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TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
J. Oliveira Fernandes
Lab. de Bromatologia e Hidrologia
Faculdade de Farmácia U. Porto
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Conjunto de técnicas afins de separação que consistem na separação dos componentes de uma mistura de substâncias por distribuição/repartição
de cada composto entre duas fases:
Fase estacionária
Constituída por uma substância sólida ou líquida aderente a um meio de suporte sólido poroso, com
grande superfície específica
Fase móvel
Constituída por um fluido (líquido ou gasoso), imiscível com a fase estacionária e que se move ao
longo desta
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A separação das diversas substâncias tem como base um fenómeno de
migração diferencial, resultante da diferente afinidade de cada
composto para com as duas fases
Fase móvel
Fase estacionária
Soluto BSoluto A
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A separação das diversas substâncias tem como base um fenómeno de
migração diferencial, resultante da diferente afinidade de cada
composto para com as duas fases
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Fundador da Cromatografia
Usou uma coluna de carbonato de cálcio para separar pigmentos de folhas arrastando-os com um solvente e separando-os numa série de bandas coloridas (cromatografia de adsorção).
1872–1919
Mikhail Semyonovich Tsvet
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Se uma solução de clorofila em éter de petróleo é passada através de uma coluna de adsorvente (p. ex. CaCO3
colocado firmemente num tubo de vidro), os pigmentos separam-se, desde o topo até à parte inferior, em
diferentes zonas coradas, de acordo com séries de adsorção, nas quais as substâncias mais fortemente adsorvidas
deslocam as menos fortemente agarradas para uma maior distância do ponto de partida. Esta separação é
praticamente completa se, após a introdução da solução, se faz passar uma corrente de solvente através da coluna
de adsorvente. Da mesma forma que os raios de luz no espectro, assim ficam os diferentes componentes da
mistura de pigmentos, separados ordenadamente na coluna de carbonato de cálcio, podendo ser assim analisados
qualitativa e quantitativamente. Designo esta preparação por cromatograma e o método correspondente por
cromatografia. É inútil afirmar que os fenómenos de adsorção não são apenas aplicáveis aos pigmentos
clorofílicos. É de esperar que todas as espécies de compostos químicos, corados ou incolores, estejam sujeitos às
mesmas leis.
1º texto sobre Cromatografia – Tswett (1903)
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OUTROS NOMES IMPORTANTES
• Kuhn, Winterstein e Lederer
Separação de carotenos da cenoura e xantofilas da gema de ovo
(1931)
• A. J. P. Martin e A. T. James:
Cromatografia Gasosa
(1952)
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No que respeita ao tipo de suporte, existem 2 grandes grupos de técnicas cromatográficas
►Cromatografia em coluna
A fase estacionária encontra-se confinada a um tubo estreito (coluna) e a fase móvel (líquida,
gasosa ou fluido supercrítico) passa ao longo dela por acção da gravidade ou forçada por um
bomba de propulsão
►Cromatografia planar
A fase estacionária constitui uma fina película sobre uma placa (de vidro, p. ex.) ou nos poros de
um papel. A fase móvel (líquida) move-se através da fase estacionária por capilaridade ou sob
acção da força da gravidade
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Cromatografia em COLUNA
Separação dos pigmentos de folhas de uma planta por cromatografia em coluna
Fase estacionária: gel de sílica
Fase móvel (“eluente”): éter de petróleo:acetona (7:3)
Neste caso a fase móvel desloca-se apenas pela força da gravidade. Nos modernos “cromatógrafos líquidos” (slide seguinte) a fasemóvel é propulsionada por bombas de alta pressão.
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Cromatografia em COLUNA
As colunas (metálicas) têm um enchimento muito compacto, que causa grande resistência à passagem da
fase móvel, de modo que esta é propulsionada com recurso a bombas de alta pressão. Todo o sistema,
incluindo as colunas, deve ser capaz de suportar esta elevada pressão.
Equipamento de cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC):
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Equipamento de cromatografia gasosa (GC)
Cromatografia em COLUNA
As colunas modernas correspondem a tubos abertos de sílica fundida com um revestimento exterior que lhes
proporciona uma grande maleabilidade
A fase estacionária reveste a parede interna da coluna
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A fase estacionária pode ser uma película de partículas sólidas
depositada sobre uma placa de vidro ou alumínio, ou uma simples
folha de papel
A fase móvel desloca-se por capilaridade no sentido contrário à
gravidade
Cromatografia PLANAR
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Tipo de
cromatografia Fase móvel Fase estacionáriaProcesso de
distribuição
AdsorçãoL
GS Adsorção
PartilhaL
GL Partilha
Troca iónica L S Reacção química reversível
Exclusão L S Crivagem molecular
TIPOS DE CROMATOGRAFIA(de acordo com o mecanismo de separação)
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Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por partículas sólidas com acção adsorvente
Cromatografia de Adsorção
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Adsorção
Os componentes da mistura a separar
(amostra), dissolvidos na fase móvel,
adsorvem à superfície das partículas
(sólidas) da fase estacionária
Trata-se de um fenómeno superficial, no
qual assume grande importância a
formação de pontes de hidrogénio
Cromatografia de Adsorção
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Cromatografia em camada fina (TLC – Thin Layer Chromatography)
Placas de vidro ou de alumínio em que se fixou uma fina camada de uma substância
adsorvente, geralmente com a ajuda de um agente ligante - sulfato de cálcio - que facilite a
adesão ao vidro.
HPTLC
Cromatografia em coluna (convencional)
Cromatografia em coluna moderna (HPLC) com fases estacionárias de sílica (fase normal)
Cromatografia gás-sólido
Cromatografia de Adsorção
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Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por um material de suporte impregnado com um líquido
Cromatografia de Partilha
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Partição (partilha)
Os componentes da mistura a
separar (amostra), dissolvidos na
fase móvel, distribuem-se entre
esta e a fase estacionária (líquido a
revestir um suporte sólido) em
função da solubilidade em cada
uma dessas fases, até se atingir um
equilíbrio. Assim, a separação faz-
se com base na diferença nos
coeficientes de distribuição ou de
partição (K) entre as duas fases.
Cromatografia de Partilha
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HPLC com fases estacionárias líquidas (fase reversa)
Cromatografia gás-líquido
Cromatografia em camada fina (apenas em casos excepcionais)
Cromatografia em papel
Cromatografia de Partilha
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Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por um sólido com uma superfície ionizada (positiva ou negativa), capaz de atrair substâncias com carga oposta
Cromatografia de Troca iónica
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Troca iónica
Usada na separação de espécies
iónicas. Os componentes da mistura
a separar com carácter iónico ligam-
se covalentemente à fase
estacionária sólida (geralmente
designada por resina de troca iónica).
Na figura, trata-se de uma resina de
troca aniónica (ou seja, tem cargas
positivas), capaz de separar os
aniões da amostra
Cromatografia de Troca iónica
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Caracteriza-se pelo facto da fase estacionária ser constituída por um material de suporte inerte (gel poroso) caracterizado por apresentar poros com diferentes dimensões
Cromatografia de Exclusão molecular
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• Exclusão molecular (Size exclusion), crivo molecular ou permeação em gel (Gel permeation)
Há uma separação em função do tamanho
das moléculas. Não existem interacções
entre a fase estacionária e os compostos a
separar. As pequenas moléculas penetram
nos poros da fase estacionária. As
grandes são excluídas.
Cromatografia de Exclusão molecular
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CLASSIFICAÇÃO DOS SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS
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Fase estacionária – Substância sólida com carácter adsorvente
Fase móvel – Líquido
Processo de separação – adsorção
Cromatografia em coluna convencional
Factores mais importantes para a eficiência do processo
Selectividade do adsorvente
Força do eluente
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A ELUIÇÃO em cromatografia em coluna
Uma típica separação cromatográfica em coluna:
-A amostra (mistura de A e B) é colocada no topo da coluna (um tubo estreito cheio com um sólido inerte - sob a forma de partículas muito pequenas - que suporta a fase estacionária na sua superfície).
-A introdução de sucessivas porções de eluente “fresco” (fase móvel) vai provocar o deslocamento dos componentes da amostra (eluição).
-O componente B tem maior afinidade para a fase estacionária do que o componente A, pelo que se “atrasa”, saindo da coluna (parte inferior) depois dele.
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Alumina (Al2O3)
Sílica (SiO2)
Celulose
Florisil (mistura de MgO e de sílica)
Carbonatos diversos
Talco
Amido
Carcoal
Adsorventes mais usados
Cromatografia em coluna convencional
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Força
de a
dso
rção
crescente
Adsorção de substâncias orgânicas por grupo funcional
Hidrocarbonetos saturados
Hidrocarbonetos insaturados
Hidrocarbonetos aromáticos
Éteres
Ésteres
Aldeídos e cetonas
Alcoóis
Ácidos e aminas
Cromatografia em coluna convencional
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Cromatografia em coluna convencional
Selectividade dos Solventes
Solubilidade dos diversos componentes da amostra (solutos) no solvente
Interacção entre as moléculas do solvente e a superfície sólida adsorvente
X + n Sad X ad + n S
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Cromatografia em coluna convencional
Sílica Alumina
Ciclohexano PentanoÉter de petróleo Éter de petróleoPentano HexanoTetracloreto de carbono CiclohexanoBenzeno Tetracloreto de carbonoClorofórmio BenzenoÉter etílico Éter etílicoAcetato de etilo ClorofórmioEtanol DiclorometanoMetanol Acetato de etiloAcetona 2-propanolÁc. Acético MetanolÁgua Água
Fo
rça d
e ad
sorçã
o crescen
te
Séries Eluotrópicas
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Cromatografia em camada fina ou Thin Layer Chromatography (TLC)
Placas de vidro ou de alumínio em que se fixou uma fina camada de uma
substância adsorvente, geralmente com a ajuda de um agente ligante -
sulfato de cálcio - que facilite a adesão ao vidro.
A eluição é geralmente no sentido ascendente, por capilaridade
Cromatografia em placa
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Cromatografia em placa
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Preparação da câmara de eluição
Aplicação das amostras
Desenvolvimento do processo cromatográfico
Visualização das manchas (Revelação do cromatograma)
Cromatografia em placa
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Preparação da câmara de eluição
Cromatografia em placa
A câmara de eluição deve ser previamente preenchida com uma pequena quantidade de eluente (geralmente uma mistura de solventes orgânicos), de forma a ocupar cerca de 0.7-1 cm de altura, e de seguida, fechada adequadamente com a tampa de vidro
O processo de desenvolvimento da placa cromatográfica deve iniciar-se apenas alguns minutos depois, de forma a permitir a saturação da fase gasosa com a mistura eluente
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Aplicação das amostras
Cromatografia em placa
Um pequeno volume de amostra (normalmente alguns µL),
correspondente geralmente a um extracto num solvente
volátil da amostra inicial, é colocada perto da extremidade
inferior da placa, mas de forma a ficar acima da altura de
eluente presente no interior da placa. A mancha inicial deve
ficar com um diâmetro não superior a 1-2 mm.
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Cromatografia em placa
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Desenvolvimento do processo cromatográfico
Cromatografia em placa
A fase móvel desloca-se através da fase estacionária por
capilaridade, movendo os componentes d amostra a
diferentes velocidades, de acordo com a sua afinidade para
a fase estacionária e a sua solubilidade no eluente. A
separação fica completa dentro de uns poucos minutos.
Quando a frente de solvente atinge as proximidades da
extremidade superior da placa, a placa é retirada da
câmara, e a “linha” de solvente imediatamente “marcada”
com a ajuda de uma espátula, antes de haver evaporação
do mesmo.
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Cromatografia em placa
Métodos Físicos (não destrutivos)
• Iodo (revelador universal)
• Fluorescência (254 nm, 365 nm)
• Directa
• Por contraste
• Radioactividade
• Etc.
Métodos Químicos (destrutivos)
• Ác. Sulfúrico + aquecimento (revelador universal)
• Reagentes selectivos
• 2,4-dinitrofenil-hidrazina (carbonilos)
• Cloreto férrico (fenóis)
• Ninidrina (aminoácidos)
• Vanilina em HCl (aminas aromáticas)
• etc.
Revelação do cromatograma
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Cromatografia em placa
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Cromatografia em placa – Factor de Retenção
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Cromatografia em placa – Resolução
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Cromatografia em placa
Eluição bidimensional
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Suporte – celulose
Fase estacionária – água
Apenas serve para separação de compostos solúveis em água
Os solventes usados para a eluição têm de formar um sistema parcial ou totalmente miscível
com a água
Podem usar-se papéis impregnados com outros solventes que não a água
Não é possível trabalhar com fins preparativos
Técnicas ascendentes, descendentes, radiais, etc.
Cromatografia em papel (partilha)
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Cromatografia em placa
Cromatografia Preparativa
(separação das manchas e análise por outra técnica, depois de eliminação da fase estacionária)
Cromatografia Analítica
(medição da área das manchas)