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JORGE ALEXANDRE NOGUEIRA SANTOS
INIBIO E ESPECIFICIDADE DA Lbpro DO VRUS DA FEBRE AFTOSA
So Paulo 2009
Tese apresentada a Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina para obteno do ttulo de Doutor em Cincias.
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Santos, Jorge Alexandre Nogueira Inibio e especificidade da Lbpro do vrus da febre aftosa/ Jorge Alexandre Nogueira Santos. - So Paulo, 2009. XI, 93 f.
Tese (Doutorado) Universidade Federal de So Paulo. UNIFESP. Programa de Ps-graduao em Biologia Molecular.
Ttulo em ingles: Substrate specificity and inhibition studies of FMDV Lbpro
1. Peptidase. 2. Inibidor de peptidases. 3. Febre Aftosa. 4.FMDV.
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Tese preparada no Departamento de Biofsica, durante o curso de Ps-graduao em Biologia Molecular e apresentada Universidade Federal de So Paulo - Escola Paulista de Medicina - como requisito parcial para obteno do ttulo de Doutor em Cincias.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Juliano Neto
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Nossos agradecimentos Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) pelo auxlio financeiro concedido ao laboratrio na forma de Projetos Temticos, e tambm ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) pela bolsa concedida e pelos Auxlios financeiros concedidos ao laboratrio e seus membros.
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Aos meus pais e meus irmos a minha eterna gratido por todo o amor e dedicao. Foi graas a todo o apoio que vocs dedicaram a mim que tive a oportunidade de concluir mais esta etapa. tambm por vocs que sinto a maior alegria ao concluir esta tese, podendo retribuir um pouco do imenso orgulho sinto de vocs.
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Luiz Juliano, orientador e mestre, que sempre me proporcionou
uma convivncia limpa e honesta. Continua sendo uma honra trabalhar sob to
distinta orientao.
Profa. Dra. Maria Aparecida Juliano, no s pela sntese de peptdeos,
mas tambm pela amizade com a qual sempre fui recebido em seu laboratrio.
Aos amigos, colegas e docentes da UNIFESP que me ensinam tanto.
Agradeo em especial aqueles que tanto me ajudaram nos momentos confusos
desta jornada, me estimulando, valorizando os meus acertos e corrigindo as
minhas falhas.
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ndice
1.INTRODUO ...............................................................................................................1 1.1.ENZIMAS............................................................................................................1
1.1.2. CLASSIFICAO DAS ENZIMAS.........................................................1 1.1.3 ENZIMAS E ENERGIA DE ATIVAO .................................................3 1.1.4. CINTICA ENZIMTICA .........................................................................4 1.1.5. PEPTIDADES..........................................................................................10
1.1.5.1. CLASSIFICAO DAS PEPTIDASES ............................................11 1.1.5.2 ESPECIFICIDADE ..............................................................................14 1.1.5.3. CISTENO-PEPTIDASES ..................................................................15
1.2. SUBSTRATOS PEPTDICOS FLUOROGNICOS..................................19 1.3. FEBRE AFTOSA ............................................................................................22
1.3.1.DISTRIBUIO GEOGRFICA ............................................................22 1.3.2. PATOGENIA............................................................................................23 1.3.3. SINAIS CLNICOS ..................................................................................24 1.3.4.VACINAS...................................................................................................24 1.3.5. AGENTE ETIOLGICO.........................................................................25 1.3.6. PEPTIDASE LEADER (Lbpro) ...............................................................27
2. OBJETIVOS ................................................................................................................38 3. MATERIAIS E MTODOS ........................................................................................39
3.1.EXPRESSO DA Lbpro e sLbpro ...................................................................39 3.2. PURIFICAES DA Lbpro e sLbpro..............................................................40 3.3 SNTESE DE PEPTDEOS FRET ................................................................41 3.4 DETERMINAO DA CONCENTRAO DOS SUBSTRATOS PEPTDICOS FRET ..............................................................................................42 3.5. PADRONIZAO DO FLUORMETRO PARA O GRUPO ABZ (CIDO ORTHO-AMINOBENZICO). ..............................................................................43 3.6. PADRONIZAO DO FLUORIMETRO PARA Z-FR-MCA. ...................43 3.7.CINTICAS ENZIMTICAS ..........................................................................44 3.8.EFEITO DE SAIS NA ATIVIDADE CATALTICA DA Lbpro .......................45 3.9. DETERMINAO DOS pKas E DO pH TIMO DA Lbpro ...................46 3.10. EFEITOS DE DETERGENTES NA ATIVIDADE ENZIMTICA ...........47
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3.11. DETERMINAO DOS VALORES DE KI DOS PEPTDEOS RESISTENTES HIDRLISE PELA Lbpro .......................................................47 3.12. MODELAGEM DA Lbpro ..............................................................................48 3.13.DETERMINAO DA ENERGIA LIVRE DE LIGAO DO SUBSTRATO (GS) E ENERGIA LIVRE DE ATIVAO (GT) ..................48 3.14. ATIVIDADE ENZIMTICA EM DIFERENTES CONCENTRAES DE Lbpro E SUA MUTANTE sLbpro ........................................................................49 3.15. INIBIO DA Lbpro POR COMPOSTOS DE TELRIO ........................50
4.RESULTADOS E DISCUSSES .............................................................................52 4.1.ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S7 AO S5. .......................................52
4.1.1.ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S1 E S2.....................................52 4.1.2. ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S3 E S4. ..................................55 4.1.3.ESPECIFICIDADE EM S5, S6 E S7 .......................................................58 4.1.4.ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S1 E S2PARA Lbpro e sLbpro..............................................................................................................................60 4.1.5.ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S3, S4 E S5 PARA Lbpro e sLbpro ....................................................................................................................62
4.2. EFEITO DO TAMANHO DOS SUBSTRATOS NA ATIVIDADE CATALTICA DA Lbpro e sLbpro ............................................................................64 4.3. RESULTADOS DA MODELAGEM MOLECULAR ...................................67 4.4. EFEITO DE DETERGENTES NA ATIVIDADE DA Lbpro e sLbpro.......74 4.5. INFLUNCIA DE SAIS NA ATIVIDADE DAS ENZIMAS Lbpro e sLbpro......................................................................................................................75 4.6. EFEITO DO PH NA ATIVIDADE DAS ENZIMAS .....................................78 4.7. ATIVIDADE ENZIMTICA EM FUNO DA CONCENTRAO DE ENZIMAS ................................................................................................................82 4.8. RESULTADOS DAS INIBIES DOS COMPOSTOS DE TELRIO COM A Lbpro............................................................................................................83
4. CONCLUSO .............................................................................................................87
5.REFERNCIAS ..........................................................................................88 6. ANEXOS..........................................................................................................96
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ABREVIATURAS
AMINOCIDOS
AMINOCIDOS
3 LETRAS
1 LETRA
ALANINA Ala A ASPARAGINA Asn N CIDO ASPRTICO Asp D ARGININA Arg R CISTENA Cys C FENILALANINA Phe F GLICINA Gly G GLUTAMINA Gln Q CIDO GLUTMICO Glu E HISTIDINA His H ISOLEUCINA Ile I LEUCINA Leu L LISINA Lys K METIONINA Met M PROLINA Pro P SERINA Ser S TIROSINA Tyr Y TREONINA Thr T TRIPTOFANO Trp W VALINA Val V
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OUTRAS ABREVIATURAS
AA Aminocido qualquer em Comprimento de onda de emisso
ex Comprimento de onda de excitao Abz cido orto-aminobenzico
ACN Acetonitrila Brij-35 ter lauril- polioxietilnico
CHAPS 3-[(3-colamidopropil) dimetilamnio CTAB Brometo de cetil-trimetil amnio DMSO Dimetilsulfxido
DTT ditiotreitol ERV Rinovrus equino
EDDnp N-(2,4-dinitrofenil)etilenodiamino EDTA cido etilenodiaminotetractico
E-64 N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4 guanidinobutilamida Fmoc 9-fluororenilmetoxicarbonil HPLC Cromatografia lquida de alta eficincia IPTG Isopropiltio-B-D-galactoside
IFN Interferon PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida
PEG Polietileno glicol 3700-4000 Pn e Sn Nomenclatura para substios de Schecter e Berger
MCA 7-Metil cumarina RPM Rotaes por minuto TFA cido trifluoroactico Tris Tri(hidroximetil)aminometano
TRITON ter(1,1,3,3 tetrametil)fenil-(7,8)-polioxitilnico TWEEN Monolaurato de sorbitan etoxilado
UAF Unidade arbitrria de fluorescncia UV Ultra-violeta
UTR Regio no traduzida
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RESUMO
O vrus da febre aftosa (FMDV), um patgeno que afeta animais no mundo todo, possui um RNA genmico de fita simples que, aps infectar a clula,
imediatamente traduzido numa nica poliprotena. Esta poliprotena produzida
processada durante a sntese em vrias protenas maduras atravs de peptidases
codificadas pelo prprio vrus. A primeira clivagem da poliprotena viral realizada
pela Lbpro entre sua prpria regio C-terminal e a regio N-terminal da protena VP4.
Lbpro tambm cliva especificamente dois homlogos dos fatores eucariticos de
iniciao (eIF) 4G, resultando na supresso da translao proteica do hospedeiro realizadas atravs dos mRNAs cap-dependentes. Consequentemente, o RNA do
FMDV, que inicia a traduo via IRES, e no requer o eIF4G intacto, pode usar
livremente a maquinaria de sntese protica do hospedeiro para traduo viral. Ns
usamos uma srie de peptdeos fluorognicos desenhados especificamente para
examinar a especificidade por substratos, efeitos do pH e fora inica sobre a
atividade cataltica da Lbpro e sua mutante sLbpro. Comparadas com outras cistenos
peptidases, como a papana e catepsinas, Lbpro e sLbpro possuem muitas
caracterticas nicas como alta sensibilidade sais e um stio de ligao ao
substrato muito especfico, extendendo-se at a posio P7. Anlises de dados
estruturais mostraram que Lbpro liga os resduos P1-P3 do substrato em uma
conformao extendida, enquanto os resduos P4-P7 so ligados numa curta hlice
310. A especificidade da Lbpro, revelada atravs dos peptdios substitudos pode ser
explicada para todas as posies, exceto para P5.
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ABSTRACT
Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a global animal pathogen, possesses a single-stranded RNA genome that, on release into the infected cell, is immediately
translated into a single polyprotein. This polyprotein product is cleaved during
synthesis by proteinases contained within it into the mature viral proteins. The first
cleavage is performed by the leader protease (Lbpro) between its own C-terminus and the N-terminus of VP4. Lbpro also specifically cleaves the two homologues of the
cellular eukaryotic initiation factor (eIF) 4G, resulting in shut-off of host cap-dependent mRNA translation. Consequently, FMDV RNA, which initiates translation
via IRES, and does not require intact eIF4G, can freely use the host protein synthesis
machinery for viral protein synthesis. We used a panel of specifically designed
fluorogenic peptides to examine the substrate specificity, effects of pH and ionic
strength on Lbpro activity and of its shorter mutant sLbpro. Compared with other
cysteine peptidases, how papain and the cathepsins, Lbpro and sLbpro possesses
several unusual characteristics, including a high sensitivity to salt and a very specific
substrate binding site extending up to P7. Indeed, almost all substitutions investigated
were detrimental to Lbpro and sLbpro activity. Analysis of structural data showed that
Lbpro binds residues P1 to P3 in an extended conformation whereas residues P4 to P7
are bound in a short 310 helix. The specificity of Lbpro as revealed by the substituted
peptides could be explained for all positions except P5.
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INTRODUO
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1.INTRODUO
1.1.ENZIMAS
Enzimas so molculas biolgicas capazes de aumentar em vrias
ordens de grandeza a velocidade das reaes que catalisam. A histria das enzimas
comea com a prpria histria da bioqumica. Podemos considerar que as primeiras
observaes relacionadas atividade das enzimas datam do final do sculo XVIII,
quando vrios estudos demonstraram que secrees estomacais podiam digerir a
carne e a saliva podia converter amido em acar.
1.1.2. CLASSIFICAO DAS ENZIMAS
Segundo a classificao sugerida pela International Union of Biochemistry
and Molecular Biology (IUBMB) encontrada na pgina http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/, as enzimas so divididas em seis
Classes (TABELA 1) , de acordo com o tipo de reao que catalisam. Cada enzima descrita recebe um nmero de classificao, conhecido por E.C. (Enzyme Commission of the IUBMB), composto por 4 dgitos :
Dgito 1= Classe
Dgito 2= Sub-classe dentro da classe
Dgito 3= Sub-subclasse
Dgito 4= a enzima, propriamente dita
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INTRODUO
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Por exemplo, para a papana, uma enzima extrada do ltex da fruta
tropical papaia (Carica papaya), o nmero de classificao E.C. 3.4.22.2, onde: 3 Classe = Hidrolase (catalisa reaes de hidrlise de ligaes covalentes) 4 Sub-Classe = Peptidase (hidrolisa ligaes peptdicas) 22 Cisteno-endopeptidases
2papana
TABELA 1. Classificao das enzimas e as reaes que catalisam
CLASSE TIPO DE REAO EXEMPLO
1. XIDO-REDUTASES xido-reduo:
AH2 + B A + BH2
LCOOL DESIDROGENASE
2. TRANSFERASES Tranferncia de grupos:
A-X +B A + B-X
GLICOQUINASE
3. HIDROLASE
Hidrlise:
A-B + H2O A-H + B-OH
SACARASE
4. LIASES
Adio de grupos a duplas ligaes ou remoo de grupos, deixando a dupla ligao:
AB + X-Y X-A-B-Y
FUMARASE
5. ISOMERASES
Rearranjos intramoleculares:
X-A-B-Y Y-A-B-X
FOSFOGLICO ISOMERASE
6. LIGASES
Condensao de duas molculas associada ao consumo de ATP:
A + B A-B
PIRUVATO CARBOXILASE
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INTRODUO
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1.1.3 ENZIMAS E ENERGIA DE ATIVAO
Todas as reaes qumicas tm uma barreira energtica em potencial
(energia de ativao), que deve ser superada antes que os reagentes possam ser convertidos em produtos. Em mdia, enzimas podem aumentar as velocidades de
reao por fator de 1010-1015 vezes em relao a uma reao no catalisada. As
enzimas aceleram a velocidade de uma reao por diminuir a energia livre de
ativao da mesma, sem alterar o G(Energia livre de Gibbs) e a Keq (constante de equilbrio), ou seja: a energia dos reagentes e produtos da reao enzimtica e de sua equivalente no enzimtica so idnticas. No pice da barreira energtica, est
o complexo ativado conhecido como estado de transio, que representa os
reagentes em seu estado ativado (FIGURA 1). A teoria do estado de transio surgiu em 1930, quando Linus Pauling
props que esta espcie qumica (complexo ativado) seria ligada preferencialmente pelo stio ativo da enzima que ao substrato (Schramm, 1998).
FIGURA 1. Diagramas de energia para reaes catalisadas versus no catalisadas.
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INTRODUO
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O estado de transio formado possui melhores contatos com a enzima
que o substrato, ou seja, a ligao da enzima com o substrato otimizada e o maior nmero possvel de interaes ocorre. A passagem por esse estado de
transio com a formao do complexo ativado leva a uma perda dos graus de
liberdade, que existem quando consideramos enzima e substratos livres
(contribuio entrpica), e isso seria fator fundamental para o aumento da velocidade das reaes, causado pelas enzimas (Menger, 2005).
1.1.4. CINTICA ENZIMTICA
A equao de velocidade para uma reao enzimtica pode ser deduzida por
dois caminhos. O mtodo mais simples considera condies de equilbrio rpido.
Leonor Michaelis e Maudi Menten propuseram em 1913 um modelo simples, que
explica a maioria das caractersticas das reaes catalisadas por enzimas. Nesse
modelo, a enzima combina-se de maneira rpida e reversvel com o substrato,
formando um complexo enzima substrato ES. A seguir, em um passo mais lento, o
complexo transforma-se em produto, regenerando a enzima livre. O modelo,
envolvendo uma molcula de substrato, representado a seguir:
k1
k-1
E + S ES E + Pk2
Onde S o substrato
E a enzima
ES o complexo enzima-substrato
P o produto
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INTRODUO
5
k1, k-1 e k2 so as constantes de velocidade de cada etapa.
A velocidade instantnea de formao do produto em qualquer tempo
depende da concentrao de ES:
V= k2[ES] (equao 1) A enzima total ([Et]) est distribuda entre E e ES:
[Et]= [E] + [ES] (equao 2) Dividindo a equao 1 de velocidade por concentrao de enzima total , onde [E] +
[ES] usado no termo da direita, obtemos:
v_ = k2[ES] (equao 3) [Et] [E] + [ES]
No equilbrio, [ES] pode ser expresso em termos de [S], [E] e Ks , onde Ks a
contante de dissociao do complexo ES:
Ks= [E][S] = k-1 (equao 4) [ES] k1
Rearranjando e considerando [ES]= [S][E] , podemos substitur [ES] na Ks equao 3 obtendo :
v_ = k2[E][S]/Ks (equao 5) [E]t [E] + [E][S]/Ks
Multiplicando o primeiro termo por k2 e cancelando [E] na equao 5
v_ = [S]/Ks (equao 6) k2[E]t 1 +[S]/Ks
Se v= k2[ES], ento k2[E]total =Vmax, a velocidade mxima que ser observada quando
toda enzima estiver presente na forma de ES:
v_ = [S]/Ks (equao 7) Vmax 1 +[S]/Ks
Todas as equaes de velocidade para sistemas em equilbrio rpido
podem ser deduzidas pelo mtodo anterior (Segel, 1993). A equao de velocidade
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INTRODUO
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7 pode ser rearranjada, fornecendo uma equao mais familiar denominada Michaelis Menten:
v_ = __[S]_ ( equao 8) Vmax Ks +[S]
A equao de Michelis-Menten nos d a velocidade instantnea ou inicial
relativa a Vmax para uma dada concentrao de substrato. A equao s vlida se
a velocidade v medida num tempo pequeno o suficiente para que [S] permanea
constante.
Se a velocidade com a qual ES forma E + P rpida quando comparada
com a qual ES se dissocia em E+S, ento E, S e ES no esto em equilbrio. Se a
concentrao de substrato for bem maior que a concentrao de enzima, logo aps
a mistura de E e S, ser estabelecido um estado estacionrio no qual a [ES]
permanece praticamente constante num certo perodo de tempo (FIGURA 2). .
FIGURA 2. Estado estacionrio
Para a deduo da equao de velocidade nessa condio a
concentrao de ES obtida a partir de equaes do estado estacionrio ao invs
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INTRODUO
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de expresses de equilbrio (deduo de Briggs e Haldane). A seqncia da reao :
k1
k-1
E + S ES E + Pk2
Como sempre,
V= k2[ES] (equao 1) e v_ = k2[ES] (equao 3) [Et] [E] + [ES]
Se a concentrao de ES for constante, ento a velocidade com a qual ES se
forma igual velocidade com a qual ES se decompe e temos
K1[Et] [S] = k-1[ES] + k2[ES] (equao 9) Resolvendo a equao 9 para ES :
[ES]= k1[E][S] (equao 10) K
-1 + k2
O grupo de trs constantes de velocidade pode ser definido por uma nica
constante, Km, chamada constante de Michaelis:
Km= k-1 + k2 / k1 (equao 11) Manipulando a equao 10 teremos:
[ES]= [S][E] / Km (equao 12) Substituindo [ES] na equao de velocidade temos
v_ = __[S]__ (equao 13) Vmax Km +[S]
Como podemos observar, a forma da equao de velocidade identica
deduzida para condies de equilbrio rpido. Apenas as constantes de velocidade
v_ = [S]/Km ou Vmax 1 +[S]/Km
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INTRODUO
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que compem a constante final K, so diferentes. Se k2 muito pequeno
quando comparado com k-1, Km se reduz a Ks (Segel, 1993 ).
O valor numrico de Km igual concentrao de substrato que produz a
metade da velocidade mxima (FIGURA 3). Para cada sistema enzimtico, Km tem um valor caracterstico que independe de concentrao da enzima, mas depende de
pH, temperatura, fora inica, etc.
FIGURA 3. Efeito da concentrao do substrato na velocidade da reao enzimtica
Se uma enzima reage em duas etapas segundo o mecanismo de
Michaellis Menten a constante de velocidade k2 usualmente idntica ( ou muito prximo) ao denominado kcat, que uma constante de primeira ordem com unidade de tempo (min-1 ou s-1). Esta constante na verdade uma constante de velocidade de primeira ordem da quebra do complexo ES para formar E e P e descreve a
velocidade da reao quando a enzima se aproxima da saturao e a velocidade
somente depende da concentrao ES.
k2 ES E + P
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INTRODUO
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Agora considerando uma enzima que reage segundo o esquema abaixo e
k1
k-1
E + S ESk2
ES'k3
E + P
onde a etapa limitante ES E +P, Vmax ser k3[Etotal] e kcat=k3 .
kcat equivalente a constante de velocidade do passo limitante da reao.
Para o clculo do kcat na prtica se determina a Vmax (velocidade mxima) que a velocidade de reao para uma concentrao infinita de substrato a uma dada
concentrao de enzima. Como concentraes infinitas no podem ser alcanadas
experimentalmente, 90-95% de saturao so usualmente possveis e se medidas
suficientes de velocidade so determinadas com concentraes de substrato, acima
e abaixo do valor de Km, Vmax pode ser calculado por extrapolao.
Vmax = K2.[E]t kcat = Vmax / [E]t [E]t = total de enzima
A comparao da eficincia cataltica de diferentes enzimas requer um
melhor parmetro que kcat ou Km separadamente. Um parmetro til para se ter
eficincia cataltica um parmetro que inclui kcat e Km. A relao kcat/Km definida
como uma constante de especificidade caracterizada pelo acoplamento enzima
substrato. As dimenses desta constante (M-1.s-1) so de uma reao de segunda ordem. Nos casos onde k2>>k-1 temos que a eficincia cataltica dada
praticamente apenas pela difuso do substrato para o centro ativo da enzima (k1). Como existe um limite para a velocidade com que E e S podem se difundir na
soluo aquosa, que de ~109 M-1.s-1, o valor de eficincia cataltica tambm ter
esse limite. Enzimas que apresentam valores elevados de eficincia cataltica se
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INTRODUO
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aproximando deste limite, tm um elevado valor para k2 e, portanto Ks diferente de
Km.
As interaes enzima-substrato so caracterizadas pela determinao
das constantes cinticas Km e kcat e da relao kcat/Km. O chamado bom substrato
caracterizado geralmente por um valor de Km baixo, um valor de kcat alto e
conseqentemente por uma relao kcat/Km de valor elevado, muitas vezes se
aproximando de 108 M-1s-1.
1.1.5. PEPTIDADES
Peptidase, protease ou proteinase referem-se classe de enzimas
hidrolases que catalisam a hidrlise de ligaes peptdicas e exibem diversas
funes nos mais variados sistemas biolgicos. O Comit de Nomenclatura da Unio
Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular (NC-IUBMB) recomenda o uso do termo peptidase.
As peptidases participam de uma grande variedade de processos
fisiolgicos que incluem a reciclagem de protenas, sinalizao celular, digesto de
alimentos, coagulao sangunea, cicatrizao, resposta imunolgica, diferenciao
e crescimento celular, fertilizao e apoptose (Twining,1994). Em humanos a atividade proteoltica descontrolada, desregulada ou indesejada est envolvida em diversos quadros patolgicos como enfisemas, derrames, infeces virais, cncer,
mal de Alzheimer, inflamao e artrite (Powers et al., 2002). Peptidases so essenciais a todos os patgenos que afetam o homem,
sendo diretamente relacionadas vrus, protozorios, bactrias e fungos
patognicos (Dunn, 1999; Monod et al., 2002).
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INTRODUO
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1.1.5.1. CLASSIFICAO DAS PEPTIDASES As peptidases so classificadas de acordo com (i) a reao catalisada, (ii)
a natureza qumica do stio cataltico e (iii) sua origem evolucionria com base na estrutura primria (Rawlings & Barrett, 1993).
i) As peptidases so divididas em endo e exopeptidases. As endopeptidases hidrolisam preferencialmente em ligaes internas da cadeia
polipeptdica enquanto que as exopeptidases atuam somente nas extremidades das
mesmas. As exopeptidases que atuam na poro N-terminal so denominadas
aminopeptidases quando liberam um nico aminocido, e aminodipeptidases e
aminotripeptidases quando liberam di ou tripeptdeos respectivamente. De forma
similar, as enzimas que atuam na extremidade C-terminal so denominadas
carboxipeptidases ou carboxidipeptidases. J as oligopeptidases, hidrolisam
polipeptdeos pequenos, no hidrolisando protenas.
ii) De acordo com seu mecanismo de ao e os resduos de aminocidos do stio ativo que esto envolvidos na catlise, as peptidases so classificadas em
aspartil-, cisteno-, glutamil-, metalo-, serino- e treonino-peptidases, e enzimas com
mecanismo de catlise desconhecido.
iii) As peptidases so ainda agrupadas em famlias e cls. Em uma famlia de peptidases agrupam-se as enzimas cuja sequncia primria de aminocidos de cada membro apresenta uma relao estatstica significativa com a sequncia de
pelo menos outro membro da famlia, geralmente na regio da molcula responsvel
pela atividade proteoltica.
Cl o termo utilizado para descrever um conjunto de famlias de enzimas nas quais os membros evoluram a partir de um ancestral comum, mas
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INTRODUO
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divergiram de tal maneira que sua relao comparada com a estrutura primria, no
pode ser mais comprovada (Rawlings &Barrett, 1993). A TABELA mostra de maneira resumida a classificao das principais
peptidases:
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INTRODUO
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Tabela 2. Principais peptidases classificadas de acordo com seu mecanismo de catlise.a
Peptidases Representativas Aminocidos presentes
no stio cataltico Serino-peptidases Cl PA(S) Tripsina
Quimotripsina His, Asp, Ser
Cl SB Subtilisina Asp, His, Ser Cl SC Carboxipeptidase C Ser, Asp, His
Cl SE Carboxipeptidase de Streptomyces
Ser, Lys
Cl SF Repressor Lexa Ser, Lys Cl SH Assemblina de Citomegalovrus His, Ser, His
Cisteno-peptidases Cl CA Papana Cys, His, Asn Cl PA(S) Endopeptidases virais
quimotripsina-smile His, Cys, Glu
Cl CD Caspase His, Cys Cl CE Endopeptidase de Adenovrus His, Glu, Cys
Aspartil-peptidases Cl AA Pepsina Asp, Asp Cl AB Endopeptidase de Nodavrus Asp, Asp
Metalo-peptidases
Cl MA Termolisina Enzima Conversora de Angiotensina I
Glu, Asp, His/ Zn2+
Cl MC Metalocarboxipeptidase His, Glu, His/ Zn2+ a = Adaptado do banco de dados MEROPS:
http://merops.sanger.ac.uk/indexes.clans.htm
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INTRODUO
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1.1.5.2 Especificidade
A habilidade de uma enzima para discriminar dois ou mais substratos que
competem entre si funo tanto das caractersticas qumicas dos substios da
peptidase quanto da natureza do substrato que com ela interage. A natureza das
interaes (eletrostticas, pontes de hidrognio, van der Waals etc.) dos resduos de aminocidos do substrato com aminocidos da enzima, envolvidos no mecanismo
de catlise, determinam a especificidade de uma peptidase, frente diferentes
seqncias peptdicas.
Na descrio da especificidade das peptidases utilizado o modelo
proposto por Schechter e Berger (1967) para a papana, no qual o stio cataltico est flanqueado em um ou nos dois lados por substios de especificidade. Cada
substio capaz de acomodar a cadeia lateral de um nico aminocido e
numerado a partir do stio de catlise em direo ao lado N-terminal de S1, S2,..., Sn
e para o lado C-terminal de S1, S2,..., Sn. Os resduos de aminocidos dos
substratos que estes substios acomodam so denominados P1, P2,..., Pn e P1, P2,
..., Pn respectivamente, como mostrado no esquema da FIGURA 4.
FIGURA 4 - Modelo de interao enzima-substrato proposto para a papana por Schechter & Berger, 1967.
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INTRODUO
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As interaes entre os substios de uma peptidase e os resduos de
aminocidos de um substrato peptdico podem contribuir de maneira significativa
para o entendimento da eficincia cataltica de uma determinada enzima. Para a
maioria das endopeptidases existe uma interao substio-resduo de aminocido
que essencial para a catlise eficiente.
Estudos com cisteno-peptidases vem demonstrando que, de forma geral,
o stio mais importante de especificidade dessa classe de enzimas definido pelo
substio S2, sendo que a grande maioria tem interaes favorveis com substratos
contendo resduos hidrofbicos na posio P2 (Turk et al., 1998). No que se refere s anlises de mapeamento de substios, segundo a
proposta de Schechter e Berger (1968), o stio cataltico da papana liga sete resduos de aminocidos do substrato apropriadamente nos substios. Os substios
seriam localizados em ambos os lados do stio ativo, sendo quatro do lado N-
terminal e trs substios do lado C-terminal.
1.1.5.3. Cisteno-peptidases
As enzimas cujo agente nucleoflico no mecanismo de catlise um grupo tiol da cadeia lateral da cistena, so conhecidas como cisteno-peptidases. A
papana foi a primeira enzima a ser classificada como cisteno-peptidase e sua
estrutura tridimensional foi determinada em 1968 por Drenth e colaboradores. A
papana , sem dvida, a cisteno-peptidase mais estudada quanto s propriedades
moleculares e catalticas, sendo uma referncia muito utilizada para o estudo de
especificidade dessa classe de enzimas.
As catepsinas que fazem parte da famlia da papana podem ser
encontradas em diversos tipos celulares. Foram identificadas 11 membros dessa
-
INTRODUO
16
famlia (catepsinas B, C, F, H , K, L, O, S, V, X e W). Sintetizadas a partir de pr-pro-catepsinas, so ativadas sob pH cido dos lisossomos e representam a maioria das
proteases presentes nesta organela. So distribudas de maneira desigual entre os
diversos tecidos humanos (Turk et al., 2000). As cisteno-peptidases possuem mecanismo cataltico similar ao
encontrado nas serino-peptidases, pois em ambas um intermedirio covalente tio-
ster formado. Porm, nas serino-peptidases, a formao do estado de transio
e do intermedirio tetradrico acompanhada por separao de cargas, onde o
prton da hidroxila transferido para o imidazol da His57 por um mecanismo de
catlise bsica geral (FIGURA 5). No caso das cisteno-peptidases o par inico tiolato-imidazol j est presente na enzima livre (FIGURA 6a) e a formao do estado de transio e do intermedirio tetradrico causa apenas uma reorientao
das cargas (Fersht, 1998).
FIGURA 5 Imidazol da His57 atuando como base geral cataltica.
O mecanismo cataltico das cisteno- peptidases usando a papana como
modelo est esquematizado na FIGURA 6:
-
INTRODUO
17
FIGURA 6. Mecanismo cataltico da papana. a) Formao do par inico Cys-S- (25) / His-ImH+ (159). b) Complexo de Michelis. c) Primeiro intermedirio tetradrico. d) acilao da enzima. e) ataque nucleoflico da gua. f) Formao do segundo intermedirio tetradrico. g) regenerao da enzima livre. Adaptado de Otto e Schirmeister (1997).
Aps a ligao do substrato peptdico enzima, o resduo da C25 fica
numa posio ideal para atacar o grupo acila da ligao petdica (6b), ao mesmo tempo que se rompe a ligao da carbonila.
Um intermedirio tetradrico ento formado (6c) e sua estabilizao ocorre atravs de pontes de hidrognios formadas entre o oxignio da carbonila da
ligao peptiddica a ser clivada e as ligaes N-H (nitrognio-hidrognio) da cadeia
-
INTRODUO
18
principal da C25 e da cadeia lateral da N19. O on imidazlico (ImH+) suficientemente cido (pKa=4) para protonar o nitrognio da ligao peptdica. Com o rompimento da ligao peptdica forma-se a estrutura acil-enzima. O grupo amino
da nova poro N-terminal da cadeia peptdica clivada liberada pela enzima (6d). Depois disso, ocorre um ataque nucleoflico de uma molcula de gua na
enzima acilada (6e) e posteriormente protonao da H159. As etapas 6f e 6g do mecanismo constituem a formao de um segundo intermedirio tetradrico e a
formao do segundo produto (RCOOH) respectivamente. As cisteno-peptidases so inibidas por agentes alquilantes do grupo tiol
(iodoacetato, clorometilcetonas), complexantes do grupo tiol (compostos mercuariais inorgnicos e orgnicos e ons de metais pesados) e inibidores peptdicos e proteicos ( Otto & Schirmeister., 1997).
O E-64, um inibidor natural de cisteno-peptidases descoberto nos anos
70 (Hanada et al., 1978) utiliza um grupo epoxisuccinil para interagir covalentemente com o enxofre reativo do stio ativo das cistenos (FIGURA 7).
-
INTRODUO
19
FIGURA 7. Alquilao da cisteno protease pelo E- 64
A primeira estrutura tridimensional obtida com a papana e o inibidor
clorometilcetona revelou que os resduos P68, V133, V157, F207 compem o substio S2
,
confirmando seu carter hidrofbico (Drenth et al., 1976).
1.2. SUBSTRATOS PEPTDICOS FLUOROGNICOS
Os substratos peptdicos sintticos permitem detectar facilmente a
atividade enzimtica, determinar as constantes cinticas caractersticas da interao
enzima-substrato e ainda comparar, de maneira eficiente e direta, a especificidade
primria entre enzimas de uma mesma famlia.
A vantagem em se utilizar substratos sintticos em relao a substratos
peptdicos naturais, alm de maior sensibilidade e facilidade de ensaio, se baseia no
fato de que podemos variar os aminocidos de maneira especfica, substituindo
sistematicamente cada aminocido e estudando o efeito dessa substituio na
catlise enzimtica.
-
INTRODUO
20
Substratos peptdicos contendo uma seqncia de aminocidos entre um
grupo fluorescente e outro supressor da fluorescncia, constituem compostos muito
convenientes para o estudo das peptidases, pois, com a fragmentao da molcula,
desaparece a supresso e h um aumento na fluorescncia, que pode ento ser
mensurada (FIGURA 8).
FIGURA 8 - Representao do mecanismo de supresso intramolecular da fluorescncia do Abz devido transferncia de energia.
Essas observaes permitiram um avano bastante significativo no
desenvolvimento de substratos artificiais para peptidases. Nos mtodos
cromognicos, a ligao amida entre o peptdeo e os grupos cromognicos constitui
o nico stio de clivagem detectvel do substrato pelas peptidases. A grande maioria
dos cromforos utilizados apresenta propriedades diferentes das dos resduos de
aminocidos. A necessidade de se colocar esses grupos diretamente nos pontos de
CONH2
AA AA AA NO2O2N
NH(CH2)2NH
CONH2
AA AA AA NO2O2N
NH(CH2)2NH
hidrlise
transferncia de energia320 nm 420 nmbaixa fluorescncia
alta fluorescncia320 nm 420 nm
-
INTRODUO
21
clivagem cataltica, alm da ligao qumica diferir das ligaes peptdicas normais,
constitui a grande desvantagem destes substratos.
Sob o ponto de vista da interao enzima-substrato evidente que, para
esses substratos sintticos, a interao fica limitada ao lado carboxlico da ligao
susceptvel, isto , P1, P2, P3, etc. Porm tratando-se de um substrato fluorognico
com supresso intramolecular (Chagas et al., 1991), o grupo supressor e o grupo fluorescente esto situados em regies opostas do peptdeo, relativamente ao stio
de hidrlise, isto permite aumentar a especificidade dos substratos pela enzima,
podendo incluir os resduos P1, P2, etc. Desta forma evita-se a maior parte dos
inconvenientes citados anteriormente para os substratos com o grupo cromforo ou
fluorforo colocado diretamente no stio de hidrlise (Juliano et al., 1991; Oliveira et al., 1992; Prado et al., 1986; Juliano & Juliano, 1985).
-
INTRODUO
22
1.3. FEBRE AFTOSA
A febre aftosa, tambm conhecida como foot-and-mouth disease (FMD) uma doena viral altamente contagiosa que infecta principalmente animais
ungulados, incluindo bovinos, caprinos, ovinos e sunos, mas pode ocorrer tambm
em seres humanos (Grubman & Bast, 2004) . A doena foi descrita pela primeira vez na Itlia em 1514 e o agente
responsvel foi identificado em 1897 por Loeffler e Frosh (Bacharach,1968). A febre aftosa representa uma importante ameaa sobre a economia
nacional de diversos pases, onde o comrcio com o exterior e estabilidade,
dependem diretamente da confiabilidade dos alimentos de origem animal, que
devem ser oriundos de animais isentos desta enfermidade (Grubman & Baxt, 2004) .
1.3.1. DISTRIBUIO GEOGRFICA
Sete sorotipos do vrus da febre aftosa identificados at agora esto
distribudos em diferentes regies geogrficas como mostra a FIGURA 9. No Brasil
j foram identificados os tipos O, A e C. Atualmente so considerados como zona livre da FMD somente o continente Australiano e Amrica do Norte (Grubman & Baxt, 2004). Na Amrica do Norte a ltima ocorrncia de FMD foi no Mxico em 1946-1954 e no Canad em 1952. Nos EUA o ltimo surto ocorreu em 1929 (House & House, 1999, Sutmoller et al., 2003). Na frica so reportados seis sorotipos: A, O, C, SAT1, SAT2 e SAT3 (Southern African Territories). Na sia e no Oriente Mdio esto os sorotipos A, O, C e sia 1.
-
INTRODUO
23
FIGURA 9. Distribuio da FMD entre 1990 e 2002. Disponvel em www.iah.bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/aphthovirus.
1.3.2. PATOGENIA
A principal forma de transmisso do vrus da febre aftosa a aerossol,
embora a infeco tambm possa ocorrer via abrases na pele ou nas membranas
mucosas. O vrus pode ser excretado via smen, urina e fezes (Donaldson,1987). A replicao do vrus ocorre tambm no epitlio da glndula mamria,
podendo o vrus ser encontrado no leite de bovinos at 10 dias aps a infeco
(Blackwell et al., 1983). Depois de atingir tecidos como epitlio, mucosa e miocrdio, o vrus
replica-se e a viremia pode persistir por 3-5 dias. (House & House, 1999). Os sunos tambm podem se contaminar ingerindo comida infectada pelo vrus, por contato
direto com animais infectados ou por serem colocados em um local onde foi
-
INTRODUO
24
previamente habitado por animais infectados. Porm, os sunos so menos
susceptveis infeco por aerossol do que os bovinos; todavia excretam muito
mais aerossis que os bovinos e ovinos (Alexandersen & Donaldson, 2002).
1.3.3. SINAIS CLNICOS
Os sinais clnicos iniciam com a diminuio na ingesto de alimentos,
febre e salivao intensa, principalmente devido a dificuldades na deglutio. Muitas
vezes, os animais abrem e fecham a boca com estalar dos lbios e apresentam
diminuio na produo de leite. Tambm aparecem vesculas e leses na lngua,
boca e patas (Bachrach, 1968).
1.3.4.VACINAS
No existe tratamento contra a Febre Aftosa e sim medidas profilticas
especficas pelo uso de vacinas. Atualmente, as vacinas convencionais preparadas
com o vrus inteiro inativado tem sido utilizadas. Como o vrus possui uma grande
variabilidade antignica (Kitching et al., 1989), a imunidade para um sorotipo no confere proteo para outros, o que representa uma dificuldade para os programas
de vacinao (Doel, 2003). Como a vacina inativada no protege de imediato o animal, o mesmo fica suscetvel antes de uma resposta imunolgica eficaz.
Diversas pesquisas vem sendo conduzidas na tentativa de se obter outros
tipos de vacinas para febre aftosa. Essas vacinas alternativas utilizam o vrus
atenuado, o capsdeo viral vazio, protenas e peptdeos derivados do capsdeo.
(Grubamn & Baxt, 2004).
-
INTRODUO
25
1.3.5. AGENTE ETIOLGICO
O agente etiolgico da febre aftosa um vrus do gnero aftovrus,
membro da famlia Picornaviridae, o FMDV (foot-and-mouth disease virus). Picornaviridae uma das maiores famlias de vrus e inclui alguns dos mais
importantes vrus, capazes de infectar humanos e animais, causando doenas como
a poliomelite, meningite, hepatite A, resfriado comum, febre aftosa, entre outros.
Como o nome indica, estes vrus so pequenos (pico) vrus de RNA (cido ribonucleico) que possuem uma estrutura de capsdeo no envelopado. A famlia tem mais de 230 membros, os quais, so divididos em cinco gneros: Enterovrus,
Rhinovirus, Heparnavirus, Cardiovirus e Aphthovirus.
O genoma do FMDV (FIGURA 10) formado por uma fita simples de RNA de polaridade positiva, com aproximadamente 8500 nucleotdeos. O FMDV
possui em seu RNA uma cauda de poli A na extremidade 3 e uma pequena
protena, a VPg, covalentemente ligada na extremidade 5. O RNA viral contm uma
nica ORF (open reading frame), sendo traduzido como uma nica poliprotena, a qual processada em vrias protenas maduras (estruturais e no estruturais), atravs de proteases codificadas pelo prprio vrus (Leader ou Lbpro, 2A e 3C) durante a traduo e aps a mesma (Mason et al.,2003).
-
INTRODUO
26
Os vrus da famlia Picornaviridae, iniciam o processo de traduo do seu
genoma pela presena de uma sequncia de RNA estruturado na sua 5UTR,
denominado stio de entrada interno do ribossomo (IRES). A IRES recruta e direciona o ribossomo primeira trinca de bases codificadora da poliprotena viral.
A sntese da protena comea em dois cdons funcionais AUG, separados
por aproximadamente 80 nucleotdeos, e codificam uma poliprotena de
aproximadamente 2330 amino-cidos. A regio P1 codifica quatro protenas
estruturais do capsdeo: 1A, 1B, 1C e 1D, e as regies P2 e P3 codificam as
protenas no estruturais envolvidas na replicao do RNA e na maturao viral
respectivamente (Mason et al., 2003; Domingo et al., 2002).
[---------------------------][-----------------][---------------------------------] P1 P2 P3
FIGURA 10. Esquema do RNA do FMDV. O genoma divido em trs principais regies: a regio codificadora da poliprotena ORF subdividida em L/P1, P2 e P3 e as regies regulatrias 5UTR e 3UTR. Adaptado de Mason et al., 2004.
STIOS DE CLIVAGEM: desconhecido LPRO 3C 2A
-
INTRODUO
27
1.3.6. PEPTIDASE LEADER (Lbpro)
Na famlia Picornaviridae, a peptidase Lbpro (E.C. 3.4.22.46) encontrada apenas no gnero Aphthovirus como mostra a FIGURA 11 abaixo.
FIGURA 11. Representao do processamento primrio dos seis gneros da famlia Picornaviridae. Adaptado de Seipelt et al., 1999.
A primeira protena a ser traduzida do genoma viral do FMDV a Lbpro
(FIGURA 12A). No genoma de todos os sorotipos de FMDV existem dois cdons de iniciao AUG, separados por 84 nucleotdeos, traduzindo duas formas da peptidase
leader : Labpro e Lbpro. Essas duas formas da peptidase leader so encontradas in
vivo e possuem as mesmas propriedades enzimticas in vitro (Medina et al., 1993). A Lbpro liberada da poliprotena viral atravs de uma auto-clivagem entre
a sua prpria regio carboxi-terminal e a regio amino-terminal da protena VP4
entre os aminocidos K e G da seqncia KVQRKLKGAGQSS de maneira intra ou
intermolecular como mostra a FIGURA 12 B.
[----------- -][----------------------------] Precursores do Precursores no estruturais Capsdeo
-
INTRODUO
28
FIGURA 12. Atividade biolgica da Lbpro . A) RNA viral. B) Autoclivagem da Lbpro na poliprotena viral. C) Clivagem do eIF4G. Adaptado de Guarn et al., 1998.
Em eucariotos superiores, a traduo proteica se inicia a partir da montagem
do ribossomo junto ao RNA mensangeiro (mRNA), com a participao de fatores de iniciao da traduo (eIF). Dentre esses, se destacam aqueles que formam o complexo eIF4 (eIF4A, eIF4E e eIF4G), que permitem a associao da subunidade menor ribossomal ao mRNA e iniciam todo o processo (FIGURA 12). A grande maioria dos mRNAs eucariticos dependente de uma guanosina
modificada presente em sua extremidade 5, denominada Cap 5' (7-metil-guanosina) para realizar o processo de traduo proteica. Esse Cap 5 reconhecido pelo fator
de iniciao de eucaritico eIF4E, iniciando o processo em cadeia que recruta a
subunidade 40S do ribossomo.
-
INTRODUO
29
Aps o processo de auto-clivagem na poliprotena viral, a Lbpro cliva o fator
eucaritico de iniciao da traduo do hospedeiro, o eIF4G (FIGURA 12C). Essa clivagem resulta na supresso da traduo dos RNA mensageiros (mRNA) do hospedeiro e na traduo dos mRNAs virais independente da estrutura 7-metil-
guanosina (Cap 5) , ou seja, por meio do stio de entrada interna do ribossomo (Guarn et al., 1998).
A Lbpro cliva duas isoformas do eIF4G na clula hospedeira. A clivagem
do eIF4GI ocorre entre os resduos de aminocidos G e R da seqncia FANLGRTT
, e entre G e S da seqncia LLNVGSRRTT no eIF4GII ( Kuehnel et al., 2004). Um vrus mutante do sorotipo A12 da febre aftosa, denominado de
leaderless virus 2 (LLV2), no qual foi deletado do seu genoma a regio codificadora da peptidase leader Lbpro, causou menor efeito citoptico do que o vrus no
deletado. Porm, este vrus demonstrou crescimento similar ao vrus que continha a
Lbpro nas clulas do tipo BHK-21(Baby Hamster Kidney), sugerindo que a Lbpro no requerida para o crescimento viral (Piccone et al., 1995).
Posteriormente, quando o LLV2 foi inoculado em animais, foram
evidenciados sinais clnicos de febre aftosa mais brando e o vrus no foi transmitido
aos animais no inoculados que estavam em contato. Isso indicou que a virulncia
do FMDV est relacionada presena da Lbpro, ou seja, ela importante para causar a forma mais aguda da febre aftosa e permitir a transmisso entre os animais
que so suscetveis doena (Chinsangaram et al., 1998; Mason et al., 1997). A clivagem do eIF4G acarreta a dimuio da sntese dos interferons tipo I
pelas clulas do hospedeiro. A supresso da produo IFN permite a rpida
replicao e disseminao do FMDV nas clulas do hospedeiro. No entanto, o
mutante LLV2 replicou de maneira ineficiente em clulas capazes de sintetizar
-
INTRODUO
30
ambos IFN e . Clulas previamente tratadas com o IFN tornaram-se resistentes
ao FMDV (Chinsangaram et al., 1999 & 2001 ). Lbpro uma cisteno-peptidase da famlia da papana e apresenta um
grau de homologia maior que 15% quando sua estrutura primria comparada com
esta enzima (FIGURA 13). As duas peptidases tambm possuem grandes semelhanas na estrutura tridimensional apresentando dois domnios, sendo que um
deles predominantemente formado por -hlices e o outro por folhas (FIGURA 14).
As peptidases da famlia da papana so caracterizadas pela trade
cataltica Cys/His/Asn. A Lbpro possui um cido asprtico no lugar da asparagina no
stio ativo.
-
INTRODUO
31
FIGURA 13. Estrutura primria da papana, ERV-1, e Lbpro (sorotipos FMDV-01K, FMDV-A10, FMDV-SAT2 e FMDV-C1). Adaptado de Guarn et al., 1998.
-
INTRODUO
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FIGURA 14. A) Lpro B) Papana. Adaptado de Seipelt et al., 1999
A estrutura da Lbpro apresenta uma regio compacta globular com uma
dimenso de aproximadamente 30 de dimetro, formada por 172 resduos de aminocidos, possuindo uma regio C-terminal (CTE), constituda pelos resduos D184 ao K201.
Os resduos catalticos C51 e H148 se encontram no topo da fenda que
separa os dois domnios, como observado em outros membros da famlia da
papana, ou seja, a localizao e o arranjo espacial dos resduos catalticos so bem conservados nessa famlia de enzimas como mostra a FIGURA 14.
A B
-
INTRODUO
33
FIGURA 15. A) Centro ativo da Lpro. B) Centro ativo da Papana. Adaptado de Guarn et al., 1998.
A papana possui um resduo de triptofano (W177) em seu stio ativo (FIGURA 15) e acredita-se que esse resduo estabilize as pontes de hidrognio formadas entre a H159 cataltica e o resduo de N175 no estado de transio formado
durante a catlise. Esse resduo de triptofano ausente na Lbpro, e os resduos
catalticos H148 e C51 so expostos ao solvente. Diferente dos outros membros da
famlia da papana, o stio ativo da Lbpro contm um grupo de resduos carregados
negativamente D163, D164, E165 e D166 (Guarn et al., 1998). A extenso C-terminal (CTE) flexvel de 18 aminocidos
(DQEPLNGEWKAKVQRKLK) est envolvida na auto-clivagem da Lbpro na poliprotena viral. Para isso, a CTE (FIGURA 13) se dobra dentro do stio ativo da enzima, e uma clivagem intramolecular ocorre (Cencic et al., 2007).
As principais interaes da CTE com o stio ativo da Lbpro, ocorrem
atravs dos seus resduos K201 e L200.
A poro aliftica da cadeia lateral da K201, que ocupa o substio S1,
posicionada entre as cadeias principais dos resduos H95 e E96 e a cadeia lateral da
A B
-
INTRODUO
34
E147, enquanto o grupo amino estabelece interaes eletrostticas com os
carboxilatos do E96 e E147. Nos outros membros da famlia da papaina o substio S1
um local amplo e irrestrito, exercendo pouca influncia na especificidade do
substrato. A cadeia lateral da K200 completamente enterrada no substio
hidrofbico S2, formado pelos resduos W52, G97, P100, L143, E147-A149 e L178 (FIGURA 16 A).
A arquitetura do substio S2 na Lbpro muito similar ao da papana. Alis,
todos os resduos so idnticos entre as duas enzimas, com exceo da L143, que
equivale V133 na papana.
Os resduos da CTE, K199(P3) e R198(P4), ocupam os substios S3 e S4, respectivamente. A poro aliftica da cadeia lateral da K199 realiza interaes de
van der Waals com os tomos da cadeia principal dos resduos G97 e G98. O grupo
amino desses dois resduos faz uma ponte de hidrognio com a carbonila da cadeia
principal do E93 e interage atravs de uma interao inica com os carboxilatos das
cadeias laterais do E93 e E96. A interao da R198 atravs de foras de van der
Waals com G98, P99, L143 e extensivamente com Q146. O grupo guanidino da R198,
tambm realiza pontes de hidrognio com o grupo amida da cadeia lateral da Q146
(Guarn et al., 1998). O substio S5 bem aberto e o resduo Q197(P5) tem sua cadeia lateral
exposta ao solvente, mas ainda interage com a cadeia principal da P99. Finalmente,
V196 enterrada numa cavidade hidrofbica (substio S6 formado pelos resduos P99, A101, V127 e L178).
O primeiro domnio da estrutura da Lbpro contem quatro -hlices (1, 2, 3 e 4) e duas folhas (1 e 2) formadas pelos resduos E30 ao T32 e K38 ao T40, respectivamente (FIGURA 16 B).
-
INTRODUO
35
A -hlices 1 e 3 so as mais longas (dos resduos N50- E64 e L78-G91, respectivamente), sendo que as duas -hlices se estendem de maneira perpendicular, com a C51sendo localizada rumo ao N-terminal da -hlice 1. A -
hlice mais curta 2 formada de apenas seis resduos de aminocidos (F68-S73) e se estende de maneira pararela -hlice 3.
O segundo domnio da Lbpro formado por uma mistura de folhas em
paralelo (3 com 4) e seis folhas estendidas de maneira antiparalela (4-9). A H148 cataltica localizada na volta que conecta as folhas 5 e 6 (formadas pelos resduos F137-L143 e A149-T155, respectivamente).
As regies mais conservadas entre a papana e a Lbpro esto localizadas
ao redor do stio ativo, especialmente entre as sequncias das -hlice 1 e folhas
5 e 6, que contm os resduos do stio cataltico C51e H148.
A cristalografia de raio X mostrou que a CTE de uma molcula da enzima
est no centro ativo de uma molcula adjacente e vice-versa formando um dmero. Esses dados cristalogrficos sustentam tambm a hiptese de que uma clivagem
intermolecular possvel de ocorrer (Cencic et al., 2007). Em soluo tambm ocorre a formao do dmero, fato este confirmado
por gel filtrao e ressonncia magntica nuclear. Para uma melhor compreenso do
papel da CTE, uma enzima mutante para a Lbpro foi construda, denominada sLbpro,
onde a extenso C-terminal apresenta apenas 12 aminocidos (D184-K195). A CTE da mutante apresentou-se em soluo de maneira desordenada e flexvel na anlise
por ressonncia magntica nuclear, e no ocorreu formao de dmero (Cencic et al., 2007).
-
INTRODUO
36
FIGURA 16. A) Resduos de aminocidos dos substios S1-S6. B) Estrutura terciria da Lbpro. Adaptado de Guarn et al., 1998.
A
B
-
INTRODUO
37
A CTE juntamente com os resduos Cys133 , D184 e E186 da Lbpro (FIGURA 17), esto envolvidos no reconhecimento do eIF4GI . A interao da enzima com o fator eucaritico eIF4GI ocorre atravs dos resduos K643, K646 e E650. Essas
interaes foram demonstradas atravs de mutaes stio-dirigidas nos resduos
D183 e E186 da Lbpro e K643, K646 e E650 do eIF4GI. As substituies desses resduos
por alanina reduziram a interao do fator eucaritico eIF4GI com a enzima (Foeger et al., 2005).
FIGURA 17. C133 envolvida no reconhecimento do eIF4G. Adaptado de Foeger et al., 2005.
-
OBJETIVOS
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2. OBJETIVOS
O objetivo desse projeto caracterizar as peptidases Lbpro e sLbpro atravs da :
a) Realizao do estudo de especificidade comparativa para a Lbpro e sLbpro, empregando substratos fluorognicos derivados da seqncia de aminocidos da
auto-clivagem (Lb/VP4) e dos fatores eucariticos eIF4GI e eIF4GII . b) Avaliar o efeito do pH em diferentes tampes sobre a atividade enzimtica c) Avaliar o efeito de sais e detergentes sobre a catlise enzimtica. d) Desenvolvimento de inibidores contra a Lbpro.
-
MATERIAIS E MTODOS
39
3. MATERIAIS E MTODOS
3.1.Expresso da Lbpro e sLbpro
Os plasmdeos de expresso pet11d Lbpro e pet11d sLbpro , contendo as
seqncias de nucleotdeos 892-1411 e 892-1393 do FMDV, sorotipo Ok1, foram
gentilmente cedido pelo Dr.Tim Skern da Universidade de Viena. A metodologia de
expresso e purificao foi semelhante para ambas as enzimas. Uma alquota de
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS competente foi transfectada por choque trmico de acordo com pET System Manual (Novagen, 2002). As colnias selecionadas em placa de cultura contendo meio LB-gar foram inoculados 500 mL de meio LB
contendo ampicilina(100g/mL) e cloranfenicol(30g/mL)
sob agitao constante
at uma densidade ptica de 0,5 em 600 nm, quando se adicionou IPTG (0,4 mM)
para induo da expresso. A cultura foi incubada por 18 horas 28C e ento
submetida centrifugao a 5000 RPM por 30 minutos. O precipitado foi
ressuspenso em tampo A (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, contendo 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM 2-mercaptoetanol e 5 % glicerol) , sonicado (4 ciclos de 30 segundos) e
centrifugado a 12000 RPM por 20 minutos 4C. O sobrenadante contendo a
frao solvel da enzima, foi filtrado em membranas de 0,45m e submetido ao
processo de purificao.
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MATERIAIS E MTODOS
40
3.2. Purificaes da Lbpro e sLbpro
A frao solvel contendo a enzima foi submetida a uma cromatografia de
troca inica Resource-Q de 1 mL (Amersham Biosciences) acoplada a um sistema de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) previamente equilibrada com tampo A(50 mM de Tris-HCl, pH 8, contendo 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de DTT e 5 % de glicerol), sob fluxo de 0.5 mL/min.
Em seguida, foi estabelecido um gradiente salino com o tampo ''B''(50 mM de Tris-HCl, pH 8, contendo 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de DTT e
5 % de glicerol ) com variao de fora inica de 0 a 500 mM de NaCl, sob fluxo de 1 mL/min. As enzimas eluiram ao redor de 300 mM de NaCl.
A alquota contendo a enzima foi concentrada por ultrafiltrao em um
sistema Amicon PM 10 (10 KDa) 4C e ento aplicadas em uma coluna HR16/50
Superdex75 (50 x 1.6cm) e submetidas a um fluxo de 0,5 mL/min de tampo A. As fraes com atividade hidroltica sobre o substrato Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-
EDDnp em tampo Tris-HCl 50 mM pH 8,0 foram analisadas por eletroforese em gel
de poliacrilamida (SDS/PAGE) 12% , corado com Coomassie Brilhant Blue. As fraes contendo apenas a banda relativa a Lbpro e sLbpro foram reunidas e
concentradas conforme descrito anteriormente. As duas enzimas foram
posteriormente tituladas com o inibidor irreversvel E-64, para determinao de suas
respectivas concentraes molares pelo mtodo descrito por Barrett et al., 1982.
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MATERIAIS E MTODOS
41
3.3 Sntese de Peptdeos fluorognicos
Os substratos utilizados neste trabalho tm as extremidades amino e
carboxi-terminais bloqueadas por um grupo fluorescente, o cido orto-
aminobenzico (Abz) e um grupo supressor, o N-(2,4-dinitrofenil)-etilenodiamino (Eddnp), respectivamente.
Os substratos FRET foram sintetizados em fase slida utilizando a
metodologia Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil), conforme descrita por Hirata e colaboradores (1994), recentemente revisada por Korkmaz e colaboradores (2008).
Os peptdeos sintticos foram caracterizados em cromatografia lquida
analtica de alta eficincia, em uma coluna de fase reversa Econosil C18 (5m, 4,6 X
150 mm), acoplada a bombas Shimadzu modelo LC-8A, dotadas de um detector de UV-Vis Shimadzu e um detector de fluorescncia em comprimentos de ondas de 220
nm e 320 nm para a excitao e 420 nm para a emisso, respectivamente. O
sistema utilizou dois sistemas de solventes, sendo: 1 - (A) TFA/H2O (1:1000) e (B) TFA/ACN/ H2O(1:900:100) e 2 - (A) H3PO4/H2O(1:1000) e (B) H3PO4/H2O/ACN(1:100:900).
Os peptdeos foram purificados por cromatografia lquida semi-preparativa
de alta presso, em uma coluna de fase reversa Econosil C18 (5 m, 22,5 X 250
mm), acoplada a bombas Shimadzu modelo LC-8A, dotadas de detector de UV-Vis Shimadzu e um detector de fluorescncia, programados para leituras em
comprimentos de onda de 220 nm, excitao de 320 nm e emisso de 420 nm,
respectivamente. Sendo utilizados dois sistemas de solventes: (A) TFA/H2O (1:1000) e (B) TFA/ACN/ H2O(1:900:100).
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MATERIAIS E MTODOS
42
Os peptdeos sintetizados foram analisados por espectrometria de massa
atravs do mtodo da medio do tempo do vo do on em um espectrmetro de
massa modelo Microflex LT, da empresa Bruker Daltonics, dotado de tecnologia
MALDI-TOF (Matrix Laser Desorption Ionization Time-of-Flight). Em todas as
anlises, a matriz empregada foi o cido -ciano-4-hidroxicianamnico. Os
fragmentos de hidrlise foram determinados atravs de cromatografia lquida de alta
eficincia associada a um espectrmetro de massas do tipo eletron spray,
utilizando um LC/MS-2010 da empresa ShimadzuSI. A cromatografia foi realizada
monitorando-se a amostra atravs de detectores de UV (220 e 365 nm) Shimadzu UV-vis SPD-20AV e fluorescncia (320 420nm) (Shimadzu RF), acoplado em uma coluna C18 Ultrasphere (5 M, 4.6 mm X 250 mm), utilizando-se dois sistemas de solventes: (A) TFA/H2O (1:1000) e (B) TFA/ACN/ H2O(1:900:100).
3.4 Determinao da concentrao dos substratos peptdicos
fluorognicos
A concentrao de cada um dos substratos peptdicos
FRET foi determinada quantificando o EDDnp por espectrofotometria, em
comprimento de onda de 365 nm utilizando um espectrofotmetro modelo U-3210
(Hitachi, Japo). Foram utilizadas cubetas de caminho ptido de 10 mm, para um volume final de soluo de 1,0 mL.
Os valores de absorbncia obtidos foram analisados por regresso linear
pelo programa GRAFIT verso 5.0, obtendo-se uma reta (absorbncia por volume de substrato) cujo coeficiente angular foi utilizado para a determinao da
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MATERIAIS E MTODOS
43
concentrao do substrato em micromolar (M) atravs da equao [substrato] =
coeficiente angular/ , sendo = 17300 M-1, coeficiente de extino do grupo EDDnp.
3.5. Padronizao do Fluormetro para o Grupo Abz (cido ortho-aminobenzico).
Para a padronizao do fluormetro modelo F-2500 (Hitachi, Japo), foi realizada inicialmente a hidrlise total por Lbpro (20 nM) de quatro concentraes (0,25 a 1,0M) do substrato Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp. Foi efetuada a medio da fluorescncia desses hidrolisados usando em = 420nm e ex = 320nm.
Os valores obtidos foram analisados por regresso linear pelo programa GRAFIT,
obtendo-se uma reta (fluorescncia x concentrao) cujo coeficiente angular corresponde a constante do aparelho em UAF/M.
3.6. Padronizao do Fluormetro para Z-FR-MCA.
Diferentes concentraes do substrato Z-RKLK-MCA (0,2 a 3M), foram submetidas a hidrlise total por Lbpro (~50 nM) e efetuada a leitura da fluorescncia (UAF) nos ex = 360nm e em = 480nm. Os valores obtidos foram analisados por regresso linear pelo programa GRAFIT 5.0 (Leatherbarrow, 1992) obtendo-se uma reta em UAF/M.
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MATERIAIS E MTODOS
44
3.7.Cinticas enzimticas
Para a realizao das cinticas, as enzimas foram previamente ativadas
com 1m M de DTT e incubadas 37C por 5 minutos.
A hidrlise dos substratos fluorognicos foi monitorada utilizando-se um
espectrofluormetro Hitachi F-2500, com fendas de excitao e emisso 5nm e 5nm,
respectivamente, e comprimentos de onda ajustados para ex 320 nm e em 420 nm
para substratos FRET e ex 380 nm e em 460 nm para MCA. Foram utilizadas
cubetas de caminho ptido de 10 mm, para um volume final de soluo de 1,0 mL.
As constantes cinticas kcat, Km e kcat/Km para a Lbpro e sLbpro foram
determinadas a partir das velocidades iniciais de hidrlise (
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MATERIAIS E MTODOS
45
As cinticas com a Lbpro e sLbpro foram realizadas em tampo cido Brico/Brax 50 mM, pH 7.8 contendo 1mM de EDTA e DTT . As cinticas com
papana e catepsinas recombinantes em tampo acetato de sdio 100 mM , 5 mM
de DTT, 2 Mm de EDTA, pH 5.5 37o C. Para catepsina S foi utilizado tampo
fosfato de sdio 50 mM e pH 7.0. A papana utilizada foi adquirida da Sigma e as
catepsinas B, L, K, V e S foram expressas em nosso laboratrio conforme descrito
em Rowan et al., (1992), Carmona et al., (1996), Linnevers et al., (1997) e Bromme & McGrath (1996).
3.8.Efeito de sais na atividade cataltica da Lbpro
O efeito de diferentes concentraes de NaCl e KCl na atividade
cataltica da Lbpro foi avaliado utilizando-se 5 M do substrato Abz-
KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp em tampo cido Brico/Brax 50 mM, pH 7.8 , contendo 1mM de EDTA, 1 mM de DTT, temperatura de 37C, e incubao prvia
da enzima por 5 minutos.
Os parmetros cinticos kcat, Km e kcat/Km foram determinados na
presena e ausncia do NaCl utilizando peptdeos derivados do eIFG4I, eIFG4II e da
juno Lb/VP4.
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MATERIAIS E MTODOS
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3.9. Determinao dos pKas e do pH timo da Lbpro
O estudo da variao de atividade da Lbpro em diferentes valores de pH foi
realizado utilizando-se os tampes cido Brico/Brax 50 mM, Tris 50mM contendo EDTA 1 mM , DTT 1 mM e o outro uma mistura contendo de 25 mM glicina, 25 mM
de cido actico, MES 25 mM , Tris 75 mM , EDTA 1 mM e DTT 1 mM. Todas as
reaes foram realizadas a 37C com incubao prvia da enzima por 2 minutos.
Condies de pseudo-primeira ordem foram empregadas para a
determinao dos valores de kcat/Km no caso do tampo contendo a mistura de 25
mM glicina, 25 mM de cido actico, 25 mM MES , 75 mM Tris , EDTA 1 mM , DTT
1 mM. Os resultados foram analisados por regresses no lineares utilizando o
software GRAFIT 5.0 atravs da equao 14:
kcat/Km = kcat/Km (limit)[1/(1 + 10pK1 - pH + 10pH - pK2)] Equao 14
onde K1 e K2 so as constantes de dissociao dos resduos catalticos cido e
bsico respectivamente.
Velocidade inicial de hidrlise do substrato Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-
EDDnp na concentrao de 5 M
foram utilizadas nas medidas realizadas nos
tampes cido Brico/Brax 50 Mm e Tris 50mM.
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MATERIAIS E MTODOS
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3.10. Efeitos de detergentes na atividade enzimtica
Curvas de velocidade inicial da enzima na presena de diferentes
concentraes de detergentes, foram realizadas com a Lbpro na presena de 5 M do
substrato Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-Eddnp . Os detergentes utilizados foram: SDS,
CHAPS, BRIJ-35, TWEEN-20, TRITON e CTAB. Todos os experimentos foram
realizados tendo como soluo tampo cido brico/Brax 50 mM , pH 7.8, contendo EDTA 1,0 mM e DTT 1 mM 37C.
3.11. Determinao dos valores de Ki dos peptdeos resistentes
hidrlise pela Lbpro
Os peptdeos FRET resistentes hidrlise pela Lbpro identificados durante
o estudo de especificidade foram ensaiados como inibidores competitivos sobre a
hidrlise de Z-LR-MCA (Km=13M e kCAT =0.002 s-1) numa concentrao fixa de 40 M. Os valores de Ki para os ensaios de inibio competititiva dos substratos foram
determinados de acordo com ( Nicklin & Barrett , 1984 ). As equaes utilizadas para os clculos de Ki foram :
Ki = Kiapp / (1+ [S]/Km) (Equao 15) Onde: [S] = concentrao molar do substrato
Kiapp= constante de inibio aparente
Ki= constante de inibio
Km= constante de Michaellis
Para o clculo do Kiapp :
Kiapp = [I] / (V0/V1 1) (Equao16)
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MATERIAIS E MTODOS
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Onde Vo a velocidade de hidrlise sem a presena do inibidor, V1 a
velocidade de hidrlise na ausncia do inibidor e [I] a concentrao do inibidor. Num grfico V0/V1 1 versus [I], o coeficiente angular igual a 1/ Kiapp Substituindo o valor de Kiapp na equao possvel determinar o valor de
Ki.
Essas inibies foram realizadas em soluo tampo cido Brico/Brax 50 mM, pH 7.8, contendo EDTA 1,0 mM e DTT 1 mM , 37C.
3.12. Modelagem da Lbpro
A modelagem molecular da interao da poro N-terminal do substrato
Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp (seqncia KVQRKLKG) com a Lbpro, baseada na estrutura cristalogrfica desta enzima foi realizada pelo colaborador Prof. Dr. Tim
Skern da Medical University of Vienna (ustria), utilizando o software PYMOL (De Lano, 2002 ) .
3.13.Determinao da energia livre de ligao do substrato (Gs) e energia livre de ativao (GT)
Os clculos da energia livre de ligao do substrato (Gs) e a energia livre de ativao (GT) foram obtidos atravs dos valores de parmetros cinticos Km e kcat/Km ( Marana et al., 2002), utilizando as equaes 17 e 18:
Gs= - RTln(1/Km) ( Equao 17)
GT = - RTln(kcat /Km) + RTln(KBT/h) (Equao 18)
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MATERIAIS E MTODOS
49
onde T= 303 K , R a constante universal dos gases, KB (1,4 x 10-23 J/K) e h (6.6 x 10-34 J.s) so as constantes de Boltzman e Planck respectivamente. O coeficiente angular do grfico de GT versus Gs relaciona a energia do estado de transio e
energia de ligao do substrato.
3.14. Atividade enzimtica para diferentes concentraes de Lbpro e sua
mutante sLbpro
As atividades enzimticas da Lbpro e sua mutante sLbpro em diferentes
concentraes molares foram medidas atravs das velocidades iniciais de hidrlise
dos substratos Abz-KAKVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp e Z-LK-MCA em
concentraes fixas de 2 M e 45 M respectivamente. A variao da concentrao
molar das enzimas ocorreu na faixa de 0.002 M at 6 M. Todos os ensaios foram
realizados em tampo cido brico/Brax 50 mM , pH 7.8 contendo EDTA 1,0 mM e DTT 1 mM 37C.
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MATERIAIS E MTODOS
50
3.15. Inibio da Lbpro por compostos de telrio
Antes de ser utilizada nos ensaios de inibio, a Lbpro foi ativada com
DTT, e em seguida foi separada do excesso de redutor por gel-filtrao usando uma
coluna PD10(Amershan). Os ensaios de inibio foram realizados medindo-se a velocidade inicial de hidrlise do substrato fluorognico, Abz-KVQRKLKGAGQSSQ
([0.3 M]), na ausncia e na presena de diferentes concentraes das teluranas 37C, em tampo cido Brico/Brax 50 mM, pH 7.8.
O substrato pode proteger a enzima da ao do inibidor, sendo assim,
esse fato deve ser levado em considerao na construo do modelo (Marangoni, 2003). Para a inibio na presena do substrato podemos considerar as seguintes etapas como mostra o esquema :
E + I EI*
E + S ES
k2
Ks
Onde E, I, S, EI*, ES, k2 e KS so enzima, inibidor, substrato, complexo
enzima-inibidor, complexo enzima-substrato, constante de inibio de segunda
ordem e constante de dissociao do complexo enzima substrato respectivamente.
Para obteno do k2, determinamos primeiro a constante de pseudo
primeira ordem k atravs da mudana da concentrao do complexo [EI*].
A reao de inibio foi monitorada continuamente pela fluorescncia do
produto formado, atravs da comparao entre a atividade da enzima livre e a
atividade da mesma na presena de diferentes concentraes dos inibidores. Assim,
para cada concentrao de inibidor, a diminuio da atividade expressa pela
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MATERIAIS E MTODOS
51
variao da fluorescncia com o tempo resultando em hiprboles. As curvas
hiperblicas obtidas so melhores ajustadas de acordo com equao 19: [EI*] = [Et ](1-exp-kt) (Equao 19)
Onde Et corresponde a concentrao de enzima total (Marangoni, 2003). As constantes de velocidade de segunda ordem das reaes inibidor/enzima, k2,
foram obtidas atravs dos grficos das constantes de primeira ordem (k) frente s respectivas concentraes de inibidores utilizadas. A regresso linear dessa relao
gera uma inclinao que corresponde :
Inclinao= k2.KS / KS + [S]
Os compostos de telrio foram sintetizados pelo Prof.Dr. Rodrigo Cunha
da Universidade Federal do ABC.
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RESULTADOS E DISCUSSES
52
4.RESULTADOS E DISCUSSES
4.1.Especificidade dos substios S7 ao S5.
A especificidade da Lbpro e sLbpro foi estudada utilizando-se substratos
FRET baseados na seqncia de aminocidos da juno Lbpro-VP4, Abz-KVQRKLXGAGQSSQ-EDDnp com mudana sistemtica dos resduos de
aminocidos em posies P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1, P1, P2, P3, P4 e P5 em relao
a ligao ...X-G... hidrolisada pela Lbpro e sLbpro .
O perfil de especifidade da Lbpro e sLbpro foram semelhantes para todos
substios estudados, mas a atividade cataltica da sLbpro foi levemente superior ao da
Lbpro em praticamente todas as cinticas realizadas.
4.1.1.Especificidade dos substios S1 e S2
Os parmetros cinticos para as hidrlises das sries Abz-
KVQRKLXGAGQSSQ-EDDnp e Abz-KVQRKXKGAGQSSQ-EDDnp pela Lbpro e
sLbpro, onde X corresponde s substituies em P1 e P2 e esto apresentados na
TABELA 3. Todas as clivagens ocorreram entre X-G e K-G , respectivamente.
Observamos que o substios S1 da Lbpro e sLbpro apresentam grande
preferncia pelos aminocidos bsicos arginina e lisina.
Interessante notar que os peptdeos contendo prolina, serina, cido
glutmico, e triptofano no foram hidrolisados pela Lbpro e sLbpro, porm esses
peptdeos interagem com o centro ativo e, portanto foram caracterizados como
inibidores competitivos para ambas as enzimas.
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RESULTADOS E DISCUSSES
53
Os baixos valores de kcat/Km para aminocidos carregados (arginina e cido asprtico) e aromticos (fenilalanina e tirosina) mostraram que o substio S2 tem preferncia por aminocidos apolares com grupos alquila na cadeia lateral como
leucina e valina, e em menor grau, por isoleucina e alanina. Essa preferncia por
leucina em P2 pela Lbpro tambm foi observada por Kuehnel e colaboradores (2004), atravs de mutaes stio dirigidas, onde a substituio da L200 por outros resduos
de aminocidos reduz a auto-clivagem da Lbpro.
O peptdeo contendo triptofano na posio P2 mostrou-se resistente
clivagem, apresentando inibio competitiva para a Lbpro e sLbpro .
A Lbpro apresentou semelhanas na especificidade com as catepsina F,
S e K em P2, que tambm possuem maior preferncia por leucina, enquanto a
papana aceita melhor valina nessa posio (Choe et al., 2006). O substio S1 da papana no seletivo como o substio S2, mas possui
grande preferncia por arginina e lisina e no aceita valina nessa posio (Barret et al., 2004).
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RESULTADOS E DISCUSSES
54
TABELA 3 . Parmetros cinticos de hidrlise das peptidases Lbpro e sLbpro utilizando as sries de peptdeos FRET Abz-KVQRKLXGAGQSSQ-EDDnp e Abz-KVQRKXKGAGQSSQ-EDDnp, com variaes (X) nas posies P1 e P2 .
Km (M)
kcat (s-1)
kcat/Km (mM-1.s-1)
X Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro
P1 Abz-KVQRKLXGAGQSSQ-EDDnp K(ref.)a 0.50.05 0.600.04 1.8 0.2 5.2 0.5 3600 8667
R 0.5 0.03 1.20.1 1.9 0.2 7.0 0.8 3800 5833
L 2.0 0.1 0.90.07 0.1 0.02 0.20.01 50 222
P Ki=2.60.06 uM (WT) Ki=3.0 0.3uM (sLb)
S Ki=6.1 0.5 uM (WT) Ki=111 uM (sLb)
Q 3.1 0.2 4.3 0.3 0.2 0.01 0.70.05 65 163
E Ki=2.20.3 uM (WT) Ki=2.00.2 uM (sLb)
F 2.5 1.7 0.2 0.2 0.02 0.2 0.01 80 118
G 112 8.61.5 0.10.01 0.10.01 9 12
W Ki=0.9 0.08uM (WT) Ki=1.70.1 uM (sLb)
P2 Abz-KVQRKXKGAGQSSQ-EDDnp R 0.6 0.08 1.4 0.2 0.010.002 0.090.00
1 17 64
L(ref)a 0.5 0.05 0.6 0.04 1.8 0.2 5.2 0.5 3600 8667
V 0.5 0.04 0.8 0.1 1.4 0.1 3.5 0.3 2800 4375
I 0.2 0.3 0.7 0.08 0.1 0.02 0.5 0.06 500 714
P 5 0.06 5.20.05 0.140.002 0.160.01 28 31
A 0.9 0.08 1.0 0.6 0.4 0.07 1.5 0.1 444 1500
D 2.0 0.2 4.4 0.4 0.0020.000
3
0.010.00
2
1 2.3
F 0.300.03 0.9 0.08 0.04 0.006 0.2 0.02 133 222
Y 0.7 0.05 2.5 0.3 0.02 0.003 0.1 0.02 29 40
W Ki=0.70.05 uM (WT) Ki=0.80.03 uM (sLb) a Substrato referncia: Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp
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RESULTADOS E DISCUSSES
55
4.1.2. Especificidade dos substios S3 e S4.
Para o estudo de especificidade dos substios S3 e S4 da Lbpro e sLbpro
foram utilizadas as sries de substratos Abz-KVQRXLKGAGQSSQ-EDDnp e Abz-
KVQXKLKGAGQSSQ-EDDnp, onde X corresponde s substituies em P3 e P4
respectivamente, sendo que todas as clivagens ocorreram entre K-G. Os parmetros
cinticos para essas duas sries so apresentados na TABELA 4. O substrato
contendo o resduo lisina em P3, apresentou maior valor de kcat/Km desta srie.
Surpreendentemente, o substrato tambm contento arginina em P3 no foi to bem
aceito pela Lbpro e sLbpro e apresentou um valor de kcat/Km menor do que fenilalanina
nessa mesma posio. Em todas as outras substituies (histidina, leucina, prolina, asparagina, alanina e glutamina) ocorreu uma significante diminuio da eficincia cataltica das enzimas, sendo que para o resduo de cido asprtico a reduo foi
drstica, indicando que esse substio no acomoda bem aminocidos carregados
negativamente.
Essa rejeio por resduo de aminocido cido no substio S3 tambm foi observada por Kuehnel e colaboradores (2004) onde a mutao da K200 por um resduo de cido asprtico reduz drasticamente a auto-clivagem da poliprotena do
FMDV.
Para o substio S4, novamente observamos uma preferncia por um
resduo carregado positivamente, porm nesta posio somente o resduo de
arginina foi bem aceito. Todas as outras substituies em P4 resultaram em
substratos hidrolisados com o valores de kcat/Km menores em maior ou menor grau.
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RESULTADOS E DISCUSSES
56
Como observado nos substios S1, S2 e S3, aminocidos com carga
negativa no so bem aceitos no substio S4, como mostra os resultados de kcat/Km
(Tabelas 4 e 5). Outros resultados interessantes foram obtidos com os substratos
contendo prolina em P3 e P4. Na posio P3 ocorreu hidrlise do substrato com baixa
eficincia cataltica, enquanto que em P4, o substrato foi resistente hidrolise e foi
ensaiado como inibidor competitivo. Isso sugere que o substrato contendo prolina
nessa posio tem uma conformao no stio ativo no favorvel hidrlise.
Ensaios realizados utilizando-se uma biblioteca combinatria de
peptdeos, Choe e colaboradores (2006), mostraram que a papana e as catepsinas L, V, K, S, F e B apresentam baixa
especifidade para as posies P3 e P4.
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RESULTADOS E DISCUSSES
57
TABELA 4 . Parmetros cinticos de hidrlise das peptidases Lbpro e sLbpro utilizando as sries de peptdeos FRET Abz-KVQRXLKGAGQSSQ-EDDnp e Abz-KVQXKLKGAGQSSQ-EDDnp, com variaes (X) nas posies P3 e P4
Km (M)
kcat (s-1)
kcat/Km (mM-1.s-1)
X Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro
P3 Abz-KVQRXLKGAGQSSQ-EDDnp R 1.10.1 1.90.2 0.90.05 3.60.3 818 1895
K(ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667
H 2.40.3 2.00.4 1.00.2 1.40.1 417 700
L 1.40.2 0.60.06 0.60.05 1.60.1 429 2667
P 2.50.03 2.20.04 1.20.005 1.40.006 480 636
A 3.00.4 1.10.1 0.50.08 0.90.06 168 818
D 4.50.4 8.60.7 0.010.002 0.10.02 2 12
N 1.20.1 0.80.06 0.70.06 2.00.2 583 2500
Q 2.00.3 3.00.3 0.30.04 1.10.1 150 367
F 0.70.08 1.50.1 0.80.06 3.70.04 1142 2467
P4 Abz-KVQXKLKGAGQSSQ-EDDnp R (ref)a 0.5 0.05 0.6 0.04 1.8 0.2 5.2 0.5 3600 8667
H 2.4 0.3 1.8 0.2 1.4 0.1 2.8 0.3 583 1556
L 1.3 0.1 1.3 0.2 1.6 0.1 2.1 0.1 1231 1615
P Ki=222 uM (WT) Ki=16.7 1.2uM (sLb)
A 2.40.2 1.50.1 1.60.2 2.00.2 667 1333
D 11.21 8.10.8 0.20.02 0.60.07 18 74
N 2.90.2 2.30.4 0.90.05 0.90.08 310 391
Q 2.30.2 2.00.2 1.70.1 3.80.3 739 1900
F 1.00.01 0.70.05 0.90.06 1.30.1 900 1857 a Substrato referncia: Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp
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RESULTADOS E DISCUSSES
58
4.1.3.Especificidade em S5, S6 e S7
Os parmetros cinticos de hidrlise obtidos para Lbpro e sLbpro para as
sries de substratos FRET Abz-KVXRKLKGAGQSSQ-EDDnp, Abz-
KXQRKLKGAGQSSQ-EDDnp e Abz-XVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp, com
substituies na posio X, so apresentados na TABELA 5.
Essas variaes correspondem s posies P5, P6 e P7, ocorrendo
clivagens somente entre K-G. Apesar de distantes do stio de clivagem, os substios
S5, S6 e S7 interagem com os resduos de aminocidos dos substratos afetando a
catlise enzimtica da Lbpro e sLbpro como podemos observar atravs dos resultados
dos parmetros cinticos destas posies.
O substio S5 na Lbpro e sLbpro uma cavidade aberta ao solvente.
Glutamina e leucina so bem aceitas na posio P5, e em menor proporo prolina.
As outras substituies nessa posio no foram eficientes, como mostrado pelos
valores de kcat/Km. Os melhores valores de kcat/Km para a posio P6, foram
observados com os substratos contendo o resduo de valina seguido de serina,
enquanto que, os piores resultados foram apresentados pelos resduos carregados.
Na posio P7, o substrato contendo lisina foi o que apresentou a maior
relao kcat/Km, enquanto leucina e cido asprtico, promoveram uma drstica
reduo na atividade cataltica. As substituies contendo leucina e cido aspartico
provocaram um grande aumento no valor de Km e diminuio no valor de kcat ,
reduzindo desse modo, os valores de kcat/Km .
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RESULTADOS E DISCUSSES
59
TABELA 5 Parmetros cinticos de hidrlise da Lbpro e sLbpro das sries de substratos FRET Abz-KVXRKLKGAGQSSQ-EDDnp, Abz-KXQRKLKGAGQSSQ-EDDnp e Abz-XVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp, com variaes (X) nas posies P5, P6 e P7 . Km
(M) kcat (s-1)
kcat/Km (mM-1.s-1)
X Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro
P5 Abz-KVXRKLKGAGQSSQ-EDDnp
R 4.4 0.5 3.50.4 1.70.2 2.60.1 386 743
L 0.40.2 0.50.1 1.20.2 4.70.2 3000 9400
S 6.00.6 1.80.2 1.30.1 1.50.1 217 833
Q (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667
D 3.60.3 1.70.2 1.40.1 2.1 0.3 389 1235
F 3.80.4 1.50.2 2.10.1 3.3 0.3 552 2200
P 0.8 0.2 0.6 0.1 1.2 0.1 2.6 0.2 1515 4343
P6 Abz-KXQRKLKGAGQSSQ-EDDnp
R 1.60.1 3.60.4 0.50.3 2.10.1 313 583
V (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667
S 0.70.06 0.80.08 1.50.1 4.0 0.1 2143 5000
D 3.50.3 1.80.2 1.60.1 2.10.2 457 1167
F 2.30.4 3.60.2 3.00.1 5.30.7 1304 1472
P 2.20.2 1.00.3 2.60.2 1.70.1 1182 1730
P7 Abz-XVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp
K (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667
L 3.40.2 3.60.1 0.40.2 1.30.2 118 389
D 6.10.3 9.40.2 0.60.1 2.10.3 98 223 a Substrato referncia: Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp
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RESULTADOS E DISCUSSES
60
4.1.4.Especificidade dos substios S1 e S2para Lbpro e sLbpro
As sries de subtratos FRET Abz-KVQRKLKXAGQSSQ-EDDnp, Abz--
KVQRKLKGXGQSSQ-EDDnp, com substituies na posio X, e seus respectivos
parmetros cinticos so apresentados na TABELA 6.
O substio S1 mostrou-se altamente seletivo, aceitando bem na posio
P1, somente os resduos de glicina seguido por alanina. Os substratos contendo
arginina, prolina e triptofano nesta posio mostraram-se resistentes hidrlise e
foram ensaiados como inibidores competitivos.
Mnard e colaboradores (1993), utilizando substratos fluorognicos do tipo Dns-Phe-Arg-X-Trp-Ala, onde X um aminocido qualquer, mostraram que os
substios S1 da papana e catepsina S aceitam uma ampla variedade de resduos de
aminocidos, sendo a especificidade desse substio de difcil determinao para
estas enzimas. Puzer e colaboradores (2004), utilizando substratos do tipo Abz-KLRXSKQ-EDDnp, mostraram que as catepsina V e L tambm possuem baixa
especificidade para o substio S1.
O substio S2 para a Lbpro e sLbpro foi menos seletivo que o substio S1,
mostrando preferncia por resduos hidrofbicos na posio P2. De maneira
surpreendente, o resduo de prolina nessa posio, apresentou uma eficincia
cataltica superior at mesmo quando comparado com o substrato de referncia.
Portaro e colaboradores (2000), utilizando substratos do tipo Abz-AFRSXAQ-EDDnp mostraram que a papana e a catepsina L tambm apresentam preferncia por
aminocidos hidrofbicos como triptofano e tirosina na posio P2 do substrato,
enquanto que, catepsina B, prefere asparagina nessa posio .
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RESULTADOS E DISCUSSES
61
TABELA 6. Parmetros cinticos de hidrlise pela Lbpro e sLbpro das series de substratos FRET Abz-KVQRKLKXAGQSSQ-EDDnp e Abz-KVQRKLKGXGQSSQ-EDDnp, com variaes(X) nas posies P1 e P2.
Km (M)
kcat (s-1)
kcat/Km (mM-1.s-1)
X Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro
P1 Abz-KVQRKLKXAGQSSQ-EDDnp
R Ki=1.10.02 uM (WT) Ki=1.20.01 uM (sLb)
L 1.10.1 1.50.1 0.30.05 1.40.1 273 933
P Ki=2.60.1 uM (WT) Ki=3.0 0.2uM (sLb)
A 2.30.2 1.00.05 2.30.1 4.00.1 1000 4000
G (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667
S 2.60.2 1.40.1 1.60.2 2.70.3 615 1929
E 3.10.3 1.90.2 0.040.006 0.080.1 13 42
Q 2.20.2 1.10.1 0.50.07 0.70.09 228 636
F 1.70.2 2.40.2 0.050.008 0.30.05 30 125
W Ki=110.8 uM (WT) Ki=13.3 0.7uM (sLb)
P2 Abz-KVQRKLKGXGQSSQ-EDDnp
R 1.00.06 1.20.1 2.10.08 4.00.2 2100 3333
L 0.30.03 0.20.03 1.10.03 1.50.05 3667 7500
P 0.20.01 0.20.02 2.70.05 3.50.06 13500 17500
A (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667
D 111 121.5 1.70.2 2.60.15 155 217
F 1.10.1 0.70.05 2.10.1 1.40.1 1909 2000
W 1.10.1 0.50.06 1.40.05 1.40.2 1272 2800 a Substrato de referncia: Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp
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RESULTADOS E DISCUSSES
62
4.1.5.Especificidade dos substios S3, S4 e S5 para Lbpro e sLbpro
A TABELA 7 apresenta os parmetros cinticos de hidrlise obtidos para
as sries de subtratos FRET Abz-KVQRKLKGAXQSSQ-EDDnp, Abz-
KVQRKLKGAGXSSQ-EDDnp e Abz-KVQRKLKGAGQXSQ-EDDnp, com
substituies na posio X, correspondentes s posies P3, P4 e P5.
Para posio P3 do substrato, somente os resduos carregados no foram
bem aceitos pela Lbpro e sLbpro, enquanto que, leucina e prolina apresentaram
valores de kcat/Km superiores ao substrato de referncia.
Segundo o trabalho realizado por Portaro e colaboradores (2000), os melhores resduos para a papana no substio S3 so triptofano, tirosina e
asparagina seguidos de fenilalanina e leucina. J para as catepsinas B e L, no h
preferncia por nenhum resduo em especial, sugerindo que os resduos P3 dos
substratos no interagem com as enzimas.
Para a posio P4, os substratos contendo prolina e triptofano nessa
posio, apresentaram eficincias catalticas maiores que o substrato de referncia.
O resduo de prolina na posio P5 tambm resultou em um substrato hidrolisado
com grande eficincia cataltica, enquanto que, aminocidos carregados no foram
to eficientes nessa posio. Os resultados dos substratos contendo prolina em P2,
P3, P4 e P5 sugerem que este resduo de aminocido confere ao substrato uma
conformao que favorea a