dissertação_tiago albertini balbino

7/27/2019 Dissertao_Tiago Albertini Balbino

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

REA DE CONCENTRAO:DESENVOLVIMENTO DEPROCESSOS BIOTECNOLGICOS

Tiago Albertini Balbino

DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO MICROFLUDICO PARAINCORPORAO DE DNA EM LIPOSSOMAS CATINICOSDESTINADOS A TERAPIA E VACINAO GNICA

DEVELOPMENT OFMICROFLUIDICPROCESS FORDNA

INCORPORATION INTOCATIONICL IPOSOMES FORGENE

THERAPY ANDVACCINATION

CAMPINAS, 2012


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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

REA DE CONCENTRAO:DESENVOLVIMENTO DEPROCESSOS BIOTECNOLGICOS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MATERIAIS E BIOPROCESSOS

Tiago Albertini BalbinoAutor

DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO MICROFLUDICO PARAINCORPORAO DE DNA EM LIPOSSOMAS CATINICOS

DESTINADOS A TERAPIA E VACINAO GNICA

DEVELOPMENT OFMICROFLUIDICPROCESS FORDNA

INCORPORATION INTOCATIONICL IPOSOMES FORGENE

THERAPY ANDVACCINATION

Dissertao de Mestrado apresentada Faculdade de Engenharia Qumica paraobteno do ttulo de Mestre emEngenharia Qumica, na rea deconcentrao Desenvolvimento deProcessos Biotecnolgicos.

Orientadora: Profa. Dra. Lucimara Gaziola

de La TorreCo-orientador: Prof. Dr. Adriano Rodrigues

Azzoni

CAMPINAS, 2012

Este exemplar corresponde verso final dadissertao de mestrado defendida porTiago Albertini Balbino e orientada pelaProfa. Dra. Lucimara Gaziola de La Torre.

Assinatura da orientadora


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FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELABIBLIOTECA DA REA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP

B185dBalbino, Tiago Albertini

Desenvolvimento de processo microfludico paraincorporao de DNA em lipossomas catinicosdestinados a terapia e vacinao gnica / Tiago AlbertiniBalbino. --Campinas, SP: [s.n.], 2012.

Orientador: Lucimara Gaziola de La TorreCo-orientador: Adriano Rodrigues Azzoni.Dissertao de Mestrado - Universidade Estadual de

Campinas, Faculdade de Engenharia Qumica.

1. Lipossomas. 2. Transfeco. 3. Microfludica. 4.Nanotecnologia. I. Torre, Lucimara Gaziola de La, 1971-.II. Azzoni, Adriano Rodrigues. III. Universidade Estadualde Campinas. Faculdade de Engenharia Qumica. IV.Ttulo.

Ttulo em Ingls: Development of microfluidic process for DNA incorporation intocationic liposomes for gene therapy and vaccination

Palavras-chave em Ingls: Liposomes, Transfection, Microfluidics,Nanotechnology

rea de concentrao: Desenvolvimento de Processos Biotecnolgicos

Titulao: Mestre em Engenharia Qumica

Banca examinadora: Maria Helena de Andrade Santana, Leide PassosCavalcanti

Data da defesa: 22-07-2012

Programa de Ps Graduao: Engenharia Qumica


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Dissertao de mestrado defendida por Tiago Albertini Balbino e aprovada

no dia 22 de junho de 2012 pela banca examinadora constituda pelos seguintes

doutores:


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Aos meus pais: aqueles quemais contriburam com esta pesquisa,

muito embora dificilmente possamcompreend-la.


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AGRADECIMENTOS

Que toda pesquisa acadmica motivada por algum desafio ou algumacuriosidade cientfico-tecnolgica sabido desde os primeiros cientistas. Porm,mais motivadores que os desafios encontrados durante o percurso desta

pesquisa, foram as pessoas que, de alguma forma, me motivavam a super-los ea me superar. Pessoas que me marcaram durante esse meu trajeto, ou que jhaviam me marcado antes mesmo do seu incio.

Primeiramente, agradeo imensamente minha famlia, j que, nas rpidasfolgas, muitas vezes o voltar para casa realmente fazia sentido. Esperar minhame perguntar o que eu queria que ela cozinhasse, apesar de ela j saber o queseria... Dar uma volta com meu pai e v-lo orgulhoso enquanto conto das coisasde Campinas... Conversar amenidades com as minhas irms, Danbia e Marcela,s para, no fundo, no perder o costume... Era nessas minhas voltas para casa

que realmente conseguia me desligar do que sou em Campinas e ser filho e irmode verdade. O amor to forte que tenho por vocs a matria-prima de todo meusucesso profissional e, acima de tudo, dos valores que me constituem humanoantes de cientista.

Aos amigos que conheci em Campinas e que me fizeram amadurecerpessoalmente numa fase to importante e marcante da minha vida. Tambm aosamigos de Umuarama e Maring, que hoje j no so mais to presentes ouprximos pelo contato cotidiano, mas que de alguma forma participaram da minhaformao como pessoa.

Aos tios, tias, primos e primas, por sempre me acolherem to ternamentenos encontros familiares. Especialmente Lu e ao Zito, por serem minha famlia

em Maring durante minha graduao. E Lu, minha segunda me, pelas horasde conversa, pelo apoio incondicional e pelo amor quase materno que recebo emcada abrao.

Aos amigos do laboratrio: Carol, Zmpero, Amanda, Gabi, Mica, Nayla,Rafa, Andria, Gilson, Mari, Pati, Fer, Aline, Felipe e Leandra. O passar do tempodentro e, algumas vezes, fora da FEQ s me fizeram admir-los ainda mais comopessoas e profissionais que so. queles com mais proximidade pessoal,

agradeo carinhosamente por toda a ateno essencial nos momentos maisdifceis.

professora Anete, pelo uso do laboratrio, e aos colegas do CBMEG, pelomodo como me acolheram e tambm pelas grandes ajudas com as bactrias eHeLas.

Ao CNPq, FAPESP e FUNCAMP, pelo financiamento.


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Ao Instituto Butant, especialmente Sylvia e Simone, pelo suporte tcnico

nas anlises de microscopia eletrnica de transmisso.

Ao Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron (LNLS), pelas medidas deSAXS, e ao Laboratrio de Microfrabricao/LNLS, pelo auxlio tcnico no design

e confeco dos dispositivos microfludicos.Ao professor Mrio Gongora Rubio e Juliana Schianti, do Instituto de

Pesquisas Tecnolgicas de So Paulo, pelas sugestes dadas no exame dequalificao e pelas grandes contribuies referentes aos processosmicrofludicos.

Leide, por quem tenho grande admirao, pelas agradveis e, muitasvezes, interminveis horas nas linhas de SAXS madrugada adentro. Pelapacincia com as cobranas dos prazos e por ter de explicar mais de uma vezsobre cailles, fittings, distncias interlamelares etc. Tambm pela disposio ao

aceitar compor a banca avaliadora. Tambm agradeo ao Antnio e ao Cristianopelo vasto enriquecimento deste trabalho ao torn-lo to interdisciplinar.

Agradeo gentilmente professora Maria Helena, por ter disponibilizado ouso de seu laboratrio, pelo conhecimento compartilhado dentro e fora da sala deaula, e pela participao como membro da banca avaliadora.

Ao meu co-orientador, professor Adriano. Por ter me ensinadometiculosamente toda a parte biolgica, que foi fundamental para esta pesquisa.Por sempre se dispor a resolvermos juntos qualquer empecilho.

minha orientadora e professora, Lucimara, por quem tenho admirao e

respeito imensos. Por tudo o que fez e tem feito por mim, por acreditar sempre emmeu trabalho e em meu potencial. Por nunca impor, mas sempre sugerir direes.Por me incitar investigao tecnolgica e tambm me ensinar que, mais que

com planejamentos experimentais, uma boa pesquisa tambm pode ser resolvida base do truco.

E ao meu companheiro, Jefferson, por estar ao meu lado durante a escritade cada pgina deste texto. Agradeo pela compreenso, pelo amor, peloincentivo, pela companhia... E, especialmente, pela beleza e poesia de uma vida adois.

A todos vocs, agradeo humildemente por estarem presentes de algumaforma durante essa etapa to importante na minha vida.


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La utopa esta en el horizonte. Me acercodos pasos, ella se aleja dos pasos. Caminodiez pasos y el horizonte se desplaza diezpasos ms all. Por mucho que camine,

nunca la alcanzar. Entonces para qusirve la utopa? Para eso: sirve paracaminar.

Eduardo Galeano


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RESUMO

Esta pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento tecnolgico de processo

microfludico para a obteno de vetores no virais, baseados na complexao

eletrosttica entre lipossomas catinicos (LC) e DNA plasmideal (pDNA) destinados

terapia e vacinao gnica. O desenvolvimento desse processo foi comparado ao

processo convencional bulk, que, a partir da simples mistura manual entre as

solues ou em sistema de vrtice, gera dificuldade no controle do tamanho destas

estruturas e pode produzir variaes nos resultados biolgicos e na estabilidade

coloidal. J o processo microfludico, que utiliza dispositivos que processam pequenas

quantidades de fluidos (10-9 a 10-18 litros), permite a complexao eletrosttica em

regime contnuo, com o controle das condies difusionais, o que tambm permite

melhor controle do tamanho destes complexos. Metodologicamente, o trabalho foi

dividido em trs principais etapas: na primeira parte, foi realizado o estudo fsico-qumico, estrutural e biolgico dos complexos pDNA/LC obtidos por processo bulk.

Nessa etapa, verificou-se a correlao das propriedades fsico-qumicas e estruturais

dos complexos com o processo de transfeco in vitro em clulas HeLa. A segunda

parte do trabalho visou otimizao da produo de lipossomas catinicos em dois

dispositivos microfludicos, com uma nica e com dupla focalizao hidrodinmica, de

modo a se obter lipossomas similares aos estudados na primeira parte do trabalho.

Na utilizao do segundo dispositivo, foi possvel operar em vazes volumtricas mais

altas quando comparadas ao primeiro. Por fim, na terceira parte, foi realizado o estudo

da complexao entre LC e pDNA por processo microfludico tambm em dois

diferentes dispositivos, um similar ao utilizado na segunda parte do trabalho, com

focalizao hidrodinmica nica, e outro com blocos regulares nas paredes do

microcanal, o que aumenta a rea de contato entre os fluidos. Os complexos

formados no primeiro dispositivo apresentaram melhores respostas biolgicas in vitro,

as quais foram similares s do processo bulk. No segundo dispositivo, ensaios de

acessibilidade de sonda de fluorescencncia ao DNA indicaram alterao na

associao entre LC e DNA. Dessa forma, a partir dos resultados, conclui-se que os

dispositivos microfludicos estudados so uma alternativa promissora para a formaode LC e tambm sua complexo com pDNA em modo contnuo, tanto pela

potencialidade tecnolgica quanto biolgica, o que contribui para o desenvolvimento

de produtos farmacuticos que veiculam DNA e que so destinados terapia e

vacinao gnica.

Palavras chave: Lipossomas; Transfeco; Microfludica; Nanotecnologia.


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ABSTRACT

This research aimed at the technological development of microfluidic process for

nonviral carriers production based on the electrostatic complexation between cationic

liposomes (CL) and plasmidal DNA (pDNA) for gene and vaccine therapy applications.

The development of this process was compared to the conventional bulk process, in

which the solutions are mixed followed by the simple hand shaking or brief vortexing,

what generates difficulties on the particles sizes control and can affect the biological

functionality and colloidal stability of the formulations. In contrast, microfluidic process,

which uses devices that manipulate small amounts of fluids (10-9 to 10-18 liters), allows

the electrostatic complexation in continuous mode, controlling diffusion conditions,

which also allows the colloidal control of the obtained formulations. Furthermore,

microfluidic devices have minimum dimensions and operate with low energy

consumption. Methodologically, the present work was carried out in three mean steps:in the first step, the physicochemical, structural and biological characteristics of the

pDNA/CL complexes obtained by the bulk process were studied. In this step, it was

possible to verify the correlation of physicochemical and structural properties with the

transfection phenomenon in vitro of HeLa cells. The second part of this work focused

the optimization of the production of CL through two microfluidic devices, with single

and double hydrodynamic focusing, to obtain similar CL to those of the first step of this

work. By employing the second device, it was possible to operate at higher volumetric

flow rates than the first one. Finally, in the third step, it was explored the complexation

between CL and pDNA via microfluidic process also in two different microfluidic

devices; the first was similar to that employed in the second part of this work, with a

single hydrodynamic focusing, and a second one with patterned microchannel walls,

which increase the surface contact area between the fluids. The complexes formed in

the first device showed better biological results in vitro, which were similar to the

complexes formed in the bulk complexation method. In the patterned device, the

experiments of the DNA accessibility to fluorescent probe pointed out modifications

between the pDNA and CL association in the complexes. In conclusion, we showed

that the studied microfluidic devices are a promising alternative for the production ofCL and the complexation with pDNA in continuous mode, because of the technological

and biological potentialities, which contributes to the development of feasible

processes, for the production of new pharmaceutical products for gene and vaccine

therapies.

Keywords: Liposomes; Transfection; Microfluidics; Nanotechnology.


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SUMRIO

Agradecimentos ................................................................................................... ix

Resumo ............................................................................................................... xiii

Abstract ................................................................................................................ xvSumrio .............................................................................................................. xvii

Lista de Figuras .................................................................................................. xxi

Lista de Tabelas ................................................................................................ xxv

Nomenclatura ................................................................................................... xxvi

Captulo 1 Introduo Geral ............................................................................ 29

1. Introduo ......................................................................................................... 29

2. Objetivos ........................................................................................................... 31

3. Organizao da Dissertao em Captulos ....................................................... 32

4. Referncias ....................................................................................................... 34

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica ..................................................................... 35

1. Lipossomas ....................................................................................................... 351.1. Veiculao de DNA em lipossomas catinicos ............................................... 35

1.2. Produo de lipossomas catinicos ............................................................... 38

2. Microfludica ...................................................................................................... 40

3. Produo de Lipossomas em Microcanais ........................................................ 42

4. Sistemas Microfludicos para a complexao eletrosttica entre lipossomascatinicos e DNA ................................................................................................... 46

5. Referncias ....................................................................................................... 49

Captulo 3 Correlation between Physicochemical and Structural Propertieswith In VitroTransfection of pDNA/Cationic Liposomes Complexes ............. 53

Abstract ................................................................................................................. 53

1. Introduction ........................................................................................................ 54


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2. Materials and Methods ...................................................................................... 57

2.1. Materials ......................................................................................................... 57

2.2. Plasmid DNA purification ................................................................................ 57

2.3. Preparation of pVAX-Luc/cationic liposome complexes (pDNA/CL) ............... 57

2.4. Physicochemical Characterization .................................................................. 58

2.4.1. Average Hydrodynamic Diameter and Polydispersity .................................. 58

2.4.2. Measurement of Zeta Potential ................................................................... 58

2.4.3. Gel retardation assay for determining the molar charge ratio for completeDNA complexation with CL .................................................................................... 58

2.4.4. Morphology .................................................................................................. 59

2.5. In Vitro Cytotoxicity ......................................................................................... 59

2.6. Culture and transfection of mammalian cells .................................................. 60

2.7. Structural characterization of the pDNA/CL complexes using Synchrotron

SAXS ..................................................................................................................... 60

3. Results .............................................................................................................. 61

3.1. Physicochemical characterization of pDNA/CL complexes ............................ 61

3.2. In vitro transfection of HeLa cells ................................................................... 65

3.3. In vitro cytotoxicity .......................................................................................... 66

3.4. Structural characterization of the pDNA/CL complexes using SynchrotronSAXS ..................................................................................................................... 67

4. Discussion ......................................................................................................... 72

5. Conclusions ....................................................................................................... 77

6. Acknowledgements ........................................................................................... 78

7. References ........................................................................................................ 78

Captulo 4 Continuous Flow Production of Cationic Liposomes at HighLipid Content in Microfluidic Devices for Gene and Vaccine Therapy ........... 83

Abstract ................................................................................................................. 83

1. Introduction ....................................................................................................... 84

2. Materials and Methods ...................................................................................... 86


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2.1. Materials ......................................................................................................... 86

2.2. Cationic Liposome Production ........................................................................ 87

2.3. Physicochemical and structural characterization ............................................ 89

2.3.1. Average hydrodynamic diameter and Polydispersity ................................... 89

2.3.2. Zeta Potential Measurement ....................................................................... 89

2.3.3. Morphology .................................................................................................. 89

2.3.4. Structural characterization using Synchrotron SAXS .................................. 90

2.4. Process productivity ....................................................................................... 90

2.5. Culture and transfection of mammalian cells .................................................. 91

2.6. Experimental design for response surface methodology ................................ 92

3. Results and Discussion ..................................................................................... 923.1 Cationic liposome production using the single hydrodynamic focusing (SHF)microfluidic device ................................................................................................. 93

3.2 Cationic liposome production using the double hydrodynamic focusing (DHF)microfluidic device ................................................................................................. 98

3.3. Comparison of the effect of flow velocities on the particle size of the liposomesproduced using the SHF and DHF microfluidic devices ...................................... 100

3.4. Flow properties and mixing time ................................................................... 101

3.4. Analysis of the Productivity and Physicochemical and Structuralcharacterization of the Cationic Liposomes Produced by the SHF and DHF Devices............................................................................................................................ 104

3.5. Biological evaluation of the Cationic Liposomes Produced by the SHF andDHF Devices ....................................................................................................... 107

4. Conclusions ..................................................................................................... 109

5. References ...................................................................................................... 109

Captulo 5 Microfluidic Devices for Continuous production of DNA/CationicLiposomes Complexes for Gene Delivery and Vaccine Therapy .................. 113

Abstract ............................................................................................................... 113

1. Introduction ...................................................................................................... 114


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2. Materials and Methods .................................................................................... 116

2.1. Materials ....................................................................................................... 116

2.2. Microfluidic Devices Fabrication ................................................................... 117

2.3. Plasmid DNA purification .............................................................................. 118

2.4. Cationic Liposome Production ...................................................................... 118

2.5. Preparation of DNA/CL complexes ............................................................... 119

2.7. Physicochemical characterization ................................................................ 120

2.7.1. Average hydrodynamic diameter and Polydispersity ................................. 120

2.7.2. Zeta Potential Measurement ..................................................................... 120

2.7.3. Morphology ................................................................................................ 120

2.7.4. Gel retardation assay ................................................................................ 1212.7.5. Plasmid DNA accessibility ......................................................................... 121

2.8. Culture and transfection of mammalian cells ................................................ 121

2.9. Statistical analysis ........................................................................................ 122

3. Results and Discussion ................................................................................... 122

3.1. Effect of temperature control on complexation process between CLs andplasmid DNA in microfluidic devices .................................................................... 123

3.2. Effect of Average Fluid Flow Velocity (Vf) on Complexes Size Distribution .. 1263.3. Physicochemical properties and Morphology of DNA/CL complexes ........... 128

3.6. In vitro HeLa transfection.............................................................................. 131

4. Conclusion....................................................................................................... 132

5. Acknowledgements ......................................................................................... 133

6. References ...................................................................................................... 133

Captulo 6 Concluses Gerais ....................................................................... 139

Captulo 7 Sugestes para Trabalhos Futuros ............................................ 141


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LISTA DE FIGURAS

Captulo 2

Figura 1. (A) Ilustrao da construo do filme lipdico. gua, leo com lipdios e

gua so seqencialmente injetados no canal principal do dispositivo microfludico,que contm microcmaras em sua parede. (B) Bombas pneumticas soacionadas formando vesculas lipdicas, que saem pelo canal principal (Fonte:KURAKAZU et al., 2010). ...................................................................................... 43

Figura 2. (A) Diagrama esquemtico do processo de formao de lipossomas emcanal microfludico. A relao de cores representa as razes de concentrao delcool isoproplico e tampo aquoso. (B) Mapa 3-D de intensidade defluorescncia durante formao de lipossomas (adaptado de JAHN et al., 2004).44

Figura 3. Representao esquemtica do sistema microfludico de focalizao

hidrodinmica para a formao do sistema auto-agregado lipossoma catinico-DNA (Fonte: KOH et al. 2005)............................................................................... 47

Captulo 3

Figure 1. Number-weighted hydrodynamic mean diameter (A), polydispersity index(B) and zeta potential (C) profiles of pDNA/CL complexes at different molar chargeratios (R+/-). The solid lines are a visual guide to better demonstrate the trend of thevariations. The error bars represent the standard error of independent triplicates. 62

Figure 2. Number (A) and volume-weighted (B) size distribution of pDNA/CLcomplexes at R+/- values of 1.8, 3, 6 and 9. Empty cationic liposomes arepresented for comparison. The lines in each size distribution represent the profile

of three independent pDNA/CL complexes. .......................................................... 63

Figure 3. Gel retardation assay. One microgram of pDNA was complexed with CLat different positive/negative molar charge ratios (R+/-) in PBS. ............................ 64

Figure 4. Negative staining electron micrographs of empty cationic liposomes

(CL) (A and B) and pDNA/CL complexes at a molar charge ratio of R+/-=3 (C andD). Scale bars indicate 100 nm in (A, B and C) and 200 nm in (D). ...................... 65

Figure 5. In vitro efficacy of HeLa cell transfection using pDNA/CL complexes atdifferent molar charge ratios (R+/-); the plasmid pVAXLUC contains a luciferasereporter gene under the control of the CMV promoter. Luciferase activity wasexpressed in RLU/mg protein. Naked pDNA and Lipofectamine (negative and

positive controls) are shown in the inset graph. The error bars represent the


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Figure 5. (A) Particle size distributions (intensity weighted) obtained by DLS and

(B) Transmission electron micrographs of cationic liposomes produced by theSingle Hydrodynamic Focusing microfluidic device at a C lip of 25 mM, FRR of 10and Vfof 143 mm/s. The bars represent 100 nm. ............................................... 106

Figure 6. (A) Particle size distributions (intensity weighted) obtained by DLS and(B) Transmission electron micrographs of cationic liposomes produced by theDouble Hydrodynamic Focusing microfluidic device at a Clip of 25 mM, FRR of 10and Vfof 285 mm/s. The bars represent 100 nm. ............................................... 106

Figure 7. Small Angle X-ray Scattering intensity of cationic liposomes produced bythe Single (SHF) and Double (DHF) Hydrodynamic Focusing devices withrespective fitting curves. Production conditions: Clip of 75 mM, FRR of 10 and Vf of

143 mm/s............................................................................................................. 107

Captulo 5Figure 1. Schematic diagram of (A) simple microfluidic hydrodynamic focusingdevice with inset illustrating the hydrodynamic focusing (SMD). (B) Patternedmicrofluidic device and the inset illustrating the geometry and dimensions of thebarriers (PMD). The microchannels are 140 m wide and 100 m deep. ........... 118

Figure 2. Effect of temperature on (A) Particle size and (B) Polydispersity Index ofthe complexation process between CLs and plasmid DNA for different methods.

Average fluid flow velocity of the microfluidic devices of 140 mm/s. The flow rateratio was maintained at 5. Error bars correspond to SD of three independentexperiments. *Statistically different (p < 0.05) when compared between the pairs.**Statistically different (p < 0.05) when compared to the bulk mixing method at 4 or25C. ................................................................................................................... 124

Figure 3. Particle size and polydispersity index of the complexes formed in simpleand patterned microfluidic devices as function of mean fluid flow velocity in thecenter outlet channel (the combined flow velocities of all inlets) at 4oC. The flowrate ratio was maintained at 5. The error bars represent the standard error ofindependent triplicates. ....................................................................................... 126

Figure 4. TEM images of DNA/cationic liposomes complexes produced by (A)simple microfluidic device and (B) patterned microfluidic device at flow rate ratio of5, at 4 C and Vfof 140 mm/s. Scale bars indicate 500 nm. ................................ 129

Figure 5. Electrophoretic mobility retardation assay of DNA complexed withcationic liposomes in different methods. Lanes: (1) free DNA; complexationprocesses: (2) bulk mixing; (3) simple microfluidic device; and (4) patterned


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microfluidic device. Average fuid flow velocity of the microfluidic devices of 140

mm/s, at 4oC and FRR 5. .................................................................................... 130

Figure 6. Relative fluorescence obtained by the probe in ultra pure water. Resultswith free DNA used as control for complexes DNA/cationic liposomes formed by

three different methods: bulk, in the simple and in the patterned microfluidicdevices. The operational conditions of the microfluidic process were average fuidflow velocity of 140 mm/s at 4C and FRR 5. Error bars correspond to SD of threeindependent experiments (n = 3). * p < 0.05 was considered statistically differentwhen compared to other samples. ...................................................................... 131

Figure 7. In vitro efficacy on HeLa cells transfection of DNA/CL complexes formedby bulk mixing and microfluidic methods. Activity was expressed in RLU/mg

protein. The DNA/CL complexes were obtained appling average fuid flow velocityof the microfluidic devices of 140 mm/s at 4C and FRR of 5. Each data represents

SD of three experiments, * p < 0.05 was considered statistically different. NS, nosignificant (p < 0.05). ........................................................................................... 132


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LISTA DE TABELAS

Captulo 3

Table 1. Parameters obtained from simultaneous fitting of all scattering curves. .. 71

Captulo 4

Table 1. CCRD matrix with the real and coded values (in parenthesis) for thefactors (Average Flow Velocity (Vf), Lipid Concentration dispersed in ethanol (Clip),and Flow Rate Ratio (FRR)) tested and the responses (Particle Size andPolydispersity (Pdl)) obtained using the SHF device in the production of cationicliposomes. ............................................................................................................. 94Table 2. ANOVA for the Cationic Liposomes produced by the Single HydrodynamicFocusing (SHF) device. ......................................................................................... 94Table 3. CCRD matrix with the real and coded values (in parenthesis) for thefactors (Average Flow Velocity (Vf), Lipid Concentration of the dispersion in ethanol

(Clip) and Flow Rate Ratio (FRR)) tested and the responses (Particle Size andPolydispersity (Pdl)) obtained using the DHF device in the production of cationicliposomes. ............................................................................................................. 99Table 4. ANOVA for the Cationic Liposomes produced by the DoubleHydrodynamic Focusing (DHF) device. ................................................................. 99Table 5. Physicochemical properties of cationic liposomes produced by the singleand double hydrodynamic focusing microfluidic devices (SHF and DHF,respectively). Operating parameters: FRR of 10, Clip of 25 mM and Vf of 165 and285 mm/s for the SHF and DHF, respectively. .................................................... 104

Captulo 5

Table 1. Flow properties of continuous formation of DNA/CL complexes in simpleand patterned microfluidic devices at Vf of 140 mm/s and temperature control. The

maximum and minimum for the patterned microfluidic device indicates the flowthrough compression regions (in the blocks) and expansion regions. ................. 128Table 2. Physicochemical properties of DNA/CL complexes obtained by the bulkmixing and microfluidic methods with Vfof 140 mm/s and at 4 C. ..................... 128


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NOMENCLATURA

: Densidade do fluido;

: Viscosidade dinmica;CL: Cationic Liposomes

Clip: Concentrao lipdica na disperso em etanol;

D: Coeficiente de difuso das partculas;

DC-Chol: 3-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterolhydrochloride;

DCCR: Delineamento Composto Central Rotacional;

Dh: Dimetro hidrulico;

DHF: Double Hydrodynamic Focusing;

DHF: Double hydrodynamic focusing;

DLS: Dynamic Light Scattering;

DMPC: 1,2-Dihexanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine;

DNA: cido desoxirribonucleico;

DOPC: 1,2-dioleoil-sn-glicero-sn-3-fosfatidilcolina;

DOPE: L--dioleoil fosfatidiletanolamina;

DOSPA: 2,3 Dioleoiloxi-N-[(esperminacarboxamino)etil]-N,N-dimetil-1-propanamnio;

DOTAP: 1,2-dioleoil -3-trimetilamnio-propano;

DOTMA: Cloreto de dioleoxi propil trimetil amnio;

DRV: Dehydrated-hydrated vesicles;

DRV: Dehydrated-rehydrated vesicles;EDP: Electronic Density Profile;

EPC: L-a-fosfatidilcolina de ovo;

EtBr: Brometo de etdio;

FRR: Flow Rate Ratio;


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xxvii

HCII: Fase hexagonal inversa;

HeLa: Human ephitelial carcinoma;

LC: Lipossomas Catinicos;

Luc: Luciferase;MCT: Modified Caill Theory;

MET: Microscopia eletrnica de transmisso;

N: Nmero de bicamadas;

P: Produtividade molar de lipossomas;

PdI: Polydispersity Index;

PDMS: Polidimetilsiloxano;

pDNA: DNA plasmideal

Pe: Peclet, nmero adimensional;

PMD: Patterned Microfluidic Device;

QT: Vazao Volumtrica Total;

R+/-: Razo molar de cargas, relao entre moles de cargaspositivas de lipdios catinicos e cargas negativas do DNA;

Re: Reynolds, nmero adimensional;

RLU: Relative Light Units;

SAXS: Small Angle X-ray Scattering;

SD: Standard Deviation;

SD: Standard Deviation;

SHF: Single Hydrodynamic Focusing;

SMD: Simple Microfluidic Device;

TEM: Microscopy Electron Transmission;

Vf: Velocidade Superficial de Escoamento;

: Potencial Zeta.


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____________________________________________________________________

CAPTULO 1INTRODUO GERAL

____________________________________________________________________

1. Introduo

A terapia gnica uma tcnica promissora destinada terapia preventiva e

ao tratamento de inmeras doenas, baseada na introduo de material gentico

em clulas especficas (CORSI et al., 2003). Visa a correo dos genes

responsveis por uma determinada doena ou a produo de determinada

protena pela prpria clula. Esta terapia pode ser utilizada em diversos tipos de

doenas, tais como cncer, AIDS e doenas cardiovasculares (TURAN et al.

2003). A partir da dcada de 90, este conceito foi tambm estendido profilaxia e

tratamento de doenas infecciosas, tais como a tuberculose (Rosada et al. 2008 e

TORRE et al., 2009) e Leischmaniose (GOMES et al., 2007).

Uma grande dificuldade na utilizao deste material gentico em aplicaes

in vitro e in vivo que o DNA quimicamente instvel quando em contato com

vrios componentes corpreos e, considerando sua natureza qumica (carga

negativa) e seu tamanho elevado, o processo de transfeco (entrada nas clulas

e no ncleo) dificultado (LASIC, 1997, ROPERT, 1999).

Nesse sentido, os efeitos de veiculadores tm sido investigados por vrios

grupos de pesquisa, a fim de se obter proteo para o DNA em contato com os

fluidos corpreos/extracelulares e aumentar sua eficincia de transfeco in vitro e

in vivo. Dentre os vetores no virais para entrega de material gentico, os

Lipossomas Catinicos (LC) se apresentam promissores, pois permitem a

proteo do DNA e o acoplamento, na sua superfcie, de compostos queaumentam a eficincia de transfeco. Alm disso, a facilidade de interao com

as clulas uma caracterstica intrnseca dessas estruturas lipdicas, devido sua

semelhana com a membrana celular (LABAS et al., 2010, DE ROSA & LA

ROTONDA, 2009).


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Captulo 1

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Lipossomas so estruturas aproximadamente esfricas de dimenses

coloidais com cerne aquoso circundado por uma ou mais bicamadas lamelares

lipdicas. So formados principalmente por fosfolipdios que se auto-agregam

espontaneamente em vesculas em meio aquoso, incorporando parte desse meio

em que se encontram.

Apesar da grande quantidade de estudos na rea e de demonstrar sucesso

em suas aplicaes, o nmero de produtos lipossomais aprovados em aplicao

humana pequeno. Dentre outras razes, isso se deve ao fato de no haver

mtodos de produo de lipossomas eficientes de baixo-custo. Em muitos dos

mtodos, a auto-agregao no completamente controlada, levando

necessidade de utilizao de operaes unitrias subsequentes para a reduo do

tamanho (MOZAFARI, 2005). Assim, a produo desses vetores em larga escalanas condies requeridas para sua aplicao uma etapa limitante das

formulaes lipossomais destinadas terapia e vacinao gnica. Para isto,

fazem-se necessrios estudos de processos capazes de reproduzirem as

propriedades fsico-qumicas e biolgicas dos lipossomas funcionais,

anteriormente obtidos por processos laboratoriais, sem alterar a estabilidade

coloidal dos mesmos.

Uma alternativa para contornar estas dificuldades de processo a

realizao da produo de LC e sua complexao eletrosttica com DNA em

sistemas microfludicos, permitindo um melhor controle dos processos difusionais

e, consequentemente, melhorando o controle do tamanho e polidispersidade das

partculas e sua estabilidade. Alm disso, os sistemas microfludicos possuem

tamanho mnimo e operam com baixo consumo de energia.

Essa perspectiva, chamada de Intensificao de Processo, tem recebido

muita ateno na Engenharia Qumica moderna. Ela concerne a inovaes que

reduzem o tamanho da planta e consumo de energia em vrias ordens de

grandeza para um determinado objetivo e consiste no desenvolvimento de novas

tecnologias que tragam melhorias na produo e processamento. Essas

inovaes diminuem substancialmente a razo tamanho de

equipamento/capacidade de produo e so mais eficientes energeticamente,


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Captulo 1

31

resultando em tecnologias sustentveis de menor custo (STANKIEWICZ et al.,

2009; SPOORTHI et al., 2010). Neste contexto, a microfludica se apresenta como

uma forma de alcanar a intensificao de processo, integrando, em uma nica

etapa, determinados processos e etapas subsequentes de produo.

No cerne dessa perspectiva de desenvolvimento de processos

microfludicos, esse trabalho visa a contribuir para o desenvolvimento de novos

processos de obteno de vetores no virais baseados em LC, destinados

terapia e vacinao gnica utilizando a microfludica como estratgia para o

controle na formao dos lipossomas e seus complexos com DNA.

Em ltima instncia, esse trabalho contribuir para o desenvolvimento

tecnolgico de novos processos que viabilizem produtos farmacuticos que

veiculem DNA destinados terapia e vacinao gnica.

2. Objetivos

O objetivo deste trabalho foi o de contribuir na rea da nanobiotecnologia,

mais especificamente para o desenvolvimento de novos processos de obteno

de vetores no virais baseados em lipossomas catinicos destinados terapia e

vacinao gnica. Para tal, a partir de LC obtidos por processo microfludico,

estudou-se o processo de complexao eletrosttica entre LC e DNA, em sistema

microfludico, empregando dispositivos de focalizao hidrodinmica e comparou-

os ao processo de complexao convencional bulk.

A pesquisa foi estruturada a partir dos trs principais objetivos:

Caracterizao dos complexos DNA/lipossomas catinicos obtidos pelo

mtodo convencional bulk: determinao das condies de complexao

bulk entre LC e DNA que foram utilizadas como referncia para o

desenvolvimento do processo microfludico.

Estudo do processo microfludico para a produo de lipossomas catinicos:

produo de LC atravs de dispositivos microfludicos de focalizao

hidrodinmica (simples e dupla) em maiores concentraes lipdicas, a fim de

produzir essas nanopartculas com nveis de polidispersidade e tamanho

similares aos LC produzidos pelo mtodo bulk.


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Captulo 1

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Desenvolvimento de processo microfludico para a complexao eletrosttica

entre lipossomas catinicos e DNA: desenvolvimento de processos que

permitam a complexao eletrosttica entre LC e DNA em dispositivos

microfludicos de focalizao hidrodinmica nica, similar ao estudado na

segunda parte, com e sem blocos regulares nas paredes do microcanal, de

modo a aumentar a rea de contato entre os fluidos.

3. Organizao da Dissertao em Captulos

A presente dissertao est organizada em captulos, conforme descrito a

seguir. Os resultados esto divididos na forma de artigos que sero submetidos a

peridicos internacionais, selecionados de acordo com a afinidade do contedo

abordado. Dessa forma, os itens introduo, metodologia, resultados e discussoe concluses de cada etapa constam nos artigos em seus respectivos captulos.

No Captulo 2, Reviso Bibliogrfica, so abordados os aspectos tericos

quanto ao Estado da Arte no mbito em que essa pesquisa se insere.

No Captulo 3, intitulado Correlation between Physicochemical and

Structural Properties with In Vitro Transfection of pDNA/Cationic Liposomes

Complexes, a caracterizao fsico-qumica aliada estrutural pde ser

correlacionada com ensaios biolgicos. Uma vez que a caracterizao fsico-

qumica dos complexos no foi suficiente para elucidar os diferentes nveis de

transfeco obtidos para diferentes razes molares de cargas, foram conduzidas

investigaes de espalhamento de raios-x a baixo ngulo (SAXS - Small angle X-

ray scattering) a fim de avaliar as modificaes estruturais, j evidenciadas por

estudos de DLS por volume. As anlises de SAXS mostraram que a populao de

vesculas com dupla bicamada cresce gradativamente com o aumento da razo

molar de cargas, assim como observado na transfeco in vitro em clulas HeLa.

Prxima regio de isoneutralidade de cargas, a queda nos nveis de transfeco

foi explicada pelo aparecimento de outra populao de partculas, com uma mdia

de 5 bicamadas lipdicas, o que, provavelmente, interferiu na liberao do DNA s

clulas.


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Captulo 1

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J no Captulo 4, Continuous Flow Production of Cationic Liposomes at

High Lipid Content in Microfluidic Devices for Gene and Vaccine Therapy, foi

estudada a produo de lipossomas catinicos em sistema contnuo em altas

concentraes com o emprego de dois dispositivos microfludicos. O primeiro com

nica focalizao hidrodinmica e o segundo com dupla, objetivando o aumento

da rea de contato entre os fluxos aquosos e orgnicos, e assim a rea de

difuso. Verificou-se que o dispositivo com dupla focalizao hidrodinmica

capaz de operar a vazes mais altas que o de focalizao nica. Os estudos de

SAXS revelaram a predominncia de lipossomas unilamelares em ambos os

dispositivos. Estudos biolgicos in vitro mostraram a potencialidade do processo

para produzir essas estruturas lipossomais carreadoras de DNA.

O Captulo 5, por sua vez, sob o ttulo de Continuous Formation ofDNA/Cationic Liposomes Complexes using Microfluidic Hydrodynamic Focusing

Devices for Gene Delivery and Vaccine Therapy, investiga a utilizao de sistemas

microfludicos para a formao de complexos DNA/lipossomas catinicos em

modo contnuo. Com o emprego de dois dispositivos e tendo o mtodo de

complexao convencional bulk como referncia, os complexos obtidos atravs

de os ambos dispositivos estudados um de paredes dos microcanais com blocos

padronizados e outro de parede simples foram capazes de transfectar in vitro

clulas humanas do tipo HeLa. O dispositivo simples atingiu nveis de transfeco

similares ao alcanados pelos complexos obtidos pelo mtodo bulk, enquanto o

dispositivo com blocos nos microcanais apresentou menores nveis de

transfeco. Isso provavelmente ocorreu devido diferena de acomodao do

DNA nas estruturas lipossomais, conforme mostrado nos ensaios de sonda de

fluorescncia. De modo geral, ambos os dispositivos foram capazes de produzir

complexos de tamanho e polidispersidade controlados para aplicaes em terapia

e vacinao gnicas.

Por fim, a dissertao fechada com dois outros captulos: Concluses

Gerais e Sugestes para Trabalhos Futuros, em que so listadas as concluses

que os estudos desenvolvidos permitiram e em que tambm se sugere rumos para

pesquisas futuras.


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Captulo 1

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4. Referncias

CORSI, K., CHELLAT, F., YAHIA, L., & FERNANDES, J. C. Mesenchymal stem cells,MG63 and HEK293 transfection using chitosanDNA nanoparticles. Biomaterials, v.24, p. 1255-1264, 2003.

DE ROSA, G.; LA ROTONDA, M. I., Nano and Microtechnologies for the Delivery ofOligonucleotides with Gene Silencing Properties. Molecules, v. 14, p. 2801-2823,2009.

GOMES, D. C. O.; PINTO, E. F.; MELO, L. D. B.; LIMA, W.P.; LARRAGA, V.; LOPES,U.G.; ROSSI-BERGMANN, B. Intranasal delivery of naked DNA encoding the LACKantigen leads to protective immunity against visceral leishmaniasis in mice. Vaccine ,v. 25, p. 2168-2172, 2007.

LABAS, R.; BEILVERT, F.; BARTEAU, B.; DAVID, S.; CHE`VRE, R.; PITARD, B. Natureas a source of inspiration for cationic lipid synthesis. Genetica, v.138, p. 153-168,2010.

LASIC, D.D. Liposomes in Gene Delivery. Boca Raton-Florida:CRC Press, p. 295. 1997.

ROPERT, C. Liposomes as a gene delivery system. Brazilian Journal of Medical andBiological Research, v. 32, p. 163-169, 1999.

ROSADA, R. S., TORRE, L. G.; FRANTZ, F. G. et al. Protection Against Tuberculosis bya Single Intranasal Administration of DNA-hsp65 Vaccine Complexed with CationicLiposomes. BMC Immunology, 9:38, 2008.

SPOORTHI, G., THAKUR, R. S., KAISTHA, N., RAO, D. P., Process intensification in PSAprocesses for upgrading synthetic landfill and lean natural gases. Adsorption-Journalof the International Adsorption Society, v. 17, p. 121-133, 2011.

STANKIEWICZ, A. I., MOULIJN, J. A., Process intensification: Transforming chemicalengineering. Chemical Engineering Progress, v. 96, p. 22-34, 2000.

TORRE, L. G.; ROSADA, R. S.; TROMBONE, A.P.F., FRANTZ, F.G.; COELHO-CASTELO, A.A.M., SILVA, C.L.; SANTANA, M.H.A. Synergy between structuralstability and dna-binding controls the antibody production in EPC/DOTAP/DOPEvesicles and DOTAP/DOPE lipoplexes. Colloids and Surfaces, v. 73, p. 175-184,2009.

TURAN, S., ARAL, C., KABASAKAL, L., & UYSAL, M. K. Coencapsulation of two plasmidsin chitosan microspheres as a nonviral gene delivery vehicle. Journal of Pharmacyand Pharmaceutical Sciences, 1, 2732, 2003.


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CAPTULO 2REVISO BIBLIOGRFICA

____________________________________________________________________

1. Lipossomas

Lipossomas so estruturas aproximadamente esfricas de dimenses

coloidais com cerne aquoso circundado por uma ou mais bicamadas lamelares

lipdicas. So formados quando fosfolipdios se autoagregam espontaneamente

em vesculas na presena de gua, incorporando parte do meio em que se

encontram. Pelo fato das lamelas mimetizarem membranas celulares, oslipossomas possuem diversas caractersticas biolgicas, que incluem interaes

com biomembranas e com diversas clulas (LASIC, 1995).

Pela sua degradabilidade e no-toxicidade (que depende da sua

composio), uma das principais vantagens da utilizao de lipossomas sua

aplicao como transportadores de frmacos de qualquer natureza, como

hidroflicos, que se posicionam nos domnios aquosos internos, lipoflicos, que se

localizam nas bicamadas, e anfiflicos, que se localizam entre ambos os domnios.

As lamelas protegem os compostos carreados das agresses do meio biolgico e

promovem sua liberao sustentada (BATISTA, 2008).

1.1. Veiculao de DNA em lipossomas catinicos

Os lipossomas catinicos apresentam-se promissores para a veiculao de

DNA, pois permitem a sua proteo contra a degradao por fluidos corpreos e

complexao eletrosttica. Alm disso, a facilidade de interao com as clulas

uma caracterstica intrnseca das estruturas lipdicas, devido sua semelhanacom a membrana celular (LABAS et al., 2010, DE ROSA & LA ROTONDA, 2009 e

LASIC, 1993).

O transporte efetivo de nucleotdeos para o interior das clulas foi

conseguido com a utilizao de lipdios catinicos, como reportado por Felgner


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Captulo 2

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(1987), em mecanismo denominado lipofeco. Desta forma, lipdios catinicos

foram usados para carrear nucleotdeos por meio de simples complexao

eletrosttica e para facilitar o seu transporte para o interior das clulas, por

possurem cargas opostas. Vrios lipdios catinicos sintticos tm sido usados,

dentre os quais os sais quaternrios de amnio, tais como o brometo de

dimetildioctadecil amnio (DDAB) e o 1,2-dioleoil -3-trimetilamnio-propano

(DOTAP), so os mais conhecidos como carreadores de nucleotdeos (Labas et al.

2010).

No processo de transporte para o interior das clulas, os nucleotdeos

associados a lipossomas catinicos so inicialmente internalizados

preferencialmente atravs do mecanismo de endocitose. Em uma segunda etapa

necessrio que os nucleotdeos sejam liberados da membrana endossomal parao citoplasma, possivelmente por ruptura da membrana que se desestabiliza devido

a interaes entre os lipdios catinicos e suas molculas aninicas (Wattiaux et

al., 1997). Dentro desse mecanismo, a presena de fosfatidoletanolaminas (PEs),

tambm designadas como auxiliadores (do ingls, helpers), intensifica o processo

de liberao por possurem caractersticas fusognicas, que facilitam a

desestabilizao da membrana endossomal (FELGNER et al., 1994). Porm, a

fuso dos lipdios associados ao DNA com a membrana endossomal provocada

pelas PEs no ocorre diretamente com a membrana citoplasmtica, sendo

necessria a etapa inicial da endocitose (Wrobel & Collins, 1995). Por essa razo

as PEs so tambm designadas na literatura como co-lipdios em relao aos

lipdios catinicos.

Dentre as PEs, mais conhecida a ao fusognica do 1,2 dioleoil- sn-

glicero-3-fosfo etanolamina (DOPE). Sua importncia nos estudos de

potencializao da liberao dos nucleotdeos in vitro com lipdios catinicos,

deve-se sua capacidade de passar para a fase hexagonal H II, facilitando a

desestabilizao da membrana endossomal e promovendo a liberao dos

nucleotdeos no citoplasma atravs da troca de lipdios do endossoma com a

membrana lipossomal.


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Captulo 2

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Em geral, a geometria molecular dos anfiflicos catinicos e do DOPE, por si

s no favorece a agregao em bicamadas lamelares nas condies fisiolgicas.

Os agregados formados so instveis, havendo co-existncia entre as fases

lamelar e hexagonal tal como reportado por Rdler et al. (1997), com o DNA

intercalado nas estruturas. A associao de lipdios catinicos e DOPE com

fosfolipdios estruturais tais como fosfatidilcolinas (PCs) imprescindvel para a

formao de lipossomas, os quais so constitudos de bicamadas regulares ou

lamelas, que se agregam intercalando domnios aquosos e gerando partculas

coloidais aproximadamente esfricas.

Devido correlao direta entre a fluidez da bicamada e a capacidade de

transfeco (DUZGUNES et al.,1989), idealmente, a temperatura de transio de

fazes das PCs deve ser baixa, o que encontrado na fosfatidilcolina natural deovo (EPC). Isso faz com que, a temperatura corprea, os lipdios que constituem

as estruturas lipossomais estejam no estado lquido-cristalino, o que lhes confere

a fluidez necessria para facilitar a ao do DOPE e do lipdeo catinico (DOTAP)

no processo de internalizao nas clulas. Alm disso, a incluso de EPC nas

formulaes demonstrou que a citotoxicidade in vitro drasticamente reduzida

(DE LA TORRE et al, 2009).

O desenvolvimento da nanoestrutura lipossomal incorporando o DNA-hsp65

foi inicialmente realizado por de La Torre et al. (2006). A composio lipdica

apresenta os trs lipdios DOTAP/DOPE/EPC, com funcionalidades de

incorporao do DNA e ligao eletrosttica com a superfcie das clulas,

intensificao da liberao do DNA no citoplasma celular e estruturao em

nanopartculas, utilizando a composio lipdica otimizada por Perrie et al. (2001).

Os lipossomas foram preparados pelo mtodo da desidratao-rehidratao com

duas configuraes referentes localizao do DNA nas nanoestruturas

lipossomais: uniformemente distribudo no interior ou preferencialmente na

superfcie (TORRE et al., 2009 e ROSADA et al., 2008).

Os resultados mostraram que ambas as configuraes foram capazes de

incorporar o DNAhsp65 com eficincia elevada e capacidade de incorporar 50 g

de DNA em 100 L de preparao lipdica (ROSADA et al., 2008, TORRE et al.,


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2009, TORRE, 2006). Alm disso, as preparaes foram reprodutveis e estveis

durante a estocagem, apresentando nveis de citotoxicidade semelhantes ao do

DNA nu (TORRE et al. 2009). A avaliao do efeito profiltico mostrou a

potencialidade da nanoestrutura lipossomal incorporando o DNA-hsp65

preferencialmente na sua superfcie (ROSADA et al., 2008). Alm da sua eficcia

profiltica, esta vacina possui a vantagem adicional de ser mais efetiva pela via

intranasal, que uma via no invasiva, desejvel para a administrao de

frmacos, com a reduo da dose de 400 g de DNA nu para 25 g de DNA

veiculado na nanoestrutura lipossomal (ROSADA et al., 2008). Desta forma, as

nanoestruturas lipossomais complexando DNAhsp65 apresentaram-se

promissoras para a produo de vacina para a tuberculose tanto do ponto de vista

fsico-qumico quanto tecnolgico (TORRE et al., 2006).Uma vez que as pesquisas para a obteno dos lipossomas vazios esto

em andamento, a busca de novas estratgias para avaliao da complexao

eletrosttica entre os lipossomas catinicos e o DNA vem sendo a prxima etapa

de investigao, visando processos menos suscetveis a variaes de processo,

alm de garantir maior estabilidade durante a estocagem.

Uma alternativa para contornar estas dificuldades de processo a

realizao da complexao eletrosttica entre os lipossomas catinicos e DNA em

sistema microfludico, permitindo um melhor controle dos processos difusionais e

consequentemente, melhorando o controle do tamanho das partculas e sua

estabilidade.

1.2. Produo de lipossomas catinicos

Apesar da grande quantidade de estudos na rea e de demonstrar sucesso

em suas aplicaes, o nmero de produtos lipossomais aprovados em aplicao

humana pequeno. Dentre outras razes, isso se deve ao fato de no haver

mtodos de produo de lipossomas eficientes de baixo-custo (MOZAFARI, 2005).

Em muitos dos mtodos, a agregao coloidal no completamente controlada

levando a necessidade de utilizao de operaes unitrias subsequentes para a

reduo do tamanho.


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H diversas tcnicas de produo em escala laboratorial e algumas em

larga escala (MOZAFARI, 2005). Dentre os mtodos tradicionais de produo

laboratorial de lipossomas, o proposto por Bangham , provavelmente, um dos

mais utilizados (LESOIN et al., 2011). O mtodo consiste na disperso dos lipdios

em uma fase orgnica e sua posterior remoo, formando um filme seco de

lipdios, que ento hidratado com uma soluo aquosa. Outros mtodos

tradicionais, como o mtodo de injeo de etanol, de evaporao da fase reversa

e emulso, tambm se baseiam na produo de uma soluo lipdica com um

solvente orgnico antes da disperso em uma fase aquosa. Todos esses mtodos

necessitam de uma operao unitria posterior produo dos lipossomas para

atender tamanhos e polidispersidade de tamanhos requeridos. Os mtodos mais

comuns de reduo/uniformizao do tamanho dos lipossomas so sonicao,extruso e homogeneizao a alta presso (MEURE et al., 2008).

Os mtodos mais recentes desenvolvidos para a produo de lipossomas

abordam tcnicas que utilizam altas temperaturas, liofilizao de solues

monofsicas, fluidos supercrticos e microcanais (MEURE et al., 2008). Os

processos que utilizam gs denso e fluidos supercrticos utilizam apenas uma

pequena quantidade de solvente orgnico, alm de possibilitarem a esterilizao

in situ (LESOIN et al., 2011). Todos os novos mtodos exploram tcnicas que

visam a intensificao do processo, para que sejam em uma nica etapa, atendam

s especificaes de Boas Prticas de Fabricao, eliminem a utilizao de

solventes, diminuam a complexidade e o tempo de produo (MEURE et al.,

2008). Apesar de alguns serem passveis de escalonamento, nenhum desses

mtodos opera em regime contnuo, exceto a produo de lipossomas em

microcanais a baixa presso.

Em geral, os mtodos para produo de nanopartculas podem ser divididos

em duas abordagens: top-down e bottom up. A abordagem top-down a forma

mais usada de obteno de nanopartculas. Primeiramente, as partculas so

obtidas em grande tamanho, e com a aplicao de foras de alta energia, o

tamanho reduzido para escalas nanomtricas. Na abordagem bottom up, as


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nanopartculas so formadas diretamente no tamanho desejado, pela auto-

organizao das molculas (TREVISAN, 2010).

A busca por processos que forneam lipossomas com tamanhos menores e

com menor polidispersidade vem da necessidade de melhorar a aparncia

macroscpica da preparao e sua possvel esterilizao, e melhorar a

estabilidade fsica em termos de sedimentao e flotao. Adicionalmente, quanto

menor o tamanho dos lipossomas, o processo de remoo da corrente sangunea

prolongado, elevando o tempo de circulao na corrente sangunea, viabilizando

aplicaes intravenosas (TORCHILIN & WEISSIG, 2007).

Alm disso, para aplicaes dos lipossomas catinicos em transfeces in

vitro, o tamanho e a polidispersidade da disperso fundamental para garantir a

condio ideal para a entrada dos complexos lipossomas-DNA nas clulas. Umaalternativa promissora para o controle do tamanho a rea de microfludica.

2. Microfludica

Microfludica um campo multidisciplinar que estuda fluidos em volumes

milhares de vezes menores que uma gota (10-9 a 10-18 litros). Alm de pequenas

dimenses e quantidade de fluidos, a microfludica explora caractersticas

hidrodinmicas para organizar no espao e no tempo fluxos de fluidos como

reagentes qumicos, clulas, lipdios, cidos nuclicos (DRAGHICIU et al., 2010;

BAEK et al., 2011; YAMASHITA et al., 2011; REINER et al., 2010; KURITA et al.,

2010). Esta cincia est entre as reas que mais tm crescido na pesquisa

cientfica e no desenvolvimento tecnolgico (LI, 2008).

Os dispositivos micromtricos projetados para realizar tarefas especficas

tm demonstrado superioridade sobre seus anlogos em macroescala (LUTZ,

2002). As especificidades destes sistemas conferem diversas vantagens em

relao aos sistemas fludicos convencionais: tamanho mnimo de dispositivos;

menor consumo de amostra e reagente; controle preciso de fenmenos de

transferncia trmico e mssico; escoamento estritamente laminar; reaes muito

mais rpidas; baixo consumo e dissipao de energia; baixo custo relativo de

produo por dispositivo.


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Captulo 2

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A estratgia de aumento de produo (scale-up) se d de forma diferente

dos processos fludicos, uma vez que estes ltimos requerem aumento do

tamanho dos equipamentos e das vazes de processo. O aumento de produo

dos processos microfludicos ocorre em termos de amplificao de processos, isto

, os dispositivos no so alterados em suas dimenses, mas sim, montados em

paralelo de forma a se elevar a produo por rplica. Assim, os dispositivos so

portteis, possuem elevada superfcie de contato entre os fluidos em relao ao

volume e possibilitam a fcil amplificao da produo, utilizando sistemas em

paralelo e, em algumas vezes, at mesmo dispositivos descartveis (JAHN et al.,

2010; LUTZ et al., 2002; TERRAY et al., 2002; SEKHON et al., 2010; TIAN et al.,

2009).

Uma nova perspectiva que tem recebido muita ateno na engenhariaqumica moderna, que concerne a inovaes que reduzem o tamanho da planta e

consumo de energia em vrias ordens de grandeza para um determinado objetivo,

a Intensificao de Processo. Esta perspectiva consiste no desenvolvimento de

novas tecnologias que tragam melhorias na produo e processamento, reduzindo

substancialmente a produo de resduos e a razo tamanho de equipamento/

capacidade de produo, que sejam mais eficientes energeticamente, resultando

em tecnologias sustentveis mais baratas (STANKIEWICZ et al., 2000 e 2009;

SPOORTHI et al., 2010). Neste contexto, a microfludica se apresenta como uma

forma de alcanar a intensificao de processo, integrando em uma nica etapa

determinados processos e etapas subsequentes de produo, alm de minimizar

efeitos de transferncia de calor e massa, pela prpria dimenso dos dispositivos.

As tcnicas utilizadas para a fabricao dos dispositivos dependem do

material a ser empregado, que deve se adequar a aplicao preterida de acordo

com as caractersticas fsicas e qumicas desse material. A utilizao de vidro e

polmeros para a produo de microdispositivos amplamente utilizada, pois tais

materiais unem boas propriedades qumicas e fsicas a baixo custo, alm de

permitirem a fcil estruturao do sistema que constituem o dispositivo, isto ,

canais, orifcios, colunas, bombas, vlvulas etc (LI et al., 2010; BECKER et al.,

2001). Atualmente, diversas tecnologias para a fabricao de dispositivos


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microfludicos so empregadas: impresso e estampagem a quente, moldagem

por injeo, litografia macia, fotoablao a laser, litografia de raio-x, dentre outros

(BECKER, 2001).

As aplicaes da microfludica na biotecnologia so uma interessante rea

que comeou a revolucionar a forma como pesquisadores estudam e manipulam

macromolculas (BELTHIER, 2006). Os avanos na microfabricao permitem

que tais sistemas operem com diversos biomateriais com investigaes nas

diversas reas desde o desenvolvimento de biorreatores, processos de separao

e tambm para a obteno de nanopartculas para diversas aplicaes

(BETTINGER, 2010).

A obteno de nanopartculas em microcanais uma das aplicaes que

tem se mostrado uma alternativa promissora para superar obstculos existentesnos mtodos convencionais de produo, como o controle da polidispersidade, do

tamanho de partcula e do potencial zeta. Devido flexibilidade desses

dispositivos para operar com uma variedade de diferentes materiais, vrios tipos

de nanopartculas obtidas por sntese, formao ou auto-agregao em

microcanais so reportadas na literatura, como niosomas, emulses, nanocristais,

partculas de PLGA e lipossomas (LO et al., 2010; PERRO et al., 2010; ZHAO et

al., 2010; SHAN et al., 2003).

3. Produo de Lipossomas em Microcanais

O escoamento em multicanais que utilizam os princpios da microfludica

vm sendo uma das alternativas mais estudadas para a produo de lipossomas

pr-formados produzidos sem a necessidade de etapas subsequentes ao

processo para reduo do tamanho e da polidispersidade, alm de operarem em

regime contnuo (JAHN et al., 2003 e 2007). Esta uma abordagem bottom up,

pois visa produo dos lipossomas j no tamanho e polidispersidade

apropriados para a aplicao biolgica.

A formao dos lipossomas nos microcanais que utilizam o princpio da

focalizao hidrodinmica ocorre atravs do contato de duas fases de fluidos

solveis entre si, uma aquosa e outra orgnica. A fase orgnica aquela na qual


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os lipdeos esto dispersos em um solvente, como etanol ou isopropanol. Dessa

forma, ocorre a difuso entre essas fases. Conforme ocorre essa difuso na

interface entre as fases, os lipdeos se tornam cada vez menos solveis no meio

aquoso, e comeam a se agregar, formando discos de bicamadas lipdicas

planares. medida que essas bicamadas lipdicas planares crescem, elas

comeam a se ligar a fim de diminuir a rea superficial das cadeias hidrofbicas

dos lipdeos expostas pelas extremidades ao meio aquoso. Dessa forma, os

discos se fecham em vesculas esfricas com uma bicamada separando um meio

aquoso no cerne do meio externo (ZOOK et al., 2010).

Figura 1. (A) Ilustrao da construo do filme lipdico. gua, leo com lipdios e guaso seqencialmente injetados no canal principal do dispositivo microfludico, que contm

microcmaras em sua parede. (B) Bombas pneumticas so acionadas formandovesculas lipdicas, que saem pelo canal principal (fonte: KURAKAZU et al., 2010).

Dentre os trabalhos que focam a formao de lipossomas em dispositivos

microfludicos, Kurakazu et al. (2010) estudaram a formao de lipossomas

gigantes utilizando um sistema microfludico de juno T com vlvulas

pneumticas. A operao do aparato se dava com a passagem sequencial de

gua, soluo de leo contendo os lipdios e gua novamente, por um canal commicrocmaras distribudas ao longo de sua parede, como mostra a Figura 1A. A

gua da primeira passagem preenchia as microcmaras, que posteriormente eram

seladas com a membrana de bicamada lipdica formada na interface dos lquidos.

Vlvulas pneumticas empurravam a gua de dentro das cmaras para fora,


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fazendo com que os lipossomas fossem formados encapsulando a gua da

primeira passagem (Figura 1B). Com esse sistema, factvel a produo de

lipossomas monodispersos e unilamelares de forma contnua. Um dispositivo com

operao similar, foi elaborado por Ota et al. (2009), que formaram lipossomas de

tamanho de dimetro entre 18 e 31 m. Os lipossomas eram formados

encapsulando calcena, que estava em soluo na primeira fase aquosa a passar

pelo canal.

Utilizando injeo cruzada de lipdios dispersos em etanol, Wagner et al.

(2002) produziram uma populao homognea de lipossomas. Este processo,

denominado tambm de focalizao hidrodinmica, representa um melhoramento

em relao ao mtodo tradicional de injeo de etanol, em que a mistura lipdio-

etanol lentamente injetada em um tanque agitado contendo soluo aquosatamponada. O processo de injeo cruzada mostrou maior facilidade de controle

do tamanho das partculas, sendo mais reprodutvel que o processo convencional.

As partculas geradas apresentaram dimetros na faixa de 200 a 500nm.

Figura 2. (A) Diagrama esquemtico do processo de formao de lipossomas em canalmicrofludico. A relao de cores representa as razes de concentrao de lcool

isoproplico e tampo aquoso. (B) Mapa 3-D de intensidade de fluorescncia duranteformao de lipossomas (adaptado de JAHN et al., 2004).

Jahn et al. (2004 e 2007) descreveram a formao de lipossomas em uma

rede de microcanais, conforme ilustrado na Figura 2. Os lipossomas foram

formados por um processo controlado pela difusividade, quando uma corrente de

lipdios dispersos em solvente orgnico hidrodinmicamente comprimido por

duas correntes aquosas tamponadas. Os lipossomas formados apresentaram


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tamanhos de 50 a 150nm, com distribuio de tamanhos menor e maior

reprodutibilidade quando comparados aos produzidos pelo processo convencional

de injeo de etanol (bulk). Este processo sensvel geometria do canal e

razo entre as vazes volumtricas de lcool e gua, sendo essa ltima razo, a

varivel controladora do processo. A formao dos lipossomas foi tambm mais

fortemente dependente da corrente de solvente orgnico e da sua difusividade na

corrente aquosa, do que das foras de cisalhamento na interface solvente-soluo

tampo.

Utilizando um dispositivo microfludico imerso em um banho de ultra-som,

Huang et al. (2010) obtiveram lipossomas monodispersos com tamanho mdio de

partcula entre 50 e 150 nm. Com a sonicao, o tamanho de partcula foi reduzido

significativamente quando comparado com os lipossomas produzidos semsonicao. Segudno os autores, isso se deve provavelmente ao fato de que, com

o processo de sonicao, pode haver cavitao no sistema, melhorando a

disperso das molculas de lipdio e consequentemente, reduzindo o tamanho dos

lipossomas. Os autores tambm observaram que o tamanho dos lipossomas

obtidos nos microcanais diminui com o aumento da razo entre as taxas de fluxo

aquosa e alcolica/lipdica (do ingls, Flow Rate Ratio FRR). O aumento de FRR

promove a formao de lipossomas em concentrao lipdica menor.

Trevisan et al. (2011), empregando a mesma composio lipdica do

presente trabalho, produziu lipossomas catinicos em altas concentraes em

dispositivos microfludicos de vidro. A concentrao lipdica da disperso etanlica

utilizada foi muito acima quelas reportadas na literatura, variando entre 100 e 400

mM. Entretanto, provavelmente devido s altas concentraes empregadas no se

adequarem a produo de LC em sistemas microfludicos, os lipossomas obtidos

no apresentaram bom controle de tamanho e polidispersidade.

A produo de niossomas tambm factvel em microcanais (LO et al.,

2010). Niossomas so e so formadas pela auto-agregao de tensoativos no-

inicos. Os niosomas so comumente usados como transportadores de agentes

de tratamento para aplicaes farmacuticas e cosmticas. Comparada com o

mtodo tradicional, a produo em microcanais se mostrou mais eficiente tanto no


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controle do tamanho das partculas, quanto na sua polidispersidade. Pelo fato dos

sistemas microfludicos apresentarem uma mistura rpida e controlada dos dois

fluidos miscveis (lcool e gua) foi possvel a obteno de niossomas com

distribuio de tamanho 40% menor em comparao com o mtodo tradicional,

sugerindo a factibilidade do desenvolvimento e otimizao de sistemas coloidais

em dispositivos microfluidicos para a aplicao em nanomedicina.

4. Sistemas Microfludicos para a complexao eletrosttica entrelipossomas catinicos e DNA

A formao de vetores no virais depende do empacotamento apropriado

do DNA em sua estrutura. As interaes eletrostticas entre os lipdeos catinicos

e o DNA produzem estruturas auto-agregadas em partculas de tamanho emorfologia diversas (MANNISTO et al., 2002 e OBERLE et al., 2000), que

dependem de fatores tais como a razo molar de cargas positivas/negativas, fora

inica do tampo, ordem de mistura, condies de reaes, tipo de lipdeo

(TORRE, 2006, MOUNT et al., 2003 e ZELPHATI et al., 1998).

A variao dos resultados de transfeco reflete muitas vezes a dificuldade

de controle do processo de auto-agregao e tem como consequncia a produo

de partculas de elevado grau de polidispersidade, levando a formao grandes

fraes das populaes fora da faixa de tamanho correta para a transfeco da

clula alvo do estudo (HSIEH et al., 2009). Vrios autores reportaram que o

tamanho dos complexos lipossoma-DNA um parmetro que influencia

diretamente a transfeco gnica (MA et al., 2007, REJMAN et al., 2004,

WIEWRODT et al. 2002, ROSS & HUI, 1999, OGRIS et al., 1998). Neste contexto,

o desenvolvimento de processos que promovam o controle da complexao

eletrosttica entre os lipossomas catinicos e o DNA, que permitam a formao de

partculas uniformes e de forma reprodutiva, resultar consequentemente emtransfeces uniformes. Estes resultados so fundamentais para o

desenvolvimento de produtos farmacuticos que veiculam tanto DNA como

tambm RNA.


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Uma abordagem recente no estudo do controle do tamanho destas

partculas a utilizao de processos microfludicos. Estes sistemas permitem e

realizao da complexao eletrosttica em fluxo contnuo, com o controle do

cisalhamento e das condies difusionais, permitindo a orientao de

macromolculas. O mtodo da focalizao hidrodinmica tambm tm sido

utilizado em estudos de complexao eletrosttica entre DNA e lipossomas

catinicos (OTTEN et al., 2005; JELLEMA et al., 2010), dendrmeros (DOOTZ et

al, 2006) e polietilenoimina (KOH et al., 2009), bem como lipossomas catinicos e

RNA, visando a caracterizao fsico-qumica destas partculas.

Adicionalmente, a focalizao hidrodinmica leva a formao de estruturas mais

organizadas. O regime de escoamento laminar tambm permite que a

compactao do DNA seja controlada pelo processo difusional, contribuindo paraa maior organizao estrutural (DOOTZ et al., 2006). Este processo permite que

agregados formados em microcanais sejam mais compactos, porm dependentes

principalmente das velocidades superficiais dos fluidos (DOOTZ et al., 2006).

Figura 3: Representao esquemtica do sistema microfludico de focalizao

hidrodinmica para a formao do sistema auto-agregado lipossoma catinico-DNA(Fonte: KOH et al. 2005).

Otten et al. (2005) elaboraram um aparato microfludico, baseado na

focalizao hidrodinmica, conforme apresentado na Figura 3, objetivando a

investigao do comportamento dinmico na formao de complexos lipossoma


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CAPTULO 3CORRELATION BETWEEN PHYSICOCHEMICAL AND

STRUCTURAL PROPERTIES WITH INVITROTRANSFECTION OFPDNA/CATIONIC LIPOSOMES COMPLEXES

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Tiago A. Balbino1, Antnio Gasperini2, Cristiano L. P. Oliveira3, Leide P. Cavalcati2,

Adriano R. Azzoni1,3, Lucimara G. de La Torre1*1University of Campinas, Brazil;2Synchrotron Light National Lab, Brazil;

3University of So Paulo, Brazil.

*Corresponding author:[email protected]

Accepted for publication in Langmui r.

Abstract

In this study, we characterized the conventional physicochemical properties of the

complexes formed by pDNA (pDNA) and cationic liposomes (CL) composed of egg

phosphatidylcholine (EPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)

and 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) (50/25/25% molar ratio). We

found that these properties are nearly unaffected at the studied ranges when the molar

charge ratio (R+/-) between the positive charge from the CL and negative charge from

pDNA is not close to the isoneutrality region (R+/-=1). However, the results from in vitro

transfection of HeLa cells showed important differences when R+/- is varied, indicating

that the relationships between the physicochemical and biological characteristics were

not completely elucidated. To obtain information regarding possible liposome structural

modifications, small angle x-ray scattering (SAXS) experiments were performed as a

function of R+/- to obtain correlations between structural, physicochemical and

transfection properties. The SAXS results revealed that pDNA/CL complexes can be

described as being composed of single bilayers, double bilayers and multiple bilayers,

depending on the R+/- value. Interestingly, for R+/-=9, 6 and 3, the system is composed of
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single and double bilayers, and the fraction of the latter increases with the amount of

DNA (or a decreasing R+/-) in the system. This information is used to explain the

transfection differences observed at an R+/-=9 compared to R+/-=3 and 6. Close to the

isoneutrality region (R+/-=1.8), there was an excess of pDNA, which induced theformation of a fraction of aggregates with multiple bilayers. These aggregates likely

provide additional resistance against the release of pDNA during the transfection

phenomenon, reflected as a decrease in the transfection level. In conclusion, the

dissertação_tiago albertini balbino

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