DIAGNÓSTICO MOLECULAR E EPIDEMIOLOGIA DAS ESPÉCIES DE Ehrlichia E Anaplasma EM CÃES DE UMA POPULAÇÃO HOSPITALAR

DO HOSPITAL VETERINÁRIO DA UEL

Rafaela Guedes Buosi (PIBIC/CNPq-UEL), Denise do Amaral Gomes Nascimento (Mestrado Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da UEL), Gislaine Cristina Ferreira da Silva (Mestrado Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da UEL), Dennys Fernandes Higashi (Fundação Araucária-UEL), Daniel Ribeiro Belussi (Fundação Araucária/IC-UEL), Rafael Felipe da Costa Vieira (Pesquisador CNPq, Doutorando em Ciência Animal – UEL) Odilon Vidotto (Orientador) email: vidotto@uel.br

Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Medicina Veterinária Preventiva – Londrina – PR.

Palavras-chave: Ehrlichia canis, Anaplasma platys, PCR, cães.

Resumo

O objetivo deste trabalho foi padronizar uma técnica de PCR para determinar a ocorrência de espécies de Ehrlichia e Anaplasma em cães atendidos no Hospital Veterinário da UEL. Foram coletados 2 ml de sangue de uma de 217 cães que apresentavam alterações hematológicas sugestivas da infecção. Após extração do DNA, as amostras foram submetidas à PCR com primers do gene dsb que amplificam um segmento de 409pb do gênero Ehrlichia (Dsb330 F e Dsb729 R). As amostras positivas para gênero foram submetidas a um segundo PCR, com os primers Canis F e Ega1ur R que amplifica um segmento de 358pb específico para E.canis. Para Anaplasma platys as 217 amostras foram submetidas à PCR com os primers Platys R e Platys F que amplificam um segmento de 504pb. Das amostras inicias 25 (11,52%) foram positivas na PCR de gênero e destas, todas (11,52%) foram positivas para E. canis e apenas uma amostra (0,46%) foi positiva na PCR para A. platys, indicando que havia infecção mista em um dos animais. Estes resultados demonstram que a E.canis é muito mais freqüente em cães da região de Londrina do que a A. platys.

Introdução

Na família Anaplasmataceae estão incluídos os gêneros Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia e Wolbachia. As espécies pertencentes aos gêneros

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Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia, são do grupo das α-protobactérias, intracelulares obrigatórias, gram-negativas, pleomórficas e dividem-se por fissão binária (Dumler et al., 2001).Ehrlichia spp e Anaplasma spp são parasitas de células sanguíneas e algumas espécies acometem os cães, eqüinos e o homem. As erliquioses apresentam manifestações clínicas vagas e variadas podendo mimetizar várias outras doenças e é por esse motivo que, na maioria dos casos positivos, os clínicos enfrentam dificuldades para diagnosticar essa doença. O diagnóstico pode ser feito pela observação de mórulas no citoplasma de leucócitos e plaquetas através do esfregaço sanguíneo corado pelo Giemsa, porém esse método é demorado e pouco sensível. A reação de imunofluorescência indireta possibilita o diagnóstico da infecção, porém não permite a distinção entre as espécies porque existe reatividade cruzada entre elas. Já a PCR é um método sensível onde é possível a correta determinação de espécie.O fato das infecções com mais de uma espécie de Anaplasmataceae serem cada vez mais comuns em áreas endêmicas deve-se a pouca informação que se tem atualmente sobre a prevalência de erliquioses humanas e caninas no Brasil. A PCR é uma técnica sensível e específica que através da amplificação de segmentos específicos de genes de um determinado microorganismo, permite a correta identificação da espécie ou espécies que estão parasitando um determinado indivíduo e, ao contrário da sorologia, indica infecção presente não sendo positiva em caso de exposição prévia.O objetivo deste trabalho foi padronizar uma técnica de PCR para identificar as amostras positivas dos gêneros Ehrlichia e Anaplasma e verificar quais as espécies estão presentes na população canina atendida no Hospital Veterinário da UEL.

Materiais e Métodos

Amostras

Foram coletados em tubos com EDTA, 2 ml de sangue de 217 cães selecionados que apresentavam pelo menos um dos seguintes critérios de inclusão: anemia, trombocitopenia, leucopenia ou presença de mórulas no sangue periférico.

Identificação das espécies de EhrlichiaExtração do DNA

As amostras de sangue para análise de DNA foram congeladas a - 20°C até a extração. O DNA foi extraído do sangue utilizando-se o kit comercial QiAMP (Qiagen, Chastworth, California, EUA) (BREITSCHWERDT et al. 1998) e armazenado a - 20°C para posterior análise.

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PCRApós extração do DNA, as 217 amostras foram submetidas à PCR com primers do gene dsb que amplificam um segmento de 409 pb do gênero Ehrlichia (Dsb330 F e Dsb729 R). As amostras positivas para gênero foram submetidas a um segundo PCR, com os primers Canis F e Ega1ur R que amplifica um segmento de 358pb específico para E. canis. Para Anaplasma platys as 217 amostras foram submetidas à PCR com os primers Platys R e Platys F que amplificam um segmento de 504 pb. As amplificações foram realizadas num termociclador (GeneAmp® PCR System 9700) usando-se técnicas conhecidas. Para a confirmação das espécies identificadas na PCR, as amostras de DNA amplificadas serão submetidas ao Sequenciamento Genômico.

Resultados e Discussão

Das 217 amostras selecionadas, 25 foram positivas na PCR de gênero e destas, todas (11,52%) foram positivas para E. canis e apenas uma amostra (0,46%) foi positiva na PCR para A. platys, indicando que em um dos animais havia infecção tanto de E.canis quanto de A.platys. Estes resultados demonstram que a E.canis é muito mais freqüente em cães da região de Londrina do que a A. platys que foi detectada pela primeira vez na região. Um levantamento sorológico e PCR realizados em uma população hospitalar semelhante há alguns anos atrás (DAGNONE et al., 2003 e TRAPP et al., 2005) apresentaram índices de infecção mais elevados para E. canis em Londrina. Dagnone et al., 2003 encontraram 23% de cães anêmicos, pancitopênicos ou infestados por carrapatos positivos na PCR para E. canis. Valores semelhantes (23%) foram encontrados por Trapp et al., 2006, pela sorologia (ELISA) para E. canis em cães atendidos na rotina hospitalar, randomicamente selecionado. Fatores ambientais ou sazonais tais como época de coleta das amostras, infestação por carrapatos e técnicas diferentes, podem ter influenciado na divergência dos resultados que foram inferiores neste estudo.

Conclusões

A PCR mostrou ser um método de diagnóstico muito mais sensível que o clássico esfregaço sanguíneo corado pelo GIEMSA, uma vez que apenas uma amostra dentre as 217 havia sido positiva neste teste. Através da PCR também foi possível identificar pela primeira vez, na região de Londrina, a espécie A. platys e constatar que E.canis é a espécie prevalente na região.

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Agradecimentos

Ao CNPq, CAPES, Fundação Araucária, PROPPG e Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da UEL, pelo apoio financeiro, bolsas de IC, Mestrado, Doutorado e Produtividade em Pesquisa.

Referências

1. BREITSCHWERDT, E. B.; HEGARTY, B. C.; HANCOCK, S. I. Sequential evaluation of dogs naturally infected with Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii, or Bartonella vinsonii. Journal of Clinical Microbiology 36:2645-51. 1998

2. DAGNONE, A. S.; MORAIS, H. A.; VIDOTTO, M. C.; JOJIMA, F. S.; VIDOTTO; O. Ehrlichiosis in anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs from a hospital population in South Brazil. Veterinary Parasitology, v. 117, p. 285–290, 2003.

3. DUMLER, J. S.; BARBET, A. F.; BEKKER, C. P. J.; DASCH, G. A.; PALMER, G. H.; RAY, S.T.; RIKIHISA, Y.; RURANGIRWA, F. R. Reorganization of genera in families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and “EGH agent” as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 51, p. 2145-2165, 2001.

4. TRAPP, S.M.; DAGNONE, A.S.; VIDOTTO, O.; FREIRE, R.L.; AMUDE, A.M.; MORAIS, H.S.A. Soroepidemiology of canine babesiosis and ehrlichiosis in a hospital population. Veterinary Parasitology, Amsterdam, v.140, p. 223 – 230, 2006a.

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