MINISTRIO DA SADE

MONOGRAFIA DA ESPCIE Salix alba (SALGUEIRO

BRANCO)

Organizao: Ministrio da Sade

Fonte do recurso: DIREB-002-FIO-13

Braslia

2015

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 rvore e ramos de Salix alba.................................................................................1

Figura 2 Mapa da distribuio geogrfica da espcie vegetal..............................................2

Figura 3 Aspectos macroscpicos e microscpicos em Salix alba L conforme Farmacopeia

Brasileira.............................................................................................................................. 6

Figura 4 Estrutura qumica dos componentes qumicos majoritrios presentes na espcie Salix

alba. Adaptado de WHO, 2009.......................................................................................... 12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Limites microbiolgicos recomendados para plantas medicinais (Adaptado de Arajo

e Baubi, 2012).......................................................................................................................9

Tabela 2 Resumo das atividades descritas em estudos farmacolgicos in vitro envolvendo a

espcie vegetal Salix alba encontrados na literatura pesquisada....................................... 31

Tabela 3 Resumo das atividades descritas em estudos farmacolgicos in vivo envolvendo a

espcie vegetal Salix alba encontrados na literatura pesquisada....................................... 44

Tabela 4 Formas farmacuticas de Salix alba obtidas a partir da literatura pesquisada.....55

ABREVIATURAS

AAPH - 2,2-azobis(2-amidinoppropano) diidrocloreto

AAS - cido acetilsaliclico

AChE - Acetilcolinesterase

AINES - Anti-inflamatrios no-esteroidais

Anvisa Agncia nacional de Vigilncia Sanitria

CCD - Cromatografia em Camada Delgada

CLAE/HPLC - Cromatografia Lquida de Alta Eficincia/ High Performance Liquid

Cromatography

COX- cicloxigenase

DCFH-DA - 2,7-diacetato de diclorofluoroscena

DNA - cido desoxirribonuclico

DPPH - 2,2-difenil-1-picril-hidrazil

EMeA - European Medicines Agency

EPO - European Patent Office

GSH - Glutationa

HLE - elastase

HSP-47 - Heat Shock Protein

ICAM-1 - Molcula de Adeso Intracelular

IC50 ndice de Inibio 50%

IL - interleucina

IN - Instruo Normativa

INPI - Instituto Nacional de Propriedade Industrial

I.P. - Intraperitoneal

IPNI - International Plant Names Index

JPO - Japan Patent Office

LPS - lipopolissacardeos

MDA - Malondialdedo

MF - Medicamentos Fitoterpicos

MTT - brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazlio

NF-B - Fator Nuclear kappa B

NO - xido Ntrico

OMS - Organizao Mundial de Sade

PGE2 - Prostaglandina E2

PTF - Produtos Tradicionais Fitoterpicos

RDC - Resoluo da Diretoria Colegiada

Rename - Relao Nacional de Medicamentos Essenciais

SOD - Superxido dismutase

TNF- - Fator de Necrose Tumoral

UFC - Unidades Formadoras de Colnia

USPTO - U.S. Patent and Trademark Office

VEGF - Fator de crescimento vascular endotelial

V.O. - Via oral

WHO - World Health Organization

WIPO - World Intellectual Property Organization

SUMRIO

1 IDENTIFICAO ...............................................................................................................1

1.1 NOMENCLATURA BOTNICA ....................................................................................1

1.2 SINONMIA BOTNICA ................................................................................................1

1.3 FAMLIA ..........................................................................................................................1

1.4 FOTO DA PLANTA .........................................................................................................1

1.5 NOMENCLATURA POPULAR ......................................................................................2

1.6 DISTRIBUIO GEOGRFICA ....................................................................................2

1.7 OUTRAS ESPCIES CORRELATAS DO GNERO, NATIVAS OU EXTICAS

ADAPTADAS .........................................................................................................................2

2 INFORMAOES BOTNICAS ..........................................................................................3

2.1 PARTE UTILIZADA / RGO VEGETAL ...................................................................3

2.2 DESCRIO MACROSCPICA DA PARTE DA PLANTA UTILIZADA .................3

2.3 DESCRIO MICROSCPICA DA PARTE DA PLANTA UTILIZADA ...................3

2.3.1 Descrio microscpica do p ........................................................................................5

2.4 INFORMAES SOBRE POSSVEIS ESPCIES VEGETAIS SIMILARES QUE

POSSAM SER UTILIZADAS COMO ADULTERANTES ..................................................7

3 INFORMAES DE CONTROLE DE QUALIDADE ......................................................7

3.1 ESPCIE VEGETAL / DROGA VEGETAL ...................................................................7

3.1.1 Caracteres organolpticos ...............................................................................................7

3.1.2 Requisitos de pureza .......................................................................................................7

3.1.2.1 Perfil de contaminantes comuns ..................................................................................7

3.1.2.2 Microbiolgico ............................................................................................................7

3.1.2.3 Teor de umidade ..........................................................................................................9

3.1.2.4 Metal pesado ...............................................................................................................9

3.1.2.5 Resduos qumicos ....................................................................................................10

3.1.2.6 Cinzas........................................................................................................................10

3.1.3 Granulometria ..............................................................................................................10

3.1.4 Prospeco fitoqumica ................................................................................................10

3.1.5 Testes fsico-qumicos ..................................................................................................10

3.1.6 Testes de identificao .................................................................................................10

3.1.7 Testes de quantificao ................................................................................................11

3.1.7.1 Componentes qumicos e suas concentraes: descritos e majoritrios, ativos ou no

...............................................................................................................................................11

3.2 DERIVADO VEGETAL ................................................................................................12

3.2.1 Descrio .....................................................................................................................12

3.2.2 Mtodo de obteno .....................................................................................................12

3.2.3 Caracteres organolpticos ............................................................................................15

3.2.4 Testes de identificao .................................................................................................15

3.2.5 Testes de quantificao ................................................................................................16

3.2.5.1 Componentes qumicos e suas concentraes: descritos e majoritrios, ativos ou

no.........................................................................................................................................16

3.3 PRODUTO FINAL ........................................................................................................16

3.3.1 Forma farmacutica .....................................................................................................16

3.3.2 Testes especficos por forma farmacutica .................................................................17

4 INFORMAES DE SEGURANA E EFICCIA .......................................................17

4.1 USOS POPULARES / TRADICIONAIS .....................................................................17

4.2 PRESENA NA NOTIFICAO DE DROGAS VEGETAIS ...................................17

4.3 ESTUDOS NO-CLNICOS .......................................................................................19

4.3.1 Estudos toxicolgicos ...................................................................................................19

4.3.1.1 Toxicidade aguda .......................................................................................................19

4.3.1.2 Toxicidade subcrnica ...............................................................................................19

4.3.1.3 Toxicidade crnica .....................................................................................................20

4.3.1.4 Genotoxicidade ..........................................................................................................20

4.3.1.5 Sensibilizao drmica ..............................................................................................21

4.3.1.6 Irritao cutnea ........................................................................................................21

4.3.1.7 Irritao ocular ...........................................................................................................21

4.3.2 Estudos farmacolgicos ................................................................................................21

4.3.2.1 Ensaios in vitro ..........................................................................................................21

4.3.2.2 Ensaios in vivo ..........................................................................................................40

4.3.2.3 Ensaios ex vivo ..........................................................................................................43

4.4 ESTUDOS CLNICOS ...................................................................................................47

4.4.1 Fase I ............................................................................................................................47

4.4.2 Fase II ...........................................................................................................................48

4.4.3 Fase III .........................................................................................................................50

4.4.4 Fase IV .........................................................................................................................51

4.4.5 Estudos observacionais ................................................................................................51

4.5 RESUMO DAS AES E INDICAES POR DERIVADO DE DROGA ESTUDADO

................................................................................................................................................52

4.5.1 Vias de Administrao .................................................................................................52

4.5.2 Dose Diria ..................................................................................................................52

4.5.3 Posologia (Dose e Intervalo) ........................................................................................52

4.5.4 Perodo de Utilizao ...................................................................................................53

4.5.5 Contra Indicaes .........................................................................................................53

4.5.6 Grupos de Risco.............................................................................................................53

4.5.7 Precaues de Uso ........................................................................................................53

4.5.8 Efeitos Adversos Relatados ..........................................................................................53

4.5.9 Interaes Medicamentosas ..........................................................................................53

4.5.9.1 Descritas ....................................................................................................................53

4.5.9.2 Potenciais ...................................................................................................................54

4.5.10 Informaes de Superdosagem ...................................................................................54

4.5.10.1 Descrio do quadro clnico .....................................................................................54

4.5.10.2 Aes a serem tomadas ............................................................................................55

5 INFORMAES GERAIS ................................................................................................55

5.1 FORMAS FARMACUTICAS /FORMULAES DESCRITAS NA LITERATURA..55

5.2 PRODUTOS REGISTRADOS NA ANVISA E OUTRAS AGNCIAS

REGULADORAS....................................................................................................................56

5.3 EMBALAGEM E ARMAZENAMENTO .......................................................................57

5.4 ROTULAGEM .................................................................................................................57

5.5 MONOGRAFIAS EM COMPNDIOS OFICIAIS E NO OFICIAIS ..........................57

5.6 PATENTES SOLICITADAS PARA A ESPCIE VEGETAL........................................57

1

1 IDENTIFICAO

1.1 NOMENCLATURA BOTNICA

Salix alba L. (1).

1.2 SINONMIA BOTNICA

A busca por sinnimos foi realizada nas bases de dados Flora do Brasil, Tropicos e

International Plant Names Index (IPNI), porm no foram identificadas sinonmias botnicas

para a espcie Salix alba (1-3).

1.3 FAMLIA

Saliaceae (4).

1.4 FOTO DA PLANTA

Figura 1 rvore (Fonte: MOBOT (5)) e ramos de Salix alba L. (Fonte: Tropicos (3))

1.5 NOMENCLATURA POPULAR

Salgueiro branco (4).

2

1.6 DISTRIBUIO GEOGRFICA

Salix alba uma espcie nativa da regio central e Sul da Europa, sia Central e

nordeste da frica. Ela foi levada aos Estados Unidos nos idos de 1700 por imigrantes europeus

e se disseminou em diversas partes da Amrica (5-8).

As espcies de Salix esto localizadas preferencialmente em regies temperadas do

hemisfrio Norte e crescem preferencialmente em regies midas (6).

Figura 2 Mapa da distribuio geogrfica da espcie vegetal (Fonte: Tropicos (3))

1.7 OUTRAS ESPCIES CORRELATAS DO GNERO, NATIVAS OU EXTICAS

ADAPTADAS

O gnero Salix contempla mais de 400 espcies, distribudas principalmente na Amrica

do Norte, Europa e China. As espcies do gnero no so comumente encontradas em regies

tropicais, havendo apenas trs espcies nativas das Amricas Central e do Sul (8).

Outras espcies correlatas ao gnero e tambm utilizadas com fim medicinal so Salix

daphnoides, Salix fragilis e Salix purpurea (7, 9-12). Estudos filogenticos indicam que a S.

fragilis derivada dos progenitores de S. alba, o que pode ser indicado pela semelhana

gentica entre as espcies (13).

3

2 INFORMAOES BOTNICAS

As espcies de Salix so caracterizadas por rvores de at 25 metros com folhas

decduas, normalmente pecioladas, simples, lineares a ovaladas com margens inteiras a

serradas. As inflorescncias so pequenas e podem emergir antes, ao mesmo tempo ou aps as

folhas. J as flores so individuais e no apresentam ptalas. Possui frutos capsulados com

muitas sementes (7).

Salix alba caracteriza-se por ser uma rvore grande com tronco curto, com ramos de

colorao marrom-amarelados, folhas elpticas e lanceoladas, acuminadas e serradas, com pelos

sercios e colorao acinzentada. Os frutos so capsulados e possuem inmeras sementes (7).

2.1 PARTE UTILIZADA / RGO VEGETAL

A parte utilizada como droga vegetal a casca obtida dos ramos jovens (4).

2.2 DESCRIO MACROSCPICA DA PARTE DA PLANTA UTILIZADA

Segundo a Farmacopeia Brasileira, a parte da planta utilizada com fins medicinais

constitui-se da casca inteira ou fragmentada (1 a 2 cm de espessura), obtida de ramos jovens,

com dois a trs anos. Macroscopicamente os fragmentos se caracterizam por serem irregulares

coriceos, flexveis, alongados e levemente acanalados, de comprimento, largura e espessura

variados. Sua superfcie externa reluzente e lustrosa, lisa ou estriada de colorao castanho-

escura. J a superfcie interna finamente estriada longitudinalmente, fibrosa e parda (4, 7, 9).

2.3 DESCRIO MICROSCPICA DA PARTE DA PLANTA UTILIZADA

Segundo a Farmacopeia Brasileira, a casca tem colorao castanho-escura e amarelada

em algumas pores quando vista frontalmente. As clulas do sber apresentam diferentes

formas, geralmente poligonais, de paredes retilneas e muitas vezes alongadas. O colnquima

possui clulas achatadas e de paredes espessadas. Em seco transversal, o crtex possui

cutcula extremamente espessada e a poro externa da casca pode apresentar diferentes

organizaes estruturais: 1) primeira camada epidrmica, uniestratificada, com clulas

4

quadrangulares pequenas, de paredes espessas, seguida por cinco a seis camadas de colnquima

tabular, de clulas alongadas, dispostas tangencialmente, de paredes espessas e com

cloroplastdios, seguido por parnquima com clulas de variadas formas e de paredes espessas;

2) camada epidrmica externa, com as mesmas caractersticas da descrita anteriormente,

seguida pelo colnquima formado por clulas pequenas, arredondadas e de paredes espessas,

seguido por parnquima com clulas tambm arredondadas e de paredes espessas; 3)

revestimento externo formado por periderme, abrangendo diferente nmero de camadas,

seguidas por parnquima com clulas arredondadas e de paredes espessas. O parnquima

cortical externo sempre formado por vrias camadas de clulas, normalmente quadrangulares

a retangulares, ou poligonais a arredondadas, de paredes espessadas, com poucos espaos

intercelulares, muitos cloroplastdios e muitos cristais de oxalato de clcio do tipo drusas, raros

monocristais e cristais prismticos. Agrupamentos de clulas ptreas so pouco comuns neste

tecido, raras so essas clulas isoladas e as contendo compostos fenlicos. O parnquima

cortical interno possui clulas de diferentes formas, maiores espaos intercelulares e menor

quantidade de cristais e de cloroplastdios. Mais internamente, as clulas mostram maior

irregularidade de forma, maiores espaos intercelulares, paredes muito espessadas, pontoadas

e mais retilneas. Agrupamentos geralmente circulares, de fibras lignificadas so abundantes e

esto distribudos aleatoriamente neste parnquima onde, muito raramente, ocorrem

agrupamentos de clulas ptreas. O cmbio formado por poucas camadas celulares, com

clulas de pequenas dimenses e achatadas tangencialmente, tanto as fusiformes quanto as

radiais. O tecido adjacente internamente ao cmbio, contm grande quantidade de gros de

amido. Raios parenquimticos so formados por clulas de diferentes formas, alongadas

verticalmente, de paredes espessas e contendo cloroplastdios. Entre esses raios, ocorrem

clulas parenquimticas de forma irregular, de paredes espessadas, sem cloroplastdios e de

maior volume do que aquelas distribudas junto ao cmbio. Clulas floemticas pequenas, ricas

em compostos fenlicos, so acompanhadas por agrupamentos de fibras lignificadas, alinhados

horizontalmente e por clulas parenquimticas, de paredes espessas, com cloroplastdios e

dispostas tangencialmente. Idioblastos contendo compostos fenlicos so comuns junto ao

cmbio interno. Este tecido delimita internamente a casca e formado por clulas de paredes

delgadas e reduzido nmero de camadas. Geralmente de difcil observao devido a suas

caractersticas e sua posio limtrofe. Em seco longitudinal, as caractersticas do sber e da

regio cortical externa so similares s descritas para a seco transversal. A regio cortical

5

interna mostra raios parenquimticos muitas vezes alargados, fibras e clulas parenquimticas

de paredes espessas (Figura 2) (4).

2.3.1 Descrio microscpica do p

So caractersticas do p da casca de Salix alba a colorao castanho-plida; a presena

de fragmentos de sber, em vista frontal; fragmentos de parnquima, com clulas de paredes

espessadas, em vista frontal; fibras isoladas ou pores de seus agrupamentos, em seco

longitudinal; fragmentos de parnquima cortical com clulas de forma poligonal e de paredes

espessas, com cristais do tipo drusas, em seco transversal; poro de fibras associadas a

idioblastos cristalferos, em seco longitudinal; fragmentos de parnquima com clulas de

paredes espessadas, com distribuio radial e com pores de cmbio; fragmentos de cmbio,

em seco transversal; cristais de oxalato de clcio dos tipos monocristais, cristais prismticos

e drusas, isolados (4).

6

7 Figura 3 Aspectos macroscpicos e microscpicos em Salix alba L conforme Farmacopeia Brasileira (4). A

aspecto geral de poro da superfcie externa da casca, em vista frontal. B aspecto geral de poro da superfcie

interna da casca, em vista frontal. C detalhe do sber, na regio de colorao marrom, em vista frontal. D

detalhe do sber, na regio de colorao amarelada, em vista frontal. E poro de colnquima em seco

transversal; cloroplastdio (clo). F detalhe de poro do parnquima, mostrando idioblastos cristalferos com

monocristais, cristais prismticos e drusas, e com compostos fenlicos, em seco transversal; idioblasto contendo

compostos fenlicos (icf); cloroplastdio (clo); idioblasto cristalfero (ic). G detalhe de poro do parnquima,

mostrando agrupamento de clulas ptreas, em seco transversal; cloroplastdio (clo); clula ptrea (cp);

idioblasto cristalfero (ic); pontoao (pto). H detalhe de poro do cortx, em seco longitudinal; cloroplastdio

(clo); fibra (fb); idioblasto cristalfero (ic); parnquima (p). I detalhe de poro do crtex, mostrando o

parnquima e clulas ptreas em seco longitudinal; cloroplastdio (clo); clula ptrea (cp); idioblasto cristalfero

(ic); parnquima (p); pontoao (pto).

2.4 INFORMAES SOBRE POSSVEIS ESPCIES VEGETAIS SIMILARES QUE

POSSAM SER UTILIZADAS COMO ADULTERANTES

Diferentemente da Farmacopeia Brasileira, na Farmacopeia Europeia a descrio da

casca de Salix utilizada como droga vegetal consiste em mais de uma espcie do gnero,

comtemplando tambm S. purpurea L., S. daphnoides Vill. e S. fragilis L, as quais so

caracterizadas por possurem pelo menos 1,5% de derivados saliclicos totais em sua

composio (9, 12). A Farmacopeia Brasileira recomenda a identificao da espcie vegetal por

meio de cromatografia em camada delgada utilizando slica-gel (4).

8

3 INFORMAES DE CONTROLE DE QUALIDADE

3.1 ESPCIE VEGETAL / DROGA VEGETAL

3.1.1 Caracteres organolpticos

A droga vegetal inodora com sabor adstringente e marcadamente amargo (4, 7).

3.1.2 Requisitos de pureza

3.1.2.1 Perfil de contaminantes comuns

Segundo a Farmacopeia Brasileira e a monografia da Organizao Mundial de Sade

(OMS), a droga vegetal deve possuir no mximo 3% de ramos com dimetro superior a 10 mm

e no mximo 2% de outros materiais estranhos (4, 7).

3.1.2.2 Microbiolgico

No h descrio de controle microbiolgico especfico para Salix alba na Farmacopeia

Brasileira ou Europeia (4, 9). No entanto, na monografia da OMS para o salgueiro h referncia

aos limites de contaminao microbiolgica determinados pelo guia da OMS para controle de

qualidade de plantas medicinais (7, 14).

De acordo com o guia da OMS, natural a presena de fungos e bactrias no material

vegetal, principalmente devido a fonte, colheita e manejo. A presena de Escherichia coli e

Salmonella spp indicam baixa qualidade de produo e colheita, o que pode ser evitado

implantando-se boas prticas de cultivo.

Mais recentemente, um estudo de Parthik e colaboradores analisou os guias da OMS e

os contaminantes potencialmente perigosos em plantas medicinais, em relao ao controle

microbiolgico, os autores descrevem o limite de material microbiolgico de acordo com o

material vegetal utilizado e o diferencia em extrato bruto, material que foi pr-tratado ou para

uso tpico e material para uso interno (15).

O livro Latest Research into Quality Control possui um captulo destinado ao controle

microbiolgico em plantas medicinais, no qual h um quadro comparativo entre os limites de

agentes microbiolgicos determinados pelas Farmacopeias brasileira, americana, europeia e

guia da OMS. O quadro comparativo foi adaptado e est apresentado abaixo (16).

9

Tabela 1 Limites microbiolgicos recomendados para plantas medicinais (Adaptado de Arajo

e Baubi, 2012 (16)).

Farmacopeia

Brasileira

Farmacopeia

Americana

Farmacopeia

Europeia

Guia OMS

Bactrias

aerbicas

107 105 107 NI

Fungos 104 103 105 105

Enterobactrias e

outras bactrias

Gram negativas

104 103 NI NI

E. coli Ausncia Ausncia 104 104

Salmonella Ausncia Ausncia NI NI

Farmacopeia Brasileira: valor representa droga vegetal na qual ser adicionada gua fervente antes do uso.

Farmacopeia Americana: Valor representa droga vegetal seca ou em ps na qual ser adicionada gua fervente

antes o uso; Farmacopeia Europeia: produtos com uma ou mais de uma droga vegetal (inteira, rasurada ou em p)

na qual ser adicionada gua fervente antes do uso. Guia OMS: valor representa matria vegetal bruta a ser

processada. NI: Limites no informados. Valores descritos em Unidades Formadoras de Colnia (UFC)/g.

3.1.2.3 Teor de umidade

Segundo a Farmacopeia Brasileira o teor de umidade mximo para Salix alba de 11%.

De acordo com a Farmacopeia Europeia essa porcentagem deve ser determinada em 1000 g de

p da planta por secagem em forno a 100 C por duas horas (4, 9).

3.1.2.4 Metal pesado

A Farmacopeia Brasileira no determina valores mnimos de metais, tampouco a

Farmacopeia Europeia ou a monografia da OMS para a espcie vegetal, neste ltimo h

referncia ao guia da OMS para determinao dos limites mximos de metais em plantas

medicinais (4, 7, 9).

O guia da OMS, por sua vez, determina que o limite mximo de metais txicos deve ser

calculado em concordncia com o limite mximo tolerado para ingesto diria e esse deve ser

estabelecido com base regional ou nacional. A recomendao da OMS para chumbo e cdmio,

por exemplo, de no mximo 10 e 0,3 mg/ kg, respectivamente (14).

Kalny e colaboradores (2012) determinaram o contedo de microelementos e metais

txicos em plantas medicinais e fitoterpicos comercializados na Polnia, dentre eles a casca

do salgueiro e encontrou alta concentrao de cdmio (1,0 mg/ kg) na droga vegetal (17).

10

3.1.2.5 Resduos qumicos

No h descrio especfica na Farmacopeia Brasileira sobre resduos qumicos, j a

monografia da OMS para a casca de Salix possui recomendao de no exceder o limite mximo

de aldrin e dieldrin em 0,05 mg/ kg. Para outros praguicidas h a indicao de consultar os

limites descritos no guia da OMS (4, 7, 9, 14).

3.1.2.6 Cinzas

A proporo mxima de cinzas descritas tanto na Farmacopeia Brasileira quanto na

Europeia e na monografia da OMS de 10% (4, 7, 9, 14).

3.1.3 Granulometria

A granulometria para a espcie Salix alba no est descrita na Farmacopeia Brasileira,

Farmacopeia Europeia ou monografia da OMS para a espcie vegetal (4, 7, 14). Entretanto, h

uma descrio genrica no guia da OMS para plantas medicinais que define o p de acordo com

o tamis pelo qual ele passa por completo, variando entre grosso e muito fino (14).

3.1.4 Prospeco fitoqumica

A espcie possui salicina, sua principal caracterstica, alm de ser rica em glicosdeos

fenlicos, flavonoides e macroelementos, como K, Ca e Mg (7, 9, 11).

3.1.5 Testes fsico-qumicos

No h descrio de testes fsico-qumicos especficos para a espcie na literatura

utilizada.

3.1.6 Testes de identificao

A Farmacopeia Brasileira define como proceder a identificao de Salix alba e define o

mtodo de cromatografia em camada delgada (CCD) como de escolha. Para isso utiliza-se

slica-gel GF254, com espessura de 250 m, como fase estacionria e mistura de acetato de

etila, metanol e gua (77:13:10) como fase mvel. Aplica-se, separadamente, em forma de

banda, 10 L de cada uma das Solues (1), (2) e (3), preparadas recentemente, como descrito

a seguir.

11

Soluo (1): aquecer 0,5 g da amostra pulverizada (500 m), com 10 mL de metanol,

em banho-maria, sob refluxo, a aproximadamente 50 C por 10 minutos. Esfriar e filtrar.

Soluo (2): adicionar a 5 mL da Soluo (1), 1 mL da soluo de carbonato de sdio anidro

50 mg/mL. Aquecer em banho-maria a, aproximadamente 60 C, sob refluxo, por 10 minutos.

Esfriar e filtrar. Soluo (3): dissolver 2 mg de salicina em 1 mL de metanol. Desenvolve-se,

ento, o cromatograma. Remove-se a placa e deixa-se secar ao ar. Em seguida, nebulizar a placa

com soluo de cido sulfrico 5% (v/v) em metanol e deixar em estufa entre 100 C e 105 C,

durante 10 a 15 minutos. O cromatograma obtido com a Soluo (3) apresenta, no tero mdio,

uma mancha violeta-avermelhada correspondente a salicina (Rf aproximadamente 0,40). No

cromatograma obtido com a Soluo (1), a mancha de salicina aparece com uma intensidade

fraca mdia. No cromatograma obtido com a Soluo (2) a mancha correspondente a salicina

aparece mais intensa e, sobre ela, aparece uma mancha (salicortina) e, s vezes, duas manchas

fracas (tremulacina), de cor violeta-avermelhada. Nos cromatogramas das Solues (1) e (2)

podem aparecer outras manchas de cores azul, amarelo e marrom (4).

3.1.7 Testes de quantificao

Segundo a Farmacopeia Brasileira o doseamento da salicina para a espcie Salix alba

deve ser realizado por meio de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE/HPLC). Para

isso, recomenda-se utilizar cromatgrafo provido de detector ultravioleta a 270 nm; pr-coluna

empacotada com slica octadecilsilanizada, coluna de 150 mm de comprimento e 3,9 mm de

dimetro interno, empacotada com slica octadecilsilanizada (4 m), mantida a temperatura

ambiente; fluxo da fase mvel de 1 mL/minuto. Fase mvel: mistura de acetonitrila, gua e

cido trifluoractico (3:97:0,05). Soluo amostra: pesar exatamente, cerca de 0,3 g da droga

seca e moda (355 m) juntar 25 mL de metanol e aquecer sob refluxo, durante 30 minutos.

Esfriar e filtrar. Retomar o resduo com 25 mL de metanol e tratar como descrito anteriormente.

Reunir os filtrados e evaporar sob vcuo at secura. Retomar o resduo com 2 mL de metanol,

adicionar 2 mL de hidrxido de sdio 0,1 M e aquecer em banho-maria, sob refluxo, durante 1

hora a 60 C, aproximadamente, com agitao frequente. Esfriar, adicionar 0,25 mL de cido

clordrico M e completar a 5 mL com uma mistura de metanol e gua (50:50). Soluo padro:

dissolver 10 mg de salicina em 10 mL de acetonitrila. Solues para curva analtica: diluir

alquotas de 40, 45, 50, 55 e 60 L da Soluo padro a 100 L com Fase mvel, de modo a

obter concentraes de 0,40 mg/ mL, 0,45 mg/ mL, 0,50 mg/ mL, 0,55 mg/ mL e 0,60 mg/ mL.

12

Procedimento: injetar, separadamente, 10 L das Solues para curva analtica e da Soluo

amostra. Registrar os cromatogramas e medir as reas sob os picos. O tempo de reteno de

aproximadamente 6 minutos para a salicina. Calcular o teor de salicina na amostra a partir da

equao da reta obtida com a curva analtica. O resultado expresso pela mdia das

determinaes em gramas de salicina por 100 gramas da droga (%), considerando o teor de gua

(4).

3.1.7.1 Componentes qumicos e suas concentraes: descritos e majoritrios, ativos ou no

A Farmacopeia Brasileira descreve apenas a salicina como componentes qumicos

majoritrios presentes no salgueiro-branco, o qual consiste no composto ativo e est presente

na proporo de 0,5 a 1,5%. J a monografia da OMS para o salgueiro relata outros glicosdeos

fenlicos, como a salicortina, a fragilina, a populina e, alm dos seguintes compostos:

triandrina, vimalina, flavonoides e taninos. As estruturas salicina, salicortina e fragilina esto

apresentadas na figura 3 (4, 7).

Figura 4 Estrutura qumica dos componentes qumicos majoritrios presentes na espcie Salix

alba. Adaptado de WHO, 2009 (7).

3.2 DERIVADO VEGETAL

3.2.1 Descrio

No h monografias para os derivados vegetais de Salix alba nos compndios oficiais,

dessa forma podem ser empregados os mtodos utilizados para a droga vegetal ou os mtodos

descritos em trabalhos cientficos, que no geral utilizaram os mesmos critrios empregados para

droga vegetal, os quais so utilizados nesta monografia.

13

3.2.2 Mtodo de obteno

Foram estudados 25 artigos cientfico que descreveram a utilizao de derivado vegetal

de Salix alba, descreveram os derivados como extrato alcolico, extrato aquoso, extrato

metanlico, extrato seco, extrato bruto, extratos utilizando acetona, clorofrmio e hexano como

solventes.

Em 1972, Toman e colaboradores relataram o isolamento de galactanas a partir da casca

de Salix alba com sucesso mediante a extrao com benzeno-etanol (1:3) por 30 h e posterior

deslignificao com 80% de etanol (18). Em 1975 o mesmo grupo utilizou 600 g da casca de

Salix alba obtida a partir de ramos jovens par ao isolamento de pectina, a qual foi extrada com

gua a temperatura ambiente (19).

Para avaliar a presena de polifenis e sua relao com atividade antimicrobiana, Raiciu

e colaboradores utilizou matria vegetal fresca triturada, a qual sofreu macerao por 4-5 dias

em frascos mbar com etanol 90%. Em seguida foi adicionada uma mistura de gua e glicerina

para que o volume final fosse 20 vezes a massa inicial da planta. A macerao continuou com

a soluo de lcool e glicerol por mais 3 semanas (20).

A atividade antimicrobiana, junto s atividades antioxidante e citotxica presentes nos

compostos fenlicos de Salix alba foi analisada pelo grupo de Sulaiman, o qual utilizou a o p

da casca e extrao com etanol fervente em Soxhlet por 7 h. A soluo foi filtrada utilizando

vcuo e o filtrado foi evaporado utilizando evaporador a vcuo a 40C (21).

A obteno dos extratos aquosos de Salix alba foi realizada de forma semelhante,

variando de acordo com o objetivo do estudo. Em 1974, Kompantsev et al. Descreveram a

obteno de glicosdeos fenlicos a partir da extrao de 4,0 kg de ramos jovens de salgueiro

branco com gua aquecida a 90-95C por uma hora, trs vezes (22).

A fim de obter compostos fenlicos a partir da casca de Salix alba, o grupo de Harbourne

realizou a extrao utilizando apenas 2,5 g da matria vegetal e 100 mL de gua destilada a

100C por 20 minutos, com agitao, seguido de filtrao e resfriamento com gelo (23).

Drummond e colaboradores utilizaram uma modificao da metodologia de Harbourne,

partindo de 7,5 g da casca de Salix alba adicionados de 100 mL de gua a 90C por 15 minutos

a fim de tambm obterem compostos fenlicos (24).

14

Para o isolamento de taninos foram utilizadas as folhas da espcie vegetal, que foram

secas por congelamento e extradas em Soxhlet com a utilizao de hexano a fim de remover

lipdeos e substncias lipoflicas, em seguida os taninos foram extrados do resduo resultante

por uma mistura de acetona e gua (7:3) (25).

A anlise de taninos tambm foi realizada a partir da extrao de folhas por Muetzel e

colaboradores, em 2006. As folhas foram secas por congelamento ou em forno a 60C por 2 h

e em seguida pulverizadas, ento 1 g do p foi extrado com 100 mL de acetona 70%por duas

vezes por 20 minutos em banho ultrassnico (26).

A extrao metanlica tambm foi utilizada por Du et al., a fim de se isolar lignanas

provenientes de S. alba. Para isso, 1000 g da casca seca da espcie vegetal foi pulverizada e

extrada sucessivamente com metanol e ter a temperatura de 40 a 60C e posteriormente

evaporada. O resduo foi ento digerido utilizando-se acetato de etila (27).

O grupo de Pobocka-Olech descreveu a extrao metanlica de Salix alba em trs

estudos analisados, enquanto no primeiro o objetivo foi isolar glicosdeos fenlicos, incluindo

salicina, dentre outros, no segundo o composto qumico isolado foi a procianidina, j no terceiro

o objetivo foi isolar fenis simples. Nas trs publicaes o processo de extrao foi descrito

partindo-se do p da casca da droga vegetal, que extrado exaustivamente com metanol a 60C

(28-30). Jazayeri e colaboradores, com a finalidade de avaliar a atividade anticolinestersica do

extrato de algumas plantas utilizadas como medicinais no Ir, tambm utilizou a metodologia

da extrao metanlica de Salix alba, semelhante ao descrito acima; de acordo com a

publicao, um grama do p da casca da planta foi extrado por macerao sob agitao a

temperatura ambiente com metanol aquoso (20 mL; 1:1 v/v) por 24 horas (31). A quantificao

de salicina em diferentes espcies do gnero Salix foram analisadas por Kenstaviien et al.

tambm aps a extrao utilizando metanol, de acordo com a metodologia do trabalho 50 mL

de metanol foi adicionado a 0,5 g do p da casca de Salix alba e a mistura foi aquecida em um

condensador de refluxo por 30 minutos, posteriormente resfriada e filtrada (6).

A obteno do extrato seco de S. alba foi descrita por Oberprieler e colaboradores para

o isolamento de compostos fenlicos e anlise taxonmica por meio de perfil gentico. Segundo

a metodologia do estudo, aps a coleta do material as cascas da espcie vegetal foram

congeladas a -80C. Aps 9 meses, o material sofreu secagem utilizando slica-gel (100 mg), o

15

qual foi adicionado de 1,5 mL de metanol e homogeneizado em banho ultrassnico por 5

minutos, 3 vezes (32).

Em alguns estudos, os extratos foram obtidos comercialmente e no h descrio da

metodologia de extrao (10, 33-39).

Diferentemente dos outros derivados vegetais descritos acima, Pinto et al utilizaram o

plen de abelhas proveniente de S. alba a fim de isolar principalmente flavonoides, para isso

foi utilizado 1 g de p de plen foi homogeneizado e misturado 9 mL de etanol 70%, colocado

em papel alumnio e deixado temperatura ambiente por 72 h, o qual foi denominado extrato

1. Esse extrato foi centrifugado por 31 min a 4C e 11000 rpm, o sobrenadante foi dividido em

alquotas de 1,5 mL e estocado a -20C. Para a hidrlise 1 mL do sobrenadante do extrato 1 foi

adicionado de 4 mL de cido clordrico 2 M e aquecido at fervura por 30 min. Aps o

resfriamento a mistura foi extrada 3 vezes com dietilter e a fase ter foi coletada e evaporada,

o resduo foi solubilizado em 1 mL de etanol 96%, filtrado (0,22 mm) e estocado a -20C, o

extrato etanlico a 96% foi denominado extrato 2 (40).

3.2.3 Caracteres organolpticos

Dentre os artigos analisados os quais relatavam a utilizao ou extrao de derivados

vegetais, o nico que relatou a anlise de caracteres organolpticos para o controle de qualidade

do derivado vegetal foi o grupo de Raiciu et al (20). Segundo o trabalho, ao final do processo

de obteno do derivado foram observados odor, sabor e cor.

3.2.4 Testes de identificao

Conforme j citado, o principal constituinte qumico obtido a partir da Salix alba a

salicina, no geral os mtodos de isolamento e identificao do composto se do CCD, de acordo

com recomendao da Farmacopeia Brasileira para a droga vegetal ou por HPLC para

identificao e quantificao, conforme orientao da Farmacopeia Europeia (4, 9).

Enquanto a identificao da salicina no extrato aquoso de Salix alba por meio de CCD

foi descrita em 1983 (35), outros trabalhos mais recentes utilizaram HPLC tanto para a salicina

(6, 29) quanto para glicosdeos fenlicos em geral (30, 32).

16

Du et al. (2005) descreveram o isolamento de salicina e amigdalina por um mtodo

semi-industrial de cromatografia a baixa rotao utilizando uma bobina preenchida com a fase

estacionria composta por metil-tert-butil-ter e butanol (1:3) saturado com metanol e gua

(1:5) e fase mvel composta por metanol e gua (1:5) saturado com metil-tert-butil-ter e

butanol (1:3). Dessa forma foi possvel a dissoluo de 500 g de salicina em 5 L de fase mvel

e obteve-se uma pureza de 87,6% (36).

Tanto Muetzel et al., em 2006, quanto Sulaiman e colaboradores, em 2013, relataram a

determinao de fenis no extrato de Salix alba por espectrofotometria pelo mtodo de Folin-

Ciocalteu (21, 26).

3.2.5 Testes de quantificao

Agnolet e colaboradores (2012) validaram a quantificao da salicina por HPLC

utilizando detector de malha de diodo, coluna C18 como fase estacionria e fase mvel

constituda por soluo de metanol, gua e cido frmico com eluio em gradiente. O mtodo

mostrou preciso, exatido, linearidade e limites de deteco e quantificao satisfatrios (10).

3.2.5.1 Componentes qumicos e suas concentraes: descritos e majoritrios, ativos ou no

De forma semelhante droga vegetal o principal constituinte qumico relatado entre os

derivados vegetais de Salix alba a salicina, composto ativo da espcie (6, 10, 22, 23, 29, 35,

36, 39). So tambm relatados outros fenis como salidrosida, piceina, helicina, triandrina,

populina e tremulacina (29). No entanto, o mais comum o relato da presena de polifenis ou

fenis totais nos derivados, sem especificar o composto (20, 21, 23, 24, 26, 30, 32).

Os taninos tambm foram descritos como constituintes dos compostos (20, 23, 25, 26),

especialmente as procianidinas, que so descritos como potenciais antifngicos (25, 28).

3.3 PRODUTO FINAL

3.3.1 Forma farmacutica

No momento, h um nico fitoterpico presente no mercado nacional contendo Salix

alba, que possui a associao de trs espcies vegetais: Passiflora incarnata, Salix alba e

Crataegus oxyacantha. O medicamento utilizado a fim de diminuir sintomas de ansiedade e

17

insnioa, principalmente devido s propriedades sedativas, antiespasmdicas e ansiolticas da

Passiflora incarnata. O fitoterpico apresentado na forma de comprimidos revestidos e cada

comprimido contm em sua composio 100 mg de extrato seco de Salix alba, 30 mg de extrato

seco de Crataegus oxyacantha e 100 mg Passiflora incarnata (41).

No mercado europeu, especialmente na Polnia, h outros fitoterpicos contendo a

espcie vegetal, como o Rutinosal, tambm comercializado na forma de comprimidos com

associao de 300 mg de Salix, 20 mg de Rutosidum de 40 mg de vitamina C; e o Salicortex,

comprimidos com 330 mg da Salix. Os medicamentos so indicados, respectivamente, para

resfriados e dores de cabea (17).

Agnolet et al. (2012) relataram e utilizao de cpsulas contendo extrato de S. alba

compradas em farmcias da Dinamarca, porm o trabalho no apresenta maiores detalhes sobre

o fitoterpico (10). Hoffman e colaboradores (2002) tambm descreveram utilizar comprimidos

contendo extrato seco de Salix alba, comprados em farmcias locais de Nova Iorque (NY,

Estados Unidos) sem descrever nome comercial ou composio do medicamento (42).

3.3.2 Testes especficos por forma farmacutica

Como no h monografias nas Farmacopeias sobre fitoterpicos contendo Salix alba e

tambm no foram encontrados, na literatura pesquisada, testes especficos de controle de

qualidade, sugere-se a realizao de testes gerais para produtos finais presentes na Farmacopeia

Brasileira, como peso, dureza, friabilidade, desintegrao, dissoluo, uniformidade de doses

unitrias, pH, densidade, volume e teste de gotejamento (4).

4 INFORMAES DE SEGURANA E EFICCIA

4.1 Usos populares e/ou tradicionais

Os primeiros achados descrevendo os efeitos teraputicos de extratos da casca de

salgueiro foram descritos pro Hipcrates, h aproximadamente 2400 anos, ele recomendava

mascar as folhas de salgueiro para analgesia em crianas. Estudos subsequentes descreveram

os efeitos analgsicos das folhas de salgueiro, como os relatos de Diocorides, um cirurgio

18

grego que atuou em Roma no ano 75 a.C., e os relatos de Galen, um mdico romano que

descreveu as propriedades antipirticas e antiinflamatrias das folhas do salgueiro (43).

Atualmente, o uso popular do salgueiro, especialmente do salgueiro branco continua

disseminado no Brasil e no mundo. A espcie vegetal conhecida por suas atividades

analgsicas, com atuao principalmente contra os sintomas de dores nas costas, artrite, dores

reumticas, alm das atividades atipirticas e anti-inflamatrias. Os efeitos da droga vegetal

parecem estar diretamente relacionados presena da salicina, pr-droga do cido acetil-

saliclico (6, 10, 41).

4.2 Presena em normativas sanitrias brasileiras

No ano de 2014 a ANVISA publicou a RDC n 26 a qual regulamenta o registro de

Medicamentos Fitoterpicos (MF) e o registro e a notificao de Produtos Tradicionais

Fitoterpicos (PTF), alm de revogar a RDC 14/2010. (44-46).

Junto RDC supracitada, foi publicada a Instruo Normativa n 2, de 13 de maio de

2014 (IN 2/2014), que publicou a "Lista de medicamentos fitoterpicos de registro

simplificado" e a "Lista de produtos tradicionais fitoterpicos de registro simplificado", na

primeira encontra-se a espcie Salix alba (45). As informaes referentes espcie esto

descritas a seguir:

Nomenclatura botnica - Salix alba L., S. purpurea L. , S. daphnoides Vill., S. fragilis L.

Nome popular - Salgueiro branco

Parte usada - Casca

Padronizao/Marcador - Salicina

Derivado vegetal - Extratos

Indicaes/Aes teraputicas - Antitrmico, anti-inflamatrio e analgsico

Dose Diria - 60 a 240 mg de salicina

Via de Administrao - Oral

Restrio de uso - Venda sem prescrio mdica

4.3 ESTUDOS NO-CLNICOS

19

4.3.1 Estudos toxicolgicos

4.3.1.1 Toxicidade aguda

Dado no encontrado na literatura pesquisada.

4.3.1.2 Toxicidade subcrnica

Apenas um estudo sobre toxicidade subcrnica foi encontrado, o qual aborda toxicidade

reprodutiva de um fitoterpico que alm de Salix alba, contm extrato de Passiflora incarnata

e Crataegus oxycantha, e utilizado com a indicao de sedativo e hipntico (47).

Para tanto, o estudo utilizou 21 ratos da linhagem Wistar, fmeas, com peso superior a

220 g e suas ninhadas. As ratas fmeas foram colocadas com ratos machos e assim que detectada

a cpula foi considerado o dia 0 da gestao. A partir de ento os animais passavam a receber

diariamente a preparao fitoterpica (n = 11 fmeas) ou veculo (n = 10 fmeas) at o final da

gestao. As ratas foram avaliadas durante a gestao, alm disso, foi avaliada a prole quanto

mortalidade e ao desenvolvimento. A dosagem utilizada nos animais foi correspondente

dose teraputica proposta para seres humanos (adulto de 70 kg), que de 4 drgeas/dia, o que

resulta em um total de 400 mg do extrato de Passiflora incarnata, 120 mg do extrato de

Crataegus oxycantha e 400 mg do extrato de Salix alba, assim sendo os animais receberam as

dosagens aproximadas de 6 mg.kg 1, 2 mg.kg-1 e 6 mg.kg1 de cada um dos extratos,

respectivamente. Para os ensaios de toxicidade decidiu-se por aplicar uma dose 10 vezes maior

que a os humanos, ou seja, 60 mg.kg1, 20 mg.kg1 e 60 mg.kg1 das plantas mencionadas,

respectivamente (47).

O dia 0 de gestao foi contado a partir da cpula e durante os 21 dias subsequentes foi

administrada a dose supracitada do fitoterpico por via oral (gavagem). Diariamente foram

avaliados o desenvolvimento ponderal e o consumo de gua e rao, alteraes de

comportamento, conscincia e disposio, avaliao da atividade do sistema locomotor,

musculatura esqueltica e reflexos e avaliao da atividade autonmica. No dia do parto e a

partir de ento, foram avaliados o nmero e a massa corporal dos filhotes, nmero de

natimortos, mortes de perinatais, alteraes macroscpicas externas nos filhotes,

desenvolvimento ponderal individual dos filhotes at o desmame, avaliao das caractersticas

de desenvolvimento geral como: descolamento das orelhas, erupo dos incisivos,

aparecimento dos pelos, abertura do canal aditivo, abertura dos olhos e descida dos testculos.

20

No desmame foram avaliados a massa corporal das ratas lactantes e dos filhotes, o nmero de

filhotes desmamados, a massa dos rgos dos filhotes (fgado e rins), o aspecto visual das

demais vsceras (corao, pulmes, tero, ovrios, trato gastrointestinal) (47). De acordo com

os resultados observados pelo estudo no houve diferena significativa entre o grupo tratado

com o fitoterpico e o grupo controle (que recebeu apenas veculo) no desenvolvimento das

ratas durante a gestao, tampouco no desenvolvimento da sua prole, o que permite concluir

que h ausncia de toxicidade reprodutiva do extrato de Salix alba, mesmo utilizando uma dose

dez vezes maior que a utilizada terapeuticamente em humanos (47).

4.3.1.3 Toxicidade crnica

Dado no encontrado na literatura pesquisada.

4.3.1.4 Genotoxicidade

Entre os estudos analisados, apenas um deles avaliou a genotoxicidade induzida por

Salix alba. Entretanto, diferentemente de outros estudos, o produto analisado no foi o extrato

da planta, mas sim dois extratos etanlicos (70 e 96%) obtidos a partir do plen de abelhas

proveniente de Salix alba, o qual pode estar presente em suplementos alimentares. Para a

avaliao da genotoxicidade, foi utilizado o ensaio do microncleo. A anti-genotoxicidade foi

avaliada mediante a avaliao da proteo do extrato frente induo de genotoxicidade por

trs quimioterpicos que agem por mecanismos celulares diferentes: bleomicina, mitomicina C

e vincristina. O material celular utilizado para os ensaios foi obtido a partir da coleta de sangue

perifrico heparinizado de trs voluntrios sadios, no fumantes, do sexo masculino. Aps 72

horas de incubao dos linfcitos estimulados, obtidos a partir do sangue perifrico na presena

do extrato de plen de abelha obtido de Salix alba, a contagem de microncleos no aumentou

significativamente, ao contrrio do observado na presena de bleomicina, utilizada como

controle positivo. Esse resultado indica que o extrato no foi capaz de induzir genotoxicidade

(40).

Por outro lado, a capacidade do plen e dos dois extratos etanlicos em proteger contra

a mutagnese induzida pelos quimioterpicos em trs diferentes concentraes (1, 10 e 100 g/

mL) foi apresentada como resultado do estudo (40). O extrato etanlico a 70% foi capaz de

evitar a genotoxicidade induzida pela bleomicina nas trs concentraes testadas. A toxicidade

induzida pela vincristina tambm foi evitada pelas trs concentraes testadas, porm, nesse

21

caso, o extrato que apresentou resultado significativo foi o extrato etanlico a 96%. J a

presena de microncleos induzidas por mitomicina C foi significativamente menor nas trs

concentraes do plen de abelha e do extrato etanlico a 70%. A diferena entre os resultados

dos extratos se d pela diferente concentrao de compostos fenlicos de acordo com a forma

e o solvente de extrao. Os resultados apresentados exploram no s a ausncia de

genotoxicidade do plen e dos extratos, mas tambm seu potencial em atuarem como protetores

frente toxicidade de agentes quimioterpicos (40).

4.3.1.5 Sensibilizao drmica

Dado no encontrado na literatura pesquisada. A ausncia desse tipo de estudo justifica-

se pela utilizao preferencialmente por via oral de formulaes contendo a espcie vegetal.

4.3.1.6 Irritao cutnea

Dado no encontrado na literatura pesquisada. A ausncia desse tipo de estudo justifica-

se pela utilizao preferencialmente por via oral de formulaes contendo a espcie vegetal.

4.3.1.7 Irritao ocular

Dado no encontrado na literatura pesquisada. A ausncia desse tipo de estudo justifica-

se pela utilizao preferencialmente por via oral de formulaes contendo a espcie vegetal.

4.3.2 Estudos farmacolgicos

4.3.2.1 Ensaios in vitro

Os ensaios farmacolgicos realizados in vitro foram os mais expressivos dentre os

ensaios no clnicos. Quinze diferentes estudos testaram as propriedades farmacolgicas da

espcie Salix alba frente a bactrias, fungos e culturas de diferentes tipos celulares. As

atividades farmacolgicas que se destacaram foram a atividade anti-inflamatria e a atividade

antioxidante, as quais se relacionam. Foram tambm observadas as atividades antimicrobiana,

antiestrognica e antiproliferativa. Todas elas seguem listadas no quadro 2.

Como esperado, pelo uso tradicional da espcie vegetal, uma das atividades mais

testadas foi a atividade anti-inflamatria. Assim como o cido saliccilico e outros anti-

inflamatrios no-esteroidais (AINES), esperava-se que o extrato vegetal de Salix alba tambm

22

atuasse principalmente inibindo as cicloxigenases (COX), enzimas essenciais para sntese das

prostaglandinas a partir da liberao do cido araquidnico pelas fosfolipases da membrana

celular. Entretanto, os estudos discutidos abaixo evidenciaram mecanismos anti-inflamatrios

muito mais complexos, ativados pelos extratos vegetais, o que pode ser explicado em parte pela

presena de outros compostos ativos alm dos salicilatos (48).

A inflamao um processo complexo e natural em resposta a uma srie de agentes

hostis aos quais os mamferos esto expostos, como parasitas, microorganismos, agentes

txicos e danos fsicos. Como resposta a esses agentes, so liberadas citocinas pelos macrfagos

e leuccitos, entre as quais se destacam o fator de necrose tumoral (TNF-), a interleucina-1

(IL-1) e a interleucina-6 (IL-6) (49, 50).

Fiebich e colaboradores (2004) analisaram o efeito do extrato etanlico da planta em

moncitos primrios de humanos. Os ensaios avaliaram a atividade das cicloxigenases 1 e 2

(COX-1 e COX-2) e liberao da prostaglandina E2 (PGE2) mediada pela COX-2. Para isso foi

utilizado o extrato comercial 1520L (Plantina GmbH,Munique, Alemanha), descrito como

efetivo no combate a dores por ensaios clnicos e j comercializado na Alemanha, o qual possui

indicao contra dor reumtica, febre e dores de cabea. Os moncitos foram pr-incubados

com o extrato em concentraes variando entre 10 e 500 g/ mL a fim de se determinar o IC50

com base em uma regresso linear. Os resultados obtidos foram comparados com padres de

salicina e salicilatos, alm de um anlogo do refocoxib (L745337). Foi demonstrado que so

necessrias concentraes superiores a cem vezes do extrato etanlico de Salix alba quando

comparado ao anlogo sinttico do anti-inflamatrio para inibir 50% da liberao da PGE2, o

que corresponde a dose utilizada do extrato (1600 mg) quando comparado ao frmaco (12,5

mg). Por outro lado, as doses testadas do extrato vegetal no demonstraram capacidade de

inibio da COX-1 ou da COX-2 (34).

Um estudo avaliou a atividade anti-inflamatria, tambm representada pela inibio da

COX-1 e COX-2 e da 5-lipoxigenase (5-LOX) em granulcitos humanos, alm da elastase

(HLE) em leuccitos humanos (39). Para isso, foram utilizadas cinco fraes do extrato aquoso

de Salix STW 33-I. Os extratos foram separados de acordo com a polaridade, utilizando-se

sequencialmente tolueno (frao A), acetato de etila (frao B), butanol (frao C) e etanol

(frao D), alm do extrato aquoso (frao E). A Frao A apresentou pequena quantidade de

salicina (0,4%) e indicou altas concentraes de polifenis indeterminados; a Frao B

apresentou concentrao de salicina de 9%, alm da presena de polifenis e flavonoides; as

23

Fraes C e D foram as que apresentaram maiores concentraes de salicina (23,6 e 25,2,

respectivamente), alm da presena de flavonoides; j na Frao E foram detectados 10,3% de

salicina e proantocianidinas. De acordo com os resultados apresentados pelos autores, houve

uma grande diferena no perfil inibitrio das ciclooxigenases de acordo com as fraes. As

fraes que apresentaram maiores inibies para COX-1, COX-2 e 5-LOX foram as fraes A

e B, exatamente aquelas com baixas concentraes de salicina, constitudas principalmente por

polifenis. J a inibio da elastase foi mais pronunciada utilizando-se a frao E, com

concentraes intermedirias de salicina, no entanto com presena de polifenis e

proantocianidinas (39).

Outro grupo publicou, posteriormente, a avaliao do mesmo extrato aquoso de Salix

comercializado (STW 33-I) (51), o qual foi separado em fraes de acordo com a metodologia

utilizada por Nahrstedt e colaboradores (2007), obtendo-se as seguintes concentraes de

salicina: 0,5% para Frao A; 1% para Frao B; 34,1% para Frao C; 37,5% para Frao D e

14,9% para Frao E. Nesse estudo, a atividade anti-inflamatria dos extratos foi avaliada em

clulas mononucleares ativadas com lipopolissacardeos (LPS), o qual ativa a liberao de

citocinas inflamatrias por meio da expresso do TNF-, do xido ntrico (NO) e a sntese de

prostaglandinas pela atividade da COX-1 e da COX-2 em moncitos. De forma semelhante ao

resultado descrito anteriormente, a Frao E foi a que inibiu a expresso dos marcadores

inflamatrios COX-2 e TNF- de forma mais expressiva e significativa, juntamente com o

extrato aquoso STW 33-I, sendo a inibio da COX-2 da ordem de 30-55% e a do TNF- da

ordem de 75-85%, resultados semelhantes aos encontrados ao tratar as clulas com diclofenaco

de sdio e cido acetil saliclico. Ademais, tanto o extrato quanto a Frao E foram capazes de

reduzir significativamente o aumento da formao de NO. Alm disso, foi avaliado o efeito do

extrato STW 33-I na translocao do NF-B do citoplasma para o ncleo, a qual foi evitada

pela presena do extrato de forma similar ao tratamento das clulas com diclofenaco (51).

Knuth e colaboradores, em 2011(52), isolaram o glicosdeo fenlico salicortina a partir

da casca de Salix alba a fim de avaliar a expresso de ICAM-1 induzido por TNF- em clulas

endoteliais humanas (HMEC-1). Como resultado, foi observado que a presena da salicortina

diminuiu a expresso do ICAM de maneira dose-dependente entre 10 e 75 M. A concentrao

de 50 M reduziu a expresso do marcador (52,4%), enquanto a salicina e o cido salicico no

apresentaram reduo significativa (52).

24

A atividade anti-inflamatria do extrato de Salix alba, entre outras espcies, foi tambm

avaliada por meio da ativao do NF-B induzida por IL-1 em um modelo in vitro de

condrcitos caninos (38) Essa ativao parece estar relacionada ao efeito inflamatrio

observado na osteoartrite. O extrato, na concentrao de 10 g/ mL, se mostrou capaz de evitar

mecanismos inflamatrios. Sob condies experimentais houve inibio da citotoxicidade

induzida pelo IL-1 (avaliada pelo ensaio do MTT), alm de antagonizar a regulao positiva

da COX-2 por prevenir a degradao do IB e a ativao do NF-B. Ademais, as clulas

tratadas com o extrato botnico se rediferenciaram em condrcitos e produziram uma matriz

cartilaginosa, indicando o potencial teraputico do extrato vegetal para tratamento da osteortrite

(38).

A atividade anti-inflamatria do extrato de salgueiro branco e seus principais polifenis

(quercetina, apigenina e cido saliclico) tambm foi avaliada pelo grupo de Drummond (2013)

por meio das citocinas IL-1, IL-6 e TNF- em uma linhagem celular de leucemia monoctica

humana denominada THP1. Em concentraes de 10 mM tanto a apigenina quanto a quercetina

foram capazes de reduzir a IL-6 significativamente, j o TNF- foi reduzido significativamente

frente a concentraes de 10 mM de apigenina e 25 mM de quercetina. Em comparao a outras

espcies vegetais testadas (camomila e ulmeira), o salgueiro apresentou maior atividade anti-

inflamatria por diminuir em maior proporo a atividade da IL- e do TNF- (24).

A atividade anti-inflamatria e antioxidante de Salix alba foi avaliada (37), utilizando

neutrfilo de ovinos, mediante imunomodulao realizada por essas clulas. Os neutrfilos so

responsveis pela resposta imune inata e so ativados por um mecanismo que envolve fases

distintas: rolagem, ativao, adeso e transmigrao. Eles atuam na defesa contra bactrias e

parasitas, alm disso, atuam tambm na ativao de mecanismos anti-inflamatrios. A atividade

do extrato e hidroetanlico de Salix alba e de outras espcies vegetais foi avaliada por meio da

viabilidade dos neutrfilos, pelo ensaio de adeso e pela produo do radical superxido (53).

A viabilidade dos neutrfilos foi inibida de maneira dose-dependente pelo extrato e a inibio

alcanou aproximadamente 65% com a concentrao mais alta testada (60 g/ mL). Ademais,

o extrato de S. alba tambm bloqueou fortemente a adeso dos neutrfilos e a produo do

radical livre superxido, com uma IC50 de apenas 17,77 g/ mL e 55,94 g/ mL,

respectivamente. O estudo relacionou os resultados obtidos eficiente atividade anti-

inflamatria do extrato, o qual possivelmente se deve presena de flavonoides e compostos

fenlicos no extrato hidroetanlico analisado (37).

25

Entre todos os estudos analisados, tm-se em comum que o extrato de Salix alba

apresentou atividade anti-inflamatria satisfatria em diferentes modelos in vitro. Em relao

ao mecanismo de ao antiinflamatrio, ressalta-se no apenas o mecanismo direto, por meio

da ativao via citocinas, mas tambm as vias que ativao pelos mecanismo de estresse

oxidativo, uma vez que a salicina nem sempre foi composto responsvel pela atividade anti-

inflamatria, mas tambm outros compostos presentes no extrato, como os polifenis, que

possuem reconhecida atividade antioxidante.

Outra importante atividade relatada foi a atividade antioxidante, a qual tambm pode

estar relacionada ativao de mecanismos inflamatrios. A produo exacerbada de radicais

livres est envolvida na mediao do processo inflamatrio por meio da ativao do NF-B e

do TNF-.

Kong e colaboradores (2014) publicaram recentemente, entre outros achados, a

influncia da salicina na gerao de radicais livres (54). Para isso, eles utilizaram cultura de

clulas originadas da veia endotelial do cordo umbilical humano (clulas ECV304), as quais

foram analisadas por microscopia de fluorescncia aps incubao com perxido de hidrognio

(indutor de estresse oxidativo) e 2,7-diacetato de diclorofluoroscena (DCFH-DA). A

intensidade da fluorescncia proporcional produo de radicais livres, ou espcies reativas

de oxignio, e essas possuem um importante papel na angiognese tumoral e regulam as vias

de sinalizao intracelular, que ativa mecanismos inflamatrios. De acordo com os resultados

observados, a salicina na dose de 2 mM reduziu significativamente a formao de radicais livres

induzida por H2O2 (54).

O grupo de Nahrsted, alm de avaliar a atividade antiinflamatria das 5 fraes do

extrato de Salix alba, conforme citado anteriormente, tambm avaliou a capacidade das fraes

em inibir a formao de radicais livres induzidos por 2,2-azobis(2-amidinoppropano)

diidrocloreto (AAPH) ou pela reao xantina-xantina oxidase (39). Esta atividade foi mais

pronunciada nas fraes A e B, ricas em polifenis e flavonoides, o que corrobora com a

informao de que a ao do extrato no se deve apenas ao princpio ativo salicina, mas ao

conjunto de compostos presentes na planta, destacando-se os flavonoides e polifenis (39).

Cinco diferentes extratos comerciais de Salix alba foram avaliados quanto atividade

antioxidante (10) , sendo eles de duas amostras de extrato hidroalcolico, de uma amostra da

casca seca utilizada para decoco e de duas amostras de extrato seco comercializadas na forma

de cpsulas. As amostras foram solubilizadas em metanol na mesma concentrao final (30 mg/

26

mL, com utilizao de 30 L da soluo) e posteriormente foi analisada a quantidade de salicina

em cada uma por HPLC. A atividade antioxidante foi verificada pela capacidade de reduo do

radical livre ABTS+, utilizando HPLC acoplado a malha de diodos (HPLC-PDA). Como

resultado, foi observado que a concentrao de salicina nos extratos variou consideravelmente,

entre 1,68% e 25,59%, com maiores concentraes de salicina para as preparaes

comercializadas na forma de cpsulas. Alm disso, o fingerprint das preparaes demonstrou

presena de outros compostos como catequina, sirigenina, triangina e cido benzoico. Dentre

as preparaes, o extrato hidroalcolico e o extrato seco para decoco foram os que

apresentaram melhor atividade sequestradora de radicais livres, o que se deve principalmente a

presena de catequina (10).

Tambm em 2012, o grupo de Jukic publicou um estudo relatando as propriedades dos

extratos de plantas medicinais utilizadas na Crocia, incluindo a Salix alba, e testou sua

atividade antioxidante. Neste estudo, a atividade antioxidante foi avaliada por dois diferentes

mtodos, pelo sequestro do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) e pela reduo do

complexo de on frrico a on ferroso por antioxidantes. Entre as 16 espcies nativas analisadas,

o extrato de Salix alba foi o que demonstrou melhor atividade antioxidante de acordo com as

duas metodologias. Em linha com os estudos j citados, essa atividade tambm foi relacionada

presena de fenis totais, uma vez que esta espcie apresentou a maior quantidade de fenis

totais entre as avaliadas (55). Metodologia semelhante foi utilizada pelo grupo de Sulaiman,

que tambm avaliou o sequestro do radical DPPH pelo extrato de Salix alba, de acordo com os

resultados desse estudo a capacidade de sequestro do radical livre alcanou 80% na

concentrao de 100 g/ mL do extrato etanlico da planta. Nesse caso, mais um autor relata a

correlao entre a alta concentrao de glicosdeos fenlicos e a capacidade de sequestrar

radicais livres (21).

Em resumo, pode-se inferir que os extratos de Salix alba possuem considervel

capacidade antioxidante relatada por diversos autores, utilizando diferentes mtodos, e que esta

capacidade pode tambm influenciar na atividade anti-inflamatria relatada pela espcie

vegetal, pois consiste em um importante sinalizador dos mecanismos intracelulares

responsveis pela resposta inflamatria. Ademais, essa atividade no parece estar relacionada

apenas concentrao de salicina presente em cada extrato, mas tambm a presena de outros

compostos, entre os quais se destacam os fenis.

27

O mesmo trabalho de Sulaiman e colaboradores (21), descrito anteriormente por avaliar

a atividade antioxidante, avaliou as atividades antimicrobiana e antiproliferativa do extrato de

S. alba. A atividade antimicrobina foi avaliada frente a cepas bactrias e de um fungo, foram

elas: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae e Candida albicans (fungo). A avaliao foi realizada utilizando placa de gar, e

as concentraes do extrato etanlico de S. alba utilizadas foram de 10, 20, 40, 60 e 80 mg/ mL

e a zona de inibio foi avaliada aps incubao overnight das placas. Os resultados mostraram

maior halo de inibio para Candida albicans tratada com extrato de S. alba na concentrao

de 80 mg/ mL. Alm disso, todas as concentraes testadas apresentaram halo de inibio

significativo para S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans. O crescimento de E. coli e K.

pneumoniae no foi afetado por nenhuma das concentraes testadas. J a atividade

antiproliferativa foi avaliada pela viabilidade celular de uma linhagem de clulas humanas

derivada de leucemia promielide, HL-60. As clulas (densidade de 1,5 x 105 clulas) foram

incubadas com concentraes entre 1 e 10 g/ mL e a viabilidade foi avaliada por azul de

Trypan aps 12 e 24 horas de incubao. A viabilidade foi diminuda de maneira dose

dependente, a morte das clulas tumorais tratadas com extrato etanlico de S. alba chegou a

84% ao se utilizar a concentrao de 10 g/ mL aps 24 horas. No entanto, a viabilidade celular

nesse estudo no foi avaliada em outas linhagens de clulas no tumorais, ficando evidenciado

apenas o potencial antiproliferativo contra HL-60, porm sem se evidenciar o potencial txico

para clulas no-tumorais (21).

O artigo publicado pelo grupo de Raiciu (2010) tambm avaliou a atividade

antimicrobiana do extrato aquoso de Salix alba e outras espcies vegetais contra quatro

diferentes bactrias (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e

Bacillus subtilis) e dois fungos (Aspergillus niger e Candida albicans). Aps 24 a 48 horas da

incubao dos micro-organismos com uma concentrao correspondente a 0,5 da escala de

MacFarland com diluies de 1:10, 1:100 e 1:1000 do extrato vegetal nos gares adequados

para o crescimento de cada micro-organismo, os halos de inibio foram analisados e no houve

nenhuma induo da inibio de crescimento das bactrias e dos fungos, diferentemente do

observado por Sulaiman et al. (2010). Destaca-se, porm, a diferena no tipo de extrato

utilizado, o que pode resultar na presena de diferentes compostos. No caso do estudo de Raiciu

e colaboradores (20), foi descrita a presena de salicosdeos, cido cumrico, cido ferrlico,

quempeferol e taninos no extrato de Salix alba.

28

A atividade do extrato seco de Salix alba solubilizado em NaCl 0,9% tambm foi

avaliada frente cepa de E. coli pelo grupo de Souza (2009), porm com outra abordagem.

Nesse estudo, o extrato vegetal foi testado com o objetivo de avaliar a reduo dos efeitos

genotxicos e citotxicos induzidos pelo cloreto estanhoso (SnCl2), uma vez que este utilizado

como agente redutor a fim de se obter o radioistopo tecncio-99, utilizado em radioterapia.

Em humanos, esses efeitos incluem irritao da mucosa e da pele e em animais foi relatado

estmulo ou depresso do sistema nervoso central, o objeto de estudo foram bactrias, pois o

SnCl2 parece ser capaz de causar danos ao DNA, sendo considerado um potencial agente

genotxico, o que pode ser atribudo ao aumento na produo de radicais livres. Os resultados

compararam grupos que receberam apenas SnCl2 (25 g/ mol) e grupos que receberam SnCl2 e

extrato de Salix alba (25g/ mol e 11,6 mg/ mL, respectivamente) aps incubao overnight.

Observou-se que o presena do extrato vegetal no foi capaz de impedir a morte das bactrias

induzida pelo SnCl2, por outro lado tambm no interferiu na curva de crescimento da E. coli

por si s. O estudo, por sua vez apresentou resultado de apenas uma concentrao do extrato e

no avaliou o resultado em clulas humanas, o que levaria a um resultado que melhor permitiria

inferir sobre a proteo contra os danos relacionados radioterapia (33).

Outra atividade avaliada por dois diferentes artigos para o extrato de Salix alba foi a

atividade anticolinestersica (31, 55). Ambos levaram em considerao as plantas locais, porm

em pases distintos, Crocia e Ir. A busca por compostos que inibam a atividade da

acetilcolinesterase justifica-se pela relao que parece haver entre um dos mecanismos

patofisiolgicos da doena de Alzheimer e a diminuio dos nveis de acetilcolina em algumas

reas do crebro. A acetilcolinesterase (AChE) a enzima responsvel pela hidrlise

metablica da acetilcolina nas sinapses colinrginas, desta forma, a inibio da atividade da

AChE pode levar a um aumento na intensidade e na durao das sinapses colinrgicas,

possibilitando uma estratgia no combate Doena de Alzheimer. Os resultados observados

em ambos os estudos esto descritos nos pargrafos seguintes. (31, 55).

A fim de avaliar o potencial do extrato de plantas medicinais comumente utilizadas na

Crocia com potencial para o tratamento da doena de Alzheimer, foi avaliada no apenas a

atividade antioxidante do extrato de S. alba, mas tambm sua capacidade em inibir a atividade

da AChE (55). Os resultados mostraram que, entre as espcies analisadas, apenas o extrato

metanlico de Salix alba apresentou atividade considervel na inibio da AChE, a qual

29

alcanou 50,8% de inibio na concentrao de 1 mg/ mL do extrato. Para os outros extratos de

plantas analisados, a inibio foi inferior a 20% (55).

Da mesma forma, em busca de uma estratgia proveniente de planta medicinal que

poderia ser utilizada no combate Doena de Alzheimer, um estudo avaliou a capacidade de

inibio da AChE dos extratos metanlicos de dezoito plantas utilizadas no Ir (31) .

Nos dois estudos citados acima (31, 55) foi utilizado o mtodo de Ellman e os resultados

obtidos foram semelhantes. No estudo mais recente (31), a concentrao do extrato de Salix

alba, necessria para inibir 50% das enzimas (IC50), foi de aproximadamente 990 g/ mL, o

que os autores consideram como uma concentrao alta. Nesse caso, outras plantas medicinais

que apresentaram resultados mais satisfatrios como Camellia sinensis (IC50 5,96 g/ mL),

Citrus aurantifolia (IC50 19,57 g/ mL), Zizyphus vulgaris (IC50 24,37 g/ mL), Brassica nigra

(IC50 84,30 g/ mL) e Rosa damascena (IC50 93,10 g/ mL), no foram analisadas no estudo

de Jukic e colaboradores (2012) (31, 55).

Apesar de no estar relacionado entre os usos populares da planta, o grupo de Nizard

publicou, em 2004 (56), um trabalho descrevendo influncia do extrato de Salix alba na

produo de colgeno e modulao de fibroblastos derivados de clulas drmicas cultivadas a

partir da doao de pacientes jovens e idosos que passaram por cirurgia plstica. As clulas

foram cultivadas e foi avaliada a expresso da heat shock protein (HSP-47), protena que

interage com o pr-colgeno de clulas. Com o avano da idade, a expresso dessa protena

diminui, o que caracterizado pela compactao do colgeno e aspecto envelhecido da pele.

Para o ensaio, as clulas foram incubadas com 2% do extrato de Salix alba, por 6 horas. De

acordo com os resultados, o tratamento como extrato vegetal aumentou significativamente a

expresso da HSP-47 em clulas de doadoras idosas (70 anos), porm no alterou a expresso

em clulas provenientes de jovens (20 anos) sugerindo que o extrato pode atuar na proteo

contra a degradao da HSP-47 e de outras protenas, provavelmente influenciada pela

capacidade de sequestrar radicais livres e melhorar a influncia do envelhecimento no aspecto

da pele, sendo assim, um produto de interesse a ser explorado no campo dermatolgico (56).

O estudo de Pinto e colaboradores (40), j citado anteriormente por avaliar a atividade

antigenotxica, destaca-se por utilizar o extrato obtido a partir do plen de abelha de Salix alba,

e no o extrato proveniente da casca de salgueiro, como a maioria dos outros. O trabalho aparece

tambm nesta seo por avaliar a atividade antiestrognica do extrato do plen utilizando a cepa

RMY326 do fungo Saccharomyces cerevisae, que contm receptor para estrgeno humano. Os

30

dois extratos avaliados (extrato etanlico a 70% - extrato 1; extrato etanlico a 96% - extrato

2) no mostraram aumento significativo na atividade estrognica.Por outro lado, a inibio da

atividade da -galactosidase se deu de maneira dose-dependente para os dois extratos com

inibio mais pronunciada para a concentrao de 660 g/ mL do extrato 2. A atividade

antiestrognica do plen da espcie vegetal foi descrita pelos autores como caracterstica da

grande concentrao de flavonoides na planta. O fato de no apresentar atividade estrognica

(atua como um efetivo inibidor de estrgeno) permite que o plen obtido a partir de Salix alba

seja de ingesto segura, uma vez que no seria um promotor para o cncer de mama, alm de

possibilitar seu emprego na quimiopreveno para cnceres dependente de estrgeno (de mama,

por exemplo) em casos de risco aumentado pela ingesto de compostos com atividade

estrognica agonista (40).

31

Tabela 2 Resumo das atividades descritas em estudos farmacolgicos in vitro envolvendo a espcie vegetal Salix alba encontrados na literatura

pesquisada.

Ref. Atividade Extrato Concentrao Metodologia Material Quantidade

Parmetr

os

observado

s

Resultado Observado

Atividade anti-inflamatria

34 Atividade

anti-

inflamatria

Extrato

aquoso

10 - 500 g/ mL

A atividade antiiflamatria

in vitro do extrato etanlico

de Salix 1520L foi avaliado

como descrito anteriormente

pelos autores e utilizado para

incubao dos moncitos e

avaliao dos pamentros

inflamatrios.

Moncitos

humanos

primrios

N.D.

Atividade

da COX1,

COX-2,

IL-1 e IL-6

Os resultados demosntraram que

a atividade anti-inflamatria do

extrato est relacionada a

inibio PGE2. A atividade das

enzimas COX no foram

significativamente alteradas,

entretanto houve induo das

IL-1 e IL-6.

39 Atividade

anti-

inflamatria

Fraes do

extrato

aquoso

STW 33-I

A estimativa

do EC50 para

o extrato de

acordo com os

testes para o

extrato foi de

100 g/ mL

para COX-1,

800 g/ mL

para COX-2,

30 g/ mL

para 5-LOX e

60 g/ mL

para HLE.

O efeito inibitrio do extrato

e das diferentes fraes foi

observado nas

cicloxigenases COX-1 e

COX-2 e na lipoxigenase 5-

LOX. A expresso de genes

mediadores de inflamao

foi avaliada pela de apoptose

de moncitos estimulados

por LPS.

N.D. N.D.

Inibio de

COX-1,

COX-2 e

5-LOX

A maior inibio da COX foi

observada para a frao A

9COX-1) e frao B (COX-2 e

5-LOX). A apoptose foi inibida

significativamente pelo extrato e

pela frao E, de modo similar

ao diclofenaco (dado no

apresentado em grfico, no

descreve a concentrao).

32

51 Atividade

anti-

inflamatria

Extrato

comercial

de Salix

0,1 a 10 g/ mL

Alm do extrato foram

obtidas 5 fraes do mesmo

com diferentes polaridades:

FrA (0.5%), B(13%),

C(34.1%), D(37.5%),

utilizando, respectivamente,

tolueno, acetato de etila,

butanol, etanol e a ltima

frao utilizando gua: Fr E

(14.9%)

Clulas

mononucleares

obtidas do

sangue

perifrico de

voluntrios

humanos

N.D.

Expresso

de TNF, produo

de nitrito,

apoptose,

localizao

intracelula

r do NF-

B

O extrato de STW33-I possui

ao anti-inflamatria tanto

sobre os moncitos no ativados

como sobre macrfagos

induzidos. A atividade foi

significativa para os ensaios

testados apenas na maior

concentrao 10 g/ mL tanto para o extrato como para suas

fraes.

52 Atividade

anti-

inflamatria

O

glicosdeo

fenlico

salicortina

foi isolado

a partir do

extrato da

casca de

salgueiro.

No foi

descrita a

forma de

obteno

do extrato.

10, 25, 50 e 75

M

As clulas foram tratadas

com salicortina e 30 minutos

aps foram adicionados

10de TNF- a fim de ativar

a expresso do ICAM-1. Em

seguida as clulas foram

incubadas com FITC

marcado com aticorpo anti-

ICAM-1, aps 20 minutos a

intensidade da fluorescncia

foi medida por citometria de

fluxo.

Clulas

endoteliais

microvasculares

humanas

(HMEC-1)

At confluncia

Degrada

o da

salicortina

e inibio

da ICAM-

1

A salicortina diminuiu a

expresso de ICAM-1 de

maneira dose-dependente.

38 Atividade

anti-

inflamatria

Extrato

lquido 10 g/ mL

Condrcitos cultivados em

meio com ausncia de soro

(passagem 2, cultivadas em

3% soro fetal de bezerro)

foram tratadas com os

extratos (10 g/ mL)

sozinhas por 24 h (pr-

tratamneto) e em seguida

com uma combinao de

extratos botnicos (10 g/

mL) e IL-1 (10 ng/ mL)

Condrcitos de

ces foram

isolados das

articulaes de

cachorros

submetidos a

cirurgias

ortopdicas na

clnica de

cirurgia

veterinria da

Universidade

0,1 106 cells/

mL

Ensaio de

MTT,

imunofluo-

rescncia e

western-

blotting e

microscopi

a

eletrnica

O extrato se mostrou

condroprotetor evitando

mecanismos inflamatrios. Sob

condies experimentais houve

inibio do IL-1, alm de

antagonizar a regulao positiva

do MMP-9, MMP-13 e COX-

2.A IL-1, induziu a ativao

do NF-B e a degradao do

IB foi inibida pelo extrato, as

clulas tratadas com o extrato

botnico se rediferenciaram em

33

pelas 48h seguintes em

cultura.

Ludwig-

Maximilian-

University, em

Munique,

Alemanha.

condrcitos e produziram uma

matriz cartilaginosa.

24 Atividade

anti-

inflamatria

Extrato

aquoso 0-50 M

As clulas foram tratadas

inicialmente com os fenis

isolados de apigenina,

quercetina e cido saliclico

a fim de estabelecer a

concentrao dose-resposta.

Aps a obteno desses

dados as clulas foram

tratadas com as mesmas

concentraes dos extratos

contendo os polifenis.

Clulas THP1 e

linfcitos B

humanos

4 x 104/ mL para

as clulas

THP1, os

linfcitos foram

utilizados

apenas para o

ensaio do

cometa

Viabilida-

de celular

(MTT),

determina

o de IL-

1, IL-6 e

TNF- e

genotoxi-

cidade

(ensaio do

cometa)

Os extratos testados

apresentaram no apenas

atividade anti-inflamatria ao

diminuir a expresso das

citocinas avaliadas, mas tambm

mostraram-se no-citotxicos e

apresentaram atividade

antioxidante. Dentre os extratos

testados (camomila, ulmeira e

salgueiro branco) o de salgueiro

branco apresentou mais potente

atividade anti-inflamatria,

diminuindo em maior proporo

a atividade da IL-6 e do TNF-.

37

Atividade

anti-

inflamatria

Extrato

reconsti-

tudo de S.

alba

2,3; 6,7; 20,0;

60,0; 180,0

g/ mL

Antes dos experimentos os

extratos aquosos foram

dissolvidos em gua na

concentrao de 25 mg/ mL

e os extratos etanlicos

dissolvidos em DMSO na

concentrao de 50 mg/ mL.

Todas as solues foram

esterilizadas utilizando

filtros de 0,22 m. Pequenas alquotas foram estocadas no

escuro a -20C para posterior

realizao dos experimentos.

Neutrfilos

obtidos de

ovelhas

2 x 106/ mL

Ensaio de

viabilidade

, ensaio de

adeso e

produo

de

superxido

Os extratos hidroetanlicos de

Salix alba reduziram a atividade

dos neutrfilos de maneira dose-

dependente, com uma reduo

maior que 60% na maior dose.

O extrato de S. alba no penas

diminuiu a adeso dos

neutrfilos como tambm

diminuiu a produo de

superxido. O extrato possui

alta atividade anti-inflamatria

sobre os neutrfilos de ovelhas.

34

Atividade antioxidante

54 Atividade

antioxidante

Foi

utilizada

salicina

isolada

obtida

comercial

mente

(Sigma-

Aldrich)

1 ou 2mM de

salicina

Clulas venosas endoteliais

originadas do cordo

umbilical humano (ECV304)

foram cultivadas em meio

adequado e posteriomente

utilizadas para o ensaio de

migrao, de crescimento

em tubo e de estresse

oxidativo.

Clulas venosas

endoteliais

originadas do

cordo

umbilical

humano

(ECV304)

At confluncia

Migrao

celular,

cresciment

o em tubo

e de

estresse

oxidativo

e western-

blotting

para os

seguintes

anticorpos:

anti-

pERK,

anti-ERK,

anti-

pAKT,

anti-AKT

e anti--

tubulina.

A presena de salicina diminuiu