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UNIVERSIDADE VILA VELHA - ES

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL

EFEITOS DA INFUSO DE CLULAS TRONCO MESENQUIMAIS

SOBRE A CICATRIZAO DE FERIDAS CUTNEAS EM RATOS

WISTAR IMUNOSSUPRIMIDOS COM DEXAMETASONA

ROBERTA DELESSA FARIA

VILA VELHA

SETEMBRO / 2013

UNIVERSIDADE VILA VELHA - ES

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL

EFEITOS DA INFUSO DE CLULAS TRONCO MESENQUIMAIS SOBRE A CICATRIZAO DE FERIDAS CUTNEAS EM RATOS


Dissertao apresentada Universidade Vila Velha, como pr-requisito do Programa de Ps-Graduao em Cincia Animal, para obteno do grau de Mestre em Cincia Animal.


VILA VELHA

SETEMBRO / 2013

iv


EFEITOS DA INFUSO DE CLULAS TRONCO MESENQUIMAIS

SOBRE A CICATRIZAO DE FERIDAS CUTNEAS EM RATOS


Dissertao apresentada Universidade Vila Velha, como pr-requisito do Programa de Ps-Graduao em Cincia Animal, para obteno do grau de Mestre em Cincia Animal.

Aprovada em 24 de setembro de 2013 .

v

DEDICATRIA:

Dedico este trabalho ao meu pai, Derli da Silva Faria, por me tornar a cada dia

uma pessoa melhor, onde mesmo diante das dificuldades e obstculos, nunca

deixou de acredita em mim, e me apoiou do incio ao fim dessa jornada, pelo

amor incondicional de PAI que ele dedica e sempre dedicou a mim.

vi

AGRADECIMENTOS

Fundao de Amparo Pesquisa do Esprito Santo (FAPES) pela concesso da

bolsa que viabilizou meus estudos, dedicao e ao apoio financeiro ao projeto.

Universidade Vila Velha que proporcionou todo apoio na logstica e execuo do

projeto de pesquisa.

minha orientadora Betnia Souza Monteiro, por toda pacincia e dedicao

durante todo esse processo.

todos os professores do programa de Mestrado em Cincia Animal, que

contriburam para a minha formao.

Ao colega Mrio Srgio Wanzeller, do Laboratrio de Acompanhamento

Experimental da UVV, pela ajuda, amizade e companhia agradvel durante todo o

meu projeto.

s colegas, Noely Godoi Pianca e Emanuelle Pimentel Cruz que me ajudaram

durante a realizao do meu projeto. Muito obrigada meninas!!!

minha amiga Alessandra, pela parceria de todas as horas, pelo companheirismo e

pacincia nos momentos compartilhados de alegrias, tristezas e dificuldades nesse

longo percurso.

aos meus pais que so minha base, meu alicerce, meu amor maior, que me

tornaram a pessoa que hoje sou, tornando assim possvel a realizao deste

mestrado.

toda minha famlia (pais, irmo, tias, tios, primos e primas), pelo constante apoio

sem o qual o que hoje sou no seria possvel.

vii

Aos meus grandes e valiosos amigos e amigas Evelyn Baptista de Bortoli, Soraya de

Figueiredo Handere, Raphaela Haddad Tpias Bissoli e Fbio Macedo Pimentel, por

entenderem minha ausncia e por torcerem sempre por mim.

Ao meu querido, amado e saudoso av Ansio Gomes Dilessa in memoriam que

mesmo estando longe, sei que est sempre ao meu lado. Que com a pouca

educao que teve criou e educou filhos e netos brilhantemente, que me ensinou a

sempre respeitar ao prximo,a ser humilde, a fazer o bem sem olhar a quem, e a

amar os animais. Vov, muito obrigada por ter sido sempre muito presente na minha

vida, a saudade imensa!

Aos amigos do SHOP CO que sempre me apoiaram e souberam entender a minha

ausncia.

Ao colega Wagner Fiorio pelos ensinamentos de patologia neste projeto.

Ao colega e professor, Dominik Lenz por estar sempre disposto e pronto para ajudar.

Mnica de Alvarenga Feij Bianchi, que desde a minha graduao sempre me

incentivou, sendo um exemplo incomparvel de sabedoria, inteligncia,

profissionalismo e amor aos animais, ela em quem me espelho quando eu crescer

quero ser igual a voc.

Ao Bud in memoriam, meu amigo de quatro patas, cachorro mais extraordinrio

que conheci, ele se doava inteiramente a qualquer pessoa que demonstrasse

carinho a ele. Animal pelo qual eu busquei estudar mais, mais infelizmente no deu

tempo de salv-lo. Bud muito obrigada!!!

As minhas meninas Miryth, Mini e Lua, pelas quais eu tenho um amor

incondicional.

E tambm no poderia deixar de agradecer aos animais que tornaram esse projeto

possvel, que Deus abenoe todas as criaturas.

Os meus mais sinceros agradecimentos.

viii

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS viii

LISTA DE TABELAS x

LISTA DE ABREVIATURAS xi

RESUMO xiii

ABSTRACT xiv

1 INTRODUO 01

2 - REVISO DE LITERATURA 03

2.1 Corticoides 03

2.2 Anatomia e fisiologia da pele 07

2.3 Cicatrizao cutnea 08

2.3.1 - Coagulao 09

2.3.2 Inflamao 10

2.3.3 Proliferao 11

2.3.4 Contrao da ferida 12

2.3.5 Remodelao 12

2.3.6 Consideraes sobre o colgeno 14

2.4 Clulas tronco mesenquimal 14

3 OBJETIVOS 18

4 - MATERIAL E MTODOS 19

4.1- Isolamento, caracterizao e expanso de CTM 20

4.2- Procedimentos anestsicos, cirrgicos e tratamentos 22

4.3- Plano cirrgico 23

4.4- Tratamento 25

4.5- Avaliao clnica 27

4.6- Bipsias e procedimentos histolgicos 28

4.7 - Avaliaes estatsticas 30

5 RESULTADOS 30

ix

5.1- Cultura celular 30

5.2- Alteraes clnicas 33

5.3- Alterao macroscpica 34

5.4- Alterao histopatolgica 37

5.4.1 Material coletado dos animais eutanasiados 3 dias aps

a realizao da ferida cirrgica do GC 37


a realizao da ferida cirrgica do GD 38


a realizao da ferida cirrgica do GDCTM 40


a realizao da ferida cirrgica do GD 41


a realizao da ferida cirrgica do GDCTM 42

5.4.6 Material coletado dos animais eutanasiados 15 dias

aps a realizao da ferida cirrgica do GC 42


aps a realizao da ferida cirrgica do GD 43


aps a realizao da ferida cirrgica do GDCTM 43

5.4.9 - Cellprofiler 43

6 DISCUSSO 47

7 CONCLUSO 51

8 REFERNCIAS 52

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura da Pele e seus anexos. 08

Figura 2: Fases da cicatrizao correlacionadas com a especificidade imune-celular.

13

Figura 3: Animal do grupo GC recebendo anestesia geral por via IM. 23

Figura 4: Animal tricotomizado (A); rea padronizada demarcada na pele

com tinta de carimbo (B); rea padronizada demarcada na pele com tinta

de carimbo j com campo operatrio (C); Ferida cirrgica sem fixao de

bordas (D).

24

Figura 5 Organograma ilustrando os animais do experimento e como

os mesmos foram divididos nos grupos de tratamento recebido.

26

Figura 6: Fotos ilustrativas dos animais recendo infuso de CTM 48

horas aps a criao da ferida cirrgica.

26

Figura 7: Imagem ilustrativa da mensurao da ARL nos dias 1, 5 e 10

aps a criao da ferida cirrgica, atravs do programa Image Pro Plus, no qual os traos em amarelo demonstram o contorno da rea da ferida.

27

Figura 8: Animais eutanasiados aos 3 (A), 7 (B) e 15 (C) dias

respectivamente, aps a criao da ferida cirrgica. Em destaque ,(retngulo) a rea de tecido coletada envolvendo a ferida cirrgica e a pele intacta, que foi encaminhada histopatologia.

Figura 9: Avaliao da frequncia de CD 34, CD 45, CD 90 e CD 54 por citometria de fluxo em clulas tronco mesenquimais (CTM) oriundas da medula ssea de ratos Wistar. A intensidade de fluorescncia de cada marcador de superfcie nas CTM indiferenciadas (grficos brancos ou abertos) esta comparada com os isotipos controle (grfico preto). O eixo X representa a escala de fluorescncia, sendo positivo quando as clulas ultrapassam 10 de clulas avaliadas durante o evento. A) Grfico de pontos demonstrando a populao celular selecionada para o estudo (R1), que representou 43% de homogeneidade. As amostras da cultura revelaram expresso negativa para 96,53% de CD34 (B) e 93,89% de CD45 (C) e expresso positiva para 99,0% de CD90 (D) e 95,8% de CD 54 (E).

29

32

Figura 10: Animais apresentando secreo ocular escura (A e B); reas

de hipotricose (C e D).

33

Figura 11 Fotos dos animais dos grupos GC, GD e GDCTM nos dias 1, 5, 10 e 15 aps a criao da ferida cirrgica.

34

xi

Figura 12 Demonstrao grfica dos valores das mdias das repeties para ARL dos grupos do experimento; GC em azul, GD em vermelho e GDCTM em verde. O eixo Y do grfico representa o valor de ARL em cm, enquanto o eixo X representa as repeties DIA 0; DIA 1; DIA 3; DIA 5; DIA 10; DIA 12 e DIA 15.

35

Figura 13 Demonstrao grfica ilustrando o TEC dos grupos: GC em azul; GD em vermelho e GDCTM em verde. No eixo Y representa o valor de TEC em dias, enquanto o eixo X representa os animais (1, 2, 3 e 4) avaliados para TEC.

36

Figura 14 Neovascularizao indicada com setas vermelhas (A); Demarcao da deposio do colgeno de forma mais discreta na rea circulada e neovascularizao indicada pela seta preta (B)

38

Figura 15 Neovascularizao indicada com a seta vermelha (A); Borda da Ferida marcada com as setas pretas (B); deposio de colgeno demarcado pelas reas circulares e neovascularizao indicada com a seta lils (C e D).

40

Figura 16 Vasodilatao indicadas pelas setas pretas (A); Evidenciao e maior nmero de fibras colgenas recm formadas destacada na rea circular (B).

41

Figura 17 Fibras colgenas menos evidentes em animal eutanasiado 7 dias aps leso do GD (A); Fibras colgenas mais espessas, logo mais evidentes em animal eutanasiado 7 dias aps leso do GDCTM.

42

Figura 18 Imagem histopatolgica original contendo fibras colgenas (A); Imagem histopatolgica em preto e branco (B); Imagem corada em verde e vermelho, onde a colorao verde demarca as fibras colgenas (C).

45

Figura 19 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GC nos dias 3 e 15 aps leso.

45

Figura 20 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GD nos dias 3, 7 e 15 aps leso.

46

Figura 21 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GC nos dias 3, 7 e 15 aps leso.

46

xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Apresenta a mdia em centmetros da rea da leso (ARL) dos animais dos grupos do experimento nos dias 1, 3, 5, 10, 12 e 15 aps a criao da ferida.

35

Tabela 2: Mdias dos valores encontrados para a varivel TEC em ratos wistar submetidos aos tratamentos com imunossupresso com dexametasona (GD), com soluo fisiolgica (GC), e Imunossupresso por dexametasona com transplante de clulas-tronco mesenquimais (GDCTM)

36

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS

CTM = Clulas tronco mesenquimais

MO = Medula ssea

SID = Uma vez ao dia

PBS = Tampo de fosfato salina

PSA = Penicilina, estreptomicina, anfotericina B

pH = Potencial hidrogeninico

DMEM = Dulbeccoss modified eagle medium

SFB = Soro fetal bovino

C = Graus celsius

CO2 = Dixido de carbono

HE = Hematoxilina e eosina

ACTH = Hormnio adrenocorticotrpico

CRH= Hormnio liberador de corticotropina

mg= Miligrama

Kg= Quilograma

ADH= Hormnio antidiurtico

TNF= Fator de necrose tumoral

PDGF= Fator de crescimento derivado de plaqueta

CTS= Clulas tronco somticas

EGF= Fator de crescimento vascular

CTGF= Fator de crescimento do tecido conectivo

FCF= Fator de crescimento fibroblstico

ICF= Fator de crescimento insulnico

EPGF= Fator de crescimento epidermal

IM= Intramuscular

IV= Intravenosa

SC= Subcutnea

FC= Frequncia cardaca

FR= Frequncia respiratria

xiv

TR= Temperatura retal

FAPES= Fundao de apoio a pesquisa do Esprito Santo

UVV= Universidade Vila Velha

UFV= Universidade federal de Viosa

UFMG= Universidade federal de Minas Gerais

g= Gramas

ml= Mililitro

mm = Milmetro

mm2= Milmetro quadrado

GC = Grupo controle

GD= Grupo dexametasona

GDCTM= Grupo dexametasona clula tronco mesenquimais

ARL= rea da leso

TEC= Tempo de cicatrizao

FIC= Fibras colgenas

ANOVA= Anlise de varincia

xv

RESUMO

FARIA, Roberta Delessa, MSc., Universidade Vila Velha ES, setembro de 2013.

Efeitos da infuso de clulas tronco mesequimais sobre a cicatrizao de

feridas cutneas em ratos Wistar imunossuprimidos com dexametasona.

Orientadora: Betnia Souza Monteiro.

A cicatrizao ocorre de forma dinmica, restaurando o tecido lesionado ou substituindo-o

por colgeno. Os corticoides interferem em todas as fases da cicatrizao, a dexametasona

um glicocorticoide que possui atividade anti-inflamatria e imunossupressora elevada.

Com o uso cada vez mais frequente desses frmacos na clnica veterinria e

subsequentemente seus prejuzos, surge a possibilidade promissora da terapia com clulas

tronco mesenquimais (CTM). As CTM so capazes de promover a manuteno e

regenerao de mltiplas linhagens de clulas do organismo. Inmeros estudos veem sido

realizados testando a regenerao de leses teciduais atravs do uso destas clulas. As

CTM podem ser administradas no local da leso ou por infuso intravenosa, e so atradas

por quimiotaxia para os locais de leso. O presente trabalho visa analisar a resposta do

processo cutneo mediante o uso de CTM, que sero administradas por via intravenosa, em

feridas cirrgicas de ratos da linhagem Wistar medicados prviamente com corticosteroides

por 30 dias. Este experimento constituiu-se com 3 grupos: grupo controle (GC), onde os

animais receberam 0,2ml de NaCl 0,9% SC/SID durante 30 dias, e uma nica aplicao de

0,5ml de NaCl 0,9% IV 48 horas aps a cirurgia; grupo dexametasona (GD) cujos animais

receberam aplicaes de corticoide durante 30 dias e aps esse tempo foi realizada a ferida

cirurgia, e o grupo dexametasona CTM (GDCTM) cujos animais receberam corticoide da

mesma forma ao grupo anterior, no entanto, foram tratados com CTM 48 horas aps a

realizao da ferida cirrgica. As feridas cirrgicas dos animais do GC fecharam em mdia

14,75 dias aps a realizao da leso, os animais do GD tiveram suas feridas cirrgicas

fechadas em at 22 dias, j as feridas cirrgicas dos animais do GDCTM foram fechadas em

14 dias. Verificou-se que os animais imunossuprimidos com dexametasona (GD) tiveram um

processo de cicatrizao em mdia com 8 dias a mais, quando comparados aos demais

grupos e o tempo de cicatrizao do GC e GDCTM apresentaram-se muito prximo e a

escolha pela infuso por via intravenosa foi efetiva para ao das clulas no local da leso.

Palavras-Chave: Reparao tecidual, corticoide, clulas-tronco.

xvi

ABSTRACT

FARIA, Roberta Delessa, MSc, University Vila Velha -. ES, September 2013. Effects

of infusion of mesenchymal stem cells on the healing of skin wounds in rats

immunosuppressed with dexamethasone. Adviser: Betnia Souza Monteiro.

Healing occurs dynamically, restoring damaged tissue and replacing it with collagen.

Corticosteroids interfere at all stages of healing, Dexamethasone is a glucocorticoid

that possess anti-inflammatory and high immunosuppressive activity. With the

frequent use of these drugs in veterinary clinic and subsequently its losses, the

promising possibility of therapy with mesenchymal stem cells (MSCs) arises. MSCs

are capable of maintaining and promoting the regeneration of multiple lineages of

cells in the organisms. Numerous studies have been conducted testing the

regeneration of tissue injury through the use of these cells. MSCs can be

administered at the site of injury or by intravenous infusion, and are attracted by

chemotaxis to sites of injury. This study aims to analyze the response of the

cutaneous process through the use of MSC, which will be administered intravenously

in surgical wounds in Wistar rats previously treated with corticosteroids for 30 days.

This experiment consisted with 3 groups: control group (CG), where the animals

received 0.2 ml of 0.9% NaCl SC / SID for 30 days and a single application of 0.5 ml

of 0.9% NaCl IV 48 hours after surgery; dexamethasone group (GD) whose animals

received corticosteroid applications for 30 days and after the wound was performed,

and the dexamethasone group (GDCTM) whose animals received similarly to the

previous group corticosteroids, were treated with MSC However 48 hours after the

completion of the surgical wound . The surgical wounds of animals GC closed on

average of 14.75 days after the completion of the lesion, the animals of GD had their

surgical wounds closed within 22 days, since the surgical wounds of animals GDCTM

were closed in 14 days. It was observed that immunosuppressed animals with

dexamethasone (GD) had a 8 days of average healing process when compared with

the other groups and the healing time of GC and GDCTM presented numbers in

close proximity, the choice by infusion via intravenously was effective for the action

of cells at the injury site.

Key words: Tissue Repair, corticosteroids, stem cells

1

1- INTRODUO

Desde os primrdios da humanidade, o homem sempre tm buscado alternativas

para o tratamento de suas feridas cutneas. Diversos produtos, medicamentos e

terapias vm sendo empregados ao longo dos sculos com o objetivo de melhorar e

acelerar a reparao cicatricial (CAMPOS, et al.,2007; DEALEY, 2008). Atualmente,

muito se tem investido em pesquisas na compreenso dos fenmenos e processos

envolvidos nas fases da reparao dos tecidos e, principalmente, no

desenvolvimento de novos recursos e tecnologias objetivando impulsionar avanos

no tratamento de feridas (GARCEZ, 2012).

O processo cicatricial comum a todas as feridas, independentemente do agente

causador, sistmico e dinmico e est diretamente relacionado s condies

gerais do organismo. A cicatrizao de feridas consiste em perfeita e coordenada

cascata de eventos celulares, moleculares e bioqumicos que interagem para que

ocorra a reconstituio tecidual (MANDELBAUM, et al., 2003; CAMPOS, et al.,2007).

A cicatrizao o processo biolgico que restaura a continuidade do tecido aps

uma leso. Consiste em uma combinao de eventos fsicos, qumicos e celulares

que restaura um tecido lesionado ou o substitui por colgeno. As fases da

cicatrizao ocorrem simultaneamente, uma vez que a cicatrizao dinmica. A

cicatrizao influenciada por fatores do hospedeiro, caractersticas da ferida e

outros fatores externos (MANDELBAUM et al., 2003). Alguns medicamentos

retardam o processo de cicatrizao, tais como os corticoides, estes deprimem todas

as fases da cicatrizao e aumentam as chances de infeco (CAMPOS et al.,

2007). Os glicocorticoides so capazes de bloquear desde as manifestaes mais

precoces do processo inflamatrio como dor, calor e rubor at as mais tardias como

2

reparao e proliferao tecidual alm de apresentarem atividade imunossupressora

(SPINOSA, 1999).

Acredita-se que os glicocorticoides prejudicam a cicatrizao, diminuindo a

proliferao celular na neovascularizao e da produo de matriz celular. Em

animais foi relatado retardo do afluxo de macrfagos, neutrfilos e fibroblastos.

Adimite-se que os corticoides suprimam a fase inflamatria da cicatrizao, visto que

seu uso crnico possa influenciar a reepitelizao, a neovascularizao e a sntese

do colgeno (AGUILAR-NASCIMENTO et al., 2000; TENIUS et al., 2007). A

dexametasona um glicocorticoide sinttico extremamente potente e de longa

durao, isto porque, possui uma ligao reduzida com protenas plasmticas,

menor velocidade de excreo e maior afinidade com receptores. Tendo portanto,

sua atividade anti-inflamatria e imunossupressora ampliadas (TENIUS et al., 2007;

SPINOSA et al., 2011). Na tentativa de minimizar os prejuzos decorrentes da

administrao contnua de agentes anti-inflamatrios esteroidas, surge a perspectiva

promissora das terapias com clulas tronco mesenquimais (COLOM et al., 2008).

As clulas-tronco mesenquimais (CTM) so clulas multipotentes e com ampla

plasticidade, capazes de promover a manuteno e regenerao de mltiplas

linhagens de clulas do organismo (NAUTA & FIBBE 2007). Esse tipo celular tem

sido utilizado em numerosos estudos clnicos com a finalidade de regenerar leses

teciduais, como por exemplo, cicatrizao de feridas (KEATING, 2006). Atualmente

sabe-se que as CTM podem ser aplicadas diretamente no local da leso (intra-

lesional) isoladas ou combinadas com biomateriais (SCHWINDT et al. 2005,

OLIVEIRA et al.,2010) ou serem administradas ou por infuso intravenosa, pois so

atradas por quimiotaxia para os locais de leso (COLOM et al., 2008).

3

2-REVISO DE LITERATURA

2.1 Corticoides

As glndulas adrenais, presentes em todos os animais vertebrados so

pequenas estruturas ovaladas, bilaterais localizadas na parte anterior dos rins. Esta

consiste em dois seguimentos endcrinos primrios: um exterior, chamado crtex

adrenal, responsvel pela secreo de hormnios esteroides; e outro interno menor

denominado medula interna, responsvel pela secreo de catecolaminas,

noradrenalina e adrenalina (ENGELKING, 2010; JERIC E MARCO, 2011;

SPINOSA et al., 2011; SILVA et al., 2008 ).

O crtex adrenal subdivido em trs zonas, zona glomerulosa que mais

externa a qual produz mineralocorticoides, como principal exemplo a aldosterona

que responsvel pela manuteno do equilbrio hdrico e eletroltico; zona

fasciculada responsvel pela produo de glicocorticoides, que afetam o

metabolismo de carboidratos e protenas, apresentando atividade anti-inflamatria e

imunossupressora sendo os principais representantes a hidrocortisona (cortisol) e

corticosterona; a zona reticulada a mais interna, onde ocorre a produo de

andrgenos ou esteroides sexuais (SAMUELSON, 2007; ENGELKING, 2010;

SPINOSA et al., 2011. ).

Os corticoides so sintetizados e liberados quando necessrios no sendo

liberados na clulas adrenais (JERIC E MARCO, 2011; ROMO, 2012). O principal

regulador da atividade adrenocortical o hormnio da hipfise anterior, hormnio

adrenocorticotrfico (ACTH) ou corticotrofina. A secreo do ACTH regulada

4

parcialmente pelo hormnio liberador de corticotropina (CRH) de origem

hipotalmica sendo a secreo do CRH controlada pelas concentraes sanguneas

dos glicocorticoides (ENGELKING, 2010; JERIC E MARCO, 2011; ROMO, 2012).

Segundo Jeric e Marco (2011) o colesterol um intermedirio obrigatrio na

sntese de corticoides. Nas espcies canina e felina a produo de cortisol em um

perodo de vinte e quatro horas de cerca de 1 mg/kg. O fgado responsvel por

cerca de 70% do metabolismo dos corticoides. Em sua maioria estes compostos so

excretados por via renal, uma parte dos corticoides so adicionados bile e

excretados pela rota intestinal (PEREIRA et al., 2007 e SAMUELSON, 2007).

Os hormnios glicocorticoides so agentes hiperglicemiantes tendo seu efeito

de inibio da captao e da utilizao perifrica da glicose e promoo da

gliconeognese a partir de aminocidos e cidos graxos livres (JERIC E MARCO,

2011; CHAMUSCA, 2012). Alm destes efeitos, interferem no metabolismo proteico,

aumentando o catabolismo e diminuindo a sntese de protenas, h uma

transformao generalizada de protena muscular em aminocidos para

gliconeognese heptica (PAPICH, 2009; CHAMUSCA, 2012).

O cortisol e alguns glicocorticoides sintticos como a dexametasona, em

concentraes farmacolgicas podem apresentar alguns efeitos mineralocorticoides

promovendo a reteno de sdio, a excreo de potssio e expanso do volume

extracelular. O cortisol tambm suprime a liberao do hormnio antidiurtico (ADH)

diminuindo o efeito deste sobre os tbulos coletores, portanto poliria e polidipsia

so evidentes (SILVA et al., 2008; PAPICH, 2009; JERIC E MARCO, 2011;

SPINOSA et al., 2011).

Os glicocorticoides antagonizam as aes da insulina no metabolismo da

glicose inibindo a captao da mesma pelos tecidos, sendo assim considerados

5

agentes hiperglicemiantes como anteriormente citado, onde promovem a polifagia

(SAMUELSON, 2007; PAPICH, 2009; ROMO, 2012).

De acordo com Engelking (2010) o cortisol possui efeito inotrpico no msculo

esqueltico causando protelise muscular e consequentemente reduo da massa

muscular e da fora (principalmente fibras musculares tipo I). Este hormnio tambm

aumenta a sntese de lipase de triglicerdeos adipcitos, elevando as aes de

hormnios lipolticos e diminuindo a captao de glicose nos adipcitos reduzindo

assim a deposio de triglicerdeos, induzindo assim a redistribuio de gordura nas

reas centrpetas.

O metabolismo de clcio tambm afetado pelo uso de glicocorticoides

atravs do aumento da excreo urinria do mesmo, causado pela reabsoro renal

com consequente hipercalciria e absoro intestinal de clcio diminuda. Em

excesso, os corticoides levam portanto, a uma diminuio da formao de ossos e

aumento na reabsoro ssea (PEREIRA et al., 2007; ENGELKING, 2010).

O uso prolongado de corticoides pode levar a inibio da sntese de colgeno

e atividade de fibroblastos, produzindo adelgaamento da pele e das paredes dos

capilares (SCOTT et al., 1996; TENIUS et al.,2007; ENGELKING, 2010).

O cortisol aumenta o nmero de eritrcitos circulantes uma vez que estimula a

produo e diminui a destruio dos mesmos, aumenta tambm o nmero de

plaquetas e neutrfilos circulantes, podendo causar portanto uma leucocitose. O uso

de corticoide diminui o nmero de linfcitos, eosinfilos e basfilos circulantes quatro

a seis horas aps sua administrao por meio da redistribuio dessas clulas para

longe da periferia e no pelo aumento da sua destruio. Diminui a massa de tecido

linfoide atravs da inibio direta da mitose, sendo por isso utilizado do tratamento

de linfomas e leucemia linfoctica (PEREIRA et al., 2007). De acordo com Engelking

6

(2010) a involuo de ndulos linfticos e rgos linfticos como timo e bao, causa

diminuio da produo de anticorpos, o que pode ajudar na reduo de uma

resposta imune de um rgo transplantado.

O uso crnico de glicocorticoides pode conduzir a um estado de

hipercoagulabilidade sangunea, isto se deve em parte ao aumento de fatores pr-

coagulantes tais como II, V, VII, IX, X, XII e fibrognio, e tambm a diminuio de um

fator natural anticoagulante, a antitrombina (SCOTT et al., 1996; TENIUS et al.,2007;

ENGELKING, 2010; CHAMUSCA, 2012).

Altos nveis de cortisol inibem a fosfolipase A2 e a cicloxigenase reduzindo a

biosntese de prostaglndinas, tromboxanos e leucotrienos. A inibio da sntese de

leucotrienos atrapalha a fagocitose de neutrfilos. Ocorre a interferncia na

elaborao de histamina, logo nas aes desta sobre a mediao da resposta

inflamatria (hiperemia local e edema). O cortisol estabiliza as membranas

lisossomais reduzindo a liberao de enzimas hidrolticas aps uma leso a celular

diminuindo a reao inflamatria (PEREIRA et al., 2007; ENGELKING, 2010;

CHAMUSCA, 2012).

Embora os efeitos antinflamatrios e imunossupressores dos glicocorticoides

possam ser teis no tratamento de diversos estados patolgicos, quando os

mesmos so administrados terapeuticamente por longos perodos podem levar a um

aumento da suscetibilidade a infeces fngicas e virais, permitindo ento, a

disseminao desses microorganismos, atraso da cicatrizao de feridas, agravar os

sintomas de diabetes melito, osteoporose, distrbios neurolgicos, e levar ao

hiperadrenocorticismo iatrognico (TENIUS et al.,2007; ENGELKING, 2010;

ROMO,2012).

7

2.2 Anatomia e Fisiologia da Pele

A pele, ou tegumento, forma o revestimento e a principal barreira de proteo

do organismo, e tem como funes bsicas impedir a perda excessiva de lquidos,

proteger da ao de agentes externos, manter a temperatura corprea, agir como

rgo do sentido e participar da termorregulao (OLIVEIRA, 2010; GIANOTTI,

2011; GARCEZ, 2012).

A pele formada por duas camadas distintas, a epiderme e a derme,

firmemente unidas entre si (Figura 1). A epiderme a poro mais superficial,

continuamente renovada e organizada em camadas (basal, granulosa, espinhosa,

lcida e queratinosa), apresentando trs diferentes linhagens celulares com

caractersticas e funes diferentes. Os queratincitos, so as clulas mais

abundantes e importantes da epiderme. Os melancitos, que so clulas

dendrticas, que produzem e secretam o pigmento melanina, que d a colorao a

pele e exerce tambm uma funo protetora contra os raios violetas. As clulas de

Langerhans, so clulas dendrticas apresentadoras de antgenos, atuando no

sistema imunolgico (DYCE et al.,1990; GARCEZ, 2012).

8

Figura 1 Estrutura da Pele e seus anexos (FONTE: BEAR et al., 2008).

2.3 Cicatrizao Cutnea

O processo de cicatrizao comum a todas as feridas, independentemente

do agente que a causou, sistmico, dinmico e est diretamente relacionado s

condies gerais do organismo (MANDELBAUM et al., 2003; CAMPOS et al., 2007;

OLIVEIRA, 2010; GARCEZ, 2012).

A cicatrizao de feridas consiste em uma perfeita e coordenada cascata de

eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a repavimentao e

a reconstituio do tecido (MANDELBAUM et al., 2003).

A regenerao ocorre mediante a perda tecidual e pode atingir a derme

completa ou incompletamente, ou mesmo atingir todo o rgo, alcanando o tecido

celular subcutneo (MANDELBAUM et al., 2003; CAMPOS et al., 2007; GIANOTTI,

2011; GARCEZ, 2012).

9

Os mecanismos da cicatrizao foram descritos por Carrel em 1910, e

posteriormente foram divididos em cinco elementos principais: inflamao,

proliferao celular, formao do tecido de granulao, contrao e remodelao da

ferida (CAMPOS et al., 2007).

Existem autores que consideram trs estgios no processo de cicatrizao:

iniciando com um estgio inflamatrio, seguido por um estgio de proliferao e

finalizado com o reparo em um estgio de remodelao (Figura 2). Outros autores

classificam de uma forma mais completa, dividindo o processo em cinco fases

principais (MANDELBAUM et al., 2003).

2.3.1 Coagulao

O incio imediato aps o surgimento da ferida, e depende da atividade

plaquetria e da cascata de coagulao. A formao do cogulo serve no somente

para juntar as bordas da ferida, mas tambm para transpor a fibronectina,

oferecendo assim uma matriz provisria, onde os fibroblastos, clulas endoteliais e

queratincitos possam dar entrada na ferida (MANDELBAUM et al., 2003;

OLIVEIRA, 2010; GARCEZ, 2012).

10

2.3.2 Inflamao

Extremamente ligada a fase anterior, a inflamao depende, alm de

inmeros mediadores qumicos, das clulas inflamatrias, como neutrfilos,

macrfagos e linfcitos (MANDELBAUM et al., 2003; CAMPOS et al., 2007;

OLIVEIRA, 2010; GIANOTTI, 2011).

Os neutrfilos so as primeiras clulas a chegar ferida, e permanecem por

um perodo que varia de trs a cinco dias. Os neutrfilos produzem radicais livres

que auxiliam na destruio bacteriana e so gradativamente substitudos por

macrfagos (CAMPOS et al., 2007; GARCEZ, 2012).

O macrfago a clula inflamatria considerada a mais importante dessa

fase. Este permanece do terceiro ao dcimo dia, fagocitando bactrias, desbridando

corpos estranhos e direcionando o desenvolvimento do tecido de granulao. Sua

maior contribuio a secreo de citocinas e fatores de crescimento, alm de

contriburem na angiognese, fibroplasia e sntese de matriz extracelular,

fundamentais para a transio para a fase proliferativa (MANDELBAUM et al., 2003;

GARCEZ, 2012).

Os linfcitos aparecem na ferida em aproximadamente uma semana. Seu

papel no bem definido, porm sabe-se que tem importante influncia sobre os

macrfagos (MANDELBAUM et al., 2003; CAMPOS et al.,2007).

A fase inflamatria, alm de ter os mediadores qumicos e as clulas

inflamatrias, conta tambm com a importante funo da fibronectina. Esta

sintetizada por uma variedade de clulas como fibroblastos, queratincitos e clulas

endoteliais. A fibronectina adere, simultaneamente, fibrina, ao colgeno e a outros

tipos de clulas, funcionando assim como cola para consolidar o colgeno de fibrina,

11

as clulas e os componentes de matriz (CAMPOS et al., 2007; OLIVEIRA, 2010;

GIANOTTI, 2011; GARCEZ, 2012).

2.3.3 Proliferao

Dividida em quatro subfases (epitelizao, angiognese, formao de tecido

de granulao e deposio de colgeno), a proliferao responsvel pelo

fechamento da leso propriamente dita (MANDELBAUM et al., 2003; GIANOTTI,

2011).

A primeira das fases da proliferao a epitelizao, onde ocorre a migrao

de queratincitos no danificados das bordas das feridas e dos anexos epiteliais

(CAMPOS et al.,2007).

A angiognese, segunda fase da proliferao, estimulada pelo fator de

necrose tumoral (TNF-), e caracterizada pela migrao de clulas endoteliais e

formao de capilares, essencial para a cicatrizao adequada (GARCEZ, 2012).

A parte final da fase proliferativa a formao de tecido de granulao

(coleo de elementos celulares, incluindo fibroblastos, clulas inflamatrias e

componentes neovasculares e da matriz, como a fibronectina, as

glicosaminoglicanas e o colgeno). Os fibroblastos e as clulas endoteliais so as

principais clulas da fase proliferativa. Os fibroblastos dos tecidos vizinhos migram

para a ferida, porm precisam ser ativados para sarem de seu estado de repouso.

O fator de crescimento mais importante na proliferao e ativao dos fibroblastos

o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), em seguida liberado o fator

de necrose tumoral (TNF-), que estimula os fibroblastos a produzirem colgeno

12

tipo I (incio da deposio de colgeno) e a transformar-se em miofibroblastos, estes,

promovem a contrao da ferida (CAMPOS et al., 2007; DEL CARLO et al., 2008).

2.3.4 Contrao da Ferida

A contrao de ferida consiste no movimento centrpeto das bordas da ferida,

em sua espessura total. Uma ferida com espessura total tem contrao mesmo

quando h enxertos, que diminuem em 20% o tamanho da ferida. Em cicatrizes por

segunda inteno a contrao pode reduzir 62% da rea de superfcie da leso

cutnea (MANDELBAUM et al., 2003).

2.3.5 Remodelao

Esta a ltima das fases, ocorre no colgeno e na matriz, pode durar meses

e responsvel pelo aumento da fora de tenso e pela diminuio do tamanho da

cicatriz e do eritema. Reformulaes dos colgenos, melhoria nos componentes das

fibras colgenas e reabsoro de gua, so eventos que permitem uma conexo

que aumenta a fora da cicatriz e diminui sua espessura (MANDELBAUM et al.,

2003; TENIUS et al., 2007; GIANOTTI, 2011).

A neovascularizao diminui, e posteriormente a cicatriz considerada

avascular (OLIVEIRA, 2010; GIANOTTI, 2011).

13

A caracterstica mais importante dessa fase a deposio de colgeno de

maneira organizada, por isso a mais importante clinicamente. Com o tempo, o

colgeno inicial reabsorvido e um colgeno mais espesso produzido e

organizado ao longo das linhas de tenso. A reorganizao da nova matriz um

processo importante da cicatrizao. Fibroblastos e leuccitos secretam

colagenases que promovem a lise da matriz antiga. A cicatrizao tem sucesso

quando h equilbrio entre a sntese da nova matriz e a lise da matriz antiga,

havendo sucesso quando a deposio maior (CAMPOS et al., 2007, TENIUS et

al., 2007; SIMES et al., 2010; OLIVEIRA, 2010; GIANOTTI, 2011; GARCEZ, 2012).

Figura 2 Fases da cicatrizao correlacionadas com a especificidade imune-celular. (Fonte: adaptado por GARCEZ, 2012).

14

2.3.6 Consideraes sobre o Colgeno

O colgeno a protena mais importante do tecido conectivo em processo de

cicatrizao. A degradao do colgeno se inicia precocemente e muito ativa

durante o processo inflamatrio. A sua digesto ocorre no ambiente extracelular e

mediada por colagenases especficas. A atividade das colagenases controlada por

citocinas liberadas principalmente por clulas inflamatrias, endoteliais, fibroblastos

e queratincitos. A formao da matriz extracelular resultante da deposio

(sntese) e degradao do colgeno. O colgeno o principal componente da matriz

extracelular dos tecidos, este estrutura-se em rede densa e dinmica resultante da

sua constante deposio e reabsoro (CAMPOS et al., 2007; GIANOTTI, 2011).

2.3 Clulas tronco Mesenquimais (CTM)

Clulas tronco so clulas indiferenciadas, onde suas principais

caractersticas que as tornam extremamente interessantes so: sua capacidade de

autorrenovao, ou seja, so capazes de se multiplicar, mantendo seu estado

indiferenciado, proporcionando uma reposio ativa de sua populao de maneira

constante nos tecidos; e, ainda mais interessante, sua capacidade de se diferenciar

em diversos tipos celulares. Desta forma, acredita-se que clulas tronco presentes

nos diferentes tecidos tenham papel regenerativo quando estes sofrem uma leso

15

ou injria (CABRAL et al., 2008; DEL CARLO et al., 2008; BYDLOWSKI et al., 2009;

PINTO FILHO et al., 2013).

As CTM so definidas como uma populao de clulas tronco somticas

presentes em regies perivasculares de todos os tecidos adultos, em pequenas

quantidades, incluindo a medula ssea, o tecido adiposo, o peristeo, o tecido

muscular e rgos parenquimatosos (MEIRELLES et al., 2008; BYDLOWSKI et al.,

2009; MONTEIRO et al., 2010; PINTO FILHO et al., 2013).

A medula ssea (MO) constitui um dos principais stios para a obteno

dessas clulas, assim como de clulas tronco hematopoiticas e endoteliais

(MONTEIRO et al., 2010; PINTO FILHO et al., 2013).

As CTM caracterizam-se por ser uma populao de clulas multipotentes

capazes de se diferenciar e produzir qualquer tipo celular necessrio em um

processo de reparao, como osteoblastos, condroblastos, hepatcitos, neurnios,

clulas epiteliais, renais, cardacas, dentre outras. Essas caractersticas de

plasticidade sugerem que esse tipo celular o responsvel pelo turnover e pela

manuteno de todos os tecidos do organismo (DEL CARLO et al., 2008;

BYDLOWSKI et al., 2009; MONTEIRO et al., 2010).

As CTM tornaram-se foco de inmeras pesquisas em todo o mundo devido ao

fato de fornecer perspectivas clnicas promissoras para terapia celular (CABRAL et

al., 2008; DEL CARLO et al., 2008; BYDLOWSKI et al., 2009; MONTEIRO et al.,

2010; PINTO FILHO et al., 2013).

As CTM so uma populao heterognea de clulas que proliferam, in vitro,

como clulas aderentes ao plstico, tendo morfologia semelhante ao fibroblasto,

capacidade de autorrenovao e diferenciao em tipos celulares distintos

(BYDLOWSKI et al., 2009; MONTEIRO et al., 2010).

16

Dentre todas as linhagens de clulas tronco somticas (CTS) estudadas at o

presente momento, as CTM apresentam maior plasticidade, originando tecidos

mesodermais e no mesodermais. Essas clulas podem ser transplantadas para os

stios lesionais logo aps a ocorrncia da injria tecidual e podem ser aplicadas na

forma indiferenciada, recebendo o estmulo do meio para posteriormente se

diferenciar, ou sofrer diferenciao em cultura antes da implantao (DEL CARLO et

al., 2009).

No processo de cicatrizao cutnea, o TGF-, ativinas, fator de crescimento

vascular (EGF), PDGF, fator de crescimento do tecido conectivo (CTGF), fator de

crescimento fibroblstico (FGF), fator de crescimento insulnico (IGF) e o fator de

crescimento epidermal (EPGF) contribuem para a organizao do tecido conjuntivo e

formao de queratincitos (BYDLOWSKI et al., 2009).

medida que o processo cicatricial avana, os estmulos mesenquimais so

ultrapassados pelos estmulos ectodermais. O TGF-, por exemplo, durante a fase

aguda da inflamao, inibe a diferenciao de queratincitos, entretanto, durante a

fase de reepitelizao, estimula a migrao dos queratincitos pela matriz de

fibronectina neoformada. O EPGF, por outro lado, inibe a apoptose de queratincitos

e diminui a resposta celular ao estmulo do TGF- e FGF (DEL CARLO et al., 2008).

Oliveira (2010) utilizou CTM em feridas ocasionadas por queimaduras em

ratos e concluiu que estas foram efetivas ao promoverem uma melhora da

cicatrizao, bem como o fechamento mais rpido das feridas em relao aos

animais do grupo controle da pesquisa.

Garcez (2012) analisou a associao de CTM e plasma rico em plaquetas

como adjuvantes da cicatrizao de leses cutneas e concluiu que a terapia com

17

CTM promoveu cicatrizes esteticamente melhores na avaliao clnica quando

comparado com os animais do grupo controle do experimento.

18

3 OBJETIVOS

Objetivos gerais:

Avaliar a contribuio teraputica da infuso endovenosa de CTM para a

cicatrizao cutnea de feridas cirrgicas em ratos Wistar imunossuprimidos com

dexametasona.

Objetivos especficos:

1 Aferir os efeitos da imunossupresso com dexametasona sobre as

variveis tempo de cicatrizao (TEC) e rea da leso (ARL) de feridas cutneas

cirrgicas de ratos;

2 Quantificar histopatolgicamente o percentual de deposio de colgenos

das feridas cutneas cirrgicas de ratos imunossuprimidos com dexametasona

tratados ou no com CTM;

3 Identificar se h efeito do tratamento com CTM sobre a reduo do tempo

de cicatrizao (TEC) e rea de leso (ARL) das feridas cutneas de ratos

imunossuprimidos com dexametasona.

19

4 - MATERIAL E MTODOS

A realizao do estudo obedeceu a lei federal 6.638 das normas do Colgio

Brasileiro de Experincia Animal (Cobea). O presente projeto foi aprovado pelo

Comit de tica em Pesquisa e Experimentao com Animais, da Universidade Vila

Velha (UVV), protocolado sob-registro: 249/2013.

Foram utilizados 35 ratos fmeas (Rattus novergicus albinus) da linhagem

Wistar, de dezesseis semanas de idade, pesando aproximadamente 300 gramas (g),

oriundos do Laboratrio de Acompanhamento Experimental do Campus Nossa

Senhora da Penha da Universidade Vila Velha (UVV).

Os animais foram mantidos em um ambiente com controle de temperatura em

23oC, umidade relativa de 55%, e fotoperiodo de 12 horas, alojados em grupos de 5

animais em cada caixa de polipropileno de dimenses 414mm x 344mm x 168mm

padronizadas para a espcie, todas as caixas eram higienizadas a cada 48 horas.

Os animais tiveram acesso irrestrito a uma dieta padro (rao comercial para

roedores) e gua filtrada.

Antes do incio do experimento, todos os animais foram vermifugados com

Ivermectina a 2% na dose de 0,4 mg/kg por via oral acrescidos em bebedouros de

700ml de gua com repetio aos 10 dias anteriores ao procedimento cirrgico.

20

4.1 Isolamento, caracterizao e expanso de CTM

Para essa fase foram utilizados dois ratos Wistar filhotes, como doador de

CTM, conforme metodologia descrita por Monteiro et al. (2012). Essa etapa foi

realizada em parceria com colaboradores da Universidade Federal de Viosa (UFV)

e do Laboratrio de Biologia Celular da Universidade Federal de Minas Gerais

(UFMG).

Os animais foram submetidos eutansia em cmara anestsica, com

inalao passiva, at a sobredosagem de isoflurano. Foi realizada tricotomia do

abdmen e membros plvicos e em seguida os animais foram transferidos para

capela de fluxo horizontal. Foi realizada dissecao da musculatura do quadrceps e

o fmur do antmero direito e esquerdo foram retirados de forma assptica. As

epfases distais foram seccionadas e na epfase proximal foi acoplado uma agulha

(23G) e uma seringas de 10 mL contendo meio de cultura DMEM completo

(Dulbeccos Modified Eagle Medium - Gibco), acrescido de penicilina, estreptomicina

e anfotericina B (PSA) (Gibco, Paisley, UK) e apresentando pH 7,2, para lavar o

canal medular.

As clulas foram plaqueadas inicialmente na concentrao de 5x106 clulas

em frascos de cultura celular de 75 mm2 (Sarstedt, Nmbrecht, Alemanha) e

mantidas em estufa 37C com 5% de CO2. O aumento do nmero de clulas foi

acompanhado diariamente, com auxlio de microscpio invertido. Os meios de

cultura foram trocados mediante a necessidade e as tripsinizaes e passagens

21

realizadas quando visualizado 80% de expanso celular nas placas, at a quarta

passagem.

Uma alquota das clulas da quarta passagem foi caracterizada por citometria

de fluxo atravs da anlise de expresso de molculas de superfcie celular para CD

34, CD 45, CD 90 e CD 54, utilizando citmetro de fluxo FACScan e software

CellQuest, obtendo-se 30.000 eventos por amostra testada.

Outra alquota de clulas de quarta passagem foi submetida a etapas de

diferenciao osteognica. As clulas aderentes foram desprendidas com tripsina,

contadas e replaqueadas em placa de 6 poos, com lamnulas de 22 mm de

dimetro, com meio de cultura DMEN enriquecido com 10% de SFB, 10-8mol/mL de

dexametasona (Sigma, St Louis MO, USA), 5,0g/mL de cido ascrbico 2-fosfato

(Sigma, St Louis MO, USA) e 10,0mmol/L de -glicerofosfato (Sigma, St Louis MO,

USA) e incubado a 37C por quatro semanas. No 30 dia aps a colocao das

clulas no meio osteognico as lamnulas foram lavadas em PBS e coradas pelo

mtodo de Von Kossa para observar a deposio de clcio.

Aps a quarta passagem, as clulas foram tripsinizadas, observadas em

microscopia ptica para a avaliao da viabilidade celular, submetidas a contagem

em cmara de neubauer e aliquotadas na concentrao de 9 x 106 clulas/0,5 mL de

PBS. Cada alquota foi armazenada em seringa de 1,0 mL, acondicionada em caixa

de isopor sem gelo, aguardando o momento do transplante.

22

4.2 Procedimentos anestsicos, cirrgicos e tratamentos

Trinta dias antes do procedimento cirrgico, 25 animais foram pesados

individualmente, identificados com brincos de numerao na orelha esquerda e

distribuidos aleatoriamente em 2 grupos (Figura 3). Estes grupos foram

diferenciados quanto ao tratamento conforme a lista abaixo e observados

diariamente por 2 meses consecutivos:

Grupo Controle (GC): formado por cinco (5) animais que receberam

aplicaes de 0,2 ml soluo fisiolgica (NaCl 0,9%) a cada 24 horas

por via subcutnea (SC) durante 30 dias consecutivos.

Grupo Dexametasona (GD): formado por vinte animais (20) que

receberam aplicaes a cada 24 horas de dexametasona na dose de

0,1 mg/kg por via SC durante 30 dias consecutivos, conforme

metodologia proposta por Tnius et al (2007).

Aps o trmino de 30 dias da administrao de dexametasona, antecedendo

ao ato cirrgico, todos os animais foram submetidos a anestesia por meio de injeo

intramuscular (IM) de uma associao de cetamina 10% (20mg/kg), xilazina 2%

(4mg/kg), midazolan 0,5% (2,5mg/kg) e morfina 1% (1,0 mg/kg) (Figura 4). Aps a

perda do reflexo de endireitamento foi realizado tricotomia da regio dorsal (Figura

5A), seguida por anti-sepsia da rea tricotomizada com soluo de clorexidine

degermante e lcool 70%.

O plano anestsico foi monitorado de acordo com a ausncia de movimentos

e perda do reflexo de pinamento da cauda e dos dgitos, alm da avaliao clnica

23

dos parmetros relacionados a frequncia cardaca (FC), frequncia respiratria

(FR) e temperatura retal (TR). Os animais receberam antibioticoterapia profiltica

com enrofloxacina 10% (10mg/kg) por via SC no trans-operatrio.

Figura 3 Animal do grupo GC recebendo anestesia geral por via IM.

4.3 Plano cirrgico

Aps a anti-sepsia, foi realizada a marcao da rea da ferida cirrgica com

tinta de carimbo atxica (Figura 4B), e posteriormente, delimitou-se o campo

operatrio com gaze estril (Figura 4C). Foi confeccionada uma ferida cirrgica

circular de aproximadamente 1,5 cm de dimetro, com remoo da pele na regio

24

dorsal (Figura 4D). As bordas da leso foram suturadas a musculatura circunvizinha,

com fio monofilamentoso, no absorvvel (Nylon 3.0) em pontos simples separados,

visando minimizar o efeito de retrao das bordas da leso. As feridas cutneas de

todos os animais foram limpas diariamente, com gaze estril umedecida em soluo

fisiolgica.

Figura 4 Animal tricotomizado (A); rea padronizada demarcada na pele com tinta de carimbo (B); rea padronizada demarcada na pele com tinta de carimbo j com campo operatrio (C); Ferida cirrgica sem fixao das bordas (D).

25

4.4 Tratamento

Aps o procedimento cirrgico, os 20 animais do GD foram subdivididos

aleatoriamente em dois grupos com 10 animais cada, que foram diferenciados

quanto ao tratamento (Figura 3), com forme a lista abaixo:

Grupo Dexametasona (GD): formado por quinze animais que

receberam uma nica aplicao de 0,5 ml soluo fisiolgica (NaCl

0,9%) por via IV, 48 horas aps a criao da ferida cirrgica e

acompanhados por mais 30 dias.

Grupo Dexametasona Clulas Tronco Mesenquimais (GDCTM):

formado por quinze animais que receberam o transplante de CTM, na

concentrao de 9x106 clulas/ml (volume final de 0,5 ml), em

aplicao nica, por via IV, 48 horas aps a criao da ferida cirrgica

(Figura 6).

Os Animais do GC receberam uma nica aplicao de 0,5 ml soluo fisiolgica

(NaCl 0,9%) por via IV, 48 horas aps a criao da ferida cirrgica. O local de

aplicao intravenosa, em todos os animais do estudo, foi a veia lateral da cauda.

26

Figura 5 Organograma ilustrando os animais do experimento e como os mesmos foram divididos nos grupos de tratamento recebido.

Figura 6 Rato Wistar recebendo infuso de CTM, pela veia lateral da cauda, 48 horas aps a criao da ferida cirrgica.

27

4.5 Avaliao clnica

Em todos os animais foram acompanhados os parmetros peso, ingesto

hdrica e alimentar e inspeo das feridas uma vez ao dia at total cicatrizao da

leso cutnea.

Em quatro animais de cada grupo, escolhidos de forma aleatria e mantidos

durante todo o perodo de observao, as feridas foram fotografadas diariamente

para a avaliao das variveis rea da leso (ARL) e tempo de cicatrizao (TEC),

conforme metodologia proposta por Arglo-Neto et al. (2012). Para isso, foram

padronizados a intensidade de luz e altura da maquina fotogrfica digital por meio de

um suporte em acrlico. As imagens foram transferidas a um computador e avaliadas

com programa especifico de analise fotogrfica, o Image Pro Plus, para

mensurao da rea da ferida cirrgica (Figura 7).

28

Figura 7 Imagem ilustrativa da mensurao da ARL nos dias 1, 5 e 10 aps a criao da ferida cirrgica, atravs do programa Image Pro Plus, no qual os traos em amarelo demonstram o contorno da rea da ferida.

De cada individuo foram obtidas mdias dos valores encontrados para as

variveis rea da leso e tempo de cicatrizao. A partir da mdia de cada varivel

para cada animal do grupo correspondente, foi obtida a mdia dos grupos.

4.6 Bipsia e procedimentos histolgicos

Os demais 6 animais de cada grupo foram escolhidos de forma aleatria e

submetidos a eutansia por sobredosagem anestsica com isoflurano, nos dias 3, 7

e 15 aps a interveno cirrgica (2 animais por dia). Em seguida, os ratos foram

contidos em mesa cirrgica para a realizao de biopsia incisional onde coletou-se

toda a rea da ferida com uma pequena margem de pele integra (Figura 8).

29

Figura 8 Animais eutanasiados aos 3 (A), 7 (B) e 15 (C) dias respectivamente, aps a criao da ferida cirrgica. Em destaque ,(retngulo) a rea de tecido coletada envolvendo a ferida cirrgica e a pele intacta, que foi encaminhada histopatologia.

As amostras de pele foram fixadas em paraformaldedo tamponado a 10% por

24 horas e encaminhadas para exame histopatolgico. As amostras de pele foram

fixadas em paraformaldedo tamponado a 10% por 24 horas e, em seguida,

desidratadas em solues de concentraes crescentes de etanol (70, 80, 90 e

100%), diafanizadas em xilol, includas em parafina histolgica e seccionadas em

micrtomo rotativo, ajustado para 4m de espessura. Os cortes foram fixados em

lmina de vidro e corados com Tricrmio de Mallury para identificao e

quantificao das fibras colgenas, (Ferrera et al., 2003) e hematoxilina e eosina.

Os cortes histopatolgicos corados pelo mtodo de Tricrmio de Mallury

foram observados em microscpio ptico conectado a um microcomputador

equipado com um software de captura de imagem. Para permitir a quantificao de

fibras colgenas (FIC) foram registradas trs imagens de trs diferentes campos de

cada parte dos cortes histolgicos, utilizando-se objetiva de 10X. Depois de

capturadas, as imagens foram analisadas por meio de um programa de anlise de

imagens, Cellprofiler com o objetivo de avaliar a proporo de fibras colgenas

30

presentes na rea pr-determinada. O programa foi calibrado para o estudo,

padronizando a colorao das fibras colgenas a serem quantificadas na rea de

1mm2 e, a partir destas, calculada as mdias dos grupos.

4.7 Avaliao estatstica

A tabulao dos dados e avaliao estatstica foi realizada com o auxilio de

planilhas eletrnicas de Excel.

Os valores mensurados para ARL e TEC, foram submetidos a analise de

varincia (ANOVA) e teste de Tukey a 5% para comparao da diferena mnima

significativa das mdias de cada tratamento.

5 - RESULTADOS

5.1- Cultura celular

A medula ssea foi capaz de propiciar uma cultura heterognea,

composta por clulas arredondadas, no aderentes e micelas lipdicas no

31

sobrenadante da cultura nas primeiras 24 horas. A partir do oitavo dia, a populao

celular apresentava-se mais homognea, com predominncia das clulas aderentes

de morfologia fibroblastide, organizada em colnias.

A citometria de fluxo foi realizada com uma amostra de cultura de quarta

passagem de clulas e GFP demonstrou que cerca de 43% das clulas

homogneas revelaram expresso negativa para 96,53% de CD34 e 93,89% de

CD45 e expresso positiva para 99,0% de CD90 e 93,89% de CD90 e 95,8% de

CD54 (Figura 9). O conjunto de marcadores utilizados permitiu inferir que a

populao isolada e cultivada era homognea com marcadores positivos para CTM

e, claramente distinta da linhagem hematopoitica.

32

Figura 9 - Avaliao da frequncia de CD 34, CD 45, CD 90 e CD 54 por citometria

de fluxo em clulas tronco mesenquimais (CTM) oriundas da medula ssea de ratos Wistar. A intensidade de fluorescncia de cada marcador de superfcie nas CTM indiferenciadas (grficos brancos ou abertos) esta comparada com os isotipos controle (grfico preto). O eixo X representa a escala de fluorescncia, sendo positivo quando as clulas ultrapassam 10 de clulas avaliadas durante o evento. A) Grfico de pontos demonstrando a populao celular selecionada para o estudo (R1), que representou 43% de homogeneidade. As amostras da cultura revelaram expresso negativa para 96,53% de CD34 (B) e 93,89% de CD45 (C) e expresso positiva para 99,0% de CD90 (D) e 95,8% de CD 54 (E).

33

5.2 Alteraes clnicas

Os animais do experimento que receberam aplicaes SC de

dexamentasona, apresentaram reduo do peso corporal com 7 dias de aplicao

do corticoide. Com 14 dias de aplicao do corticoide 8 animais apresentaram

secreo ocular de colorao vermelho-amarronzada e regies de hipotricose

(Figura 10). No momento da cirurgia, apenas a hipotricose persistia. A partir de 7

dias aps a cirurgia observou-se discreto ganho de peso em todos os animais.

Figura 10 - Animais apresentando secreo ocular escura (A e B); reas de

hipotricose (C e D).

34

5.3 Avaliao macroscpica

Em todos os animais as feridas apresentaram-se ressecadas, eritemato

crostosas e no exsudativas, que regrediram lentamente at a perda da crosta

superficial e epitelizao (Figura 11).

Figura 11 Fotos dos animais dos grupos GC, GD e GDCTM nos dias 1, 5, 10 e 15 aps a criao da ferida cirrgica.

As imagens capturadas de 4 animais de cada grupo do experimento foram

avaliadas para ARL pelo programa Image Pro Plus, posteriormente foi realizada a

mdia de cada grupo (Tabela 1) para realizao da anlise de varincia e teste de

35

Tukey a 5% (Figura 12), onde constatou-se que no houve diferena de significncia

nos tratamentos.

Tabela 1 Apresenta a mdia em centmetros da rea da leso (ARL) dos animais dos grupos do experimento nos dias 1, 3, 5, 10, 12 e 15 aps a criao da ferida.

GRUPO DIA 0 DIA 1 DIA 3 DIA 5 DIA 10 DIA 12 DIA 15

GC 3,337a 2,229 a 1,780 a 1,543 a 0,542 a 0,093 a 0,000 a

GD 3,215 a 2,804 a 2,748 a 2,439 a 0,967 a 0,652 a 0,368 a

GDCTM 3,738 a 2,541 a 2,288 a 2,035 a 0,589 a 0,113 a 0,000 a

Pares de mdias seguidas de letras iguais, na mesma coluna, no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significncia.

Figura 12 Demonstrao grfica dos valores das mdias das repeties para ARL dos grupos do experimento; GC em azul, GD em vermelho e GDCTM em verde. O eixo Y do grfico representa o valor de ARL em cm, enquanto o eixo X representa as repeties DIA 0; DIA 1; DIA 3; DIA 5; DIA 10; DIA 12 e DIA 15.

O tempo de cicatrizao (TEC) foi observado diariamente em quatro animais

de cada grupo do experimento. Conforme pode ser observado na tabela 6, as feridas

cirrgicas dos animais do GC fecharam em at 15 dias aps a realizao da leso.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

DIA 0 DIA 1 DIA 3 DIA 5 DIA 10 DIA 12 DIA 15

Controle

DEXA

CTM

36

Os animais do GD tiveram suas feridas cirrgicas fechadas em at 22 dias, j as

feridas cirrgicas dos animais do GDCTM foram fechadas em at 14 dias.

Com base nos resultados do TEC dos grupos, realizou-se anlise de varincia

(ANOVA) e teste de Tukey 5%, onde observou-se que houve diferena de

significncia entre os tratamentos (Tabela 6).

Tabela 2 - Mdias dos valores encontrados para a varivel TEC em ratos wistar

submetidos aos tratamentos com imunossupresso com dexametasona (GD), com soluo fisiolgica (GC), e Imunossupresso por dexametasona com transplante de clulas tronco mesenquimais (GDCTM)

TRATAMENTO MDIAS (dias) GD 21,25a GC 14,75b

GDCTM 13,5b

Pares de mdias seguidas de letras diferentes, na mesma coluna, diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significncia; Pares de mdias seguidas de letras iguais, na mesma coluna, no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significncia.

0

5

10

15

20

25

Animal 1

Animal 2

Animal 3

Animal 4

Nmero de dias de cicatrizao

Controle

DEXA

CTM

37

Figura 13 Demonstrao grfica ilustrando o TEC dos grupos: GC em azul; GD

em vermelho e GDCTM em verde. No eixo Y representa o valor de TEC em dias,

enquanto o eixo X representa os animais (1, 2, 3 e 4) avaliados para TEC.

5.4 Avaliao histopatolgica

5.4.1 Material coletado dos animais eutanasiados 3 dias aps a realizao da ferida

cirrgica do GC:

Na leso foi observada a presena de ferida extensa, compacta, recoberta por

material fibrinoso e neutrfilos, em processo degenerativo ou em hipersegmentao.

O tecido conjuntivo abaixo mostrou-se edematoso, com formao de uma delicada

trama fibrinosa e, exibiu tambm proliferao de fibroblastos imaturos, sendo

ocasionalmente vistas figuras de mitose. Houve discreta hipertrofia de clulas

endoteliais vasculares, os quais estiveram moderadamente dilatados em planos

profundos (Figura 14).

A zona de proliferao endotelial foi discreta a partir de vasos congestos

remanescentes.

Quanto ao colgeno, visualizou-se rarssimas fibras colgenas

remanescentes, com presena de fibras colgenas inconspcuas (no facilmente

perceptveis) (Figura 14).

Borda da ferida e tecidos adjacentes: verificou-se processo de hiperplasia

evidente do epitlio marginal, com ntida acantose (hipertrofia ou espessamento do

38

estrato germinativo da epiderme). Na derme pode-se verificar vasodilatao discreta,

porm com evidente processo de congesto e dilatao vascular em planos. Houve

intensa reatividade, com proliferao de fibroblastos localizados na periferia do

tecido muscular, acompanhada por discreto processo inflamatrio supurativo.

Clulas imaturas foram notadas em quantidade moderada.

Alm da margem da ferida evidenciou-se tambm congesto, dilatao

vascular e infiltrado inflamatrio mononuclear difuso moderado.

Quanto ao colgeno, houve deposio colgena perimsial discreta.

Figura 14 Neovascularizao indicada com setas vermelhas (A); Demarcao da deposio do colgeno, corado em verde pelo Tricrmio de Maully, de forma mais discreta, na rea circulada, e neovascularizao indicada pela seta preta (B) 5.4.2 - Material coletado de animal eutanasiado 3 dias aps a realizao da ferida

cirrgica do GD:

Na leso observou-se presena de crosta pio-serosa e fibrinosa mais frouxa

em relao ao GC, com a mesma qualidade celular. O tecido conjuntivo abaixo

apresentou edema difuso, com delicada trama fibrinosa, porm com vasos mais

evidentes e com vasos neoformados (Figura 15A). Houve proliferao intersticial

mais evidente ao GC. Marginao de polimorfonucleares foi evidente.

1mm 1mm

39

Borda da Ferida e tecido adjacentes: verificou-se processo de menor

hiperplasia do epitlio marginal (Figura 15B). Na derme pode-se verificar vaso

dilatao evidente, congesto e dilatao vascular em planos alm do msculo

cutneo. Houve intensa reatividade, com proliferao de fibroblastos perimisiais,

acompanhada por processo proliferativo de clulas mesenquimais pouco

diferenciadas.

Colgeno: visualizou-se rarssimas fibras colgenas remanescentes, com

presena de fibras colgenas inconspcuas. Deposio colgena perimsial mais

evidente (Figura 15C).

40

Figura 15 Neovascularizao indicada com a seta vermelha(A); Borda da Ferida marcada com as setas pretas (B); deposio de colgeno, corado em verde, demarcado pelas reas circulares e neovascularizao indicada com a seta lils (C).

5.4.3 - Material coletado de animal eutanasiado 3 dias aps a realizao da ferida

cirrgica do GDCTM:

Leso: Presena de crosta semelhante ao GD. A trama vascular mostrou

aspecto mais ramificado, com formao de inmeros brotos vasculares, zona

proliferativa ntida com discreta formao de capilares, alm de evidente hiperplasia

do endotlio vascular (Figura 16A). O tecido conjuntivo em plano profundo,

apresentou-se com maior celularidade, em relao aos grupos anteriores, por

clulas mesenquimais imaturas, porm com aspecto fibroblstico.

1mm

C

1mm 1mm

41

Colgeno: evidenciao de fibras colgenas (em discreta quantidade) maior

que os grupos anteriores (Figura 16B).

Borda da ferida e tecido adjacentes: verificou-se processo de menor

hiperplasia do epitlio marginal em relao ao GC, porm maior em relao ao GD,

com discreta acantose. Na derme pode-se verificar vaso dilatao evidente,

congesto e dilatao vascular em planos alm do msculo cutneo. Houve discreta

reatividade, com proliferao de fibroblastos perimisiais. Alm da margem da ferida

evidenciou-se tambm congesto, dilatao vascular e infiltrado inflamatrio

mononuclear difuso moderado em menor intensidade que o GD.

Figura 16 Vasodilatao indicadas pelas setas pretas (A); Evidenciao e maior nmero de fibras colgenas recm formadas destacada na rea circular (B). Estruturas esverdeadas representam as fibras colgenas em maior quantidade que nos GC e GD.


cirrgica do GD:

Preenchimento do leito da ferida por tecido de granulao evidente. Edema

difuso moderado. Epitelizao desenvolvendo de forma adequada, sendo

presenciada ainda fibras colgenas delgadas, separadas por clulas mesenquimais

alongadas em grande quantidade.

1mm 1mm

42


cirrgica do GDCTM:

Em relao ao GD 7 dias, apresenta fibras colgenas com aspecto mais

espesso, de forma mais compacta (Figura 17A). Neste grupo (GDCTM), o aspecto

do tecido de granulao mais maduro (com menor espessura) (Figura 17B).

Processo de epitelizao mais acentuado, ou seja, cobre mais o leito lesionado. H

presena de clulas alongadas multinucleadas, junto a extremidade remanescente

da musculatura esqueltica, o que no ocorreu no GD 7 dias.

Figura 17 Fibras colgenas menos evidentes e/ou menos definidas destacadas na rea retngular em animal eutanasiado 7 dias aps leso do GD (A); Fibras colgenas mais espessas, logo bem mais evidentes, destacadas na rea circular, em animal eutanasiado 7 dias aps leso do GDCTM.


cirrgica do GC:

Epitelizado com tecido cicatricial em formao, apresentando fibras colgenas

delicadas. H reatividade de clulas musculares esquelticas.

1mm 1mm

43


cirrgica do GD:

Epitelizao em avano, sem recobrir a ferida. Nota-se grande nmero de

clulas alongadas por entre as fibras colgenas, as quais apresentam padro mais

delicado em relao do GC. Presena de discreto infiltrado inflamatrio linfocitrio

associado ao epitlio formado.


cirrgica do GDCTM:

Epitelizado, com tecido cicatricial apresentando fibras colgenas mais

espessas e contendo menor quantidade de clulas alongadas em relao ao GC e

GD. Ncleos de clulas musculares esquelticas muito reativas e em processo de

multinucleao. J se evidencia formao de papilas drmicas, evidente hiperplasia

com hipertrofia dos anexos cutneos adjacentes, comparado ao GD. Presena de

moderado infiltrado inflamatrio linfocitrio associado ao epitlio formado.

5.4.9 - Cellprofiler

As imagens foram analisadas pelo programa Cellprofiler, onde as fibras

colgenas foram coradas em verde, j as em vermelho e amarelo, no foram

identificadas como fibras, logo estas foram excludas (Figura 18). Os valores mdios

de fibras colgenas quantificadas aos 15 dias de observao foram 14,3 fibras no

GC, 7,3 fibras no GD e 12,7 fibras no GDCTM aos 15 dias de observao, numa

rea de 5mm2.

44

B A A

B

45

Figura 18 Imagem histopatolgica original contendo fibras colgenas (A) de animal do GDCTM aos 15 dias; Imagem histopatolgica em preto e branco (B); Imagem corada em verde e vermelho, onde a colorao verde demarca as fibras colgenas (C).

Figura 19 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GC nos dias 3 e 15 aps leso.

NaCl

3 dias 7 dias 15 dias

fib

ros

-10

0

10

20

30

C

NaCl


fib

ros

-10

0

10

20

30

46

Figura 20 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GD nos dias 3, 7 e 15 aps leso.

Figura 21 Demonstrao grfica da quantidade de fibras colgenas presentes no GDCTM nos dias 3, 7 e 15 aps leso.

Dexa


fib

ros

-10

0

10

20

30

Dexa & CMT


fibro

s

-10

0

10

20

30

47

6 DISCUSSO

A cicatrizao um processo complexo, que comeou a ser entendido em

maior amplitude nos ltimos anos. Contudo ainda h necessidade de se continuar

estudando seus mecanismos, visto que grande parte dele ainda desconhecida

(CAMPOS et al., 2007; GIANOTTI, 2011; GARCEZ, 2012).

O futuro promissor em medidas preventivas e curativas mais eficientes e

que possam estar a disposio dos cirurgies, diminuindo assim a possibilidade de

complicaes no manuseio dos doentes que necessitam agresso cirrgica para a

cura dos seus males (CAMPOS et al., 2007). Pacientes que fazem uso crnico de

corticoides, quando submetidos a procedimento cirrgico, apresentam pele com

comportamento distinto dos demais doentes e respondem ao processo regenerativo

de forma diferente (TENIUS et al., 2007). O que pode ser visualizado nos animais do

grupo GD deste presente estudo, visto que os mesmos demoraram em mdia 8 dias

a mais para obter cicatrizao total quando comparado com os outros grupos (GC e

GDCTM).

A imunossupresso experimental deve ser realizada apenas mediante

avaliao constante do paciente, visto que pacientes muito deprimidos podem

apresentar complicaes como aplasia medular, infeces e determinados tipos de

neoplasias (TEIXEIRA & REZENDE, 2004). No presente estudo as alteraes

clnicas observadas foram a presena de secreo ocular escura e reas de

hipotricose nos animais aps 14 dias de aplicao de dexametasona.

48

Os corticoides so bastante utilizados na pratica mdica, especialmente pelo

seu excelente efeito antiinflamatrio. No entanto, alguns efeitos adversos na

cicatrizao de feridas tais como, reduo da formao de tecido colgeno e tardio

aparecimento de fibrose, tm sido relatados (AGUILAR-NASCIMENTO et al., 2000;

TENIUS et al., 2007). No a quantidade do colgeno, mas sua organizao

espacial, que proporciona resistncia ferida (TENIUS et al., 2007). No grupo GC

foi observado presena de fibras colgenas inconspcuas, ou seja, pouco

perceptveis nos animais eutanasiados no terceiro dia aps a criao da ferida

cirrgica.

A reduo da reao inflamatria efeito j descrito na literatura, tanto que os

corticides so tambm conhecidos como antiinflamatrios hormonais (AGUILAR-

NASCIMENTO et al., 2000; TENIUS et al., 2007).

Tenius et al (2007) relataram que a medida das clulas inflamatrias esteve

diminuda no grupo que recebeu dexametasona em todos os momentos da

avaliao e significativamente no terceiro e stimo dias, caracterizando a ao da

dexametasona na fase inflamatria da cicatrizao. Neste estudo foi observado

reduo de infiltrado inflamatrio nos grupos que receberam dexametasona.

A partir de 1999, os estudos com clulas tronco tomaram conhecimento

pblico pelo seu potencial teraputico. Muito se alardou sobre o uso de clulas

tronco em diversas doenas. Houve enfoque em clulas tronco embrionrias, uma

vez que possuem capacidade de pluripotncia. Mas, com os estudos sobre a

plasticidade e ausncia de respostas imunolgicas as CTM se tornaram atrativas

para fins teraputicos (SEMEDO et al., 2009; OLIVEIRA, 2010).

As CTM encontram-se atualmente como a nova promessa na terapia contra

diversos tipos de doena, sejam elas congnitas e/ou hereditrias ou adquiridas, em

49

animais e seres humanos. Os resultados obtidos de pesquisas realizadas, utilizando

as fraes totais de CTM da medula ssea e tecido adiposo, demonstraram a

possibilidade de utilizao de clulas de diferentes tecidos, uma vez que essas

clulas so passveis de adaptao ao cultivo, expanso e armazenagem

(OLIVEIRA, 2010; GARCEZ, 2012; PINTO FILHO et al., 2013).

O protocolo de aplicao das CTM neste experimento foi baseado em

trabalhos semelhantes que avaliaram o potencial teraputico desse grupo celular em

leses cutneas (OLIVEIRA, 2010; ARGOLO-NETO et al, 2012; GARCEZ, 2012).

Estudo recente descreve a utilizao algena e autgena das CTM para a reparao

de diversos tecidos (MONTEIRO et al., 2010), no entanto, a capacidade destas

clulas em restaurar o tecido cutneo ainda no bem esclarecida (MEIRELLES et

al, 2008).

Mesmo no realizando o transplante de clulas tronco in situ, diretamente

sobre o tecido cutneo, e optando pela aplicao intravenosa, pela veia da cauda do

rato, observamos no GDCTM que houve presena em maior quantidade de fibras

colgenas, e estas aos 15 dias encontram-se mais espessas que nos outros grupos

experimentais (MONTEIRO et al., 2010).

Neste trabalho pretendeu-se avaliao da variveis dependentes ARL e

TEC, por serem dados importantes sobre o processo de evoluo de uma leso. Foi

clinicamente relevante a aparncia da cicatriz obtida com o tratamento com as CTM,

onde pode-se perceber uma maior qualidade cosmtica nos grupos os quais foram

utilizadas. Estes achados foram tambm descritos por autores que relatam que as

CTM alm de acelerar o processo cicatricial podem produzir uma cicatriz de melhor

qualidade esttica e funcional (GARCEZ, 2012).

50

A cicatrizao das feridas foi considerada quando do encontro das margens,

resultando na inibio da contrao pelo contato. Os animais do GC obtiveram

cicatrizao completa com mdia de 14,75 dias, j os indivduos do GD,

apresentaram cicatrizao total em mdia de 21,25 dias, e os animais do GDCTM

tiveram o processo de cicatrizao finalizado em mdia de 13,5 dias. Tendo em vista

a constatao clinica de uma possvel melhora no processo cicatricial das feridas

nos animais que receberam CTM, acredita-se que os benefcios referentes

qualidade da cicatrizao provenientes da utilizao das CTM possam ser melhor

evidenciadas em avaliaes superiores aos 15 dias, onde a produo de uma

cicatriz de melhor qualidade cosmtica poderia ser analisada pela organizao da

deposio de colgeno (GIANOTTI, 2011; GARCEZ, 2012).

sabido que as CTM indiferenciadas, fibroblastos e macrfagos iniciam a

formao do tecido e que a proliferao, diferenciao, modulao e coordenao

destas clulas ocorrem pela interao de vrios fatores de crescimento,

coordenando a mitose celular e a sntese proteica (DEL CARLO et al., 2008;

MONTEIRO et al., 2010). A terapia celular com CTM foi efetiva em nosso estudo,

acelerando o processo cicatricial e incrementado a formao de fibras colgenas. Os

mecanismos envolvidos nesse processo no foram elucidados durante o estudo,

assim sendo, maiores investigaes mostram-se necessrias a fim de confirmar

essa hiptese.

51

7- CONCLUSO

Sobre as condies que foram realizadas este experimento constata-se:

- que a dose de 0,1mg/kg SID SC de dexametasona, durante 30 dias, foi capaz de

inibir a formao do colgeno presente no processo de cicatrizao epitelial dos

animais do GD comparando-se ao GC;

- As CTM contriburam com a cicatrizao cutnea, reduzindo o tempo de

cicatrizao tanto quanto nos animais saudveis, denotando mnima interferncia da

dexametasona;

- que o transplante de CTM derivadas de MO contribui de maneira positiva na

varivel TEC para a cicatrizao de feridas cutneas em animais imunossuprimidos

com dexametasona;

- a escolha pela infuso por via intravenosa foi efetiva para ao das clulas no local

da leso.

52

8- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

AGUILAR-NASCIMENTO, J. E.; DA SILVA, L.R.F.; TEIXEIRA, R.L.; DE OLIVEIRA, A.F. Deflazacort e cicatrizao de anastomoses colnicas. Estudo experimental em ratos. Rev. Ass. Med. Brasil, v. 46, n. 3, p. 218-223, 2000. ARGOLO NETO, N. M.; DEL CARLO, R.J.; MONTEIRO, B. S.; NARDI, N. B.; CHAGASTELLES, P. C.; DE BRITO, A. F. S.; REIS, A. M. S. Role of autologous mesenchymal stem cells associated with platelet-rich plasma on healing of cutaneous wounds in diabetic mice. Clinical and Experimental Dermatology, v. 37, p. 544553, 2012. BEAR, M.; CONNORS, B.; PARADISO, M. Neurocincias: desvendando o sistema nervosa. 3.ed. Artmed, Porto Alegre. 857p, 2008.

BYDLOWSKI, S. P. ; DEBES, A. A.; MASELLI, L. M. F. ; JANZ, F. L. Caractersticas biolgicas das Clulas Tronco Mesenquimais. Rev. Bras. Hematol. Hemotec. v.31, p.25-35, 2009.

CABRAL, A.C.V.; NGELO, P.C.; LEITE, H.V.; PEREIRA, A.K.; LOPES, A.P.B.M.; DE OLIVEIRA, M.B.;BORGES, K.B.G.; PARDINI, V.C.; FERREIRA, A.C.S. Isolamento, diferenciao e aspectos bioqumicos de clulas tronco de lquido amnitico. Rev. Ass. Med. Brasil, v. 54, n. 6, p. 489-493, 2008.

CARREL, A. The treatment of wounds. JAMA, p. 2148,1910.

CHAMUSCA, F.V. Mediadores do efeito sistmico do processo inflamatrio em terapias fotobiomoduladoras: Uma reviso de literatura. Revista de Cincias Mdicas e Biolgicas, v.11, n.1, p.70-78, Jan./Abr., 2012. COLOM, L.M.; GOMES, C.; CROSIGNANI, N.; PAZ, A.H.; LUGO, A.A.; GUIMARES, K.M.; FOERSTROW, L.P.; TESSARI, J.P.; COLOM, L.M.; GRAA, D.L.; MCURER, L.; PASSOS, E.P.; PIPPI, N.L.; CONTESINI, E.A.; LIMA, E.O.C. Utilizao de clulas tronco autlogas de medula ssea na regenerao do nervo tibial de coelhos mediante tcnica de tubulizao com prtese de silicone. Cincia Rural, v. 38, n. 9, p. 2529-2534, 2008. DEALEY, C. Case study methodology in tissue viability. Part 2: A study to determine the levels os knowledge of nurse providing care for patients with leg ulcers in an acute hospital setting. J Tissue Viability, v. 11, n. 1, p. 28-34, 2001. DEL CARLO, R.J.; MONTEIRO, B.S.; ARGOLO NETO, N.M. Avanos no estudo de clulas tronco no Brasil e suas implicaes. Revista Ceres.v. 56, n. 4, p. 446-450, 2009. DEL CARLO, R.J.; MONTEIRO, B.S.; ARGOLO NETO, N.M. Clulas tronco e fatores de crescimento na reparao tecidual.Cinc.Vet.Trp.,v. 11, p. 167-169, 2008. DYCE, K.M.; SACK, W.O.; WENSING, C.J.G. Tratado de Anatomia Veterinria. Rio de Janeiro: Guanabara Koongan, 1990.

53

ENGELKING, L.R. Fisiologia Endcrina e Metablica em Medicina Veterinria. So Paulo: Roca, 2010, p.72-79. JERIC, M.M.; MARCO, V. Anti-inflamatrios Esteroidais. In_____.Farmacologia Aplicada Medicina Veterinria. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011, p.261-271. JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Histologia bsica. Rio de Janeiro: Ganabara koogan, 11 ed. 2008. GARCEZ, T.N.A. Clulas tronco mesenquimais e plasma rico em plaquetas como adjuvantes da cicatrizao de leses cutneas experimentais em coelhos Nova Zelndia. Porto Alegre, RS: UFRGS, 2012. Dissertao (Mestrado em cincias veterinrias) Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2012. GIANOTTI, A.W.K.B. Clulas tronco mesenquimais e eletroacupultura na cicatrizao de leses cutneas em coelhos. Porto Alegre, RS: UFRGS, 2011. Dissertao (Mestrado em cincias veterinrias) Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2011. KEATING, A. Mesenchymal stromal cells. Current opinion in hematology, v.13,

p.419-425, 2006.

MANDELBAUM, S.H.; DI SANTIS, E.P.; MANDELBAUM, M.H.S. Cicatrizao:

conceitos atuais e recursos auxiliares - Parte I. Anais Brasileiros Dermatologia, Rio

de Janeiro, v.78, p.393-410, 2003.

MEIRELLES, L.S.; CAPLAN, A.I.; NARDI, N.B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem Cells, v.26, p.2287-2299, 2008.

MONTEIRO, B.S.; ARGOLO NETO, N.M.; DEL CARLO,R.J. Clulas-tronco Mesenquimais. Cincia Rural. v. 40, n.1, p. 238-245, 2010. MONTEIRO, B.S.; ARGLO-NETO, N.M.; NARDI, N.B.; CHAGASTELLES, P.C.; CARVALHO, P.H.; BONF, L.P.; FILGUEIRAS, R.R.; REIS, A.S.; DEL CARLO, R.J. Treatment of critical defects produced in calvaria of mice with mesenchymal stem cells. Anais da Academia Brasileira de Cincias. V.84, p.841-851, 2012.

NAUTA, A.J. FIBBRE, W.E. Immunomodulatory properties of mesencgymal stroma cells. Blood, v.110, p. 3499-3506, 2007.

OLIVEIRA,C.C. Avaliao do potencial teraputico das clulas tronco mesenquimais em feridas ocasionadas por queimaduras em ratos. Ribeiro Preto, SP: FCFRP/USP, 2010. Dissertao (Mestrado em cincias) Programa de Ps-Graduao em Cincias Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo, 2010. OLIVEIRA, G.K.; RAISER, A.G.; OLSSON, D.; SALBEGO, F.Z..; MARINS, D.B.; DEZENGRINE, R.; SANTOS JNIOR, E.B.; RAPPETI, J.; TRINDADE, L.B.; TOGNOLI, G.K.; PIPPI, N.L.; SAUSEN,L. Clulas tronco mononucleares autlogas e

54

protena ssea morfogentica na cicatrizao de defeitos tibiais experimentais induzidos em ces. Arq.Bras.Med.Vet.Zootec., v. 62, n. 1, p. 72-79, 2010.

PAPICH, M.G. Manual Saunders Teraputico Veterinrio, 2ed, So Paulo: MedVet, 2009.

PAPICH, M.G. Manual Saunders: Teraputica Veterinria.2.ed. So Paulo: MedVet, 2009 p.202-206. PEREIRA, A.L.C.; BOLZANI, F.C.B.; STEFANI, M.; CHARLN, R. Uso sistmico de corticosteroides:reviso de literatura. Medicina Cutanea Ibero-Latino-America. v.2, n.35, p.35-50, 2007. PINTO FILHO, S,T,L; TREICHEL, T.L.E.; ARAMBURU JUNIOR, J.S.; ROSA, M.B.; DALMOLIN, F.; BRUN, M.V.; KRAUSE, A.; PIPPI, N.L. Clulas tronco mesenquimais adultas: caractersticas e aplicaes experimentais em animais. Veterinria e Zootecnia. v.20, p.49-59, 2013.

ROMO, F.G.; ANTUNES, M.I. Hipoadrenocorticismo em ces: Reviso. Veterinaria e Zootecnia, v.1, n.19, p. 044-054, mar., 2012. SAMUELSON, D.A. Tratado de Histologia. Rio de Janeiro: Elsevier. 2007. p.398-402.

SCOTT, D.; MILLER, W.; GRIFFIN, C. Muller & Kirk. Dermatologia de pequenos animais.Rio de Janeiro:Interlivros, p. 1130, 1996.

SCHWINDT, T.T.; BARNAB, G.F.; MELLO, L.E.A.M. proliferar ou diferenciar? perspectivas de destinos das clulas tronco. J.Bras.Neurocirurg. v. 16, n. 1, p. 13-19, 2005. SEMEDO P, COSTA MC, CENEDEZE MA, MALHEIROS DMAC, SHIMIZU MHM, SEGURO AC, PACHECO-SILVA, A, CMARA, NOS, et al. Papel imunossupressor e remodelador das clulas tronco mesenquimais em um modelo experimental de doena renal crnica. Einstein. 2009;7(4):469-79. SILVA, R.; ALMEIDA JNIOR, G. S., CURY, J. R. M., AMARAL, J. B., PERENHA, R. A., LOCATELLI, L.; MATIAS, V.; SACCO, S. R. Leucograma de estresse. Revista Cientifica Eletrnica de Medicina Veterinria. ano. VI, n.11, jul., 2008. SIMES, J.C.; BATTAGLIN, F.S.; OUTI, D.N.E. Aplicao tpica de glicocorticoides e avaliao de aderncias intraperitoneais em ratos.Rev.Med.Res. v. 12, n. 3 e 4, p. 118-123, 2010. SPINOSA, H.S.; GRNIAK, S.L.; BERNARDI, M.M. Farmacologia aplicada Medicina Veterinria. 5.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011.

SPINOSA, S. H. Farmacologia aplicada a Medicina veterinria. 2.ed. Rio de Janeiro.

1999.

TEIXEIRA MW, REZENDE CMF. Imunossupresso e transplantes: perspectivas atuais e futuras. Medvep: Rev Cient Med Vet Pequenos Anim Anim Estim. 2004;2(7):205-10.

55

TENIUS, F.P.; BIONDO-SIMOES, M.L.; IOSHII, S.O. Efeitos do uso crnico da dexametasona na cicatrizao de feridas cutneas em ratos. Anais Brasileiros de Dermatologia, v.2, n.82, p.141-149, 2007.

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