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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
BRUNA BOLGENHAGEN XAVIER
DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA
DE SISTEMAS NANODISPERSOS CONTENDO EXTRATO DOS
FRUTOS DA Rapanea ferruginea
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
BRUNA BOLGENHAGEN XAVIER
DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA
DE SISTEMAS NANODISPERSOS CONTENDO EXTRATO DOS
FRUTOS DA Rapanea ferruginea
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profª. Dra. Angélica Garcia Couto
Itajaí, Março de 2015
Dedicatória
A Deus, por me conduzir em toda trajetória e por
permitir que tudo pudesse ser realizado;
E a minha mãe, pelo apoio incondicional e por me fazer
acreditar que eu seria capaz.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela proteção do início ao fim, por ser meu principal guia e
me dar forças para seguir em frente mesmo perante as dificuldades;
A minha orientadora, Profª. Dra. Angélica, por ter aceitado me orientar, por
todo conhecimento compartilhado, ensinamentos, paciência, dedicação e amizade.
Ter sido sua orientanda trouxeram grandes aprendizados que serão levados como
exemplo, pois tenho imensa admiração por sua ética e profissionalismo;
Aos que foram minha motivação maior de chegar até aqui: minha mãe, por
ser a grande incentivadora para a realização dos meus sonhos, foi quem me ajudou,
acalmou e esteve presente em todos os momentos e meu pai, obrigada pelo amor,
incentivo, orações, suporte moral e financeiro e por acreditar na minha capacidade;
Aos meus irmãos que sempre estiveram ao meu lado, me encorajarando nas
horas difíceis e me aplaudindo em todas as conquistas;
A minha vó Eli por sempre estar presente e pelo apoio para meu crescimento
profissional, suporte financeiro, orações e todas as vibrações por minhas conquistas;
A minha vó Elenita, pelas orações, preocupações e pela paz e ao amor
transmitidos em suas visitas;
A minha prima Bettieli, que me acolheu e se tornou uma grande amiga,
compartilhando todas as vivências diárias;
Aos meus tios Nilza e Gegê e a minha prima Estela, que sempre me
receberam de portas abertas, me motivaram a continuar e me acolheram sempre
quando precisei;
Aos meus primos Márcia e Fábio, por estarem comigo desde o primeiro dia de
mudança, por me receberem em sua casa e pelo apoio de sempre;
As amizades que ganhei em minha vivência em Balneário Camboriú, obrigada
por serem excelentes companhias, por me proporcionarem momentos divertidos,
viagens e conversas;
As minhas amigas de longe, que sempre estiveram presentes, obrigada pelo
carinho, apoio e compreensão;
As minhas colegas de mestrado, aos professores, aos técnicos dos
laboratórios, ao pessoal da secretaria e aos alunos da graduação pela amizade,
companheirismo, trocas de ideias e pela disposição em ajudar e auxiliar quando
preciso;
A Ionice, pelo auxílio, companheirismo e amizade ao longo do mestrado;
A Tailyn, pela parceria e amizade no presente estudo;
A Profª. Dra. Angela Malheiros pela disponibilidade dos frutos da R. ferruginea
e parceria no projeto;
A Profª. Dra. Márcia Maria de Souza pela ajuda nos testes farmacológicos;
A Profª. Dra. Joana Lea Meira Silveira da Universidade Federal do Paraná por
possibilitar as análises para caracterização das amostras;
A UNIVALI e ao suporte financeiro cedido pela CAPES, CNPQ e FAPESC
(PRONEM), pela oportunidade de realizar o mestrado;
Enfim, aqueles que não foram citados, mas que contribuíram de alguma forma
para a realização deste trabalho.
A todos vocês, meus sinceros agradecimentos.
“Esforça-te e tem bom ânimo; não te atemorizes, nem te espantes; porque o Senhor está contigo, por onde quer que andares.”
Josué:1.9
DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE SISTEMAS NANODISPERSOS CONTENDO EXTRATO DOS
FRUTOS DA Rapanea ferruginea
Bruna Bolgenhagen Xavier Março/2015
Orientadora: Angélica Garcia Couto, Drª. Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 117 A nanotecnologia é aplicada a diversas áreas, sendo de especial interesse quando se busca o aumento da efetividade nos tratamentos, sobretudo aliado ao potencial farmacológico das plantas medicinais. O extrato dos frutos da espécie vegetal Rapanea ferruginea tem despertado o interesse na pesquisa de desenvolvimento de fitoterápicos devido às suas propriedades antioxidante, cognitiva e anticolinesterásica. Neste extrato, foram identificados marcadores de grande interesse, o ácido mirsinoico A (AMA) e um triglicerídeo ainda não elucidado. O presente estudo teve por objetivo desenvolver sistemas nanoemulsionados contendo extrato mole dos frutos da R. ferruginea com avaliação da atividade antinociceptiva. A droga vegetal, as soluções extrativas (SE) e o extrato mole (EM) foram caracterizados por métodos farmacopeicos, cromatografia em camada delgada (CCD) e de alta eficiência (CLAE), avaliando-se o teor do marcador AMA, o sistema solvente e as condições extrativas em frutos maduros e imaturos. As SE foram avaliadas quanto à citotoxicidade por MTT. No EM a atividade antioxidante foi determinada pelo método de DPPH. Neste trabalho os sistemas foram otimizados a partir da seleção do óleo, do sistema tensoativo e dos métodos de preparo e de incorporação do EM, determinados em estudo prévio. As formulações previamente selecionadas foram submetidas ao estudo de estabilidade preliminar e acelerada. O EM, a formulação selecionada (SND – sistema nanodisperso) e o AMA foram avaliados por modelo in vivo de contorções abdominais induzidas por ácido acético, por via oral e intraperitoneal (i.p.). O perfil de CCD demonstrou a semelhança na composição dos frutos maduros e imaturos e o teor de AMA foi diretamente proporcional ao grau alcoólico. O etanol revelou-se o melhor sistema solvente, cujos extratos não foram citotóxicos e apresentaram atividade antioxidante (IC50 aprox. 20 µg/mL). No estudo de estabilidade preliminar e acelerada, os SNDs mostraram-se instáveis com o aumento de tamanho médio da fase interna, porém o teor de AMA em CLAE manteve-se relativamente constante. O ensaio farmacológico in vivo evidenciou que a atividade antinociceptiva foi potencializada para o EM incorporado no SND na dose de 100 mg/kg, tendo inibição do processo doloroso (IM) calculada para 61,2% via oral, quando comparado com o grupo controle. Em conclusão, o presente estudo demonstra que o SND, de tamanho médio da fase interna de 10 nm, contendo 5% de óleo, 10% de tensoativos e 1% do EM etanólico dos frutos da R. ferruginea aumentou o efeito antinociceptivo, representando um sistema com potencial contra a nocicepção. Palavras-chave: Nanodispersões. Rapanea ferruginea. Frutos. Antioxidante.
Antinociceptivo.
TECHNOLOGICAL DEVELOPMENT AND BIOLOGICAL EVALUATION OF NANODISPERSION SYSTEMS CONTAINING EXTRACT OF
FRUITS OF Rapanea ferruginea
Bruna Bolgenhagen Xavier
March/2015
Supervisor: Angélica Garcia Couto, Drª. Area of Concentration: Natural Products and Sinthetic Bioactive Substances Number of Pages: 117 Nanotechnology is applied to various fields, and is of particular interest when seeking increased effectiveness in treatments, especially when combined with the pharmacological potential of medicinal plants. The extract of the fruit of the plant species Rapanea ferruginea has attracted interest in herbal development research because of its antioxidant, cognitive and acetylcholinesterase properties. In this extract, markers of great interest have been identified: mirsinoic acid A (AMA) and a triglyceride not yet elucidated. This study aimed to develop nanoemulsified systems containing soft extract of the fruits of R. ferruginea with evaluation of antinociceptive activity. The plant drug, extractive solutions (ES) and soft extract (SE) were characterized by pharmacopoeial methods, thin layer chromatography (TLC), and high performance (HPLC), evaluating the AMA marker content, the solvent system and extractive conditions in mature and immature fruit. The ES were evaluated for cytotoxicity by MTT. In the SE, antioxidant activity was determined by the DPPH method. In this work, the systems were been optimized through the selection of oil, surfactant system, and the methods of preparation and incorporation of SE, determined in a previous study. The previously selected formulations were submitted to the study of preliminary and accelerated stability. The SE, the selected formulation (NDS - nanodispersion system) and the AMA were evaluated through in vivo model of writhing induced by acetic acid, by the oral and intraperitoneal routes (i.p.). The TLC profile demonstrated similarity in the composition of mature and immature fruit, and the AMA content was directly proportional to the alcohol content. Ethanol proved to be the best solvent system, as its extracts were not cytotoxic and showed antioxidant activity (IC50 approx. 20 µg/ml). In the study of preliminary and accelerated stability, NDSs proved to be unstable with increasing average size of the inner phase, but AMA HPLC content remained relatively constant. The pharmacological testing in vivo showed that the antinociceptive activity was enhanced for the SE incorporated into the SND at a dose of 100 mg/kg, with inhibition of the painful process (IM) calculated for 61.2% via the oral route, compared with the control group. In conclusion, this study demonstrates that the NDS, of average size of the internal phase of 10 nm, containing 5% oil, 10% surfactant and 1% ethanolic SE of fruits of R. ferruginea, increased the antinociceptive effect, representing a system with potential against nociception. Keywords: Nanodispersions. Rapanea ferruginea. Fruits. Antioxidant.
Antinociceptive.
LISTA DE FIGURAS Figura 1 Nanoemulsão do tipo O/A........................................................................ 34
Figura 2 Ilustração esquemática dos dois tipos de inversão de fases para a
preparação de nanoemulsões O/A.........................................................
36
Figura 3 Frutos maduros e imaturos da R. ferruginea.......................................... 39
Figura 4 Estrutura química dos ácidos mirsinoicos A e B, respectivamente...... 39
Figura 5 Teste de contorções abdominais............................................................ 49
Figura 6 Sistemas nanodispersos obtidos usando o diagrama pseudoternário... 62
Figura 7 Frutos maduros (1) e frutos imaturos (2) da R. ferruginea, antes (A) e
após a moagem (B).................................................................................
71
Figura 8 Distribuição granulométrica da droga vegetal- frutos maduros (FM) e
imaturos (FI) da R. ferruginea.................................................................
72
Figura 9 Soluções extrativas etanólicas (álcool 30, 50, 70, 90 e 96 ºGL)
contendo frutos maduros (1) e imaturos (2) da R. ferruginea.................
73
Figura 10 Cromatografia em camada delgada das soluções extrativas dos frutos
maduros (FM) e frutos imaturos (FI) da R. ferruginea nos diferentes
graus alcoólicos, utilizando como padrões o AMA e o AMB. Como
fase estacionária utilizou-se sílica gel (GF254) e, como fase móvel,
hexano:acetato de etila (6:4), após revelação com anisaldeído
sulfúrico e aquecimento..........................................................................
75
Figura 11 Exemplo de cromatograma das soluções extrativas dos frutos da R.
ferruginea por CLAE. Fase estacionária: coluna de fase reversa
Kinetex® C18 150 x 4,6 mm, com partículas core-shell com tamanho de
2,6 µm. Fases móveis: acetonitrila (ACN), metanol (MeOH) e água
acidificada com ácido fosfórico a pH 2,5. Leitura em comprimento de
onda = 260 nm........................................................................................
75
Figura 12 Cromatografia em camada delgada das soluções extrativas dos frutos
da R. ferruginea nos diferentes graus alcoólicos. Como fase
estacionária utilizou-se sílica gel (GF254) e, como fase móvel,
hexano:acetato de etila (6:4), após revelação com anisaldeído
sulfúrico e aquecimento..........................................................................
78
Figura 13 Teor de AMA (mg/g) para as soluções extrativas de álcool 70 °GL (A)
e álcool 96 °GL (B) dos frutos da R. ferruginea em relação à
proporção droga:solvente (%) e ao tempo (h)........................................ 79
Figura 14 Viabilidade das células L929 expostas às soluções extrativas dos
frutos da R. ferruginea na concentração de 5 µg/mL, utilizando como
controle negativo meio DMEM e DMSO 0,01%......................................
80
Figura 15 A: Atividade antioxidante do EM álcool 96 °GL dos frutos da R.
ferruginea; B: Atividade antioxidante do ácido ascórbico (Vit. C)...........
83
Figura 16 Análise visual das formulações do diagrama pseudoternário após 24 h
de preparo. A: formulações com EM dos frutos da R. ferruginea; B:
formulações sem EM..............................................................................
87
Figura 17 Tamanho médio da fase interna (nm) dos sistemas nanodispersos
contendo extrato mole dos frutos da R. ferruginea (SND_EM) e dos
sistemas nanodispersos sem extrato mole (SND), em função da
proporção de óleo e tensoativo (%)........................................................
88
Figura 18 Análise da distribuição de tamanho médio da fase interna por
intensidade dos sistemas nanodispersos contendo EM dos frutos da
R. ferruginea...........................................................................................
90
Figura 19 Aspecto visual dos sistemas nanodispersos, 1.1, 2.1, 5.1 e 14.1,
respectivamente, submetidos ao estudo de estabilidade preliminar.......
91
Figura 20 Análise do tamanho médio das formulações contendo EM dos frutos
da R. ferruginea sujeitas ao estudo de estabilidade preliminar..............
92
Figura 21 Fotomicrografias (MET) dos SND1 EM 1% - Aumento 20000 (A),
SND1 sem EM - Aumento 40000 (B), SND14 EM 1% - Aumento
25000 (C), SND14 sem EM (D) - Aumento 20000 e SND14 EM 0,25%
- Aumento 25000 (E)...............................................................................
94
Figura 22 Análise visual dos SND1 com e sem EM dos frutos da R. ferruginea
submetidos ao estudo de estabilidade acelerada...................................
96
Figura 23 Análise do tamanho médio dos SND com e sem EM dos frutos da R.
ferruginea sujeitos ao estudo de estabilidade acelerada........................
97
Figura 24 Exemplo do perfil cromatográfico apresentado em todas as condições
e tempos analisados para os SND1 com e sem extrato mole da R.
ferruginea submetidos ao estudo de estabilidade acelerada..................
99
Figura 25 Perfil dos cromatogramas das amostras submetidas ao teste de
fotoestabilidade na radiação UVA em 260 nm e 280 nm,
respectivamente...................................................................................... 101
Figura 26 Perfil dos cromatogramas das amostras submetidas ao teste de
fotoestabilidade na radiação visível em 260 nm e 280 nm,
respectivamente......................................................................................
101
Figura 27 Análise de agarose overlay para (1 e 4) extrato mole da R. ferruginea,
(2) SND1 sem EM, (3) controle negativo - meio DMEM, (4), (5) SND1
com EM 1%, (6) controle positivo – Triton X-100....................................
103
Figura 28 Efeito do extrato etanólico contendo os frutos de R. ferruginea (50 -
300 mg/kg), do AMA (40 mg/kg) e da indometacina (10 mg/kg)
administrados por via oral, sobre as contorções abdominais induzidas
por ácido acético (0,6%) em camundongos. Cada coluna representa a
média dos experimentos (N=8) seguidas dos respectivos E.P.Ms.
Asteriscos (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001) denotam significância
estatística quando comparado com o grupo controle (veículo). ANOVA
- Bon Ferroni...........................................................................................
104
Figura 29 Efeito do SND1 contendo extrato dos frutos da R. ferruginea (10 - 100
mg/kg) e da indometacina (10 mg/kg) administrados por gavagem (via
oral) sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético
(0,6%) em camundongos. Cada coluna representa a média dos
experimentos (n = 8) seguidas dos respectivos E.P.Ms. Asteriscos
(**p<0,01; ***p<0,001) denotam significância estatística quando
comparado com o grupo controle (veículo). ANOVA - Bon
Ferroni.....................................................................................................
105
Figura 30 Efeito do SND1 contendo extrato dos frutos da R. ferruginea (100
mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) administrados por via
intraperitoneal) sobre as contorções abdominais induzidas por ácido
acético (0,6%) em camundongos. Cada coluna representa a média
dos experimentos (n = 8) seguidas dos respectivos E.P.Ms. Asteriscos
(***p<0,001) denotam significância estatística quando comparado com
o grupo controle (sistema sem incorporação do extrato). ANOVA - Bon
Ferroni.....................................................................................................
105
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Relação dos compostos isolados e identificados da R. ferruginea.......... 43
Quadro 2 Relação entre os compostos isolados e atividade farmacológica da R.
ferruginea................................................................................................
44
Quadro 3 Relação de modelos utilizados nos estudos farmacológicos da R.
ferruginea................................................................................................
45
Quadro 4 Planejamento fatorial para o desenvolvimento das soluções extrativas. 56
Quadro 5 Gradiente empregado para análise em CLAE das soluções extrativas
da R. ferruginea......................................................................................
59
Quadro 6 Quantidades dos componentes do diagrama pseudoternário................ 63
Quadro 7 Composição das formulações submetidas ao espalhamento de luz
multi-ângulos...........................................................................................
66
Quadro 8 Classificação do grau de reatividade...................................................... 68
Quadro 9 Divisão dos grupos experimentais para a realização do teste
farmacológico de nocicepção induzida por ácido
acético.....................................................................................................
69
Quadro 10 Características físicas das formulações do diagrama pseudoternário
após centrifugação..................................................................................
87
LISTA DE TABELAS Tabela 1 Caracterização dos frutos maduros e imaturos moídos da R.
ferruginea.................................................................................................
72
Tabela 2 Rendimento (%), pH, resíduo seco (%), teor do AMA (mg/g) e área do
pico referente ao TGL das soluções extrativas a partir dos frutos
maduros e imaturos da R. ferruginea, variando-se o solvente de
extração..................................................................................................
74
Tabela 3 Rendimento (%), pH , resíduo seco (%), teor do AMA (mg/g) e área do
pico referente ao TGL das soluções extrativas dos frutos da R.
ferruginea na maximização do processo extrativo..................................
77
Tabela 4 Caracterização da solução extrativa a 5% (m/v) e extrato mole dos
frutos da R. ferruginea preparados com álcool 96 °GL, 5 h de
extração..................................................................................................
81
Tabela 5 Caracterização das formulações do diagrama pseudoternário quanto
ao tamanho médio da fase interna por número e PDI............................
89
Tabela 6 Resultados do estudo de estabilidade preliminar dos sistemas
nanodispersos (1.1, 2.1, 5.1 e 14.1).......................................................
93
Tabela 7 Comparação do tamanho médio da fase interna entre Goniômetro e
ZetaSizer Nano ZS..................................................................................
95
Tabela 8 Análise do PDI, potencial zeta e pH dos SND sujeitos ao estudo de
estabilidade acelerada............................................................................
98
Tabela 9 Análise por CLAE do sistema nanodisperso SND1 contendo 1% de
extrato mole dos frutos da R. ferruginea submetidos ao estudo de
estabilidade acelerada............................................................................
100
LISTA DE ABREVIATURAS AA = Atividade Antioxidante
Abs = Absorbância
AMA = Ácido mirsinoico A
AMB = Ácido mirsinoico B
ANOVA = Análise de Variância
ANVISA = Agência Nacional de Vigilância Sanitária
C+ = Controle Positivo
C- = Controle Negativo
CCD = Cromatografia em Camada Delgada
CIM = Concentração Inibitória Mínima
CLAE = Cromatografia de Alta Eficiência
DMEM = Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO = Dimetilsulfóxido
DPPH = 1,1-difenil-2-picrilhidrazina
EHL = Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo
EM = Extrato Mole
E.P.M. = Erro Padrão Médio
FI = Frutos Imaturos
FM = Frutos Maduros
IC50 = Concentração com inibição de 50%
IM = Inibição do processo doloroso
MET = Microscopia Eletrônica de Transmissão
NIQFAR = Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas
MTT = Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]
PIC = Phase Invertion Composition
PIT = Phase Invertion Temperature
PDI = Índice de Polidispersividade
SE = Solução Extrativa
SND = Sistema Nanodisperso
TGL = Triglicerídeo
UVA = Ultravioleta A
Vis = Visível
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 29
2 OBJETIVOS.......................................................................................... 31
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 31
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 31
3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................... 32
3.1 Nanoemulsões ................................................................................................... 33
3.1.1 Métodos de obtenção das nanoemulsões ................................................... 35
3.2 Rapanea ferruginea ........................................................................................... 37
3.3 Mecanismos de oxidação e Antioxidantes ...................................................... 46
3.4 Atividade antinociceptiva ................................................................................. 47
4 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 51
4.1 Material ............................................................................................................... 51
4.1.1 Droga vegetal .................................................................................................. 51
4.1.2 Reagentes e materiais .................................................................................... 51
4.1.3 Equipamentos ................................................................................................. 52
4.2 Métodos .............................................................................................................. 54
4.2.1 Caracterização da droga vegetal................................................................... 54
4.2.1.1 Perda por dessecação ................................................................................ 54
4.2.1.2 Determinação de cinzas totais ................................................................... 54
4.2.1.3 Determinação de cinzas insolúveis em ácido ........................................... 54
4.2.1.4 Análise granulométrica ............................................................................... 55
4.2.2 Obtenção dos derivados vegetais: da droga vegetal ao extrato mole ...... 55
4.2.3 Caracterização físico-química dos derivados vegetais .............................. 57
4.2.3.1 Determinação do rendimento ..................................................................... 57
4.2.3.2 Determinação do pH .................................................................................... 57
4.2.3.3 Determinação do resíduo seco .................................................................. 57
4.2.3.4 Análise do perfil cromatográfico dos derivados vegetais por CCD ........ 57
4.2.3.5 Quantificação do marcador por CLAE ....................................................... 58
4.2.3.6 Avaliação da citotoxicidade por MTT ........................................................ 59
4.2.3.7 Determinação da atividade antioxidante por DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazina) ......................................................................................................... 60
4.2.3.8 Determinação do coeficiente de partição do extrato ............................... 61
4.2.4 Pré-formulação e otimização dos sistemas nanoedispersos ..................... 61
4.2.6 Estudo de estabilidade e caracterização das formulações ........................ 64
4.2.6.1 Características organolépticas (aspectos físicos) ................................... 65
4.2.6.2 Determinação do pH .................................................................................... 65
4.2.6.3 Análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão (MET) 65
4.2.6.4 Análise morfológica e de propriedades de superfície ............................. 65
4.2.6.5 Perfil cromatográfico e teor em CLAE ....................................................... 66
4.2.6.6 Estudo de fotoestabilidade ......................................................................... 67
4.2.6.7 Avaliação da segurança do extrato mole da R. ferruginea e sistemas
nanodispersos ......................................................................................................... 67
4.3 Ensaio farmacológico ....................................................................................... 68
4.3.1 Animais ........................................................................................................... 68
4.3.2 Drogas e Tratamento ...................................................................................... 69
4.3.3 Nocicepção induzida por Ácido Acético ...................................................... 70
4.4 Análise estatística ............................................................................................. 70
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................... 71
5.1 Droga vegetal ..................................................................................................... 71
5.3 Maximização do processo extrativo ................................................................ 76
5.4 Caracterização dos derivados vegetais obtidos com álcool 96 °GL............. 79
5.4.1 Determinação da citotoxicidade pelo método MTT ..................................... 79
5.4.2 Caracterização físico-química do extrato mole selecionado ...................... 81
5.4.3 Determinação da atividade antioxidante por DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazina) ......................................................................................................... 82
5.4.4 Coeficiente de partição óleo/água ................................................................ 84
5.5 Desenvolvimento de sistemas nanodispersos ............................................... 85
5.6 Estabilidade preliminar ..................................................................................... 91
5.7 Caracterização dos sistemas nanodispersos ................................................. 93
5.7.1 Análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão ............. 93
5.7.2 Espalhamento de luz dinâmico multi-ângulos ............................................. 95
5.8 Estabilidade acelerada da formulação selecionada ....................................... 96
5.8.1 Análise dos sistemas nanodispersos por CLAE ......................................... 99
5.9 Fotoestabilidade .............................................................................................. 100
5.10 Avaliação da segurança do extrato mole da R. ferruginea e sistemas
nanodispersos ....................................................................................................... 102
5.11 Análise farmacológica .................................................................................. 103
6 CONCLUSÕES ................................................................................... 107
REFERÊNCIAS ..................................................................................... 109
29
1 INTRODUÇÃO
A nanotecnologia mostra-se promissora para diversas áreas de pesquisa e
aplicação. Trata-se de uma ciência fundamentada na capacidade de caracterizar,
manipular e organizar materiais em escala nanométrica, cujo processo de
preparação e tamanho diminuto lhes conferem propriedades químicas, físico-
químicas e comportamentais diferenciadas, como o movimento browniano, e a
estabilização estérica, que reduzem a atuação da força da gravidade e resultam em
estabilidade por um longo período de tempo (FDA, 2014; FRONZA et al., 2007; LEE,
2004; RSRAE, 2004).
Na área farmacêutica, a nanotecnologia pode estar presente na forma de
nanoemulsões, que constituem uma classe de emulsões com gotículas uniformes,
com até 500 nm. As características peculiares das nanoemulsões, tanto de
formulação como de processo e produto, tem se tornado um atrativo do ponto de
vista industrial, popularizando-se como veículos para a dispersão otimizada de
fármacos para medicamentos e de ativos para cosméticos (ANTON; BENOIT;
SAULNIER, 2008; GUTIÉRREZ et al., 2008; SOLÈ et al., 2006; SONNEVILLE-
AUBRUN; SIMONNET; L’ALLORET, 2004; TADROS et al., 2004; XIN et al., 2013).
Segundo a Agência Brasileira de Desenvolvimento Industrial (ABDI, 2010), a
pesquisa científica em nanotecnologia no setor cosmético e farmacêutico tem
apresentado crescimento expressivo no Brasil, o qual pode ser observado pelo
número de publicações em periódicos nacionais e internacionais indexados e de
considerável impacto. As pesquisas referem-se principalmente à avaliação de
eficácia, segurança e estabilidade de produtos envolvendo novas substâncias ativas
com finalidades terapêuticas.
O desenvolvimento de formulações contendo extratos vegetais tem sido
intensamente valorizado, devido às atividades benéficas que a composição de
princípios ativos presentes nestes extratos podem exercer e pelo conceito de que
são seguros e biocompatíveis, fatores que reforçam a atual tendência de utilização
de produtos naturais (BLOISE, 2003; OYEDEJI; OKEKE, 2010; SANTOS et al.,
2007). Atualmente, dá-se também importância aos frutos presentes nas espécies
vegetais, que além de possuírem um grande valor nutritivo, apresentam efeitos
30
medicinais, estando entre os maiores agentes terapêuticos obtidos da natureza (IHA
et al., 2008).
Nesse contexto, considerando a importância dos fatores existentes, este
trabalho visa explorar o potencial de uma espécie vegetal denominada Rapanea
ferruginea, que tem sido estudada pelos pesquisadores do Núcleo de Investigações
Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da Universidade do Vale do Itajaí. Esta pertence
à família Myrsinaceae e apresenta-se como arbustos ou árvores de pequeno porte,
com folhas elípticas e frutos arredondados, pequenos e de coloração negro-
arroxeada quando maduros. É popularmente conhecida como capororoca, azeitona-
do-mato, camará, capororocaçu, capororoca-vermelha, pororoca e capororoca-mirim
e pode ser encontrada em todo sul do Brasil (PASCOTTO, 2007).
Os estudos existentes com a Rapanea ferruginea têm demonstrado
resultados positivos quanto à sua capacidade antioxidante dentre outras atividades
farmacológicas a partir de extratos dos frutos, caules e cascas, dos quais já foram
isolados os compostos ácido mirsinoico A (AMA), ácido mirsinoico B (AMB) e um
triglicerídeo (TGL) ainda não elucidado (ANTONIALLI, 2009; BACCARIN, 2010;
BARRETTA, 2011; COSTA, 2011; GALVAN, 2007; GAZONI, 2009; HESS, 2006).
Considerando os benefícios do emprego de extratos vegetais como agentes
terapêuticos, associados às vantagens da nanotecnologia, ao melhorar a sua
biodisponibilidade e potencializar a ação farmacológica, este trabalho teve por
objetivo o desenvolver sistemas nanodispersos contendo o extrato etanólico dos
frutos da Rapanea ferruginea e avaliar sua atividade antinociceptiva, pelo modelo de
contorções abdominais indizidas pelo ácido acético em camundongos.
31
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver sistemas nanodispersos contendo extrato dos frutos da Rapanea
ferruginea e avaliar a atividade antinociceptiva dos sistemas em modelo
farmacológico in vivo.
2.2 Objetivos Específicos
- Caracterizar a droga vegetal por meio de ensaios farmacopeicos;
- Obter e caracterizar os derivados vegetais (soluções extrativas e extrato mole) dos
frutos de Rapanea ferruginea, analisando as características físicas e químicas, como
resíduo seco, pH, perfil em CCD e CLAE,
- Avaliar a citotoxicidade in vitro das soluções extrativas;
- Avaliar a atividade antioxidante e o coeficiente de partição do extrato mole;
- Otimizar a obtenção dos sistemas nanodispersos, usando diagrama
pseudoternário, a partir das condições selecionadas em estudo anterior;
- Caracterizar os sistemas nanodispersos selecionados e avaliar a sua estabilidade
preliminar e acelerada;
- Avaliar a atividade antinociceptiva do extrato mole, AMA e sistema nanodisperso.
32
33
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Nanoemulsões
Ao longo das últimas décadas, extensas pesquisas têm mantido o foco em
nanotecnologia, que compreende a habilidade de caracterizar, manipular e organizar
materiais em escala nanométrica (1 x 10-9 m) (ARMAREGO; CHAI, 2013; LEE, 2004;
NSET, 2000) e que se mostra amplamente promissora em diversas áreas da ciência
e tecnologia (ANTON; BENOIT; SAULNIER, 2008; FDA, 2014; TAYLOR;
OTTEWILL, 1994), como a de medicamentos e cosméticos (PASCHOALINO;
MARCONE; JARDIM, 2010).
Atualmente, um grande número de produtos farmacêuticos de base
nanotecnológica estão disponíveis no mercado mundial e podem estar presentes na
forma de nanoemulsões, como são mais comumente denominadas. Para o uso de
medicamentos destinados a via oral, as nanoemulsões tornam-se interessantes
alternativas como sistemas de liberação de fármacos, aumentando a
biodisponibilidade, a eficácia terapêutica e diminuindo os efeitos adversos (ALVES;
POHLMANN; GUTERRES, 2005; MCCLEMENTS, 2011).
Uma nanoemulsão pode ser considerada uma emulsão convencional
contendo gotículas muito pequenas (MCCLEMENTS, 2012; XIN et al., 2013). Na
literatura, ainda não há um consenso quanto ao tamanho nanométrico de gotículas
das nanoemulsões, que variam até 500 nm, estabelecidas com base em critérios de
propriedades ópticas e de aplicação pretendida (FRONZA et al., 2007; LIU et al.,
2011; SOLANS; SOLÉ, 2012; SUTRADHAR; AMIN, 2013; YILMAZ; BORCHERT,
2005).
Usualmente, a nanoemulsão é uma preparação constituída por óleo, água,
tensoativo e possivelmente um co-tensoativo. Podem ser do tipo óleo-em-água (O/A)
ou água-em-óleo (A/O), dependendo se o óleo é disperso como gotículas em água,
ou vice versa. Considerando que nanoemulsões do tipo O/A vêm sendo usadas para
formulações cosméticas e medicamentosas, é de fundamental importância saber
que uma nanoemulsão O/A consiste em pequenas gotículas compostas de óleo na
fase interna e tensoativos dispersos dentro de um meio aquoso (Figura 1), podendo
aumentar a solubilidade de uma quantidade considerável de fármacos lipossolúveis
no domínio hidrofóbico da fase interna oleosa e, portanto apresenta potencial de
34
aplicação terapêutico como transportadores destes fármacos (MCCLEMENTS,
2012).
Figura 1 – Nanoemulsão do tipo O/A.
Fonte: CHAUDHARY; GAUTAM; KUMAR, 2014.
Devido ao seu tamanho característico, nanoemulsões são transparentes ou
translúcidas a olho nu (quando o tamanho médio da fase interna é menor que 30
nm) e possuem estabilidade frente à sedimentação ou formação de cremeação,
sendo cineticamente estáveis. A elevada estabilidade coloidal pode ser
compreendida a partir da estabilização estérica das nanoemulsões (TADROS et al.,
2004; MCCLEMENTS, 2012; XIN et al., 2013), caracterizadas por uma excelente
estabilidade em dispersão, devido ao tamanho das gotas, uma vantagem
fundamental para aplicação industrial (ANTON et al., 2007). No entanto, a principal
causa de instabilidade cinética é devido à maturação de Ostwald, isto é, a difusão de
gotículas pequenas para gotas maiores, que ocorre quando o óleo possui alguma
solubilidade com a fase aquosa, fazendo com que a nanoemulsão perca sua
transparência com o tempo, tendo então como resultado, o aumento de tamanho
das gotículas. Este fenômeno pode ser evitado com a adição de uma segunda fase
de óleo com uma solubilidade muito baixa em água, ou adição de tensoativos não-
iônicos, e/ou polímeros, que são insolúveis em meio aquoso e fortemente adsorvidos
na interface O/A (ANTON; VANDAMME, 2009; SOLANS, SOLÉ, 2012; TADROS et
al., 2004).
Segundo Tadros et al. (2004) e Sutradhar e Amin (2012), as vantagens das
nanoemulsões em relação às emulsões tradicionais em função do tamanho diminuto
das gotículas são explicados devido aos seguintes fenômenos:
35
- o movimento browniano que é capaz de superar a força da gravidade, diminuindo
fenômenos de instabilidade como cremeação e sedimentação;
- a redução dos efeitos de floculação, fazendo com que o meio permaneça disperso
sem separação;
- o aumento da biodisponibilidade e a solubização de ativos lipofílicos quando
administrados via oral;
- a possível penetração na superfície da pele, melhorando a penetração de ativos,
sendo que a grande área de superfície deste sistema aumenta a superfície de
contato, permitindo uma rápida penetração dos ativos, além da capacidade de
distribuição eficiente desses ativos pela pele.
Na literatura, ainda existem algumas divergências relacionadas aos conceitos
de nanoemulsões e microemulsões, uma vez que são sistemas coloidais, formados
por tensoativo, água e óleo e apesar do termo “micro”, as microemulsões também
apresentam gotículas de tamanho nanométrico e características estruturais e visuais
semelhantes às nanoemulsões em determinadas condições. A principal diferença se
refere à estabilidade termodinâmica, pois enquanto que microemulsões são sistemas
termodinamicamente estáveis, nanoemulsões são termodinamicamente instáveis
(BRUXEL et al., 2012; MCCLEMENTS, 2012).
3.1.1 Métodos de obtenção das nanoemulsões
As nanoemulsões são formadas através de métodos que envolvem alta ou
baixa energia de emulsificação (IZQUIERDO et al., 2005; PEY et al., 2006; SOLANS;
SOLÉ, 2012).
Os métodos de alta energia de emulsificação utilizam homogeneizadores de
alta pressão ou geradores de ultrassom para promover o cisalhamento capaz de
deformar a gotícula. A aplicação de alta energia gera forças que podem romper as
gotas de fase dispersa, de forma que a diferença entre as pressões interna e externa
da gota seja superada (Lei de Young-Laplace). Estas técnicas permitem melhor
controle da granulometria e ampla escolha de constituintes. Contudo, os
equipamentos são de alto custo, limitando a viabilidade industrial destes processos
(FERNANDEZ et al., 2004; SOLANS; SOLÉ, 2012).
Os métodos de baixa energia de emulsificação empregam a energia química
armazenada no sistema e podem ser classificados quanto à inversão ou não de fase
36
da curvatura espontânea do tensoativo produzido durante a emulsificação (ANTON;
VANDAMME, 2009). A formação de nanoemulsão desencadeada pela rápida
difusão do tensoativo e/ou moléculas de solvente a partir da fase dispersa na fase
contínua, sem envolver uma alteração da curvatura espontânea do tensoativo é
referida como "auto-emulsão". O método de emulsificação espontânea é utilizado na
indústria farmacêutica para se obter nanoemulsões O/A como veículos para
fármacos lipofílicos em um meio aquoso, com baixo consumo de energia. Quando
ocorrem alterações na curvatura espontânea do tensoativo durante o processo de
emulsificação, estes são designados como "métodos de inversão de fase", podendo
ocorrer à temperatura constante, variando-se a composição do sistema (Phase
Inversion Composition - PIC) ou à composição constante, variando-se a temperatura
do sistema (Phase Inversion Temperature – PIT), conforme mostra a Figura 2
(FERNANDEZ et al., 2004; PORRAS et al., 2008; SOLANS; SOLÉ, 2012).
Figura 2 - Ilustração esquemática dos dois tipos de inversão de fases para a preparação de nanoemulsões O/A.
Nota: A linha preta sólida marca o local de inversão e as linhas pontilhadas a zona de histerese. Fonte: FERNANDEZ et al., 2004.
O método de temperatura de inversão de fases (PIT) está baseado na
mudança da solubilidade dos tensoativos com a mudança na temperatura do
sistema forçando uma transição da emulsão A/O em altas temperaturas para uma
emulsão O/A em baixas temperaturas. Pode ser aplicado somente a tensoativos
sensíveis a mudanças de temperatura, como os tensoativos não-iônicos
polietoxilados em que o aumento na temperatura induz uma desidratação das
cadeias de poli (oxietileno), ou seja, as pontes de hidrogênio entre os átomos de
37
oxigênio desses grupos e os átomos de hidrogênio da água deixam de ocorrer,
modificando sua afinidade pelas fases aquosa e oleosa (SOLANS; SOLÉ, 2012).
Este método consiste em preparar a nanoemulsão na sua temperatura de inversão
de fase ou equilíbrio de temperatura hidrófilo-lipófilo (EHL), onde as propriedades
hidrofílicas e lipofílicas do sistema são equilibradas (a curvatura espontânea média
das moléculas de surfactante é zero) e se atinge uma mínima tensão interfacial, para
promover a emulsificação, o que predispõe a formação de gotículas finamente
dispersas. Pela técnica PIT são formadas emulsões com tamanho de gotícula muito
pequeno que apresentam ótima estabilidade (FERNANDEZ et al., 2004;
MCCLEMENTS, 2011; TADROS et al., 2004).
A concentração de eletrólitos e as mudanças nos valores de pH são fatores
que também devem ser considerados, pois podem interferir na afinidade do
tensoativo pela fase aquosa ou oleosa, bem como o grau de etoxilação dos
tensoativos não-iônicos, pois quanto maior for o grau de etoxilação (e
consequentemente elevados valores de EHL), maior será a temperatura de inversão
de fases (IZQUIERDO et al., 2005; MCCLEMENTS, 2011; TADROS et al., 2004).
A técnica da variação da composição do sistema (PIC) também pode
promover a transição espontânea no raio da curvatura. Pela sucessiva adição de
água na fase oleosa, formam-se glóbulos de água nesta fase contínua. Aumentando
o volume da fração de água ocorre uma mudança espontânea na curvatura das
moléculas de tensoativo, denorminada inversão de fases catastrófica, causando
inversão de emulsão A/O para O/A, onde a mínima tensão superficial é atingida,
facilitando a formação de pequenas gotículas. Este método de emulsificação ocorre
à temperatura constante, sem a necessidade de aquecimento da amostra a uma
determinada temperatura (SOLANS; SOLÉ, 2012).
3.2 Rapanea ferruginea
A Rapanea ferruginea é uma espécie vegetal pertencente à família
Myrsinaceae, que consiste aproximadamente de 44 gêneros e 1400 espécies de
árvores e arbustos (LORENZI, 2000). As espécies são caracterizadas pela presença
de compostos como 2,5-di-hidroxi-3-alquilbenzoquinonas e uma série de
triterpenoides baseados nos esqueletos oleanano e/ou ursano (MANGURO et al.,
38
2003). No Brasil encontram-se 8 gêneros e cerca de 70 espécies (LORENZI;
SOUZA, 2000).
Plantas da família Myrsinaceae têm sido conhecidas por apresentar inúmeras
propriedades farmacológicas interessantes, como atividades anti-inflamatória,
antiviral, antitumoral, citotóxica e leishmanicida (AL-MEKHLAFI et al., 2012).
Adicionalmente, um estudo realizado com uma espécie desta família, a Labisia
pumila, demonstrou que o extrato possui alto potencial antioxidante e fotoproteção
às células cutâneas contra a radiação ultravioleta, extendendo a sua aplicação como
produto cosmético (CHOI et al., 2010; CHUA et al., 2011; MUKHERJEE et al., 2011).
O gênero Rapanea ou Myrsine é representado morfologicamente por árvores
de pequeno a médio porte, folhas simples alternadas no caule, encontrado perto de
áreas litorâneas (LORENZI, 2000). Os derivados de ácidos benzoicos diprenilados
têm sido os principais compostos isolados a partir deste gênero, incluindo os ácidos
mirsinoicos A, B, C, E e F. Estes compostos têm demonstrado atividade analgésica e
anti-inflamatória (BACCARIN, 2010). Há também estudo relatado com a espécie
deste gênero na área cosmética, a espécie denominada Myrsine africana é utilizada
na forma de pó para suspensão aquosa como tônico de pele e seu extrato já foi
estudado para tingimento de fibras de queratina e uso cosmético como
despigmentante, em função da presença de compostos fenólicos como seus
constituintes químicos (MOMTAZ; LALL; BASSON, 2008).
Para a espécie Rapanea ferruginea dois sinônimos são encontrados na
literatura botânica: Myrsine floculosa e Gaballeria ferruginea, no entanto, o nome
científico válido é Rapanea ferruginea (LORENZI, 1992). A R. ferruginea é uma
espécie pantropical e possui ampla distribuição pelo território brasileiro, estando
presente nos estados da Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São
Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Sua distribuição estende-se a
outras regiões da América do Sul, em países como a Bolívia, México, Argentina,
Paraguai e Uruguai (SPATHELF et al., 2001).
A R. ferruginea é uma planta popularmente conhecida como canela-azeitona,
azeitona-do-mato, camará, capororocaçu, capororoca-vermelha, pororoca,
capororoca, capororoca-mirim. Apresenta-se como um arbusto de pequeno a médio
porte, e ocorre em quase todas as formações vegetais, principalmente nas encostas
e beiras de córregos, floresce duas vezes ao ano, podendo estar com flores e frutos
maduros na mesma árvore. Os frutos são pequenos, geralmente com 3-5 mm
39
diâmetro, globulosos e de coloração negro-arroxeada quando maduros (Figura 3);
apresentam uma única semente e um pericarpo delgado (PASCOTTO, 2007). Os
frutos maduros são produzidos anualmente em grande quantidade, possuem alto
poder de germinação e servem de alimento para diversas aves (SPATHELF et al.,
2001).
Figura 3 – Frutos maduros e imaturos da R. ferruginea.
Fonte: KUHLMANN, 2012.
A planta apresenta uma concentração significativa de ácidos benzoicos
prenilados. Dentre estes, o ácido mirsinoico A (AMA) e o ácido mirsinoico B (AMB)
apresentam-se como os principais componentes do metabolismo secundário desta
espécie (Figura 4). O AMA é um composto fenólico encontrado principalmente nos
frutos, estando o AMB em maior concentração em outras partes da R. ferruginea,
como as cascas (COSTA, 2011).
Figura 4 – Estrutura química dos ácidos mirsinoicos A e B, respectivamente.
40
Na literatura há quatro espécies do gênero Rapanea estudadas no Brasil,
sendo três destas espécies relatadas no estudo de Januário et al. (1992), as quais
são designadas R. umbellata, R. lancifolia e R. guyanensis, da qual foram isolados
os ácidos mirsinoicos A, B e C e dois compostos triterpenoides, e a R. ferruginea
que vem sendo estudada na Universidade do Vale do Itajaí.
Stieven (2005) avaliou o efeito hipoglicemiante do extrato bruto clorofórmico
da R. ferruginea sobre a liberação de insulina em animais normoglicêmicos. Os
resultados indicaram que a administração do extrato nas concentrações de 200 e
300 mg/kg apresentou perfil semelhante à glibenclamida, fármaco utilizado na
terapêutica do diabetes, enquanto que a dose de 1000 mg/kg não apresentou o
mesmo perfil farmacológico, indicando que a Rapanea ferruginea pode atuar na
liberação de insulina em baixas concentrações.
Turmina (2005) realizou estudo fitoquímico das cascas da R. ferruginea e
determinou a estrutura dos metabólitos mais abundantes por meio de técnicas
cromatográficas e espectroscópicas (infravermelho e ressonância magnética
nuclear). O extrato clorofórmico permitiu o isolamento do AMB e de compostos
sugestivos como álcool de cadeia longa, e outros três compostos que indicam ser
derivados de ácido benzoico prenilado.
Hess (2006) avaliou a atividade antinociceptiva do AMB extraído da Rapanea
sp. Os resultados indicaram que o AMB, quando testado nas doses de 3 – 60 mg/kg
via intraperitoneal e 150 – 500 mg/kg via oral, apresentou importante efeito
antinociceptivo evidenciado em diversos modelos experimentais de dor em
camundongos, o que torna este composto e seus análogos atraentes para o estudo
e desenvolvimento de fármacos analgésicos.
Galvan (2007) avaliou a atividade anti-hiperalgésica do extrato bruto
clorofórmico de R. ferruginea e do composto isolado AMB na dor neuropática
diabética, visando contribuir para terapêuticas alternativas. Os resultados mostraram
que tanto o extrato bruto (200 e 300 mg/kg) quanto o composto isolado AMB (60
mg/kg) produzem efeitos antinociceptivos semelhantes ao da morfina contra a dor
neuropática induzida por diabetes, tornando-se útil para estudo e desenvolvimento
de novos fármacos com atividade antinociceptiva para esta condição.
Fronza e Giuradelli (2009) realizaram estudo sobre a composição química do
extrato de diclorometano das cascas da R. ferruginea na busca de outras
substâncias que possam contribuir para o esclarecimento de seu potencial
41
farmacológico. Os autores isolaram os ácidos mirsinoicos A e C, além do AMB, por
meio de técnicas cromatográficas. Ainda foi possível o isolamento de um
hidrocarboneto e dois outros compostos sugestivos de ácidos mirsinoicos. As
estruturas foram elucidadas por técnicas espectroscópicas como infravermelho e
ressonância magnética nuclear.
Gazoni (2009) realizou estudo fitoquímico do extrato etanólico de frutos,
caules e folhas da R. ferruginea e analisou a atividade antiacetilcolinesterásica de
extratos e compostos isolados. Além do AMA e do AMB, foi possível isolar o
espinasterol, um ácido graxo de cadeia longa e um álcool de cadeia longa, por meio
de técnicas cromatográficas. A atividade antiacetilcolinesterásica foi maior para os
compostos AMA, AMB, e espinasterol em comparação aos extratos das folhas,
caules e frutos. No teste in vitro a atividade foi mais intensa no cérebro total
(30,10%) do que no hipocampo (22,08%) para o AMB na concentração de 44 µM.
Fillipin (2010) avaliou a atividade anticolinesterásica dos compostos AMA e
AMB obtidos por meio de extrato etanólico da R. ferruginea em estudos in vitro
utilizando tecidos cerebrais de ratos. Os resultados mostraram-se satisfatórios,
sendo que o AMA apresentou atividade superior ao AMB em todos os tecidos
cerebrais. A IC50 do AMA no hipocampo e no cérebro total foram de 35,80 µM e
34,83 µM respectivamente, o que o torna um composto promissor para melhora da
transmissão colinérgica por produtos naturais.
Kazmierczak (2010) avaliou a atividade antimicrobiana dos extratos (cascas,
caule, folhas e frutos) e das frações e substâncias (AMA, AMB e compostos
modificados do AMB) obtidas da R. ferruginea, utilizando o método de diluição em
ágar. Os resultados demonstraram que os compostos extraídos da R. ferruginea não
apresentaram atividade contra bactérias gram-negativas e fungos até a
concentração de 1000 µg/mL, mas os extratos apresentaram atividade seletiva para
bactérias gram-positivas testadas com concentração inibitória mínima (CIM) entre
31,2 a 1000 µg/mL, assim como as substâncias isoladas com valores de CIM desde
7,8 até 500 µg/mL, com destaque para o AMA.
Antonialli (2009) avaliou o efeito antinociceptivo do AMB, extraído das cascas
da R. ferruginea, em diferentes modelos de hipernocicepção inflamatória e
neuropática persistentes em camundongos, bem como seu mecanismo de ação. Os
resultados obtidos neste estudo permitiram concluir que o AMB, quando
administrado oralmente nas doses de 3 a 30 mg/kg, apresenta efeito anti-
42
hipernociceptivo marcante, podendo constituir uma nova alternativa para o
tratamento de distúrbios sensoriais em humanos.
Baccarin et al. (2011) desenvolveram extrato seco hidroalcoólico padronizado
das cascas de R. ferruginea por spray drying e avaliaram a atividade antinociceptiva
in vivo nas doses de 150, 300 e 500 mg/kg via oral e 10, 30 e 60 mg/kg via
intraperitoneal através do modelo da formalina. O etanol 90 °GL e o tempo de
extração de 2 h foram identificados como as condições ótimas para a extração das
cascas, tendo-se como indicador o AMB (BACCARIN, 2010). Os extratos mole e
seco demonstraram melhor resposta na dor inflamatória, não havendo relação com o
teor de AMB.
Tomio (2011) avaliou a atividade antitumoral e a citotoxicidade dos extratos
etanólicos das cascas, galhos, folhas e frutos bem como os compostos isolados da
R. ferruginea (AMA, AMB, AMC e derivados de AMB) através de ensaios in vitro e in
vivo de crescimento tumoral. Os resultados apresentaram níveis significativos de
citotoxicidade em concentração de 100 µg/mL para algumas das linhagens celulares
testadas, indicando como fonte promissora para o desenvolvimento de moléculas
bioativas frente às células tumorais.
Costa (2011) avaliou os efeitos do extrato diclorometano de frutos da R.
ferruginea e seus compostos isolados sobre a memória de animais normais e
animais com doença de Alzheimer induzida por estreptozotocina. Pôde-se constatar
melhora da cognição nos animais tratados com o extrato de R. ferruginea nas doses
de 150 e 300 mg/kg, com o AMA nas doses de 15 e 30 mg/kg e com o TGL na dose
de 5 mg/kg.
Barretta (2011) avaliou a atividade antioxidante dos extratos etanólicos das
cascas e frutos e dos compostos isolados (AMA, AMB e AMC) da R. ferruginea
empregando os métodos radicalares indiretos: ORAC (Capacidade de absorção do
radical oxigênio); DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina); ABTS+.(2,2’-azino-bis-(3-
etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico); quantificação de fenólicos totais e teste de
quelação de metais. Os resultados demonstraram que tanto os extratos como os
compostos isolados apresentam potencial antioxidante significativo na concentração
de 10 μg/mL.
No Quadro 1, foram agrupados de forma sistemática, os compostos isolados
das diferentes partes da planta, a sua atividade farmacológica no Quadro 2, e por
43
fim, a relação dos modelos utilizados na avaliação da atividade biológica da R.
ferruginea (Quadro 3).
Quadro 1– Relação dos compostos isolados e identificados da R. ferruginea.
*Baccarin (2010) avaliou a otimização do processo de extração resultando em 27 lotes de soluções extrativas. Foram analisados a graduação alcoólica do solvente (50, 70 e 90 ºGL), a granulometria da droga vegetal e o tempo de extração. As melhores condições foram apresentadas em solução hidroalcoólica 90 ºGL e tempo de extração de 2 h.
Parte da planta
Composto isolado Solvente Rendimento Referência
Cascas
AMB Clorofórmio 20 mg%
Turmina (2005)
Álcool de cadeia longa Clorofórmio 20 mg%
Derivado de ácido benzoico prenilado 1
Clorofórmio 3 mg%
Derivado de ácido benzoico prenilado 2
Clorofórmio 1 mg%
Derivado de ácido benzoico prenilado 3
Clorofórmio 2 mg%
Cascas AMB Clorofórmio 720 mg% Hess (2006);
Antonialli (2009)
Cascas
AMA Diclorometano 40 mg%
Fronza; Giuradelli
(2009)
AMB Diclorometano 350 mg%
AMC Diclorometano 30 mg%
Hidrocarboneto Diclorometano 2 mg%
Composto sugestivo de ácido mirsinoico
(AM1) Diclorometano 10 mg%
Composto sugestivo de ácido mirsinoico
(AM2) Diclorometano 2 mg%
Cascas AMB Hidroalcoólico 221 a 726
mg% *Baccarin
(2010)
Frutos
AMA Diclorometano 50 mg%
Costa (2011) Triglicerídeo (TGL) não identificado
Diclorometano 160 mg%
44
Quadro 2 – Relação entre os compostos isolados e atividade farmacológica da R. ferruginea.
Parte da Planta
Composto / Tipo de extrato
Atividade Modelo Referência
Cascas Extrato clorofórmico Hipoglicemiante In vivo Stieven (2005)
Cascas AMB/extrato clorofórmico Antinociceptiva In vivo Hess (2006)
Cascas AMB/extrato clorofórmico Antinociceptiva
sobre a neuropatia diabética
In vivo Galvan (2007)
Cascas AMB/extrato clorofórmico Antinociceptiva In vivo Antonialli
(2009)
Frutos, folhas e caules
AMA, AMB, espinasterol/extrato
etanólico Anticolinesterásica
Bioautográfico e
in vitro
Gazoni (2009)
Cascas AMB/extrato hidroalcoólico Antinociceptiva In vivo Baccarin (2010)
Frutos, folhas e caules
AMA e AMB/extrato etanólico
Anticolinesterásica In vitro Fillipin (2010)
Cascas, caules, folhas e frutos.
AMA, AMB e compostos modificados de AMB/extrato
diclorometano Antimicrobiana In vitro
Kazmierczak (2010)
Cascas, folhas e frutos
AMA, AMB, AMC, derivados/extrato etanólico
Citotóxica e antitumoral
In vivo e in
vitro
Tomio (2011)
Frutos AMA e triglicerídeo (TGL) não identificado/extrato
diclorometano Cognitiva
In vivo e in vitro
Costa (2011)
Cascas e frutos
AMA, AMB, AMC/extrato etanólico
Antioxidante In vitro Barretta (2011)
45
Quadro 3 – Relação de modelos utilizados nos estudos farmacológicos da R. ferruginea.
Modelo Nome do modelo Referências
In vivo
- Administração do extrato bruto de Rapanea sp. sobre a glicemia pós-prandial de animais normoglicêmicos - Administração do extrato bruto de Rapanea sp. durante quinze dias
Stieven (2005)
In vivo
- Testes de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético - Avaliação do tempo de reação (Time Course) - Modelo de dor induzida pela Formalina - Modelo de dor induzida pela Capsaicina - Modelo de dor induzida pelo Glutamato - Modelo de dor induzida pelo calor (Hot Plate) - Modelo de hiperalgesia (Randall-Selitto) - Modelo de toxicidade aguda - Modelo de citotoxicidade induzida pela Artemia salina - Modelo do campo aberto Open Field
Hess (2006)
In vivo - Modelo de indução de Diabetes mellitus com aloxano - Modelo de indução de Diabetes mellitus com estreptozotocina
Galvan (2007)
In vivo
- Hipernocicepção induzida pela Carragenina - Hipernocicepção inflamatória induzida pelo adjuvante completo de Freund (CFA) - Dor neuropática induzida pela constrição parcial do nervo ciático (CPNC) - Análise do limiar mecânico através do filamento de Von Frey - Análise do limiar térmico através do teste de retirada da pata (Hargreaves - estímulo quente) - Teste da acetona (hipernocicepção ao estímulo frio) - Avaliação do desempenho motor (Rota Rod) - Avaliação da atividade locomotora (Open Field) - Medida da temperatura retal
Antonialli (2009)
Bioautográfico In vitro
- Determinação da atividade anticolinesterásica em cérebro total e hipocampo de ratos - Ensaio enzimático (método espectrofotométrico)
Gazoni (2009)
In vivo - Modelo de dor induzido pela formalina Baccarin (2010)
In vitro - Ensaio enzimático (método espectrofotométrico) Fillipin (2010)
In vivo - Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de diluição em ágar
Kazmierczak (2010)
In vitro In vivo
- Avaliação da morte celular por microscopia de fluorescência (brometo de etídeo e diacetato de fluoresceína/brometo de etídeo e alaranjado de acridina) - Influência sobre crescimento tumoral - Método do campo aberto (Open field)
Tomio (2011)
In vivo In vitro
- Modelo de avaliação da memória - Teste da esquiva inibitória - Modelo de deambulação – Teste do Open field - Modelo de ansiedade - Labirinto em cruz elevado (LCE) - Indução de Alzheimer pelo modelo da Estreptozotocina - Determinação da atividade da Superóxido Dismutase (SOD) - Determinação da atividade da Catalase (CAT) - Determinação da atividade da Glutationa Peroxidase (GPx) - Determinação da atividade da Glutationa Redutase (GR) - Determinação dos níveis de Malondialdeído (MDA)
Costa (2011)
In vitro
- Avaliação da atividade antioxidante total pelo método do ORAC - Determinação da atividade antioxidante via DPPH - Determinação da atividade antioxidante via ABTS+ - Identidade da atividade antioxidante através do teste de quelação de metais - Avaliação da atividade citotóxica em célula L929 - Avaliação da atividade citoprotetora em célula L929 - Avaliação da atividade antigenotóxica – proteção do plasmídeo pBSK II
Barretta (2011)
46
3.3 Mecanismos de oxidação e Antioxidantes
A exposição prolongada aos raios ultravioleta ativa reações que causam a
depleção de antioxidantes celulares e antioxidantes produtores de enzimas
existentes na pele, conduzindo a um estado de estresse oxidativo. O estresse
oxidativo é um fenômeno que ocorre quando a capacidade de defesa antioxidante é
menor do que a quantidade de espécies reativas formadas pelas radiações solares,
denominadas radicais livres. Radicais livres são moléculas altamente reativas,
caracterizadas por um ou mais elétrons não pareados em seu orbital mais externo,
que podem causar a morte de células e tecidos (KAUR; KAPILA; AGRAWAL, 2007).
Os antioxidantes, por sua vez, referem-se a substâncias que têm por
característica diminuir ou bloquear as reações de oxidação induzidas por radicais
livres, pela doação de elétrons a estes, que assim se estabilizam (SCOTTI et al.,
2007).
Em princípio, a suplementação oral ou tópica de antioxidantes pode reduzir os
danos oxidativos induzidos pela radiação ultravioleta, desde que sejam
primeiramente absorvidos, e alcancem o tecido alvo na forma ativa (DAUDT et al.,
2013).
As espécies vegetais são ricas em compostos antioxidantes devido a sua
própria natureza de proteção aos radicais livres formados pela radiação ultravioleta
necessária à fotossíntese. Os compostos fenólicos formam o maior grupo de
antioxidantes extraídos de vegetais, sendo capazes de neutralizar a reatividade
radicalar através da doação de um átomo de hidrogênio (MAHDI et al., 2011).
No entanto, os extratos vegetais podem ter a atividade antioxidante
comprometida em razão de sua instabilidade físico-química, tornando-se alvo para
as pesquisas de desenvolvimento que empregam a nanotecnologia, como estratégia
para a estabilização de das matérias-primas ativas e produto final (DAUDT et al.,
2013).
Além disso, estudos das propriedades antienvelhecimento das substâncias
ativas vêm despertando muito interesse de pesquisadores, considerando o aumento
da expectativa de vida observado nas últimas décadas e a busca da qualidade de
vida durante o processo de envelhecimento. Desta forma, é preocupação constante
prevenir e atenuar o fotoenvelhecimento por meio da busca e do estudo de
47
substâncias antioxidantes eficazes, que são oferecidas em produtos inovadores aos
consumidores (SCOTTI et al., 2007).
Para nanoemulsões via oral, estudos relatam a melhora da biodisponibilidade
dos antioxidantes que apresentam baixa solubilidade aquosa e elevado metabolismo
no trato gastrintestinal, o qual limita a absorção e o alcance de concentrações
terapêuticas destas substâncias. Desta maneira, o desenvolvimento de sistemas de
liberação nanoemulsionados visam o aproveitamento do potencial terapêutico (GUO
et al., 2014).
3.4 Atividade antinociceptiva
De acordo com a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), o
termo dor conceitua-se como uma experiência sensorial e emocional desagradável,
relacionado à lesão tecidual real ou potencial, ou descritas em termos desse tipo de
dano. Assim, a dor caracteriza-se como uma experiência complexa que envolve
além de transdução de estímulos nocivos ambientais, o processamento emocional
pelo cérebro. É uma consequência fisiopatológica de diversas morbidades e de suas
repercussões, mas que na maioria das vezes configura-se como uma função
protetora, representando, em muitos casos, o único sintoma para o diagnóstico de
várias doenças (SILVA et al., 2013).
Diferente de nocicepção, a dor é mais que uma sensação, é uma experiência,
podendo incorporar componentes sensoriais com influências pessoais e ambientais
importantes. Enquanto isso, o termo nocicepção refere-se ao estímulo doloroso
propriamente dito, sem levar em consideração o componente emocional, ou seja,
engloba as vias neuroanatômicas, bem como os mecanismos neurológicos e os
receptores específicos que detectam o estímulo lesivo. Sendo assim, uma vez que
os animais não são capazes de expressar verbalmente os componentes subjetivos
da dor, neles não se avalia dor, e sim nocicepção. Logo, termos como dor e
analgesia são empregados para estudos em humanos, enquanto que nocicepção e
antinocicepção são mais utilizados para estudos pré-clínicos, envolvendo animais de
laboratório (SILVA et al., 2013).
A dor pode ser classificada de diversas maneiras, e os agentes indutores do
processo são também variados. Geralmente, o processo fisiológico da dor se
desencadeia quando há danos teciduais decorrentes de um estímulo externo. Pode
48
ser induzida por um estímulo mecânico, térmico, químico ou elétrico. Além disso, há
dores cuja gênese é totalmente desconhecida, incluindo a dor psicogênica e
neuropática, onde não se detecta especificamente um dano tecidual (BRESOLIN;
CECHINEL FILHO, 2003).
Devido à baixa eficácia e expressivos efeitos adversos apresentados pela
maioria dos fármacos disponíveis no mercado farmacêutico para este fim, surge o
grande interesse dos pesquisadores na descoberta de novos protótipos de fármacos
provenientes de plantas da flora brasileira. Produtos naturais são amplamente
utilizados no estudo de antinocicepção e são classificados conforme o estímulo
doloroso utilizado no processo (COUTO et al., 2011).
Vários modelos in vivo que empregam estímulos dolorosos são utilizados na
pesquisa de compostos com atividade analgésica. Várias das técnicas descritas,
utilizadas para um screening da atividade antinociceptiva são gerais e independem
do composto a ser ensaiado. Apesar de, na maioria das vezes, não se chegar ao
mecanismo de ação definitivo da substância ou extrato da planta em estudo, esses
modelos experimentais são de grande importância e representam o ponto de partida
para a caracterização farmacológica de novos compostos capazes de interferir com
o curso da dor (COUTO et al., 2011).
Diversos são os testes possivelmente aplicados em laboratório, tais como os
que avaliam a ação de drogas sobre comportamentos indicativos de nocicepção
manifesta, nos quais o estímulo utilizado causa, por si só, a ativação das vias
nociceptivas, induzindo o comportamento compatível com dor. Essas atitudes
caracterizam a nocicepção e os fármacos que suprimem esse comportamento se
chamam antinociceptivos e os que desencadeiam se chamam algogênicos (ALVES;
POHLMANN; GUTERRES, 2005).
Dentre estes modelos, tem-se o teste das contorções abdominais por ácido
acético, onde o agente indutor é químico e se baseia na contagem das contorções
da parede abdominal seguidas de torção do tronco e extensão dos membros
posteriores (Figura 5), como resposta reflexa à irritação peritoneal e à peritonite
produzidas pela injeção intraperitoneal de uma solução de ácido acético 0,6%. Este
teste é sensível à avaliação de drogas analgésicas, no entanto, pode ser visto como
um modelo geral, não seletivo, para estudos de drogas antinociceptivas. Apesar de
ser um modelo de nocicepção simples, e pouco específico, ele permite avaliar a
49
atividade antinociceptiva de várias substâncias que atuam tanto em nível central
quanto periférico (BRESOLIN; CECHINEL FILHO, 2003).
Figura 5 – Teste de contorções abdominais.
Fonte: NEPLAME, 2014.
50
51
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Droga vegetal
A droga vegetal utilizada no desenvolvimento das nanoemulsões são frutos
da espécie Rapanea ferruginea, após tratamentos de colheita, triagem, secagem e
moagem. Os frutos foram coletados no município de Blumenau, Santa Catarina, em
15 de setembro de 2012, e identificados pela sigla F01. O material vegetal foi
identificado pelo Prof. Oscar Benigno Iza (UNIVALI) e uma amostra foi depositada no
Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí/SC), sendo catalogada pelo código HBR2715.
Após a colheita, os frutos foram mantidos em sala de secagem, com controle
de umidade e foram tratados manualmente, por meio da retirada dos caules e
separados conforme o grau de maturação, em FM (frutos maduros) e FI (imaturos).
Após a triagem, os frutos foram submetidos à moagem em moinho de facas
(Marconi, modelo MA048).
4.1.2 Reagentes e materiais
Acetato de etila P.A. ACS, Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;
Acetato de uranila, Merck;
Acetona P.A. ACS, Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;
Acetonitrila grau HPLC, J.T. Baker;
Ácido acético Glacial P.A., Biotec;
Ácido ascórbico, Sigma-Aldrich;
Ácido clorídrico P.A., Vetec Química Fina;
Ácido sulfúrico P.A. ACS, Dinamica;
Ágar bacto, BD Ágar;
Água purificada obtida por sistema de purificação de osmose reversa,
Gehaka;
Água ultrapurificada, Barnstead – Easy pure LF;
Álcool etílico absoluto 95% P.A. ACS, Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;
52
AMA (ácido mirsinoico A) – isolado e purificado a partir dos frutos da R.
ferruginea – laboratório de fitoquímica, pureza de 76,2%;
p-Anisaldeído, Aldrich;
Cromatoplacas de sílica gel 60 F254, Merck;
DMSO (dimetilsulfóxido) P.A., Dinamica;
DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila), Sigma-Aldrich (Chemistry®);
Hexano (mistura de isômero) P.A., Vetec Química Fina, Sigma-Aldrich;
Indometacina, Fagron;
Linhagem de células L929 de fibroblastos de camundongos, obtidas do Banco
de Células do Rio de Janeiro (BCRJ);
Meio DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium), Cultilab;
Metanol grau HPLC, J.T. Baker;
MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]), Sigma-Aldrich;
N-octanol, Sigma-Aldrich;
Phenonip® (fenoxietanol e metil, etil, butil, propil e isobutil parabenos), Pharma
Special;
Polymol® (triglicerídeos do ácido cáprico e caprílico), Mapric Produtos
Farmacosméticos;
Solução salina 0,9%, LBS;
Soro fetal bovino (SFB), Gibico;
Span 80® (monooleato de sorbitano), Sigma-Aldrich;
Tampão PBS (phosphate buffered saline), Gibico;
Tripsina, Gibico;
Triton X-100, Sigma;
Ultramona RH400® (óleo de mamona hidrogenado etoxilado a 40 mols de
EO), Oxiteno;
Vermelho neutro, Sigma.
4.1.3 Equipamentos
Agitador magnético (Constant Temperature Magnetic Stirrier) – 78HW-1
(Vertex);
Agitador mecânico – 713D (Fisatom) ;
53
Agitador de tubos Vortex – QL-901 (Biomixer);
Autoclave vertical (Phoenix);
Balança analítica – 250A (UMark);
Balança digital – AS2000 (Marte)
Banho de ultrassom- USC 5000 (Unique);
Banho maria com circulação – MA159 (Marconi);
Cabine de fluxo laminar (Veco);
Câmara de fotoestabilidade-EC/0,2/R-F (Mecalor);
Câmaras climáticas de 500 L (Mecalor);
Centrífuga – Z300 (Hermle);
Centrífuga excelsa baby II – 206-R (Fanem);
Conjunto de tamizes (Bertel);
Coluna C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m) (Kinetex);
Cromatógrafo LC 20-AC, equipado com uma bomba quaternária, detector de
varredura de espectro ao ultravioleta por arranjo de fotodiodos (diodo array) e
injetor automático SIL-20A (Shimadzu);
Espalhamento de luz multi-ângulos – BI-9000 (Brookhaven Instrumentos);
Espectrofotômetro UV - Vis UV-1601PC (Shimadzu);
Estufa – 316B25 (Quimis);
Estufa CO2 (Ultra-Safe);
Estufa de cultura/controlador microprocessado – 502C (Fanem);
Incubadora de bancada – 400 (Gefran);
Lâmpada UV para CCD – GRC-03 (Dist);
Leitor de microplaca – Spectro star nano (BMG Labtech);
Microscópio eletrônico de transmissão – JEM 1200EX-II (JEOL);
Microscópio óptico invertido – CK40 (Olympus);
Micropipetas automáticas e ajustáveis de 10 -1000 µL;
Moinho – MA085 (Marconi);
Mufla – 318D24 (Quimis);
Potenciômetro – DM 20 (Digimed) ;
Rota-evaporador – TE-211 (Tecnal);
Sonicador Ultra Cleaner – 800 A (Unique);
54
Zetasizer Nano ZS – Zen3600 (Malvern Instruments).
4.2 Métodos
4.2.1 Caracterização da droga vegetal
Para caracterização da droga vegetal foram empregados testes
farmacopeicos para frutos maduros e imaturos, separadamente. Quando não
diferentemente especificado, os ensaios foram feitos em triplicata.
4.2.1.1 Perda por dessecação
Cerca de exatamente 1,0 g da droga vegetal, foi transferida e distribuída
uniformemente em cadinho, previamente dessecado a 105 °C por 30 min. Em
seguida o cadinho contendo a amostra foi colocado em estufa a 105 °C por 2 h,
esfriado por 20 min em dessecador e pesado. O procedimento foi repetido por
períodos de 30 min de secagem até peso constante. Os resultados expressos em
percentual ponderal representam a média de três determinações (BRASIL, 2010).
4.2.1.2 Determinação de cinzas totais
Cerca de 3,0 g da droga vegetal, foram transferidos e distribuídos
uniformemente em cadinho, previamente dessecado em mufla até no máximo 600
ºC, até peso constante. As amostras foram incineradas aumentando gradativamente
a temperatura, até que todo o carvão fosse eliminado. As cinzas foram dessecadas
até peso constante, para o cálculo da sua porcentagem em relação à droga seca ao
ar (BRASIL, 2010).
4.2.1.3 Determinação de cinzas insolúveis em ácido
Após a determinação das cinzas totais, o resíduo obtido foi fervido durante 5
min com 25 mL de solução de ácido clorídrico a 7% em cadinho coberto com vidro
de relógio. Após, o vidro de relógio foi lavado com 5 mL de água quente, juntando
esta água ao cadinho com resíduo. O resíduo insolúvel em ácido foi retido sobre
55
papel de filtro isento de cinzas, lavando-o com água quente até que o filtrado se
tornasse neutro. O papel de filtro contendo o resíduo foi transferido para o cadinho
original, seco sobre chapa quente e incinerado a cerca de 500 ºC por 2 h até peso
constante. A porcentagem de cinzas insolúveis em ácido foi calculada em relação à
droga seca ao ar (BRASIL, 2010).
4.2.1.4 Análise granulométrica
Cerca de 25,0 g da droga vegetal foram submetidos à passagem por tamises,
com aberturas de malhas de diferentes tamanhos (2, 1, 0,850, 0,500, 0,250 e 0,150
mm). A tamisação foi realizada a 50 vibrações por segundo, durante 15 min. Em
seguida, as frações retidas nos tamises e no coletor foram pesadas. Este ensaio foi
realizado em duplicata (BRASIL, 2010). Os resultados foram representados pela
distribuição granulométrica, através de um histograma, e pelo tamanho médio de
partículas, segundo a equação 1 (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007).
(1)
onde dmédio = diâmetro médio aritmético (mm); AM = abertura média de malha (mm)
e a Fr% = fração retida percentual em cada tamis.
4.2.2 Obtenção dos derivados vegetais: da droga vegetal ao extrato mole
Para a seleção da droga vegetal e do sistema solvente, foram preparados 100
mL de solução extrativa, em duplicata, na proporção planta/solvente 5% (p/v). Foram
testados como droga vegetal, os frutos maduros (FM) e imaturos (FI), e como
solvente, etanol em diferentes graus alcoólicos (30, 50, 70, 90 e 96 °GL). As
soluções extrativas dos frutos de R. ferruginea foram obtidas pelo método de
maceração dinâmica, em agitador mecânico na velocidade de 300 rpm e na
temperatura ambiente. Após 5 h de agitação, seguiu-se a filtração em papel filtro
qualitativo, em filtro de Büchner acoplado à bomba a vácuo. As soluções extrativas
foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar e armazenadas na temperatura
ambiente.
56
Após a seleção da faixa do sistema solvente e da droga vegetal, foi realizado
um estudo fatorial variando-se o tempo de extração (5 e 10 h), a relação
droga:solvente (5 e 10%, p/v) e a graduação alcoólica (70 e 96 ºGL) para maximizar
o rendimento dos marcadores nas soluções extrativas (Quadro 4). Esta estapa
realizou-se em parceria com a aluna de iniciação científica Scheila Krachinski.
Quadro 4 - Planejamento fatorial para o desenvolvimento das soluções extrativas.
FATOR NÍVEL
A) SOLVENTE (Álcool GL) 70 = -1 96 = +1
B) TEMPO (h) 5 = -1 10 = +1
C) RELAÇÃO DROGA:SOLVENTE (%) 5 = -1 10 = +1
As soluções extrativas foram geradas em dois lotes de 100 mL cada e
analisadas quanto às características de pH, resíduo seco, perfil cromatográfico por
cromatografia em camada delgada (CCD) e líquida de alta eficiência (CLAE). Como
fatores dependentes ou resposta às condições estudadas foi analisado o teor de um
ou mais marcadores quantificados por CLAE, empregando metodologia
desenvolvida pela mestranda Tailyn Zermiani (ZERMIANI et al., 2014).
Um novo lote de solução extrativa do sistema solvente selecionado foi obtido,
num volume de 1000 mL para concentração em banho de água a 45 ºC até
obtenção do extrato mole. O extrato mole foi novamente caracterizado quanto ao pH,
resíduo seco e quantificado quanto ao teor dos marcadores, após reconstituição no
sistema solvente, obedecendo ao resíduo seco (%) da solução extrativa. Esta
análise teve como objetivo avaliar a influência da etapa de evaporação do solvente
sobre a estabilidade dos marcadores.
Após a seleção da droga vegetal, do sistema solvente e das condições de
extração, foi produzido um lote de extrato mole para o desenvolvimento de
formulações nanoemulsionadas e avaliação biológica (atividade antinociceptiva).
As soluções extrativas também foram caracterizadas quanto à citotoxicidade e
o extrato mole obtido foi avaliado quanto à atividade antioxidante para
monitoramento das etapas produtivas.
57
4.2.3 Caracterização físico-química dos derivados vegetais
As soluções extrativas e extratos moles foram caracterizados empregando-se
os ensaios a seguir, em triplicata.
4.2.3.1 Determinação do rendimento
O rendimento das soluções extrativas e extratos moles foram calculados a
partir do volume e massa obtidos no final da extração, expresso em porcentagem,
em relação ao esperado.
4.2.3.2 Determinação do pH
Para determinação do pH, as amostras foram lidas a 25 ºC em potenciômetro
previamente calibrado com soluções tampão fosfato e acetato, pH 7,0 e 4,0,
respectivamente. As soluções extrativas foram lidas diretamente em eletrodo
combinado de pH, e o extrato mole foi dissolvido com o próprio solvente de extração,
em banho de ultrassom por 15 min, para posterior leitura.
4.2.3.3 Determinação do resíduo seco
Cerca de exatamente 5,0 g da amostra de solução extrativa e 0,2 g de extrato
mole foram pesados em cadinho de porcelana previamente dessecado a 105 ± 5 ºC.
As amostras de solução extrativa foram levadas a secura sobre chapa de
aquecimento. Após evaporação do solvente, as amostras dessecadas em estufa a
105 ± 5 ºC, por aproximadamente 3 h, resfriadas em dessecador e pesadas. Este
procedimento foi repetido a cada 1 h em estufa, até obter peso constante. O resíduo
seco foi calculado e expresso em % (m/m) (BRASIL, 2010).
4.2.3.4 Análise do perfil cromatográfico dos derivados vegetais por CCD
Na análise química qualitativa por CCD, foram utilizadas cromatoplacas de
sílica gel Merck® e como sistema de eluição, uma mistura de hexano e acetato de
etila (6:4). Os extratos foram aplicados com tubos capilares. Os cromatogramas
58
foram desenvolvidos de forma ascendente, em cubas saturadas com o sistema
eluente até a altura de aproximadamente 10 cm. Após a secagem, na temperatura
ambiente, a cromatoplaca foi visualizada com câmara de UV em 254 nm, e revelada
com anisaldeído sulfúrico, seguido de aquecimento. Foram empregados os padrões
de ácido mirsinoico A (AMA) e ácido mirsinoico B (AMB), dissolvidos em acetona na
concentração de 10 mg/mL. As soluções amostras foram preparadas com diluição
em metanol na concentração de 10 mg/mL (COSTA, 2011).
4.2.3.5 Quantificação do marcador por CLAE
As amostras foram analisadas conforme metodologia analítica desenvolvida e
validada por Zermiani (2015).
A metodologia desenvolvida foi adequada para a separação do AMA nas
amostras analisadas, com tempo de corrida de 30 min. O método desenvolvido foi
específico, linear, preciso, sensível, e exato na quantificação do AMA no extrato dos
frutos da R. ferruginea (ZERMIANI, 2015).
A quantificação do marcador nos extratos foi realizada empregando a
equação da reta das curvas de calibração do AMA (y = 26919,71x - 10682,36) com o
coeficiente de correlação (r) de 0,9996 e coeficiente de determinação (r²) de 0,9992
(ZERMIANI, 2015).
Para a análise por CLAE, as soluções extrativas foram diluídas na proporção
de 1:10 com metanol (v/v), e o extrato mole foi dissolvido na proporção 1:10 (m/v)
pesando-se exatamente 500 mg de extrato em 5,0 mL de metanol. Antes da injeção,
todas as soluções foram filtradas com membrana de celulose regenerada de 0,45
μm, colocadas em vials, e injetados (20 µL) no cromatógrafo. A quantidade de AMA
foi expressa pela massa da amostra, considerando o seu valor de resíduo seco,
descontando portanto o valor de umidade no extrato mole.
O software LC Solution® foi utilizado para registrar os cromatogramas e medir
as áreas dos picos. A detecção por varredura de espectro foi realizada na faixa de
comprimentos de onda entre 190 nm até 400 nm, sendo registrado o cromatograma
em 260 nm para o AMA e 280 nm para o TGL. Foi realizada a quantificação do AMA
e a medição da área do TGL.
A fase estacionária empregada foi uma coluna de fase reversa Kinetex® C18
150 x 4,6 mm, com partículas core-shell com tamanho de 2,6 µm. A fase móvel
59
utilizada foi composta por acetonitrila (ACN), metanol e água acidificada com ácido
fosfórico a pH 2,5. Todos os solventes usados foram de grau HPLC e os solventes
da fase móvel foram filtrados a vácuo com membrana de celulose regenerada 47
mm de diâmetro e 0,45 μm de porosidade e degaseificados em ultrassom. O método
gradiente está apresentado no Quadro 5.
Quadro 5 – Gradiente empregado para análise em CLAE das soluções extrativas da R. ferruginea.
*H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5. Fonte: Zermiani, 2015.
4.2.3.6 Avaliação da citotoxicidade por MTT
A viabilidade celular foi determinada pelo método do MTT (brometo de [3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]). Este método avalia a função de enzimas
mitocondriais, as quais reduzem o sal tetrazólio formando cristais de formazan, que
possuem cor roxa característica ao serem dissolvidos em DMSO (dimetilsulfóxido).
As células foram distribuídas na densidade de 8,5x104 células por poço em
placas de 96 poços. Após 24 h para adesão, a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2,
as células foram incubadas com as amostras durante 24 h.
Para preparar as amostras das soluções extrativas, foi calculado um volume
correspondente a 10 mg/mL em resíduo seco, para evaporação até secura em
estufa à vácuo a 40 °C. Os resíduos secos foram dissolvidos em 1 mL de DMSO.
Desta diluição, 100 µL foram homogeneizados juntamente com 900 µL de DMSO,
resultando em uma concentração de 1 mg/mL. Por fim, para obter a concentração
escolhida de 5 µg/mL, para fins de comparação com outros estudos realizados
anteriormente nesta concentração, foram adicionados 1 µL de solução extrativa nos
poços (seis poços para cada amostra) e 199 μL de tampão PBS em cada poço, de
modo a obter a concentração final de 5 μg/mL de amostra (THIESEN, 2013).
Tempo (min)
Acetonitrila (%)
*H20 (%)
Metanol (%)
0 5 70 25
2 5 70 25
5 30 45 25
10 60 15 25
12 70 5 15
15 84 1 15
25 84 1 15
30 5 70 25
35 5 70 25
60
Decorrido o tempo de 24 h, o meio foi substituído por 100 μL de uma solução
de MTT 0,5 mg.mL-1 em PBS. As células imersas nesta solução foram incubadas por
mais 4 h a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2. Em seguida, a solução de MTT que
não reagiu foi retirada, adicionando-se DMSO (0,01%) para dissolução dos cristais
de formazan formados. Após homogeneização, foi feita a leitura das placas em leitor
de microplacas a um comprimento de onda de 550 nm e os resultados foram
expressos como % de viabilidade em relação ao controle (100%).
As unidades arbitrárias de fluorescência foram normalizadas como 100% na
condição controle (sem tratamento) e foi calculado o percentual de resposta nas
amostras em relação a este controle (REILLY et al., 1998).
4.2.3.7 Determinação da atividade antioxidante por DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazina)
Para a análise do consumo do radical DPPH pelos extratos, foi preparada
uma solução estoque de DPPH na concentração de 40 μg/mL em etanol absoluto e
a absorbância da solução estoque em 517 nm foi verificada em espectrofotômetro. A
solução radical de DPPH 0,1 mM foi mantida em estoque em frasco âmbar, sob
refrigeração (-2°C). Como controle positivo, foi utilizado o ácido ascórbico, na
concentração de 1 a 4 μg/mL em etanol. Este ensaio foi realizado conforme
metodologia descrita por Brand-Williams (1995) com modificações e empregado
para avaliar a influência do fator solvente e da etapa de concentração com uso de
calor, necessária para a obtenção do EM. Para a análise das amostras, foi
preparada uma solução-mãe do extrato mole a 1000 μg/mL (EM Álcool 96 °GL). A
partir desta solução, foram preparadas as soluções intermediárias, utilizando-se
etanol como diluente, com as seguintes concentrações: 2,5, 5,0, 7,5, 10, 20 e 30
μg/mL. Para tanto, foram transferidos em triplicata, respectivamente 0,3 mL da
solução intermediária, para tubos de ensaio, acrescentando DPPH para completar
2,7 mL, incluindo solução sem DPPH. Em seguida, as misturas foram agitadas em
vórtex e mantidas na estufa a 37 ºC, por 30 min. Posteriormente, foi realizada a
leitura das absorbâncias das amostras e de DPPH, em espectrofotômetro, em 517
nm, em cubeta de plástico de 1 cm de caminho óptico. O etanol foi usado como
branco. A capacidade antioxidante foi determinada utilizando-se a equação 2:
61
Atividade Antioxidante (AA %) = A0 – A1 x100 A0 (2) Onde:
A0 = absorbância da amostra sem DPPH
A1 = absorbância da amostra + DPPH
Para o cálculo da concentração necessária para reduzir 50% dos radicais
DPPH (IC50) foi utilizada a equação da reta, obtida através da relação da AA% em
função da concentração.
4.2.3.8 Determinação do coeficiente de partição do extrato
O coeficiente de partição (P) do extrato foi determinado baseando-se no
método proposto por Wells (1988).
O coeficiente de partição é definido como a razão das concentrações em
equilíbrio de uma substância dissolvida em um sistema de duas fases, composto de
dois solventes, n-octanol e água, usando a equação 3.
P = Cn-octanol Cágua (3)
O n-octanol foi saturado com uma quantidade idêntica de água, para isso, a
mistura dos dois solventes foi agitada por 12 h em agitador magnético a 400 rpm.
Após a saturação, 10 mL da solução aquosa contendo 100 µg/mL do extrato
mole de R. ferruginea foi adicionado em 10 mL do n-octanol saturado. Esta mistura
sofreu agitação por 30 min, foi transferida para funil de separação e mantida em
repouso por 5 min. Após o repouso, a fase aquosa foi retirada e centrifugada por 5
min a 2500 rpm. As amostras foram analisadas em triplicata por CLAE.
4.2.4 Pré-formulação e otimização dos sistemas nanoedispersos
Os estudos de pré-formulação das nanoemulsões foram realizados em
parceria com a aluna de iniciação científica Ionice de Araújo Dutra.
Os componentes das nanoemulsões selecionados para dar continuidade
neste trabalho foram o óleo Polymol® (triglicerídeos do ácido cáprico e caprílico, de
EHL 11), que demonstrou maior capacidade de dissolver e dispersar o EM, e a
mistura de tensoativos Span 80® (monooleato de sorbitano, de EHL 4,3) com
Ultramona RH400® (óleo de mamona hidrogenado etoxilado 40 OE, de EHL 14,1),
62
selecionada pelo aspecto visual e tamanho de gotículas menores que 200 nm. A
concentração do EM foi fixada em 1%. O método selecionado para a preparação das
nanoemulsões foi o de inversão de fases por baixa energia (DUTRA et al., 2014).
A partir dos resultados obtidos na etapa de pré-formulação, foram avaliados
diferentes proporções dos tensoativos, fase oleosa e aquosa, empregando o
diagrama pseudoternário (Figura 6), como um meio sistemático para aperfeiçoar a
composição da formulação (BERNARDI, 2011; PEREIRA, 2008). Os sistemas foram
denominados sistemas nanodispersos (SND) a partir deste momento, pela
possibilidade de formação de outros sistemas, que não poderiam ser classificados
como nanoemulsões.
Figura 6 –Sistemas nanodispersos obtidos usando o diagrama pseudoternário.
Tomando-se por base a região de obtenção de nanoemulsão já identificada
em trabalhos que empregaram os mesmos óleos e sistemas de tensoativos, foi
delineado um diagrama pseudoternário, ao redor desta região, correspondente a
Formulação 1 (Quadro 6) (BERNARDI, 2011). Este diagrama foi construído para o
sistema de tensoativos resultante para a formação de uma nanoemulsão, com 5%
de variação entre os componentes. Para as diferentes concentrações de água,
tensoativo e óleo testadas, foram preparadas formulações com e sem extrato, em
dois lotes cada (Quadro 6).
As amostras foram preparadas em um total de 20 mL, por aquecimento em
banho-maria a 75 ± 5 ºC das fases aquosa e oleosa, separadamente. A fase aquosa
foi gotejada sobre a oleosa contendo os tensoativos e o extrato mole dos frutos da
R. ferruginea sob aquecimento e agitação mecânica a 600 rpm. Após completa
63
adição de água, o sistema permaneceu sob agitação e aquecimento por mais 5 min.
Decorrido este tempo, as emulsões foram retiradas do banho-maria, mantendo-se a
agitação com agitador mecânico por mais 5 min (DUTRA et al., 2014).
Quadro 6 - Quantidades dos componentes do diagrama pseudoternário.
Formulação Óleo
(% p/p)
Tensoativos (% p/p) Água purificada (% p/p)
Extrato mole de R. ferruginea (% p/p) Total Span RH400
1.1 5 10 3,16 6,84 84 1
1.2 5 10 3,16 6,84 85 -
2.1 5 15 4,74 10,26 79 1
2.2 5 15 4,74 10,26 80 -
3.1 5 20 6,32 13,68 74 1
3.2 5 20 6,32 13,68 75 -
4.1 10 5 1,58 3,42 84 1
4.2 10 5 1,58 3,42 85 -
5.1 10 15 4,74 10,26 74 1
5.2 10 15 4,74 10,26 75 -
6.1 10 20 6,32 13,68 69 1
6.2 10 20 6,32 13,68 70 -
7 .1 15 5 1,58 3,42 79 1
7.2 15 5 1,58 3,42 80 -
8.1 15 10 3,16 6,84 74 1
8.2 15 10 3,16 6,84 75 -
9.1 15 20 6,32 13,68 64 1
9.2 15 20 6,32 13,68 65 -
10.1 20 5 1,58 3,42 74 1
10.2 20 5 1,58 3,42 75 -
11.1 20 10 3,16 6,84 69 1
11.2 20 10 3,16 6,84 70 -
12.1 20 15 4,74 10,26 64 1
12.2 20 15 4,74 10,26 65 -
13.1 5 5 1,58 3,42 89 1
13.2 5 5 1,58 3,42 90 -
14.1 10 10 3,16 6,84 79 1
14.2 10 10 3,16 6,84 80 -
15.1 15 15 4,74 10,26 69 1
15.2 15 15 4,74 10,26 70 -
16.1 20 20 6,32 13,68 59 1
16.2 20 20 6,32 13,68 60 -
*Tensoativos: considerar EHL Span 80® = 4,3; EHL RH 400
® = 14,1. EHL ideal = 11.
64
As formulações desenvolvidas foram avaliadas quanto à estabilidade a partir
da visualização macroscópica e do teste de centrifugação a 3000 rpm por 30 min
após 24 h de preparo. As formulações que se apresentaram estáveis foram
avaliadas quanto ao tamanho médio da fase interna no aparelho Zetasizer Nano ZS
e os resultados foram expressos em distribuição de tamanho por número.
4.2.6 Estudo de estabilidade e caracterização das formulações
As formulações selecionadas no diagrama pseudoternário foram submetidas
aos estudos de estabilidade preliminar, de acordo com o guia de estudos de
estabilidade da ANVISA (BRASIL, 2004), a fim de selecionar as formulações
mediante a avaliação das suas características físicas para posterior avaliação da
estabilidade acelerada.
Para a estabilidade preliminar, novos lotes, em duplicata, foram preparados
para as formulações avaliadas denominadas 1.1, 2.1, 5.1 e 14.1, variando as
proporções de tensoativos não-iônicos Span 80® e Ultramona RH400® (1.1 e 14.1 =
10%, 2.1 e 5.1 = 15%) e de óleo Polymol® (1.1 e 2.1 = 5%, 5.1 e 14.1 = 10%),
mantendo-se o EM a 1% e o conservante Phenonip® a 0,5%. Os SND foram
preparados em duplicata, acondicionados em tubos de ensaio com tampa,
submetendo-os a 14 ciclos (40 ± 2 °C - estufa / 5 ± 2 °C - geladeira), a cada 24 h.
Uma amostra de cada lote foi mantida a 25 ± 2 °C (temperatura ambiente) e outra a
5 ± 2 °C (geladeira). Os SND foram avaliados nos tempos de 24 h, 14 dias e 28 dias,
após a preparação. Foram observados a cor, aspecto visual, separação de fases,
pH, tamanho médio de fase interna e índice de polidispersividade (PDI) pelo método
de espalhamento de luz dinâmico (Zetasizer Nano ZS).
Adicionalmente, para as formulações que obtiveram melhor comportamento
na estabilidade preliminar, foram preparados novos lotes, em duplicata, e avaliadas
pelos métodos de microscopia eletrônica de transmissão (MET) e goniômetro
(equipamento de luz dinâmico multi-ângulos) para caracterização.
Para a estabilidade acelerada, foram preparados novos lotes da formulação
SND1 selecionada na estabilidade preliminar, em duplicata, as quais foram
acondicionadas em frascos de vidro âmbar, de 50 mL. As condições de temperatura
estudadas foram: 40 ± 2 °C (estufa), 5 ± 2 °C (geladeira) e 25 ± 2 °C (temperatura
ambiente). As avaliações foram realizadas após 24 h e em 30, 60 e 90 dias
65
(BRASIL, 2004). Foram observados a cor, aspecto visual, separação de fases, pH,
tamanho médio de fase interna, potencial zeta e índice de polidispersividade (PDI)
pelo método de espalhamento de luz dinâmico (Zetasizer Nano ZS). Adicionalmente,
nos tempos de 24 h, 30 e 60 dias após o preparo, as formulações foram
quantificadas quanto ao teor de AMA por CLAE.
4.2.6.1 Características organolépticas (aspectos físicos)
As formulações foram analisadas quanto à cor, transparência, separação de
fases e cremeação.
A separação de fases foi verificada por percepção direta, após centrifugação
a 3000 rpm por 30 min, conforme descrito na literatura para análise de sistemas
emulsionados (BRASIL, 2004).
4.2.6.2 Determinação do pH
A determinação do pH foi realizada com potenciômetro calibrado com
soluções de fosfato e acetato, pH 7,0 e 4,0, respectivamente. As amostras foram
diluídas 1:10 (g/mL) com água purificada.
4.2.6.3 Análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão (MET)
A caracterização da morfologia dos SNDs selecionados na estabilidade
preliminar foi analisada por MET em parceria com a equipe da profª. Dra. Joana Lea
Meira Silveira, na Universidade Federal do Paraná (UFPR). As amostras foram
adicionadas em suportes metálicos (400 mesh) de cobre com revestimento de
carbono e Formvar, esperou-se 20 min até total absorção da amostra e fez-se o
contraste negativo com solução de acetato de uranila a 2%. Após 10 min, as
amostras foram submetidas à análise com aumentos de 20000 até 40000 vezes.
4.2.6.4 Análise morfológica e de propriedades de superfície
O tamanho médio de fase interna, o índice de polidispersividade (PDI) e o
potencial zeta das formulações foram determinados pelo método de espalhamento
66
de luz dinâmico usando equipamento Zetasizer Nano ZS. As análises foram
realizadas em um ângulo de 90° e a temperatura constante (25°C). As amostras
foram diluídas em água ultrapura na proporção de 1:100 e os resultados foram
expressos em distribuição de tamanho por número (number mean).
Para o tamanho médio de fase interna, as amostras selecionadas na
estabilidade preliminar também foram avaliadas em um equipamento de
espalhamento de luz multi-ângulos (goniômetro), utilizando a 15 mW He-Ne laser a
632,8 nm. Esta análise foi realizada na UFPR, em parceria com a equipe da profª.
Dra. Joana Lea Meira Silveira.
Para o processamento de dados das análises foi utilizado o software Dynamic
Light Scattering versão 5.43.
As amostras (Quadro 7) foram diluídas em água ultrapura na proporção de
1:100, filtradas sequencialmente e duplamente com membranas Millipore com
porosidade de 0,22 μm, com a finalidade de eliminar a presença de particulados em
solução.
Para as amostras selecionadas, mediu-se em ângulos de 30, 90 e 150 °.
Quadro 7 - Composição das formulações submetidas ao espalhamento de luz multi-ângulos.
4.2.6.5 Perfil cromatográfico e teor em CLAE
As amostras foram analisadas conforme metodologia analítica desenvolvida
por Zermiani (2015), descrita no item 4.2.3.4.
Para os sistemas nanodispersos sujeitos à estabilidade acelerada, pesou-se
exatamente cerca de 0,5 g das formulações em balão volumétrico de 5 mL, no qual
foi adicionado cerca de 2,5 mL de acetonitrila e colocado em ultrassom por 20 min.
Foi completado o volume do balão, e a amostra foi centrifugada a 3000 rpm por 10
min. O sobrenadante foi filtrado em membrana de celulose regenerada de 0,45 mm e
analisado em triplicata.
Amostras Tensoativos
(% p/p) Óleo
(% p/p) Conservante
(% p/p) EM
(% p/p) Água
(% p/p)
SND1 EM 1% 10 5 0,5 1 83,5
SND1 sem EM 10 5 0,5 - 84,5
SND4 EM 1% 10 10 0,5 1 78,5
SND4 sem EM 10 10 0,5 - 79,5
67
Adicionalmente, foi preparada uma solução a 1 mg/mL de EM em metanol
grau HPLC, para injeção, apenas para controle de eventuais interferentes das
amostras dos SNDs.
4.2.6.6 Estudo de fotoestabilidade
Foi realizado o teste de fotoestabilidade para o SND com extrato mole e para
o SND sem extrato mole, a fim de analisar a presença de possíveis produtos de
fotodegradação e a sua interferência nas amostras. As amostras foram pesadas (5,0
g) e expostas à radiações de luz visível (1.200.000 e 2.400.000 lux/h) e radiações
UVA (200 e 400 W.h/m2), em placas de Petri. Para todas as condições de exposição,
as amostras foram acompanhadas de um controle, isto é, uma amostra cuja
incidência de luz foi bloqueada revestindo a placa de Petri com papel laminado
(BRASIL, 2011).
Após a irradiação, as amostras foram diluídas em metanol de modo a obter
solução com concentração de 3 mg/mL de EM. As amostras foram filtradas e
injetadas no cromatógrafo, em duplicata. Foi analisado o perfil cromatográfico,
avaliando a pureza dos picos, por meio do detector PDA, a resolução dos referidos
picos, e a sua área, calculando-se o teor dos marcadores nas amostras irradiadas e
não irradiadas. Foi analisado o desaparecimento ou surgimento de picos
suplementares e possíveis co-eluições a fim de analisar se as amostras são
fotoestáveis.
4.2.6.7 Avaliação da segurança do extrato mole da R. ferruginea e sistemas
nanodispersos
Foi realizado teste de citotoxicidade in vitro do sistema nanodisperso (SND1)
contendo EM da R. ferruginea, SND1 sem EM e do extrato mole selecionado,
através do teste de agarose overlay, preconizado pela ANVISA para avaliar a
segurança de emulsões em geral (BRASIL, 2012).
As células foram tripsinizadas e desta suspensão celular (L929) foram
transferidos 3 mL em cada poço (placas de 6 poços), a concentração da suspensão
foi de 300.000 células/mL. Após 24 h, o meio de cultura foi substituído por meio
DMEM contendo 0,01% de vermelho neutro como corante vital. As células foram
68
mantidas no escuro. Posteriormente, o excesso de corante vital foi removido e foram
3 mL de meio DMEM, em cada poço. A placa foi incubada por 1 h até aparecimento
de coloração vermelha celular. O meio de cultura foi novamente removido e
substituído por uma mistura de 1:1,2 de meio agarose:meio DMEM (mistura overlay),
mantida em aquecimento (45 °C) a fim de evitar a solidificação dos meios. Foram
adicionados 3 mL de mistura overlay a cada poço e a placa foi mantida na estufa a
37 °C em atmosfera de 5% CO2 por 2 h.
A amostra foi incorporada em discos de papel filtro (diâmetro de 0,54 cm),
previamente autoclavados (121 °C/20 min). Como controle positivo foi utilizado
Triton X-100 e como controle negativo meio DMEM. As placas foram incubadas por
24 h na estufa a 37 °C em atmosfera de 5% CO2.
Foi avaliado o grau de irritação pela zona de lise (ausência de incorporação
do corante vital) através do uso de paquímetro e avaliação microscópica, segundo a
classificação descrita pela Farmacopéia Americana (USP, 2013) (Quadro 8).
Quadro 8 - Classificação do grau de reatividade (USP, 2013).
Classificação Reatividade Descrição da zona de reatividade
0 Nenhum Nenhuma reatividade ao redor da amostra
1 Leve Alguma má-formação ou degeneração ao redor da amostra
2 Médio Zona limitou a área ao redor da amostra
3 Moderado Zona estende 0,5 a 1,0 cm além da amostra
4 Severo Zona estende maior que 1,0 cm além da amostra
4.3 Ensaio farmacológico
4.3.1 Animais
Para os experimentos foram utilizados camundongos Swiss machos (25 a 35
g). Os animais foram obtidos do Biotério Central da UNIVALI e, mantidos no biotério
de farmacologia experimental, com ciclo claro/escuro de 12 h e aclimatados a
temperatura de 22 ± 2 ºC. Os animais foram divididos em grupos de 8 animais e
tratados com água e ração, exceto durante os experimentos. Para o processo de
adaptação, os animais permaneceram no ambiente de teste 1 h antes da realização
dos experimentos. Os protocolos experimentais foram apresentados ao Comitê de
Ética em Pesquisa da UNIVALI, os quais foram aprovados e receberam o parecer
69
número 18/15p. Esta etapa realizou-se sob orientação da Profª. Dra. Márcia Maria de
Souza.
4.3.2 Drogas e Tratamento
Durante os experimentos, foram utilizadas as seguintes substâncias: ácido
acético (0,6%), indometacina (controle positivo), extrato mole dos frutos da Rapanea
ferruginea, veículo no qual foi dissolvido o EM (salina 0,9% NaCl e DMSO – controle
negativo EM), SND com extrato e SND sem extrato (controle negativo SND). As
drogas foram dissolvidas em salina 0,9% NaCl e DMSO. Todas as doses foram
escolhidas baseadas em trabalhos anteriores (COSTA, 2011; HESS et al., 2010).
Os animais foram divididos em 12 grupos experimentais, contendo 8 animais
cada, conforme mostra o Quadro 9.
Quadro 9 – Divisão dos grupos experimentais para a realização do teste farmacológico de nocicepção induzida por ácido acético.
GRUPO TRATAMENTO DOSE
1 C- EM (4,5 mL salina + 0,5 mL DMSO) v.o. 0,1 mL – 10 g
2 EM v.o. 50 mg/kg
3 EM v.o. 100 mg/kg
4 EM v.o. 150 mg/kg
5 EM v.o. 300 mg/kg
6 AMA v.o. 40 mg/kg
7 C- SND (SND sem EM) v.o. 0,1 mL – 10 g
8 SND v.o. 10 mg/kg
9 SND v.o. 50 mg/kg
10 SND v.o. 100 mg/kg
11 SND v. i.p. 100 mg/kg
12 C+ (indometacina) v.o. e v. i.p. 10 mg/kg
C- = controle negativo; EM = extrato mole; AMA = ácido mirsinoico A; SND = sistema nanodisperso; C+ = controle positivo; v.o. = via oral; v. i.p. = via intraperitoneal.
70
4.3.3 Nocicepção induzida por Ácido Acético
O modelo de dor escolhido para o estudo foi o do ácido acético, padronizado
por Collier e colaboradores (1968), descrito por Willain-Filho e colaboradores (2008),
onde as contrações abdominais foram induzidas por injeção intraperitoneal de ácido
acético 0,6%, resultando em contração do músculo abdominal e alongamento dos
membros posteriores. Os animais foram pré-tratados com o SND1, administrado por
via oral (10, 50 e 100 mg/kg) e intraperitoneal (i.p.) (100 mg/kg) e comparados com
animais que receberam o SND branco (SND sem o extrato) e indometacina (10
mg/kg, v.o. e i.p.), os quais foram submetidos ao modelo de contorções abdominais
induzidas por ácido acético, injetado 60 min depois do tratamento. Também foi
avaliado no mesmo modelo de dor, o efeito do EM (50, 100, 150 e 300 mg/kg) e do
composto majoritário do extrato, o ácido mirsinoico A (AMA/40 mg/kg) administrados
via oral, comparados com os animais que receberam o veículo (4,5 mL salina + 0,5
mL DMSO, v.o.) e indometacina (10 mg/kg, v.o.).
O número de contorções abdominais foi contado cumulativamente por um
período de 30 min. A atividade antinociceptiva foi expressa pela redução do número
de contorções abdominais em animais pré-tratados com indometacina, que foi usada
como controle positivo para comparar o potencial do efeito antinociceptivo do SND,
do EM e do AMA neste modelo.
4.4 Análise estatística
Os dados submetidos à análise estatística foram realizados empregando o
teste t-independente e o teste one way análise de variância (ANOVA).
71
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Droga vegetal
A R. ferruginea é uma espécie vegetal que não possui monografia
farmacopeica e portanto não se tem especificações para controle de qualidade da
droga vegetal proveniente desta espécie. Portanto, os resultados obtidos neste
trabalho tornam-se importantes para o conhecimento destas características que
poderão contribuir para o futuro estabelecimento de uma monografia dos frutos da R.
ferruginea.
Conforme visualizado na Figura 7, os frutos maduros e imaturos apresentam
forma arredondada e diâmetro aproximado de 3 mm, diferindo quanto a sua
coloração. Os frutos maduros apresentam coloração negro-arroxeada, e os imaturos,
esverdeada (1A), e após a moagem, a coloração é acastanhada, mais escura nos
frutos maduros.
Figura 7 - Frutos maduros (1) e frutos imaturos (2) da R. ferruginea, antes (A) e após a moagem (B).
Os resultados da perda por dessecação estão descritos na Tabela 1. Os
valores encontrados para as amostras estão dentro dos limites de 8-14%,
estabelecidos pela Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), demonstrando que a
operação de secagem pós-colheita foi efetiva. É importante ressaltar que a perda de
umidade de frutos imaturos é maior em relação aos maduros, uma vez que ocorre a
perda de água com a evolução de maturação (TOTTI; MEDEIROS, 2006).
Aproximadamente 50% das partículas da droga vegetal apresentaram maior
rendimento nas frações entre 0,500 e 0,850 mm, tanto para os frutos maduros ou
imaturos. Segundo a Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2010), o pó é classificado
72
como grosso, pois as partículas passam em sua totalidade pelo tamis com abertura
nominal de malha 1,7 mm e, no máximo, 40% pelo tamis com abertura nominal de
malha de 355 µm. Verificou-se também que não existe diferença estatisticamente
significante (p > 0,05) na granulometria média entre frutos maduros e imaturos. A
granulometria média está representada na Tabela 1 e a distribuição granulométrica
na Figura 8.
Os resultados de cinzas totais na droga vegetal não indicam diferença
estatisticamente significante (p > 0,05) entre as amostras de frutos maduros e
imaturos da R. ferruginea, enquanto que as cinzas insolúveis em ácido
apresentaram diferença estatisticamente significante (p < 0,05). O teor de cinzas
insolúveis foi extremamente baixo, representando apenas 0,04 e 0,11% das cinzas
totais, para frutos maduros e imaturos respectivamente (Tabela 1). Esta análise pode
indicar baixo índice de contaminação pelo solo, já que os frutos não estão em
contato direto com terra ou areia e baixo teor de constituintes silicosos presentes na
droga vegetal (BRASIL, 2010).
Tabela 1 - Caracterização dos frutos maduros e imaturos moídos da R. ferruginea.
DPR = desvio padrão relativo
Figura 8 - Distribuição granulométrica da droga vegetal- frutos maduros (FM) e imaturos (FI) da R. ferruginea.
Teste farmacopeico Frutos maduros
média + desvio (DPR%) Frutos imaturos
média + desvio (DPR%)
Perda por dessecação (%) 7,97 ± 0,10 (1,23) 8,59 ± 0,10 (1,20)
Granulometria média (mm) 0,674 ± 0,02 (2,80) 0,747 ± 0,04 (5,45)
Teor de cinzas totais (%) 2,57 ± 0,13 (5,03) 2,72 ± 0,05 (1,93)
Teor de cinzas insolúveis em ácido (%)
0,04 ± 0,001 (1,42) 0,11 ± 0,005 (4,40)
73
5.2 Ensaios preliminares para a extração da droga vegetal
No presente trabalho, inicialmente foram preparadas soluções extrativas em
duplicata para frutos maduros e imaturos (Figura 9), resultando em 20 lotes de
soluções extrativas. Como fator foi analisado a graduação alcoólica do solvente (30,
50, 70, 90 e 96 ºGL).
As diferenças na coloração das amostras foram atribuídas somente ao grau
alcoólico: as soluções extrativas com álcool 30 °GL apresentaram-se marrom-
alaranjada, com 50 °GL, vermelho-arroxeadas, com álcool 70 e 90 °GL, negro-
arroxeadas e com álcool 96 ºGL, púrpura (Figura 9).
Figura 9 - Soluções extrativas etanólicas (álcool 30, 50, 70, 90 e 96 ºGL) contendo frutos maduros (1) e imaturos (2) da R. ferruginea.
O rendimento em relação ao volume da filtração das soluções extrativas foi
acompanhado para garantir que as condições de preparo fossem reprodutíveis.
Como mostra a Tabela 2, o rendimento das soluções extrativas para frutos imaturos
variou de 84 a 91% e para frutos maduros de 86,5 a 89%, evidenciando a
reprodutibilidade do preparo.
O outro parâmetro de controle foi o pH, que se apresentou levemente ácido,
na faixa de 5,54 a 5,94, sem diferença significativa (p > 0,05) entre as soluções
extrativas de mesmo grau alcoólico, exceto entre as soluções extrativas de álcool 30
°GL, que foram mais ácidas quando preparadas a partir dos frutos maduros.
O resíduo seco das soluções extrativas variou de 0,46 a 0,76% para frutos
maduros e 0,41 a 0,74% para frutos imaturos, sendo diretamente proporcional ao
grau alcoólico (Tabela 2), indicando a maior extração de substâncias apolares nos
frutos. Pode-se observar também que o resíduo seco foi sempre maior nos frutos
maduros, exceto nas soluções extrativas de álcool 96 ºGL. Portanto, constata-se que
o grau alcoólico foi mais determinante que a maturação dos frutos para o resíduo
seco.
74
Tabela 2 - Rendimento (%), pH, resíduo seco (%), teor do AMA (mg/g) e área do pico referente ao TGL das soluções extrativas a partir dos frutos maduros e imaturos da R. ferruginea, variando-se o solvente de extração.
Resultados representados pela média seguida do DPR = Desvio Padrão Relativo
A caracterização e a identificação por CCD permitiu evidenciar a presença do
AMA e a ausência do AMB em todas as soluções extrativas testadas tanto nos frutos
maduros quanto nos imaturos. Pode-se constatar qualitativamente que, quanto maior
o grau alcoólico da solução extrativa, maior a concentração de AMA (Figura 10).
Observa-se também que substâncias muito polares permanecem no ponto de
aplicação e que, no terço inferior e superior da cromatoplaca, há a presença de
manchas de fraca intensidade, denotando a presença de substâncias mais polares e
mais apolares do que o padrão. Constata-se também a presença de uma mancha
abaixo do padrão AMA, uma vez que sua pureza consiste em 76,2%, determinada
por CLAE (ZERMIANI, 2015).
Solvente Lote Rendimento
(%) pH
Resíduo seco (%)
Teor AMA (mg/g)
Área TGL
30 ºGL
Imaturo 89 (1,59) 5,94
(0,65) 0,41 (2,83) 1,60 (15,52)
126454
(6,74)
Maduro 88 (3,21) 5,72
(1,27) 0,46 (4,46) 0,67 (26,58) 90112 (3,02)
50 ºGL
Imaturo 89 (3,18) 5,86
(1,04) 0,54 (1,76) 38,10 (1,41)
1828603
(8,67)
Maduro 86,5 (2,45) 5,83
(0,37) 0,60 (3,69) 27,02 (1,44)
1125797
(8,50)
70 ºGL
Imaturo 91 (1,55) 5,60
(0,54) 0,65 (5,42) 52,27 (3,88)
5572539
(1,56)
Maduro 89 (6,36) 5,54
(0,39) 0,72 (3,90) 50,00 (7,85)
5377928
(3,37)
90 ºGL
Imaturo 85 (11,65) 5,68
(0,61) 0,64 (2,48) 57,88 (4,22)
7704575
(1,51)
Maduro 88 (6,43) 5,67
(1,39) 0,72 (2,24) 48,18 (2,98)
7060134
(1,72)
96 ºGL
Imaturo 84 (10,10) 5,60
(1,26) 0,74 (4,60)
62,10
(11,47)
9155676
(6,56)
Maduro 88,5 (3,99) 5,70
(0,36) 0,76 (4,64) 50,60 (8,17)
6870148
(6,22)
75
Figura 10 - Cromatografia em camada delgada das soluções extrativas dos frutos maduros (FM) e frutos imaturos (FI) da R. ferruginea nos diferentes graus alcoólicos, utilizando como padrões o AMA e o AMB. Como fase estacionária utilizou-se sílica gel (GF254) e, como fase móvel, hexano:acetato de etila (6:4), após revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento.
A Figura 11 apresenta um exemplo de cromatograma do perfil das soluções
extrativas por CLAE em 260 nm, onde foi possível observar a presença do AMA e de
um triglicerídeo (TGL) ainda não totalmente elucidado, sendo o teor do AMA o
parâmetro empregado na escolha das soluções extrativas para o estudo de
maximização do processo extrativo.
Figura 11 - Exemplo de cromatograma das soluções extrativas dos frutos da R. ferruginea por CLAE. Fase estacionária: coluna de fase reversa Kinetex
® C18 150 x 4,6 mm, com partículas core-shell com
tamanho de 2,6 µm. Fases móveis: acetonitrila (ACN), metanol (MeOH) e água acidificada com ácido fosfórico a pH 2,5. Leitura em comprimento de onda = 260 nm.
Na Figura 11, não foi possível observar a presença de nenhum pico que
pudesse ser referente à contaminação do padrão de AMA observada por CCD na
Figura 10, provavelmente devido à baixa absortividade dos contaminantes, os quais
76
produziram uma mancha visível na CCD após revelação com anisaldeído sulfúrico
(Figura 10).
Quanto ao teor de AMA, este foi proporcional ao grau alcoólico, conforme já
observado na CCD, com aumento considerável com álcool 96 °GL. Em relação à
área do TGL, esta foi maior (p < 0,05) para a solução extrativa de álcool 96 °GL
obtida dos frutos imaturos (Tabela 2). Visualiza-se também que as médias dos
teores do AMA e as áreas do TGL foram sempre maiores nas soluções obtidas dos
frutos imaturos, porém não houve diferença significativa (p > 0,05) entre frutos
maduros e imaturos para as soluções extrativas álcool 70 ºGL e 96 ºGL.
De acordo com Zermiani (2015), o AMA possui a característica de um óleo e é
praticamente insolúvel em água, o que condiz com os resultados do presente
trabalho, em que a maior extração do AMA ocorre com o álcool de maior graduação.
A escolha para a próxima etapa, de maximização do processo extrativo, se
deu pela mistura dos frutos secos e moídos, independente do grau de maturação,
pois além de ser um processo facilitado tecnologicamente, verificou-se que o grau de
maturação não foi determinante para os parâmetros avaliados (resíduo seco, pH e
teor de AMA e TGL), que se mostraram mais dependentes do grau alcoólico, até
mesmo por se tatrar de compostos mais apolares.
No estudo de otimização, tendo-se como marcador químico o AMA, trabalhou-
se com as variáveis tempo de extração, relação droga solvente e graduação
alcoólica de 70 e 96 °GL, uma vez que os resultados foram muito semelhantes entre
os líquidos extratores de maior teor alcoólico.
5.3 Maximização do processo extrativo
Para a maximização do processo extrativo empregou-se o planejamento
fatorial conforme o Quadro 4 e a Tabela 3.
O lote empregado nesta etapa é representado pela mistura dos frutos
maduros e imaturos, e portanto, a coloração varia de negro-arroxeada a esverdeada.
Os resultados da análise do rendimento de filtração, resíduo seco, pH, teor do
AMA e área do TGL são apresentados na Tabela 3.
77
Tabela 3 - Rendimento (%), pH, resíduo seco (%), teor do AMA (mg/g) e área do pico referente ao TGL das soluções extrativas dos frutos da R. ferruginea na maximização do processo extrativo.
Experimento (*ABC)
Rendimento (%)
pH
Resíduo seco (%)
Teor AMA (mg/g)
Área TGL
1 (70.05.05) 93 (4,56) 5,55 (0,51) 0,73 (5,81) 69,44 (0,76) 3465871 (13,34)
2 (70.10.10) 86 (1,64) 5,60 (0,13) 1,35 (0,53) 42,35 (7,62) 4492410 (16,48)
3 (70.10.05) 87 (4,88) 5,52 (0,51) 0,74 (1,91) 36,09 (4,01) 3722941 (0,01)
4 (70.05.10) 84 (4,34) 5,54 (0,51) 1,59 (8,89) 77,79 (17,00) 4863538 (9,16)
5 (96.05.05) 92 (3,07) 5,49 (2,71) 1,00 (8,49) 50,16 (7,23) 4836133 (3,19)
6 (96.10.10) 83,5 (2,54) 5,41 (0,78) 1,89 (0,75) 52,19 (3,30) 8441196 (4,47)
7 (96.10.05) 83 (10,22) 5,60 (0,38) 1,15 (4,32) 47,06 (5,42) 4809916 (7,71)
8 (96.05.10) 89 (4,77) 5,30 (0,001) 1,47 (1,92) 53,70 (11,03) 8871126 (7,53)
Resultados representados pela média seguida do DPR = Desvio Padrão Relativo *ABC = A) Solvente (álcool °GL); B) Tempo (h); C) Relação droga:solvente (%).
O rendimento da extração variou de 83 a 93% e esteve relacionado com a
taxa de evaporação do solvente em relação ao tempo de extração, ou seja, nas
soluções extrativas onde o tempo de extração foi de 10 h, o rendimento foi menor.
O pH obtido é levemente ácido para todas as condições, variando entre 5,30
a 5,60, havendo diferença estatisticamente significante (p > 0,05) entre as soluções
extrativas obtidas com álcool 70 °GL e álcool 96 °GL de tempo de extração de 10 h e
relação droga:solvente 5 e 10% (Tabela 3).
O resíduo seco das soluções extrativas variou de 0,73 a 1,89. A análise
estatística revela que este parâmetro é definido pela proporção droga:solvente e
pela diferença no grau alcoólico, não havendo interferência do tempo de extração (p
> 0,05). As soluções extrativas 70 °GL e 96 °GL, quando expostas às mesmas
condições, apresentaram diferença estatisticamente significante (p > 0,05), sendo
que os maiores valores de resíduo seco foram apresentados para o álcool 96 °GL
(Tabela 3).
A caracterização e a identificação por CCD (Figura 12) repetiu o mesmo
comportamento já descrito no estudo inicial de extração (Figura 10), conforme era o
esperado.
78
Figura 12 - Cromatografia em camada delgada das soluções extrativas dos frutos da R. ferruginea nos diferentes graus alcoólicos. Como fase estacionária utilizou-se sílica gel (GF254) e, como fase móvel, hexano:acetato de etila (6:4), após revelação com anisaldeído sulfúrico e aquecimento.
1: álcool 70 °GL-5h.-5% droga:solvente; 2: álcool 70 °GL-10h-10% droga:solvente; 3: álcool 70 °G-10h-5% droga:solvente; 4: álcool 70 °GL-5h-10% droga:solvente; 5: álcool 95%-5h-5% droga:solvente; 6: álcool 95%-10h-10% droga:solvente; 7: álcool 95%-10h-5% droga:solvente; 8: álcool 95%-5h-10% droga:solvente, utilizando como padrões os ácidos mirsinoicos A e B.
Em todas as amostras analisadas por CLAE, foi possível confirmar, a
presença do AMA e do TGL, já identificados no estudo preliminar (Figura 11).
No presente trabalho, apenas quantificou-se o AMA, devido à disponibilidade
de metodologia já desenvolvida e validada para este marcador em estudo anterior
(ZERMIANI, 2015). Portanto, o teor de AMA foi usado como indicador no estudo de
otimização do processo extrativo. Observam-se diferenças significativas (p < 0,05)
entre as SE 70 ºGL e 96 °GL (Figura 13, Tabela 3). Nas extrações com o solvente 70
ºGL observa-se que o teor foi mais sensível ao tempo, sofrendo redução quando
passou de 5 para 10 h de extração. Provalvemente este comportamento seja
inerente à fraca estabilidade do marcador neste solvente mais aquoso, que oferece
um meio hidrolítico. Por outro lado, nas soluções obtidas com o solvente álcool 96
°GL, o percentual de variação foi menor, independente dos níveis dos fatores
estudados. Portanto, elegeu-se o solvente álcool 96 °GL, nos menores tempo e
relação droga:solvente como as melhores condições para o processo extrativo.
Os valores de alto DPR apresentados em algumas soluções extrativas nos
resultados do teor de AMA (Tabela 3) podem ser atribuídos à variabilidade inerente
dos processos extrativos vegetais, entre lotes, ainda que sejam do mesmo tamanho
79
(100 mL) e da mesma coleta. O alto valor de DPR% indicou que a extração dos
frutos não foi reprodutível, provavelmente devido à composição heterogênea da
amostra.
Quanto à área do TGL, os fatores de maior influência para a extração foram a
droga:solvente e o grau alcoólico, sendo diretamente proporcionais (Tabela 3).
Figura 13 – Teor de AMA (mg/g) para as soluções extrativas de álcool 70 °GL (A) e álcool 96 °GL (B) dos frutos da R. ferruginea em relação à proporção droga:solvente (%) e ao tempo (h).
5.4 Caracterização dos derivados vegetais obtidos com álcool 96 °GL
5.4.1 Determinação da citotoxicidade pelo método MTT
Na determinação da citotoxicidade em células fibroblásticas de camundongos
da linhagem L929, as soluções extrativas de álcool 96 °GL nos tempos de 5 e 10 h e
droga:solvente 5 e 10% foram avaliadas. Em nenhuma das soluções extrativas o
IC50 foi menor que a maior concentração testada (5 µg/mL). Porém, houve redução
significativa (p < 0,05) da viabilidade celular de 44% para a condição extrativa no
tempo de 10 h e droga:solvente 10%. Para as demais soluções extrativas, a taxa de
sobrevivência das células foi maior que 90%, quando comparadas ao controle
negativo (Figura 14).
80
Figura 14 – Viabilidade das células L929 expostas às soluções extrativas dos frutos da R. ferruginea na concentração de 5 µg/mL, utilizando como controle negativo meio DMEM e DMSO 0,01%.
*ABC = A) Solvente (álcool °GL); B) Tempo (h); C) Relação droga:solvente (%).
Tomio (2011) avaliou a citotoxicidade dos extratos moles etanólicos das
cascas, folhas, frutos e galhos da R. ferruginea em linhagem celular L929, e os
resultados mostraram que apenas o extrato das cascas da R. ferruginea
apresentaram citotoxicidade na concentração de 100 µg/mL, com redução da
viabilidade celular de 70%. O AMA, isolado das cascas da R. ferruginea, não
apresentou efeito citotóxico em nenhuma concentração testada (0,1, 1,0, 10 e 100
µg/mL). No trabalho de Tomio (2011), os frutos foram secos e moídos e submetidos
a um processo de extração exaustiva com etanol (EtOH) durante 7 dias. Após
filtração, o solvente foi removido por destilação em evaporador rotatório sob pressão
reduzida para obtenção dos extratos moles.
No entanto, Barretta (2011) avaliou a citotoxicidade dos extratos moles
etanólicos dos frutos da R. ferruginea, obtidos com o mesmo processo que Tomio
(2011), em linhagem celular L929 pelo método do vermelho neutro. Quando testatos,
não foi evidenciada toxicidade nas concentrações 0,01, 1 a 100 μg/mL, diferente do
composto isolado (AMA), que apresentou possível efeito citotóxico na concentração
de 10 e 100 μg/mL.
Nestes dois trabalhos, nota-se uma divergência entre os resultados, mesmo
entre extratos obtidos com o mesmo tipo de solvente e mesmo método de extração,
e composto isolado, na mesma concentração. Estas diferenças podem estar
relacionadas às variáveis das metodologias empregadas. Assim como observado no
81
presente trabalho, essa disparidade, também pode estar supostamente relacionada
com o método de obtenção dos extratos, já que a citotoxicidade das soluções
extrativas etanólicas dos frutos, em alguns casos especialmente, se mostrou ligada
às condições de preparação da solução extrativa, como tempo de extração. O teor
de AMA das soluções extrativas (Tabela 3) não parece estar relacionado à baixa
viabilidade da solução extrativa de relação droga:solvente a 10% e tempo de 10 h,
uma vez que a variação de teor foi mínima.
Um importante critério de segurança na pesquisa de compostos ativos com
potencial terapêutico, é determinar a ausência de efeitos tóxicos em células não-
tumorais. As soluções extrativas, quando testadas em uma concentração
relativamente baixa, já demostraram certa citotoxicidade. Talvez este resultado
esteja relacionado a formação de produtos resultantes da oxidação, em função do
maior tempo de extração (10 h). As demais soluções extrativas demonstraram
segurança, podendo ser úteis para o desenvolvimento de novos medicamentos e/ou
cosméticos.
5.4.2 Caracterização físico-química do extrato mole selecionado
A partir dos resultados anteriores, novo lote de solução extrativa foi
preparado. Escolheu-se o tempo de 5 h para a extração da droga vegetal, evitando
assim menor exposição a possíveis fatores de degradação, como relatado
anteriormente. A relação droga:solvente foi mantida em 5% para evitar a saturação
do solvente. Após o preparo da solução extrativa, foi obtido o extrato mole.
O rendimento, pH, resíduo seco e teor de AMA das soluções extrativas e extrato mole dos frutos da R. ferruginea, preparados com álcool 96 °GL, estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4 - Caracterização da solução extrativa a 5% (m/v) e extrato mole dos frutos da R. ferruginea preparados com álcool 96 °GL, 5 h de extração.
Parâmetros Solução extrativa Extrato mole
Rendimento (%) 85 18,42*
pH 5,85 (0,78) 5,41 (0,43)
Resíduo seco (%) 0,91 (0,69) 71,69 (4,42)
Teor AMA (mg/g) 103,03 (0,38) 55,53 (0,29)
*Relação EM : droga vegetal Resultados representados pela média seguida do DPR = Desvio Padrão Relativo
82
O pH do extrato mole e solução extrativa estão em conformidade, uma vez
que permanece levemente ácido, não sofrendo alteração perante o processo de
evaporação do solvente.
O resíduo seco do extrato mole é considerado baixo, denotando alto teor de
líquidos, mesmo após longo período de evaporação em banho-maria. Este resultado
pode ser atribuído à composição dos extratos dos frutos, rica em triglicerídeos e
AMA, que são líquidos oleosos.
Observou-se novamente que os resultados de teor de AMA alteram-se entre
lotes de mesmo tamanho, e que esta diferença se torna ainda maior, quando o
tamanho de lote é modificado, visto que o tamanho de lote variou de 100 mL (Tabela
3) a 1000 mL (Tabela 4).
5.4.3 Determinação da atividade antioxidante por DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazina)
Com a finalidade de avaliar a capacidade do extrato dos frutos da Rapanea
ferruginea de capturar radicais livres (DPPH), foi realizada a análise das soluções do
extrato mole com graduação alcoólica de 96 °GL no tempo de 5 h e 5%
droga:solvente, em diferentes concentrações. Os resultados estão expressos em
percentagem de inibição de oxidação, ou seja, a porcentagem de atividade
antioxidante é correspondente à quantidade de DPPH consumida pelo antioxidante.
Quanto maior o consumo de DPPH pela amostra, maior é sua atividade antioxidante
(AA) (ALVES et al., 2007). Observa-se, portanto, uma relação dose-resposta, ou
seja, quanto maior a concentração do extrato, maior sua atividade antioxidante. A
aplicação tópica de antioxidantes reduz os danos oxidativos induzidos pela radiação
UV.
Com o objetivo de determinar o IC50, que é a concentração necessária para
reduzir 50% dos radicais da amostra, foi construída uma curva com a amostra, a
partir das concentrações de 2,5, 5,0, 7,5, 10, 20 e 30 μg/mL e com o padrão de
ácido ascórbico nas concentrações de 1 a 4 μg/mL, calculando-se a equação da reta
e o coeficiente de determinação (r2), conforme mostra a Figura 15. Quando
calculado o IC50 pela equação da reta, foram obtidas as concentrações de 16,26
μg/mL para o EM Álcool 96 °GL e de 2,28 μg/mL para o ácido ascórbico (controle
positivo). Comparado ao padrão de ácido ascórbico, houve uma diferença
83
significativa (p < 0,05), sendo necessária uma concentração 11 vezes maior de
extrato para reduzir 50% dos radicais. Porém, ao se tratar de extratos vegetais
considera-se uma atividade antioxidante razoável, visto que na literatura, encontram-
se estudos com extratos etanólicos de espécies vegetais brasileiras, demonstrando
que plantas como Anadenanthera peregrina e Pseudopiptadenia contorta
apresentaram maior potencial antioxidante, com IC50 nas concentrações de 9,82
µg/mL e 13,60 µg/mL, enquanto que extratos de Ginkgo biloba mostraram atividade
inferior ao presente estudo, com IC50 equivalente a 44,72 µg/mL (MENSOR et al.,
2001).
Figura 15 – A: Atividade antioxidante do EM álcool 96 °GL dos frutos da R. ferruginea; B: Atividade antioxidante do ácido ascórbico (Vit. C).
A
B
84
Estudo realizado com os frutos da Litchi chinensis evidenciaram atividade
antioxidante na concentração de 20 µg/mL, em que seus extratos apresentaram AA
em torno de 50% (ZHAO et al., 2006). Comparando estes resultados com o presente
estudo, observa-se uma atividade antioxidante similar para os frutos da R.
ferruginea.
Roesler e colaboradores (2007) verificaram que a extração etanólica resulta
em extratos com maiores conteúdos de compostos fenólicos e, consequentemente,
com maior capacidade de sequestrar radicais livres para diversos frutos do cerrado
brasileiro. Barretta (2011) verificou que há uma correlação positiva entre a atividade
antioxidante e o teor de fenólicos presentes no extrato etanólico das cascas e dos
frutos da R. ferruginea, sugerindo que compostos, como o AMA, sejam os maiores
responsáveis pela atividade antioxidante determinada.
Barretta (2011) avaliou a atividade antioxidante pelo método DPPH do extrato
etanólico dos frutos da R. ferruginea nas concentrações de 1, 5 e 10 μg/mL, com
valores de IC50 (9,73 µg/mL), ou seja, com atividade antioxidante superior ao
presente estudo. Essa diferença provavelmente está atrelada às especificidades da
metodologia, diferentes condições de análise empregadas e a forma de expressão
dos resultados que muitas vezes não permitem uma comparação direta. Além disso,
cada lote tem sua especificidade.
5.4.4 Coeficiente de partição óleo/água
Para produzir resposta farmacológica, a molécula do fármaco precisa penetrar
uma barreira biológica representada pelas camadas lipofílicas (membranas
celulares) e hidrofílicas (líquidos inter e intracelulares), e essa capacidade
fundamenta-se, em parte, na sua lipofilicidade em comparação com sua
hidrofilicidade. O coeficiente de partição de um fármaco é a medida de sua
distribuição em um sistema de fase lipofílica/hidrofílica, e indica sua capacidade de
penetrar sistemas biológicos. A velocidade de dissolução aliada a dados sobre
solubilidade, constante de dissolução e coeficiente de partição podem proporcionar
uma indicação sobre a biodisponibilidade do fármaco (KORINTH et al., 2012).
Através da quantificação do AMA remanescente na solução aquosa, foi
verificado que 100% do marcador particionou para a fase oleosa (octanol). A partir
destes resultados, o AMA pode ser considerado uma substância com alto coeficiente
85
de partição óleo/água, ou seja, possui maior afinidade e tende a migrar para uma
fase mais lipofílica, o que também pode indicar que o extrato mole, quando
incorporado a um sistema nanoemulsionado, estará totalmente incorporado no
interior da fase oleosa na formulação.
Além disso, os resultados de log P (coeficiente de partição) encontrados para
o AMA no estudo de Zermiani (2015), foram de 3,30. Substâncias com log P positivo
possuem maior afinidade e tendem a migrar para uma fase mais lipofílica e que junto
às demais características moleculares, sugerem uma boa absorção e
permeabilidade pela via cutânea, uma vez que estudos sugerem que o máximo de
absorção percutânea ocorre em substâncias com log P entre 2 e 3 (KORINTH et al.,
2012).
O AMA mostra-se favorável também à farmacocinética no corpo humano, o
que faz dele uma substância ativa quando administrado via oral, já que substâncias
com log P maiores que 5 é que sugerem baixa absorção (LIPINSKI et al., 2012).
O log P encontrado para o AMA foi semelhante ao de fármacos anti-
inflamatórios não esteroidais como diclofenaco, ibuprofeno, indometacina e
naproxeno (HADGRAFT; PLESSIS; GOOSEN, 2000).
5.5 Desenvolvimento de sistemas nanodispersos
Em trabalho anterior, realizado em parceria com a aluna de iniciação científica
Ionice de Araújo Dutra, desenvolveu-se nanoemulsões O/A para a incorporação do
extrato mole dos frutos da R. ferruginea (DUTRA et al., 2014). Os resultados obtidos
nesse estudo apontavam a necessidade de estudos posteriores para a otimização
das formulações contendo o extrato de R. ferruginea
Portanto, no presente trabalho, deu-se continuidade com a construção de um
diagrama de fases pseudoternário, ferramenta fundamental para a otimização de
sistemas nanoemulsionados.
As formulações desenvolvidas no diagrama pseudoternário foram submetidas,
após 24 h de preparo, à análise visual (Quadro 10). As formulações 1.1, 2.1, 3.1, 5.1
e 9.1 apresentaram características semelhantes, aspecto líquido e coloração
marrom-avermelhadas e não houve presença de sedimento. A formulação 6.1
apresentou aspecto oleoso, sendo a formulação mais viscosa e com maior
quantidade de espuma, devido a maior quantidade de tensoativos. As formulações
86
4.1, 7.1, 10.1, 11.1 apresentaram aspecto líquido leitoso e coloração rosada, com
presença de pequeno sedimento e gotículas dispersas na superfície (após uma
semana, houve separação de fases). A formulação 8.1 apresentou coloração rosada
mais escura, aspecto opalescente comparada à formulação 7.1 e aspecto líquido
leitoso. Ocorreu separação de fases na superfície da formulação que apresenta uma
camada de óleo. A formulação 12.1 sofreu separação de fases. As formulações 13.1
a 16.1 apresentaram aspectos opalescentes. A formulação 16.1 mostrou aspecto
oleoso e viscoso (Figura 16).
Após a centrifugação, apenas as formulações 4.1, 7.1, 8.1 e 11.1
apresentaram pequena presença de sedimento, o que já serviu como forma de
exclusão destas formulações para próxima fase. Na formulação 10.1 houve
separação de fases e alta sedimentação. As formulações 12.1 e 13.1 apresentaram
separação de fases, sendo excluídas. As outras formulações não foram alteradas (a
cor dificultou a visualização).
As formulações sem EM apresentaram características físicas semelhantes
aos lotes contendo extrato, exceto pela cor, característica da ausência do EM
(Figura 16).
Após a centrifugação, as formulações 1.2, 2.2, 3.2 e 5.2 apresentaram
aspecto translúcido e coloração azulada. As formulações 4.2, 7.2, 10.2, 11.2
apresentaram aspecto leitoso e coloração branca. A formulação 6 ficou translúcida e
azulada, porém mais oleosa que as demais. As formulações 8.2 e 12.2 ficaram
branca leitosas, parecidas com as formulações 4.2 e 7.2. A formulação 9 apresentou
aspecto translúcido. As formulações 13.2 a 16.2 apresentaram aspecto opalescente
(Quadro 10, Figura 16).
87
Figura 16 - Análise visual das formulações do diagrama pseudoternário após 24 h de preparo. A: formulações com EM dos frutos da R. ferruginea; B: formulações sem EM.
Quadro 10 - Características físicas das formulações do diagrama pseudoternário após centrifugação.
Centrifugação Características organolépticas
Lotes Óleo.Tensoativo.EM
(%) Ausência de
sedimentação Aspecto
macroscópico Consistência
1.1 05.10.1 Conforme Translúcido Fluido
1.2 05.10.0 Conforme Translúcido Fluido
2.1 05.15.1 Conforme Translúcido Fluido
2.2 05.15.0 Conforme Translúcido Fluido
3.1 05.20.1 Conforme Translúcido Fluido
3.2 05.20.0 Conforme Translúcido Fluido
4.1 10.05.1 Não conforme Leitoso Fluido
4.2 10.05.0 Não conforme Leitoso Fluido
5.1 10.15.1 Conforme Leitoso Fluido
5.2 10.15.0 Conforme Leitoso Fluido
6.1 10.20.1 Conforme Translúcido Fluido
6.2 10.20.0 Conforme Translúcido Fluido
7.1 15.05.1 Não conforme Leitoso Fluido
7.2 15.05.0 Não conforme Leitoso Fluido
8.1 15.10.1 Não conforme Opalescente Fluido
8.2 15.10.0 Não conforme Opalescente Fluido
9.1 15.20.1 Conforme Translúcido Fluido
9.2 15.20.0 Conforme Translúcido Fluido
10.1 20.05.1 Não conforme Leitoso Fluido
10.2 20.05.0 Não conforme Leitoso Fluido
11.1 20.10.1 Não conforme Leitoso Fluido
11.2 20.10.0 Não conforme Leitoso Fluido
12.1 20.15.1 Não conforme Opalescente Fluido
12.2 20.15.0 Não conforme Opalescente Fluido
13.1 05.05.1 Não conforme Opalescente Fluido
13.2 05.05.0 Não conforme Opalescente Fluido
14.1 10.10.1 Conforme Opalescente Fluido
14.2 10.10.0 Conforme Opalescente Fluido
15.1 15.15.1 Conforme Opalescente Fluido
15.2 15.15.0 Conforme Opalescente Fluido
16.1 20.20.1 Conforme Opalescente Fluido
16.2 20.20.0 Conforme Opalescente Fluido
88
Aparentemente, todas as formulações apresentaram característica de
nanoemulsão, uma vez que seus aspectos foram fluidos e coloração translúcida
azulada a opalescente, proporcional ao tamanho de gotícula. O reflexo azulado
ocorre em virtude do efeito Tyndall, característico de sistemas coloidais, que ocorre
quando há a dispersão da luz pelas gotículas do sistema. Neste caso, é possível
visualizar o trajeto que a luz percorre, pois estas gotículas dispersam os raios
luminosos (XU; YANG; HAMMOUDA, 2011).
Houve alteração de tamanho entre os lotes com e sem extrato, sendo que as
formulações com EM diminuem o tamanho da fase interna, o que pode ter sido
influenciado pela presença do extrato no processo de emulsificação (Tabela 5). Foi
observado também que o tamanho foi inversamente proporcional ao tensoativo,
quando se aumentou a concentração de tensoativo, o tamanho médio da fase
interna foi menor e as formulações apresentaram-se mais estáveis, sem presença de
sedimento do EM. O PDI, referente à distribuição das gotículas da fase interna,
variou de 0,134 a 0,374, indicando que nem todas as formulações apresentaram-se
monodispersas (Tabela 5). As formulações que apresentaram PDI menor que 0,2
indicam homogeneidade do sistema.
Conforme a Figura 17, é possível observar que o aumento da fase interna é
proporcional à concentração de óleo e inversamente proporcional ao tensoativo,
característico de sistemas nanoemulsionados.
Figura 17 – Tamanho médio da fase interna (nm) dos sistemas nanodispersos contendo extrato mole dos frutos da R. ferruginea (SND_EM) e dos sistemas nanodispersos sem extrato mole (SND), em função da proporção de óleo e tensoativo (%).
89
Tabela 5 – Caracterização das formulações do diagrama pseudoternário quanto ao tamanho médio da fase interna por número e PDI.
Lotes Óleo.Tensoativo.EM
(%) Tamanho médio (nm)
Média (s) PDI
Média (s)
1.1 05.10.1 9,94 (2,24) 0,239 (0,01)
1.2 05.10.0 22,64 (1,42) 0,154 (0,02)
2.1 05.15.1 5,40 (1,15) 0,320 (0,06)
2.2 05.15.0 14,21 (4,16) 0,194 (0,03)
3.1 05.20.1 5,97 (2,60) 0,346 (0,08)
3.2 05.20.0 12,07 (0,80) 0,248 (0,01)
4.1 10.05.1 101,17 (6,74) 0,145 (0,01)
4.2 10.05.0 90,97 (30,83) 0,154 (0,01)
5.1 10.15.1 34,22 (1,40) 0,150 (0,01)
5.2 10.15.0 27,67 (1,13) 0,215 (0,01)
6.1 10.20.1 6,31 (1,82) 0,178 (0,01)
6.2 10.20.0 12,34 (5,07) 0,270 (0,01)
7.1 15.05.1 182,20 (1,84) 0,247 (0,01)
7.2 15.05.0 80,01 (4,68) 0,185 (0,01)
8.1 15.10.1 76,65 (4,43) 0,149 (0,01)
8.2 15.10.0 80,01 (4,68) 0,152 (0,01)
9.1 15.20.1 34,15 (4,89) 0,214 (0,03)
9.2 15.20.0 28,07 (1,58) 0,193 (0,01)
10.1 20.05.1 52,42 (7,47) 0,274 (0,005)
10.2 20.05.0 81,14 (7,95) 0,374 (0,07)
11.1 20.10.1 98,95 (10,19) 0,163 (0,02)
11.2 20.10.0 119,30 (7,85) 0,156 (0,01)
12.1 20.15.1 64,94 (3,31) 0,161 (0,01)
12.2 20.15.0 29,92 (4,44) 0,168 (0,01)
13.1 05.05.1 48,19 (1,76) 0,134 (0,004)
13.2 05.05.0 54,70 (3,36) 0,162 (0,02)
14.1 10.10.1 49,02 (4,62) 0,165 (0,01)
14.2 10.10.0 46,29 (2,73) 0,140 (0,001)
15.1 15.15.1 51,79 (2,09) 0,175 (0,01)
15.2 15.15.0 45,65 (2,42) 0,153 (0,005)
16.1 20.20.1 48,99 (2,74) 0,183 (0,01)
16.2 20.20.0 46,50 (3,63) 0,144 (0,01) s = desvio padrão
90
Conforme apresentado na Figura 18, nem todas as formulações
apresentaram distribuição de tamanho homogêneo. As formulações 3, 7 e 10 foram
eliminadas para a seleção da formulação, em função da heterogeineidade.
Figura 18 – Análise da distribuição de tamanho médio da fase interna por intensidade dos sistemas nanodispersos contendo EM dos frutos da R. ferruginea.
91
Por fim, as formulações 1, 2, 5 e 14 foram escolhidas para seguir os estudos
de estabilidade por apresentarem menor concentração de óleo e principalmente,
pela concentração de tensoativos, em que se prioriza sempre a menor concentração
possível. Nas quais, as formulações 1 e 2 apresentam quantidade mínima de óleo
(5%) com quantidades intermediárias de tensoativo (10 e 15%, respectivamente) e
as formulações 5 e 14 com quantidade intermediária de óleo (10%) com quantidades
intermediárias de tensoativo (15 e 10%, respectivamente).
5.6 Estabilidade preliminar
A estabilidade preliminar foi realizada com o objetivo de auxiliar e orientar na
escolha das formulações. Os sistemas nanodispersos (SND) 1.1 a 5.1 apresentaram
coloração vermelha-escura e translúcidas e com aspecto fluido. O SND 14.1
apresentou-se com coloração mais rosada e opalescente e aspecto fluido,
proporcional ao tamanho de gotícula, a qual também mostrou indício de
coalescência de fase oleosa, após 14 dias do ciclo (Figura 19). As formulações não
apresentaram alterações antes e após a centrifugação até o final do ciclo (28 dias).
Figura 19 - Aspecto visual dos sistemas nanodispersos, 1.1, 2.1, 5.1 e 14.1, respectivamente,
submetidos ao estudo de estabilidade preliminar.
1.1: 5% óleo, 10% tensoativo; 2.1: 5% óleo, 15% tensoativo; 5.1: 10% óleo, 15% tensoativo; 14.1: 10% óleo, 10% tensoativo. Nota: Todas as formulaões contém 1% EM dos frutos da R. ferruginea e 0,5% de conservante.
O aumento de tamanho foi observado em todas as formulações, que
apresentaram diferença estatisticamente significante, (p < 0,05) ao final de 28 dias
do ciclo, em relação ao tempo inicial (24 h) (Tabela 6, Figura 20).
92
O tamanho médio das formulações 5.1 e 14.1, quando expostas às condições
gelo-degelo manifestaram aumento significativo após os 14 dias, o qual não diferiu
de ambos os controles (5 C e 25 C).
Para 1.1, este aumento foi significativo aos 28 d, assemelhando apenas ao
controle (5 C), o que denota a influência da queda de temperatura. Este
comportamento de instabilidade foi mais lento para a 2.1, dependente do tempo e
das variações de temperatura (Tabela 6, Figura 20).
O índice de polidispersividade (PDI) refere-se à distribuição homogênea das
gotículas da fase interna, preconizando-se que seja inferior a 0,2. Destaca-se a
formulação 14.1, com menor PDI, o que pode estar atrelado ao maior tamanho de
fase interna, uma vez que o limite mínimo de leitura do ZetaSizer Nano ZS é de 1 nm
(Tabela 6).
O pH permaneceu levemente ácido durante os 28 dias, variando de 5,53 a
6,15 entre as formulações. (Tabela 6).
Os resultados de estabilidade e tamanho de fase interna indicaram que as
formulações são termodinamicamente instáveis, característicos de sistemas
nanoemulsionados.
Figura 20 - Análise do tamanho médio das formulações contendo EM dos frutos da R. ferruginea sujeitas ao estudo de estabilidade preliminar.
93
Tabela 6 – Resultados do estudo de estabilidade preliminar dos sistemas nanodispersos (1.1, 2.1, 5.1 e 14.1).
Condições Tempo inicial Ciclo 5 C/ 40 C,
a cada 24 h Controles
Tempo e Temperatura
24 h 14 d 28 d 28 d
5 C
28 d
25 C Tamanho médio (nm)
Média (s)
1.1 5,17 (6,69) 7,51 (9,54) 23,56 (7,87) 23,83 (17,70) 7,51 (17,64)
2.1 5,13 (7,33) 6,57 (2,26) 10,03 (13,16) 6,65 (8,68) 7,76 (6,52)
5.1 2,35 (8,72) 31,42 (6,87) 31,87 (5,34) 31,12 (3,94) 30,02 (1,09)
14.1 42,21 (4,56) 50,77 (6,51) 49,28 (5,31) 51,58 (3,08) 50,06 (5,83)
PDI Média (s)
1.1 0,198 (1,67) 0,232 (10,52) 0,183 (13,84) 0,213 (3,01) 0,209 (3,65)
2.1 0,247 (2,66) 0,255 (5,84) 0,224 (1,39) 0,262 (2,65) 0,241 (0,78)
5.1 0,208 (0,40) 0,202 (7,78) 0,201 (4,17) 0,226 (3,17) 0,217 (1,70)
14.1 0,148 (1,50) 0,158 (4,49) 0,142 (5,50) 0,146 (2,47) 0,142 (4,24)
pH Média (s)
1.1 5,77 (0,75) 5,76 (2,01) 5,62 (0,42) 5,68 (0,35) 5,53 (4,55)
2.1 5,96 (1,20) 6,06 (2,04) 5,93 (3,04) 5,86 (1,47) 6,00 (0,52)
5.1 6,13 (0,48) 6,16 (0,67) 5,97 (0,98) 6,00 (0,52) 6,04 (0,78)
14.1 6,05 (0,70) 5,95 (1,51) 5,75 (1,87) 5,98 (2,34) 5,87 (0,16)
1.1: 5% óleo, 10% tensoativo; 2.1: 5% óleo, 15% tensoativo; 5.1: 10% óleo, 15% tensoativo; 14.1: 10% óleo, 10% tensoativo. s = desvio padrão Nota: Os resultados representam a média dos lotes 1 e 2 para cada SND, seguidos pelo desvio padrão.
Após o estudo de estabilidade preliminar, selecionou-se as formulações 1.1 e
14.1 para dar continuidade na caracterização por microscopia eletrônica de
transmissão e pelo equipamento de espalhamento de luz dinâmico multi-ângulos. A
escolha foi realizada a partir do tamanho médio de fase interna distintos e a menor
quantidade de tensoativo (10%) nas formulações, já que os SND 2.1 e 5.1
apresentavam 15% de tensoativo em suas composições.
5.7 Caracterização dos sistemas nanodispersos
5.7.1 Análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão
As fotomicrografias obtidas por MET dos sistemas nanodispersos revelam
estruturas esféricas, mostrando a aparência típica de nanoemulsão óleo em água
94
(Figura 21). Além disso, as fotomicrografias não apresentam interferência quanto à
incorporação do EM a 1% e a 0,25%.
Porém, observa-se nas fotomicrografias o fenômeno de coalescência, ou seja,
um processo que ocorre quando duas gotículas alcançam proximidade suficiente e
têm a estrutura de suas interfaces comprometidas devido à individualidade tornando-
se um único glóbulo. A coalescência pode ocorrer em nanoemulsões, visto que são
sistemas instáveis (MCCLEMENTS, 2012; NAZARZADEH; ANTHONYPILLAI;
SAJJADI, 2013; XIN et al., 2013). Sugere-se que este fenômeno tenha ocorrido em
função do preparo da técnica, que requer secagem.
Figura 21 - Fotomicrografias (MET) dos SND1 EM 1% - Aumento 20000 (A), SND1 sem EM - Aumento 40000 (B), SND14 EM 1% - Aumento 25000 (C), SND14 sem EM (D) - Aumento 20000 e SND14 EM 0,25% - Aumento 25000 (E).
95
5.7.2 Espalhamento de luz dinâmico multi-ângulos
De maneira complementar à técnica do equipamento ZetaSizer Nano ZS,
verificou-se também a dependência angular do diâmetro médio dos sistemas
nanodispersos SND1 e SND14 pelo espallhamento de luz dinâmico multi-ângulos,
sendo submetidos aos ângulos de 30, 90 e 150 °.
Inicialmente, comparou-se o tamanho da fase interna das formulações entre
os ângulos pelo mesmo equipamento, o goniômetro. Conforme detalha a Tabela 7,
as formulações SND1 EM 1%, SND1 sem EM e SND14 EM 1% não apresentaram
diferença estatisticamente significante (p > 0,05) entre os ângulos. A formulação
SND14 sem EM não apresentou diferença (p > 0,05) entre os ângulos de 30 e 150 °.
Percebe-se que a técnica comparada com o ZetaSizer Nano ZS, apresenta
divergências quanto ao tamanho de gotículas para a formulação SND14, ao fato da
caracterização do tamanho médio varia de acordo com o ângulo de espalhamento
de luz. Esta informação fica evidenciada nos resultados da Tabela 7, em que quanto
maior o ângulo, maior é o espalhamento da luz laser sob as gotículas, exceto a
formulação SND14 EM 1%.
Por fim, a formulação SND14 apresenta maior instabilidade quanto ao
tamanho da fase interna, denotando sua heterogeineidade, por apresentar valores
diferentes conforme o ângulo de espalhamento de luz.
Tabela 7 – Comparação do tamanho médio da fase interna entre Goniômetro e ZetaSizer Nano ZS.
s = desvio padrão
Após a caracterização das amostras SND1 e SND14, com 5 e 10% de óleo,
respectivamente e 10% de tensoativo em suas composições, selecionou-se a
formulação SND1 para dar continuidade aos estudos, pois mostrou ser mais
homogênea quanto ao tamanho médio da fase interna (Tabela 7), além da análise
Goniômetro Zetasizer Nano ZS
Amostras
30 ° Média (s)
nm
90 ° Média (s)
nm
150 ° Média (s)
nm
173° Média (s)
nm
SND1 EM 1% 9,9 (8,4) 10,50 (1,13) 12,75 (1,20) 8,55 (1,37)
SND1 sem EM 5,7 (7,4) 11,15 (1,62) 18,5 (2,82) 15,88 (4,92)
SND14 EM 1% 59,85 (29,34) 32,05 (1,48) 30,75 (27,05) 50,89 (5,90)
SND14 sem EM 73,65 (10,82) 27,55 (2,47) 85,95 (2,05) 45,17 (1,11)
96
visual ser mais estável que SND14, o qual apresentou indício de coalescência de
fase oleosa no estudo de estabilidade preliminar após 14 dias (item 5.6).
5.8 Estabilidade acelerada da formulação selecionada
A avaliação da formulação SND1 no estudo da estabilidade acelerada deu-se
início com o aspecto visual, onde as amostras SND1 contendo EM apresentaram-se
com coloração vermelha-escura e translúcidas e aspecto fluido, já as formulações
sem EM apresentaram-se com coloração translúcida e azulada e aspecto fluido,
característico de nanoemulsões (Figura 22). As formulações também não
apresentaram alterações antes e após a centrifugação até o tempo final de 90 dias,
exceto para SND1 EM 1% 25 C, que no tempo de 90 dias apresentou aparente
contaminação, apontando a necessidade de um aumento da concentração de
conservante para a formulação.
Figura 22 – Análise visual dos SND1 com e sem EM dos frutos da R. ferruginea submetidos ao estudo de estabilidade acelerada.
O aumento de tamanho foi observado em todas as formulações, exceto para
o SND1 EM 5 C que ao final de 90 dias apresentou tamanho médio semelhante ao
tempo inicial (24 h), porém apenas os SND1 sem EM 40 °C e SND1 sem EM 5 C
apresentaram diferença estatisticamente significante, (p < 0,05) ao final de 90 dias
em relação ao tempo inicial, denotando alguma influência quanto à incorporação do
EM, uma vez que houve menor diferença de tamanho no tempo final (90 d) para
estas formulações (SND1 EM 40 °C e SND1 EM 5 C) (Tabela 8, Figura 23). O
aumento do tamanho da fase interna pode estar relacionado à coalescência das
gotículas das formulações com o passar do tempo (NAZARZADEH;
ANTHONYPILLAI; SAJJADI, 2013).
O PDI variou de 0,064 a 0,255, vale ressaltar que assim como na estabilidade
preliminar, os menores valores de PDI foram das formulações que apresentaram
97
maior tamanho (SND1 sem EM 40 °C). Em modo geral, a faixa de PDI sugere um
sistema monodisperso, considerando que a faixa de PDI ficou em torno de 0,2
(Tabela 8).
O potencial zeta indica o grau de repulsão entre gotículas adjacentes e
similarmente carregadas em uma dispersão. Gotículas que são suficientemente
pequenas, como é o caso das formulações SND1, um potencial zeta alto conferirá
estabilidade, o que significa que a dispersão resistirá à agregação. Quando o
potencial é baixo, atração excede a repulsão e assim, a dispersão quebrará e
floculará. De modo geral, a linha que divide os sistemas em estáveis e instáveis é
marcada em +30 ou -30 mV, assim gotículas com potencial mais positivo que +30 ou
mais negativo que -30 mV são considerados estáveis (HE et al., 2011). A avaliação
do potencial zeta demonstrou que os SND1 contendo EM em todas as condições
foram mais estáveis do que na condição de 40 °C, ao final de 90 dias, acompanhado
de um aumento de tamanho progressivo do tamanho médio, confirmando sua
instabilidade termodinâmica frente às temperaturas mais elevadas (Tabela 8).
O pH variou de 3,37 a 7,25 entre as formulações, sugerindo que os
componentes das formulações podem aumentar o valor do pH, uma vez que o pH do
EM é igual a 5,41 e que as formulações sem EM apresentam maior pH. Houve uma
queda de pH para o SND1 sem EM 40 °C, reforçando a ideia de que, quando
submetida às condições de estresse, esta formulação é termodinamicamente
instável (Tabela 8).
Figura 23 - Análise do tamanho médio dos SND com e sem EM dos frutos da R. ferruginea sujeitos ao estudo de estabilidade acelerada.
98
Tabela 8 - Análise do PDI, potencial zeta e pH dos SND sujeitos ao estudo de estabilidade acelerada.
Condições Tempo
Formulações 24 h 30 d 60 d 90 d
Tamanho médio (nm)
Média (s)
SND1 EM 1% 25 °C 7,28 (1,02) 9,73 (5,45) 12,05 (7,11) 15,09 (7,69)
SND1 sem EM 25 °C 12,99 (5,80) 13,04 (5,12) 17,10 (6,03) 19,82 (1,54)
SND1 EM 1% 40 °C * 6,60 (0,55) 13,77 (6,71) 16,32 (7,01)
SND1 sem EM 40 °C * 15,57 (3,92) 24,77 (0,23) 29,13 (1,32)
SND1 EM 1% 5 °C * 6,26 (1,44) 12,85 (8,18) 6,97 (0,92)
SND1 sem EM 5 °C * 13,20 (7,24) 16,13 (6,13) 20,61 (1,87)
PDI
Média (s)
SND1 EM 1% 25 °C 0,224 (0,008) 0,239 (0,006) 0,195 (0,010) 0,166 (0,032)
SND1 sem EM 25 °C 0,172 (0,012) 0,197 (0,008) 0,157 (0,04) 0,171 (0,020)
SND1 EM 1% 40 °C * 0,226 (0002) 0,196 (0,007) 0,184 (0,008)
SND1 sem EM 40 °C * 0,208 (0,061) 0,088 (0,006) 0,064 (0,01)
SND1 EM 1% 5 °C * 0,235 (0,03) 0,216 (0,017) 0,255 (0,02)
SND1 sem EM 5 °C * 0,184 (0,007) 0,159 (0,036) 0,157 (0,02)
Potencial zeta (mV)
Média (s)
SND1 EM 1% 25 °C -44,32 (3,77) -33,75 (2,61) -39,60 (12,68) -39,00 (15,17)
SND1 sem EM 25 °C -28,37 (4,29) -30,57 (9,14) -23,83 (6,72) -20,12 (4,50)
SND1 EM 1% 40 °C * -35,63 (3,96)- -30,97 (2,48) -32,13 (4,64)
SND1 sem EM 40 °C * -24,92 (6,36) -20,43 (5,69) -10,65 (1,21)
SND1 EM 1% 5 °C * -36,40 (3,25) -38,83 (3,89) -40,92 (3,05)
SND1 sem EM 5 °C * -25,28 (5,80) -25,33 (7,69) -32,38 (12,5)
pH
Média (s)
SND1 EM 1% 25 °C 4,66 (0,20) 6,25 (0,34) 5,04 (0,03) 4,70 (0,67)
SND1 sem EM 25 °C 7,21 (0,12) 6,91 (0,11) 6,45 (0,07) 6,47 (0,16)
SND1 EM 1% 40 °C * 6,02 (0,20) 5,30 (0,02) 5,38 (0,12)
SND1 sem EM 40 °C * 6,92 (0,41) 4,37 (0,19) 3,37 (0,20)
SND1 EM 1% 5 °C * 6,37 (0,30) 5,66 (0,02) 6,02 (0,19)
SND1 sem EM 5 °C * 7,25 (0,16) 6,64 (0,08) 6,96 (0,06)
s = Desvio Padrão * No tempo de 24 h após o preparo, as formulações não foram submetidas às temperaturas de 5 e 40 °C. Nota: Os resultados representam a média dos lotes 1 e 2 para cada SND, seguidos pelo desvio padrão.
99
5.8.1 Análise dos sistemas nanodispersos por CLAE
Os SND contendo 1% de extrato mole da R. ferruginea apresentaram perfil
cromatográfico semelhante ao do extrato nos dois comprimentos de onda
empregados (260 e 280 nm). O cromatograma das formulações com e sem extrato
apresentam outros picos (com tempo de retenção de 5 - 15,0 min), picos estes não
observados para o EM (Figura 11), que, portanto, devem estar relacionados com os
excipientes da formulação, mas que não interferem na eluição do AMA (Figura 24).
Figura 24 - Exemplo do perfil cromatográfico apresentado em todas as condições e tempos
analisados para os SND1 com e sem extrato mole da R. ferruginea submetidos ao estudo de estabilidade acelerada.
Quanto ao teor de AMA, pode-se observar que manteve-se entre 97%
(mantido em geladeira) até 115,9% (após 60 dias em 40 °C) do valor inicialmente
obtido (Tabela 9), provavelmente devido à evaporação da formulação na estufa. Os
SND sem EM foram mantidos como controle, uma vez que não apresentam picos de
AMA e TGL.
100
Tabela 9 – Análise por CLAE do sistema nanodisperso SND1 contendo 1% de extrato mole dos frutos da R. ferruginea submetidos ao estudo de estabilidade acelerada.
Amostras Teor AMA (µg/g) Média (DPR%)
% recuperação de AMA Área TGL
Média (DPR%)
24 h
SND1 EM 1% 700,69 (2,27) 100 7653076 (0,69)
30 d
SND1 EM 1% 25 °C 704,55 (0,64) 100,6 3178521 (11,63)
SND1 EM 1% 40 °C 719,33 (2,19) 102,7 1498305 (13,08)
SND1 EM 1% 5 °C 683,04 (0,24) 97,6 5049990 (1,43)
60 d
SND1 EM 1% 727,74 (0,36) 103,9 3080607 (2,18)
SND1 EM 1% 40 °C 812,23 (3,48) 115,9 825348 (9,87)
SND1 EM 1% 5 °C 698,15 (0,96) 99,6 5029759 (4,30)
DPR = Desvio Padrão Relativo
5.9 Fotoestabilidade
A exposição do sistema nanodisperso à radiação UVA na intensidade de 200
w.h/m² (Figura 25), e à radiação visível na intensidade de 1,2 milhões lux/h (Figura
26), causou a degradação total do AMA e do TGL, conforme observado pelo
desaparecimento dos picos de AMA e TGL.
101
Figura 25 – Perfil dos cromatogramas das amostras submetidas ao teste de fotoestabilidade na radiação UVA em 260 nm e 280 nm, respectivamente.
Figura 26 – Perfil dos cromatogramas das amostras submetidas ao teste de fotoestabilidade na radiação visível em 260 nm e 280 nm, respectivamente.
102
Zermiani (2015) realizou este mesmo estudo para a avaliar a fotoestabilidade
do marcador AMA e do extrato mole dos frutos. No presente trabalho, foram
avaliados os SND1 contendo EM e SND1 sem EM, expostos às mesmas condições.
De acordo com os resultados apresentados por Zermiani (2015), o composto
isolado AMA submetido inicialmente à radiação UVA na intensidade de 200 W.h/m²
sofreu degradação de 26,6%, quando dobrada a dose de radiação, a degradação do
AMA passou para 45,01%. Na região da luz visível com intensidade de 1,2 milhões
lux/h o AMA degradou de forma significativa (34,42%). O aumento da intensidade de
exposição para 2,4 milhões lux/h não causou degradação maior, demonstrando seu
limite para a máxima degradação.
O extrato mole etanólico dos frutos irradiados com radiação UVA na máxima
intensidade, apresentou 46,41% de degradação do AMA, muito semelhante ao valor
alcançado pelo composto isolado nas mesmas condições, e nenhuma degradação
do TGL. Quando exposto a radiação visível na máxima intensidade, houve uma
degradação intensa (98,66%) do marcador AMA, assim como do TGL que degradou
72,49% (ZERMIANI, 2015).
Portanto, estes resultados afirmam a fotoinstabilidade do extrato mole
etanólico dos frutos da R. ferruginea incorporados no SND1, e que este sistema
potencializa a degradação do AMA, uma vez que sistemas nanodispersos
apresentam grande área superficial e consequentemente aumentam a superfície de
contato, podendo facilitar uma maior exposição do extrato mole às radiações. Assim,
esta formulação demostra a necessidade de embalagens que ofereçam proteção à
luz.
5.10 Avaliação da segurança do extrato mole da R. ferruginea e sistemas
nanodispersos
A segurança do EM de R. ferruginea e da formulação selecionada (SND1)
foram avaliados pelo teste de difusão em ágar in vitro, cujos resultados podem ser
observados na Figura 27. Verificou-se que o EM não apresentou nenhuma
reatividade, sendo classificado com reatividade zero, o controle positivo (Triton X-
100) apresentou halo de 2,1 cm, classificado com reatividade 4, que significa
irritação severa, e os SND1 contendo EM 1%, assim como os SND1 sem EM,
apresentaram halo de 0,6 cm, com nível 3 de reatividade, correspondente a irritação
103
moderada, demonstrando que os componentes que causam alguma citotoxicidade
fazem parte da formulação e não do EM.
Figura 27 - Análise de agarose overlay para (1 e 4) extrato mole da R. ferruginea , (2) SND1 sem EM, (3) controle negativo - meio DMEM, (4), (5) SND1 com EM 1%, (6) controle positivo – Triton X-100.
5.11 Análise farmacológica
Os resultados obtidos sobre a avaliação dos efeitos do extrato mole da R
ferruginea (50 – 300 mg/kg), indometacina (10 mg/kg) e AMA (40 mg/kg)
administrados por via oral, sobre o processo doloroso induzido por ácido acético
(0,6%) estão representados na Figura 28. Os resultados demonstram que o
tratamento com o extrato mole da planta promoveu redução dos números de
contorções abdominais de forma significativa em todas as doses testadas (p < 0,05,
p < 0,01), com redução de 53,46% da dor na dose de 100 mg/kg quando comparado
com o grupo controle (veículo). Observou-se também que o AMA e a indometacina
promoveram efeito antinociceptivo maior do que o extrato, com inibição máxima do
processo doloroso calculado respectivamente para 62,26 e 91,64%.
104
Figura 28 - Efeito do extrato etanólico contendo os frutos da R. ferruginea (50 - 300 mg/kg), do AMA (40 mg/kg) e da indometacina (10 mg/kg) administrados por via oral, sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,6%) em camundongos. Cada coluna representa a média dos experimentos (n = 8) seguidas dos respectivos E.P.Ms. Asteriscos (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001) denotam significância estatística quando comparado com o grupo controle (veículo). ANOVA - Bon Ferroni.
Quando o extrato da planta é incorporado ao sistema nanodisperso (SND1),
administrado por via oral e avaliado no mesmo modelo de indução do processo
doloroso (Figura 29), observa-se um efeito antinociceptivo significativo (p < 0,01, p <
0,001) somente nas doses de 50 e 100 mg/kg respectivamente, tendo inibição do
processo doloroso (IM) calculada para 44,81 e 61,2% quando comparado com o
grupo que recebeu somente o sistema nanodisperso branco, ou seja, sem o extrato
mole dos frutos da R. ferruginea.
105
Figura 29 - Efeito do SND1 contendo extrato dos frutos da R. ferruginea (10 - 100 mg/kg) e da indometacina (10 mg/kg) administrados por gavagem (via oral) sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,6%) em camundongos. Cada coluna representa a média dos experimentos (n = 8) seguidas dos respectivos E.P.Ms. Asteriscos (**p<0,01; ***p<0,001) denotam significância estatística quando comparado com o grupo controle (SND1 sem incorporação do extrato). ANOVA - Bon Ferroni.
No mesmo modelo, avaliou-se o efeito do SND com o extrato da planta,
utilizando, entretanto a via intraperitoneal. Os resultados demostraram que em 100
mg/kg a formulação promoveu de forma bastante efetiva (p < 0,001) a redução da
nocicepção induzida por ácido acético, com IM calculada de 85,30% quando
comparada com o grupo controle (Figura 30).
Figura 30 - Efeito do SND1 contendo extrato dos frutos da R. ferruginea (100 mg/kg) e indometacina (10 mg/kg) administrados por via intraperitoneal sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,6%) em camundongos. Cada coluna representa a média dos experimentos (n = 8) seguidas dos respectivos E.P.Ms. Asteriscos (***p<0,001) denotam significância estatística quando comparado com o grupo controle (SND1 sem incorporação do extrato). ANOVA - Bon Ferroni.
106
Os resultados em conjunto confirmam o efeito antinociceptivo da planta R.
ferruginea, independente da forma como é utilizada. A administração intraperitoneal
do SND1 se dá na mesma área corporal onde é administrado o agente indutor do
processo doloroso, o ácido acético, tendo um efeito quase que local. Isto pode
explicar também os resultados observados no presente estudo.
Hess e colaboradores (2010) testaram a atividade antinociceptiva do ácido
mirsinoico B nas concentrações de 3, 6, 10, 30 e 60 mg/kg, pela via intraperitoneal e
nas concentrações de 150, 200, 300 e 500 mg/kg pela via oral. Os resultados
demonstraram que o AMB, administrado via i.p. apresentou potente ação
antinociceptiva nas concentrações de 30 e 60 mg/kg, enquanto que as
concentrações de 3, 6 e 10 mg/kg apresentaram ação antinociceptiva mais branda.
A IM para a administração i.p. foi de 76%. Se comparado com o presente estudo, o
SND1 contendo o extrato dos frutos de R. ferruginea apresenta maior IM que AMB,
apresentando maior ação antinociceptiva via i.p.. Por via oral, os resultados
demonstram que o AMB apresentou ação antinociceptiva nas doses de 200, 300 e
500 mg/kg, enquanto que a dose de 150 mg/kg não mostrou-se significativa. A IM
para este experimento foi de 43%, sendo que para o AMA na dose de 40 mg/kg
apresentou IM de 62,26% no presente estudo.
Estudos revelam que a dor pode estar associada ao estresse oxidativo.
Ungard e colaboradores (2013) demonstraram que, em células cancerígenas, a
liberação de glutamato, neurotransmissor excitatório do sistema nervoso, é
entendida como sendo um efeito secundário da resposta celular ao estresse
oxidativo. A liberação de glutamato a partir de células cancerígenas tem sido
demonstrada para resultar em redução de dor em modelos in vivo.
Castellain e colaboradores (2014) avaliaram a atividade antioxidante e
antinociceptiva de folhas de Litchi chinensis, que tem sendo utilizada
tradicionalmente na medicina popular. Os extratos metanólicos e os compostos
isolados desta planta apresentaram atividade antinociceptiva e atividade
antioxidante.
De modo semelhante, no presente estudo, sugere-se que a atividade
antioxidante do extrato mole de álcool 96 °GL dos frutos da R. ferruginea possa
estar relacionada ao efeito antinociceptivo observado no teste farmacológico.
107
6 CONCLUSÕES
Para a droga vegetal, o grau de maturação dos frutos é pouco determinante
para o teor de AMA, sendo maior nos frutos imaturos.
Para as soluções extrativas, a graduação alcoólica interfere diretamente no
teor de AMA.
No estudo de maximização de extração, a relação droga:solvente foi o único
fator preponderante sobre o teor de AMA, para cada solvente.
Quanto à análise in vitro, as soluções extrativas apresentaram viabilidade
celular acima de 50%, revelando relativa segurança de uso.
As formulações, selecionadas para os estudos de estabilidade foram
desenvolvidas com 5% (SND1) e 10% (SND14) do óleo Polymol®, e 10% do par de
tensoativos Ultramona RH400®/Span 80®.
Verificou-se a influência do extrato mole no tamanho de gotícula, que diminui
com o aumento da concentração de EM.
A análise por MET confirmou a forma esférica das gotículas e a coalescência
das gotículas sugere a presença de sistema nanoemulsionado.
No estudo de estabilidade acelerada, verificou-se que o teor de AMA é
relativamente constante até 60 dias em geladeira, ambiente e estufa a 40 °C, porém
há um aumento do tamanho de gotículas dependente do tempo, e acelerado na
estufa a 40 °C.
A exposição do SND1 às radiações UVA e visível causou 100% de
degradação para AMA e TGL, confirmando a fotoinstabilidade dos compostos pelo
desaparecimento do picos por CLAE.
A análise farmacológica sugere que o extrato dos frutos da R. ferruginea exibe
efeito antinociceptivo em animais, o qual é potencializado pelo SND1.
Por fim, o presente estudo sugere que o SND1, de tamanho médio da fase
interna de 10 nm, contendo 5% de óleo, 10% de tensoativos e 1% do EM etanólico
contendo os frutos da R. ferruginea mostra-se um sistema com potencial contra a
nocicepção.
108
109
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