DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DAS INFECÇÕES POR DENGUE,

CHIKUNGUNYA E ZIKA VÍRUS

Prof. Dra. Edna Maria Vissoci Reiche

Imunologia Clínica

Diagnóstico Molecular

PAC/CCS/UEL

Dengue• vírus da dengue

• Flavivírus – RNA vírus • Grupo dos Arbovírus (Arthopod borne virus)

• Sorotipos DEN-1,DEN-2, DEN-3 e DEN-4

• Geneticamente e antigenicamente diferentes• DEN-2: mais imunogênico

• Diferentes genótipos para cada sorotipo

Diferenças clínicas entre sorotipos• DEN1

• maior taxa de morbidade e • menor taxa de mortalidade

• DEN2• maior variabilidade na patogenicidade• alguns genótipos parecem produzir pouca ou nenhuma

doença• outros genótipos podem apresentar doença grave (FHD)

• DEN 3• Infecções similares ao DEN1

• DEN 4• Infecções similares ao DEN2

• DEN 5• não identificado no Brasil (epidemia na Malásia)

Organização genômica do vírus da dengue

Dengue: Testes Laboratoriais

• Específicos Diretos: • Isolamento viral• Detecção do RNA viral : RT-PCR• Pesquisa de antígeno NS1

• Específicos Indiretos: • Pesquisa de anticorpos IgM e/ou IgG• IHA• Teste de Neutralização• ELISA

Isolamento viral

• Inoculação em culturas celulares, animais e mosquitos

• Detecção de antígenos virais (ELISA ou RIE)

• Detecção do genoma viral (RT-PCR)

Isolamento viralCultura de células

Coleta : Até o quinto dia

Amostra: Sangue ou outros fluídosorgânicos, fragmento de órgãos emacerado de mosquito

Procedimento: frasco estéril semanticoagulante

Método: Cultura celulares emlinhagens C6/36 provenientes domosquito Aedes

Tempo: 6 a 10 dias

Diagnóstico da dengue

Resposta imune na dengue

30 a 60 dias

Teste rápido para Dengue (IgG e IgM) –

Imunocromatografia (para 4 sorotipos);

Sensibilidade e especificidade depende do laboratório

Sens: 96 - 99% Esp: 98%

Diagnóstico laboratorial específicoSorologia - Pesquisa de IgM

Coletar no 7º dia de início da doença, IgM persiste por 1 a 2 meses (s/n repetir entre o 11º e 30º dia do início dos sintomas)

> 75% de positividade entre 7 a 10 dias

> 99% de 10 a 20 dias

IgG + no 9º dia na primo-infecção e no 1º dia na re-infecção

Diagnóstico laboratorial específico

Detecção do vírus ou antígenos virais:

Detecção de antigenemia - NS1

Reação em cadeia de polimerase (RT-PCR) - genoma viral

Isolamento viral - define sorotipo

Imunohistoquímica - antígenos virais

Indicação: casos graves (nos primeiros 3-5 dias de evolução)

Teste rápido Ag NS1 - Imunocromatografia

CT

Teste positivo

Kit – “COMBO”AgNS1 + IgM + IgG

Dengue: Testes Laboratoriais

• INESPECÍFICOS

• Hemograma• Hematócrito • Plaquetas• Albumina• Função hepática: AST, ALT• Urina I

Dengue Grave (Febre hemorrágica do dengue

Síndrome de choque)

• Hematócrito: aumento súbito de 20% do valorhabitual do paciente em 24 horas

• Plaquetas: < 100.000/mm3

• Hipoproteinemia• Elevação das aminotransferases AST e ALT• Elevação de uréia• Hiponatremia• Redução da fração C3 do complemento

Dengue Grave(Febre hemorrágica do dengue

Síndrome de choque)

• CID• Redução dos fatores de coagulação

• V, VII, IX e X

• Prolongamento do tempo • Protrombina

• Tromboplastina parcial

• Elevação dos produtos de degradação da fibrina

Prova do Laço

• (PAS +PAD)/2: manguito insuflado

• Adulto: 5 mim ( 20 petéquias)

• Criança: 3 min (10 petéquias)

• Presença de petéquias

Área de 2,5 x 2,5 cm

Vírus Chikungunya (CHIKV)

RNA vírusFamília: Togaviridae (mesmo da rubéola)Gênero: Alphavírus

Apenas um subtipo causa a doença

CHKV

• Diagnóstico laboratorial: sangue ou soro, LCR

• Métodos diretos:• Isolamento do vírus• Detecção do RNA viral: RT-PCR

• Métodos indiretos:• Detecção de anticorpos IgM e/ou IgG: ELISA, IHA

• Aumento de 4 vezes o título acs entre as amostras nas fases aguda (preferencialmente primeiros oito dias de doença) e convalescente, preferencialmente de 15 a 45 dias após o início dos sintomas, ou 10-14 dias após a coleta da amostra na fase aguda

• Teste de neutralização por redução de placas (PRNT)

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

• ISOLAMENTO DO VÍRUS (C636)

• RT-PCR (fase aguda da doença – até D8)

• DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO:

• FASE AGUDA: após D5• FASE CONVALESCENTE: 15 –45d

• ELISA: Anticorpos anti-CHIKV (após D7)

• INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO (5º - 7º d)

FEBRE CHIKUNGUNYA

Teste de Neutralização por Redução de Placas de Lise – PRNT

• Plaque Reduction Neutralization Test • Método sorológico de quantificação dos anticorpos

neutralizantes. • Teste referência (padrão) • Avaliação resposta vacinal

• fornece a melhor correlação para proteção da infecção,

• Mais sensível do que os testes IH e ELISA.

Exames inespecíficos

• Hemograma• Leucopenia• Linfocitose

• Trombocitopenia: rara

• VHS elevada

Diagnóstico diferencial

• Outras enfermidades a considerar são: • malária • leptospirose • infecções por outros Alphavírus (ex. vírus Mayaro)• artrite pós-infecciosa (Chlamydia, Shigella, Neisseria, febre

reumática), • artrite reumatoide juvenil, • mononucleose infecciosa • primo-infecção por HIV. • Região Amazônica: a malária e febre Mayaro são endêmicas

e fazem parte do diagnóstico diferencial obrigatório.

Zika vírus (ZIKV)• É um vírus RNA pertencente à família Flaviviridae e

causa quadro clínico semelhante à dengue.• O Brasil é um dos países com maior diversidade de

flavivírus

• DEN 1-4, • vírus da encefalite japonesa • vírus da febre amarela • vírus da hepatite C

Serviços de referência no Paraná para atendimento de casos suspeitos de MICROCEFALIA e/ou outras

malformações do SNC

• Serviços de referência para as respectivas macrorregiões de saúde para o encaminhamento das crianças que ao nascimento apresentarem microcefalia.

• Macrorregional Norte: • Hospital Universitário de Londrina (HU – UEL);

• Macrorregional Noroeste: • Hospital Universitário de Maringá (HU – UEM);

• Macrorregional Oeste: • Hospital Universitário do Oeste do Paraná (HUOP);

• Macrorregional Leste: • Hospital Infantil Waldemar Monastier; • Hospital Infantil Pequeno Príncipe.

Esquema proposto para diagnóstico laboratorial do ZIKAV por técnicas de isolamento, RT-PCR e sorologia (IgM/IgG)

Sorologia X PCR Zika

Pode ocorrer reação cruzada com outros flavivírus, como o da dengue, febre do Nilo Ocidental e febre amarela

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO

ISOLAMENTO VÍRUS (C636)

D1– D5 RT PCR TR

DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO

NOVOS TESTES SOROLÓGICOS – somente em laboratórios de referência

Reação cruzada: dengue, febre amarela

ZIKA

Teste rápido ZIKA- V

• 15 fevereiro 2016

• ANVISA concedeu registro de um teste rápido para detecção do zika vírus.

• Laboratório canadense Biocan Diagnostics

• Detecta Anticorpos em até 20 minutos

ZIKA-V

• alterações típicas laboratoriais associadas com a infecção são escassas,

• leucopenia, trombocitopenia • ligeira elevação da LDH sérica, gama-GT• ligeira elevação de marcadores de atividade

inflamatória • proteína C reativa, fibrinogênio e ferritina

Como diferenciar DEN, CHKV e ZIKV

• DEN: • PCR para dengue• Teste rápido para Dengue• Sorologia para Dengue IgG, IgM e antígeno NS1

• CHKV • PCR qualitativo para Chikungunya• Sorologia para Chikungunya

• ZIKV• PCR para Zika vírus

Sorologia para Zika Vírus IgG e IgM quantitativos