DOUTORADO EM ODONTOLOGIA

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA

TÂNIA ROCHA CABRAL RIBAS

DIVERSIDADE BACTERIANA NO BIOFILME SUBGENGIVAL DE

INDIVÍDUOS COM PERIODONTITE AGRESSIVA LOCALIZADA

Guarulhos

2012

TÂNIA ROCHA CABRAL RIBAS

DIVERSIDADE BACTERIANA NO BIOFILME SUBGENGIVAL DE

INDIVÍDUOS COM PERIODONTITE AGRESSIVA LOCALIZADA

Tese apresentada à Universidade Guarulhos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia.

Área de concentração: Periodontia Orientador: Prof. Dr. Marcelo de Faveri

Co - orientadora: Profª. Dra Magda Feres

Guarulhos

2012

Dedico este trabalho a todos aqueles que me

apoiaram para a concretização de um sonho.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me conceder tantos momentos de grande alegria e em especial, este importante

passo na minha carreira profissional.

Ao meu orientador Profº Dr Marcelo de Faveri que me abriu um novo horizonte e acreditou

no meu desenvolvimento científico apontando uma trajetória complexa, mas possível de ser

atingida. Muito Obrigada!

Aos meus pais pelo amor, exemplo de vida, por ser meu porto seguro e pela minha formação

moral e intelectual que permitiram o meu desenvolvimento pessoal e profissional.

Ao meu amado marido “Ribas” pela paciência, atenção e companheirismo nas horas difíceis.

Aos meus dois “lindos” filhos Ana Lia e Rafael, razão de nossas vidas, pelo entendimento das

horas da minha ausência.

Aos meus irmãos Vânia, Vidal, Lânia, Vilar, Luís, Glênia, Sidney e Taninha pelas vibrações

de apoio em silêncio, carinho e amor.

Aos meus queridos sobrinhos: Nayra e Nayara, Dalise, Fernanda e Julia, Igor e Davi.

Aos professores do Curso de Pós-graduação pelo estímulo constante e por compartilhar seus

conhecimentos durante todo o processo do nosso desenvolvimento científico. Obrigada!

Aos meus amigos e orientadores profissionais Dr. Pascoal Laércio Armonia e Guilherme

Saraceni Junior que me mostraram o encantamento da docência.

A todos os professores do Curso de Graduação de Odontologia pelo companheirismo e apoio

nos vários períodos que me ausentei de minhas atividades no curso, em especial Profª Mônica,

Ana Paula, Paula, Andressa, Ricardo, Max, Leonardo, Calil.

Ao meu querido amigo Prof° Perito pelo exemplo de profissionalismo e principalmente pela

liderança harmônica e alegre que realiza, facilitando a integração da nossa equipe. Obrigada

pelo companheirismo e ensinamentos diários.

À Universidade Guarulhos pelo suporte financeiro concedido e em especial à Coordenadora

da Pós-Graduação Profª Magda Feres por ter viabilizado o meu sonho.

A FAPESP – Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro

concedido para o desenvolvimento desta pesquisa.

Aos meus colegas do doutorado e em especial o Profº Ênio e Profº Ivan pela amizade,

convivência e auxílio no laboratório de pesquisas.

As nossas queridas Izilvânia e Cristina por todo o auxílio e agradável convivência.

A bibliotecária Mariana Feitosa pelo excelente auxílio bibliográfico.

Agradecimento especial a todos os pacientes da clínica de Odontologia da Universidade

Guarulhos sem os quais não seria possível o desenvolvimento desta pesquisa.

A minha filha espiritual e anjo da guarda de todas as horas Lucileni de Almeida Suliano

minha eterna gratidão.

“Sua profissão não é aquilo que traz para casa o seu salário.

Sua profissão é aquilo que foi colocado na terra para você

fazer com tal paixão e tal intensidade que se torna chamamento

espiritual”

Vicente Van Gogh

Resumo O objetivo deste estudo foi determinar a diversidade bacteriana no biofilme

subgengival de indivíduos com periodontite agressiva localizada (PAgL) e com saúde periodontal (SP) usando métodos moleculares independentes de cultura baseados na clonagem do gene 16S rRNA pelo método de Sanger. Quinze indivíduos com PAgL e 15 indivíduos com saúde periodontal (SP) foram selecionados. Nos indivíduos com PAgL, foram coletadas amostras de placa subgengival de 2 sítios subgengivais, sendo um sítio com profundidade de sondagem (PS) > 5mm com sangramento a sondagem e um sítio com PS < 3mm sem sangramento à sondagem (SS). Nos indivíduos com SP foi coletado 1 sítio subgengival com PS < 3mm como controle. O DNA de todas as amostras foi extraído e posteriormente a presença de Aggregatibacter actinomycetemcomitans de máxima e mínima leucotoxicidade foi avaliada por reação em cadeia da polimerase (PCR). Posteriomente, o gene 16S rRNA foi amplificado usando o par de iniciadores universais 4F - 1541R e 4F - 1492R. Os genes amplificados foram clonados, seqüenciados e identificados comparando com o banco de dados de seqüências 16S rRNA. Nove dos 15 indivíduos com PAgL eram colonizados pelo A. actinomycetemcomitans, sendo que 7 apresentavam a cepa de alta leucotoxicidade. Em relação à análise clonal do gene 16S, um total de 2.041 clones foram sequenciados, sendo 697 clones para as bolsas profundas (PS>5mm) do grupo com PAgL, 666 clones para as bolsas rasas (PS<3mm) do grupo PAgL e 678 clones para as amostras (PS<3mm) nos indivíduos com SP. Cento e sessenta e quatro diferentes espécies/filotipos foram identificadas nas 45 amostras analisadas sendo que 42% destas espécies ainda não foram cultivadas. Nos indivíduos com saúde periodontal, espécies do gênero Streptococcus representaram cerca de 32,7% dos clones analisados. Por outro lado, este gênero representou apenas 14,1% e 13,0% dos clones encontrados nos sítios rasos e profundos dos indivíduos com PAgL, respectivamente. Actinomyces sp. BL008/OT171 e Actinomyces sp. IP073/OT448 foram as espécies de bactérias ainda não cultivadas encontradas em freqüência e número de clones mais elevados nos indivíduos com saúde periodontal. Parvimonas micra, Selenomonas sputigena, Filifactor alocis, Pseudoramibacter alactolyticus, Dialister pneumonsites, Dialister invisus, Synergistes sp BH007/OT359, Prevotella sp. AH125/OT292, Desulfobulbus sp. R004/OT041, Selenomonas sp. DS051/OT137, foram as espécies de bactérias incomuns ou ainda não cultivadas encontradas em freqüência e número de clones mais elevados nos indivíduos com periodontite agressiva localizada. Em conclusão, a diversidade da microbiota subgengival de indivíduos com PAgL difere marcadamente da observada em indivíduos periodontalmente saudáveis, sendo que existem diferenças entre a diversidade bacteriana presente nos sítios rasos dos indivíduos com PAgL e sítios rasos com saúde periodontal. Palavras-chave: Periodontite agressiva, microbiota subgengival, bactérias ainda não-cultiváveis, gene 16S rRNA, sondas genômicas

Abstract The aim of this study was to determine the bacterial diversity in subgingival

biofilm of individuals with localized aggressive periodontitis (LAgP) and periodontally healthy (PH) subjects. Fifteen individuals with LAgP and 15 periodontally healthy (PH) individuals were selected. In individuals with LAgP, subgingival biofilm samples were collected from 2 subgingival sites, one with probing depth (PD) > 5mm and the other with PD < 3mm. In PD healthy individuals samples were collected from 1 subgingival site with PD < 3mm. DNA of all samples was extracted and gene 16S rRNA was amplified using the pair of universal initiators. Amplified genes were cloned, sequenced and identified by comparing with the 16S rRNA sequence data bank A total of 2.041 clones were sequenced, with 697 and 666 clones for deep and shallow pockets of the LAgP group, respectively and 678 clones for samples from the PH group. In the SP group, species of the genus Streptococcus represented around 32.7% of the clones analyzed. Whereas, this genus represented only 14.1% and 13.0% of the clones found in the shallow and deep sites of individuals with LAgP, respectively. Actinomyces sp. BL008/OT171 and Actinomyces sp. IP073/OT448 were the species of bacteria not yet cultivated found with higher frequency in clones of PH individuals. Parvimonas micra, Selenomonas sputigena, Filifactor alocis, Pseudoramibacter alactolyticus, Dialister pneumonsites, Dialister invisus, Synergistes sp BH007/OT359, Prevotella sp. AH125/OT292, Desulfobulbus sp. R004/OT041, Selenomonas sp. IP073/OT448 were the uncommon, or not-yet-cultivated species of bacteria found with higher frequency in clones of individuals with LAgP. In conclusion, the diversity of the subgingival microbiota of individuals with LAgP differs remarkably from that observed in PH individuals, and there are differences between the bacterial diversity present in shallow sites of individuals with LAgP and shallow sites in those who are PH.

Key Words: Aggressive Periodontites, subgingival microbiota, non cultivable bacteria, gene

16S rRNA, genomic probes.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA 12

1.1 Periodontite agressiva localizada 12

1.2. Estudo de Metagenômica 14

2. OBJETIVO 18

3. MATERIAL E MÉTODOS 19

1.2 Seleção da população 19

3.2. Avaliação clínica 19

3.3. Critérios de inclusão e exclusão 20

3.3.1.Critérios de inclusão 20

3.3.2.Critérios de exclusão 20

3.4 .Seleção dos sítios-teste 21

3.4.1 Coleta das amostras de placa subgengival 21

3.5 Análise microbiológica. 21

3.5.1.Extração de DNA 21

3.5.2. Amplificação da região 16S rRNA de A.actinomycetemcomitans

pela reação em cadeia da polimerase 22

3.5.3. Amplificação da região 16S rRNA pela reação em cadeia da

polimerase (PCR) 22

3.5.4. Clonagem 23

3.5.5. Sequenciamento 24

3.5.6. Análise das sequencias do gene 16S rRNA 25

3.5.7.Análises estatísticas 25

4.RESULTADOS 26

4.1.Resultados Clínicos 26

4.2. Resultados Microbiológicos 27

5. DISCUSSÃO 37

6. CONCLUSÃO 42

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 43

ANEXO A 50

12

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

1.1. Periodontite agressiva localizada

A periodontite agressiva (PAg) é uma infecção que acomete indivíduos

sistemicamente saudáveis, caracterizada por uma grande perda de inserção clínica associada a

uma rápida destruição óssea alveolar, atingindo normalmente indivíduos jovens

(ARMITAGE, 1999; LANG et al., 1999; TONETTI e MOMBELLI, 1999). Esta infecção

pode apresentar-se na forma localizada ou generalizada, dependendo de sua extensão

(ARMITAGE, 1999; LANG et al., 1999; ARMITAGE, 2004; ARMITAGE, 2010). A forma

localizada da PAgL caracteriza-se por perdas ósseas e de inserção localizadas na região

interproximal dos primeiros molares e incisivos permanentes, não envolvendo mais do que

dois elementos dentários, além dos molares e incisivos (ARMITAGE, 1999). A perda óssea

vertical, progressão rápida, moderada inflamação com pequena presença ou ausência de

cálculo e resposta imunológica aumentada para determinados agentes infecciosos, são

importantes características da periodontite agressiva localizada (PAgL).

A microbiota da PAgL é complexa consistindo geralmente de bactérias anaeróbias

Gram-negativas, tais como Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas

gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Campylobacter rectus e

Fusobacterium ssp. (LOESCHE et al., 1985; MULLALY et al., 2000; KAMMA et al., 2001;

KAMMA et al., 2004; FAVERI et al., 2009; SANZ e WINKELHOFF, 2011). O papel de

bactérias específicas, especialmente do A. actinomycetemcomitans na forma localizada da

periodontite agressiva tem sido extensivamente estudado em adolescentes e adultos jovens.

Slots et al. (1980) analisando por meio de cultura microbiana, amostras de biofilme

subgengival de bolsas periodontais profundas de pacientes portadores de PAgL, detectaram A.

actinomycetemcomitans em 9 dos 10 indivíduos analisados. Outros estudos detectaram A.

actinomycetemcomitans em cerca de 75 a 100% das amostras de biofilme de bolsas

periodontais de indivíduos com PAgL (SLOTS et al.,1980; MANDELL e SOCRANSKY,

1981; ZAMBON et al., 1983; CHISTERSSON et al., 1985; ZAMBON, 1985; RUSSO et

al.,1998; LEE et al.,2003; YANG et al., 2004; CORTELLI et al., 2005) demonstrando assim a

possível relação existente entre este patógeno e a forma agressiva das periodontites. Por outro

lado, a prevalência deste patógeno em indivíduos jovens sem perdas ósseas alveolares ou

portadores de periodontite crônica é mais baixa, variando entre 19 a 28% respectivamente

(TINOCO et al., 1997; MOMBELLI et al., 2002; CORTELLI et al., 2005).

13

O A. actinomycetemcomitans é um cocobacilo, fermentativo, Gram-negativo,

capnofílico, imóvel e anaeróbio facultativo e vêm demonstrando capacidade de invadir as

células epiteliais da gengiva humana in vitro, células endoteliais vasculares humana; e células

epiteliais bucais in vivo (SREENIVASAN et al., 1993; SCHENKEIN., et al., 2000; RUDNEY

et al., 2001; NOGUSHI et al., 2003). Embora esta espécie seja considerada o principal

patógeno na PAg, existem dados contraditórios na literatura (HAN et al., 1991; LOPEZ et al.,

1996; MULLALY et al., 2000; KAMMA et al., 2001; ISHIKAWA et al., 2002;

TREVILATTO et al., 2002; TAKEUCHI et al., 2003; GAJARDO et al., 2005). Mullally et

al. (2000) e Kamma et al. (2001) estudando populações na Irlanda do Norte e na Grécia,

respectivamente, observaram por meio da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR)

uma baixa prevalência de A. actinomycetemcomitans (28% e 18,8%) em bolsas periodontais

de indivíduos com PAgL. Em outro estudo, Han et al. (1991) não detectaram esta espécie em

nenhuma das 23 amostras subgengivais obtidas de indivíduos chineses portadores de PAg.

Trevilatto et al. (2002) estudaram uma família brasileira com PAg (n=14) e relataram uma

baixa prevalência de A. actinomycetemcomitans, questionando assim o valor do isolamento

deste microrganismo como forma de diagnóstico. Gajardo et al. (2005) por meio de cultura

microbiana isolaram este periodontopatógeno em apenas 19,4% das bolsas periodontais de 30

indivíduos com PAg em uma população chilena. Esta baixa prevalência de A.

actinomycetemcomitans na população chilena já havia sido reportada previamente por Lopez

et al. (1996). Complementando, Mombelli et al. (2002), em uma revisão sistemática da

literatura, relataram que a presença ou ausência do A. actinomycetemcomitans não pode ser

um parâmetro para diferenciar indivíduos com periodontite agressiva e/ou crônica. Assim,

estes estudos sugerem que outros microrganismos podem estar associados à etiologia da PAg.

Outro ponto que deve ser ressaltado são a patogenicidade e mecanismos de virulência

descritos para as cepas de A. actinomycetemcomitans, sendo os principais: fator cito-letal (lct)

e leucotoxina (ltx). A toxina distensora cito-letal é capaz de causar parada de ciclo celular na

fase G2, levando a distensão das células epiteliais e fibroblastos, além de agir sobre linfócitos

T (SUGAI et al.,1998; MAYER et al., 1999). A ltx pertence à família das toxinas de

repetição (RTX), sendo codificada por 4 genes designados ltxC, ltxA, ltxB, e ltxD. A estrutura

da ltx é designada ao gene A, e os demais genes são responsáveis pela ativação e transporte da

toxina. (LALLY et al., 1999). A ltx é expressa de maneira distinta entre as diferentes cepas de

A. actinomycetemcomitas, sendo algumas cepas produtoras de elevados níveis da toxina,

consideradas cepas leucotóxicas que apresentam uma deleção de 530 pb na região promotora

do operon ltx e as cepas consideradas de baixa leucotoxicidade que apresentam a região

14

promotora sem alterações com um tamanho de 1022 pb (BROGAN et al., 1994; MAYER et

al., 1999; HAUBEK., 2009).

Como já descrito anteriormente, outros patógenos podem estar envolvidos com a

etiologia da PAgL. Faveri et al. (2009) estudaram o perfil microbiano do biofilme subgengival

de indivíduos com PAgL e comparando com indivíduos com saúde periodontal, periodontite

crônica (PC) e periodontite agressiva generalizada (PAgG). Os autores relataram que espécies

do complexo vermelho (T. forsythia, P. gingivalis e Treponema denticola) e algumas espécies

do complexo laranja (Campylobacter gracilis, Eubacterium nodatum e Prevotella intermedia)

foram encontradas em elevados níveis, proporções e prevalência nos indivíduos com PAgL.

Além disso, os autores observaram níveis aumentados de A. actinomycetemcomitans em sítios

com profundidade de sondagem <3mm e entre 4-6mm de indivíduos com PAgL em

comparação aos grupos PAgG e PC. Esta diferença não foi observada em sítios mais

profundos. Os autores observaram ainda baixos níveis de espécies de Actinomyces nos

indivíduos com PAgL. Em conclusão, os autores sugerem que o A. actinomycetemcomitans

pode estar associado com o início da PAgL e outras espécies tais como T.forsythia,

P.gingivalis, T. denticola, C.gracilis, E.nodatum e P.intermedia podem ser patógenos

importantes na progressão da doença. Desta forma, uma vez que a diversidade bacteriana

presente no ambiente subgengival das PAgL ainda não foi completamente definido, outros

estudos devem ser realizados para estudar a fundo a diversidade bacteriana presente nestes

indivíduos e assim aumentar a compreensão da etiologia e formas de tratamento para esta

infecção.

1.2 Estudos de Metagenômica

Seguindo a taxonomia Lineana tradicional, baseada em dados morfológicos e

fisiológicos, todas as formas de vida na Terra podem ser classificadas em 5 reinos: Animalia,

Plantae, Fungi, Protista e Monera (WHITTAKER.,1969). Além disso, pode-se também

dividir a vida em dois tipos fundamentais: aqueles que possuem uma membrana nuclear

(eucariotos) e aqueles que não a possuem (procariotos), de modo que a maior diversidade da

vida na terra era devido aos Eucariotos, particularmente às suas formas multicelulares

(WHITTAKER.,1969). Os procariotos (Reino Monera) eram considerados simples, primitivos

e relativamente uniformes em suas características (HUGENHOLTZ e PACE, 1996) e esses

sistemas perduraram até 1990 quando Woese et al. (1990) utilizaram as comparações de

sequências de 16S e 18S rRNA para propor uma nova classificação universal para a grande

diversidade existente no meio ambiente. Pela primeira vez uma proposta completa de

15

classificação foi feita baseada em dados moleculares e não morfológicos (WOESE,

KANDLER e WHEELIS, 1990). Os autores propuseram a criação de um novo nível

taxonômico, denominado Domínio, sendo a vida no planeta dividida em três Domínios:

Bacteria, Archaea e Eukarya, já que o sistema de 5 Reinos era insuficiente e não refletia a

filogenia natural dos seres vivos. Desta forma, estudos avaliando a diversidade de

microrganismos presentes nestes domínios em diferentes ambientes e a evolução das

metodologias de biologia molecular vem contribuindo significativamente para um grande

avanço do conhecimento sobre diversidade microbiana (HUNTER-CEVERA,1998). O termo

diversidade para a biologia é geralmente utilizado para descrever o número de espécies

presentes em um habitat. Em termos moleculares, a diversidade é caracterizada pelo número

de diferentes tipos de sequências de DNA encontradas em um ambiente.

Inúmeros métodos têm sido utilizados para a identificação dos microrganismos

bucais. As técnicas de microscopia de contraste de fase e de campo escuro podem demonstrar

diferenças de tamanho, forma e motilidade dos microrganismos presentes no biofilme dental.

Porém, estes métodos microscópicos não diferenciam as espécies bacterianas (LOESCHE et

al., 1985; BELTRAMI et al., 1987; OMAR et al., 1999; DAHAN et al., 2004). O método de

cultura, considerado o “padrão-ouro”, é capaz de identificar diversos microrganismos

presentes no biofilme dental, além de ser extremamente importante para a busca de novas

espécies e para a determinação da susceptibilidade microbiana a diferentes antibióticos (ALI

et al., 1992; LIE et al., 1995). Entretanto, estima-se atualmente que a cavidade bucal apresente

aproximadamente 700 espécies de bactérias, sendo que mais de 40% destas espécies ainda

não foram cultivadas (DEWHIRST et al., 2010). Assim, outros microrganismos poderiam

estar associados às doenças periodontais, embora muitos não tenham sido ainda cultivados e

caracterizados (PASTER et al., 2001; HUGHES et al., 2001; KUMAR et al., 2005, SANZ e

WINKELHOFF, 2011). Para determinar a diversidade bacteriana sem a necessidade do

cultivo dos microrganismos, foram desenvolvidos métodos baseados na extração do DNA da

amostra, amplificação da região do gene 16S rRNA com a utilização de iniciadores universais,

clonagem do amplicon em plasmídeo inserido em Escherichia coli e posterior

sequenciamento genético. Esta metodologia vem sendo utilizada em inúmeros estudos de

Metagenômica em vários ambientes, incluindo a cavidade bucal (HUGENHOLTZ e PACE,

1996; HUGENHOLTZ et al., 1998; PASTER et al., 2001; KAZOR et al., 2003; KUMAR et

al., 2005; FAVERI et al. 2008; WADE, 2011; TELES., 2011).

Os RNA ribossomal (rRNA) está entre as macromoléculas mais conservadas

evolutivamente em todos os seres vivos. Seu papel funcional no sistema de processamento de

16

informações deve ter sido bem estabelecido nos primeiros ancestrais comuns de Bacteria,

Archaea e Eukaria. Os genes dos rRNA em todos os organismos contemporâneos partem de

um ancestral comum e eles não parecem submeter-se à transferência lateral de gene entre

espécies. Por causa das unidades funcionais, grandes porções nos genes rRNA são bem

conservadas e suas sequências podem ser usadas para medir distâncias filogenéticas, mesmo

entre os organismos mais distintamente relacionados. Variações nas sequências dos

nucleotídeos do gene de rRNA são indícios de mudanças evolucionárias. Resultados de

filogenia baseados nas análises do gene 16S, 18S e 23S rRNA revelaram separação dos

domínios Bacteria, Archaea e Eukaria. O gene 16S rRNA é uma das moléculas que compõe a

subunidade menor do ribossomo nos domínios Archaea e Bacteria. O gene 16S rRNA possui

também 9 regiões variáveis, alternadas com regiões conservadas, denominadas de V1 a V9.

Estas regiões são utilizadas para determinação de filogenia (WOESE et al.,1990). Áreas

variáveis podem ser usadas para estudar as relações evolutivas entre dois organismos muito

próximos. Já as áreas conservadas podem ser usadas para revelar relações antigas entre duas

moléculas. Desta forma, os estudos de diversidade utilizam os conhecimentos adquiridos com

o gene 16S rRNA para estudar diferentes habitats (WADE, 2011).

Recentemente, Faveri et al. (2008) analisaram a diversidade bacteriana no

ambiente subgengival de 10 indivíduos com PAgG. Os autores observaram uma alta

diversidade bacteriana na microbiota desses indivíduos e que espécies de Selenomonas

poderiam estar envolvidas na etiologia da forma generalizada da PAg. Assim sendo,

investigações realizadas utilizando este modelo em amostras de biofilme subgengival de

pacientes portadores de PC (SAKAMOTO et al., 2000; PASTER et al., 2001; KUMAR et al.,

2003; KUMAR et al., 2005) e de PAgG (FAVERI et al., 2008) demonstraram a presença de

novos filotipos (espécies) de bactérias que poderiam estar associadas às periodontites.

Deferribacteres sp. D084 e BH017, Megasphaera sp. BB166 e CS025, TM7 sp. AH040, TM7

sp. BS003, Eubacterium sp. BB167, Prevotella sp. DO027, Eubacterium saphenum,

Cryptobacterium curtum, Filifactor alocis, Dialister pneumosintes, Dialister sp. GBA27,

Selenomonas sputigena, Selenomonas sp. EW084 e FNA3, Selenomonas sp. CS002,

Prevotella denticola, Porphyromonas sp. BB136, Peptostretococcus sp. AJ062, Bacteroidetes

sp. AU126, Pseudoramibacter alactolyticus, Solobacterium moorei, Brevundimonas

diminuta, Veillonella atypica e Granulicatella adiacens são alguns exemplos de

espécies/filotipos que tem sido sugerido como possíveis patógenos periodontais em diferentes

estudos (PASTER et al., 2001; KUMAR et al., 2003; KUMAR et al., 2005; KUMAR et al.,

2006; PASTER et al., 2006; FAVERI et al., 2008; COLOMBO et al., 2009). Por outro lado,

17

espécies/filotipos tais como, Veillonella sp. X042, Deferribacteres sp. W090, Bacteroidetes

sp. BU063, Atopobium rimae, Atopobium parvulum, e espécies do gênero Streptococcus e

Granulicatella sp. são indicados com associação com a saúde periodontal (AAS et al., 2005;

KUMAR et al., 2005).

Em outro estudo, Kumar et al (2003) a partir da análise de amostras provenientes

de pacientes com Periodontite Crônica e indivíduos com saúde periodontal, por meio de

clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA, identificou diversos gêneros, ainda não

cultivados, que foram associados a periodontite e representados por bactérias Gram-positivas,

incluindo espécies do gênero Peptostreptococcus e Filifactor. Além disso, espécies dos

gêneros Megasphaera e Desulfobulbus também foram encontradas em elevados níveis em

indivíduos com PC, bem como níveis de várias espécies ou filotipos de Campylobacter,

Selenomonas, Deferribacteres, Dialister, Catonella, Tannerella, Streptococcus, Atopobium,

Eubacterium e Treponema. Já as espécies de Streptococcus e Veillonella spp. foram

encontradas em números elevados em todas as amostras e representaram uma fracção

significativamente maior em indivíduos saudáveis quando comparado a indivíduos com PC. O

perfil microbiológico da saúde periodontal também incluiu espécies do gênero

Campylobacter, Abiotrophia, Gemella, Capnocytophaga e Neisseria. P.gingivalis, P.

denticola e T. forsythia foram raramente detectadas neste estudo e somente T. forsythia

apresentou uma associação com a doença.

Até o presente momento, nenhum estudo analisou a diversidade bacteriana

presente no ambiente subgengival de indivíduos com PAgL. Desta forma, o uso da

metodologia de clonagem e sequenciamento do gene 16S rRNA em amostras de biofilme

subgengival de indivíduos com PAgL é importante para analisar a diversidade e observarmos

se existem espécies que ainda não foram cultivadas envolvidas com a etiologia desta doença.

18

2. OBJETIVO

Determinar a diversidade bacteriana presente no biofilme subgengival de

indivíduos com PAgL e com saúde periodontal pela técnica de Sanger de clonagem e

sequenciamento genético.

19

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Seleção da população

Foram selecionados 15 indivíduos com PAgL (grupo teste) e 15 indivíduos com

saúde periodontal (SP, grupo controle). Todos os participantes foram informados sobre o

objetivo do estudo, seus riscos e benefícios, incluindo os tipos de medições clínicas e forma

de coleta de amostras. Os pacientes que concordaram em participar do estudo assinaram um

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, responderam a um questionário de

saúde/anamnese e quando necessário receberam a terapia periodontal, estando de acordo com

as diretrizes e normas do Conselho Nacional de Saúde (Resolução n° 196/96) (ANEXO).

3.2 Avaliação clínica

O exame clínico periodontal foi realizado por um único examinador previamente

treinado e calibrado no início do estudo com o objetivo de realizar o diagnóstico do indivíduo

e selecionar os sítios-teste. Todos os dentes, exceto os terceiros molares, foram avaliados em

6 sítios (mésio-vestibular, vestibular, disto-vestibular, mésio-lingual, lingual, disto-lingual),

para os seguintes parâmetros:

- Índice de placa visível - IPV (AINAMO e BAY, 1975): presença (escore 1) ou

ausência (escore 0) de biofilme dental supra gengival visível, após lavagem e secagem dos

dentes.

- Índice de sangramento gengival – ISG (AINAMO e BAY, 1975): presença

(escore 1) ou ausência (escore 0) de sangramento na gengiva marginal após percorrer

levemente a sonda periodontal ao longo do sulco gengival.

- Profundidade de sondagem – PS: distância, em milímetros, entre a margem

gengival livre e a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal.

- Nível clínico de inserção - NCI: distância, em milímetros, entre a junção

esmalte-cemento e a porção mais apical sondável do sulco/bolsa periodontal.

- Sangramento à sondagem - SS: presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de

sangramento após 20 segundos da sondagem com sonda periodontal milimetrada.

- Supuração: presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de supuração após 20

segundos da sondagem com sonda periodontal milimetrada.

A metodologia utilizada para a calibração foi preconizada por Araujo et al. (2003)

onde se avaliou o erro padrão da medida (e.p.m) e o erro médio percentual (e.m.p) para os

20

parâmetros clínicos periodontais contínuos (profundidade de sondagem e nível clínico de

inserção. O e.p.m e e.m.p intra-examinador demonstrou que o examinador obteve e.p.m. de

0,18 mm e 0,21 mm para a PS e NCI, respectivamente. Para as variáveis categóricas (IPV e

ISG), considerando somente a presença ou a ausência do parâmetro clínico, foi realizada a

média do nível de concordância e o examinador apresentou uma concordância intra-

examinador igual a 90% (Teste Kappa).

3.3 Critérios de inclusão e exclusão

3.3.1 Critérios de inclusão

Periodontite agressiva localizada (PAgL)

Os indivíduos foram selecionados baseado em critérios propostos pela Academia

Americana de Periodontia (AAP) (ARMITAGE 1999):

- possuir no mínimo 20 dentes excluindo-se os terceiros molares;

- possuir mínimo de 6 dentes com pelo menos 1 sítio interproximal apresentando

profundidade à sondagem e nível clínico de inserção maior do que 5 mm, não contíguos,

localizados na região de incisivos e primeiros molares;

- não apresentar mais do que 2 dentes com as mesmas características clínicas;

- possuir idade inferior ou igual a 30 anos.

Indivíduos com saúde periodontal (SP)

- Possuir no mínimo 20 dentes excluindo-se os terceiros molares;

- não apresentar sítios com PS e/ou NCI maior do que 3 mm;

- não apresentar sinais clínicos de gengivite generalizada;

- não apresentar mais de 10% dos sítios com sangramento sondagem;

- não apresentar mais do 10% dos sítios com sangramento marginal;

- idade inferior ou igual a 30 anos.

3.3.2 Critérios de exclusão

Os seguintes critérios de exclusão foram respeitados. Foram excluídos os

indivíduos :

- fumantes;

- grávidas ou lactantes;

- ter realizado tratamento periodontal previamente;

21

- uso de antibióticos sistêmicos nos últimos 12 meses;

- uso periódico de antissépticos bucais nos últimos seis meses;

- história de doença sistêmica que comprometa a resposta do

hospedeiro ou exija medicação profilática ao tratamento.

3.4 Seleção dos sítios testes

Nos indivíduos com PAgL foram selecionados aleatoriamente 2 sítios

subgengivais, sendo 1 sítio com PS > 5mm com SS e outro sítio com PS< 3mm sem SS que

não apresentasse sangramento à sondagem. Nos indivíduos com SP foi coletado 1 sítio com

PS < 3mm que não apresentasse sangramento à sondagem.

3.4.1 Coleta das amostras de placa subgengival

Após a remoção da placa supragengival a coleta de amostras de biofilme

subgengival foi feita com curetas Gracey do tipo mini-five (HuFriedy, USA), posicionadas na

porção mais apical dos sítios selecionados. As amostras foram depositadas em tubos de

polipropileno de 1,5 ml (tubo1) contendo 50 µL de solução TE (10 mM Tris-HCl, 0,1mM

EDTA, pH 7,6). Imediatamente após a coleta da amostra, esta foi homogeneizada por 1

minuto em agitador de tubos e armazenados à -80OC até serem analisadas.

3.5 Análise microbiológica

Análise da diversidade do domínio bactéria por sequenciamento do gene 16S rRNA

pelo método de Sanger.

3.5.1 Extração de DNA

O tubo contendo 50 µL da amostra foi utilizado para extração do DNA segundo o

método descrito por Dewhirst et al. (2000). Após o descongelamento da amostra, foram

adicionados 1µL de solução de proteinase K em uma concentração de 200mg/mL (Sigma) e 5

µL de solução de Tween 20 a 5%. A amostra foi aquecida a 55 0C durante 120 minutos e

posteriormente a 95 0C por 10 minutos para inativação da Proteinase K em um termociclador

(Gen Amp PCR System 2400, Applied Biosystems, California, EUA).

22

3.5.2 Amplificação da região 16S rRNA de A. actinomycetemcomitans pela reação em cadeia

da polimerase (PCR)

O DNA das amostras foram extraídas e posteriormente utilizado como molde na

reação em cadeia da polimerase (PCR) padrão para amplificação da região 16S rRNA de A.

actinomycetemcomitans usando os iniciadores propostos por Macheleidt et al. (1999).

Os iniciadores apresentavam as seguintes sequências:

Forward primer: 5’ GTT TAG CCC TGG TGC CCG AAG -3’

Reverse primer: 5’ TGA CGG GCG GTG TGT ACA AGG - 3’

Para cada reação de amplificação do gene 16S rRNA foram utilizados: 5µL de

DNA molde, 0,5 µL de Platinum Taq polimerase (5 unidades/µL, Invitrogen, São Paulo, SP,

Brasil), 5 µL de tampão (10X), 4µL de dNTPs (10nM) , 1µL de uma solução de cada

iniciador (25 pmoles; Invitrogen), 1,5 µL de cloreto de magnésio (50 mM) e 36 µL água Milli

Q estéril q.s.p. para uma solução final de 50 µL.

As reações de amplificação foram realizadas segundo as seguintes condições:

desnaturação inicial a 94oC por 4 minutos, seguindo-se 30 ciclos de desnaturação a 94oC por

30 segundos, 55oC por 30 segundos e 72oC por 60 segundos, e uma extensão final de 5

minutos a 72oC em termociclador (Gen Amp PCR System 2400). Os produtos da reação de

PCR foram submetidos à corrida eletroforética em gel de agarose a 1%, em tampão Tris

Acetato EDTA (TAE, Tris acetato a 40mM, pH 8,5; EDTA a 2mM) e corados com brometo

de etídio. Os fragmentos específicos contendo 547 bp foram visualizados e documentados sob

luz ultravioleta. Os controles positivos (A. actinomycetemcomitans cepa 652) e negativos

foram incluídos.

3.5.3 Amplificação da região 16S rRNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR)

O DNA das amostras foi utilizado como molde em duas reações de PCR para

amplificação da região 16S rRNA utilizando os iniciadores universais propostos por Colombo

et al. (2009). Na primeira reação de PCR foram associados na proporção de 1/1 dois “forward

primer” (4F: 5′-CCAGAGTTTGATYMTGGC-3’ e 6F 5′- GACTAGAGTTTGATYMTGGC-

3’) e um “reverse primer (1541R 5′-GAAGGAGGTGWTCCADCC-3’) (Invitrogen). Para

esta reação foram utilizados: 1µL de DNA molde, 0,2µL de Platinum Taq polimerase (5

unidades/µL, Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity, Invitrogen), 5 µL de tampão

(10X), 0,5µL de dNTPs (10nM), 1µL de uma solução de cada iniciador (5 pmoles/µL), 1,5 µL

de cloreto de magnésio (50 mM) e 13,8 µL água Milli Q estéril q.s.p. para uma solução final

23

de 25 µL. Para a segunda reação de PCR, foram utilizados os mesmos “forward primer”

descritos anteriormente e o seguinte “reverse primer”: 1492R (5’-

GYTACCTTGTTACGACTT-3’) (Invitrogen). Para esta reação foram utilizados: 1µL de

DNA molde, 0,2µL de Platinum Taq polimerase (5 unidades/µL, Platinum Taq DNA

Polymerase High Fidellity, Invitrogen), 5 µL de tampão (10X), 0,5µL de dNTPs (10nM), 1µL

de uma solução de cada iniciador (15 pmoles/µL para “forward” e 5 pmoles/µL para

“reverse), 1,5 µL de cloreto de magnésio (50 mM) e 13,8 µL água Milli Q estéril q.s.p. para

uma solução final de 25 µL.

As reações de amplificação foram realizadas segundo as condições propostas por

Colombo et al (2009): desnaturação inicial a 94oC por 120 segundos, seguindo-se 32 ciclos de

desnaturação a 94oC por 30 segundos, 55oC por 30 segundos e 68oC por 90 segundos, com 1

segundo adicional para cada ciclo e uma extensão final de 10 minutos a 68oC em

termociclador (Gen Amp PCR System 2400). Os produtos da reação de PCR foram

submetidos à corrida eletroforética em gel de agarose a 1%, em tampão Tris Acetato EDTA

(TAE, Tris acetato a 40mM, ph 8,5; EDTA a 2mM) e corados com brometo de etídio. Os

fragmentos específicos contendo 1500 pb foram visualizados e documentados sob luz

ultravioleta.

3.5.4 Clonagem

Após a determinação da presença do amplicom, descritos no item 3.5.3

(Amplificação da região 16S rRNA pela reação em cadeia da polimerase) estes foram

clonados em Escherichia coli. Para a clonagem foi utilizado o kit comercial TOPO TA

Cloning - Version P (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante.

Os produtos obtidos foram ligados ao vetor TOPO. A seguir, as células

quimiocompetentes de E. coli TOPO foram transformadas por choque térmico e

posteriormente adicionados em meio S.O.C. (2% Triptone, 0,5% extrato de levedura, 10mM

NaCL, 2,5 mM KCL, 10mM MgCL2, 10mM MgSO4, 20 mM glucose). As células foram

semeadas em placas de Petri contendo ágar Luria-Bertani acrescido de 50µg/mL de

Canamicina e posteriormente incubadas a 37o C por 24hs. As colônias recombinantes foram

transferidas para tubos contendo 40 µL de tampão TE e mantidas em -80oC até o momento do

processamento.

Foram selecionadas 50 colônias por amostra clonada e em seguida foi realizada

uma reação de PCR contendo 1µL de cada amostra para determinar o tamanho correto dos

24

insertos. Para cada reação de amplificação da região 16S rRNA de microrganismos procariotos

foram utilizados os iniciadores M13 (TOPO, Invitrogen). As condições da reação foram as

mesmas já descritas no item 3.5.3 (Amplificação da região 16S rRNA pela reação em cadeia

da polimerase). Os produtos da reação de PCR foram submetidos à corrida eletroforética em

gel de agarose a 1%, em tampão Tris Acetato EDTA (TAE, Tris acetato 40mM, pH 8,5;

EDTA 2mM) e corados com brometo de etídio. Os fragmentos específicos foram visualizados

e documentados sob luz ultravioleta. Após a amplificação do fragmento, os produtos das

reações 16S rRNA foram purificados por meio do Microcon 100 (Amicon, Indianápolis, IN,

USA) e a seguir pelo QIAquick PCR purification (Qiagen, Cambridge, MA, USA).

3.5.5 Sequenciamento

Após a purificação dos produtos das reações de 16S rRNA, 50 produtos foram

selecionados ao acaso para cada uma das amostras. Preliminarmente, a concentração de DNA

foi quantificada em espectrofotômetro 260 e 280 nm (Nanodrop Technologies ND-100, DE,

EUA), de forma que o volume a ser utilizado na reação de sequencimento fosse estimado. As

reações de seqüenciamento foram realizadas utilizando o kit de seqüenciamento Big Dye

Terminator Cycle Sequencing Standart Version 3.1 (Applied Biosystems, CA, EUA). O

primer utilizado para o seqüenciamento foi o 533R (TKACCGCGGCTGCTG). A reação de

seqüenciamento foi constituída por: 2 µL das bases fluorescentes (Big Dye), 3,5 µL de

tampão (5X), 50 de primer, 100 a 200 ng produto de PCR purificado e água para completar 20

µL de volume final da reação. A reação foi submetida à termociclagem (MJ Research,

Minnesota, EUA) de acordo com as seguintes condições: desnaturação inicial a 96º C por 2

minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 96º C (45 segundos), anelamento a 60º C (30

segundos) e extensão a 60º C (4 minutos). Após a reação de seqüenciamento, os produtos

obtidos foram submetidos à precipitação. Foram adicionados 28 µL de etanol 100% gelado,

1,15 µL de 3M NaOAc (pH 5,2) e 1,15 µL de glicogênio (1mg/mL) aos 15 µL da reação.

Após a incorporação dos reagentes a reação foi agitada e mantida em gelo por 15 minutos, em

ambiente escuro, seguindo-se centrifugação a 4.000 rpm por 30 minutos em temperatura

ambiente. O sobrenadante foi removido pela inversão dos tubos e execução de dois pulsos de

1.000 rpm. O pellet remanescente foi lavado com 50 µL de etanol 70% gelado por reação. A

centrifugação foi repetida, seguida pelo procedimento de drenagem dos tubos e secagem por 1

minuto a 95º C em termociclador (MJ Research, Minnesota, EUA). As amostras seladas e

protegidas da luz foram encaminhadas ao Serviço de Seqüenciamento do Instituto de Química

25

(IQ – USP, São Paulo, Brasil). As sequências foram analisadas com o auxílio do ABI

PRISM® 3100GeneticAnalyzer (HITACHI).

3.5.6 Análise das sequências do gene 16S rRNA

Cerca de 50 clones de cada amostra com o tamanho certo do inserto em 30

amostras provenientes de 15 indivíduos com periodontite agressiva localizada e 15 amostras

de indivíduos saudáveis foram analisadas. Uma sequência de aproximadamente 500 pares de

base foi obtida por clone para determinar e identificar a posição filogenética do

microrganismo (PASTER et al., 2001, FAVERI et al. 2008). A sequência de DNA obtida foi

comparada com sequências 16S rRNA em banco de genes (GenBank) e no banco de dados do

Forsyth Institute (www.hmod.org). Os dados foram inseridos em um software (TREECON,

Microsoft Windows) e árvores filogenéticas (dendrograma) foram construídas segundo a

metodologia preconizada por Paster e Dewhirst. (1988). As matrizes de similaridade foram

corrigidas para a mudança de bases pelo método descrito por Jukes e Cantor (1969). Após a

identificação das espécies e/ou filotipos, a prevalência das mesmas foi comparada entre as

amostras.

3.5.7 Análise estatística

A média das medidas clínicas de profundidade de sondagem e nível clínico de

inserção, assim como a média da porcentagem de sítios apresentando placa visível,

sangramento gengival, sangramento à sondagem e supuração foram calculadas para cada

indivíduo e, posteriormente, para cada grupo. As diferenças entre os grupos foram avaliadas

utilizando o teste de Mann–Whitney. O teste Qui-quadrado foi utilizado para a variável

gênero. A significância estatística foi estabelecida em 5%. Os dados microbiológicos foram

tabulados e uma análise estatística descritiva foi realizada.

26

4 RESULTADOS

4.1 Resultados clínicos

A Tabela 1 apresenta os dados epidemiológicos e respectivos valores médios dos

parâmetros clínicos dos indivíduos em ambos os grupos experimentais. Os grupos foram

homogêneos em relação à distribuição do gênero (teste Qui-quadrado, p>0,05), na média de

idade e de Índice de Placa Visível. Foram observadas diferenças significativas entre os grupos

para as variáveis clínicas de média de profundidade de sondagem e nível clínico de inserção e

para o percentual de sítios com sangramento gengival, sangramento à sondagem e supuração.

O grupo PAgL apresentou maiores médias para estes parâmetros clínicos comparado com o

grupo SP.

Tabela 1. Média (±DP) dos parâmetros demográficos e clínicos para os indivíduos com saúde periodontal (SP) e com periodontite agressiva localizada (PAgL).

t Teste Qui- Quadrado ; p> 0,005

Variáveis

SP n=15

PAgL n=15

Idade t 22,1±3,5

18-26 21,3±2,2

15-24

Gênero (F/M) t 9/6 8/7

Profundidade de sondagem * 2,19 ± 0,3 3,43 ± 0,91

Nível clínico de inserção * 2,15 ± 0,2 3,59 ± 1,03

% sítios com:

Índice de placa visível 33,74 ± 17,8 49,20 ± 15,9

Sangramento gengival * 6,71 ± 2,5 13,29 ± 14,0

Sangramento à sondagem * 7,21 ± 1,5 61,56 ± 14,22

Supuração * 0,0 3,10 ± 3,14

* Teste U Mann-Whitney; p<0,05 M=masculino; F=feminino

27

4.2 Resultados microbiológicos

Com o objetivo de analisar a prevalência de cepas de A. actinomycetemcomitans,

as amostras selecionadas foram submetidas a reação de PCR. A figura 1 apresenta uma

fotografia do gel de agarose (1%) resultante da reação de amplificação para o A.

actinomycetemcomitans. Amostras clínicas de pacientes com PAgL e SP foram amplificadas

conforme o item 3.5.2 e posteriormente submetidos à eletroforese. Dois e nove indivíduos dos

grupos SP e PAgL, respectivamente eram colonizados por esta espécie.

Figura 1. Fotografia do gel de agarose (1%) em tampão TAE onde produtos da reação de amplificação do gene

16S rRNA do A. actinomycetemcomitans de amostras clínicas de pacientes com periodontite agressiva localizada

foram submetidos à eletroforese. Em (PM) 1000 bp Mass Ladder (Invitrogen, São Paulo, Brasil), em (CN)

controle negativo. Controle positivo (+) - cepas JP2 e FDCY4 (Y4).

Com a finalidade de estudar a diversidade bacteriana presente nas amostras de

biofilme subgengival dos indivíduos com PAgL e com SP, foi realizado o sequenciamento de

45 amplicons 16S rRNA, sendo 30 amplicons de indivíduos com PAgL e 15 de SP. Um total

de 2.041 clones foram sequenciados, sendo 697 clones para as bolsas profundas (PS≥5mm) do

grupo com PAgL, 666 clones para as bolsas rasas (PS≤3mm) do grupo com PAgL e 678

clones para as amostras (PS≤3mm) do grupo com SP. O número de clones 16S rRNA por

amostra variou entre 36 e 49 clones, com uma média de 45,3 ± 4,5. O valor de identidade de

98,5% foi colocado como limite para definição de homologia às espécies encontradas por

meio do programa BLAST presente no banco de dados HOMD (Human Oral Microbiome

Database – The Forsyth Institute – www.homd.org) e GenBank

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Entre todas as amostras analisadas, foram

+ + CN-

28

identificadas 164 espécies/filotipos bacterianos, representados em 8 diferentes Filos

(Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Fusubacteria, Proteobacteria, Spirochaetes,

Synergistetes e TM7), 16 diferentes classes (Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacili,

Bacteroides, Betaproteobacteria, Clostridia, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria,

Firmicutes, Flavobacteria, Fusobacteria, Gammaproteobacteria, Mollicutes, Spirochaetes,

Synergistetes e TM7), 32 e 46 diferentes famílias e gêneros bacterianos, respectivamente. A

Tabela 3 apresenta a distribuição de Filos, Classe, Família, Gênero e Espécies/Filotipos

bacterianos encontrados nos 2 grupos experimentais e analisadas para ambos os grupos

experimentais.

Espécies pertencentes aos Filos, Spirochaetes, Synergistes e TM7 não foram

encontradas nos indivíduos com SP. Vinte e oito espécies/filotipos foram comuns aos sítios

profundos e rasos dos indivíduos com PAgL e com SP. Trinta e três e 16 espécies/filotipos

foram encontrados somente nas amostras de sítios profundos e rasos dos indivíduos com

PAgL, respectivamente. Por outro lado, 33 espécies/filotipos foram encontrados

exclusivamente nos indivíduos com SP.

Tabela 3. Prevalência de diferentes Filos, Classe, Família, Gênero e de Espécies nas amostras para ambos os grupos experimentais.

A Figura 3 apresenta o número de clones encontrados entre os diferentes Filos

bacterianos em ambos os grupos experimentais. Podemos observar que a principal diferença

entre os sítios profundos dos indivíduos com PAgL e os sítios rasos deste mesmo grupo e

sítios do grupo com SP foi no número de clones dos Filos Actinobacteria e Spirochaetes. A

Tabela 4 apresenta o número de clones encontrados entre os diferentes gêneros bacterianos

29

em ambos os grupos experimentais. A tabela foi ordenada de forma crescente para o número

de clones encontrado no grupo com SP. Espécies do gênero Streptococcus representaram

cerca de 32,7% dos clones analisados no grupo SP. Por outro lado, este gênero representou

apenas 14,1% e 13,0% dos clones encontrados nos sítios rasos e profundos dos indivíduos

com PAgL, respectivamente. Nos sítios rasos do grupo PAgL, espécies de outros gêneros

apresentaram-se em grande quantidade em comparação aos indivíduos com SP, tais como

espécies do gênero Parvimonas, Pseudoramibacter, Synergistetes, Desulfobulbus, Filifactor,

Dialister, Neisseria e Selenomonas. Em bolsas profundas de indivíduos com PAgL,

observamos que espécies do gênero Selenomonas representaram cerca de 15% da microbiota

encontrada. Além disso, espécies do gênero Dialister, Parvimonas, Porphyromonas e

Eubacterium também foram encontrados em elevado número.

Figura 3. Número de clones encontrados dentre os diferentes filos bacterianos em ambos os grupos experimentais. PAgL: periodontite agressiva localizada; SP: saúde periodontal.

PAgL – PS>5mm PAgL – PS<3mm SP – PS<3mm

30

Tabela 4. Prevalência de clones encontrados nos diferentes gêneros bacterianos em ambos os grupos experimentais.

Grupos experimentais Gênero SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>5mm Afipia 0 7 0 Aggregatibacter 0 2 3 Bacteroidetes[G-1] 0 0 7 Corynebacterium 0 2 2 Haemophilus 0 0 6 Mitsuokella 0 9 8 Mogibacterium 0 3 4 Olsenella 0 0 2 Parvimonas 0 24 29 Peptococcus 0 0 5 Pseudoramibacter 0 18 17 Synergistetes 0 14 6 TM7 0 4 6 Treponema 0 2 10 Cardiobacterium 1 0 0 Desulfobulbus 1 12 9 Peptoniphilus 1 0 0 Tannerella 1 12 8 Anaeroglobus 2 0 14 Filifactor 2 21 27 Oribacterium 2 0 0 Peptostreptococcus 2 7 16 Leptotrichia 3 8 1 Clostridiales[F-2][G-1] 4 5 9 Dialister 4 27 35 Capnocytophaga 5 0 6 Kingella 6 5 5 Firmicutes 7 8 0 Solobacterium 7 8 6 Porphyromonas 8 12 25 Abiotrophia 10 0 1 Megasphaera 10 0 1 Neisseria 11 22 2 Catonella 12 8 0 Granulicatella 12 0 0 Rothia 13 14 0 Fusobacterium 14 13 14 Eubacterium 20 19 43 Prevotella 24 34 11 Gemella 29 0 48

31

Tabela 4. Continuação Gênero Grupos experimentais SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>5mm Selenomonas 40 83 104 Campylobacter 41 39 44 Veillonella 66 64 63 Actinomyces 68 42 9 Streptococcus 222 94 91 PS: profundidade de sondagem, PAgL: periodontite agressiva localizada; SP: saúde periodontal.

A Tabela 5 apresenta um comparativo do número de clones encontrados e o

número de indivíduos colonizados pelas espécies/filotipos encontrados em ambos os grupos

experimentais. A Tabela 5 foi ordenada de forma crescente para o número de clones

encontrado no grupo SP. Podemos observar que existem diferenças nos perfis de colonização

entre indivíduos com SP e com PAgL. Além disso, um fato interessante é que existem

também diferenças entre os perfis de colonização de sítios rasos dos indivíduos com

periodontite e os sítios rasos dos indivíduos com saúde periodontal. Algumas espécies foram

encontradas em altas taxas entre os indivíduos, independentemente do grupo experimental.

Veillonella parvula foi encotrado em 66,6% (37 clones) dos indivíduos do grupo com SP,

40% (19 clones) e 53,3% das amostras de sítios rasos e profundos do grupo com PAgL,

respectivamente. Streptococcus oralis foi encontrado em 46,6% (31 clones) dos indivíduos do

grupo com saúde periodontal e em 60% (28 clones) e 40% (12 clones) das amostras de sítios

rasos e profundos do grupo com periodontite agressiva localizada, respectivamente. Outras

espécies/filotipos que tiveram destaque tanto para o grupo com saúde periodontal como para

as amostras de sítios rasos e profundos de indivíduos com periodontite, respectivamente,

foram: Streptococcus mitis, 66,6% (59 clones), 33,3% (10 clones) e 26,65% (12 clones); C.

gracilis, 53,3% (28 clones), 66,6% (24 clones) e 33,3% (14 clones).

32

Tabela 5. Prevalência de espécies/filotipos (número de indivíduos colonizados) encontrados em ambos os grupos experimentais Grupos experimentais Espécies/Filotipos SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>5mm Afipia broomeae 0 (0) 7 (5) 0 (0) Agregatibacter aphrophilus 0 (0) 6 (4) 0 (0) Prevotella denticola 0 (0) 5 (3) 0 (0) Eikenella corrodens 0 (0) 5 (2) 0 (0) Parvimonas sp. AJ062 / OT110 0 (0) 5 (3) 0 (0) Peptostreptocossus sp. BS044 / AF385559 0 (0) 1 (1) 0 (0) Selenomonas sp. DD020 / OT134 0 (0) 10 (3) 0 (0) Selenomonas sp. EO003 / OT284 0 (0) 4 (3) 0 (0) Streptococccus sanguinis 0 (0) 5 (4) 0 (0) Streptococcus sp. DO002 / OT431 0 (0) 1 (1) 0 (0) Veillonella sp. X042 0 (0) 14 (6) 0 (0) Neisseria subflava 0 (0) 2 (2) 0 (0) Treponema socranskii 0 (0) 1 (1) 0 (0) Synergistes sp. BH007 / OT359 0 (0) 3 (3) 0 (0) Synergistes sp. W028 / OT363 0 (0) 11 (7) 0 (0) TM7 sp. EW055 / OT353 0 (0) 1 (1) 0 (0) Haemophilus parainfluenzae 0 (0) 0 (0) 6 (3) Actinomyces sp. EP005 / OT175 0 (0) 0 (0) 1 (1) Olsenella uli 0 (0) 0 (0) 2 (1) Bacteroidetes sp. X083 / OT 272 0 (0) 0 (0) 7 (3) Capnocytophaga granulosa 0 (0) 0 (0) 2 (2) Porphyromonas catoniae 0 (0) 0 (0) 3 (1) Abiotrophia para-adiances 0 (0) 0 (0) 1 (1) Eubacterium nodatum 0 (0) 0 (0) 14 (5) Eubacterium saphenum 0 (0) 0 (0) 13 (6) Gemella 933-88 0 (0) 0 (0) 22 (4) Gemella haemolysans 0 (0) 0 (0) 8 (4) Peptococcus sp. I070 / OT168 0 (0) 0 (0) 2 (1) Peptococcus sp. JM048 / OT500 0 (0) 0 (0) 3 (1) Peptostreptococcus stomatis 0 (0) 0 (0) 2 (1) Selenomonas artemedis 0 (0) 0 (0) 4 (3) Selenomonas dianae 0 (0) 0 (0) 5 (3) Selenomonas P2PA_80 0 (0) 0 (0) 6 (3) Selenomonas sp CS024 / OT133 0 (0) 0 (0) 1 (1) Selenomonas sp IQ048 0 (0) 0 (0) 1 (1) Selenomonas sp IQ049 0 (0) 0 (0) 1 (1) Staphylococcus aureus 0 (0) 0 (0) 1 (1) Streptococcos BP2-25 0 (0) 0 (0) 3 (1) Streptococcus sp C6_7A 0 (0) 0 (0) 5 (5) Streptococcus sp. AY020 / OT056 0 (0) 0 (0) 1 (1) Veillonela BP2-87 0 (0) 0 (0) 18 (5) Veillonella sp. AA050 0 (0) 0 (0) 7 (1) Veillonellaceae OT150 0 (0) 0 (0) 6 (2) Fusubacterium sp. I035 / OT 203 0 (0) 0 (0) 2 (1) Campylobacter concisus 0 (0) 0 (0) 5(2)

33

Tabela 5. Continuação Grupos experimentais Espécies/Filotipos SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>6mm Aggegatibacter actinomycetemcomitans 0 (0) 3 (2) 3 (1) Corynebacterium matruchotti 0 (0) 2 (2) 2 (1) Neisseria elongata 0 (0) 0 (0) 2 (1) Treponema paladium 0 (0) 0 (0) 1 (1) Synergistes sp W090 / OT363 0 (0) 0 (0) 6 (3) TM7 sp I025 / OT 356 0 (0) 0 (0) 1 (1) Porphyromonas endodontalis 0 (0) 1 (1) 6 (3) Porphyromonas gingivalis 0 (0) 3 (2) 12 (6) Porphyromonas sp. DP023 / OT279 0 (0) 4 (3) 4 (3) Prevotella sp. AH125 / OT292 0 (0) 13 (7) 7 (3) Tannerella forsythia 0 (0) 2 (2) 6 (3) Eubacterium yuri 0 (0) 3 (2) 7 (4) Mitsuokella sp. CS002 / OT131 0 (0) 9 (5) 8 (4) Mogibacterium tidmidium 0 (0) 3 (2) 4 (1) Parvimonas micra 0 (0) 19 (10) 29 (10) Peptostreptococcus sp. DA014 / OT065 0 (0) 6 (4) 14 (4) Pseudoramibacter alactolyticus 0 (0) 18 (8) 17 (7) Selenomonas sp. EW084 / OT146 0 (0) 6 (4) 9 (3) Streptococcus constelattus 0 (0) 5 (5) 5 (3) Streptococcus salivarius 0 (0) 12 (6) 3 (1) Veillonellaceae sp. GAA14 / OT155 0 (0) 8 (6) 1 (1) Treponema denticola 0 (0) 1 (1) 9 (4) TM7 sp AH040 / OT346 0 (0) 3 (2) 5 (2) Rothia BQ2-13 1 (1) 0 (0) 0 (0) Eubacterium sp. DZ073 1 (1) 0 (0) 0 (0) Peptoniphilus asaccharoliticus 1 (1) 0 (0) 0 (0) Peptostreptococcus sp. FX38-1 1 (1) 0 (0) 0 (0) Pretostreptococcus FX38-1 1 (1) 0 (0) 0 (0) Selenomonas sp. EY047 / OT124 1 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus BP2-25 1 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus mitis bv 2 1 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus mitis/pneumoniae 1 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus peneumoniae 1 (1) 0 (0) 0 (0) Veillonella OH1A 1 (1) 0 (0) 0 (0) Cardiobacterium valvarum 1 (1) 0 (0) 0 (0) Porphyromonas sp. EP003 / OT284 1 (1) 4 (3) 0 (0) Veillonella sp. BI029 / OT158 1 (1) 9 (6) 0 (0) Fusobacterium periodonticum 1 (1) 7 (3) 0 (0) Eubacterium saburreum 1 (1) 0 (0) 7 (3) Tannerella sp. BU063 / OT286 1 (1) 10 (5) 2 (1) Dialister pneumonsites 1 (1) 10 (8) 8 (3) Veillonella atypica 1 (1) 6 (5) 8 (2) Desulfobulbus sp. R004 / OT041 1 (1) 12 (6) 9 (4) Oribacterium sp. AO068 / OT078 2 (1) 0 (0) 0 (0) Selenomonas fluggei 2 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp.EK048 / OT064 2 (2) 0 (0) 0 (0) Gemella 1714-94 2 (2) 0 (0) 0 (0)

34

Tabela 5. Continuação Grupos experimentais Espécies/Filotipos SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>6mm Campylobacter curvus 2 (1) 0 (0) 0 (0) Neisseria flava 2 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp. CH016 / OT058 2 (2) 4 (4) 0 (0) Streptococcus sp. EK048 / OT064 2 (2) 3 (2) 0 (0) Neisseria mucosa 2 (2) 8 (6) 0 (0) Neisseria sp. AP132 / OT018 2 (2) 3 (2) 0 (0) Capnocytophaga gingivalis 2 (1) 0 (0) 2 (1) Anaeroglobus germinatus 2 (2) 0 (0) 14 (6) Filifactor alocis 2 (1) 21 (8) 27 (11) Actinomyces meyeri 3 (2) 0 (0) 0 (0) Eubacterium sp. EI074 / OT100 3 (2) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp. AA007 / OT055 3 (1) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp. DN025 / OT061 3 (2) 0 (0) 0 (0) Streptococcus sp. FN051 / OT066 3 (2) 0 (0) 0 (0) Fusobacterium nucleatum ss. polymorphum 3 (2) 0 (0) 0 (0) Prevotella sp. FM005 3 (1) 1 (1) 0 (0) Capnocytophaga sputigena 3 (2) 0 (0) 2 (2) Selenomonas sp. CS024 / OT133 3 (2) 0 (0) 1 (1) Shuttleworthia satelles 3 (1) 0 (0) 6 (3) Leptotrichia buccalis 3 (1) 8 (5) 1 (1) Dialister invisus 3 (2) 17 (9) 27 (11) Streptococcus BP2-15 4 (1) 0 (0) 0 (0) Fusubacterium sp CY024 / OT203 4 (3) 0 (0) 0 (0) Eubacterium sulci 4 (2) 7 (2) 0 (0) Selenomonas sp. DS051 / OT137 4 (2) 12 (6) 0 (0) Eubacterium infirmum 4 (2) 0 (0) 2 (2) Streptococcus intermedius 4 (2) 0 (0) 13 (5) Prevotella intermedia 4 (2) 6 (6) 1 (1) Clostridiales sp. F058 / OT075 4 (1) 5 (3) 9 (5) Selenomonas noxia 4 (4) 17 (9) 19 (10) Streptococcus anginosus 4 (1) 4 (2) 13 (5) Fusubacterium nucleatum sp. nucleatum 4 (3) 6 (4) 12 (5) Selenomonas sp. AA024 5 (2) 0 (0) 0 (0) Veillonellaceae sp. EZ011 / OT148 5 (1) 0 (0) 0 (0) Atopobium parvulum 5 (2) 9 (4) 0 (0) Neisseria ap. AP015 / OT014 5 (2) 9 (4) 0 (0) Actinomyces gerencseriae 5 (2) 7 (4) 5 (2) Streptococcus cristatus 5 (3) 2 (1) 3 (2) Streptococcus parasanguinis 5 (2) 7 (3) 1 (1) Campylobacter rectus 5 (1) 5 (5) 20 (6) Campylobacter showae 5 (2) 10 (6) 5 (2) Gemella sanguinis 6 (5) 0 (0) 0 (0) Catonella morbi 6 (3) 4 (3) 0 (0) Cantonella morbi 6 (3) 4 (3) 0 (0) Kingella oralis 6 (3) 5 (4) 5 (3) Porphyromonas sp. CW034 / OT279 7 (2) 0 (0) 0 (0)

35

Tabela 5. Continuação Grupos experimentais Espécies/Filotipos SP PAgL PAgL PS<3mm PS<3mm PS>6mm Firmicutes sp. CH017 7 (3) 8 (3) 0 (0) Eubacterium brachy 7 (3) 4 (3) 0 (0) Solobacterium moorei 7 (3) 8 (3) 6 (5) Actinomyces odontolyticus 8 (3) 5 (5) 0 (0) Prevotella melaninogenica 8 (4) 3 (3) 0 (0) Prevotella oris 9 (6) 6 (6) 3 (1) Selenomonas infelix 9 (4) 9 (6) 9 (5) Selenomonas sputigena 9 (4) 25 (9) 42 (9) Abiotrophia adiacens 10 (4) 0 (0) 0 (0) Megasphaera micronuciformis 10 (2) 0 (0) 1 (1) Granulicatella adiacens 12 (5) 0 (0) 0 (0) Rothia dentocariosa 12 (4) 14 (7) 0 (0) Streptococcus gordonii 13 (5) 7 (6) 2 (1) Actinomyces sp. BL008 / OT171 14 (4) 11 (6) 0 (0) Actinomyces sp. IP073 / OT448 14 (5) 8 (6) 0 (0) Streptococcus infantis 19 (6) 0 (0) 0 (0) Veillonella dispar 21 (7) 8 (3) 0 (0) Streptococcus sp. FN042 / OT065 21 (3) 0 (0) 8 (3) Gemella morbillorum 23 (7) 0 (0) 18 (9) Actinomyces naeslundii 24 (7) 11 (5) 3 (1) Atopobium rimae 25 (8) 8 (8) 0 (0) Streptococcus sanguinis 28 (9) 0 (0) 9 (4) Campylobacter gracilis 29 (8) 24 (10) 14 (5) Streptococcus oralis 31 (7) 28 (9) 12 (6) Veillonella parvulla 37 (10) 19 (6) 23 (8) Streptococcus mitis 59 (10) 10 (5) 12 (4) PS: profundidade de sondagem, PAgL: periodontite agressiva localizada; SP: saúde periodontal.

Quando comparamos os sítios rasos dos indivíduos com saúde periodontal com os

sítios rasos dos indivíduos com PAgL observamos algumas espécies/filotipos em destaque

para o grupo com periodontite, tais como: Selenomonas sp. DD020/OT134 (20%, 10 clones),

Veillonella sp. X042 (40%, 14 clones), Synergistes sp. W028/OT363 (46,6%, 11 clones),

Prevotella sp. AH125/OT292 (66,6%, 13 clones), Parvimonas micra (66,6%, 10 clones),

Pseudoramibacter alactolyticus (66,6%, 18 clones), Streptococcus salivarius (46,6%, 12

clones), Tannerella sp. BU063/OT286 (33,3%, 10 clones), Dialister pneumonsites (66,6%, 10

clones), Desulfobulbus sp. R004/OT041 (46,6%, 12 clones), F. alocis (66,6%, 21 clones),

Dialister invisus (73,3%, 27 clones), Selenomonas sp. DS051 / OT137 (46,6%, 12 clones),

Selenomonas noxia (66,6%, 17 clones) e S. sputigena (66,6%, 25 clones). Algumas

espécies/filotipos foram predominantes nas bolsas profundas dos indivíduos com PAgL, tais

como: E. nodatum (33,3%, 14 clones), Eubacterium saphenum (40%, 13 clones), Gemella

36

933-88 (26,6%, 22 clones), Veillonella BP2-87 (33,3%, 18 clones), Anaeroglobus germinatus

(40%, 14 clones), F. alocis (73,3%, 27 clones), D. invisus (73,3%, 27 clones), Campylobacter

rectus (40%, 20 clones), S. sputigena (60%, 42 clones), P. gingivalis (40%, 12 clones), P.

micra (66,6%, 29 clones), P. alactolyticus (46,6%, 17 clones).

É importante salientar que, das cento 164 espécies/filotiopos encontrados em

ambos os grupos experimentais, 69 (42%) eram filotipos ainda não cultivados. Não foram

observados diferenças no perfil microbiológico quando sítios positivos e negativos para A.

actinomycetemcomitans foram analisados.

37

5. DISCUSSÃO

O principal objetivo do presente estudo foi avaliar a diversidade bacteriana por

análise clonal do gene 16S rRNA pela técnica de Sanger, em amostras de biofilme subgengival

de indivíduos com SP e com PAgL. Primeiramente, é relevante a discussão do perfil clínico

dos indivíduos selecionados. O grupo saudável apresentou todos os parâmetros clínicos

compatíveis com SP, como valores significativamente inferiores dos parâmetros de

profundidade de sondagem, nível clínico de inserção, sangramento à sondagem, sangramento

gengival e supuração em relação ao grupo de indivíduos portadores de periodontite agressiva

localizada. O único parâmetro clínico que não diferiu significativamente entre os grupos foi o

índice de placa visível. Estes dados corroboram com estudos que avaliaram populações com

PAgL (TAKEUCHI et al., 2003; GAJARDO et al., 2005; FAVERI et al., 2009). Muitos

estudos microbiológicos envolvendo indivíduos com PAg têm avaliado poucas espécies

bacterianas (SLOTS et al., 1980; ZAMBON et al., 1985; SCHENKEIN et al., 1993; TINOCO

et al., 1997; CORTELLI et al., 2005). No entanto, o biofilme subgengival é composto por

diversas espécies de microrganismos altamente relacionadas entre si. As associações entre

determinadas espécies, como a co-agregação, mediada por diferentes adesinas presentes nas

superfícies celulares, e as relações de cooperação e antagonismo, e as diferentes fontes de

nutrição irão caracterizar as propriedades do biofilme que será formado (KOLEMBRANDER

et al., 2006). Assim sendo, é de suma importância que o biofilme subgengival dos indivíduos

com PAgL seja estudado de uma maneira mais complexa do que a análise de poucas espécies

bacterianas, que representariam uma pequena porcentagem do total de células microbianas na

amostra. Faveri et al. (2009) analisaram por meio da técnica do Checkerboard DNA-DNA

Hybridization amostras subgengivais de indivíduos com PAgL. Os autores observaram que o

perfil microbiológico para as 40 espécies bacterianas analisadas nestes indivíduos apresentou-

se tão complexa quanto à dos indivíduos com PAgG e PC. De uma maneira geral, o perfil de

colonização bacteriana frente às 40 espécies bacterianas analisadas, não foi diferente entre as

3 formas de periodontite. Estes dados corroboram com os dados do presente estudo, onde

observamos que a diversidade microbiológica presente nas amostras de biofilme subgengival

de indivíduos com PAgL é tão complexa quanto a apresentada em outros estudos que

avaliaram a diversidade da PAgG e com PC (KUMMAR et al., 2005; FAVERI et al., 2008)

A análise da literatura revelou que 69 destas 164 espécies (42%) detectadas no

presente estudo ainda não foram cultivadas (Tabela 5). Estes dados corroboram com estudos

anteriores onde a proporção de espécies ainda não cultivadas era em média de 40% (PASTER

38

et al., 2001; PASTER et al., 2002; KUMMAR et al., 2005; AAS et al., 2005, KAZOR et al.,

2003; SAKAMOTO et al., 2006, DEWHIRST et al. 2010).

No grupo SP, em relação a espécies já cultivadas, foram observadas uma alta

prevalência e número de clones de S. mitis, V. parvulla, S. oralis, S. sanguinis, A. naeslundii e

G. morbilorium. Esses achados corroboram com estudos anteriores onde essas espécies

estavam associadas à saúde periodontal (COLOMBO et al., 2009; HAFFAJEE et al., 2005;

XIMENEZ-FYVIE et al., 2006; FAVERI et al., 2009). Uma espécie incomum que foi

encontrada em alta prevalência no grupo SP e nas bolsas rasas do grupo PAgL foi o A. rimae.

Kummar et al. (2005) avaliaram 66 indivíduos com PC e 66 indivíduos com SP por meio da

técnica do PCR e observaram que 79% e 33 % dos indivíduos do grupo SP e PC,

respectivamente, eram colonizados por A. rimae (p<0,0001). Estes dados corroboram com o

presente estudo, onde dos 15 indivíduos com SP analisados 8 (53,3%) eram colonizados por

esta espécie. Observamos uma redução de espécies do filo Actinobacteria presentes nas

amostras de sítios profundos dos indivíduos com PAgL e um aumento de espécies deste Filo

nas bolsas rasas do grupo PAgL e SP (Figura 3). Estes dados corroboram com estudos de

clonagem e sequenciamento que observaram uma grande proporção de espécies deste filo em

indivíduos com SP (AAS et al. 2005, PASTER et al. 2006). Dentre as espécies ainda não

cultivadas, Actinomyces sp. BL008/OT171 e Actinomyces sp. IP073/OT448 apresentaram

relativa frequência e número de clones em comparação com as amostras de sítios profundos

do grupo PAgL (Tabela 5). O presente estudo corrobora com os achados prévios que

relacionavam estes dois filotipos com a SP (KUMAR et al., 2003; KUMAR et al., 2005; AAS

et al. 2005, COLOMBO et al., 2009).

Por meio da avaliação de análise clonal, a espécie A. actinomycetemcomitans foi

encontrada em baixos índices e prevalência em ambos os grupos (Tabela 5), tendo apenas

13,3% (2/15) de frequência para os indivíduos do grupo PAgL com apenas 3 clones

encontrados para esta espécie neste grupo. Além disso, nenhuma diferença foi observada

quando analisamos a diversidade bacteriana presente em sítios colonizados ou não por esta

espécie. A baixa frequência e número de clones encontrados para o A.

actinomycetemcomitans não foi surpreendente, pois já é bem observado na literatura que em

trabalhos de análise clonal do gene 16S rRNA, esta espécie é raramente observada. Em um

estudo de nosso grupo de pesquisa Faveri et al. (2008) identificou 7 de 10 indivíduos com

PAgG eram positivos para esta espécie e durante os procedimentos de análise clonal destas

amostras, nenhum clone de A. actinomycetemcomitans foi encontrado. É interessante observar

que Bragd et al. (1987) e Rams et al. (1997) sugeriram que a A. actinomycetemcomitans

39

apresenta uma alta patogenicidade e, portanto, mesmo níveis baixos dessa espécie poderiam

ser danosos ao periodonto. O fato de outras espéceis terem sido encontrados em frequência e

número de clones superiores ao do A. actinomycetemcomitans, corroboram com estudos que

relatam que outras espécies bacterianas, além do A. actinomycetemcomitans, apresentam

importância no desenvolvimento da forma localizada da PAg conforme estudos de Ximenez-

Fyvie et al. (2006); Gajardo et al. (2005); Faveri et al. (2009) e devem ser melhor estudadas.

Algumas espécies já cultivadas foram encontradas em alta frequência e número de

clones nos indivíduos com PAgL, tanto nos sítios rasos quanto nos sítios profundos. Entre

estas espécies podemos citar S. sputigena e F. alocis, que também foram encontradas em

níveis, proporção e prevalência superiores em todas as análises realizadas (Figuras 1 a 5). S.

sputigena é um bacilo, multiflagelado, dotado de motilidade, anaeróbio estrito e Gram-

negativo, tem sido associado com casos de periodontite ulcerativa necrosante (Gmur et al.

2004), periodontite de progressão rápida ( Kamma et al. 1994), lesões periodontais ativas

(Haffajee et al., 1984) e com a PAgG (FAVERI et al., 2008). F. alocis foi primeiramente

isolado em 1985 em amostras de fluido gengival como Fusobacterium alocis por meio de

estudos de Cato et al. (1985) e posteriormente reclassificado como Filifactor alocis (JALAVA

et al., 1999). Trata-se de uma espécie Gram-positiva, anaeróbia estrita que tem a capacidade

de processar N-benzoyl-DL-arginine-2-naphtylamide, assim como P.gingivalis e T. denticola.

Os dados do presente estudo corroboram com estudos prévios que vinculam esta espécie a

etiologia das periodontites (DAHLÉN & LEONHARDT, 2006; KUMAR et al., 2006;

COLOMBO et al., 2009; SCHLAFER et al., 2010). Schlafer et al. (2010) estudaram em

detalhes a relação desta espécie no biofilme subgengival de indivíduos com várias condições

periodontais. Por meio da técnica do “Dot blot hybridization” os autores analisaram a

presença desta espécie em 78 amostras de biofilme subgengival de bolsas profundas (média

de PS 7,1 ± 1,4) de 30 indivíduos com PC e 82 amostras de biofilme subgengival de 19

pacientes com SP (média de PS 3,6 ± 0,8). Apenas 15,8% das amostras do grupo SP

apresentavam-se colonizados por esta espécie, enquanto que 76,7% das amostras do grupo PC

eram positivos para F. alocis. Por meio da técnica “Fluorescent in situ hybridization” (FISH)

os mesmos autores observaram que F. alocis concentra-se próximo à parede da bolsa

periodontal e em maiores concentrações no fundo da bolsa. Desta forma, visto os resultados

do presente estudo e os dados disponíveis na literatura, sugere-se que o F. alocis e S.

sputigena podem apresentar um papel importante na etiologia da periodontite agressiva

localizada e deveriam ser melhor investigados. P. micra, P. alactolyticus, D. pneumonsites,

D. invisus e S. noxia também apresentaram em frequência e número de clones elevados em

40

ambos os sítios avaliados no grupo PAgL. É interessante observar que o número de clones

destas espécies encontrados nas amostras de SP foi em muitos casos inexistente.

Várias espécies bacterianas ainda não cultivadas também foram encontradas em

altas frequências no grupo PAgL em comparação aos indivíduos com SP. Entre elas

encontram-se Synergistes sp BH007 / OT359 (46,6%, 11 clones), Prevotella sp. AH125 /

OT292 (46,6%, 13 clones), Selenomonas sp. DS051 / OT137 (40%, 12 clones). Os dados do

presente estudo corroboram com os estudos que tem vinculado à possibilidade destas espécies

ainda não cultivadas serem possíveis periodontopatógenos (PASTER et al., 2002; KUMAR et

al., 2003; FAVERI et al., 2008; COLOMBO et al., 2009; TELES et al., 2011).

Outro achado interessante refere-se ao padrão de colonização observado nas

diferentes categoria de Profundidade à Sondagem no grupo PAgL (Figura 3, Tabela 4 e 5).

Indivíduos do grupo PAgL mostraram uma alteração evidente na microbiota nas

profundidades rasas às profundas, sendo que o mais interessante é que a microbiota de sítios

rasos de indivíduos com periodontite apresentam uma diversidade diferente da observada nos

sítios rasos de indivíduos com SP. Estes dados corroboram com a hipótese de que a

periodontite não é apenas uma infecção do sítio, mas trata-se de uma infecção da cavidade

bucal ( Kumar et al. 2005) e desta forma a visão de tratamento não deve ser sítio especifica.

41

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Até o presente momento, nenhum estudo havia descrito a diversidade bacteriana

presente no ambiente subgengival de indivíduos com PAgL. Por muito tempo, o A.

actinomycetemcomitans foi considerado como o principal patógeno na doença periodontal

agressiva localizada. Entretanto, estudos recentes, bem como o presente estudo,

demonstraram que esta infecção apresenta uma microbiota tão complexa quanto à vista na

PAgG e PC. Um fato interessante que observamos em nossos dados é que os sítios

considerados saudáveis nos indivíduos com PAgL apresentam uma diversidade bacteriana

diferente dos sítios saudáveis de indivíduos com SP. O estudo mais detalhado da microbiota

presente nestes sítios será de fundamental importância para detectar possíveis marcadores

microbiológicos que indicam o início da progressão da perda dos tecidos de sustentação do

elemento dentário. Além disso, dentre as espécies que apresentaram frequência e número

aumentado de clones, o estudo dos níveis, proporções e prevalência em um número maior de

indivíduos e amostras se faz necessário.

42

6. CONCLUSÃO

Dentro dos limites do presente estudo, podemos concluir que:

- A diversidade da microbiota subgengival de indivíduos com periodontite

agressiva localizada difere marcadamente da observada em indivíduos periodontalmente

saudáveis;

- A diversidade da microbita subgengival de sítios rasos de indivíduos com saúde

periodontal apresenta diferenças em relação a diversidade encontrada em sítios rasos de

indivíduos com periodontite agressiva localizada;

- Actinomyces sp. BL008 / OT171 e Actinomyces sp. IP073 / OT448 foram as

espécies de bactérias ainda não cultivadas encontradas em freqüência e número de clones

mais elevados nos indivíduos com saúde periodontal;

- S. sputigena, F. alocis, Synergistes sp BH007 / OT359, Prevotella sp. AH125 /

OT292, Selenomonas sp. DS051 / OT137 foram as espécies/filotipos de bactérias incomuns

ou ainda não cultivadas encontradas em frequência e número de clones mais elevados nos

indivíduos com peridontite agressiva localizada.

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ANEXO