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16/09/2015

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Detecção de M.O. Em Alimentos

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Métodos quantitativos

grupos específicos de m.o.

• aeróbios

• anaeróbios

• psicrotróficos

• termodúricos

• coliformes

• bolores

• leveduras

Métodos qualitativos

presença de uma dada espécie

• patogénicos

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Métodos padrão

publicados por organizações de referência

WHO FAO FDA

Métodos recomendados

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• amostra representativa do total

• método reprodutível

• adequado ao método de detecção

• conhecimento do tipo e natureza do produto

• recolha asséptica

• quantidade suficiente para replicadas

• mantida em condições que não permitam morte ou crescimento de m.o. até análise

• rotulagem completa

Amostragem

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• após recepção, deve ser rapidamente analisada

• parte não usada deve ser armazenada adequadamente• por vezes tempo longo

Amostragem

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• métodos de contagem directa

• contagem ao microscópio• não diferencia células viáveis das mortas

• nº de m.o. tem que ser grande (>106 mL-1)

• não eficaz para alimentos com partículas


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• Unidades Formadoras de Colónias (CFU) em agar não selectivo

• alíquotas obtidas por diluições

• diferentes meios podem originar diferentes resultados

• condições de incubação variam com grupos de m.o.


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• CFU em meio diferencial não selectivo• meio suplementado com agente capaz de diferenciar

grupos de m.o.

• indicadores de pH, redox


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• CFU em meio de agar selectivo• meio suplementado com agentes selectivos ou

inibidores

• condições de incubação variam com m.o.


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• CFU em meio de agar selectivo e diferencial• meio suplementado com agentes que permitem

crescimento selectivo de um grupo de m.o., inibindo o crescimento de outros m.o. semelhantes

• agente adicional permite desenvolvimento de colónias com características diferentes, entre as seleccionadas


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• métodos de contagem indirecta

• diluição até extinção em caldos não selectivos• diluições em série da amostra

• transferência de uma alíquota para um caldo não selectivo

• incubação

• tempo e temperatura dependem do grupo de m.o.

• crescimento (turbidez) ou não crescimento

• a partir da amostra mais diluída que deucrescimento calcula-se nº de m.o.

• valor pode divergir fortemente do real

• pouco usado para determinação em alimentos


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• nº mais provável em caldos selectivos• diluições em série da amostra

• transferência de uma alíquota para um caldo com agente selectivo

• incubação

• tempo e temperatura dependem do grupo de m.o.

• crescimento ou não crescimento

• a partir dos tubos com crescimento em 3 diluiçõessucessivas, estima-se nº de células viáveis

• tabelas estatísticas

• valor pode divergir fortemente do real

• usado para determinação de coliformes e coliformesfecais em água e alimentos


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• ensaio de redução de pigmentos• pigmentos que mudam de cor com estado de

oxidação

• mudança causada por metabolismo e crescimento microbiano

• taxa de redução do pigmento durante incubaçãodirectamente proporcional à carga microbiana inicialno alimento

• pouco rigoroso com diversos alimentos

• usado para determinação de qualidademicrobiológica em leite não tratado


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• contagem de grupos microbianos danificados em meio selectivo

• coliformes e patogénicos com danos subletaispodem morrer em meio de agar selectivo

• não são detectados

• criadas condições de reparação em meio não selectivo

• posteriormente colocados em meio selectivo


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• isolamento de patogénicos

• diversos passos• incubada em meio não selectivo

• reparação de possíveis células danificadas

• incubada em meio selectivo

• cultivada em meio de agar com agentes selectivos e diferenciais

• ensaio não categórico• requer confirmação por outros métodos

• pode demorar 10 – 12 dias

Métodos qualitativos

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• enterotoxina de S. aureus• extracção da toxina a partir de 100 g do

alimento

• concentração da toxina em água esterilizada ou soro fisiológico

• presença de toxina avaliada por anticorpo específico

• método de precipitação microslide

• métodos alternativos

• ensaio radioimunológico (RIA), ensaioimunoenzimático (ELISA), aglutinação em latex reversa passiva (RPLA)

• ressonância de plasma de superfície (SPR), sensor de fibra óptica

Ensaios para toxinas bacterianas

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• enterotoxina de S. aureus• método de precipitação microslide


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• neurotoxina de C. botulinum• extracção da toxina a partir do alimento

• parte do extracto tratado com tripsina• activar toxinas de tipos não proteolíticos (B, E)

• outra parte não tratada• tipos proteolíticos (A, B)

• ambos extractos injectados em ratos• verificar efeitos durante 48 h vs. ratos controlo


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• outras toxinas

• métodos específicos para toxinas de diversas bactérias patogénicas e bolores

• disponíveis na literatura

• disponibilidade comercial


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• métodos tradicionais• lentos e trabalhosos

• métodos rápidos• carga microbiana, patogénicos e toxinas

• automação parcial

• alguns aprovados oficialmente

• úteis durante processamento

• usados para monitorizar processos de limpeza e higienização

• específicos, sensíveis, relativamente rigorosos, menos trabalhosos

• eficácia pouco clara em alimentos poucocontaminados

Métodos rápidos / Automação

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• impressão digital metabólica

• cada espécie possui requisitos únicos de C e N• fornecer conjunto apropriado de açúcares (fonte de

C) ou a. a. (fonte de N)

• metabolizados, com produção de compostosespecíficos

• reagem com indicador padrão metabólico único


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• impressão digital metabólica

• requisitos• culturas puras

• condições fisiológicas óptimas

• kits comerciais para vários m.o.

• placas de 96 poços


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• ensaios imunológicos para patogénicos

• utilização de anticorpos

• detecção de células, toxinas, metabolitos

• simples

• pouco equipamento

• resultados fáceis de interpretar

• podem não diferenciar entre células vivas e mortas

• m.o. danificados podem alterar morfologia e fisiologia

• expressão alterada de antigénios


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• sucesso depende de disponibilidade de anticorpo específico para antigénio

• anticorpos policlonais e monoclonais


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• anticorpos policlonais (PAb)• conjunto de anticorpos com diferentes origens

celulares

• produzidos contra diferentes epitopos do mesmo antigénio

• podem apresentar reacção cruzada com antigénios de diferentes m.o.


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• anticorpos monoclonais (MAb)• homogéneos

• grande especificidade


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• separação imunomagnética

• pequenas partículas superparamagnéticasrevestidas com anticorpos

• partículas só exibem propriedades magnéticas napresença de campo magnético externo


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• 1º passo• suspensão com m.o. de interesse misturada com

partículas magnéticas

• tubo com complexo magnético colocado emseparador magnético e líquido retirado

• 2º passo• complexo lavado várias vezes com tampão

• remoção de contaminantes

• células recolhidas para ensaios posteriores

• PCR, imunológicos, biossensores


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• método directo• m.o. alvo misturado com partículas magnéticas

revestidas com anticorpo específico para esse m.o.

• partículas em contacto com m.o. ligam-se atravésdo anticorpo primário


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• método indirecto• anticorpo primário adicionado à suspensão

• liga-se ao m.o. alvo

• adicionam-se partículas magnéticas revestidas com anticorpo secundário (específico para anticorpoprimário)

• complexos separados com concentrador magnético


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• eficaz na captura de• E. coli O157:H7

• Salmonella• Listeria

• captura não específica de bactérias não alvo

• taxa de captura variável (10 % - 70 %)


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• aglutinação em latex reversiva passiva (RPLA)

• detecção de toxinas de patogénicos• S. aureus• C. perfringens• B. cereus• V. cholera• E. coli


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• aglutinação em latex reversiva passiva (RPLA)

• anticorpo específico para toxina imobilizado em partículas de latex

• misturado com amostra em placas de poços• padrão difuso indica presença da toxina

• anel ou botão indica ausência


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• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

• muito usado para detecção de patogénicos e suas toxinas

• Salmonella• L. monocytogenes• E. coli O157:H7

• C. jejuni


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• medida quantitativa da ligação do antigénio ao anticorpo primário, utilizando um anticorpo secundário conjugado com uma enzima

• reacção positiva quantificada por medição daintensidade num espectrofotómetro

• quantidade de enzima presente proporcional à quantidade de antigénio


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• método indirecto• antigénio imobilizado na placa

• feito reagir com anticorpo primário

• após lavagem, adiciona-se anticorpo secundário com enzima

• liga-se ao anticorpo primário

• adiciona-se solução com substrato paradesenvolvimento de coloração


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• método sandwich• anticorpo imobilizado na placa

• captura o antigénio

• adiciona-se anticorpo secundário, específico para o antigénio, com enzima

• forma “sandwich”

• antigénio necessita pelo menos dois locais de ligação para os dois anticorpos


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• método competitivo• células bacterianas ou antigénios imobilizados na

placa

• separadamente preparam-se misturas do anticorpo primário com várias diluições da bactéria ou antigénio (amostra)

• adiciona-se mistura à placa com antigénio


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• método competitivo• lavagem da placa

• remoção de anticorpos não ligados

• quanto mais antigénio na amostra, menosanticorpo disponível para se ligar ao antigénio daplaca – competição

• adiciona-se um conjunto anticorpo secundário-enzima-substrato

• quanto maior a concentração de antigénio naamostra, mais fraca a cor


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• limite de detecção relativamente alto• 106 – 107 células/mL

• muito elevado para produtos alimentares

• necessário passo prévio de enriquecimento


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• imunofluorescência

• semelhante a ELISA

• anticorpo de detecção ligado a composto queemite fluorescência ao formar complexo com antigénio

• detecção por microscópio de flurescência, câmaradigital ou espectrofluorímetro


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• imunofluorescência

• método directo• ligação do antigénio ao conjunto anticorpo

específico-marcador fluorescente

• método indirecto• anticorpo secundário ligado a marcador complexa o

anticorpo primário


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• imunocromatografia por fluxo lateral

• variante do ELISA sandwich realizado numa membrana

• rápido, fácil, barato

• despiste inicial• anticorpo de captura imobilizado na membrana

• anticorpo de detecção ligado a corante colocadonoutra zona da membrana

• coloca-se amostra com antigénio numa extremidadeda membrana

• liga-se ao anticorpo de detecção


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• imunocromatografia por fluxo lateral• complexo desloca-se por capilaridade até zona de

detecção

• 2 zonas de captura

• específica para antigénio

• específica para anticorpos não ligados (controlo)

• 1 linha colorida (controlo) resultado negativo

• 2 linhas coloridas resultado positivo


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• citometria de fluxo• caracterização rápida baseada em diversos

parâmetros

• morfologia

• conteúdo em ácidos nucleicos

• antigenicidade superficial


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• citometria de fluxo

• células ligadas a composto fluorescente• composto fluorescente pode estar ligado a anticorpo

• passam individualmente através de um túnel• detecção por raio laser

• analisada e representada interacção com cadacélula

• falta de discriminação entre células vivas e mortas


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• bioluminescência

• medida de ATP na amostra• medida indirecta da carga microbiana

• só células viáveis retêm ATP

• usa sistema luciferina/luciferase, na presençade Mg2+

• quantifica ATP de células lisadas

• bastante sensível em alimentos e equipamento

• rápido, pode ser automatizado


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• bioluminescência

• detecção de genes responsáveis porbioluminescência bacteriana

• gene lux de bactérias luminescentes clonado emm.o. a detectar

• luciferase bacteriana leva células viáveis a emitir luz

• método permite controlar eficácia de processos de destruição ou remoção de m.o. em alimentos

• existe equipamento automatizado


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• hibridização

• pequenas sondas de DNA específicas de um grupo de patogénicos

• prepara-se sonda com 20 – 40000 nucleótidos

• sequência de DNA ou rRNA das células

• sequência de a. a. de uma toxina

• sondas marcadas após hibridização

• 32P – detecção por autoradiografia

• sistema enzimático – detecção colorimétrica

• existem sondas comerciais e aprovadas paraSalmonella e L. monocytogenes


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• PCR (reacção em cadeia da polimerase)

• técnica baseada em DNA mais usada

• amplificação de sequência genética específicapara um patogénico

• cópias separadas em gel para identificação


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• Multiplex PCR• genes múltiplos num único ensaio

• L. monocytogenes, S. enterica, E. coli, Campylobacter, Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, V. vulnificus


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• PCR quantitativo em tempo real (qPCR)

• permite alguma automação• sonda com marcador fluorescente e com extintor

hibridiza com DNA alvo

• marcador fluorescente libertado no fim daamplificação

• sinal fluorescente medido

• quantificação


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• métodos não diferenciam células vivas das mortas

• utilização da transcriptase reversa (RT-PCR)

• mRNA que só é transcrito em células viáveis usadopara amplificação

• mRNA sintetiza cDNA, usando RT

• cDNA amplificado

• permite também detectar alguns vírus

• norovirus, rotavirus, vírus entéricos


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• impressão genética

• detecção e identificação de patogénicos

• isolamento do DNA

• digestão com enzimas de restrição

• amplificação ou hibridização de fragmentos

• existem sistemas automatizados• padrão de DNA comparado com base de dados

• identificação do m.o. de origem


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• impressão genética

• electroforese em gel de campo pulsado (PFGE)

• DNA polimórfico amplificado ao acaso (RAPD)

• polimorfismo de comprimento de fragmentoamplificado (AFLP)

• polimorfismo de comprimento de fragmentosde restrição (RFLP)

• sequências repetitivas de DNA (rep-PCR)


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• ensaios de patogenicidade

• utilizam-se modelos animais ou células de mamíferos

• determinação de doses letal e infecciosa

• efeitos citopatogénicos por microscopia• danos na membrana, organelos, ...

• citotoxicidade quantificada por ensaioscolorimétricos

• células mortas coradas


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• ensaios de patogenicidade

• mecanismo de patogénese celular• adesão

• invasão

• formação de placa

• apoptose


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• aparelhos capazes de detectar complexosquímicos ou biológicos

• antigénio-anticorpo

• enzima-substrato

• receptor-ligando

• apoptose

• sinal eléctrico, óptico ou mássico

• equipamento automático ou semi-automático

• rápidos (24-72 h)

Detecção de patogénicos por biossensores

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• detecção baseada em• utilização de substrato

• expressão fenotípica da virulência

• marcadores fisiológicos ou estruturais

• análise genética

• interacção de patogénicos com células eucariotas

• utilização de um dos princípios ou combinações

• baseados em anticorpos mais versáteis


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• métodos• electroquímicos

• impedância e amperométricos

• ópticos

• fibra óptica e ressonância de plasma de superfície

• mais populares – sensibilidade, disponibilidade, fácil interpretação

• termométricos

• termístor e piroeléctricos

• mássicos

• piezoeléctricos e acústica superficial


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• fibra óptica

• baseado no ensaio imunológico sandwich

• intensidade luminosa proporcional à quantidadede antigénio presente

• aparelho semi-automático capaz de detectar 4 patogénicos em simultâneo


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• fibra óptica

• detecção eficaz• esporos de Bacillus anthracis, Franciscella tularensis,

esporos de Bacillus globigii, toxina de C. botulinum, Yersinia pestis, Brucella melitensis, vírus vaccinia

• detecção de patogénicos em diversos alimentos• L. monocytogenes, C. jejuni, Salmonella, E. coli

O157:H7

• detecção de micotoxinas• ocratoxina A, fumonisina B, aflatoxina B1,

deoxinivalenol


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• fibra óptica

• limites de detecção• bactérias

• 103 – 104 CFU mL-1

• toxinas

• 0.5 – 20 ng mL-1


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• ressonância de plasma de superfície (SPR)

• quantifica cinética de ligação de 2 moléculas• não requer marcador fluorescente

• ressonância medida é deslocada para maioresc.d.o. pela presença de um complexo antigénio-anticorpo

• desvio proporcional à quantidade de moléculasligadas


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• ressonância de plasma de superfície (SPR)

• vantagens• muito rápido (< 30 min)

• sensor pode ser reutilizado para mesmo analito

• muito sensível (ng)

• sistemas comerciais disponíveis


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• imunosensores electroquímicos

• extensão do ELISA• enzima conjugada a anticorpo produz catálise de um

substrato

• alteração de pH, iões, consumo de O2

• sinal eléctrico medido num transductor

• potenciométricos, capacitivos, amperométricos

• muito sensíveis

• rápidos (30 – 90 min)

• usados na detecção de Salmonella, E. coliO157:H7


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• biosensores piezoeléctricos

• detectam variações de massa na superfície de um cristal de quartzo

• anticorpos usados para capturar um patogénicoaumentam a massa

• variação num campo eleéctrico oscilante aplicado

• detecção de enterotoxinas de Staphylococcus

• detecção de células de Salmonella typhimurium, S. paratyphi, L. monocytogenes, B. cereus, E. coli O157:H7


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• sensores de bioimpedância

• alteração na condutância e impedância do meiodevida a metabolismo microbiano

• substratos inertes convertidos em compostos iónicose subprodutos ácidos (láctico, acético, a. a.)

• medição de condutância e impedância permiteseguir crescimento microbiano em função do tempo (T constante)


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• possível calcular carga inicial e tempo de geração


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• detectam apenas células viáveis

• existem sistemas comercializados• controlo de qualidade

• monitorização de patogénicos

• contaminação do leite

• detecção e contagem de Listeria, Campylobacter, E. coli, Staphylococcus, Salmonella

• aceite pela AOAC

• falta de sensibilidade

• tempo de resposta relativamente longo (24 –48 h)


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• desenvolvimento de “biochips” para aumentarsensibilidade

• células confinadas a pequeno volume• rápida conversão de substratos pelas bactérias

• detecção mais rápida e sensível

• L. monocytogenes


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• FTIR (IV com transformada de Fourier)

• radiação IV sensível a composição molecular daparede celular e citoplasma

• espectro ou “impressão digital”

• comparado com biblioteca de espectros

• classificação ou identificação de diversas espéciese estirpes de patogénicos

• Yersinia, Staphylococcus, Salmonella, Listeria, Klebsiella, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter


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• FTIR (IV com transformada de Fourier)

• rápido

• não destrutivo

• requer transferência das células para superfíciereflectora


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• dispersão de luz

• fonte de luz monocromática polarizada incidenas células

• luz dispersa produz perfis distintivos

• identificação e detecção de bactérias

• amostras diferenciadas com base em• índice de refracção

• tamanho

• forma

• composição


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• dispersão de luz

• reprodutibilidade afectada por• fase de crescimento

• meio de crescimento

• temperatura de crescimento

• arejamento

• diluição do meio

• sucesso limitado na detecção de célulasindividuais

• simples

• não invasivo

• rápido (< 1 min)


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• sensores baseados em células

• célula serve de transdutor ao emitir sinalespecífico durante interacção com analito de interesse

• sinal produzido em s - min

• medem perturbações à actividade fisiológicanormal da célula quando exposta a um patogénico ou molécula

• L. monocytogenes, E. coli, O2, pesticidas

• não invasivo

• rápido (< 1 min)


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• sensores baseados em células

• sensor baseado numa célula B geneticamentemanipulada

• muito baixas quantidades de bactérias patogénicas

• E. coli O157:H7, esporos de B. anthracis, Y. pestis• alguns min

• célula artificial (“liposoma”)• detecção de toxinas formadoras de poros

• ng em 30 min

• biochip baseado em células de mamífero• detecção de alergénios e vírus


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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s

grande quantidade de novos alimentos

• necessidade de avaliar crescimentomicrobiano

• diversos parâmetros de processamento, embalagem e armazenamento

• métodos tradicionais de análise• complexos, lentos e caros

• métodos preditivos – modelos matemáticos• falta de rigor

• eficazes para obter informação rápida

• seleccionar informação mais relevante, usadapara estudos tradicionais

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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s

métodos tradicionais

• ensaios de desafio

• alimento inoculado com m.o. emcondições de comercialização

• armazenado em condições típicas

• analisado durante armazenamento• crescimento microbiano ou produção de

toxinas

• diversas variáveis• ingredientes

• factores intrínsecos e extrínsecos

• possível manipulação indevida

• …

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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s


• ensaios de armazenamento

• alimento armazenado em condiçõesnormais

• amostras analisadas a intervalosregulares

• deterioração e m.o. patogénicos

• resultados permitem prever tempo de prateleira e seguranças nas condições de armazenamento usadas

• não se consegue informação útil se houver exposição a temperaturaindevida, mesmo por períodos curtos

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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s


• ensaios acelerados

• eficazes em alimentos com grande tempo de prateleira

• aumento de temperatura aumenta a taxa de crescimento microbiano e a deterioração

• necessário calcular temperatura de modo a não destruir os m.o. de interesse

• alimento tem flora microbiana variada

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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s

microbiologia preditiva

• modelos matemáticos

• previsão crescimento de m.o.• usam dados obtidos a partir de ensaios de

crescimento, em laboratório, com condições variáveis

• pH, aw, T, conservantes

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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s


• modelo da raiz quadrada

• relação linear entre raiz quadrada da taxade crescimento e temperatura

• r – taxa de crescimento

• b – declive da regressão linear

• T – temperatura do alimento

• Tmin – temperatura mínima teórica de crescimento

minr=b( )T T

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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s


• modelo da raiz quadrada

• expansão do modelo para incorporar aw e pH

• eficácia decresce com quantidade de parâmetros usados

w wmin min minr=b a -a pH-pH ( )T T

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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s


• modelo sigmoidal (USDA)

• testado em laboratório para vários m.o. e variáveis

• L. monocytogenes, S. aureus, Salmonellaspp., Shigella flexneri, E. coli O157:H7, Aeromonas hydrophila

• T, pH, aw, [NaCl], [NaNO2], aerobiose ou anaerobiose

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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s



• curvas de crescimento estatisticamenteajustadas

• regressão não linear + funções de Gompertz

• permitem obter tempo lag, constante máxima de crescimento, carga microbiana máxima

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Pre

vis

ão d

o c

resc

imento

m

icro

bia

no e

m a

limento

s



• N – log(CFU/mL)

• t – tempo

• A – log(CFU/mL) inicial

• C – diferença de log(CFU/mL) entre tempo t e tempo 0

• M – tempo ao qual o crescimento é máximo

• B – taxa de crescimento relativo ao tempo M

A exp( exp[ ( )])N C B t M

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Exemplos de aplicação

• Leite e produtos lácteos

• Directiva Europeia 92/46/CEE e documentos associados

• para além dos métodos especificados, podem ser usados outros reconhecidos internacionalmente

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http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:1992:268:0001:0032:PT:PDF

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• Leite pasteurizado

• coliformes

• contagem em placa antes da incubação

• fosfatase

• peroxidase

• ausência de patogénicos

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• amostragem

• a partir do equipamento de embalagem ou câmara de refrigeração

• o mais rápido possível após processamento

• transportadas a 0 ºC – 4 ºC

• 3 amostras (ensaios em quintuplicado)

• medição de T ao chegar ao laboratório

• coliformes, fosfatase e peroxidase

• manter a 6 ºC para contagem em placa

• ensaios < 24 h após amostragem

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• contagem de colónias

• amostra incubada a 6 ºC, 5 dias

• preparar diluições e incubar em meio agar

• 21 ºC, 25 h

• contar colónias nas placas com 10-300 colónias

• calcular nº de organismos (N) por mL

n° total de colónias contadas

volume total × diluiçãoN

91





• se existirem placas com 10-300 colónias em mais que umadiluição:

1 2( 0.1 )

CN

V n n d

C – soma das colónias em todas as placasV – vol. aplicado a cada placan1 – nº de placas para a 1ª diluiçãon2 – nº de placas para a 2ª diluiçãod – diluição usada para a 1ª contagem

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• contagem de colónias (ex:)• 1 mL de volume aplicado

• diluição 10-2 – 173 e 145 colónias

• diluição 10-3 – 15 e 8 colónias

• contagens abaixo de 5x104 CFU mL-1 são satisfatórias

• contagens acima de 5x105 CFU mL-1, não

4

-2

173+145+15+8 341= = =15500=1.6×10

0.0222+ 0.1 2 10N

93




• ensaio de coliformes

• inocular leite não diluído em meio agar lactose bile vermelho violeta (VRBA)

• preparar placas controlo só com meio

• incubar a 30 ºC, 24 h

• contar colónias vermelhas, com diâmetro de pelo menos0.5 mm

• características de coliformes

• contar também colónias vermelhas atípicas

• colónias atípicas confirmadas por inoculação em caldo bile verde brilhante

• 30 ºC, 24 h

• colónias que formam gás são coliformes

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• cálculos

• contar colónias dos 2 ensaios

• resultados satisfatórios se não forem encontradascolónias

• resultados não satisfatórios se > 5 CFU mL-1

• se pasteurização foi correcta, presença de coliformes indicacontaminação pós-pasteurização

95




• ensaio da fosfatase

• fosfatase alcalina existe em leite de mamíferos

• destruída em condições de pasteurização

• amostras mantidas a 0 – 4 ºC, não mais que 2 dias antes da análise

• espectrofotometria

• fluorimetria

• colorimetria

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• método espectrofotométrico

• usa fenilfosfato dissódico como substrato

• convertido em fenol pela enzima

• fenol reage com corante para formar indofenol

• intensidade da cor azul produzida medida porespectrofotómetro

• método lento e com níveis de detecção relativamentealtos

97






• lípidos e proteínas interferentes precipitados com sais de zinco e bário

• necessário preparar curva de calibração para cada ensaio

• resultados < 4 mg fenol mL-1 são satisfatórios

• valores > 1 mg requerem investigação na produção

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• método fluorimétrico

• método automatizado

• muito sensível

• medida cinética contínua

• fosfatase presente na amostra hidrolisa substrato nãofluorescente a composto muito fluorescente

• intensidade de fluorescência medida a 38 ºC

• resultado expresso em miliunidades /L

• 1 unidade – quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 mmol min-1 L-1 de amostra

99






• requer curva de calibração

• valores < 500 mU L-1 considerados satifatórios

100

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• fosfatase microbiana

• mais termorresistente que a de mamíferos

• pode resistir a pasteurização mal efectuada

• originária de falta de higene ou de presença de psicrotróficos no leite não tratado

• aquecer amostra a 63 ºC, 30 min e realizar ensaio de fluorimetria

101





• reactivação

• pode ocorrer se leite pasteurizado a temperaturaexcessivamente alta

• pode ocorrer se leite armazenado a temperatura demasiadoelevada, após pasteurização

• verificar se iões Mg2+ capazes de reactivar enzima

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• teor de fosfatase pode ser devido a fosfatase microbiana e reactivação

• reactivação pode mascarar presença de fosfatase de mamífero

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• ensaio colorimétrico de Aschaffenburg & Mullen

• não reconhecido internacionalmente

• eficaz para rastreio

• não capaz de detectar níveis baixos de enzima

104

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• ensaio colorimétrico de Aschaffenburg & Mullen

• amostra aquecida à temperatura ambiente antes do ensaio

• p-nitrofenol fosfato dissódico hidrolisado pela enzima

• produz p-nitrofenol

• cor amarela

• intensidade medida em espectrofotómetro (405 nm)

105




• ensaio da peroxidase

• inactivada a 75 – 80 ºC

• se leite sobreaquecido durante pasteurização (> 75 ºC) ocorre inactivação

• ensaio da peroxidase negativo

• só avalia qualidade

• se leite devidamente pasteurizado, ensaio é positivo

106

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• ensaio da peroxidase

• enzima decompõe H2O2

• O libertado oxida 1,4-fenilenodiamina a indofenol

• passa de incolor a púrpura

• intensidade da cor proporcional a concentração daenzima

• resultado positivo se formar cor em 30 s

• negativo se não aparecer cor

• não específico se aparecer cor após 30 s

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• Leite não tratado

• coliformes

• contagem de colónias a 30 ºC

• Leite não tratado para lacticínios

• contagem de colónias a 30 ºC

• S. aureus

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• amostragem

• amostras transportadas a 0 – 4 ºC

• tempo até análise não deve exceder 36 h

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• preparar diluições do leite

• inocular em agar de contagem de placas com leite

• 30 ºC, 72 h

• valores < 2.0104 CFU mL-1 são satisfatórios

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• proceder como no leite pasteurizado

• valores < 100 CFU mL-1 são satisfatórios

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• Leite UHT e esterilizado


• após pré-incubação a 30 ºC

• se houver probabilidade esporos termorresistentes, incubara 55 ºC

• ensaio visa detectar m.o viáveis

• não deverão existir durante tempo de prateleira

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• Leite UHT e esterilizado


• embalagem incubada a 30 ºC, 15 dias (55 ºC, 7 dias)

• abrir e retirar alíquotas assepticamente

• incubar em agar de contagem de placas com leite

• 30 ºC, 72 h

• contar colónias visíveis

• calcular CFU mL-1

• valor 100 CFU mL-1 satisfatórios

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• Produtos lácteos

• ensaios para E. coli

• presença de L. monocytogenes e Salmonella

• S. aureus para queijos

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• ensaios para E. coli• amostras diluídas e incubadas em meios apropriados para

verificar produção de gás, fluorescência e coloração

• calcula-se nº mais provável por mL (g) de E. coli

115




• lacticínios líquidos

• natas, iogurtes, bebidas lácteas

• ausência de L. monocytogenes em 1 g

• ausência de Salmonella em 25 g

• teores de coliformes

• patamar para nº de bactérias é 0

116

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• nata pasteurizada

• além dos ensaios genéricos

• fosfatase

• aquecer a 66 ºC, 30 min, em vez de 63 ºC



• método colorimétrico (só rastreio)

• peroxidase

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• nata UHT e esterilizada



• após pré-incubação em recipiente aberto

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• nata não tratada


• semelhante à análise de leite não tratado

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• bebidas lácteas pasteurizadas


• fosfatase, método fluorimétrico

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• iogurtes

• ensaios genéricos

• tamponizar a pH 7.5 na preparação das amostras

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• gelados e sobremesas refrigeradas


• ausência de L. monocytogenes em 1 g

• contagem de colónias e coliformes facultativos

• amostras fundidas a 37 ºC, em banho de água

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• gelados e sobremesas refrigeradas


• agar com leite, incubação a 30 ºC, 72 h

• < 105 CFU g-1 é satisfatório

• > 5105 CFU g-1 não satisfatório


• < 10 coliformes/g é satisfatório

• > 100 coliformes/g não satisfatório

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• produtos desidratados

• Salmonella


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• queijos

• varia com tipo de queijo

• pasta dura, macia ou fresco

• varia com tipo de leite

• tratado ou não


• ausência de L. monocytogenes em 1 g de queijo de pasta dura

• 25 g nos outros

• S. aureus excepto para queijo de pasta dura feito com leite pasteurizado

• E. coli em queijos de pasta macia

• coliformes em queijo de pasta macia feito com leitetratado

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• queijos

• queijos de pasta macia e fresco

• < 100 E. coli/g satisfatório para queijo feito com leitepasteurizado

• < 10000 E. coli/g satisfatório se for usado leite nãopasteurizado

• amostras preparadas a pH 7.5

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detecção de m.o. em alimentos - pfigueiredo.org · 16/09/2015 2 detecção de m.o. em alimentos...

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