Métodos para detecção de antígenos e

anticorpos e aplicações no diagnóstico

imunológico

Prof.Esp. Marcos Valério Zschornack

INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO

Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico

RESPOSTA DE ANTICORPOS• EspecificidadeHabilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag.• QuantidadeN° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção.• IsotipoDetermina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados.• AfinidadeForça de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário.• Avidez: força total de ligação, nos dois sítios.

Avidez x Afinidade

INTERAÇÕES Reações reversíveis.

Ligações não covalentes:- Pontes de hidrogênio- Interações hidrofóbicas- Interações de Van der Waals- Ligações iônicas

MÉTODOS

1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados• RIA• ELISA • Imunofluorescência• Western Blotting

MÉTODOS

• PRECIPITAÇÃO- Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese• AGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de Coombs• IMUNOENSAIOS- RIA- ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo- Western Blotting

APLICAÇÕES

- Pesquisa - Diagnóstico- Soroepidemiologia

PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO• Precipitação:Formação de complexos Ag/Ac.

• Aglutinação:É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.

• As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO• Interação entre Ac e Ag solúvel • Ac precisa ser bivalente• Ag precisa ser bi ou polivalente• A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que

cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

PRECIPITADO

É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações

dos mesmos. Observe abaixo:

Zona de excesso de anticorpo

Zona de equivalência

Zona de excesso de antígeno

+ - -+- -

Anticorpo livre

Antígeno livre 100%-- Percentual de complexo imune precipitado

Quantidade de antígeno adicionado

TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL

IMUNODIFUSÃO

• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

Imunodifusão Dupla:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac

IMUNODIFUSÃO DUPLA

Ac

Ag Ag

Ac

Ag Ag

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Ac

Ag Ag

Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose

• As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação:

• Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante

• Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo.

• O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em torno do orifício.

IMUNODIFUSÃO RADIAL

Poços onde são colocados padrões e amostras a serem

dosados Agarose contendo anticorposanti-IgG humana

Halo de precipitação IgG – anti-IgG

Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas.

• Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.

• As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.

• Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.

• Ag e Ac formam arcos de precipitação.

IMUNOELETROFORESE

+ -

Ag

Ag

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna

canaleta

2- Anti-soro na canaleta

canaleta

3- Difusão e precipitação

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO• Ac + Ag multivalente particulado • Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-

quantitativo)• Pó-zona: excesso de Ac• Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica

(repulsão)• Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex

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2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA

1) Amostra de sangue na placa teste:

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

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3) Controle negativo:

4) Mistura-se:

AGLUTINAÇÃO DIRETA

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5) Leitura do resultado:

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.

negativo positivo

AGLUTINAÇÃO DIRETA

AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: • As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi

(ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

• O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa.

• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço.Aglutinação Positiva

Negativa

Ag solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

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Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO

+Soro anti - hCGUrina

São incubados e colocados numa placa

Adicionam-se Partículas revestidas com hCG

Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.

Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial

Resultado negativo:(ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

TESTE DE COOMBS• Ac antiimunoglobulinas (Robert

Coombs);• DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;• Não aglutinam os eritrócitos;• Direto: Ac ligados aos eritrócitos

fetais;• Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes

no soro materno. • Permite detectar incompatibilidades

Rh, prevenindo contra DHRN.

IMUNOENSAIOS• Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos,

isótopos)• Tipos:- RIA- ELISA- IFA / CITOMETRIA DE FLUXO- WESTERN BLOTTING

IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Princípio da técnica: • Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a

uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.

• Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.

• A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).

• Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.

Microscópio de fluorescência com epiluminação

luz UV atinge o ma- terial examinado

fluorescência emitida chega ao observador

TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

IFA direta:• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina,

nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.

IFA indireta:• Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como

a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.

• É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade

(fluorescência é mais intensa) e especificidade.

APLICAÇÃO DA TÉCNICA

IMAGENS

CITOMETRIA DE FLUXO • Ferramenta que detecta e quantifica células individuais

passando em uma corrente através de um feixe de Laser.• Separa as células por fluorescência ativada.• Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo

diferente.• É um teste qualitativo e quantitativo.

APLICAÇÕES• Tipo de linfócitos;• Quantidade, tamanho, granulosidade;• Isolamento de populações celulares;• HIV

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

• O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.

• O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).

• A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro.

• Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.

Fosfatase alcalinaPeroxidase

B-galactosidase

TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

DIRETO OU SANDUÍCHE

INDIRETO PLACA UTILIZADA

ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa

Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo

ELISA Competitivo

RADIOIMUNOENSAIO – RIE Marcações:

I125: emite raios gama H3: raios beta

Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g)

Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações:

Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios,

proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa

WESTERN BLOTTING• Eletroforese de

proteínas.• Identifica

antígenos ou anticorpos.

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING

FIM