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MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO EM PLANTAS
Dra. MARIZA MONTEIRO
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
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CONTEÚDO
1- INTRODUÇÃO
2- ISOLAMENTO DO GENE E CONSTRUÇÃO DO CASSETE DE
EXPRESSÃO
3- MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO
3.1- Agrobacterium3.2- Biobalística
3.3- Eletroporação
4- CULTURA DE TECIDOS COMO PRÉ-REQUISITO PARA
TRANSFORMAÇÃO
5- CULTIVO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS NO MUNDO
6- EXEMPLOS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
7– CONSIDERAÇÕES FINAIS
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1- INTRODUÇÃO
MELHORAMENTO DE PLANTAS CULTIVADAS
MÉTODOS MELHORAMENTO CLÁSSICO
TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
MÉTODOS BIOTECNOLÓGICOS
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Plantas Transgênicas
São plantas que tiveram sua constituição genética alterada pela introdução de gene(s) de um outro organismo, em geral de outra espécie.
(Torres et al., 1999)
Importância da técnica de transformação:
Obter plantas com características agronômicasdesejáveis, as quais não são possíveis por polinização.
“Fonte adicional de variabilidade genética para ser incorporada em um programa de melhoramento”.
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Utilização - Plantas resistentes a herbicidas e patógenos
- Melhor qualidade do produto
- Produção de proteínas animais
- Fitorremediação - detoxificação de metais pesados
- Alteração das vias metabólicas - produtos mais vantajosos
Limitação:
Número limitado de genes isolados que regulamcaracteres agronômicos relevantes.
TÉCNICAS DE ENGENHARIA GENÉTICA
Genes de interesse isolados e clonados em um vetor
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2- ISOLAMENTO DO GENE
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Gene:
Sequência de nucleotídeos que compreende um segmento de DNA cujo produto é um polipeptídeo.
Unidade básica da herança.
Estrutura do gene:
Promotor Éxon 2Éxon 1 TerminadorÍntron 1
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Processo de transcrição do DNA
5’ 3’
5’3’Transcrição
5’ 3’ hnRNA
Sítio de iniciação da Transcrição
Códon de finalização da tradução UGA, UAA ou UAG
5’3’mRNA
5’ 3’
Filamento não molde
Filamento molde
Splicing ou processamento
AAAAA
AAAAA
Núcleo
Cap
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Isolamento do gene de interesse por “Differential display”
Planta inoculada com bacteriose
Ex. Gene de resistência a uma doença (bacteriose)
Plantas resistentes
Planta não inoculada com bacteriose
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Extração do mRNA total
Extração do mRNA total da planta inoculada e da planta não inoculada com a bacteriose
mRNA
Planta inoculada com bacteriose
Planta não inoculada com bacteriose
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Formação do cDNA5’ 3’mRNAAAAAA
3’AAAAA
Transcriptase reversa
Primer oligo (dT)
TTTTTTAlça
DNA polimerase
Tratamento com alcali
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Isolando o gene5’ 3’mRNAAAAAA
Primer oligo (dT)
TTTTTTAlça
DNA polimerase
AAAAA
Transcriptase reversa
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Isolando o gene5’ 3’mRNAAAAAA
Primer oligo (dT)
TTTTTTAlça
DNA polimerase
AAAAA
Nuclease S1(específica unifilamentar)
cDNA bifilamentar
Transcriptase reversa
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Identificação do cDNA correspondente ao gene de interesse
Planta inoculada com bacteriose
Planta não inoculada com bacteriose
Isolamento do cDNA correspondente ao gene de resistência a bacteriose por “Differential Display”
cDNA cDNA
Extrai o cDNAdo gel
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Clonagem do cDNA em um vetor
Plasmídeo
cDNA
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Amplificação e identificação do cDNA
VetorBactéria
Introdução do vetor contendo o cDNA em uma bactéria
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Construção do Cassete de expressão
Inserção de um promotor e um terminador
Promotor: Região de DNA envolvida na ligação da RNA-polimerase
para iniciar a transcrição
Promotor
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Promotores constitutivos:
Dicotiledôneas - 35S – vírus do mosaico da couve-flor
Monocotiledôneas - Adh1 - álcool desidrogenase do milho
- Act1 - actina do arroz
- Ubi1 - ubiquitina do milho
Promotores induzidos - expresso quando submetidos a fatores de indução
ats1A - subunidade menor da ribose 1,6-bifosfato carboxilase oxigenase da Arabidopsis thaliana – induzido pela luz
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Terminador: Sequencia de DNA, presente na extremidade do
transcrito, que leva a RNA-polimerase a terminar a transcrição
Promotor Terminador
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Clonando o gene em um vetor
Plasmídeo
Promotor Terminador
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pCAMBIA1301
11837 bp
lacZ alpha
Gus first exon
Gus second exon
kanamycin (R)
hygromycin (R)
pVS1 sta
Catalase intron
T-Border (right)
Histidine tag
pBR322 bom
T-Border (left)
Nos poly-A
CaMV35S polyA
CaMV 35S promoter
CaMV35S promoter
pBR322 ori
pVS1 rep
BamH I (11046)
Bgl II (8)
Bst EII (2050)
Bst XI (10782)
EcoR I (11025)
Hind III (11076)
Kpn I (11041) Nco I (1)
Pst I (11068)
Sac I (11035)
Sac II (8383)
Sal I (11058)
Sma I (11043)
Xba I (11052)
Nhe I (2014)
Nhe I (5458)
Sph I (2455)
Sph I (11074)
Xho I (8901)
Xho I (9995)
Plasmídeo pCambia 1301
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3- MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO
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INDIRETO
Agrobacterium
DIRETOS
Biobalística
Eletroporação - Protoplastos e Tecidos íntegros
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3.1- TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium
Agrobacterium - microorganismos tipicamente de solo- induzem doenças em tecidos injuriados de
dicotiledôneas
Agrobacterium tumefaciens - galha-da-coroa
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Formação de galha-da-coroa por Agrobacterium tumefaciens (www.biologi.uio.no/plfys/ haa/gen/gmo.html)
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Indução do tumor - Plasmídeo Ti
Plasmídeo:
- DNA circular, extracromossômico de replicação
autônoma, presente em bactérias.
- Geralmente ligado a patogenicidade ou virulência
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Agrobacterium tumefaciens (www.apsnet.org/.../DNA_easy/Images/agrobacterium.jpg)
plasmideo Ti
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Esquema de organização estrutural do plasmídeo Ti (Sluys, 1999)
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Processo biológico da infecção
Interação Planta-Agrobacterium (Sheng e Citovsky, 1996).
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Processo biológico da infecção
Interação Planta-Agrobacterium (Sheng e Citovsky, 1996).
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3.1.1- VETORES UTILIZADOS PARA Agrobacterium
Esquema dos sistemas de vetores de Agrobacterium para transformação de plantas - a) Co-integrados - cis - b) Vetores binários - trans (Brasileiro e Dusi, 1999).
TRANSFORMAÇÃO POR Agrobacterium
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Agrobacterium tumefaciens (www.apsnet.org/.../DNA_easy/Images/agrobacterium.jpg)
pCAMBIA1301
11837 bp
lacZ alpha
Gus first exon
Gus second exon
kanamycin (R)
hygromycin (R)
pVS1 sta
Catalase intron
T-Border (right)
Histidine tag
pBR322 bom
T-Border (left)
Nos poly-A
CaMV35S polyA
CaMV 35S promoter
CaMV35S promoter
pBR322 ori
pVS1 rep
BamH I (11046)
Bgl II (8)
Bst EII (2050)
Bst XI (10782)
EcoR I (11025)
Hind III (11076)
Kpn I (11041) Nco I (1)
Pst I (11068)
Sac I (11035)
Sac II (8383)
Sal I (11058)
Sma I (11043)
Xba I (11052)
Nhe I (2014)
Nhe I (5458)
Sph I (2455)
Sph I (11074)
Xho I (8901)
Xho I (9995)
vetor binario
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pCAMBIA1301
11837 bp
lacZ alpha
Gus first exon
Gus second exon
kanamycin (R)
hygromycin (R)
pVS1 sta
Catalase intron
T-Border (right)
Histidine tag
pBR322 bom
T-Border (left)
Nos poly-A
CaMV35S polyA
CaMV 35S promoter
CaMV35S promoter
pBR322 ori
pVS1 rep
BamH I (11046)
Bgl II (8)
Bst EII (2050)
Bst XI (10782)
EcoR I (11025)
Hind III (11076)
Kpn I (11041) Nco I (1)
Pst I (11068)
Sac I (11035)
Sac II (8383)
Sal I (11058)
Sma I (11043)
Xba I (11052)
Nhe I (2014)
Nhe I (5458)
Sph I (2455)
Sph I (11074)
Xho I (8901)
Xho I (9995)
Mapa de restrição do plasmídeo pCambia 1301
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3.1.2- MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO VIA Agrobacterium tumefaciens
Método de co-cultivo (Brasileiro et al., 1998)
Co-cultivo
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MÉTODOS DIRETOS
3.2 - TRANSFORMAÇÃO POR BIOBALÍSTICA
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3.2- TRANSFORMAÇÃO POR BIOBALÍSTICA
- Consiste na aceleração, a velocidade supersônica, de
micropartículas carregando as moléculas de interesse em
direção a um alvo biológico.
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Partículas de ouro Partículas de tungstênio
Micropartículas - ouro ou tungstênio - 0,4 a 1,5 µµµµm
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Acelerador de partículas com alta pressão de gás hélio (Biorad).
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Esquema de funcionamento.
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Vetores - não requerem seqüências especiais
Utilização:
- transformar meristemas e tecidos com alto
potencial de regeneração.
- transformação de organelas e pólens
- transformação de cereais, leguminosas e espécies
arbóreas recalcitrantes a outros métodos.
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3.3 - TRANSFORMAÇÃO POR ELETROPORAÇÃO
DE PROTOPLASTOS
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protoplastos:
- células desprovidas de sua parede vegetal mediante
tratamento enzimático.
enzimas são capazes de degradar:
- Celulose - Pectina - Hemicelulose
- Outros polissacarídeos que compõem a parede
celular.
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Choque elétrico:
- formação de poros reversíveis na membrana plasmática
permitindo a entrada do DNA
- Fatores importantes
- Duração do pulso
- Voltagem aplicada
Técnica de eletroporação de protoplastos:
-Consiste em submeter os protoplastos e DNA a um campo
elétrico de intensidade controlada
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Esquema de eletroporação
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Cubetas para eletroporação
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Eletroporador
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Vantagem –
Aumento da freqüência de plantas transformadas
Ex. (Quecini, 1999) - 36% - eficiência de transformação por
eletroporação
- 3,47% - de eficiência de transformação por
biobalística
Desvantagem –
- A regeneração a partir de protoplastos é um processo
longo, podendo induzir variação somaclonal.
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4- CULTURA DE TECIDOS COMO PRÉ-REQUISITO PARA TRANSFORMAÇÃO
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- CULTURA DE TECIDOS: É o processo pelo qual pequenos pedaços de tecido vivo (explantes) são isolados da planta e crescem assepticamente em meio de cultura nutritivo.
- TOTIPOTÊNCIA CELULAR = toda célula tem a capacidade de se dividir e regenerar um novo indivíduo (Schleiden e Schwann, 1938 e 1939), desde que devidamente estimulados.
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- Estímulos
- meio nutritivo - sais minerais, vitaminas, fonte de carbono
- condições ambientais - adequadas para o crescimento e
desenvolvimento.
- fitorreguladores
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Auxínas AIA - ácido indol-3-acético
AIB - ácido indol-3-butirico
2,4-D - ácido 2,4-Diclorofenóxiacético
ANA - ácido 1-Naftalenoacético
Citocininas K - Cinetina
BAP - 6-Benzilaminopurina
ZEA – Zeatina
* Induzem a desdiferenciação e respostas morfogênicas em tecidos diferenciados
- fitorreguladores
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0
0
0,005
0,02
1,0
0,03 0,18 1,08 3,0
CONCENTRAÇÃO DE AIA (mg/L)CO
NCE
NTRA
ÇÃO DE CINET
INA (mg/L)
(Raven, 1998)
Explantes: discos foliares de tabaco
Balanço hormonal
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- Protocolos eficientes de regeneração de plantas
Aumenta e eficiência de plantas transformadas
Agrobacterium – Regeneração na extremidade do explante
Biobalística - Regeneração na superfície do explante - Acompanhamento histológico da formação dos meristemóides
Eletroporação de protoplastos
- Protocolo eficiente de isolamento, cultura e regeneração de plantas
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5- Cultivo de plantas transgênicas no mundo
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Area Global de Plantas Transgênicas Cultivadas em 2008: por Paises (Milhões de Hectares)
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6- Exemplos de plantas transgênicas
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Tomate Longa Vida
http//www.zoo.utoronto.ca
Flavr savr Tradicional
Etileno
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TranscriçãoTranscrição
Tradução
Síntese do gene poligalacturonase (pg)
Síntese do gene e do antisense
Enzima
Enzima não produzida
http//www.zoo.utoronto.ca
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Batata resistente a larva de Lacanobia oleracea(mariposa do tomate)
ControleTransgênico
http//www.europe.eu.int
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Mamão resistente ao PRSV (Vírus da mancha anelar do mamão)
ControleTransgênico
http//www.apsnet.org
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Arroz Dourado apresentando betacaroteno
http//www.news.bbc.uk
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Esquema do processo de transformação do Arroz Dourado apresentando betacaroteno
http//www.news.bbc.uk
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Soja resistente ao herbicida imazapyr
Detalhe de linhas transgênicas (direita) e não-transgênicas(esquerda) após a aplicação do herdicida
(Abud,S. et al., 2003)
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Alimentos Transgênicos
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7- CONSIDERAÇÕES FINAIS
-A técnica de transformação nos permite:
- a obtenção de inúmeras espécies vegetais, com diferentes características:
- resistência ou tolerância a estresse biótico e abiótico
- melhor capacidade nutricional ou capaz de produzir fármacos (biorreatores).
- estudos básicos nas áreas de Genética, Fisiologia, Biologia Celular e Biologia Molecular.
-Superar as barreiras reprodutiva
-Transferir apenas genes de interesse
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- Adequação dos processos de cultivo in vitro para
várias espécies recalcitrantes.
- Compreensão das funções da grande maioria de genes.
- Manipulação de características complexas que são
governadas por vários genes e que freqüentemente
estão associados a produtividade.
-Desafios a serem superados: