Download - Cinética Enzimatica atual
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CinéticaEnzimática
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Enzimas são proteínas que agem comocatalisadores biológicos:
enzima
CompostoComposto A A ((substratosubstrato))
CompostoComposto BB ((produtoproduto))
Centro ativoou
sítio catalíticode uma enzima é a porçãoda molécula onde ocorre a
atividade catalítica
Observe que não há consumoou modificação permanente da
enzima
Reação catalisada pela enzima
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TeoriaTeoria dada catcatááliselise
No equilíbrio da reação, as velocidades das reações se igualam: v1 = v-1
- concentrações de todos os reagentes não se alteram mais- pode se dizer que a reação terminou
Catalisador acelera as velocidades de ambos os lados da reação
- o ponto do equilíbrio é atingido mais rápido
- o ponto do equilíbrio não se altera, ou seja [reagentes] e de [produtos] no “final” da reação” são as mesmas dareação não catalisada
- termodinâmica da reação não se altera
Catalisador não é consumido na reação pode atuar em [ ] baixas
A + B CA + B Cv1
v-1
Considere as reações:
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Um Catalisador diminui a barreira energética criando percursos alternativosda reação para formação do estado de transição.
Energia de ativação ou barreiraenergética:
quantidade de energiaque é preciso fornecer aosreagentes para a reação ocorrer
Estado de transição oucomplexo ativado:
forma molecular inter-mediária entre o reagente e o produto, existe somenteno alto da barreiraenergética.
É altamente instável.Progresso da reação
Ene
rgia
Estado de transição
Reação não catalisada
Reação catalisada
Energia de
ativação
Substrato (S)
Produto (P)
TeoriaTeoria dada catcatááliseliseO gráfico mostra a variação de energia ao longo de uma reação.
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Enzimaholozima
Apoenzimaparte proteica
Grupo prostético
metal
coenzima
cofator
Coenzima Reação com Vitamina
Biocitina CO2 Biotina
Coenzima A Grupos acil Ác. Pantotênico
Coenzima B12 H e grupos alquil Vitamina B12
FAD, FMN óxido-redução Riboflavina
NAD, NADP óxido-redução Niacina
Fosfato de piridoxal Grupos aminos Piridoxina
Pirofosfato Tiamina Grupos aldeídos Tiamina
Tetrahidrofolato unidades C Ácido fólico
Algumas proteínas, enzimas em especial, contêm em sua molécula uma porção não proteica, que é essencial para atividade biológica.
Distinção entre cofator e coenzima depende da força de ligação com a apoproteína. Ex: o NAD+
pode ser cofator de uma enzima (ligação fraca) e ser coenzima de outra (ligação forte). O mesmo ocorre com os metais.
ativa
inativaGrupo Prostético
Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas
recebendo ou fornecendo grupos químicos para a reação
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Algumas enzimas formam intermediários covalentescom seus substratos
QuimotripsinaElastase
EsterasesTrombina
Tripsina
PapaínaGliceraldeído-3-PO4
desidrogenase
Fosfatase alcalinaFosfoglicomutase
Fosfoglicerato mutaseSuccinil-CoA sintase
AldolaseDescarboxilases
Enzimas dependentesde piridoxal fosfato
Grupo reativono sítio ativo
Intermediáriocovalente
Enzimas
Enzimas com o mesmo tipo de mecanismo catalítico, ou seja,
possuem o mesmo grupo de aminoácidos no sítio
ativo, formam intermediários covalentes
similares
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Formas rígidas
E e S se deformam, paraotimizar o encaixe
Emil Fisher (1950)Modelo chave-fechadura• o reconhecimento (especificidade) do substrato pela enzima. • o sítio ativo da enzima é pre-formado e tem a forma complementar à molécula do Substrato, de modo que outras moléculas não teriam acesso a ela.
No entanto, o modelo chave-fechadura não explica a interação das enzimas com inibidores e análogos dos substratos.
Daniel Kosland (1970) Modelo de encaixe induzido• o contacto com a molécula do substrato induz mudanças conformacioais na enzima, que otimizam as interações com os resíduos do sítio ativo.
Enzimas são específicas para o reconhecimento de seus substratos.
Modelo Chave-Fechadura
Modelo Chave-Fechadura
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Carboxipeptidase A é uma enzima digestiva da classe dasmetaloproteinases.
Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profundamudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.
Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, à direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de ZnZn2+2+,, que está
acima do Glu270.
A B
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Mecanismo de ação da quimotripsinaquimotripsina, um exemplo típico de uma serino protease
O H+ é transferido da His-57 para o substrato. A ligação susceptível éclivada, e parte do substrato fica ligadocovalentemente à enzima
Ligação a ser hidrolisada
Enzima interagecom substratos
aromátcos
Tríade catalíticaSer – His - Asp
A Ser-195 transfere H+
para His-57 formando um estado de transiçãotetraédrico com o substrato. O Asp-102 estabiliza o próton na His-57 fazendo uma ligaçãoiônica
A H2O entra no sítioativo e forma umaponte de H+ com a His-57
A H2O transfere H+ para a His-57 e –OH para o substrato, formando um segundoestado de transiçãotetraédrico
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
Victor Henri (1903): E E ++ S S ⇔⇔ EESSAfirmou que um complexo enzima-substrato é um passo essencial na
catálise enzímática
��1913 1913
Leonor Michaelis Leonor Michaelis --EnzimologistaEnzimologista
MaudMaud MentenMenten -- PediatraPediatra
E + SK1
K-1
ESKp
E + P
Etapa rápida Etapa lenta
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A velocidade da reação apresenta três regiões de comportamentodiferente, a medida que se aumenta a concentração do substrato:
-parte a: v aumenta proporcionalmentecom aumentos de S.
-parte b: v aumenta não proporcional-mente com aumentos de S.
-parte c: v não aumenta mais, tendendoa um valor máximo (Vmax), sendo independente da [S]
O gráfico mostra um conjunto de reaçõesque estão acontecendo simultâneamente, conforme as equações abaixo:
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EE ++ SS EE SS P P + + EEK1
K2
K3
e - x s - x xv
Enzimas – Componentes da Reação
K1 = Cte de velocidade de formação do complexo
K2 = Cte de velocidade de dissociação do complexo
K3 = Cte de velocidade de cecomposição do complexo formando o produto
v = Velocidade de formação do produto
s = Molaridade inicial do substrato
e = Molaridade inicial da enzima
x = Molaridade do complexo no instante t
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ENZIMAS CINÉTICA ENZIMÁTICA
Cinética Enzimática
�Determinar as constantes de afinidade do S e
dos inibidores;
�Conhecer as condições ótimas da catálise;
�Ajuda a elucidar os mecanismos de reação;
�Determinar a função de uma determinada
enzima em uma rota metabólica.
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Enzimas Cinética enzimática
E + SK1
K2ES
K3
K4E +P
Km = K2+ K3K1
Estabilidade do complexo ES pode ser expressa pela relação entre as velocidades de dissociação e de formação do complexo
Específico para cada
enzima
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Cinética Enzimática
Com o aumento na concentração do substrato,observa-se uma mudança na Atividade Enzimática
Concentração SubstratoCapítulos Prova
Nota
Atividade
Enzim
ática
Estudante A
Estudante B
Estudante C
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
☺
☺
��
Juang RH (2004) BCbasics
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Aum
entona
Concentração
do Substrato
21 3 4 5 6 7 80
0 2 4 6 8
Substrato (µmole)
Produto
80
60
40
20
0
S+E↓P
(emu m
períodofixo
de tempo)
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Cinética Enzimática
E S+ P+
TeoriaTeoria do Regime do Regime EstacionEstacionááriorio
No estado estacionário, a produção e o consumo do estado de transição dá-se na mesma taxa. Destaforma, a [ ] no estado de transição mantêm-se cte.
SE E
Juang RH (2004) BCbasics
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Concentração do complexo ES em regime estacionário
SP
E
ES
Tempo de Reação
Concentração
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Cinética enzimática
Michaelis e Menten expressaram matematicamente a velocidade da reação pela fórmula:
V=Vm . [S]
Km +[S]
Onde Vm évelocidade máxima da
reação
E + S
K1
K2ES
K3E +P
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Cinética enzimática
Km= [S]
Numericamente, Km pode ser expresso como o [substrato] necessária para que a velocidade da
reação seja metade da velocidade máxima
V máx
[S]
V
Vmax2
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A A constanteconstante de de MichaelisMichaelis--MentenMenten (K(KMM) ) éé um um parâmetroparâmetro cincinééticotico queque traztrazinformainformaççõesões sobresobre a a afinidadeafinidade queque a a enzimaenzima tem tem pelopelo substratosubstrato. .
k1
KM = k-1+ k2
Quando Vf é mais alta do que Vd
k-1+ k2 = pequenok1 = grande
Km baixo
E tem alta afinidade por S
Quando Vd é mais alta do que Vf
k-1+ k2 = grandek1 = pequeno
Km alto
E tem baixa afinidade por S
Considerando a afinidade da E pelo seu S, temos 2 casos:
1. 2.
O KM é numéricamente igual à [substrato] queproduz metade da Vmax .
Substituindo na equação v por Vmax/2, vemos:
Vmax.Km + Vmax.[S] = 2Vmax.[S]
Vmax.Km = Vmax.[S] Km = [S]
Vo=Vmax Vmax = Vmax.[S]2 2 Km + [S]
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y = a . x + b equaçãode reta
Aplicando-se o inverso a ambos
os lados daequação de
Michaelis-Mentem, obtem-se a equação de
Lineweaver-Burk, que é uma funçãolinear (uma reta):
Uma outra forma de se obter os valores de KM e de Vmax é através do gráfico dos duplos recíprocos (1/V x 1/S), e da equação de Lineweaver-Burk.
Tang α
A interseção da reta com o eixo x é igual a -1/KM
substituindo y = 0 na equação, temos:
0 = Km . 1 + 1 -1 = Km . 1 Vmax [S] Vmax Vmax Vmax [S]
-1 = Km - 1 = 1[S] Km [S]
=KM/Vmax
a = coef. angular = Km/Vmax(tangente ângulo alfa)
b = coef. linear = 1/Vmax(interseção com o eixo y)
Onde:
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A velocidade da reaçãosomente é proporcional à
[E]quando a enzima está
saturada, ou seja, reação éde ordem zero (independe)
em relação a [S]
Eficiência catalítica
Kcat/Km
Parâmetro mais adequadopara comparações
cinéticas
- k2 ou kcat (constante catalítica) mede o “podercatalítico” da enzima
v = k2 Etotal + [P] k2 = Vmax (s-1)
[ES] [Etotal]
Para calcular kcat considera-se que toda a E existe como ES, e que v=Vmax
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Exemplo de Cinética Enzimática (Invertase)
Vmax
Km S
vo
1/S
1v
o
Dobro recíproco Plotagem
1)1) Usar uma qtidade pré-defininada de Enzima→ E
2)2) Adicionar o Substrato em várias concentrações.→ S (x )
3)3) Medir o produto em um Tempo fixo (P/t)→ vo
(y )
4)4) (x, y) Plote (curva hiperbólica), estimar → Vmax
5)5) Quando y = 1/2 Vmax obtêm x ([S]) → Km
1Vmax
- 1 Km
1/2
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Exemplo real de cinética EnzimáticaD
ata
no
1234
0.250.501.02.0
0.420.720.800.92
Absorbância v (µmole/min)[S]
0.210.360.400.46
(1) O produto foi medido por espectroscopia a 600 nm
(2) (2) Tempo de reação 10 min
VelocidadeSubstrato Produto Dobro recíproco
1/S 1/v421
0.5
2.081.561.351.16
→→→→
1.0
0.5
0
v
Plo
tage
mD
ireta
Dob
rore
cípr
oco 2.0
1.0
0
1/v
-4 -2 0 2 41/[S]
0 1 2[S]
1.0
-3.8
Lineweaver-Burk
![Page 26: Cinética Enzimatica atual](https://reader034.vdocuments.com.br/reader034/viewer/2022042714/5571f82249795991698cb6c6/html5/thumbnails/26.jpg)
Cinética Enzimática
vo=
Vmax [S]
Km
+ [S]
Km
Vmax &
E1E2E3
1st order
zero order
Competitivo
Não-competitivo
Imcompetição
Plotagem Direta
Duplo recíprocoAfinidade comSubstrato
VelocidadeMáxima Inibição
Atividade
Observe de vo
sobVários [S], resultouna plotagem do rendimentoVmax and K
m
k3
[Et]
kcat
No
Turn over
kcat
/Km
Unid. de Atividade
1 µmolemin
Ativ. Especifica
unitmg
Significância
NÚMERO DE RENOVAÇÃO(TURNOVER NUMBER)
nº de mols de substrato convertido em produto por mol
de enzima em unidade de tempo
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Conclusões sobre Km
Km
Afinidade da enzima pelo substrato
Pequena [substrato] énecessária para a reação
atingir metade da Vmáxima
KmGrande [substrato] é
necessária para a reação atingir metade da Vmáxima
Afinidade da enzima pelo substrato
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Conclusões sobre KmKm Afinidade da enzima pelo substrato
Km Afinidade da enzima pelo substratov
V
V/2 1/V
Km Km s -1/Km -1/Km1/s
Vmáx
V
V/2
Km Km
ENZIMAS
[s]
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Conclusões sobre Km
� Característico de cada enzima� Reflete a afinidade da enzima pelo seu
substrato� É numericamente IGUAL a [substrato] na
qual a velocidade da reação é metade da Vmáxima
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Ordem de Reação
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Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática
•Mantidas fixas as condições de- temperatura ótima- pH ótimo- [enzima]
Vel
oci d
ade
da r
eaçã
o
[S]
Cinética de1a ordem
Cinética deordem zero
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Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática
E E
E E
S+ E E
E E
S E E
E EP
P+
Baixa concentração de substrato
Formação do produto é PROPORCIONAL àconcentração de substrato
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Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática
3/4 de saturação do centro ativo da enzima
S
S
S
+E E
E E
E E
E E
S S
S
E E
E E+
PP
P
PP
P
Formação do produto é PROPORCIONAL àconcentração de substrato
100 % de saturação do centro ativo da enzima
SS
SS
+E E
E E
E E
E E
S S
S S
E E
E E+ P
P
P
P
P
PP
P
![Page 34: Cinética Enzimatica atual](https://reader034.vdocuments.com.br/reader034/viewer/2022042714/5571f82249795991698cb6c6/html5/thumbnails/34.jpg)
Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática
[Substrato] em excesso
SS
S
S
S
S
S
S
+E E
E E
E E
E E
S S
S S
E E
E E + P
P
P
P
P
PP
P
SS
S
SS
SS
S
Velocidade da reação independe da [S]
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Influência da concentração de substrato sobre a atividade enzimática
Quando aformaformaçção de P for ão de P for proporcionalproporcional àà [S][S]
a reação é de1a ORDEM
Quando a velocidade velocidade da reada reaçção independe ão independe da [S]da [S] a reação é de
ORDEM ZERO
Vel
ocid
ade
da r
eaçã
o
[S]
v = K[S]
v = Vmax
![Page 36: Cinética Enzimatica atual](https://reader034.vdocuments.com.br/reader034/viewer/2022042714/5571f82249795991698cb6c6/html5/thumbnails/36.jpg)
Cinética EnzimáticaV
eloc
idad
eda
rea
ção
[S]
Devido à ascensão gradual da curva
hiperbólica édifícil determinar
quando foi atingida a Vmáx
Não se pode calcular com
exatidão os valores de Km e Vmáx
![Page 37: Cinética Enzimatica atual](https://reader034.vdocuments.com.br/reader034/viewer/2022042714/5571f82249795991698cb6c6/html5/thumbnails/37.jpg)
Considerações Finais
� Apresentam alto grau de especificidade;
� São produtos naturais biológicos;
� Reações baratas e seguras;
� São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (108 a 1011 + rápida);
� São econômicas, reduzindo a energia de ativação;
� Não são tóxicas;
� Apresenta um mercado em crescente expansão
![Page 38: Cinética Enzimatica atual](https://reader034.vdocuments.com.br/reader034/viewer/2022042714/5571f82249795991698cb6c6/html5/thumbnails/38.jpg)
Perguntas ?
![Page 39: Cinética Enzimatica atual](https://reader034.vdocuments.com.br/reader034/viewer/2022042714/5571f82249795991698cb6c6/html5/thumbnails/39.jpg)
Para mais informações, visite as páginas abaixo:
http://www.brenda.uni-koeln.de/
http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA/
http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi?id=index;action=clanid