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MINISTRIO DA SADE
MONOGRAFIA DA ESPCIE Salix alba (SALGUEIRO
BRANCO)
Organizao: Ministrio da Sade
Fonte do recurso: DIREB-002-FIO-13
Braslia
2015
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LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 rvore e ramos de Salix alba.................................................................................1
Figura 2 Mapa da distribuio geogrfica da espcie vegetal..............................................2
Figura 3 Aspectos macroscpicos e microscpicos em Salix alba L conforme Farmacopeia
Brasileira.............................................................................................................................. 6
Figura 4 Estrutura qumica dos componentes qumicos majoritrios presentes na espcie Salix
alba. Adaptado de WHO, 2009.......................................................................................... 12
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Limites microbiolgicos recomendados para plantas medicinais (Adaptado de Arajo
e Baubi, 2012).......................................................................................................................9
Tabela 2 Resumo das atividades descritas em estudos farmacolgicos in vitro envolvendo a
espcie vegetal Salix alba encontrados na literatura pesquisada....................................... 31
Tabela 3 Resumo das atividades descritas em estudos farmacolgicos in vivo envolvendo a
espcie vegetal Salix alba encontrados na literatura pesquisada....................................... 44
Tabela 4 Formas farmacuticas de Salix alba obtidas a partir da literatura pesquisada.....55
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ABREVIATURAS
AAPH - 2,2-azobis(2-amidinoppropano) diidrocloreto
AAS - cido acetilsaliclico
AChE - Acetilcolinesterase
AINES - Anti-inflamatrios no-esteroidais
Anvisa Agncia nacional de Vigilncia Sanitria
CCD - Cromatografia em Camada Delgada
CLAE/HPLC - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia/ High Performance Liquid
Cromatography
COX- cicloxigenase
DCFH-DA - 2,7-diacetato de diclorofluoroscena
DNA - cido desoxirribonuclico
DPPH - 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
EMeA - European Medicines Agency
EPO - European Patent Office
GSH - Glutationa
HLE - elastase
HSP-47 - Heat Shock Protein
ICAM-1 - Molcula de Adeso Intracelular
IC50 ndice de Inibio 50%
IL - interleucina
IN - Instruo Normativa
INPI - Instituto Nacional de Propriedade Industrial
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I.P. - Intraperitoneal
IPNI - International Plant Names Index
JPO - Japan Patent Office
LPS - lipopolissacardeos
MDA - Malondialdedo
MF - Medicamentos Fitoterpicos
MTT - brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazlio
NF-B - Fator Nuclear kappa B
NO - xido Ntrico
OMS - Organizao Mundial de Sade
PGE2 - Prostaglandina E2
PTF - Produtos Tradicionais Fitoterpicos
RDC - Resoluo da Diretoria Colegiada
Rename - Relao Nacional de Medicamentos Essenciais
SOD - Superxido dismutase
TNF- - Fator de Necrose Tumoral
UFC - Unidades Formadoras de Colnia
USPTO - U.S. Patent and Trademark Office
VEGF - Fator de crescimento vascular endotelial
V.O. - Via oral
WHO - World Health Organization
WIPO - World Intellectual Property Organization
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SUMRIO
1 IDENTIFICAO ...............................................................................................................1
1.1 NOMENCLATURA BOTNICA ....................................................................................1
1.2 SINONMIA BOTNICA ................................................................................................1
1.3 FAMLIA ..........................................................................................................................1
1.4 FOTO DA PLANTA .........................................................................................................1
1.5 NOMENCLATURA POPULAR ......................................................................................2
1.6 DISTRIBUIO GEOGRFICA ....................................................................................2
1.7 OUTRAS ESPCIES CORRELATAS DO GNERO, NATIVAS OU EXTICAS
ADAPTADAS .........................................................................................................................2
2 INFORMAOES BOTNICAS ..........................................................................................3
2.1 PARTE UTILIZADA / RGO VEGETAL ...................................................................3
2.2 DESCRIO MACROSCPICA DA PARTE DA PLANTA UTILIZADA .................3
2.3 DESCRIO MICROSCPICA DA PARTE DA PLANTA UTILIZADA ...................3
2.3.1 Descrio microscpica do p ........................................................................................5
2.4 INFORMAES SOBRE POSSVEIS ESPCIES VEGETAIS SIMILARES QUE
POSSAM SER UTILIZADAS COMO ADULTERANTES ..................................................7
3 INFORMAES DE CONTROLE DE QUALIDADE ......................................................7
3.1 ESPCIE VEGETAL / DROGA VEGETAL ...................................................................7
3.1.1 Caracteres organolpticos ...............................................................................................7
3.1.2 Requisitos de pureza .......................................................................................................7
3.1.2.1 Perfil de contaminantes comuns ..................................................................................7
3.1.2.2 Microbiolgico ............................................................................................................7
3.1.2.3 Teor de umidade ..........................................................................................................9
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3.1.2.4 Metal pesado ...............................................................................................................9
3.1.2.5 Resduos qumicos ....................................................................................................10
3.1.2.6 Cinzas........................................................................................................................10
3.1.3 Granulometria ..............................................................................................................10
3.1.4 Prospeco fitoqumica ................................................................................................10
3.1.5 Testes fsico-qumicos ..................................................................................................10
3.1.6 Testes de identificao .................................................................................................10
3.1.7 Testes de quantificao ................................................................................................11
3.1.7.1 Componentes qumicos e suas concentraes: descritos e majoritrios, ativos ou no
...............................................................................................................................................11
3.2 DERIVADO VEGETAL ................................................................................................12
3.2.1 Descrio .....................................................................................................................12
3.2.2 Mtodo de obteno .....................................................................................................12
3.2.3 Caracteres organolpticos ............................................................................................15
3.2.4 Testes de identificao .................................................................................................15
3.2.5 Testes de quantificao ................................................................................................16
3.2.5.1 Componentes qumicos e suas concentraes: descritos e majoritrios, ativos ou
no.........................................................................................................................................16
3.3 PRODUTO FINAL ........................................................................................................16
3.3.1 Forma farmacutica .....................................................................................................16
3.3.2 Testes especficos por forma farmacutica .................................................................17
4 INFORMAES DE SEGURANA E EFICCIA .......................................................17
4.1 USOS POPULARES / TRADICIONAIS .....................................................................17
4.2 PRESENA NA NOTIFICAO DE DROGAS VEGETAIS ...................................17
4.3 ESTUDOS NO-CLNICOS .......................................................................................19
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4.3.1 Estudos toxicolgicos ...................................................................................................19
4.3.1.1 Toxicidade aguda .......................................................................................................19
4.3.1.2 Toxicidade subcrnica ...............................................................................................19
4.3.1.3 Toxicidade crnica .....................................................................................................20
4.3.1.4 Genotoxicidade ..........................................................................................................20
4.3.1.5 Sensibilizao drmica ..............................................................................................21
4.3.1.6 Irritao cutnea ........................................................................................................21
4.3.1.7 Irritao ocular ...........................................................................................................21
4.3.2 Estudos farmacolgicos ................................................................................................21
4.3.2.1 Ensaios in vitro ..........................................................................................................21
4.3.2.2 Ensaios in vivo ..........................................................................................................40
4.3.2.3 Ensaios ex vivo ..........................................................................................................43
4.4 ESTUDOS CLNICOS ...................................................................................................47
4.4.1 Fase I ............................................................................................................................47
4.4.2 Fase II ...........................................................................................................................48
4.4.3 Fase III .........................................................................................................................50
4.4.4 Fase IV .........................................................................................................................51
4.4.5 Estudos observacionais ................................................................................................51
4.5 RESUMO DAS AES E INDICAES POR DERIVADO DE DROGA ESTUDADO
................................................................................................................................................52
4.5.1 Vias de Administrao .................................................................................................52
4.5.2 Dose Diria ..................................................................................................................52
4.5.3 Posologia (Dose e Intervalo) ........................................................................................52
4.5.4 Perodo de Utilizao ...................................................................................................53
4.5.5 Contra Indicaes .........................................................................................................53
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4.5.6 Grupos de Risco.............................................................................................................53
4.5.7 Precaues de Uso ........................................................................................................53
4.5.8 Efeitos Adversos Relatados ..........................................................................................53
4.5.9 Interaes Medicamentosas ..........................................................................................53
4.5.9.1 Descritas ....................................................................................................................53
4.5.9.2 Potenciais ...................................................................................................................54
4.5.10 Informaes de Superdosagem ...................................................................................54
4.5.10.1 Descrio do quadro clnico .....................................................................................54
4.5.10.2 Aes a serem tomadas ............................................................................................55
5 INFORMAES GERAIS ................................................................................................55
5.1 FORMAS FARMACUTICAS /FORMULAES DESCRITAS NA LITERATURA..55
5.2 PRODUTOS REGISTRADOS NA ANVISA E OUTRAS AGNCIAS
REGULADORAS....................................................................................................................56
5.3 EMBALAGEM E ARMAZENAMENTO .......................................................................57
5.4 ROTULAGEM .................................................................................................................57
5.5 MONOGRAFIAS EM COMPNDIOS OFICIAIS E NO OFICIAIS ..........................57
5.6 PATENTES SOLICITADAS PARA A ESPCIE VEGETAL........................................57
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1
1 IDENTIFICAO
1.1 NOMENCLATURA BOTNICA
Salix alba L. (1).
1.2 SINONMIA BOTNICA
A busca por sinnimos foi realizada nas bases de dados Flora do Brasil, Tropicos e
International Plant Names Index (IPNI), porm no foram identificadas sinonmias botnicas
para a espcie Salix alba (1-3).
1.3 FAMLIA
Saliaceae (4).
1.4 FOTO DA PLANTA
Figura 1 rvore (Fonte: MOBOT (5)) e ramos de Salix alba L. (Fonte: Tropicos (3))
1.5 NOMENCLATURA POPULAR
Salgueiro branco (4).
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2
1.6 DISTRIBUIO GEOGRFICA
Salix alba uma espcie nativa da regio central e Sul da Europa, sia Central e
nordeste da frica. Ela foi levada aos Estados Unidos nos idos de 1700 por imigrantes europeus
e se disseminou em diversas partes da Amrica (5-8).
As espcies de Salix esto localizadas preferencialmente em regies temperadas do
hemisfrio Norte e crescem preferencialmente em regies midas (6).
Figura 2 Mapa da distribuio geogrfica da espcie vegetal (Fonte: Tropicos (3))
1.7 OUTRAS ESPCIES CORRELATAS DO GNERO, NATIVAS OU EXTICAS
ADAPTADAS
O gnero Salix contempla mais de 400 espcies, distribudas principalmente na Amrica
do Norte, Europa e China. As espcies do gnero no so comumente encontradas em regies
tropicais, havendo apenas trs espcies nativas das Amricas Central e do Sul (8).
Outras espcies correlatas ao gnero e tambm utilizadas com fim medicinal so Salix
daphnoides, Salix fragilis e Salix purpurea (7, 9-12). Estudos filogenticos indicam que a S.
fragilis derivada dos progenitores de S. alba, o que pode ser indicado pela semelhana
gentica entre as espcies (13).
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3
2 INFORMAOES BOTNICAS
As espcies de Salix so caracterizadas por rvores de at 25 metros com folhas
decduas, normalmente pecioladas, simples, lineares a ovaladas com margens inteiras a
serradas. As inflorescncias so pequenas e podem emergir antes, ao mesmo tempo ou aps as
folhas. J as flores so individuais e no apresentam ptalas. Possui frutos capsulados com
muitas sementes (7).
Salix alba caracteriza-se por ser uma rvore grande com tronco curto, com ramos de
colorao marrom-amarelados, folhas elpticas e lanceoladas, acuminadas e serradas, com pelos
sercios e colorao acinzentada. Os frutos so capsulados e possuem inmeras sementes (7).
2.1 PARTE UTILIZADA / RGO VEGETAL
A parte utilizada como droga vegetal a casca obtida dos ramos jovens (4).
2.2 DESCRIO MACROSCPICA DA PARTE DA PLANTA UTILIZADA
Segundo a Farmacopeia Brasileira, a parte da planta utilizada com fins medicinais
constitui-se da casca inteira ou fragmentada (1 a 2 cm de espessura), obtida de ramos jovens,
com dois a trs anos. Macroscopicamente os fragmentos se caracterizam por serem irregulares
coriceos, flexveis, alongados e levemente acanalados, de comprimento, largura e espessura
variados. Sua superfcie externa reluzente e lustrosa, lisa ou estriada de colorao castanho-
escura. J a superfcie interna finamente estriada longitudinalmente, fibrosa e parda (4, 7, 9).
2.3 DESCRIO MICROSCPICA DA PARTE DA PLANTA UTILIZADA
Segundo a Farmacopeia Brasileira, a casca tem colorao castanho-escura e amarelada
em algumas pores quando vista frontalmente. As clulas do sber apresentam diferentes
formas, geralmente poligonais, de paredes retilneas e muitas vezes alongadas. O colnquima
possui clulas achatadas e de paredes espessadas. Em seco transversal, o crtex possui
cutcula extremamente espessada e a poro externa da casca pode apresentar diferentes
organizaes estruturais: 1) primeira camada epidrmica, uniestratificada, com clulas
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4
quadrangulares pequenas, de paredes espessas, seguida por cinco a seis camadas de colnquima
tabular, de clulas alongadas, dispostas tangencialmente, de paredes espessas e com
cloroplastdios, seguido por parnquima com clulas de variadas formas e de paredes espessas;
2) camada epidrmica externa, com as mesmas caractersticas da descrita anteriormente,
seguida pelo colnquima formado por clulas pequenas, arredondadas e de paredes espessas,
seguido por parnquima com clulas tambm arredondadas e de paredes espessas; 3)
revestimento externo formado por periderme, abrangendo diferente nmero de camadas,
seguidas por parnquima com clulas arredondadas e de paredes espessas. O parnquima
cortical externo sempre formado por vrias camadas de clulas, normalmente quadrangulares
a retangulares, ou poligonais a arredondadas, de paredes espessadas, com poucos espaos
intercelulares, muitos cloroplastdios e muitos cristais de oxalato de clcio do tipo drusas, raros
monocristais e cristais prismticos. Agrupamentos de clulas ptreas so pouco comuns neste
tecido, raras so essas clulas isoladas e as contendo compostos fenlicos. O parnquima
cortical interno possui clulas de diferentes formas, maiores espaos intercelulares e menor
quantidade de cristais e de cloroplastdios. Mais internamente, as clulas mostram maior
irregularidade de forma, maiores espaos intercelulares, paredes muito espessadas, pontoadas
e mais retilneas. Agrupamentos geralmente circulares, de fibras lignificadas so abundantes e
esto distribudos aleatoriamente neste parnquima onde, muito raramente, ocorrem
agrupamentos de clulas ptreas. O cmbio formado por poucas camadas celulares, com
clulas de pequenas dimenses e achatadas tangencialmente, tanto as fusiformes quanto as
radiais. O tecido adjacente internamente ao cmbio, contm grande quantidade de gros de
amido. Raios parenquimticos so formados por clulas de diferentes formas, alongadas
verticalmente, de paredes espessas e contendo cloroplastdios. Entre esses raios, ocorrem
clulas parenquimticas de forma irregular, de paredes espessadas, sem cloroplastdios e de
maior volume do que aquelas distribudas junto ao cmbio. Clulas floemticas pequenas, ricas
em compostos fenlicos, so acompanhadas por agrupamentos de fibras lignificadas, alinhados
horizontalmente e por clulas parenquimticas, de paredes espessas, com cloroplastdios e
dispostas tangencialmente. Idioblastos contendo compostos fenlicos so comuns junto ao
cmbio interno. Este tecido delimita internamente a casca e formado por clulas de paredes
delgadas e reduzido nmero de camadas. Geralmente de difcil observao devido a suas
caractersticas e sua posio limtrofe. Em seco longitudinal, as caractersticas do sber e da
regio cortical externa so similares s descritas para a seco transversal. A regio cortical
-
5
interna mostra raios parenquimticos muitas vezes alargados, fibras e clulas parenquimticas
de paredes espessas (Figura 2) (4).
2.3.1 Descrio microscpica do p
So caractersticas do p da casca de Salix alba a colorao castanho-plida; a presena
de fragmentos de sber, em vista frontal; fragmentos de parnquima, com clulas de paredes
espessadas, em vista frontal; fibras isoladas ou pores de seus agrupamentos, em seco
longitudinal; fragmentos de parnquima cortical com clulas de forma poligonal e de paredes
espessas, com cristais do tipo drusas, em seco transversal; poro de fibras associadas a
idioblastos cristalferos, em seco longitudinal; fragmentos de parnquima com clulas de
paredes espessadas, com distribuio radial e com pores de cmbio; fragmentos de cmbio,
em seco transversal; cristais de oxalato de clcio dos tipos monocristais, cristais prismticos
e drusas, isolados (4).
-
6
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7 Figura 3 Aspectos macroscpicos e microscpicos em Salix alba L conforme Farmacopeia Brasileira (4). A
aspecto geral de poro da superfcie externa da casca, em vista frontal. B aspecto geral de poro da superfcie
interna da casca, em vista frontal. C detalhe do sber, na regio de colorao marrom, em vista frontal. D
detalhe do sber, na regio de colorao amarelada, em vista frontal. E poro de colnquima em seco
transversal; cloroplastdio (clo). F detalhe de poro do parnquima, mostrando idioblastos cristalferos com
monocristais, cristais prismticos e drusas, e com compostos fenlicos, em seco transversal; idioblasto contendo
compostos fenlicos (icf); cloroplastdio (clo); idioblasto cristalfero (ic). G detalhe de poro do parnquima,
mostrando agrupamento de clulas ptreas, em seco transversal; cloroplastdio (clo); clula ptrea (cp);
idioblasto cristalfero (ic); pontoao (pto). H detalhe de poro do cortx, em seco longitudinal; cloroplastdio
(clo); fibra (fb); idioblasto cristalfero (ic); parnquima (p). I detalhe de poro do crtex, mostrando o
parnquima e clulas ptreas em seco longitudinal; cloroplastdio (clo); clula ptrea (cp); idioblasto cristalfero
(ic); parnquima (p); pontoao (pto).
2.4 INFORMAES SOBRE POSSVEIS ESPCIES VEGETAIS SIMILARES QUE
POSSAM SER UTILIZADAS COMO ADULTERANTES
Diferentemente da Farmacopeia Brasileira, na Farmacopeia Europeia a descrio da
casca de Salix utilizada como droga vegetal consiste em mais de uma espcie do gnero,
comtemplando tambm S. purpurea L., S. daphnoides Vill. e S. fragilis L, as quais so
caracterizadas por possurem pelo menos 1,5% de derivados saliclicos totais em sua
composio (9, 12). A Farmacopeia Brasileira recomenda a identificao da espcie vegetal por
meio de cromatografia em camada delgada utilizando slica-gel (4).
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8
3 INFORMAES DE CONTROLE DE QUALIDADE
3.1 ESPCIE VEGETAL / DROGA VEGETAL
3.1.1 Caracteres organolpticos
A droga vegetal inodora com sabor adstringente e marcadamente amargo (4, 7).
3.1.2 Requisitos de pureza
3.1.2.1 Perfil de contaminantes comuns
Segundo a Farmacopeia Brasileira e a monografia da Organizao Mundial de Sade
(OMS), a droga vegetal deve possuir no mximo 3% de ramos com dimetro superior a 10 mm
e no mximo 2% de outros materiais estranhos (4, 7).
3.1.2.2 Microbiolgico
No h descrio de controle microbiolgico especfico para Salix alba na Farmacopeia
Brasileira ou Europeia (4, 9). No entanto, na monografia da OMS para o salgueiro h referncia
aos limites de contaminao microbiolgica determinados pelo guia da OMS para controle de
qualidade de plantas medicinais (7, 14).
De acordo com o guia da OMS, natural a presena de fungos e bactrias no material
vegetal, principalmente devido a fonte, colheita e manejo. A presena de Escherichia coli e
Salmonella spp indicam baixa qualidade de produo e colheita, o que pode ser evitado
implantando-se boas prticas de cultivo.
Mais recentemente, um estudo de Parthik e colaboradores analisou os guias da OMS e
os contaminantes potencialmente perigosos em plantas medicinais, em relao ao controle
microbiolgico, os autores descrevem o limite de material microbiolgico de acordo com o
material vegetal utilizado e o diferencia em extrato bruto, material que foi pr-tratado ou para
uso tpico e material para uso interno (15).
O livro Latest Research into Quality Control possui um captulo destinado ao controle
microbiolgico em plantas medicinais, no qual h um quadro comparativo entre os limites de
agentes microbiolgicos determinados pelas Farmacopeias brasileira, americana, europeia e
guia da OMS. O quadro comparativo foi adaptado e est apresentado abaixo (16).
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9
Tabela 1 Limites microbiolgicos recomendados para plantas medicinais (Adaptado de Arajo
e Baubi, 2012 (16)).
Farmacopeia
Brasileira
Farmacopeia
Americana
Farmacopeia
Europeia
Guia OMS
Bactrias
aerbicas
107 105 107 NI
Fungos 104 103 105 105
Enterobactrias e
outras bactrias
Gram negativas
104 103 NI NI
E. coli Ausncia Ausncia 104 104
Salmonella Ausncia Ausncia NI NI
Farmacopeia Brasileira: valor representa droga vegetal na qual ser adicionada gua fervente antes do uso.
Farmacopeia Americana: Valor representa droga vegetal seca ou em ps na qual ser adicionada gua fervente
antes o uso; Farmacopeia Europeia: produtos com uma ou mais de uma droga vegetal (inteira, rasurada ou em p)
na qual ser adicionada gua fervente antes do uso. Guia OMS: valor representa matria vegetal bruta a ser
processada. NI: Limites no informados. Valores descritos em Unidades Formadoras de Colnia (UFC)/g.
3.1.2.3 Teor de umidade
Segundo a Farmacopeia Brasileira o teor de umidade mximo para Salix alba de 11%.
De acordo com a Farmacopeia Europeia essa porcentagem deve ser determinada em 1000 g de
p da planta por secagem em forno a 100 C por duas horas (4, 9).
3.1.2.4 Metal pesado
A Farmacopeia Brasileira no determina valores mnimos de metais, tampouco a
Farmacopeia Europeia ou a monografia da OMS para a espcie vegetal, neste ltimo h
referncia ao guia da OMS para determinao dos limites mximos de metais em plantas
medicinais (4, 7, 9).
O guia da OMS, por sua vez, determina que o limite mximo de metais txicos deve ser
calculado em concordncia com o limite mximo tolerado para ingesto diria e esse deve ser
estabelecido com base regional ou nacional. A recomendao da OMS para chumbo e cdmio,
por exemplo, de no mximo 10 e 0,3 mg/ kg, respectivamente (14).
Kalny e colaboradores (2012) determinaram o contedo de microelementos e metais
txicos em plantas medicinais e fitoterpicos comercializados na Polnia, dentre eles a casca
do salgueiro e encontrou alta concentrao de cdmio (1,0 mg/ kg) na droga vegetal (17).
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10
3.1.2.5 Resduos qumicos
No h descrio especfica na Farmacopeia Brasileira sobre resduos qumicos, j a
monografia da OMS para a casca de Salix possui recomendao de no exceder o limite mximo
de aldrin e dieldrin em 0,05 mg/ kg. Para outros praguicidas h a indicao de consultar os
limites descritos no guia da OMS (4, 7, 9, 14).
3.1.2.6 Cinzas
A proporo mxima de cinzas descritas tanto na Farmacopeia Brasileira quanto na
Europeia e na monografia da OMS de 10% (4, 7, 9, 14).
3.1.3 Granulometria
A granulometria para a espcie Salix alba no est descrita na Farmacopeia Brasileira,
Farmacopeia Europeia ou monografia da OMS para a espcie vegetal (4, 7, 14). Entretanto, h
uma descrio genrica no guia da OMS para plantas medicinais que define o p de acordo com
o tamis pelo qual ele passa por completo, variando entre grosso e muito fino (14).
3.1.4 Prospeco fitoqumica
A espcie possui salicina, sua principal caracterstica, alm de ser rica em glicosdeos
fenlicos, flavonoides e macroelementos, como K, Ca e Mg (7, 9, 11).
3.1.5 Testes fsico-qumicos
No h descrio de testes fsico-qumicos especficos para a espcie na literatura
utilizada.
3.1.6 Testes de identificao
A Farmacopeia Brasileira define como proceder a identificao de Salix alba e define o
mtodo de cromatografia em camada delgada (CCD) como de escolha. Para isso utiliza-se
slica-gel GF254, com espessura de 250 m, como fase estacionria e mistura de acetato de
etila, metanol e gua (77:13:10) como fase mvel. Aplica-se, separadamente, em forma de
banda, 10 L de cada uma das Solues (1), (2) e (3), preparadas recentemente, como descrito
a seguir.
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Soluo (1): aquecer 0,5 g da amostra pulverizada (500 m), com 10 mL de metanol,
em banho-maria, sob refluxo, a aproximadamente 50 C por 10 minutos. Esfriar e filtrar.
Soluo (2): adicionar a 5 mL da Soluo (1), 1 mL da soluo de carbonato de sdio anidro
50 mg/mL. Aquecer em banho-maria a, aproximadamente 60 C, sob refluxo, por 10 minutos.
Esfriar e filtrar. Soluo (3): dissolver 2 mg de salicina em 1 mL de metanol. Desenvolve-se,
ento, o cromatograma. Remove-se a placa e deixa-se secar ao ar. Em seguida, nebulizar a placa
com soluo de cido sulfrico 5% (v/v) em metanol e deixar em estufa entre 100 C e 105 C,
durante 10 a 15 minutos. O cromatograma obtido com a Soluo (3) apresenta, no tero mdio,
uma mancha violeta-avermelhada correspondente a salicina (Rf aproximadamente 0,40). No
cromatograma obtido com a Soluo (1), a mancha de salicina aparece com uma intensidade
fraca mdia. No cromatograma obtido com a Soluo (2) a mancha correspondente a salicina
aparece mais intensa e, sobre ela, aparece uma mancha (salicortina) e, s vezes, duas manchas
fracas (tremulacina), de cor violeta-avermelhada. Nos cromatogramas das Solues (1) e (2)
podem aparecer outras manchas de cores azul, amarelo e marrom (4).
3.1.7 Testes de quantificao
Segundo a Farmacopeia Brasileira o doseamento da salicina para a espcie Salix alba
deve ser realizado por meio de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE/HPLC). Para
isso, recomenda-se utilizar cromatgrafo provido de detector ultravioleta a 270 nm; pr-coluna
empacotada com slica octadecilsilanizada, coluna de 150 mm de comprimento e 3,9 mm de
dimetro interno, empacotada com slica octadecilsilanizada (4 m), mantida a temperatura
ambiente; fluxo da fase mvel de 1 mL/minuto. Fase mvel: mistura de acetonitrila, gua e
cido trifluoractico (3:97:0,05). Soluo amostra: pesar exatamente, cerca de 0,3 g da droga
seca e moda (355 m) juntar 25 mL de metanol e aquecer sob refluxo, durante 30 minutos.
Esfriar e filtrar. Retomar o resduo com 25 mL de metanol e tratar como descrito anteriormente.
Reunir os filtrados e evaporar sob vcuo at secura. Retomar o resduo com 2 mL de metanol,
adicionar 2 mL de hidrxido de sdio 0,1 M e aquecer em banho-maria, sob refluxo, durante 1
hora a 60 C, aproximadamente, com agitao frequente. Esfriar, adicionar 0,25 mL de cido
clordrico M e completar a 5 mL com uma mistura de metanol e gua (50:50). Soluo padro:
dissolver 10 mg de salicina em 10 mL de acetonitrila. Solues para curva analtica: diluir
alquotas de 40, 45, 50, 55 e 60 L da Soluo padro a 100 L com Fase mvel, de modo a
obter concentraes de 0,40 mg/ mL, 0,45 mg/ mL, 0,50 mg/ mL, 0,55 mg/ mL e 0,60 mg/ mL.
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Procedimento: injetar, separadamente, 10 L das Solues para curva analtica e da Soluo
amostra. Registrar os cromatogramas e medir as reas sob os picos. O tempo de reteno de
aproximadamente 6 minutos para a salicina. Calcular o teor de salicina na amostra a partir da
equao da reta obtida com a curva analtica. O resultado expresso pela mdia das
determinaes em gramas de salicina por 100 gramas da droga (%), considerando o teor de gua
(4).
3.1.7.1 Componentes qumicos e suas concentraes: descritos e majoritrios, ativos ou no
A Farmacopeia Brasileira descreve apenas a salicina como componentes qumicos
majoritrios presentes no salgueiro-branco, o qual consiste no composto ativo e est presente
na proporo de 0,5 a 1,5%. J a monografia da OMS para o salgueiro relata outros glicosdeos
fenlicos, como a salicortina, a fragilina, a populina e, alm dos seguintes compostos:
triandrina, vimalina, flavonoides e taninos. As estruturas salicina, salicortina e fragilina esto
apresentadas na figura 3 (4, 7).
Figura 4 Estrutura qumica dos componentes qumicos majoritrios presentes na espcie Salix
alba. Adaptado de WHO, 2009 (7).
3.2 DERIVADO VEGETAL
3.2.1 Descrio
No h monografias para os derivados vegetais de Salix alba nos compndios oficiais,
dessa forma podem ser empregados os mtodos utilizados para a droga vegetal ou os mtodos
descritos em trabalhos cientficos, que no geral utilizaram os mesmos critrios empregados para
droga vegetal, os quais so utilizados nesta monografia.
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3.2.2 Mtodo de obteno
Foram estudados 25 artigos cientfico que descreveram a utilizao de derivado vegetal
de Salix alba, descreveram os derivados como extrato alcolico, extrato aquoso, extrato
metanlico, extrato seco, extrato bruto, extratos utilizando acetona, clorofrmio e hexano como
solventes.
Em 1972, Toman e colaboradores relataram o isolamento de galactanas a partir da casca
de Salix alba com sucesso mediante a extrao com benzeno-etanol (1:3) por 30 h e posterior
deslignificao com 80% de etanol (18). Em 1975 o mesmo grupo utilizou 600 g da casca de
Salix alba obtida a partir de ramos jovens par ao isolamento de pectina, a qual foi extrada com
gua a temperatura ambiente (19).
Para avaliar a presena de polifenis e sua relao com atividade antimicrobiana, Raiciu
e colaboradores utilizou matria vegetal fresca triturada, a qual sofreu macerao por 4-5 dias
em frascos mbar com etanol 90%. Em seguida foi adicionada uma mistura de gua e glicerina
para que o volume final fosse 20 vezes a massa inicial da planta. A macerao continuou com
a soluo de lcool e glicerol por mais 3 semanas (20).
A atividade antimicrobiana, junto s atividades antioxidante e citotxica presentes nos
compostos fenlicos de Salix alba foi analisada pelo grupo de Sulaiman, o qual utilizou a o p
da casca e extrao com etanol fervente em Soxhlet por 7 h. A soluo foi filtrada utilizando
vcuo e o filtrado foi evaporado utilizando evaporador a vcuo a 40C (21).
A obteno dos extratos aquosos de Salix alba foi realizada de forma semelhante,
variando de acordo com o objetivo do estudo. Em 1974, Kompantsev et al. Descreveram a
obteno de glicosdeos fenlicos a partir da extrao de 4,0 kg de ramos jovens de salgueiro
branco com gua aquecida a 90-95C por uma hora, trs vezes (22).
A fim de obter compostos fenlicos a partir da casca de Salix alba, o grupo de Harbourne
realizou a extrao utilizando apenas 2,5 g da matria vegetal e 100 mL de gua destilada a
100C por 20 minutos, com agitao, seguido de filtrao e resfriamento com gelo (23).
Drummond e colaboradores utilizaram uma modificao da metodologia de Harbourne,
partindo de 7,5 g da casca de Salix alba adicionados de 100 mL de gua a 90C por 15 minutos
a fim de tambm obterem compostos fenlicos (24).
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Para o isolamento de taninos foram utilizadas as folhas da espcie vegetal, que foram
secas por congelamento e extradas em Soxhlet com a utilizao de hexano a fim de remover
lipdeos e substncias lipoflicas, em seguida os taninos foram extrados do resduo resultante
por uma mistura de acetona e gua (7:3) (25).
A anlise de taninos tambm foi realizada a partir da extrao de folhas por Muetzel e
colaboradores, em 2006. As folhas foram secas por congelamento ou em forno a 60C por 2 h
e em seguida pulverizadas, ento 1 g do p foi extrado com 100 mL de acetona 70%por duas
vezes por 20 minutos em banho ultrassnico (26).
A extrao metanlica tambm foi utilizada por Du et al., a fim de se isolar lignanas
provenientes de S. alba. Para isso, 1000 g da casca seca da espcie vegetal foi pulverizada e
extrada sucessivamente com metanol e ter a temperatura de 40 a 60C e posteriormente
evaporada. O resduo foi ento digerido utilizando-se acetato de etila (27).
O grupo de Pobocka-Olech descreveu a extrao metanlica de Salix alba em trs
estudos analisados, enquanto no primeiro o objetivo foi isolar glicosdeos fenlicos, incluindo
salicina, dentre outros, no segundo o composto qumico isolado foi a procianidina, j no terceiro
o objetivo foi isolar fenis simples. Nas trs publicaes o processo de extrao foi descrito
partindo-se do p da casca da droga vegetal, que extrado exaustivamente com metanol a 60C
(28-30). Jazayeri e colaboradores, com a finalidade de avaliar a atividade anticolinestersica do
extrato de algumas plantas utilizadas como medicinais no Ir, tambm utilizou a metodologia
da extrao metanlica de Salix alba, semelhante ao descrito acima; de acordo com a
publicao, um grama do p da casca da planta foi extrado por macerao sob agitao a
temperatura ambiente com metanol aquoso (20 mL; 1:1 v/v) por 24 horas (31). A quantificao
de salicina em diferentes espcies do gnero Salix foram analisadas por Kenstaviien et al.
tambm aps a extrao utilizando metanol, de acordo com a metodologia do trabalho 50 mL
de metanol foi adicionado a 0,5 g do p da casca de Salix alba e a mistura foi aquecida em um
condensador de refluxo por 30 minutos, posteriormente resfriada e filtrada (6).
A obteno do extrato seco de S. alba foi descrita por Oberprieler e colaboradores para
o isolamento de compostos fenlicos e anlise taxonmica por meio de perfil gentico. Segundo
a metodologia do estudo, aps a coleta do material as cascas da espcie vegetal foram
congeladas a -80C. Aps 9 meses, o material sofreu secagem utilizando slica-gel (100 mg), o
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15
qual foi adicionado de 1,5 mL de metanol e homogeneizado em banho ultrassnico por 5
minutos, 3 vezes (32).
Em alguns estudos, os extratos foram obtidos comercialmente e no h descrio da
metodologia de extrao (10, 33-39).
Diferentemente dos outros derivados vegetais descritos acima, Pinto et al utilizaram o
plen de abelhas proveniente de S. alba a fim de isolar principalmente flavonoides, para isso
foi utilizado 1 g de p de plen foi homogeneizado e misturado 9 mL de etanol 70%, colocado
em papel alumnio e deixado temperatura ambiente por 72 h, o qual foi denominado extrato
1. Esse extrato foi centrifugado por 31 min a 4C e 11000 rpm, o sobrenadante foi dividido em
alquotas de 1,5 mL e estocado a -20C. Para a hidrlise 1 mL do sobrenadante do extrato 1 foi
adicionado de 4 mL de cido clordrico 2 M e aquecido at fervura por 30 min. Aps o
resfriamento a mistura foi extrada 3 vezes com dietilter e a fase ter foi coletada e evaporada,
o resduo foi solubilizado em 1 mL de etanol 96%, filtrado (0,22 mm) e estocado a -20C, o
extrato etanlico a 96% foi denominado extrato 2 (40).
3.2.3 Caracteres organolpticos
Dentre os artigos analisados os quais relatavam a utilizao ou extrao de derivados
vegetais, o nico que relatou a anlise de caracteres organolpticos para o controle de qualidade
do derivado vegetal foi o grupo de Raiciu et al (20). Segundo o trabalho, ao final do processo
de obteno do derivado foram observados odor, sabor e cor.
3.2.4 Testes de identificao
Conforme j citado, o principal constituinte qumico obtido a partir da Salix alba a
salicina, no geral os mtodos de isolamento e identificao do composto se do CCD, de acordo
com recomendao da Farmacopeia Brasileira para a droga vegetal ou por HPLC para
identificao e quantificao, conforme orientao da Farmacopeia Europeia (4, 9).
Enquanto a identificao da salicina no extrato aquoso de Salix alba por meio de CCD
foi descrita em 1983 (35), outros trabalhos mais recentes utilizaram HPLC tanto para a salicina
(6, 29) quanto para glicosdeos fenlicos em geral (30, 32).
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16
Du et al. (2005) descreveram o isolamento de salicina e amigdalina por um mtodo
semi-industrial de cromatografia a baixa rotao utilizando uma bobina preenchida com a fase
estacionria composta por metil-tert-butil-ter e butanol (1:3) saturado com metanol e gua
(1:5) e fase mvel composta por metanol e gua (1:5) saturado com metil-tert-butil-ter e
butanol (1:3). Dessa forma foi possvel a dissoluo de 500 g de salicina em 5 L de fase mvel
e obteve-se uma pureza de 87,6% (36).
Tanto Muetzel et al., em 2006, quanto Sulaiman e colaboradores, em 2013, relataram a
determinao de fenis no extrato de Salix alba por espectrofotometria pelo mtodo de Folin-
Ciocalteu (21, 26).
3.2.5 Testes de quantificao
Agnolet e colaboradores (2012) validaram a quantificao da salicina por HPLC
utilizando detector de malha de diodo, coluna C18 como fase estacionria e fase mvel
constituda por soluo de metanol, gua e cido frmico com eluio em gradiente. O mtodo
mostrou preciso, exatido, linearidade e limites de deteco e quantificao satisfatrios (10).
3.2.5.1 Componentes qumicos e suas concentraes: descritos e majoritrios, ativos ou no
De forma semelhante droga vegetal o principal constituinte qumico relatado entre os
derivados vegetais de Salix alba a salicina, composto ativo da espcie (6, 10, 22, 23, 29, 35,
36, 39). So tambm relatados outros fenis como salidrosida, piceina, helicina, triandrina,
populina e tremulacina (29). No entanto, o mais comum o relato da presena de polifenis ou
fenis totais nos derivados, sem especificar o composto (20, 21, 23, 24, 26, 30, 32).
Os taninos tambm foram descritos como constituintes dos compostos (20, 23, 25, 26),
especialmente as procianidinas, que so descritos como potenciais antifngicos (25, 28).
3.3 PRODUTO FINAL
3.3.1 Forma farmacutica
No momento, h um nico fitoterpico presente no mercado nacional contendo Salix
alba, que possui a associao de trs espcies vegetais: Passiflora incarnata, Salix alba e
Crataegus oxyacantha. O medicamento utilizado a fim de diminuir sintomas de ansiedade e
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17
insnioa, principalmente devido s propriedades sedativas, antiespasmdicas e ansiolticas da
Passiflora incarnata. O fitoterpico apresentado na forma de comprimidos revestidos e cada
comprimido contm em sua composio 100 mg de extrato seco de Salix alba, 30 mg de extrato
seco de Crataegus oxyacantha e 100 mg Passiflora incarnata (41).
No mercado europeu, especialmente na Polnia, h outros fitoterpicos contendo a
espcie vegetal, como o Rutinosal, tambm comercializado na forma de comprimidos com
associao de 300 mg de Salix, 20 mg de Rutosidum de 40 mg de vitamina C; e o Salicortex,
comprimidos com 330 mg da Salix. Os medicamentos so indicados, respectivamente, para
resfriados e dores de cabea (17).
Agnolet et al. (2012) relataram e utilizao de cpsulas contendo extrato de S. alba
compradas em farmcias da Dinamarca, porm o trabalho no apresenta maiores detalhes sobre
o fitoterpico (10). Hoffman e colaboradores (2002) tambm descreveram utilizar comprimidos
contendo extrato seco de Salix alba, comprados em farmcias locais de Nova Iorque (NY,
Estados Unidos) sem descrever nome comercial ou composio do medicamento (42).
3.3.2 Testes especficos por forma farmacutica
Como no h monografias nas Farmacopeias sobre fitoterpicos contendo Salix alba e
tambm no foram encontrados, na literatura pesquisada, testes especficos de controle de
qualidade, sugere-se a realizao de testes gerais para produtos finais presentes na Farmacopeia
Brasileira, como peso, dureza, friabilidade, desintegrao, dissoluo, uniformidade de doses
unitrias, pH, densidade, volume e teste de gotejamento (4).
4 INFORMAES DE SEGURANA E EFICCIA
4.1 Usos populares e/ou tradicionais
Os primeiros achados descrevendo os efeitos teraputicos de extratos da casca de
salgueiro foram descritos pro Hipcrates, h aproximadamente 2400 anos, ele recomendava
mascar as folhas de salgueiro para analgesia em crianas. Estudos subsequentes descreveram
os efeitos analgsicos das folhas de salgueiro, como os relatos de Diocorides, um cirurgio
-
18
grego que atuou em Roma no ano 75 a.C., e os relatos de Galen, um mdico romano que
descreveu as propriedades antipirticas e antiinflamatrias das folhas do salgueiro (43).
Atualmente, o uso popular do salgueiro, especialmente do salgueiro branco continua
disseminado no Brasil e no mundo. A espcie vegetal conhecida por suas atividades
analgsicas, com atuao principalmente contra os sintomas de dores nas costas, artrite, dores
reumticas, alm das atividades atipirticas e anti-inflamatrias. Os efeitos da droga vegetal
parecem estar diretamente relacionados presena da salicina, pr-droga do cido acetil-
saliclico (6, 10, 41).
4.2 Presena em normativas sanitrias brasileiras
No ano de 2014 a ANVISA publicou a RDC n 26 a qual regulamenta o registro de
Medicamentos Fitoterpicos (MF) e o registro e a notificao de Produtos Tradicionais
Fitoterpicos (PTF), alm de revogar a RDC 14/2010. (44-46).
Junto RDC supracitada, foi publicada a Instruo Normativa n 2, de 13 de maio de
2014 (IN 2/2014), que publicou a "Lista de medicamentos fitoterpicos de registro
simplificado" e a "Lista de produtos tradicionais fitoterpicos de registro simplificado", na
primeira encontra-se a espcie Salix alba (45). As informaes referentes espcie esto
descritas a seguir:
Nomenclatura botnica - Salix alba L., S. purpurea L. , S. daphnoides Vill., S. fragilis L.
Nome popular - Salgueiro branco
Parte usada - Casca
Padronizao/Marcador - Salicina
Derivado vegetal - Extratos
Indicaes/Aes teraputicas - Antitrmico, anti-inflamatrio e analgsico
Dose Diria - 60 a 240 mg de salicina
Via de Administrao - Oral
Restrio de uso - Venda sem prescrio mdica
4.3 ESTUDOS NO-CLNICOS
-
19
4.3.1 Estudos toxicolgicos
4.3.1.1 Toxicidade aguda
Dado no encontrado na literatura pesquisada.
4.3.1.2 Toxicidade subcrnica
Apenas um estudo sobre toxicidade subcrnica foi encontrado, o qual aborda toxicidade
reprodutiva de um fitoterpico que alm de Salix alba, contm extrato de Passiflora incarnata
e Crataegus oxycantha, e utilizado com a indicao de sedativo e hipntico (47).
Para tanto, o estudo utilizou 21 ratos da linhagem Wistar, fmeas, com peso superior a
220 g e suas ninhadas. As ratas fmeas foram colocadas com ratos machos e assim que detectada
a cpula foi considerado o dia 0 da gestao. A partir de ento os animais passavam a receber
diariamente a preparao fitoterpica (n = 11 fmeas) ou veculo (n = 10 fmeas) at o final da
gestao. As ratas foram avaliadas durante a gestao, alm disso, foi avaliada a prole quanto
mortalidade e ao desenvolvimento. A dosagem utilizada nos animais foi correspondente
dose teraputica proposta para seres humanos (adulto de 70 kg), que de 4 drgeas/dia, o que
resulta em um total de 400 mg do extrato de Passiflora incarnata, 120 mg do extrato de
Crataegus oxycantha e 400 mg do extrato de Salix alba, assim sendo os animais receberam as
dosagens aproximadas de 6 mg.kg 1, 2 mg.kg-1 e 6 mg.kg1 de cada um dos extratos,
respectivamente. Para os ensaios de toxicidade decidiu-se por aplicar uma dose 10 vezes maior
que a os humanos, ou seja, 60 mg.kg1, 20 mg.kg1 e 60 mg.kg1 das plantas mencionadas,
respectivamente (47).
O dia 0 de gestao foi contado a partir da cpula e durante os 21 dias subsequentes foi
administrada a dose supracitada do fitoterpico por via oral (gavagem). Diariamente foram
avaliados o desenvolvimento ponderal e o consumo de gua e rao, alteraes de
comportamento, conscincia e disposio, avaliao da atividade do sistema locomotor,
musculatura esqueltica e reflexos e avaliao da atividade autonmica. No dia do parto e a
partir de ento, foram avaliados o nmero e a massa corporal dos filhotes, nmero de
natimortos, mortes de perinatais, alteraes macroscpicas externas nos filhotes,
desenvolvimento ponderal individual dos filhotes at o desmame, avaliao das caractersticas
de desenvolvimento geral como: descolamento das orelhas, erupo dos incisivos,
aparecimento dos pelos, abertura do canal aditivo, abertura dos olhos e descida dos testculos.
-
20
No desmame foram avaliados a massa corporal das ratas lactantes e dos filhotes, o nmero de
filhotes desmamados, a massa dos rgos dos filhotes (fgado e rins), o aspecto visual das
demais vsceras (corao, pulmes, tero, ovrios, trato gastrointestinal) (47). De acordo com
os resultados observados pelo estudo no houve diferena significativa entre o grupo tratado
com o fitoterpico e o grupo controle (que recebeu apenas veculo) no desenvolvimento das
ratas durante a gestao, tampouco no desenvolvimento da sua prole, o que permite concluir
que h ausncia de toxicidade reprodutiva do extrato de Salix alba, mesmo utilizando uma dose
dez vezes maior que a utilizada terapeuticamente em humanos (47).
4.3.1.3 Toxicidade crnica
Dado no encontrado na literatura pesquisada.
4.3.1.4 Genotoxicidade
Entre os estudos analisados, apenas um deles avaliou a genotoxicidade induzida por
Salix alba. Entretanto, diferentemente de outros estudos, o produto analisado no foi o extrato
da planta, mas sim dois extratos etanlicos (70 e 96%) obtidos a partir do plen de abelhas
proveniente de Salix alba, o qual pode estar presente em suplementos alimentares. Para a
avaliao da genotoxicidade, foi utilizado o ensaio do microncleo. A anti-genotoxicidade foi
avaliada mediante a avaliao da proteo do extrato frente induo de genotoxicidade por
trs quimioterpicos que agem por mecanismos celulares diferentes: bleomicina, mitomicina C
e vincristina. O material celular utilizado para os ensaios foi obtido a partir da coleta de sangue
perifrico heparinizado de trs voluntrios sadios, no fumantes, do sexo masculino. Aps 72
horas de incubao dos linfcitos estimulados, obtidos a partir do sangue perifrico na presena
do extrato de plen de abelha obtido de Salix alba, a contagem de microncleos no aumentou
significativamente, ao contrrio do observado na presena de bleomicina, utilizada como
controle positivo. Esse resultado indica que o extrato no foi capaz de induzir genotoxicidade
(40).
Por outro lado, a capacidade do plen e dos dois extratos etanlicos em proteger contra
a mutagnese induzida pelos quimioterpicos em trs diferentes concentraes (1, 10 e 100 g/
mL) foi apresentada como resultado do estudo (40). O extrato etanlico a 70% foi capaz de
evitar a genotoxicidade induzida pela bleomicina nas trs concentraes testadas. A toxicidade
induzida pela vincristina tambm foi evitada pelas trs concentraes testadas, porm, nesse
-
21
caso, o extrato que apresentou resultado significativo foi o extrato etanlico a 96%. J a
presena de microncleos induzidas por mitomicina C foi significativamente menor nas trs
concentraes do plen de abelha e do extrato etanlico a 70%. A diferena entre os resultados
dos extratos se d pela diferente concentrao de compostos fenlicos de acordo com a forma
e o solvente de extrao. Os resultados apresentados exploram no s a ausncia de
genotoxicidade do plen e dos extratos, mas tambm seu potencial em atuarem como protetores
frente toxicidade de agentes quimioterpicos (40).
4.3.1.5 Sensibilizao drmica
Dado no encontrado na literatura pesquisada. A ausncia desse tipo de estudo justifica-
se pela utilizao preferencialmente por via oral de formulaes contendo a espcie vegetal.
4.3.1.6 Irritao cutnea
Dado no encontrado na literatura pesquisada. A ausncia desse tipo de estudo justifica-
se pela utilizao preferencialmente por via oral de formulaes contendo a espcie vegetal.
4.3.1.7 Irritao ocular
Dado no encontrado na literatura pesquisada. A ausncia desse tipo de estudo justifica-
se pela utilizao preferencialmente por via oral de formulaes contendo a espcie vegetal.
4.3.2 Estudos farmacolgicos
4.3.2.1 Ensaios in vitro
Os ensaios farmacolgicos realizados in vitro foram os mais expressivos dentre os
ensaios no clnicos. Quinze diferentes estudos testaram as propriedades farmacolgicas da
espcie Salix alba frente a bactrias, fungos e culturas de diferentes tipos celulares. As
atividades farmacolgicas que se destacaram foram a atividade anti-inflamatria e a atividade
antioxidante, as quais se relacionam. Foram tambm observadas as atividades antimicrobiana,
antiestrognica e antiproliferativa. Todas elas seguem listadas no quadro 2.
Como esperado, pelo uso tradicional da espcie vegetal, uma das atividades mais
testadas foi a atividade anti-inflamatria. Assim como o cido saliccilico e outros anti-
inflamatrios no-esteroidais (AINES), esperava-se que o extrato vegetal de Salix alba tambm
-
22
atuasse principalmente inibindo as cicloxigenases (COX), enzimas essenciais para sntese das
prostaglandinas a partir da liberao do cido araquidnico pelas fosfolipases da membrana
celular. Entretanto, os estudos discutidos abaixo evidenciaram mecanismos anti-inflamatrios
muito mais complexos, ativados pelos extratos vegetais, o que pode ser explicado em parte pela
presena de outros compostos ativos alm dos salicilatos (48).
A inflamao um processo complexo e natural em resposta a uma srie de agentes
hostis aos quais os mamferos esto expostos, como parasitas, microorganismos, agentes
txicos e danos fsicos. Como resposta a esses agentes, so liberadas citocinas pelos macrfagos
e leuccitos, entre as quais se destacam o fator de necrose tumoral (TNF-), a interleucina-1
(IL-1) e a interleucina-6 (IL-6) (49, 50).
Fiebich e colaboradores (2004) analisaram o efeito do extrato etanlico da planta em
moncitos primrios de humanos. Os ensaios avaliaram a atividade das cicloxigenases 1 e 2
(COX-1 e COX-2) e liberao da prostaglandina E2 (PGE2) mediada pela COX-2. Para isso foi
utilizado o extrato comercial 1520L (Plantina GmbH,Munique, Alemanha), descrito como
efetivo no combate a dores por ensaios clnicos e j comercializado na Alemanha, o qual possui
indicao contra dor reumtica, febre e dores de cabea. Os moncitos foram pr-incubados
com o extrato em concentraes variando entre 10 e 500 g/ mL a fim de se determinar o IC50
com base em uma regresso linear. Os resultados obtidos foram comparados com padres de
salicina e salicilatos, alm de um anlogo do refocoxib (L745337). Foi demonstrado que so
necessrias concentraes superiores a cem vezes do extrato etanlico de Salix alba quando
comparado ao anlogo sinttico do anti-inflamatrio para inibir 50% da liberao da PGE2, o
que corresponde a dose utilizada do extrato (1600 mg) quando comparado ao frmaco (12,5
mg). Por outro lado, as doses testadas do extrato vegetal no demonstraram capacidade de
inibio da COX-1 ou da COX-2 (34).
Um estudo avaliou a atividade anti-inflamatria, tambm representada pela inibio da
COX-1 e COX-2 e da 5-lipoxigenase (5-LOX) em granulcitos humanos, alm da elastase
(HLE) em leuccitos humanos (39). Para isso, foram utilizadas cinco fraes do extrato aquoso
de Salix STW 33-I. Os extratos foram separados de acordo com a polaridade, utilizando-se
sequencialmente tolueno (frao A), acetato de etila (frao B), butanol (frao C) e etanol
(frao D), alm do extrato aquoso (frao E). A Frao A apresentou pequena quantidade de
salicina (0,4%) e indicou altas concentraes de polifenis indeterminados; a Frao B
apresentou concentrao de salicina de 9%, alm da presena de polifenis e flavonoides; as
-
23
Fraes C e D foram as que apresentaram maiores concentraes de salicina (23,6 e 25,2,
respectivamente), alm da presena de flavonoides; j na Frao E foram detectados 10,3% de
salicina e proantocianidinas. De acordo com os resultados apresentados pelos autores, houve
uma grande diferena no perfil inibitrio das ciclooxigenases de acordo com as fraes. As
fraes que apresentaram maiores inibies para COX-1, COX-2 e 5-LOX foram as fraes A
e B, exatamente aquelas com baixas concentraes de salicina, constitudas principalmente por
polifenis. J a inibio da elastase foi mais pronunciada utilizando-se a frao E, com
concentraes intermedirias de salicina, no entanto com presena de polifenis e
proantocianidinas (39).
Outro grupo publicou, posteriormente, a avaliao do mesmo extrato aquoso de Salix
comercializado (STW 33-I) (51), o qual foi separado em fraes de acordo com a metodologia
utilizada por Nahrstedt e colaboradores (2007), obtendo-se as seguintes concentraes de
salicina: 0,5% para Frao A; 1% para Frao B; 34,1% para Frao C; 37,5% para Frao D e
14,9% para Frao E. Nesse estudo, a atividade anti-inflamatria dos extratos foi avaliada em
clulas mononucleares ativadas com lipopolissacardeos (LPS), o qual ativa a liberao de
citocinas inflamatrias por meio da expresso do TNF-, do xido ntrico (NO) e a sntese de
prostaglandinas pela atividade da COX-1 e da COX-2 em moncitos. De forma semelhante ao
resultado descrito anteriormente, a Frao E foi a que inibiu a expresso dos marcadores
inflamatrios COX-2 e TNF- de forma mais expressiva e significativa, juntamente com o
extrato aquoso STW 33-I, sendo a inibio da COX-2 da ordem de 30-55% e a do TNF- da
ordem de 75-85%, resultados semelhantes aos encontrados ao tratar as clulas com diclofenaco
de sdio e cido acetil saliclico. Ademais, tanto o extrato quanto a Frao E foram capazes de
reduzir significativamente o aumento da formao de NO. Alm disso, foi avaliado o efeito do
extrato STW 33-I na translocao do NF-B do citoplasma para o ncleo, a qual foi evitada
pela presena do extrato de forma similar ao tratamento das clulas com diclofenaco (51).
Knuth e colaboradores, em 2011(52), isolaram o glicosdeo fenlico salicortina a partir
da casca de Salix alba a fim de avaliar a expresso de ICAM-1 induzido por TNF- em clulas
endoteliais humanas (HMEC-1). Como resultado, foi observado que a presena da salicortina
diminuiu a expresso do ICAM de maneira dose-dependente entre 10 e 75 M. A concentrao
de 50 M reduziu a expresso do marcador (52,4%), enquanto a salicina e o cido salicico no
apresentaram reduo significativa (52).
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24
A atividade anti-inflamatria do extrato de Salix alba, entre outras espcies, foi tambm
avaliada por meio da ativao do NF-B induzida por IL-1 em um modelo in vitro de
condrcitos caninos (38) Essa ativao parece estar relacionada ao efeito inflamatrio
observado na osteoartrite. O extrato, na concentrao de 10 g/ mL, se mostrou capaz de evitar
mecanismos inflamatrios. Sob condies experimentais houve inibio da citotoxicidade
induzida pelo IL-1 (avaliada pelo ensaio do MTT), alm de antagonizar a regulao positiva
da COX-2 por prevenir a degradao do IB e a ativao do NF-B. Ademais, as clulas
tratadas com o extrato botnico se rediferenciaram em condrcitos e produziram uma matriz
cartilaginosa, indicando o potencial teraputico do extrato vegetal para tratamento da osteortrite
(38).
A atividade anti-inflamatria do extrato de salgueiro branco e seus principais polifenis
(quercetina, apigenina e cido saliclico) tambm foi avaliada pelo grupo de Drummond (2013)
por meio das citocinas IL-1, IL-6 e TNF- em uma linhagem celular de leucemia monoctica
humana denominada THP1. Em concentraes de 10 mM tanto a apigenina quanto a quercetina
foram capazes de reduzir a IL-6 significativamente, j o TNF- foi reduzido significativamente
frente a concentraes de 10 mM de apigenina e 25 mM de quercetina. Em comparao a outras
espcies vegetais testadas (camomila e ulmeira), o salgueiro apresentou maior atividade anti-
inflamatria por diminuir em maior proporo a atividade da IL- e do TNF- (24).
A atividade anti-inflamatria e antioxidante de Salix alba foi avaliada (37), utilizando
neutrfilo de ovinos, mediante imunomodulao realizada por essas clulas. Os neutrfilos so
responsveis pela resposta imune inata e so ativados por um mecanismo que envolve fases
distintas: rolagem, ativao, adeso e transmigrao. Eles atuam na defesa contra bactrias e
parasitas, alm disso, atuam tambm na ativao de mecanismos anti-inflamatrios. A atividade
do extrato e hidroetanlico de Salix alba e de outras espcies vegetais foi avaliada por meio da
viabilidade dos neutrfilos, pelo ensaio de adeso e pela produo do radical superxido (53).
A viabilidade dos neutrfilos foi inibida de maneira dose-dependente pelo extrato e a inibio
alcanou aproximadamente 65% com a concentrao mais alta testada (60 g/ mL). Ademais,
o extrato de S. alba tambm bloqueou fortemente a adeso dos neutrfilos e a produo do
radical livre superxido, com uma IC50 de apenas 17,77 g/ mL e 55,94 g/ mL,
respectivamente. O estudo relacionou os resultados obtidos eficiente atividade anti-
inflamatria do extrato, o qual possivelmente se deve presena de flavonoides e compostos
fenlicos no extrato hidroetanlico analisado (37).
-
25
Entre todos os estudos analisados, tm-se em comum que o extrato de Salix alba
apresentou atividade anti-inflamatria satisfatria em diferentes modelos in vitro. Em relao
ao mecanismo de ao antiinflamatrio, ressalta-se no apenas o mecanismo direto, por meio
da ativao via citocinas, mas tambm as vias que ativao pelos mecanismo de estresse
oxidativo, uma vez que a salicina nem sempre foi composto responsvel pela atividade anti-
inflamatria, mas tambm outros compostos presentes no extrato, como os polifenis, que
possuem reconhecida atividade antioxidante.
Outra importante atividade relatada foi a atividade antioxidante, a qual tambm pode
estar relacionada ativao de mecanismos inflamatrios. A produo exacerbada de radicais
livres est envolvida na mediao do processo inflamatrio por meio da ativao do NF-B e
do TNF-.
Kong e colaboradores (2014) publicaram recentemente, entre outros achados, a
influncia da salicina na gerao de radicais livres (54). Para isso, eles utilizaram cultura de
clulas originadas da veia endotelial do cordo umbilical humano (clulas ECV304), as quais
foram analisadas por microscopia de fluorescncia aps incubao com perxido de hidrognio
(indutor de estresse oxidativo) e 2,7-diacetato de diclorofluoroscena (DCFH-DA). A
intensidade da fluorescncia proporcional produo de radicais livres, ou espcies reativas
de oxignio, e essas possuem um importante papel na angiognese tumoral e regulam as vias
de sinalizao intracelular, que ativa mecanismos inflamatrios. De acordo com os resultados
observados, a salicina na dose de 2 mM reduziu significativamente a formao de radicais livres
induzida por H2O2 (54).
O grupo de Nahrsted, alm de avaliar a atividade antiinflamatria das 5 fraes do
extrato de Salix alba, conforme citado anteriormente, tambm avaliou a capacidade das fraes
em inibir a formao de radicais livres induzidos por 2,2-azobis(2-amidinoppropano)
diidrocloreto (AAPH) ou pela reao xantina-xantina oxidase (39). Esta atividade foi mais
pronunciada nas fraes A e B, ricas em polifenis e flavonoides, o que corrobora com a
informao de que a ao do extrato no se deve apenas ao princpio ativo salicina, mas ao
conjunto de compostos presentes na planta, destacando-se os flavonoides e polifenis (39).
Cinco diferentes extratos comerciais de Salix alba foram avaliados quanto atividade
antioxidante (10) , sendo eles de duas amostras de extrato hidroalcolico, de uma amostra da
casca seca utilizada para decoco e de duas amostras de extrato seco comercializadas na forma
de cpsulas. As amostras foram solubilizadas em metanol na mesma concentrao final (30 mg/
-
26
mL, com utilizao de 30 L da soluo) e posteriormente foi analisada a quantidade de salicina
em cada uma por HPLC. A atividade antioxidante foi verificada pela capacidade de reduo do
radical livre ABTS+, utilizando HPLC acoplado a malha de diodos (HPLC-PDA). Como
resultado, foi observado que a concentrao de salicina nos extratos variou consideravelmente,
entre 1,68% e 25,59%, com maiores concentraes de salicina para as preparaes
comercializadas na forma de cpsulas. Alm disso, o fingerprint das preparaes demonstrou
presena de outros compostos como catequina, sirigenina, triangina e cido benzoico. Dentre
as preparaes, o extrato hidroalcolico e o extrato seco para decoco foram os que
apresentaram melhor atividade sequestradora de radicais livres, o que se deve principalmente a
presena de catequina (10).
Tambm em 2012, o grupo de Jukic publicou um estudo relatando as propriedades dos
extratos de plantas medicinais utilizadas na Crocia, incluindo a Salix alba, e testou sua
atividade antioxidante. Neste estudo, a atividade antioxidante foi avaliada por dois diferentes
mtodos, pelo sequestro do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) e pela reduo do
complexo de on frrico a on ferroso por antioxidantes. Entre as 16 espcies nativas analisadas,
o extrato de Salix alba foi o que demonstrou melhor atividade antioxidante de acordo com as
duas metodologias. Em linha com os estudos j citados, essa atividade tambm foi relacionada
presena de fenis totais, uma vez que esta espcie apresentou a maior quantidade de fenis
totais entre as avaliadas (55). Metodologia semelhante foi utilizada pelo grupo de Sulaiman,
que tambm avaliou o sequestro do radical DPPH pelo extrato de Salix alba, de acordo com os
resultados desse estudo a capacidade de sequestro do radical livre alcanou 80% na
concentrao de 100 g/ mL do extrato etanlico da planta. Nesse caso, mais um autor relata a
correlao entre a alta concentrao de glicosdeos fenlicos e a capacidade de sequestrar
radicais livres (21).
Em resumo, pode-se inferir que os extratos de Salix alba possuem considervel
capacidade antioxidante relatada por diversos autores, utilizando diferentes mtodos, e que esta
capacidade pode tambm influenciar na atividade anti-inflamatria relatada pela espcie
vegetal, pois consiste em um importante sinalizador dos mecanismos intracelulares
responsveis pela resposta inflamatria. Ademais, essa atividade no parece estar relacionada
apenas concentrao de salicina presente em cada extrato, mas tambm a presena de outros
compostos, entre os quais se destacam os fenis.
-
27
O mesmo trabalho de Sulaiman e colaboradores (21), descrito anteriormente por avaliar
a atividade antioxidante, avaliou as atividades antimicrobiana e antiproliferativa do extrato de
S. alba. A atividade antimicrobina foi avaliada frente a cepas bactrias e de um fungo, foram
elas: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae e Candida albicans (fungo). A avaliao foi realizada utilizando placa de gar, e
as concentraes do extrato etanlico de S. alba utilizadas foram de 10, 20, 40, 60 e 80 mg/ mL
e a zona de inibio foi avaliada aps incubao overnight das placas. Os resultados mostraram
maior halo de inibio para Candida albicans tratada com extrato de S. alba na concentrao
de 80 mg/ mL. Alm disso, todas as concentraes testadas apresentaram halo de inibio
significativo para S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans. O crescimento de E. coli e K.
pneumoniae no foi afetado por nenhuma das concentraes testadas. J a atividade
antiproliferativa foi avaliada pela viabilidade celular de uma linhagem de clulas humanas
derivada de leucemia promielide, HL-60. As clulas (densidade de 1,5 x 105 clulas) foram
incubadas com concentraes entre 1 e 10 g/ mL e a viabilidade foi avaliada por azul de
Trypan aps 12 e 24 horas de incubao. A viabilidade foi diminuda de maneira dose
dependente, a morte das clulas tumorais tratadas com extrato etanlico de S. alba chegou a
84% ao se utilizar a concentrao de 10 g/ mL aps 24 horas. No entanto, a viabilidade celular
nesse estudo no foi avaliada em outas linhagens de clulas no tumorais, ficando evidenciado
apenas o potencial antiproliferativo contra HL-60, porm sem se evidenciar o potencial txico
para clulas no-tumorais (21).
O artigo publicado pelo grupo de Raiciu (2010) tambm avaliou a atividade
antimicrobiana do extrato aquoso de Salix alba e outras espcies vegetais contra quatro
diferentes bactrias (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e
Bacillus subtilis) e dois fungos (Aspergillus niger e Candida albicans). Aps 24 a 48 horas da
incubao dos micro-organismos com uma concentrao correspondente a 0,5 da escala de
MacFarland com diluies de 1:10, 1:100 e 1:1000 do extrato vegetal nos gares adequados
para o crescimento de cada micro-organismo, os halos de inibio foram analisados e no houve
nenhuma induo da inibio de crescimento das bactrias e dos fungos, diferentemente do
observado por Sulaiman et al. (2010). Destaca-se, porm, a diferena no tipo de extrato
utilizado, o que pode resultar na presena de diferentes compostos. No caso do estudo de Raiciu
e colaboradores (20), foi descrita a presena de salicosdeos, cido cumrico, cido ferrlico,
quempeferol e taninos no extrato de Salix alba.
-
28
A atividade do extrato seco de Salix alba solubilizado em NaCl 0,9% tambm foi
avaliada frente cepa de E. coli pelo grupo de Souza (2009), porm com outra abordagem.
Nesse estudo, o extrato vegetal foi testado com o objetivo de avaliar a reduo dos efeitos
genotxicos e citotxicos induzidos pelo cloreto estanhoso (SnCl2), uma vez que este utilizado
como agente redutor a fim de se obter o radioistopo tecncio-99, utilizado em radioterapia.
Em humanos, esses efeitos incluem irritao da mucosa e da pele e em animais foi relatado
estmulo ou depresso do sistema nervoso central, o objeto de estudo foram bactrias, pois o
SnCl2 parece ser capaz de causar danos ao DNA, sendo considerado um potencial agente
genotxico, o que pode ser atribudo ao aumento na produo de radicais livres. Os resultados
compararam grupos que receberam apenas SnCl2 (25 g/ mol) e grupos que receberam SnCl2 e
extrato de Salix alba (25g/ mol e 11,6 mg/ mL, respectivamente) aps incubao overnight.
Observou-se que o presena do extrato vegetal no foi capaz de impedir a morte das bactrias
induzida pelo SnCl2, por outro lado tambm no interferiu na curva de crescimento da E. coli
por si s. O estudo, por sua vez apresentou resultado de apenas uma concentrao do extrato e
no avaliou o resultado em clulas humanas, o que levaria a um resultado que melhor permitiria
inferir sobre a proteo contra os danos relacionados radioterapia (33).
Outra atividade avaliada por dois diferentes artigos para o extrato de Salix alba foi a
atividade anticolinestersica (31, 55). Ambos levaram em considerao as plantas locais, porm
em pases distintos, Crocia e Ir. A busca por compostos que inibam a atividade da
acetilcolinesterase justifica-se pela relao que parece haver entre um dos mecanismos
patofisiolgicos da doena de Alzheimer e a diminuio dos nveis de acetilcolina em algumas
reas do crebro. A acetilcolinesterase (AChE) a enzima responsvel pela hidrlise
metablica da acetilcolina nas sinapses colinrginas, desta forma, a inibio da atividade da
AChE pode levar a um aumento na intensidade e na durao das sinapses colinrgicas,
possibilitando uma estratgia no combate Doena de Alzheimer. Os resultados observados
em ambos os estudos esto descritos nos pargrafos seguintes. (31, 55).
A fim de avaliar o potencial do extrato de plantas medicinais comumente utilizadas na
Crocia com potencial para o tratamento da doena de Alzheimer, foi avaliada no apenas a
atividade antioxidante do extrato de S. alba, mas tambm sua capacidade em inibir a atividade
da AChE (55). Os resultados mostraram que, entre as espcies analisadas, apenas o extrato
metanlico de Salix alba apresentou atividade considervel na inibio da AChE, a qual
-
29
alcanou 50,8% de inibio na concentrao de 1 mg/ mL do extrato. Para os outros extratos de
plantas analisados, a inibio foi inferior a 20% (55).
Da mesma forma, em busca de uma estratgia proveniente de planta medicinal que
poderia ser utilizada no combate Doena de Alzheimer, um estudo avaliou a capacidade de
inibio da AChE dos extratos metanlicos de dezoito plantas utilizadas no Ir (31) .
Nos dois estudos citados acima (31, 55) foi utilizado o mtodo de Ellman e os resultados
obtidos foram semelhantes. No estudo mais recente (31), a concentrao do extrato de Salix
alba, necessria para inibir 50% das enzimas (IC50), foi de aproximadamente 990 g/ mL, o
que os autores consideram como uma concentrao alta. Nesse caso, outras plantas medicinais
que apresentaram resultados mais satisfatrios como Camellia sinensis (IC50 5,96 g/ mL),
Citrus aurantifolia (IC50 19,57 g/ mL), Zizyphus vulgaris (IC50 24,37 g/ mL), Brassica nigra
(IC50 84,30 g/ mL) e Rosa damascena (IC50 93,10 g/ mL), no foram analisadas no estudo
de Jukic e colaboradores (2012) (31, 55).
Apesar de no estar relacionado entre os usos populares da planta, o grupo de Nizard
publicou, em 2004 (56), um trabalho descrevendo influncia do extrato de Salix alba na
produo de colgeno e modulao de fibroblastos derivados de clulas drmicas cultivadas a
partir da doao de pacientes jovens e idosos que passaram por cirurgia plstica. As clulas
foram cultivadas e foi avaliada a expresso da heat shock protein (HSP-47), protena que
interage com o pr-colgeno de clulas. Com o avano da idade, a expresso dessa protena
diminui, o que caracterizado pela compactao do colgeno e aspecto envelhecido da pele.
Para o ensaio, as clulas foram incubadas com 2% do extrato de Salix alba, por 6 horas. De
acordo com os resultados, o tratamento como extrato vegetal aumentou significativamente a
expresso da HSP-47 em clulas de doadoras idosas (70 anos), porm no alterou a expresso
em clulas provenientes de jovens (20 anos) sugerindo que o extrato pode atuar na proteo
contra a degradao da HSP-47 e de outras protenas, provavelmente influenciada pela
capacidade de sequestrar radicais livres e melhorar a influncia do envelhecimento no aspecto
da pele, sendo assim, um produto de interesse a ser explorado no campo dermatolgico (56).
O estudo de Pinto e colaboradores (40), j citado anteriormente por avaliar a atividade
antigenotxica, destaca-se por utilizar o extrato obtido a partir do plen de abelha de Salix alba,
e no o extrato proveniente da casca de salgueiro, como a maioria dos outros. O trabalho aparece
tambm nesta seo por avaliar a atividade antiestrognica do extrato do plen utilizando a cepa
RMY326 do fungo Saccharomyces cerevisae, que contm receptor para estrgeno humano. Os
-
30
dois extratos avaliados (extrato etanlico a 70% - extrato 1; extrato etanlico a 96% - extrato
2) no mostraram aumento significativo na atividade estrognica.Por outro lado, a inibio da
atividade da -galactosidase se deu de maneira dose-dependente para os dois extratos com
inibio mais pronunciada para a concentrao de 660 g/ mL do extrato 2. A atividade
antiestrognica do plen da espcie vegetal foi descrita pelos autores como caracterstica da
grande concentrao de flavonoides na planta. O fato de no apresentar atividade estrognica
(atua como um efetivo inibidor de estrgeno) permite que o plen obtido a partir de Salix alba
seja de ingesto segura, uma vez que no seria um promotor para o cncer de mama, alm de
possibilitar seu emprego na quimiopreveno para cnceres dependente de estrgeno (de mama,
por exemplo) em casos de risco aumentado pela ingesto de compostos com atividade
estrognica agonista (40).
-
31
Tabela 2 Resumo das atividades descritas em estudos farmacolgicos in vitro envolvendo a espcie vegetal Salix alba encontrados na literatura
pesquisada.
Ref. Atividade Extrato Concentrao Metodologia Material Quantidade
Parmetr
os
observado
s
Resultado Observado
Atividade anti-inflamatria
34 Atividade
anti-
inflamatria
Extrato
aquoso
10 - 500 g/ mL
A atividade antiiflamatria
in vitro do extrato etanlico
de Salix 1520L foi avaliado
como descrito anteriormente
pelos autores e utilizado para
incubao dos moncitos e
avaliao dos pamentros
inflamatrios.
Moncitos
humanos
primrios
N.D.
Atividade
da COX1,
COX-2,
IL-1 e IL-6
Os resultados demosntraram que
a atividade anti-inflamatria do
extrato est relacionada a
inibio PGE2. A atividade das
enzimas COX no foram
significativamente alteradas,
entretanto houve induo das
IL-1 e IL-6.
39 Atividade
anti-
inflamatria
Fraes do
extrato
aquoso
STW 33-I
A estimativa
do EC50 para
o extrato de
acordo com os
testes para o
extrato foi de
100 g/ mL
para COX-1,
800 g/ mL
para COX-2,
30 g/ mL
para 5-LOX e
60 g/ mL
para HLE.
O efeito inibitrio do extrato
e das diferentes fraes foi
observado nas
cicloxigenases COX-1 e
COX-2 e na lipoxigenase 5-
LOX. A expresso de genes
mediadores de inflamao
foi avaliada pela de apoptose
de moncitos estimulados
por LPS.
N.D. N.D.
Inibio de
COX-1,
COX-2 e
5-LOX
A maior inibio da COX foi
observada para a frao A
9COX-1) e frao B (COX-2 e
5-LOX). A apoptose foi inibida
significativamente pelo extrato e
pela frao E, de modo similar
ao diclofenaco (dado no
apresentado em grfico, no
descreve a concentrao).
-
32
51 Atividade
anti-
inflamatria
Extrato
comercial
de Salix
0,1 a 10 g/ mL
Alm do extrato foram
obtidas 5 fraes do mesmo
com diferentes polaridades:
FrA (0.5%), B(13%),
C(34.1%), D(37.5%),
utilizando, respectivamente,
tolueno, acetato de etila,
butanol, etanol e a ltima
frao utilizando gua: Fr E
(14.9%)
Clulas
mononucleares
obtidas do
sangue
perifrico de
voluntrios
humanos
N.D.
Expresso
de TNF, produo
de nitrito,
apoptose,
localizao
intracelula
r do NF-
B
O extrato de STW33-I possui
ao anti-inflamatria tanto
sobre os moncitos no ativados
como sobre macrfagos
induzidos. A atividade foi
significativa para os ensaios
testados apenas na maior
concentrao 10 g/ mL tanto para o extrato como para suas
fraes.
52 Atividade
anti-
inflamatria
O
glicosdeo
fenlico
salicortina
foi isolado
a partir do
extrato da
casca de
salgueiro.
No foi
descrita a
forma de
obteno
do extrato.
10, 25, 50 e 75
M
As clulas foram tratadas
com salicortina e 30 minutos
aps foram adicionados
10de TNF- a fim de ativar
a expresso do ICAM-1. Em
seguida as clulas foram
incubadas com FITC
marcado com aticorpo anti-
ICAM-1, aps 20 minutos a
intensidade da fluorescncia
foi medida por citometria de
fluxo.
Clulas
endoteliais
microvasculares
humanas
(HMEC-1)
At confluncia
Degrada
o da
salicortina
e inibio
da ICAM-
1
A salicortina diminuiu a
expresso de ICAM-1 de
maneira dose-dependente.
38 Atividade
anti-
inflamatria
Extrato
lquido 10 g/ mL
Condrcitos cultivados em
meio com ausncia de soro
(passagem 2, cultivadas em
3% soro fetal de bezerro)
foram tratadas com os
extratos (10 g/ mL)
sozinhas por 24 h (pr-
tratamneto) e em seguida
com uma combinao de
extratos botnicos (10 g/
mL) e IL-1 (10 ng/ mL)
Condrcitos de
ces foram
isolados das
articulaes de
cachorros
submetidos a
cirurgias
ortopdicas na
clnica de
cirurgia
veterinria da
Universidade
0,1 106 cells/
mL
Ensaio de
MTT,
imunofluo-
rescncia e
western-
blotting e
microscopi
a
eletrnica
O extrato se mostrou
condroprotetor evitando
mecanismos inflamatrios. Sob
condies experimentais houve
inibio do IL-1, alm de
antagonizar a regulao positiva
do MMP-9, MMP-13 e COX-
2.A IL-1, induziu a ativao
do NF-B e a degradao do
IB foi inibida pelo extrato, as
clulas tratadas com o extrato
botnico se rediferenciaram em
-
33
pelas 48h seguintes em
cultura.
Ludwig-
Maximilian-
University, em
Munique,
Alemanha.
condrcitos e produziram uma
matriz cartilaginosa.
24 Atividade
anti-
inflamatria
Extrato
aquoso 0-50 M
As clulas foram tratadas
inicialmente com os fenis
isolados de apigenina,
quercetina e cido saliclico
a fim de estabelecer a
concentrao dose-resposta.
Aps a obteno desses
dados as clulas foram
tratadas com as mesmas
concentraes dos extratos
contendo os polifenis.
Clulas THP1 e
linfcitos B
humanos
4 x 104/ mL para
as clulas
THP1, os
linfcitos foram
utilizados
apenas para o
ensaio do
cometa
Viabilida-
de celular
(MTT),
determina
o de IL-
1, IL-6 e
TNF- e
genotoxi-
cidade
(ensaio do
cometa)
Os extratos testados
apresentaram no apenas
atividade anti-inflamatria ao
diminuir a expresso das
citocinas avaliadas, mas tambm
mostraram-se no-citotxicos e
apresentaram atividade
antioxidante. Dentre os extratos
testados (camomila, ulmeira e
salgueiro branco) o de salgueiro
branco apresentou mais potente
atividade anti-inflamatria,
diminuindo em maior proporo
a atividade da IL-6 e do TNF-.
37
Atividade
anti-
inflamatria
Extrato
reconsti-
tudo de S.
alba
2,3; 6,7; 20,0;
60,0; 180,0
g/ mL
Antes dos experimentos os
extratos aquosos foram
dissolvidos em gua na
concentrao de 25 mg/ mL
e os extratos etanlicos
dissolvidos em DMSO na
concentrao de 50 mg/ mL.
Todas as solues foram
esterilizadas utilizando
filtros de 0,22 m. Pequenas alquotas foram estocadas no
escuro a -20C para posterior
realizao dos experimentos.
Neutrfilos
obtidos de
ovelhas
2 x 106/ mL
Ensaio de
viabilidade
, ensaio de
adeso e
produo
de
superxido
Os extratos hidroetanlicos de
Salix alba reduziram a atividade
dos neutrfilos de maneira dose-
dependente, com uma reduo
maior que 60% na maior dose.
O extrato de S. alba no penas
diminuiu a adeso dos
neutrfilos como tambm
diminuiu a produo de
superxido. O extrato possui
alta atividade anti-inflamatria
sobre os neutrfilos de ovelhas.
-
34
Atividade antioxidante
54 Atividade
antioxidante
Foi
utilizada
salicina
isolada
obtida
comercial
mente
(Sigma-
Aldrich)
1 ou 2mM de
salicina
Clulas venosas endoteliais
originadas do cordo
umbilical humano (ECV304)
foram cultivadas em meio
adequado e posteriomente
utilizadas para o ensaio de
migrao, de crescimento
em tubo e de estresse
oxidativo.
Clulas venosas
endoteliais
originadas do
cordo
umbilical
humano
(ECV304)
At confluncia
Migrao
celular,
cresciment
o em tubo
e de
estresse
oxidativo
e western-
blotting
para os
seguintes
anticorpos:
anti-
pERK,
anti-ERK,
anti-
pAKT,
anti-AKT
e anti--
tubulina.
A presena de salicina diminuiu