determinação de gêneros de fitobactérias

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSADEPARTAMENTO DE FITOPATOLOGIALABORATÓRIO DE BACTERIOLOGIA DE PLANTAS36.571-000 VIÇOSA - MG – BRASIL

ESTRATÉGIA PARA DETERMINAÇÃO DO GÊNERO NO CASODE FITOBACTÉRIAS NÃO-FASTIDIOSAS MAIS COMUNS

Reginaldo da Silva RomeiroProfessor Titular da UFV

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CONSIDERAÇÕES INICIAIS

Existem muitos gêneros de organismos procariotas capazes de incitar enfermidades emplantas, todos considerados genericamente como bactérias, para efeitos práticos, tais comobactérias propriamente ditas, rickettsias, espiroplasmas, micoplasmas, clamidias, estreptomicetosetc (ROMEIRO, 1995). Habitualmente eles são divididos em fastidiosos e não-fastidiosos(SCHAAD, 1988) e diferençados conforme explicitado na Figura 1. Os procariotasfitopatogênicos fastidiosos (parasitas obrigatórios ou que demandam meios de culturaextremamente complexos para serem cultivados "in vitro") não são objeto de estudo nestadisciplina, mas podem ser distinguidos um dos outros com base em características como asmostradas na Figura 2.

PROCARIOTASFITOPATOGÊNICOS

FASTIDIOSOS

PAREDE CELULARPRESENTE

RICKETTSIAS

Bortonela

PAREDE CELULARAUSENTE

CÉLULAS HELICOIDAIS

ESPIROPLASMAS

Spiroplasma

CÉLULAS TIPO COCÓDE,BASTONETE ETC.

MICOPLASMAS

Micoplasma

Figura 2 - Algumas características fundamentais que permitem diferençar os principais grupos deprocariotas fitopatogênicos fastidiosos. Adaptado de SCHAAD (1988)


PROCARIOTAS FITOPATOGÊNICOS

FASTIDIOSOS

Rickettsias, Micoplasmas,

etc

NÃO FASTIDIOSOS

GRAM-POSITIVOS

Bacillus sp.Clostridium sp.

NÃO-ESPOROGÊNICOSPLEOMÓRFICOS

GRUPO CORINEFORME

GRAM-NEGATIVOS

INDUZEM

TUMORES

Agrobacterium sp.

NÃO INDUZEM TUMORES

ANAERÓBICOS FACULTATIVOS

Erwinia sp.

AERÓBICOS ESTRITOS

Pseudomonas sp.

ASPARAGINASE (-)FAT. DE CRESCIMENTO(+)

XANTHOMONADINAS (+)

Xanthomonas sp.

Clavibacter sp.Rhodococcus sp.Arthrobacter sp

Corynebacterium sp.

ESPOROGÊNICOS

NÃO - PLEOMÓRFICOS

ASPARAGINASE (+)FAT. DE CRESCIMENTO (-)XANTOMONADINAS (-)

Figura 1: Características básicas para diferenciação de procariotas fitopatogênicos


Os procariotas não-fastidiosos, ou seja, aqueles que podem ser facilmente cultiváveis emmeios de cultura rotineiros, englobam estreptomicetos, alguns gêneros de importância secundáriae os gêneros tradicionalmente estudados por bacteriologistas de plantas.

No que tange aos gêneros de importância secundária, menciona-se, por exemplo, Bacilluse Clostridium que abrigam algumas poucas espécies incitadoras de enfermidades em plantas,principalmente apodrecimento de órgãos de reserva (SCHAAD, 1988). Essas espécies ainda nãoforam relatadas no Brasil, e os problemas fitopatológicos por elas incitadas não se revestem degrande importância. Há também relatos, mais de interesse acadêmico que prático, de outrosgêneros de bactérias não-fastidiosas incitando esporádicas enfermidades em plantas, tais comoAcetobacter sp. (lesões e frutos de maçã), Actinomyces sp. (sarna da batatinha), Bacillus sp.(lesões em sementes de soja), Serratia (apodrecimento de raízes de alfafa) e inúmeros outros(BRADBURY, 1986; LELLIOT & STEAD, 1987; YOUNG et alii, 1977). Desses gêneros deocorrência pouco comum também não trataremos ao nível da presente disciplina.Adicionalmente, Streptomyces scabies, agente etiológico da sarna da batatinha, também é umprocariota fitopatogênico não-fastidioso. Contudo, apesar de possuir grande importânciaeconômica e fitopatológica, é mais estudado por micologistas, por formar pseudomicélio e poruma questão de tradição.

Assim, apenas os gêneros clássicos de fitobactérias, cujas espécies são não-fastidiosas eincitantes de importantes enfermidades de plantas no Brasil, serão objetos de estudo nestadisciplina, a saber: Agrobacterium, espécies do "Grupo Corineforme" (antigo gêneroCorynebacterium), Erwinia, Pseudomonas e Xanthomonas.

Esses podem ser diferenciados com base em algumas características simples como asexplicitadas no Quadro 1.

QUADRO 1 - Principais características utilizáveis para a diferenciação de gêneros defitobactérias, em conformidade com FAHY & PERSLEY (1983), KRIEG &HOLT (1984), SNEATH et alii, 1984; LELLIOTT & STEAD ( 1987), SCHAAD(1988), KLEMENT et alii (1990) & ROMEIRO (1995)

CARACTERÍSTICA DIFERENCIAL GÊNERO GRUPO GÊNERO GÊNERO GÊNERO

CONSIDERADA Agrobacterium Corineforme Erwinia Pseudomonas Xanthomonas

Crescimento em meios de rotina

Forma de bastonete + + + + +

Reação de Gram - + - - -

Utilização de asparagina + + + + -

Produção de xantomonadinas - - - - +

Anaerobiose facultativa - - + - -

Aerobiose + + + + +

Indução de tumores + - - - -

(1) = Algumas espécies apresentam pleomorfismo, variando de bastonetes típicos a cocóides (KRIEG & HOLT,1984)

(2) = Há relato de algumas espécies capazes de utilizar asparagina (STARR & WEISS, 1941; DYE, 1978 eSIQUEIRA, 1988)

(3) = Uma espécie (Pseudomonas syringae pv. savastanoi) induz nódulos aéreos em oliveira (KRIEG & HOLT,1984) embora a gênese da proliferação de tecido seja de origem hormonal e não neoplásmica.


ESTRATÉGIA PARA DETERMINAÇÃO DO GÊNERO FITOPATOGÊNICO

De acordo com o raciocínio sumarizado na Figura 3, primeiro é preciso primeirodeterminar com segurança se as alterações mórbidas constatadas na planta têm uma origembiótica e são de etiologia bacteriana, o que se consegue através do teste de exsudação em gota.

TESTE DE EXSUDAÇÃO

PLANTADOENTE

ISOLAMENTO

INOCULAÇÃO

��

CONFIRMAÇÃO DEPATOGENICIDADE

DETERMINAÇÃODO

GÊNERO

DETERMINAÇÃODA

ESPÉCIE

Figura 3: Sequência lógica de eventos para se determinar gênero e espécie de uma bactériafitopatogênica

Confirmada a etiologia bacteriana, é necessário realizar tentativas para isolar o patógenoe confirmar que as culturas surgidas em placa de isolamento realmente são fitopatogênicas, o quese consegue com testes de fitopatogenicidade (HR e Inoculação artificial).

Concluídas essas três etapas, críticas e absolutamente essenciais, realizam-se os testesbioquímicos, tintoriais e biológicos mostrados no Quadro 1, chegando-se ao gênerofitopatogênico. Numa outra etapa, testes adicionais, mais complexos e em maior número sãoimplementados para a determinação da espécie.

Ao término de nossa determinação do gênero, se encontrarmos resultados diferentes dosexplicitados no Quadro 1, após exaustivas repetições no tempo e no espaço, devemos suspeitar deum novo gênero ou de um gênero fitopatogênico pouco comum de bactéria fitopatogênica nãofastidiosa, como os dos quais se mencionou inicialmente.


01.CRESCIMENTO EM MEIOS DE ROTINA

Meios de rotina são aqueles de uso no dia a dia de um laboratório de bacteriologia de plantas,fáceis de preparar, não muito complexos nem muito completos sob o ponto de vista nutricional.Cada laboratório costuma adotar um meio como padrão. Se a bactéria cujo gênero procura-sedeterminar cresce nesses meios ou em outros de composição semelhante, com certeza ela não éfastidiosa. Exemplos de 3 meios bacteriológicos comuns e de largo uso:

a) Meio 523 de KADO & HESKETT (1970)

Esse é o meio de rotina utilizado para isolamento, cultivo e manutenção de bactériasfitopatogênicas no Laboratório de Bacteriologia de Plantas da Universidade Federal de Viçosa eno da Universidade da Califórnia - Davis e tem a seguinte composição:

COMPONENTE QUANTIDADESacarose 10,0 gCaseína ácida hidrolisada 8,0 gExtrato de levedura 4,0 gK2HPO4 (anidro) 2,0 gMgS04.7H20 0,3 gAgar 15,0 gÁgua destilada l.000 ml

b) GYCA ("Glucose-yeast extract-Calcium carbonate-Agar)

COMPONENTE QUANTIDADEGlucose 5,0 gExtrato de levedura 5,0 gCaCO3 (Pó) 40,0 gAgar 15,0 gÁgua destilada l.000,0 ml

c) Agar-nutriente ou Nutriente-ágar

COMPONENTE QUANTIDADEExtrato de carne 1,0 gExtrato de levedura 2,0 gPeptona 5,0 gCloreto de sódio 5,0 gAgar 15,0 gÁgua destilada l.000 ml

Esse meio, muito usado também em para bactérias não-fitopatogênicas, pode ser


encontrado no comércio, liofilizado.

FORMA DE BASTONETE

Existem inúmeras maneiras de corar a célula bacteriana de modo a visualizá-la aomicroscópio ótico comum. Vamos utilizar o método de coloração simples com tinta nanquins, ummétodo negativo de coloração.

a)Preparo do esfregaçoDeposite na extremidade de uma lâmina uma gota de tinta Nanquim e misture nela, por

meio de alça de repicagem, pequena quantidade de crescimento bacteriano (ACKERMAN-BROWN, 1977). A seguir, com auxílio de outra lâmina, promova o espalhamento do esfregaço,conforme mostrado na Figura 4a.

b) FixaçãoNão é feita fixação, nem química nem física.

c) Reagentes e seu preparoO único reagente é a tinta Nanquim, de boa qualidade e não muito velha pois com o

tempo a suspensão tende a perder suas propriedades de colóide.

d) Procedimento para observação1. Aguarde o completo secamento, ao ar, do esfregaço2. Observe com objetiva de imersão3. Células bacterianas são visualizadas de cor branca num fundo amarronzado (Fig. 4b)

Figura 4: Método de coloração com tinta Nanquim para visualização e estudo de forma earranjamento de células bacterianas. (a) - Preparo do esfregaço, (b) - Aspecto visual deum campo microscópico

A B


REAÇÃO DE GRAM : MÉTODOS TINTORIAIS E ALTERNATIVOS

Saber realizar o teste de Gram está para o bacteriologista assim como saber tomar apressão arterial está para o médico cardiologista!

Essa técnica, de largo emprego em Microbiologia, foi idealizada por Christian Gram, em1848. Roux, em 1866, verificou que espécies bacterianas se comportavam diferentemente quantoà coloração de Gram e dividiu as bactérias em Gram-positivas e Gram-negativas (BROCK, 1974 ;GERHARDT, 1994; STANIER et alii, 1986). O método de Gram possui importância naidentificação, pois, das bactérias fitopatogênicas não-fastidiosas , apenas as do grupoCorineforme possuem espécies Gram-positivas. Simplificadamente, o procedimento consiste emcolorir a célula bacteriana com corantes básicos e descolori-la com solventes neutros (LOURES& GUIMARÃES, 1974).

Conforme explicita de modo esquemático a Figura 5, quando o esfregaço é coberto com asolução de cristal violeta, tanto as células Gram-positivas como as Gram-negativas absorvem ocorante e tornam-se roxas. O tratamento seguinte, que é a cobertura do esfregaço com lugol(solução de iodo), faz com que ambos os tipos de célula também absorvam o iodo e continuem decoloração roxa. No interior das células, o iodo reage com o cristal-violeta formando complexos depesos moleculares elevados e a partir deste ponto começa a diferença entre células Gram-positivae Gram-negativas. As células Gram-negativas têm sua parede celular mais permeável e o solventeneutro (etanol, por exemplo) consegue remover de seu interior o complexo iodo/cristal-violeta -com isto as células se descolorem e o esfregaço, antes roxo, fica incolor. Em contraposição, ascélulas Gram-positivas, de parede celular bem mais impermeável, o solvente não consegueremover de seu interior o complexo iodo/cristal-violeta. Por uma questão de visualização, ocorante final é safranina (contraste) - as células Gram-positivas não o absorvem pois já estãocoradas de roxo e assim permanecem e as Gram-negativas, descoloridas pelo solvente, oabsorvem e tornam-se vermelhas.


G+ G-ou IncolorIncolor G+ G-ou IncolorRoxo CV-I2CV

+CRISTAL VIOLETA

+SAFRANINA

G+ G-ou RoxoRoxo CV CV G+ G-ou VermelhoRoxo CV

+IODO

G+ G-ou RoxoRoxo CV-I2CVCV-I2

GRAM-POSITIVA

GRAM-NEGATIVA

+ETANOL

CV-I2

Figura 5: Esquema explicativo do método de coloração de Gram

PROCEDIMENTO

Existe um multiplicidade de variações de técnicas para a coloração de Gram, ainda quetodas se fundamentem nos mesmos princípios fundamentais. O método de Burke, que se segue,tem proporcionado excelentes resultados.

a)Preparo e fixação do esfregaço

GERHARDT (1994) afirma que a fixação química com formalina é ideal para o teste deGram. Prepare suspensão aquosa de células bacterianas que seja nitidamente turva e a elaadicione formalina para ter uma concentração final de 5% (v/v). Aguardar alguns minutos, eproceder à lavagem das células por centrifugação (15.000g/20 minutos, com descarte dosobrenadante e ressuspensão do precipitado em pequeno volume de formalina a 5%). Preparar oesfregaço com "cotonete", aguardar secagem completa ao ar e proceder a nova fixação pelo calor.

b) Reagentes e seu preparo

Solução A:Cristal violeta (p.a., 90% ou mais do corante)................................................... 2,0 gEtanol................................................................................................................ 20 ml


Solução B:Oxalato de amôneo.......................................................................................... 0,8 gÁgua destilada.................................................................................................. 20 ml

Misturar as soluções (A) e (B) e deixar em repouso por 24 horas e, após, filtrar.

MordenteIodo metálico................................................................................................... 1,0 gIodeto de potássio........................................................................................... 2,0 gÁgua destilada................................................................................................ 300 ml

Moer o iodo e o iodeto de potássio em almofariz e ir adicionado água lentamente. Após opreparo, a solução deve ser mantida ao abrigo da luz, em frascos escuros ou envoltos em papelaluminizado.

Corante de contrasteSafranina a 2,5% em etanol............................................................................ 10 mlÁgua destilada................................................................................................ 100 ml

c) Procedimento de coloração

1. Cobrir o esfregaço com solução de cristal-violeta por 1 minuto2. Lavar com água de torneira3. Cobrir o esfregaço com o mordente por 1 minuto4. Lavar novamente com água de torneira5. Secar com papel de filtro6. Lavar o esfregaço com etanol absoluto, com piseta, até que o solvente escorra sem

coloração7. Voltar a secar com papel de filtro8. Cobrir com safranina por 10-20 segundos9. Lavar sob água de torneira. Secar com papel de filtro e depois ao ar.10. Examinar com objetiva de imersão. Células Gram-positivas apresentam-se roxas e

Gram-negativas, vermelhas.

d) Recomendações adicionais importantes

a) Não usar reagentes preparados há mais de 6 meses.b) Manter reagentes que contenham iodo ao abrigo da luz.c) Usar culturas jovens (18 - 24 h). Bactérias podem variar quanto à reação de Gram em função

da idade.d) O preparo do esfregaço é crítico. Se muito espesso ou desuniforme, pode, inclusive, haver

inversão de resultados.e) Uma coloração de Gram bem feita, realizada por operador experiente e cuidadoso, dispensa o

uso de microscópio. As alterações visuais sofridas pelo esfregaço durante a execução do


método são suficientes para se determinar se o isolamento em estudo é Gram-positivo ouGram-negativo.

f) Quando se deseja determinar a reação de Gram para um isolamento desconhecido éabsolutamente essencial que se preparem, na mesma lâmina, três esfregaços: de um controleGram-positivo, de um controle Gram-negativo e do isolamento em investigação.

TESTE DE SOLUBILIDADE EM KOH

O teste de solubilidade em KOH reveste-se de caráter alternativo, confirmatórios e, ou,complementares da coloração de Gram. Não deve ser empregado isoladamente mas ajuda a tirardúvidas. Mesmo o pesquisador mais experiente pode ter eventuais dúvidas sobre ainterpretação dos resultados da coloração de Gram uma vez que o sucesso na execução da técnicaé função de inúmeros fatores.

Este teste foi idealizado por RYU (1938, 1940) para diferenciar bactérias Gram-positiva eGram-negativas sem uso de coloração. SUSLOW et alii (1982), citado por FAHY & PERSLEY(1983) comparou este método com a coloração tradicional de Gram e encontrou resultadosconsistentes para um grande número de fitobactérias.

O teste é simples. Deposita-se 1 gota de KOH a 2% numa lâmina comum de microscopiae para esta gota transfere-se crescimento bacteriano da cultura em meio sólido. Homogeneiza-sebem por 5 a 10 segundos, com a própria alça de repicagem. Se a preparação fica viscosa a pontode, levantando-se a alça, o material a ela aderir e a massa viscosa ficar pendente, considera-se abactéria como Gram-negativa. Se, em contraposição, a preparação, ao invés de ficar viscosa, ficaraquosa e não aderir à alça, considera-se a bactéria como Gram-positiva.

Segundo FAHY & PERSLEY (1983) o aumento de viscosidade seria devido à dissoluçãoda parede celular das bactérias Gram-negativas com liberação de DNA bacteriano, o que nãoacontece com as Gram-positivas processadas nas mesma condições.

RELAÇÕES COM O OXIGÊNIO LIVRE

Dos gêneros fitopatogênicos objeto deste curso, somente o gênero Erwinia possui espéciesanaeróbicas facultativas. Assim, saber se um isolamento fitopatogênico é ou não capaz de crescerna ausência de oxigênio assume conspícua importância para determinação do gênero. Existemvários métodos de se testar isso, todos com suas naturais limitações

1.MÉTODO DA PLACA DE PETRI

Esse método é bastante limitado por sua própria natureza, mas pode ser tentado quandonão se dispõem de reagentes e equipamentos mais adequados.

a) Preparar meio de rotina. Fundir. Quando ainda fundente (48-50oC), adicionar a ele algumasgotas de suspensão bacteriana (24 h de idade).

b) Homogeneizar bem, sem permitir a formação de bolhas de ar. Verter em placas e aguardarsolidificação.


c) Depositar na superfície do meio lamínulas estéreis. Com bastão de vidro estéril, pressionar aslamínulas de modo a garantir um perfeito contato das mesmas com a superfície. Incubar por24-48 h.

d) Bactérias anaeróbicas estritas crescem apenas de baixo da lamínula e distantes dos bordos.Microaerófilas crescem apenas debaixo da lamínula, mas próximas dos bordos. Aeróbicasfacultativas crescem em toda a superfície do meio, inclusive debaixo da lamínula (Fig. 6).

Figura 6: Padrão de crescimento, em função da técnica, respectivamente, de: (A) = Aeróbicaestrita, (B) = Anaeróbica estrita, (C) = Anaeróbica facultativa e (D) = Microaerófila

2.MÉTODO DE HUGH & LEIFSON (1953)

Essa técnica consiste em proceder ao semeio da bactéria num meio adequado que contemum açúcar utilizável pela bactéria e um indicador de pH (azul de bromotimol). Estando o pH emtorno de 7,0, o meio é azul. Dois tubos são utilizados, colocando-se um deles em condição deanaerobiose. Para crescer, a bactéria utiliza o açúcar com produção de acido, o que ocasionaabaixamento do pH e mudança da cor do meio de azul para amarelo.

A B

C D


Às vezes, ocorrem problemas com essa técnica. A bactéria pode não crescer por não sercapaz de utilizar o açúcar. Algumas bactérias basificam o meio ao utilizarem a peptona e ao invésde ficar amarelo, o meio fica azul intenso. Por fim, segundo BRADBURY (1968), produtos demetabolização da peptona podem neutralizar o ácido produzido. De qualquer forma, mesmo comessas limitações, é uma técnica que tem sido extensivamente utilizada.

PROCEDIMENTO

a) Meio de cultura (HUGH & LEIFSON, 1953)

COMPONENTES QUANTIDADESPeptona 2,0 gNaCl 5,0 gK2HPO4 0,3 gAgar 3,0 gAzul de bromotimol (1%) 3,0 mlÁgua destilada q.s.p. 1.000 ml

Dissolver todos os ingredientes menos a glucose, ajustar o pH para 7,1 e distribuiralíquotas de 5 ml em tubos que não devem ser inclinados após a autoclavagem usual. Esterilizar,por filtração, solução a 10% de glucose e adicionar 0,5 ml, asseticamente, a cada tubo.Homogeneizar sem fazer bolhas de ar e deixar solidificar em pé. Proceder ao semeio da bactériacom alça de repicagem reta, mergulhando-a até o fundo dos tubos, pelo centro da coluna de meio.Utilizar dois tubos. Após o semeio, adicionar a um dos tubos vaselina líquida, parafina líquida ouóleo "Nujol" (autoclavados) ou agar-água fundente, até um altura de 0,5 cm. Incubar os 2 tubos,na posição vertical, por até 7 dias. Aeróbicas estritas só crescem no tubo sem óleo e somente elefica amarelo. Anaeróbicas facultativas crescem nos dois tubos e ambos ficam amarelos (Figura 7).

A B C

Figura 7: Alterações de cor no meio de Hugh & Leifson, a saber: (A) - Bactéria aeróbica estrita,(B) - Anaeróbica facultativa e (C) - Anaeróbica estrita.


3. MÉTODO DA JARRA DE ANAEROBIOSE

O método fundamenta-se em criar condições de anaerobiose no interior de um recipientepassível de ser vedado de modo hermético. No interior, são colocadas placas de Petri recém-semeadas com os isolamentos em estudo. A condição de ausência de oxigênio é criada por meiode uma reação química durante a qual o oxigênio existente é consumido e igual tensão de CO2

liberada. Existe no mercado "Anaerocult A" (Merk), que são bandejas de plástico contendosubstâncias que, quando em contato com água, reagem consumindo O2 e liberando CO2 (Fig. 8).

A

C

CO2

O2VO

LU

ME

RE

LA

TIV

O (

%)

TEMPO EM MINUTOS

A

C

Figura 8: Método da jarra de anaerobiose, com testagem simultânea de três bactérias, sendo (A) e(B) anaeróbicas facultativas e (C) aeróbica estrita, em que 1 = Modo de semeio namesma placa, 2 = Variações de tensões O2/CO2 pelo efeito do “Anaerocult” e 3 =Aspecto da placa após incubação

Procedimento

a) Providencie uma jarra de "Gas-Pak" ou um dessecador bem vedado com mistura em partesiguais de lanolina e vaselina. Acomode em seu interior a bandeja de Anaerocult deixandoespaço para as placas.

b) Proceda ao semeio dos isolamentos em estudo em placas de Petri. Trabalhe com duplicatas.c) Imediatamente, transfira as placas para o interior da jarra, adicione água ao reagente e vede

hermeticamente. Após 1 h todo oxigênio terá sido consumido. Incube.d) A proporção é de 35 ml de água/bandeja/2,5 l de volume interno da jarra.e) Incube as duplicatas das placas em condições de aerobiose para comparação. Observe os

resultados após 24-48 h


UTILIZAÇÃO DE ASPARAGINA

Em conformidade com o Manual de Bergey (KRIEG & HOLT, 1984) é característico dogênero Xanthomonas a não utilização de asparagina como única fonte de carbono e nitrogênio.Repica--se, pois, o isolamento para o meio onde o aminóacido asparagina é a única fonte de C eN e observa-se se há crescimento ou não, o que é indicado pela ocorrência ou não de turvamentodo meio.

Há que se atentar para alguns detalhes. Quando o Manual de Bergey diz ser umadeterminada prova bioquímica positiva ou negativa, está implícito ser isso verdade para 90% dasespécies. No caso de Xanthomonas sp., há relatos de espécies (raros) capazes de utilizarasparagina. Além disso, se os componentes do meio não são combinados de forma adequada,pode ocorrer a formação de um precipitado que por sua vez pode ser confundido com turbidez.

Além do mais, se a cultura de Xanthomonas estiver impura, o contaminante pode utilizarasparagina e ocasionar turbidez. Se se transferir a cultura de Xanthomonas de meio sólido e se serepicar uma grande quantidade de células, algumas células podem vir a utilizar a cápsula deoutras como fonte de carbono e se multiplicarem, gerando turbidez.

a) Meio de cultura (STARR E WEISS, 1943)

COMPONENTES QUANTIDADESKH2PO4 1,0 gKCl 0,2 gMgSO4.7H2O 0,2 gAsparagina 5,0 gÁgua destilada 1000,0 ml

b)Procedimento:

1) Cultivar o organismo em estudo em meio líquido por 24 h.2) Repicar para o meio de asparagina3) Incubar a 28oC e observar, por até 7 dias, se ocorre turbidez.

INDUÇÃO DE TUMORES E, OU, CRESCIMENTO HIPERTRÓFICO OUHIPERPLÁSTICO

O operador que realiza o isolamento presumivelmente sabe se o órgão vegetal utilizadoexibia ou não sintomas de hipertrofia e, ou, hiperplasia (tumores, galhas, etc.). Geralmenteespécies de Agrobacterium incitam hipertrofias e hiperplasias (ROMEIRO, 1995). É importante,pois, observar exatamente o tipo de sintoma incitado pelo patógeno (Fig.9).

Não é comum, mas algumas espécies fora do gênero Agrobacterium podem tambémincitar tumores, embora por mecanismos diferentes. Por exemplo, Pseudomonas syringae pv.savastanoi incida tumores em galhos de oliveira (SCORTICHINI, 1995). Em casos como esse,que são raros, testes adicionais se tornam necessários para diferenciar esses espécies das dogênero Agrobacterium.


Figura 9: Tumores em caule de Datura sp. incitados por Agrobacterium tumefaciens(SCORTICHINI, 1995)

PRODUÇÃO DE XANTOMONADINAS

Xantomonadinas são aril-polienos brominados, um grupo de pigmentos amarelos, não-hidrossolúveis, presentes na parede da célula bacteriana, que conferem a típica coloraçãoamarelada às colônias da maioria das espécies do gênero Xanthomonas (KRIEG & HOLT, 1984).A presença desses pigmentos parece ser uma característica típica do gênero Xanthomonas esomente dele, revestindo-se, consequentemente, de enorme importância no que tange a taxonomiae sistemática.

Xantomonadinas, quando extraídas da célula bacteriana e submetidas à análiseespectrofotométrica para determinação do espectro de absorção, apresentam um pico em torno de443 nm, com dois ombros, respectivamente a 420 e 467 nm (STARR & STEPHENS, 1964),conforme mostrado na Figura 10.

Não se poderia menos de ressaltar que existem espécies apigmentadas de Xanthomonassp. como X. campestris pv. manihotis, X. campestris pv. ricini, X. albilineans etc., que nãoproduzem Xantomonadinas, sendo suas colônias são brancas e não amarelas.

PROCEDIMENTO

a) Proceda ao cultivo da bactéria em meio de caldo nutriente ("Nutrient broth"). O crescimentonesse meio costuma ser lento e há que esperar vários dias. Use Erlenmeyers de 250 ml para ocultivo sob agitação contínua.

b) Colete as células por centrifugação (10.000 g / 15 minutos), ressuspenda-as em H20 destiladae centrifugue novamente, descartando o sobrenadante.

c) Ressuspenda as células em metanol (grau de pureza analítico) de modo a formar umasuspensão bem concentrada.

d) Transfira a suspensão para tubos e proceda à extração em banho-maria, a 90oC por 10minutos.

e) Centrifugue a, pelo menos, 10.000 g/15 minutos, para remover detritos celulares.f) Concentre o sobrenadante em rotavapor, caso esteja muito diluído (caso a cor amarela não

esteja bem nítida).


g) Determine o espectro de absorção ao espectrofotômetro, pelo menos de 5 em 5 nm, desde 400nm até 500 nm.

h) Xantomonadinas tipicamente dão um pico de absorção máxima a 443 nm e dois ombros, um a420 nm e outro a 467 nm (Fig. 10).

i) Como controle, para efeito de comparação, é recomendável utilizar uma cultura de X.campestris e uma de Pseudomonas sp, por exemplo.

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,2

0,3

0,4

0,5

COMPRIMENTO DE ONDA (nm)

AB

SO

RB

ÂN

CIA

(Pse

udo

mon

as s

olan

acea

rum

)4O

O

500

450X. campestrisP. solanacearum

AB

SO

RB

ÂN

CIA

Xan

thom

onas

cam

pest

ris

420 nm

443nm

467nm

Figura 10 : Típico espectro de absorção de xantomonadinas, com 1 pico e 2 ombros.

CONFIRMAÇÃO DO GÊNERO

As características diferenciadoras para os 5 gêneros fitopatogênicos objeto deste roteiropermitem-nos determinar com razoável segurança a qual gênero pertence o isolamento com oqual se trabalha. Caso nosso isolamento não se enquadre em nenhum dos 5 gêneros clássicos, ostestes devem ser repetidos, pois, devemos ter

em conta não só a possibilidade de erro humano como também a quase infinita diversidadebioquímica e fisiológica das bactérias. Contudo, em persistindo dúvidas, testes para confirmaçãodo gênero devem ser realizados para maior segurança antes de se pensar na possibilidade de seestar trabalhando com um novo gênero diferente dos 5 clássicos anteriormente mencionados.

O Manual de Bergey (KRIEG & HOLT, 1984) ressalta, em negrito, as característicasprincipais dos 5 gêneros fitopatogênicos, como se segue. Essas características habitualmente sãoverdadeiras para 90% das espécies do gênero


1. Gênero Agrobacterium, Conn, 1942 a) Forma de bastonete, não esporogênica b) Gram negativa, móvel c) Aeróbica estrita, quimiorganotrofíca d) Catalase positiva e) Usualmente oxidase e urease positivas f) Indução de tumores ou rizogênese em plantas.

2. Grupo Corineforme a) Bastonetes curtos, retos ou curvos, pleomórfico b) Não ácido-resistentes, habitualmente não-móveis c) Aeróbicas estritas, Gram-positivas, não-esporogênicas d) Catalase positiva e) Negativos para indol, oxidase, tirosinase e urease f) Não utilizam benzoato, malonato, galacturonato, oxalato ou tartarato g) Não reduzem nitrato nem nitrito h) Produção de H2S a partir de cisteina

3. Gênero Erwinia, Wilson, Broadhurst, Buchanan, Kaumwiede, Rogers & Smith, 1920 a) Bastonetes retos, não-esporogênicas b) Anaeróbicos facultativos c) Oxidase negativa, catalase positiva d) Não utiliza benzoato, oxalato ou propionato como fonte de C para a produção de

energia.

4. Gênero Pseudomonas, Migula, 1894 a) Bastonetes retos ou curvos, móveis b) Gram-negativos, não-esporogênicas c) Aeróbicos estritos d) Catalase positivos e) Grande diversidade bioquímica e fisiológica.

5. Gênero Xanthomonas, Dowson, 1939 a) Bastonetes b) Aeróbicos estritos, Gram-negativos c) Móveis por meio de 1 flagelo polar d) Não redução de nitrato, nem denitrificação e) Produção do pigmentos denominados Xantomonadinas f) Oxidase fraca ou negativa, catalase positiva g) Asparagina não 'e usada como 'única fonte de carbono e nitrogênio h) Ausência de produção de ácido a partir de ramnose inulina, adonitol, dulcitol,

sorbitol, meso-inositol. i) Não acidificam o leite de litmus.


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determinação de gêneros de fitobactérias

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