, temos assim 64 codes possveis. Visto queapenas existem 20 aminocidos, e temos 64 codes, indica-nos que o cdigo
gentico redundante, sendo um aminocido codificado por mais do queum codo.
Vrus de RNA e Transcrio Reversa
Apesar do DNA ser o material gentico de eleio para quase todas osorganismos, devido sua maior estabilidade, existem alguns vrus cujogenoma constitudo apenas por RNA Retrovrus.
Surgiu ento a questo de como poderia este vrus incluir o seu genomano da clula, assim sendo, estes vrus possuem uma enzima, a transcriptasereversa, que faz o inverso da transcrio, sintetizando uma molcula de
DNA tendo como molde uma de RNA.A transcrio reversa no ocorre apenas nestes vrus, mas tambm nasnossas clulas e responsvel pela transposio de sequncias de DNA deuma localizao cromossmica para outra.
Este processo, a transcrio reversa, permite ainda aos investigadoresoriginar de qualquer molcula de RNA uma de DNA, o que facilita o estudo dasclulas eucariticas.
DNA Recombinante
A tcnica de DNA recombinante permitiu aos cientistas isolar,sequenciar e manipular os genes individuais de qualquer clula,revolucionando assim a Biologia Molecular e Celular. Esta tcnica inclui alguns
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conceitos como as endonucleases de restrio, vectores recombinantes,sequenciamento, entre outras que abordaremos de seguida.
Endonucleases de Restrio
So enzimas que clivam oDNA em sequencias especificas,de quatro a oito pares de bases, eque foram pela primeira vezidentificadas em bactrias, ondeclivam o DNA estranho como modode defesa contra vrus.
Existe uma enorme variedadede endonucleases de restrio, maisde uma centena, cada umreconhece apenas uma sequnciaespecifica, sendo esta uma dassuas caractersticas.
Aps a clivagem num ponto desta determinada sequencia, no maiorparte dos casos, originam-se extremidades coesivas, que socomplementares; porm existem excepes, em que ao clivarem, estasenzimas, no originam extremidades com cadeia simples, , que surgem nestecaso, so complementares com qualquer outra extremidade cega, no entanto mais difcil fazer com que estas se unam.
Electroforese em Gel
O mtodo mais comum em que asmolculas so separadas com base narazo da sua migrao num campo elctrico,tendo em conta que se usam gis deagarose ou de policrilamida. Este gel colocado num compartimento contendo umasoluo tampo e elctrodos, a amostra pipetada em poos abertos no gele o campoelctrico ligado. Os cidos nucleicos,carregados negativamente, devido ao grupofosfato, migram em direco ao plopositivo. O gel funciona como que umapeneira, retardando o movimento dasmolculas maiores e facilitando a passagemde molculas menores, o que permite a suaseparao pelo seu tamanho e pesomolecular.
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Gerar Molculas de DNARecombinante
A estratgia bsica da clonagem de
molculas inserir o DNA de interesse numvector, que consiste numa molcula de DNAcom a capacidade de se auto-replicar,independentemente do DNA da clulahospedeira. Resulta ento uma molcularecombinante que composta pelo insert deDNA (molcula de interesse) ligado sequenciade DNA do vector. Este vector pode ser inseridonuma clula hospedeira e originar inmerascpias.
Os fragmentos de DNA usados paracriar molculas recombinantes sonormalmente gerados por digesto comenzimas de restrio, deixandoextremidade coesivas que podem ligar-sea outras por complementaridade. O
restabelecer entre estas extremidadespode ser mediado pelas DNA ligases,assim sendo dois fragmentos de DNAclivados pelo mesma enzima de restriopodem ser unidos, originando umamolcula de DNA recombinante.
As sequencia de RNA tambmpodem ser clonadas, primeiro atravs datranscriptase reversa, que origina cDNA(DNA complementar), podendo assim ser
ligada a um vector como j foi descritoanteriormente. Este mtodo permite ummelhor estudo da estrutura e funogentica dos eucaritas, viste que permiteestudar as sequencias de DNA sem osseus intres, sequencias no codificantese que so removidas na clula porsplicing, visto que originamos cDNA apartir de mRNAs maduros (j sem os seusintres).
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Vectores para DNA Recombinante
Existem diversos tipos de vectores, como o caso dos vectros bacterifagos ,cosmdeos, cromossomas artificiais de leveduras
(YAC), no entanto os que mais amplamenteutilizados so os plasmdeos. Os plasmdeospermitem uma mais fcil manipulao, sendomolculas circulares de DNA com capacidadede ser auto-replicarem.
Para um vector de clonagem necessrio:
- Origem de Replicao: local onde se liga a DNA polimerase e quepermite a replicao;
- Gene de Resistncia a Antibiticos: permite seleccionar as clulashospedeiras onde foi ou no incorporada o vector;
- Local de Policlonagem: local onde existem sequencias de corte paravrias enzimas de restrio, o nico local onde estas clivam, e na maior partedos casos clivam neste local apenas uma vez;
- Promotor: permite a expresso, pois aqui que se ir ligar a RNApolimerase, e a sua presena distingue um vector de expresso de um declonagem.
Nota: importante ter em conta que a ligao entre o insert de DNAe o vector de clonagem no um processo muito eficaz, por isso coloca-se o insert de DNA em excesso. Mesmo que este processo ocorra, e haja
uma recirculao da molcula de DNA, existem trs situao possveis eapenas uma delas a pretendida: plasmideo no-recombinante,plasmideo recombinante com o insert na posio correcta (5 3) ou naposio incorrecta (3 5). Esta situao solucionvel com a anlisedas colnias que se formam, podendo assim determinar qual a que tem oplasmdeo recombinante com o insert na posio correcta. Esta situao analisada com a digesto dos plasmideo de vrias colnias, com amesma enzima de restrio, e posterior electroforese, que atravs dotamanho dos fragmentos nos permite saber qual o correcto.
Sequenciao do DNA
A clonagem de DNA permite o isolamento de sequncias de DNA emquantidades suficientes para a sua caracterizao detalhada, incluindo adeterminao da sua sequencia. O mtodo mais utilizado o baseado naterminao prematura da sntese de DNA resultante da incluso dedidesoxinucleotdeos (no contm o grupo hidroxilo no carbono 3).
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A sntese de DNAcomea com um primer, pois aDNA polimerase no capazde iniciar a sntese a partir deuma cadeia simples de DNA,
este primer marcado com umradioistopo. So feitas quatroreaces separadas, cada umadelas contento umdidesoxinucleotdeo, alm dosrestantes componentes comuns(primers, DNA de interesse,nucleotdeos e DNApolimerase). A incorporao deum didesoxinucleotdeobloqueia a sntese da restante
cadeia, existem assim em cadareaco diversos fragmentos
com diversos tamanhos, no entanto todos eles terminam numdidesoxinucleotdeo (A,G,C ou T). Estes fragmento so separados porelectroforese, em gel de policrilamida (que permite uma maior resoluo), o gel exposto a um filme raio-X. visto que o tamanho de cada fragmento determinado pelo didesoxinucleotdeo terminal, a sequencia do DNAcorresponde ordem dos fragmentos lidos a partir do gel.
Actualmente a sequenciao em grande escala feito por sistemasautomticos que contendo primers ou didesoxinucleotdeos florescentes, sosubmetidos electroforese e ao passarem num laser so excitados e emitemluz, que detectada por um fotomultiplicador e analisada por um computador, assim feita a sequencia do DNA (em fluorogramas de sequenciao). Se foremutilizados didesoxinucleotdeos florescentes, desde que cada um emita uma luzdistinta, a reaco pode ser toda efectuada num mesmo microtubo.
Expresso dos Genes Clonados
A clonagem molecular alm de permitir sequenciar os genes, permiteainda a obteno de grandes quantidades de protena, tanto para o seu estudo,
como para o uso teraputico.
Para expressar um gene eucaritico em E.Coli, o cDNA de interesse clonado dentro de um vector plasmidial ou fago que contenha sequncia quedirijam a transcrio, promotor, o que origina um vector de expresso. Vistoque se trata de uma protena eucariotica til expressa-la num organismoeucariotico, para que as modificaes ps-traducionais possam ocorrer deforma normal.
Por norma, nos vectores de expresso, existe uma sequncia dereguladora, para que a expresso de determinada protena possa ser
controlada, de modo a preservar a clula hospedeira. Podemos ainda adicionarao vector determinadas sequncias, como o caso da sequencia de Shine
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Delgarno, onde se liga a RNA polimerase procaritica, de modo a aumentar aproduo de uma determinada protena.
Amplif icao de DNA pelaReaco em Cadeia de Polimerase(PCR)
Para realizarmos a PCR, que consistenuma DNA polimerase usada repetidas vezes,produzindo de forma exponencial; no entanto necessrio conhecer alguma sequencia damolcula de DNA que desejamos amplificar.
So usados primers de DNA, de 15 a 20nucletidos, que flanqueiam a regio em ambos oslados e que hibridem apenas uma vez na molcula
de DNA presente. A soluo contendo DNA, DNApolimerase, nucletidos e primers aquecida(95C) para que haja a separao das cadeiasduplas de DNA. A temperatura diminuda parapermitir a hibridao dos primers, permitindoassim que a DNA polmeras inicie a sntese denovas cadeias, o que feito a uma temperaturaptima (75C). Estes ciclos so repetidos cercasde 30 vezes e permitem originar de uma nicamolcula de DNA inmeras molculas de DNA,cerca de 230.
Transferncia de Genes emPlantas e Animais
Apesar de o estudo em clulas eucaritasser complexo possvel, recorrendo transferncia gnica, estudar os mecanismos de regulao da expressogenica e processamento proteico.
O DNA introduzido nas clulas animais juntamente com um co-precepitado de fosfato de clcio. Inicialmente o processo era feito atravs deDNA infecciosos virais e por isso este processo muitas vezes designadocomo transfeco. Este DNA absorvido e transportado at ao ncleo onde transcrito por vrios dias, no entanto numa pequena fraco das clulas o DNA integrado no seu genoma e transmitido aos seus descendentes. As clulasque contem este gene podem ser isoladas se este conferir resistncia adeterminados antibiticos, podendo assim ser estudado o efeito destes genesno comportamento celular.
Existem outros mtodos para a incorporao de DNA em clulas demamferos:
- Microinjeco directa de DNA no ncleo;
- Incorporao de DNA em vesculas lipdicas;
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- Impulso elctrico que abre os poros transientes na membrana(electroporao);
- Vrus usados como vectores, especialmente retrovrus, pois no seuciclo est includa a integrao estvel do DNA viral no genoma das clulashospedeiras.
Mutagnese de DNA Clonados
Os genes mutados so detectados porque resultam em mudanasfenotpicas observveis.
O isolamento de genes pelo DNA recombinante tem aberto novasfronteiras, agora possvel introduzir qualquer alterao desejada num gene,clona-lo e determinar o efeito dessa mutao, esta tcnica designa-se porgentica reversa.
A mutagnese in vitro tem permitido a caracterizao detalhada dasactividades funcionais de sequencias regulatrias e codificantes para protenasdos genes clonados.
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Captulo Quatro
A complexidade dos Genomas Eucaritas
Os genomas eucaritas so maiores e mais complexos do que osprocaritas, o tamanho pode estar relacionado com uma maior complexidade,no entanto no parece que assim seja, pois organismos menos complexospossuem mais DNA que outros mais complexos.
Este paradoxo foi solucionado pela descoberta que no genomaeucaritico no existe somente genes funcionais, mas sim uma grandequantidade de sequencias de DNA que no codificam protenas. Apenas cercade 3% do DNA codifica protenas. Isto deve-se ao facto de existirem intres eexes, juntamente com as famlia de genes e as sequencias repetitivas, queaprofundaremos de seguida.
Intres e Exes
Parte do DNA no-codificante situa-se entres os genes e denomina-se porsequncias espaadoras. No entantosequencias no codificantes soencontradas nos genes, assim sendo temosos exes, que codificam realmente asprotenas, e os intres, que no codificamas protenas e so removidos do mRNAaps o seu processamento.
O gene inteiro transcrito, eseguidamente atravs de splicing os intresso removidos. Os intres no entanto estoem grande quantidade, e so geralmentemaiores que os exes, o que ajuda amanter uma baixa taxa de mutaes; pois mais provvel que esta ocorra em sequncias no codificantes. Apesar de areal funo dos intres ainda no ser conhecidos, alguns deles codificampequenos RNAs. Em todos os genes existem ainda sequencias que os
flanqueiam, e que so transcritas, no entanto no so traduzidas, as UTR 5 e3.
Famlias Gnicas e Pseudogenes
Outro factor que contribui para o grande tamanho dos genomaseucaritas a presena de alguns genes repetidos muitas vezes, a estasmltiplas cpias de uma mesmo gene chamamos famlias gnicas. Este facto justificado pela necessidade de grandes quantidades de determinadaprotenas ou RNAs, existem ainda diferentes membros da famlia que podemser transcritos em clulas diferentes ou em estgios diferentes do
desenvolvimento. O ltimo acontecimento pensa-se que deriva da existncia demutaes que surgiram em diferentes membros da famlia, originados por
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duplicao de um gene, que se podem ter tornado optimizados em diferentestecidos ou estgios de desenvolvimento. No entanto como era de esperar nemtodas as mutaes melhoram a funo dos genes, outras tornam-nos inactivos,originando pseudogenes.
Sequncias de DNA Repetitivas
Uma parte substancial do genoma constitudo por sequenciasrepetitivas de DNA no-codificante. Sequencias simples de DNA contendomilhares de cpias de sequencias curtas, de 5 a 20 nucletidos, ordenados emsrie, designam-se porDNAs Satlites e so responsveis por 10% a 20% dogenoma.
Outras sequncias encontram-se espalhadas pelo DNA genmico, emvez de estarem agrupadas. Se forem elementos curtos dispersos repetidos,designam-se SINEs e temos como exemplo os elementos Alu; se foremelementos longos dispersos repetidos, designam-se LINEs.
Cromossomas e Cromatina
O genoma dos eucaritas muito mais complexo do que o dosprocaritas, mas tambm organizado de forma diferente. O genoma dosprocaritas est contido num nico cromossoma e que usualmente circular.Nos eucaritas o genoma composto por vrios cromossomas, contendo cadaum uma molcula linear de DNA, que se encontra associado a protenas, ashistonas, que o empacotam de modo ordenado.
CromatinaA cromatina composta
pelo DNA eucaritico juntamentecom as protenas associadas aeste, sendo que estas seencontram numa proporo de1:2, existindo na cromatina umamaior proporo de protenas doque de DNA. Alm das histonasexistem outras protenas que
contribuem para oempacotamento do DNA nucleare ainda as que participam nosprocessos de replicao e de expresso do DNA.
A unidade estrutural bsica da cromatina o nucleossoma, cuja partecentral constituda pela cromotossoma e uma histona. Fazem ainda parte donucleossoma protenas no histnicas que esto flanqueando a parte centraldeste, sendo duas, e que esto separadas por cerca de 200 pb.
Os nucleossomas so empacotados em fibras com cerca de 30 nm, cujaestrutura ainda no foi determinada, no entanto sabe-se que o grau decondensao da cromatina varia ao longo do ciclo celular; podemos assimdistinguir a eurocromatina, quando esta se encontra descondensada, e aheterocromatina, quando esta se encontra condensada.
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- STRs existem a repetio de uma sequencia curta, varia de individuopara individuo o nmero de repeties que existem;
- VNTRs repetio de uma sequencia de tamanho varivel, mas maiordo que em STRs, e que varia igualmente entre os indivduos;
- SNPs polimorfismos que so originados devido a uma alterao em
um nico nucletido.
Os genes humanos podem ser mapeados por hibridao de clulassomticas, hibridao in situ fluorescente e anlise de ligao gentica. Tmsido usados clones de YAC para construir mapas do genoma humano. Osequenciamento aleatrio de genes de cDNA tem fornecido marcadores parasequencias presentes nos mRNAs. Marcadores de DNA de mais de 30000genes humanos tm sido usados para construir um mapa fsico e genticointegrado do genoma humano.
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Captulo Cinco
DNA Polimerases
A capacidade desta enzima de copiar um molde de DNA prova a basebioqumica para a hiptese de replicao proposta inicialmente, hiptese semi-conservativa. Existem vrias DNA polimerases que desempenham diferentespapeis na replicao e reparao do DNA. Conclui-se aps vrias experienciasque a DNA polimerase I e III so necessrias, e de grande importncia, para areplicao na E.Coli.
As clulas eucaritas contm as DNA polimerases ,,, e .
A DNA polimerase localiza-se na mitocndria e responsvel pelareplicao do seu DNA. As restantes localizam-se no ncleo e so possveis
intervenientes na replicao do genoma nuclear.
As polimerases encontram-se activas tanto em clulas que estodiviso como em clulas que no esto, o que nos sugere que podeprimariamente estar envolvida em mecanismos de reparao.
O papel das polimerases , e na replicao foi comprovada emvrias experiencias, como exemplo a replicao do vrus SV40 em clulaslivres, que nos mostrou a importncia a importncia das polimerases e ; e ofacto das , e serem encontradas em leveduras e clulas de mamferosdemonstrou que sem qualquer uma delas no ocorre replicao em leveduras,
mas foi igualmente demonstrado que as polimerases possuem um papelespecifico nas leveduras, concluindo que as polimerases e so asgrandes responsveis pela replicao nas clulas eucaritas em geral.
Todas as polimerases possuem duas caractersticas indispensveis paraa replicao do DNA:
- Sintetizam DNA somente na direco de 5 3, adicionando um dNTPno grupo hidroxilo da cadeia nascente;
- Apenas conseguem adicionar um novo desoxirribonucleico a umacadeia de DNA dupla; assim sendo as DNA polimerases no so capazes deiniciar, por si s, a replicao sem a existncia prvia de uma cadeia dupla; um dos aspectos em que difere da RNA polmeras, pois esta consegue ligar-sea uma cadeia simples e iniciar a sua funo.
Estas caractersticas parecem ser criticas na manuteno da altafidelidade da replicao do DNA para a reproduo celular.
Nota: O facto de a DNA polimerase apenas sintetizar no sentido de 5 3 deve-se ao facto de o grupo fosfato que clivado, de modo a fornecerenergia para a formao da ligao do nucletido que se ir juntar de novo.Se fosse sintetizada no sentido 3 5, o grupo fosfato clivado seria o donucletido na extremidade na cadeia que est a ser sintetizado, assim sendo
se houver um erro e for necessrio substituir este nucletido no existe j ogrupo fosfato que permita a formao de uma nova ligao, se a sntese for
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feita no sentido 5 3, a energia para a formao da nova ligao provem donovo nucletido, o que nos permite a reparao do DNA.
A Forquilha de Replicao
Durante a replicao das molculas circulares de DNA podiam serobservadas duas forquilhas de replicao, que representam as regiesactivas na sntese de DNA e so constitudas por duas cadeias de DNAparental separadas e duas filhas sendo sintetizadas. Surgiu ento um problemadevido ao facto de as cadeias terem que ser sintetizadas em sentidos opostos,no entanto a DNA polimerase apenas consegue sintetizar na direco 5 3,como poderiam duas cadeias ser sintetizadas em simultneo?
Ficou ento demonstrado que apenas uma das cadeias sintetizada deforma contnua, no sentido da forquilha, a outra cadeia sintetizada de formadescontinua, sendo composta por fragmentos descontnuos que sosintetizados no sentido oposto ao da forquilha, permitindo que sejamsintetizados no sentido de 5 3. Estes fragmentos so denominados porfragmentos de Okazaki e so posteriormente unidos por uma DNA ligase.
A cadeia que sintetizada no sentido da forquilha designa-se por cadeiade sntese continua, enquanto que a outra cadeia de sntese descontinua.Outro dos problemas que surgiu foi: como conseguiria a DNA polimerasesintetizar os fragmentos de Okazaki, se esta necessita de primers?
Existem pequenos fragmentos de RNA que actuam como primers e sosintetizados (fragmentos de 3 a 10 nucletidos) por uma enzima especifica
primase.
ento necessrio remover os fragmentos de RNA que existem nosfragmentos de Okazaki, esta aco realizada pela DNA polimerase I naE.Coli, que tem o papel de uma exonuclease, nas clulas eucaritas desempenhada por outras exonucleases e o espao que surge preenchido pelaDNA polimerase .
Funo Eucaritas ProcaritasSntese de cadeiascontinua e alongamento
da descontinua
DNA Polimerase DNA Polimerase III
Remoo de Primers Exonucleases RNase H + DNAPolimerase I
Sntese de pequenosfragmentos DNA-RNA
DNA Polimerase +Primase
DNA Polimerase II
Unio dos Fragmentosde DNA
DNA Ligases DNA Ligases
Alm da DNA polimerase e das primases existem mais protenasenvolvidas na replicao do DNA; um grupo de protenas liga-se DNApolimerase aumentando a sua actividade e fazendo que permaneam ligados
cadeia de modo a que continuem a sintetizar; existem ento dois tipos de
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protenas acessrias, as de carregamento do grampo (RFC em mamferos) eas de deslizamento do grampo (PCNA em mamferos):
- RFC, complexo C no eucaritas, reconhecem e ligam-seespecificamente ao DNA no local do primer;
- PCNA, antignio nuclear de clulas em proliferao nos eucaritas,
ligam-se s adjacncias das protenas de carregamento de grampo (RFC),formando um anel em torno da cadeia molde do DNA, este anel mantm aassociao entre a cadeia de DNA e o complexo da DNA polimerase e asprotenas acessrias, permitindo a sntese ininterrupta de milhares denucleotdeos.
Existem ainda as helicases que catalisam o desenrolamento da cadeiadupla do DNA parental, e as protenas SSB (protenas de ligao ao DNA decadeia simples), que estabilizam a cadeia molde desenrolada, mantendo-acomo cadeia simples para que possa ser copiada.
medida que as cadeias vo sendo desenroladas, as regio frente daforquilha de replicao so obrigada a rodar, o que levaria a um bloqueio dareplicao, devido ao enrolamento excessivo das cadeias. Este problema foiresolvido por uma enzima, a topoisomerase, que catalisa a reaco reversvelde quebra e juno de cadeias de DNA; existem dois tipos desta enzima:
- Topoisomerase I, que clivam em apenas uma das cadeias;- Topoisomerase II, que clivam simultaneamente as duas cadeias.Estas quebras permitem molcula girar livremente evitando a
supertoro do DNA frente da forquilha de replicao, permitindo que areplicao prossiga. Apesar de os cromossomas eucaritas serem lineares,eles tambm requerem a interveno de topoisomerases, de modo a evitar ocontinuo girar do cromossoma.
A topoisomerase II est tambm envolvida na condensao do DNAmittico.
As enzimas envolvidas na replicao actuam de forma coordenadapermitindo a sntese simultnea tanto da cadeia continua, como dadescontinua. Esta simultaneidade conseguida pela formao de dmeros dasDNA polimerases, estando uma envolvida na sntese da cadeia continua eoutra na cadeia descontinua.
Fidelidade da ReplicaoA exactido da replicao do DNA crucial para a reproduo celular,
as estimativas indicam que apenas existe uma nica base incorrecta a cada109 ou 1010 nucleotdeos incorporados. Esta fidelidade nos dada pela simplescomplementaridade de bases, no entanto ela to elevada devido sactividades da DNA polimerase.
A DNA polimerase no catalisa apenas a incorporao de qualquernucleotdeo, mas ela evita a incorporao de uma base erra, mal-pareada,atravs de uma presumvel adaptao conformao da base correcta, este
mecanismo permite aumentar em 100x a fidelidade da replicao. Outromecanismo a correco dos erros pela DNA polimerase, que atravs das
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suas funes de exonuclease remove a base mal-pareada e substitui-a pelacorrecta. Esta actividade est associada s DNA polimerases e , eaumenta a fidelidade entre 100 a 1000 vezes. A importncia do mecanismo decorreco explica a existncia de primers e do DNA ser apenas sintetizado nosentido de 5 3.
As Origens e a Iniciao da Replicao
A replicao tanto em eucaritas como em procaritas inicia-se em umasequencia particular, a origem de replicao. Esta consiste numa sequenciade nucletidos onde se ligam protenas. Inicialmente a protena iniciadora querecruta as helicases e a SSB (que desenrolam a cadeia dupla e expem acadeia molde), seguidamente a primase inicia a sntese da cadeia continuam,surgem assim duas forquilhas de replicao que se movem em sentidosopostos.
Nas clulas eucaritas existem milhares de origens de replicao,contrariamente E.Coli, onde apenas existe uma, de modo a que apesar dotamanho do genoma e de uma sntese mais lenta, a replicao em eucaritasseja feita em poucas horas. Estas diversas origens de replicao noseucaritas existem em intervalos de 50 a 300 kb.
Nas leveduras encontram-se sequncias que podem sustentar areplicao de plasmdeos, sem necessidade de incorporao no cromossoma.Estas sequncias de auto-replicao (ARS), existem igualmente no DNAcromossomal da levedura, e nelas est contida o complexo da origem de
replicao (ORC), onde se vo ligar as protenas envolvidas na replicao.Apesar de ainda pouco conhecidas as sequncias de iniciao dareplicao nos eucaritas mais complexos, pensa-se que sejam idnticas sdas presentes nas leveduras.
Os Telmeros e a Telomerase
Visto que a DNA polimerase no capaz de copiar as extremidades doscromossomas, visto que apenas sintetiza no sentido 5 3 e com inicio numacadeia dupla; por isso necessrio a presena de mecanismos especiais parareplicar as sequncias dos telmeros.
Os telmeros so sequencias repetidas directas, que so sintetizadaspor intermdio da telomerase, que capaz de catalisar a sntese de DNA naausncia de um molde de DNA. A telomerase uma transcriptase reversa eque como tal sintetiza DNA apartir de um molde de RNA, que est contido nelae complementar s sequencias repetitivas dos telmeros. Este molde permiteque a telomerase estenda a extremidade 3 do DNA cromossomal uma unidadede comprimento alm do seu tamanho original, podendo assim a cadeiacomplementar ser sintetizada pelo complexo DNA polimerase + primase. Aremoo do primer de RNA deixa a extremidade 3 numa cadeia simples, o quepode levar a formao de laos nos cromossomas eucaritas.
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A telomerase, e os telmeros, permitem que haja a replicao domaterial gentico sem perda de sequncias significativas, visto que em cadareplicao existe a perda de uma parte da extremidade da cadeia.
A telomerase no se encontra sempre activa, pensa-se que apenas na
fase embrionria, o que nos leva a pensar que os telmeros determinam onmero de vezes que uma clula se pode replicar e desta forma a nossalongevidade.
Reparao do DNA
O DNA, como qualquer molcula, pode sofrer reaces qumicas, sendoalterado, o que no deve acontecer pois ela responsvel pelo nosso materialgentico.
As mutaes vo desde a incorporao incorrecta de base durante areplicao, alteraes qumicas espontneas ou como resultado deexposio a agentes mutagnicos.
Os mecanismos de reparao do DNA pode dividir-se em dois grandesgrupos: reverso directa da reaco qumica responsvel pelo dano eremoo de bases alteradas por substituio com DNA recm-sintetizado.Onde a reparao do DNA falha, desenvolveram-se mecanismos para que aclula posso lidar com o dano provocado.
Reverso Directa de Leses do DNA
Poucos tipos de leses so reparados por este mecanismo,particularmente os dmeros de timina devido exposio a UV e os resduosde guanina alquilados, que foram modificados pela adio de grupos metiloou etilo na posio O6 do anel purnico.
A radiao UV das maiores fontes de dano do DNA e na sua maiorialeva formao de dmeros de pirimidinas, estas formaes destorcem acadeia de DNA e bloqueiam a transcrio e replicao. A reparao feita deforma directa por uma reaco de dimerizao, e o processo denomina-se porfotoreactivao, pois a energia da luz visvel que permite a quebra daestrutura do anel formado entre dos dois nucleotdeos. de salientar que este
processo no ocorre nos humanos.
Outra forma directa de reparao lida com os danos resultantes dareaco de agentes alquilantes do DNA, que transferem grupos metilo e etilopara bases do DNA, temos o caso especifico da O6-metilguanina, que seemparelha com a timina em vez da citosina. Esta leso pode ser reparada poruma enzima, que remove o grupo metilo para um resduo de cistena no seucentro activo.
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Reparao por Exciso
Apesar da reparao directa ser uma forma eficiente de lidar com tiposparticulares de leses no DNA, a forma mais utilizada a reparao porexciso. Esta pode dividir-se em:
- Reparao por exciso de base: uma nica base lesada, identificada e removida, sendo depois substituda pela correcta. A exciso donucleotdeo catalisada por enzimas especificas, formando um local AP. Asendonucleases AP clivam as regies adjacentes ao sitio AP e a falha preenchida pela DNA polimerase e pelas DNA ligases.
- Reparao por base de nucleotdeo: as bases lesadas soremovidos como parte de um oligonucleotdeo contendo a leso. Na E.Coli estaexciso catalisada pelo complexo UvrABC, a UvrA idfentifica a leso erecruta a UvrB e a UvrC que cliva nas posies 3e 5, respectivamente, o locallesado, excisando um nucleotdeo com 12 ou 13 bases. Este complexo geralmente designado por excinucleases. A helicase e a DNA polimerasecompletam este processo. Nas clulas eucaritas existe um modelo bsicopara explicar este processo, apesar de este ainda no se encontrarcompletamente elucidado. As protenas XPA identificam a leso e recrutam asprotenas XPB e XPD (funcionam como helicases); o complexo XPF/ERCC1 5e a protena XPG 3, clivam um oligonucleotdeo (com cerca de 30 bases)contendo a leso. O restante processo e concludo pela DNA polimerase ou juntamente com as protenas RFC e PCNA.
- Reparao por malpareamento: bases malpareadas durante areplicao, estes erros so muitas vezes corrigidas pela DNA polimerase.Existem enzimas que reconhecem na cadeia recm-sintetizada as bases
malpareadas. A reparao iniciada pela MutS, a qual identifica omalpareamento e recruta a MutL e a MutH, estas direccionam a remoo doDNA entre a quebra na cadeia e o malpareamento. O reconhecimento dacadeia recm-sintetizada possvel devido existncia de quebras nesta.
Mutaes nos genes MutS e MutL so responsveis por uma dasformas cancro do clon.
Reparao Ps-Replicao
Os mecanismos de reparao referidos anteriormente ocorrem antes da
replicao ser concluda de forma a que esta possa ocorrer de forma correcta.A replicao geralmente bloqueada a quando do aparecer de umaleso, no entanto esta pode recomear logo aps a leso atravs da sntese deum fragmento de Okazaki. Este tipo de falhas pode ser reparada