diferenças genotípicas durante o cultivo in vitro e in vivo de variantes e não variantes...
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Congresso Regional de Biotecnologia
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Biotecnologia Vegetal
DIFERENÇAS GENOTÍPICAS DURANTE O CULTIVO in vitro E in vivo DE
VARIANTES E NÃO VARIANTES SOMACLONAIS DE BANANEIRAS ‘PRATA-ANÃ’ COM A UTILIZAÇÃO DE RAPD1
Guilherme Araújo Lacerda2, Antônio Chalfun-Junior
2, Juscélio Clemente de Abreu
3 e
Luciano Vilela Paiva2
1LCBM e UFLA
2Laboratório Central de Biologia Molecular – Universidade Federal de Lavras
3Laboratório de Pesquisa I – Universidade Vale do Rio Verde
A produção de bananas é de vital importância para centenas de milhões de pessoas em países
em desenvolvimento, por quais, aproximadamente 90% do total produzido é utilizado como
alimento pelo consumo doméstico in natura. Há uma grande necessidade de se obter
variedades geneticamente melhoradas, garantindo uma produção sustentável e
ambientalmente segura, pois, a banana possui notável papel sócio-econômico em países em
desenvolvimento como o Brasil. A variação somaclonal pode ser uma variação fenotípica de
origem genética, ou seja, uma variação cromossômica que se torna herdável nas gerações
seguintes, ou epigenética, que é uma variação transitória devido ao estresse fisiológico que o
material sofre quando entra na cultura in vitro. Com a utilização da técnica de
micropropagação, mudas de bananeiras provenientes de cultura de tecidos são produzidas e
colocadas à disposição do agricultor. Ainda hoje, a deficiência na identificação das plantas
variantes, para alguns cultivares regionais de bananeira, é responsável pela colocação no
mercado de mudas de qualidade duvidosa, trazendo prejuízos aos agricultores devido à
ocorrência de alta taxa de variação somaclonal. Os marcadores RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA) representam um marco na análise genética por se tornarem um processo
de análise molecular rápido e de custo relativamente reduzido, tornando-se bastante acessível
para se obter informações sobre a variabilidade genética. A identificação de marcadores
permite que a definição da composição genômica de uma planta seja feita em estágio de
plântula ou in vitro, contornando os problemas que envolvem a lenta propagação da planta, o
longo ciclo da cultura (18-24 meses) e o grande espaço requerido. O objetivo deste trabalho
foi identificar marcadores moleculares RAPD para caracterizar os cultivares micropropagados
de ‘Prata-anã’ em relação aos seus variantes somaclonais que apresentam a característica
gigantismo, em condições in vivo e in vitro. Foram utilizadas bananeiras micropropagadas
‘Prata-anã’, repicadas a partir de plantas sabidamente normais e a partir de variantes
somaclonais previamente determinados, de acordo com as características morfológicas como
altura das plantas. Como se tratavam de três plantas variantes distintas elas foram designadas
como PI, PII e PIII, sendo as não-variantes designadas como PA – ‘Prata-anã’. A extração,
bem como a quantificação do DNA, foi realizada de acordo com metodologia descrita por
Lacerda (2006). A amplificação foi realizada sob condições descritas por Guimarães (2005).
Foram testados 28 oligonucleotídeos (primer), QIAGEN® da série Operon (OPH-13, OPJ-04,
OPJ-10, OPJ-13, OPP-05, OPP-06, OPP-08, OPP-09, OPP-17, OPN-01, OPN-02, OPN-03,
OPN-05, OPN-07, OPN-13, OPN-17, OPN-19, OPN-20, OPM-02, OPM-04, OPM-05, OPM-
07, OPM-12, OPM-13, OPM-14, OPM-19, OPU-06, OPU-08) onde 4 (OPH-13, OPJ-04,
OPN-05, OPM-13) demonstram-se marcadores moleculares eficientes na amplificação de
fragmentos polimórficos na diferenciação da PA de suas variantes somaclonais (PI, PII e PII).
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Alguns primers apresentaram perfil diferente entre as plantas in vitro e in vivo apesar de
ambos serem oriundos da micropropagação. O primer OPJ-04 (5’-CCGAACACGG-3’), não
apresentou bandas polimórficas para os diferentes materiais in vitro, porém conseguiu
distinguir a PA in vivo das variantes também in vivo. O mesmo resultado ocorreu ao
utilizarmos o primer OPM-13 (5’-GGTGGTCAAG-3’), onde visualizamos a banda
polimórfica presente na PA in vivo e ausente nas demais variantes também in vivo. Além
disso, foi observada também uma banda presente em todas as plantas in vivo e ausente em
todas as plantas in vitro. Este resultado também foi confirmado utilizando-se o primer OPH-
13 (5’-GACGCCACAC-3’). O primer OPN-05 (5’-ACTGAACGCC-3’) apresentou um
polimorfismo que diferiu a PA das variantes, em condições in vitro, além de diferenciar as
plantas PA e PI de PII e PIII, todas in vitro, bem como a PIII in vitro das demais. Baseado nos
resultados obtidos com técnica RAPD, podemos inferir que uma possível mutação de bases
(inserção, deleção, alteração) pode estar acontecendo durante o processo de aclimatação das
plantas. Este fato mostra-se coerente, sugerindo que os variantes somaclonais para
características gigantismo das bananeiras ‘Prata-anã’, não ocorrem de maneira uniforme no
genoma. Os resultados encontrados com o primer OPJ-04 não puderam ser reproduzidos com
respectiva fidelidade comprovando um problema com este marcador,sendo esta uma das
muitas desvantagens do marcador RAPD, o que inclui ainda a dominância natural do
marcador sistêmico. Acessos de banana apesar de exibirem características morfológicas
diferentes, apresentam estabilidade genética ao decorrer de seu genoma. Assumimos, porém
que, a análise por RAPD é sensível a mudanças durante a amplificação em PCR (Polymerase
Chain Reaction). Entretanto, os resultados aqui obtidos foram gerados a partir de ensaios em
duplicata. O sucesso do uso de marcadores RAPD requer conhecimento de fatores que
influenciam na amplificação do DNA. Baseados nos resultados obtidos com esses primers,
conclui-se que bananeiras normais e variantes cultivadas in vitro e in vivo, podem ser
diferenciadas através de marcadores RAPD.
Palavras-chave: Musa, marcadores moleculares, mutação