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Redutasebonucleótido
QUÍMICA BIOINORGÂNICALicenciatura em Bioquímica
2012/2013
HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
MetaloproteínadeFerro
ProfessoraResponsável:Prof.Dr.AnaCrisinaFreire
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2012/2013CLASSIFICAÇÃO
RibonucleósidodifosfatoRedutase
Nome
2’-desoxiribonucleósido-difosfato:oredoxina-dissulfito2’-oxidoredutaseNomeSistemáco
Oxidoredutase
ClasseEnzimáca
1.17.4.1
NúmeroES
9047-64-7sy
NúmeroCAS
ClasseI —Formanaturalmaisabundante; —Usaoradicardarosinaparaavaraponteférrea. —ReduzNDPsadNDPs.
ClasseII —Encontradaemcianobactérias; —Recorreàadenosinacobalaminaparageraroradical.
ClasseIII —Encontradaapenasemseresvivosanaeróbiosfacultavosouobrigatórios; —Oradicalforma-senumresíduodeglicinapróximodocentroférreo.
ClassesdeRNR[1]
[1]Stubbe,J.A.C.J.e.J.(2011)."ClassIRibonucleodeReductases:MetallocofactorAssemblyandRepairInVitroandInVivo."AnnualReviewofBiochemistry80:733-767.
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Ins/tuiçõeseInves/gadores
• MassachusesInstuteofTechnology(MIT)
• NozomiAndo,DepartamentodeQuímica• JoAnneStubbe,DepartamentosdeQuímicaeBiologia• CatherineL.Drennan,DepartamentodeQuímica
• UniversidadedeOslo
• K.KristofferAndersson,DepartamentodeBiociênciasMoleculares• MahiasKolberg,DepartamentodeBiociênciasMoleculares
• UniversidadedeEstocolmo
• MargaretaSahlin,DepartamentosdeBiosicaeBiologiaMolecular
• FaculdadedeCiênciasdaUniversidadedoPorto
• NunoM.F.S.A.Cerqueira,REQUIMTE• PedroAlexandrinoFernandes,REQUIMTE
•
MariaJoãoRamos,REQUIMTEHENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
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2012/2013RNR
Caracterís/cas:Tetrâmero(duasR1eduasR2)CadasubunidadeR2possuíumnúcleodiférrico
[2] J.Shao, B.Z., Bernard Chu e Y.Yen (2006). "RibonucleodeReductase Inhibitors and Future Drug Design." Current Cancer DrugTargets6:409-431.
Imagensdocentrometálicoobdasaparrdoficheirodecoordenadas1AV8eporvisualizaçãoemChimera®.
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2012/2013
DescriçãodaGeometriaFe(III)
Imagensdocentrometálicoobdasaparrdoficheirodecoordenadas1AV8eporvisualizaçãoemChimera®.
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2012/2013
DescriçãodaGeometriaFe(III)
Imagensdocentrometálicoobdasaparrdoficheirodecoordenadas1AV8eporvisualizaçãoemChimera®.
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2012/2013MecanismoReacional
R1R2
Imagensdocentrometálicoobdasaparrdoficheirodecoordenadas1AV8e1RLReporvisualizaçãoemChimera®.
[3]JillianL.Dempsey,J.R.W.,eHarryB.Gray(2010)."Proton-CoupledElectronFlowinProteinRedoxMachines."AmericanChemicalSociety110:7024-7039. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
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MecanismoReacionalFormaçãodoRadical
O
H
Y122
Fe2+Fe2+
O
O O
O
E115
E238
O
O
E204
O
O
D84
N N
NN
H118
H241
Apoproteína
+2Fe(II)
Geometria:TetraédricacomligeiradistorçãoFe2+:d6deSpinAlto
Mecanismoinspiradonoargo[4]edesenhadoemCSChemBioDrawUltra®.[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
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2012/2013
MecanismoReacionalFormaçãodoRadical
O
H
Y122
Fe2+Fe2+
O
O O
O
E115
E238
O
O
E204
O
O
D84
NN
NN
H118
H241
+O2
Fe(IV)—O—Fe(III)
EstadodeTransiçãoU
PossívelMecanismo:
Fe(III)—O—O—Fe(III)Peróxido
Fe(IV) Fe(IV)
O
O
Mecanismoinspiradonoargo[4]edesenhadoemCSChemBioDrawUltra®.[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
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MecanismoReacionalFormaçãodoRadical
Mecanismoinspiradonoargo[4]edesenhadoemCSChemBioDrawUltra®.[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34.
O
H
Y122
Fe3+Fe4+
O
O
O
O
E115
E238
O
O
E204
O
O
D84
NN
NN
H118
H241
O
OH
Fe(IV)—O—Fe(III)
EstadodeTransiçãoU
+e-(W48.)
EstadodeTransiçãoX
+H2O
O
.
Y122
Fe3+Fe3+
O
HO
O
O
E115
E238
O
O
E204O
O
D84
NN
NN
H118
H241O
OH2
H2O
FormaAva
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MecanismoReacionalReaçãocomADP
ADP
Mecanismoinspiradonoargo[4]emodeladoemChimera®aparrdosficheirosdecoordenadas1RLReADP(ligando)[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
l
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RadicalCisteinil
MecanismoReacionalReaçãocomADP
Mecanismoinspiradonoargo[4]emodeladoemChimera®aparrdosficheirosdecoordenadas1RLReADP(ligando)[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
i i l
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Radical
Carbonilo
MecanismoReacionalReaçãocomADP
Mecanismoinspiradonoargo[4]emodeladoemChimera®aparrdosficheirosdecoordenadas1RLReADP(ligando)[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
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+
—
MecanismoReacionalReaçãocomADP
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+
—
MecanismoReacionalReaçãocomADP
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MecanismoReacionalReaçãocomADP
Mecanismoinspiradonoargo[4]emodeladoemChimera®aparrdosficheirosdecoordenadas1RLReADP(ligando)[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34. HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
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dADP
MecanismoReacionalReaçãocomADP
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MecanismoReacionalReaçãocomADP
PoraçãodaTiorredoxinaapontedissulfuretoéquebrada(Redução)
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2012/2013SAXS
• TitulaçãodasubunidadeR1comsubunidadeR2
• Aumentodovolumedas
par•culascomatulação
• Tetrâmerocomestequiometria1:1
[8] Nozomi Andoa, E. J. B., Chrisna M.Zimanyib, Michael A.Funkb, Kenichi Yokoyamab, Francisco J. Asturiasd, JoAnne Stubbeb,eCatherineL.Drennan"StructuralinterconversionsmodulateacvityofE.coliribonucleodereductase."HENRIQUEFERNANDES([email protected])|JOÃORODRIGUES([email protected])
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2012/2013SAXS
• Paraconcentraçõessuperioresa4mg/mLotetrâmeroformaagregados
[9]U.Uhlin,V.D.,P.V.Konarev,D.I.SverguneL.Thelander"AfirstSAXStest-runtoestablishtheformaonoftheClassIribonucleode
reductase(RNR)complexoftheT4phage."331-332.
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Í Â
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2012/2013SAXS
PerfisdeSAXSsimuladospeloprogramaChimera®
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Í ÂDi í Ci l
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DicroísmoCircularMagné/co
[4] Mahias Kolberg, K. R. S., Pa ̊l Graff, K. Kristoffer Andersson (2004). "Structure, funcon, and mechanism of ribonucleodereductases."1-34.[5]AneB.Tomter,C.B.B.I.,A ̊smundK.Røhr,K.KristofferAndersson,eEdwardI.Solomon(2008)."CircularDichroismandMagnec
CircularDichroismStudiesoftheBiferrousSiteoftheClassIbRibonucleodeReductasefromBacilluscereus:ComparisontotheClassIaEnzymes."Biochemistry47:11300-11309.
EnsaiodeDCM;A–Dadosrecolhidosa4°C;B–Dadosrecolhidosa1,6Ke7T.[5]
• Curva a vermelho corresponde aonúcleo de ferro da RNR (subunidadeR2)daE.coli .
• Pico a 7500 cm-1 evidenciam que osdois Fe(II) (d6) são de spin alto masapresentam sinais opostos pelo queevidenciam um campo paramagnécofraco.
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Í ÂE t i
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EspectroscopiaElectrónica
Legenda:...... 0,1sdepoisdamistura--- 1,1sdepoisdamistura— 20sdepoisdamistura
Intermediárioµ-1,2-peróxido
diférrico(III)Fe3+—O—O—Fe3+
RadicalTirosil
[8]JeffreyBaldwin,W.C.V.,NellyKhidekel,PierreMoenne-Loccoz,CarstenKrebs,AliceS.Pereira,BrendaA.Ley,BoiHanhHuynh,ThomasM.Loehr,Pamela J. Riggs-Gelasco, Amy C. Rosenzweig, e J. Marn Bollinger, Jr. (2001). "Raonal Reprogramming of the R2 Subunit of Escherichia coliRibonucleodeReductaseintoaSelf-HydroxylangMonooxygenase."AmericanChemicalSociety123(29):7017-7030.
R2-W48F/D84E avada por O2emedidoem“stopped-flowspectrofotometry”.Os
espectros foram obdos por mistura deiguais volumes de uma solução de O2saturada e uma solução de 0,14mM daproteínaemtampão.
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Í ÂEspectroscopia de
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EspectroscopiadeMössbauer—>MMO
A—Após0,025segundosB—Após0,08segundosC—Após0,3segundosD—Após60segundos
--- EspectroExperimental
— EspectroTeórico(nãoprevêaexistênciadeumaespécieintermediária)
[8]JeffreyBaldwin,W.C.V.,NellyKhidekel,PierreMoenne-Loccoz,CarstenKrebs, Alice S.Pereira,BrendaA. Ley,Boi Hanh Huynh, Thomas M.Loehr,PamelaJ.Riggs-Gelasco,AmyC.Rosenzweig,eJ.MarnBollinger,Jr.(2001)." Rao nal R ep ro gram mi ng o f the R 2 S ub un it o f E sche ri ch ia col iRibonucleode Reductase into a Self-Hydroxylang Monooxygenase."
AmericanChemicalSociety123(29):7017-7030.
“Mössbauer spectra of freeze-quenched” de amostrasobdasporreaçãode0,56mMdeapoproteínaR2-W48F/D84E,1,7mMFe(II)e1,9mMO2at5°Cem50mMNa-
Hepes(pH7.6).
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QUÍMICA BIOINORGÂNICA
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EXAFS—IntermediárioX
[6]PamelaJ.Riggs-Gelasco,L.S.,ShuxianChen,DougBurdi,BoiHanhHuynh,LawrenceQue,Jr.,eJoAnneStubbe(1997)."EXAFSCharacterizaonoftheIntermediateXGeneratedDuringtheAssemblyoftheEscherichiacoliRibonucleodeReductaseR2DiferricTyrosylRadicalCofactor."AmericanChemicalSociety120.
Resultados de EXAFS; A corresponde à formanavaantesde seangiro intermediárioX;Bcorresponde ao intermdiário X da R2; CcorrespondeaumaformadaY122marcada.
TransformadadeFourierparaosvalores obdos por EXAFS aparr de 5 amostras contendointermediárioX
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QUÍMICA BIOINORGÂNICAIntermediário X
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IntermediárioXCoordenação
Correspondema transferência d-d permidas por spin para o Fe(IV)(d4)despinalto.OFe(III)despin alto não possuí nenhumatransiçãod-dpermidaporspin.
Bandasdetransferênciadecarga
[7]NatasˇaMic´,L.S.,GerhardSchenk,J.MarnBollinger,Jr.,eEdwardI.Solomon(2003)."Rapid-Freeze-QuenchMagnecCircularDichroismofIntermediateXinRibonucleodeReductase:NewStructuralInsight."AmericanChemicalSociety125(37):11200-11201.
IntermediárioR2-Y122F/Y356F-X;A–ResoluçãogaussianadosdadosdeDCMa10K;B—ResoluçãogaussianadosdadosdeDCMa1,7K7T.
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QUÍMICA BIOINORGÂNICA
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Compostosinté/cos
[10]LawrenceQue,J.(1997)."Oxygenacvaonatnon-hemediironacvesitesinbiology:lessonsfrommodelcomplexes."JournalChemistrySociety:3933-3940.
Exemplo de dois compostos
que mimezam o centrometálico da RNR. (Rosa) Fe;(Vermelho) O; (Cinzento) C;(Roxo) N; (Azul) N do grupoamino
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QUÍMICA BIOINORGÂNICA
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2012/2013BibliografiaComplementar
[11]LivJ.Rather,E.B.,WaelIsmaileGeorgFuchs(2011)."ThereducingcomponentBoxAofbenzoyl-coenzymeAepoxidasefromAzoarcusevansiiisa[4Fe–4S]protein."Elsevier1814:1609-1615.[12] Guro K. Sandvik1, A. B. T., Jonas Bergan, Giorgio Zoppellaro, Anne-Laure Barra, A ̊smund K. Røhr, MahiasKolberg,SanEllefsen,K.KristofferAnderssoneGoranE.Nilsson(2012)."StudiesofRibonucleodeReductaseinCrucianCarp—AnOxygenDependentEnzymeinanAnoxiaTolerantVertebrate."PlosOne7(8).[13]BradS.Pierce,T.E.E.,eMichaelP.Hendrich(2002)."MechaniscImplicaonsfortheFormaonoftheDiiron
ClusterinRibonucleodeReductaseProvidedbyQuantaveEPRSpectroscopy."AmericanChemicalSociety125:8748-8759.[14] Ane B. Tomter, G. Z., Florian Schmitzberger, Niels H. Andersen, Anne-Laure Barra, Henrik Engman, Pa ̈rNordlund,e K. KristofferAndersson(2011)."HF-EPR,Raman, UV/VIS Light Spectroscopic, and DFT Studies of theRibonucleodeReductaseR2TyrosylRadicalfromEpstein-BarrVirus."PlosOne6(9).
[15]Wen-GeHan,T.L.,TimothyLovell,eLouisNoodleman(2005)."AcveSiteStructureofClassIRibonucleodeReductase Intermediate X: A Density Funconal Theory Analysis of Structure, Energecs, and Spectroscopy."AmericanChemicalSociety127:15778-15790.[16]NunoM.F.S.A.Cerqueira,P.A.F.,LeifA.Eriksson,eMariaJoãoRamos(2006)."DehydraonofRibonucleodesCatalyzedbyRibonucleodeReductase:TheRoleoftheEnzyme."BiophysicalJournal90:2109-2119.