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Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Dissertação de Mestrado

Desenvolvimento e caracterização de microcápsulas de alginato/quitosana contendo

ácido retinóico e óleo de babaçu

FABIANA TOLÊDO VELLOSO

Recife, 2008

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Mestranda Fabiana Tolêdo Velloso

Desenvolvimento e caracterização de microcápsulas de alginato/quitosana contendo

ácido retinóico e óleo de babaçu

Dissertação de mestrado aprovada pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito para obtenção do grau de Mestre na linha de pesquisa: Produção e Controle de Medicamentos.

Mestranda: Fabiana Tolêdo Velloso Orientador: Prof. Dr. Davi Pereira de Santana

Co-orientadora: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães

Recife, 2008

Dedico este trabalho à minha família que me forneceu tanto suporte emocional quanto

financeiro, a Deus por ter sido sempre tão bondoso comigo e ao meu filho Gabriel que ainda está por nascer, mas que tanto me deu forças para que eu pudesse finalizar esta dissertação.

AGRADECIMENTOS

Embora uma dissertação seja, pela sua finalidade acadêmica, um trabalho individual, há contribuições de natureza diversa que não podem nem devem deixar de ser realçadas. Por essa razão, desejo expressar os meus sinceros agradecimentos:

Aos meus pais por terem sempre me proporcionado a melhor educação possível, por sempre terem sido dedicados, preocupados e atenciosos. Agradeço, de forma muito carinhosa, a atuação de minha mãe no período de construção deste trabalho. Sua paciência infinita e sua crença absoluta na minha capacidade de realização, indubitavelmente, foram elementos propulsores desta dissertação. Às minhas irmãs Roberta e Fernanda pela companhia e lealdade. Uma atenção especial para Roberta que me estendeu a mão, me emprestou o ombro e me aconselhou num dos momentos mais difíceis da minha vida. Ao meu namorado Allan que sempre tentou entender minhas dificuldades e minhas ausências, procurando se aproximar de mim através da própria dissertação, por ele cuidadosamente lida, às vezes digitada. Agradeço-lhe, por me proporcionar a felicidade de poder ser mãe, gerar uma criança linda dentro de mim – Nosso filho Gabriel. Ao meu filho Gabriel que ainda nem chegou nesse mundo, mas que tanto me fortaleceu. À Deus que sempre esteve ao meu lado, segurando na minha mão e me mostrando que se naquele momento não tava dando certo eu não me preocupasse e continuasse seguindo em frente, pois assim, Ele me mostraria que tudo se resolveria num passe de perseverança. A todos os meus familiares principalmente a minha avó Vera e meu avô Géber que sempre me trataram como se eu fosse mais que uma filha. Sempre com palavras certas, gestos carinhosos e muito orgulho da neta! Ao Prof. e Dr. Davi Pereira de Santana por ter aceito a orientação da minha dissertação, por sempre ter sido uma pessoa maravilhosa, dedicada, que me ensinou muitas coisas entre elas a viver mais feliz e sempre lutar pelos meus ideais. Além de um grande mestre é um grande amigo. Agradeço também por todo apoio financeiro. À minha Co-orientadora Profa. e Dra. Nereide Stela Santos Magalhães por ter me aceitado de braços abertos, pelo seu profissionalismo exemplar e por ter me orientado com grande estima. À Profa. e Dra. Ana Amélia Lira que me auxiliou com plena dedicação, consideração, carinho e amizade. À Rafaela Ferraz, aluna de iniciação científica, pelo apoio técnico, dedicação e amizade durante todo o desenvolvimento do projeto.

Aos amigos Farmacêuticos Catarine, Jenayce e Alexandre pela disponibilidade sempre manifestada. À amiga Marianne Lira por ter me inspirado e pelo apoio irrestrito de sempre. À amiga Danielle Di Cavalcanti por sempre estar dispostas a me ajudar sem nunca se importar com o que quer que fosse. Às amigas Analice, Natália, Tatiana, Cris, Mariana, Cris Perez, Kika, Isabela, por todos os nossos almoços, encontros, farras, casamentos, chás de panela, pois eles sempre foram muito saudáveis para desopilar. Nove mulheres fofocando, depois de beber algumas caipiroscas, só saia um monte de besteiras. Ainda bem que vocês fazem parte da minha vida! Nesse grupo de mulheres faltou um homem que infelizmente não está mais aqui com a gente, mas tenho certeza que ele estaria mega feliz em compartilhar esses momentos com a gente. Mesmo ausente continua presente sendo um grande Exemplo de vida – Tiago Haig Toscano! À amiga Adriana Lima pelas palavras de conforto nas horas certas. À amiga Palloma Braga por toda sua irreverência. À toda a Família Tolêdo que não mora aqui em Recife, mas que sempre torceu com todo afeto e energias positivas por mim. À toda a família Velloso principalmente a Ana Maria e Cláudia Velloso que são dois grandes exemplos de mulheres profissionais e dedicadas, as quais sempre me serviram como fonte de inspiração. À família Villela por ser grandiosa em todos os sentidos, por possuir pessoas tão maravilhosas como Marquinhos e Cris. À professora Suzene Izídio, o professor Munfred e a Roberta por terem me ajudado durante o desenvolvimento do projeto. À todo o grupo SLC Catarine, André, Débora, Rafaela, Ellis, Milena, Islene, Valdenice, Isabela pela compreensão, convivência e companheirismo. Ao pessoal do NUDFAC Talita, Júlio, Juliana e Karine. À André Luis por ter me auxiliado e me aconselhado durante as cinéticas de liberação in vitro. À Karina por ter me dado uma direção de como realizar alguns experimentos. Ao pessoal da bioequivalência Danilo Bedor, Eduardo Miranda e Denis pelo auxílio nas análises cromatográficas. Ao pessoal da Farmácia Escola Carlos Drummond de Andrade Karine, Homero, Olívia, Elisson e a todos os outrosfuncionários.

Aos funcionários do LIKA em geral e principalmente a Rafael, por liofilizar minhas amostras, a Sérgio por sempre estar pronto para ajudar e a Vera por sempre ter sido um doce de pessoa. À todos aqueles que colaboraram direta ou indiretamente para realização deste trabalho meus sinceros agradecimentos.

SUMÁRIO

LISTAS DE FIGURAS I

LISTAS DE TABELAS III

RESUMO IV

ABSTRACT V

1. Introdução 1

2. Revisão da Literatura 4

2.1 Sistemas de liberação controlada de fármacos 5

2.1.2 Microencapsulação 6

2.1.3 Polímeros para revestimento de micropartículas 8

2.1.3.1 Quitosana 9

2.1.3.2 Alginato 10

2.1.4 Principais métodos para obtenção das micropartículas de

alginato/quitosana

12

2.1.5 Mecanismo de liberação do ativo microencapsulado 13

2.2 Cinética de liberação in-vitro 13

2.3 Via tópica 15

2.3.1 Anatomia e fisiologia da pele 15

2.3.2 A função barreira da pele 18

2.3.3 Penetração de fármacos através da pele 19

2.3.4 Capacidade de Hidratação da Pele 22

2.3.5 Avaliação da hidratação cutânea 23

2.4. Ácido retinóico 24

2.4.1. Aspectos toxicológicos do ácido retinóico tópico 27

2.4.1.1. A dermatite retinóide 27

2.4.1.2. A absorção sistêmica 28

2.4.2. Estabilidade do ácido retinóico 28

2.4.3 Efeitos do ácido retinóico no envelhecimento cutâneo 30

3. Objetivos 32

3.1 Geral 33

3.2 Específicos 33

4. Artigo I 34

Resumo 35

Abstract 36

1. Introdução 37

2. Materiais e método 39

2.1. Materiais 39

2.2. Obtenção de microcápsulas de alginato e microcápsulas de

alginato/quitosana contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu

39

2.3. Caracterização físico-química das microcápsulas de alginato e


40

2.3.1. Rendimento das microcápsulas 40

2.3.2. Tamanho e morfologia das microcápsulas 40

2.3.3. Taxa de encapsulação das microcápsulas 40

2.3.4. Estudo de interação entre o ácido retinóico e constituintes das

microcápsulas utilizando espectroscopia em IV com transformada de

Fourier (FTIR)

41

2.4. Estudo de liberação in vitro das microcápsulas de alginato/quitosana

contendo ácido retinóico disperso em óleo de babaçu

41

2.5. Condições cromatográficas para a quantificação do AR por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

42

3. Resultados e discussão 43

3.1. Obtenção de microcápsulas de alginato e microcápsulas de


43

3.2. Caracterização físico-química de microcápsulas de


46

3.2.1. Determinação do rendimento, da taxa de encapsulação,

potencial zeta e tamanho de partículas das microcápsulas de

alginato/quitosana contendo do ácido retinóico e óleo de babaçu

46

3.2.2. Morfologia das microcápsulas 48

3.3.3. Estudo de interação entre o ácido retinóico e constituintes das

microcápsulas de alginato/quitosana contendo do ácido retinóico e

óleo de babaçu utilizando espectroscopia em IV com transformada de

Fourier (FTIR)

50

3.3.4 Estudo do perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir

de microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu 53

Conclusão 55

Referências bibliográficas 56

5. Referências bibliográficas 59

6. Anexos 70

Artigo II 71

Submissão do artigo II à RBCF 72

Resumo 74

Abstract 75

1. Introdução 76

2. Materiais e métodos 78

2.1. Reagentes e materiais 78

2.2. Condições cromatográficas 78

2.3. Validação do método analítico para o ácido retinóico 78

2.3.1. Curva analítica do ácido retinóico 79

2.3.1.1. Linearidade 79

2.3.2. Seletividade 79

2.3.3. Precisão e exatidão 79

2.4. Obtenção das microcápsulas de alginato/quitosana

contendo ácido retinóico e óleo de babaçu

80

2.5. Estudo de liberação in vitro das microcápsulas 80

3. Resultados e discussão 81

3.1. Validação do método analítico para o ácido retinóico 81

3.1.1. Linearidade 81

3.1.2. Precisão e exatidão 85

3.1.3. Seletividade 86

3.2 Aplicação do método validado na avaliação da cinética de

liberação in vitro do ácido retinóico a partir de microcápsulas de

alginato/quitosana incorporadas em gel natrosol®

87

4. Conclusão 88

5. Referências bibliográficas 89

I

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 1: Microfotografias de micropartículas: microcápsula (a) e microesfera

(b)

8

Figura 2. Fórmula estrutural da quitosana 10

Figura 3. Fórmula estrutural do alginato 11

Figura 4. Figura ilustrativa de uma célula de difusão 14

Figura 5. Fotorafia de uma célula de difusão in vitro (tipo Franz) 14

Figura 6. Representação esquemática da estrutura da pele 16

Figura 7. Representação esquemática da bicamada lipídica do corneócito 17

Figura 8. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de

substâncias (vias intercelular e transcelular) através do estrato córneo

20

Figura 9. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de

substâncias (via transepidémica e via apêndice) através da pele humana, 1 =

glândula sebácea, 2 = via transepidérmica e 3 = folículo piloso

21

Figura 10. Estrutura química da tretinoína 25

Figura 11. Estrutura química da isotretinoína 25

ARTIGO I

Figura 1. Fotografias de microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido

retinóico a 0,5 % e óleo de babaçu a 30 % (F11)

49

Figura 2. Fotomicrografias de microcápsulas de alginato/quitosana contendo AR

a 0,5 % e cavidade preenchida com óleo de babaçu a 30 % (F11). Microscopia

eletrônica de varredura

49

Figura 3. Espectro comparativo de FTIR do AR (linha contínua), do óleo de

babaçu (linha tracejada) e da mistura física AR e óleo de babaçu 1:1 (p/p). (linha

pontilhada). A = estrutura do AR

51

Figura 4. Espectros FTIR das microcápsulas de alginato/quitosana com AR

(0,5%) (linha contínua) e sem AR (brancas) (linha tracejada) em comparação

com o AR puro (linha pontilhada). A = alginato, B = quitosana

52

II

Figura 5. Perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das

microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu. As formulações

utilizadas foram as F11 [AR (0,5%) e Q (0,1%)] e F8 [AR (0,5%) e Q (0,05%)]

54

ARTIGO II

Figura 1. Representação do cromatograma do ácido retinóico obtido por CLAE-

UV a 350 nm

83

Figura 2. Cromatogramas da análise de microcápsulas de alginato/quitosana

incorporadas em gel natrosol® sem fármaco (A) e com ácido retinóico disperso

em óleo de babaçu (B)

86

Figura 3. Perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das microcápsulas

de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu

87

III

LISTA DE TABELAS

REVISÃO DA LITERATURA

Tabela1. Trabalhos recentes sobre microencapsulação de diferentes substâncias

utilizando diferentes métodos

9

ARTIGO I

Tabela 1. Avaliação da influência da porcentagem de óleo babaçu no

rendimento do processo de obtenção das microcápsulas de alginato

44

Tabela 2. Avaliação da influência da presença do AR (0,1%) no rendimento das

microcápsulas de alginato com concentrações variadas de óleo de babaçu

44

Tabela 3. Influência da concentração de AR no rendimento e na taxa de

encapsulação das microcápsulas de alginato contendo óleo de babaçu (30 %)

45

Tabela 4: Apresentação dos resultados dos tamanhos das microcápsulas de

alginato

45

Tabela 5. Valores do rendimento do processo e da taxa de encapsulação das

microcápsulas de alginato/quitosana contendo 2% de alginato e 30% de óleo

47

Tabela 6. Apresentação dos resultados dos tamanhos das microcápsulas 48

ARTIGO II

Tabela I - Dados das curvas analíticas autênticas 82

Tabela II - Valores obtidos na avaliação da precisão e exatidão intra-ensaio 85

Tabela III - Valores obtidos na avaliação da precisão e exatidão inter-ensaio 85

IV

RESUMO O ácido retinóico (AR) tem sido largamente utilizado em formulações dermatológicas para o tratamento de acne, distúrbios de queratinização como psoríase e também em formulações cosméticas com a finalidade de reduzir os efeitos do fotoenvelhecimento, celulite e estrias. Entretanto, apesar de seus efeitos benéficos provoca irritação local manifestada na forma de eritema, queimação, coceira, secura e descamação da pele, além de ser instável na presença de ar e luz e pobremente solúvel na água. Para resolver estes problemas, microcápsulas (MC) de alginato/quitosana contendo AR e óleo de babacu, foram preparadas com o propósito de proteger e promover uma liberação sustentada do AR e o óleo de babaçu foi acrescentado para evitar o ressecamento causado pelo AR. Devido ao alto tempo de retenção encontrado na literatura e a sensibilidade do AR à luz e ao calor na primeira parte deste trabalho um método rápido e sensível para o doseamento do AR em microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu dispersas em gel natrosol® foi desenvolvido e validado por cromatografia líquida de alta eficiência associada à espectroscopia UV. Este método foi utilizado para quantificar o AR de forma específica em cinéticas de liberação in vitro. As análises foram realizadas em modo isocrático, comprimento de onda de 350 nm e foi utilizado coluna C18 de fase reversa 150 x 4,6 mm (5µm). A fase móvel foi constituída de metanol e ácido acético 1% (85:15 v/v) e o fluxo foi de 1,8 mL/minuto. A faixa de linearidade do estudo foi de 0,5 a 60 µg/mL (r2 = 0,999). O método validado mostrou-se sensível, específico, exato, preciso, de baixo custo e o tempo de retenção do AR foi de 5,8 ± 0,4 minutos sendo, desta forma, mais rápido do que os relatados na literatura. A segunda parte do trabalho foi desenvolver e caracterizar as MC, estudar a interação fármaco-polímero-óleo e o perfil de liberação in vitro. As MC foram obtidas utilizando a técnica de coacervação complexa, apresentaram forma esférica, diâmetro em torno de 400 µm e taxa de encapsulação afetada pela concentração de AR, quitosana e solvente utilizado. A taxa de encapsulação do AR (0,1 e 0,5%) variou de 8% a 44% para concentrações de quitosana de 0,05 e 0,1%, respectivamente, utilizando etanol como solvente. No entanto, utilizando clorofórmio como solvente, a taxa de encapsulação foi de 78% No estudo de interação fármaco-polímero-óleo, na mistura física óleo-AR, alterações e deslocamentos das bandas nas regiões entre 1310 e 1046 cm-1 foram observadas. A banda 758 cm-1 (estiramento =C-H) presente na mistura física resultou da fusão de várias bandas tanto do AR quanto do óleo de babaçu, indicando, portanto, uma interação e/ou solubilização do fármaco no óleo de babaçu. Os resultados da cinética de liberação in vitro mostraram que aproximadamente 67% do fármaco foi liberado a partir das microcápsulas preparadas com quitosana a 0,05% e em torno de 45% daquelas preparadas com quitosana a 0,1% ao final de 48 h do ensaio. O desenvolvimento das MC mostrou-se simples, rápido e economicamente viável além de utilizar quitosana e alginato que são polímeros biocompatíveis e o óleo de babaçu um componente de interesse econômico do nordeste do país podendo ser, desta forma, uma alternativa para driblar a baixa solubilidade, a foto-instabilidade e a toxicidade do AR. Sendo consideradas boas candidatas para sistemas de liberação sustentada do AR na pele melhorando e deixando mais segura a terapia tópica com o AR. Palavras chave: ácido retinóico, óleo de babaçu, alginato, quitosana, microcápsulas

V

ABSTRACT

Retinoic acid (RA) has been widely used for dermatological applications, such as acne, psoriasis and keratinization disorders. Of particular, retinol has been used for cosmetic formulations to reduce wrinkles and avoid cellulite and striae. However despite many beneficial effects, the topical application of retinoids is limited by poor water solubility, photolability and severe local irritation manifested as mild erythema, peeling, itching, dryness and burning. To solve this problems Alginate coating chitosan microparticles containing RA and babassu oil were prepared with the purpose of protect and provide a sustained release of the RA. The babassu oil was used to reduce transepidermal water loss and reducing some side effects of RA such as peeling and drying. According to high retention time to RA found in the literature and its rapidly degradation under light and high temperate exposure the first part of this study was to develop and validate a rapid and responsive method to quantify the RA in microcapsules of alginate coating by chitosan containing babassu oil dispersed in natrosol® hydrogel using high performance liquid chromatography (HPLC). Furthermore this method was used to quantify in vitro release kinetics of RA from microcapsules. The analyses have been carried through an isocratic HPLC-UV method at 350 nm using a C18 150 x 4,6 mm (5µm) reversed-phase column and a mobile phase constituted of methanol and 1% acetic acid (85:15) at a flow rate of 1.8 mL/min. The linearity range was 0.5-60 µg/mL (r2 = 0.999). The validated HPLC-UV method was responsive, specific, accurate, precise, economic and the RA retention time was 5.8 ± 0.4 minutes, being therefore, faster than that one previously reported. The second part of this study was to develop and characterize the microcapsules, study the drug-polymer-oil interaction and the in vitro drug release profile. Microcapsules were obtained by complex coacervation presented spherical shape, mean diameter of about 400 µm and variable drug loading capacity as a function of polymers, drug concentrations and solvent used. The encapsulation efficience varied from to chitosan concentration from 0,05 and 0,1%, respective using ethanol as a solvent. However using chloroform as a solvent the encapsulation efficiency was 78%. The in vitro drug release profile showed that approximately 67% of RA was released from microcapsules with 0,05% chitosan concentration and 45% of that one prepared with 0,1% of chitosan in a period of 48 hours. The development of microcapsules has showed to be simple, rapid and viable economically. In spite of use chitosan and alginate biocompatible polymers and babassu oil an economical component of northeast of Brazil. The system could be considered a good candidate to drop off the low solubility, sensitivity to light exposure e toxicity of RA and to deliver RA in the skin, improving and making safer the topical therapy with retinoids. Keywords: retinoic acid, babassu oil, alginate, chitosan, microcapsules

1. Introdução

_____________________________________________________________Introdução

2

1. INTRODUÇÃO

A área de sistemas de liberação controlada (SLC) vem crescendo rapidamente e

ganhando a atenção de cientistas, farmacêuticos e das indústrias do mundo inteiro. O

desenvolvimento de SLC efetivos, que podem transportar a droga de forma precisa e

eficaz para o local de ação desejado, tem sido a grande preocupação dos pesquisadores.

Nos últimos anos, as micropartículas despertaram crescente interesse como

sistemas de liberação controlada (ALENCASTRE et al., 2006). Muitos autores

demonstraram que as micropartículas poderiam ser utilizadas para carrear compostos

ativos na pele em maiores quantidades que as formulações tópicas convencionais,

maximizando o tempo de estadia na pele, minimizando a absorção transdérmica e

provocando uma melhor ação no local desejado como, por exemplo: retinol

(ROSSELER et al., 1994) e vitamina E (ALENCASTRE et al., 2006).

O ácido retinóico atua na proliferação e diferenciação celulares, e ainda na

secreção sebácea. Ele tem tido destaque na terapia tópica de diferentes alterações

cutâneas como acne, foto-envelhecimento, psoríase e outras desordens da pele

(BRISAERT et al., 2001; DINARVAND et al., 2003). Entretanto, apesar dos vários

benefícios, a aplicação tópica do ácido retinóico frequentemente causa irritação da pele

manifestada na forma de eritema, descamação e ressecamento do estrato córneo

(BRISAERT et al., 2001). O ácido retinóico é ainda fotossensível e pouco solúvel em

água (LEHMAN et al., 1988).

Os óleos vegetais são opções interessantes para o desenvolvimento de

formulações farmacêuticas e cosméticas, pois além de fontes de vitaminas e outros

ativos, podem também oferecer benefícios devido a sua composição de ácidos graxos

(OLIVEIRA, 2003). Seus benefícios incluem: umectação, lubrificação, oclusão e

melhoria de retenção de água na pele (KAMERSHWARL, MISTRY, 2001;

RODRIGUES, SALKA, 2001).

A Orbignya phalerata Mart., da família Arecaceae, conhecida como babaçu é

uma palmeira nativa que se concentra nas regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste do

Brasil merecendo maior destaque para a região nordeste a qual detém, atualmente, a

maior produção de amêndoas e apresenta a maior área ocupada de cocais. Outra espécie

de babaçu, Attalea, ocorre em regiões específicas da Bahia, Minas Gerais e Espírito

Santo (FILHO, 1983).

_____________________________________________________________Introdução

3

A amêndoa é a parte mais interessante e valiosa da palmeira do babaçu, com sua

elevada proporção de óleo que atinge 66-67% quando madura. Esse óleo apresenta-se

claro, ligeiramente ambreado, com odor agradável e sabor adocicado (ARIÉ, 1931).

O óleo de babaçu é muito utilizado na fabricação de sabão e detergente. Ele

possui uma combinação de ácidos graxos que são de grande importância em

cosmetologia, como por exemplo, os ácidos mirístico e oléico, pois estes fornecem

formação de um filme que impede a evaporação de água da pele (OLIVEIRA et al.,

1995).

Um melhor aproveitamento do óleo de babaçu é de grande interesse atualmente,

pois, apesar da importância do babaçu como oleaginosa, observa-se o desmatamento

gradual, em boa parte dos babaçuais, para implantação de pastos objetivando a criação

de gado ou até mesmo sua substituição pela agricultura (CLAY et al., 2000). Tal fato

vem acarretando o desequilíbrio do ecossistema, assim como interferindo nas relações

sócio-econômica-cultural da população diretamente relacionada ao aproveitamento

desta palmeira.

Nesse contexto, o objetivo desse trabalho consiste em encapsular o ácido

retinóico em microcápsulas de alginato e alginato/quitosana com cavidade preenchida

com óleo de babaçu, visando o aumento de sua estabilidade, a diminuição do

ressecamento da pele causado pelo uso tópico do ácido retinóico e agregar valores

sócio-econômicos e sócio-ecológicos ao óleo de babaçu. As microcápsulas contendo

ácido retinóico serão incorporadas em gel natrosol® (hidroxietilcelulose) para uso

tópico.

2. Revisão da

Literatura

_____________________________________________________Revisão da literatura

5

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Sistemas de Liberação Controlada (SLC) de fármacos

O desenvolvimento de SLC tem sido alvo de pesquisas há pelo menos quatro

décadas (ARAÚJO et al., 2003). Estes sistemas de liberação representam uma das

fronteiras da ciência, a qual envolve diferentes aspectos multidisciplinares e pode

contribuir muito para o avanço da saúde humana (KUMAR, 2000).

O primeiro produto com material encapsulado só surgiu em 1954. A empresa

norte-americana “Nacional Cash Register” foi a pioneira ao comercializar um papel de

cópia sem carbono (“no carbon required”). Este papel recebeu uma fina camada de

microcápsulas contendo uma tinta incolor. Tal camada era recoberta com um reagente

também incolor. A pressão da ponta do lápis sobre a superfície do papel rompia as

microcápsulas, liberando a tinta incolor que, ao entrar em contato com o reagente,

tornava-se colorida e propiciava a obtenção de uma cópia idêntica ao que estava sendo

escrito no primeiro papel (SOUZA, 2001).

As pesquisas em torno das microtecnologia foram embasadas pelo trabalho de

Würster, por volta de 1950, com o processo patenteado de encapsulamento de finas

partículas sólidas em leito fluidizado (WURSTER, 1964).

Nas últimas décadas, a indústria farmoquímica se destacou no uso e no

aproveitamento de matérias primas de baixo custo e fácil acesso para o desenvolvimento

de novos materiais poliméricos, o que permitiu o uso de várias técnicas para

encapsulamento de compostos em sistemas de micropartículas, como microesferas e

microcápsulas, no intuito de proteger, estabilizar, mascarar os sabores indesejáveis ou

modificar as propriedades de liberação (JOSUÉ et al., 2000).

Os Sistemas de Liberação Controlada oferecem inúmeras vantagens quando

comparados aos sistemas de dosagem convencional como: maior eficácia terapêutica,

liberação progressiva e controlada do fármaco; diminuição significativa da toxicidade,

maior tempo de permanência na circulação; natureza e composição variadas dos

veículos, administração segura e conveniente (menor número de doses); maior aceitação

da terapia pelo paciente, direcionamento a alvos específicos e possibilidade de


6

incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas (BRANNON-PEPPAS,

1997; DURAN, 2003).

Um SLC ideal deve ser inerte, biocompatível, mecanicamente resistente,

confortável para o paciente, capaz de encapsular uma grande quantidade de fármaco,

estar livre da possibilidade de liberações acidentais, ser de simples administração,

remoção, fabricação e esterilização (BRANNON-PEPPAS, 1997).

Ampla variedade de sistemas, visando controlar a velocidade e o local de

liberação dos fármacos, tem sido objeto de investigação na área da indústria

farmacêutica. Entre estes sistemas estão incluídos os lipossomas, as bombas osmóticas,

os revestimentos entéricos, os sistemas transdérmicos, os pró-fármacos, as

micropartículas, entre outros (LOPES et al., 2005).

As micropartículas são sistemas de liberação que têm se destacado por

conferirem proteção de materiais sensíveis ao meio ambiente, conversão de líquidos a

pós, liberação lenta ou sustentada de princípios ativos e também uma liberação sítio-

específico (BENITA, 2006).

Para prover a pele com um ativo por períodos prolongados e reduzir sua

absorção sistêmica um SLC é necessário. Deste modo, vários autores usaram esses

sistemas para carrear diferentes ativos como retinol (ROSSELER et al., 1994) e

vitamina E (ALENCASTRE et al., 2006).

2.1.2. Microencapsulação

A microencapsulação é um procedimento para revestimento e proteção de

substâncias, estudada desde algumas décadas com as primeiras aplicações na indústria

de fotocópias (FANGER, 1974). Nos últimos trinta anos os estudos dessa técnica

permitiram a ampliação do seu uso para a indústria de alimentos, farmacêutica, aromas

e sabores, tintas, química, agrícola, dentre outras (FANGER, 1974; POTHAKAMURY,

BARBOSA-CÁNOVAS, 1995; RÉ, 1998; WIELAND-BERGHAUSEN et al., 2002).

O conceito primário e também o modelo mais bem sucedido de

microencapsulação é observado nas células vivas, nas quais uma membrana natural

protege os componentes celulares e exerce função importante no metabolismo,

controlando seletivamente a entrada e saída de substâncias das células (FANGER,


7

1974). Foi a partir da observação e mimetização deste modelo vivo que os cientistas

foram capazes de desenvolver a técnica de microencapsulação altamente utilizada

atualmente.

Além da função de proteção, outras vantagens podem ser associadas à

encapsulação de substâncias (SHAHIDI, HAN, 1993; Ré, 1998):

♦ Conversão de substâncias líquidas ou gasosas em pós, permitindo sua melhor

utilização em sistemas desidratados;

♦ Mascarar propriedades indesejáveis do material encapsulado como sabor, odor,

pH, propriedades catalíticas, dentre outras;

♦ Permitir mecanismos de liberação controlada das substâncias encapsuladas para

fins específicos nos produtos onde está veiculada.

Essas vantagens permitem que os produtos microencapsulados apresentem

melhor potencial de uso, tanto pela minimização na perda de suas características

desejáveis quanto pela possibilidade de uma liberação controlada.

A possibilidade de controle na taxa de liberação do material encapsulado das

cápsulas é uma das mais exploradas funções dessa tecnologia e está diretamente

relacionada com as características do revestimento formado como: estrutura química,

espessura, tamanho, porosidade e solubilidade (FANGER, 1974). Por sua vez, essas

características determinam a permeabilidade e a difusividade do material encapsulado

pelo revestimento. As características funcionais das micropartículas produzidas

dependem, além do material de revestimento escolhido, das características do material a

ser encapsulado, do método empregado na produção das micropartículas e do meio onde

serão utilizadas.

O controle da taxa de liberação do fármaco é muito desejado no

desenvolvimento de microcápsulas e algumas variáveis que permitem esse controle são:

o coeficiente de difusão, a espessura do revestimento e a porosidade da cápsula, a

variação na concentração de saturação do material encapsulado e sua distribuição na

partícula (HEGER, 2001).

O termo micropartículas, aplicado à liberação controlada de fármacos, é amplo e

refere-se a dois tipos de estruturas diferentes, microesferas e microcápsulas (Figura 1).

Essas partículas têm tamanhos entre 1-1000 µm (MOSHFEGHI, PEYMAN, 2005).


8

Figura 1: Microfotografias de micropartículas: microcápsula (a) (Adaptado de RONG

et al., 2004) e microesfera (b) (Adaptado de CHOI et al., 2000).

2.1.3. Polímeros para revestimento de micropartículas

O material de revestimento é usado para cobrir, dar forma à microcápsula, reter

o material encapsulado e permitir a sua liberação de forma controlada. A escolha do

revestimento está relacionada com as propriedades físicas e químicas do material a ser

encapsulado, o processo empregado para produção das micropartículas e a aplicação

final destas (JACKSON, LEE, 1991; NORI, 1996). Fundamentalmente, o material de

revestimento não deve reagir com o material encapsulado e nem ser solúvel neste

(FANGER, 1974; JACKSON, LEE, 1991).

Segundo Ré (1998), o material de revestimento deve apresentar as seguintes

características tecnológicas:

♦ Boa propriedade emulsificante e de formação de filme;

♦ Baixa viscosidade, mesmo em soluções com alta concentração de sólidos;

♦ Baixa higroscopicidade e boas propriedades de secagem;

♦ Estabilidade e boa proteção ao material encapsulado.

Polímeros diversos como gomas, carboidratos, celuloses, lipídios, proteínas e

alguns materiais inorgânicos (silicatos, argilas, etc.) apresentam as características

(a)

(b)


9

supracitadas e são muito utilizados na microencapsulação de substâncias (JACKSON,

LEE, 1991).

A Tabela 1 mostra diversos trabalhos publicados nos últimos anos sobre o uso de

vários polímeros em microencapsulação de substâncias por diversas técnicas.

Tabela1. Trabalhos recentes sobre microencapsulação de diferentes substâncias

utilizando diferentes métodos.

2.1.3.1. Quitosana

A quitosana (Figura 2) é um carboidrato insolúvel em água, mas que pode ser

solubilizado em ácido acético diluído através de formação do seu acetato (THANOO et

al., 1992). Quimicamente é o β(1→4)-2-amino-2-desoxi-D-glicose, obtido pela

hidrólise dos grupos aminoacetil da quitina, um polissacarídeo abundante, componente

Material de

revestimento

Material

encapsulado

Método de

encapsulação

Autores

Alginato/quitosana Dextrana Geleificação

Ionotrópica

SEZER; AKBUGA,

1999

Carboximetilcelulose/

quitosana

Vitamina E Coacervação

complexa

ALENCASTRE et

al., 2006

Gelatina

Ácido retinóico Coacervação DINARVAND et al.,

2003

PLGA Ácido retinóico Formação de

emulsão/evaporação

de solvente

CIRPRANLI et al.,

2005

PLLA/PEG-PLLA Ácido retinóico Formação de


de solvente

CHOI et al., 2001

PLGA Ácido retinóico Formação de


de solvente

JEONG et al., 2003.


10

estrutural das carapaças protetoras de crustáceos (JAMEELA; JAYAKRISHNAN,

1995; KAS, 1997).

Figura 2. Fórmula estrutural da quitosana.

Entre suas vantagens podem ser destacadas a biodegradabilidade, a atoxicidade e

a biocompatibilidade (WANG et al., 1996). Além dessas propriedades, a excelente

capacidade em formar filme e a disponibilidade em grande quantidade torna-o um

material muito interessante para utilização em sistemas de liberação controlada.

Devido à presença de grupos aminos livres na sua estrutura, a quitosana

apresenta uma carga positiva que pode reagir com muitas superfícies e polímeros

carregados negativamente (FUKUDA et al., 1980). Essa característica estrutural

também é responsável por suas propriedades mucoadesivas, já que sua carga positiva

pode interagir com as superfícies de mucosas carregadas negativamente (SHIMODA et

al., 2001; KOCKISCH et al., 2003).

Comercialmente, a quitosana está disponível na forma de pós e solução com

massa molecular variando entre 3.800 e 2.000.000 Da e grau de deacetilação entre 66 e

95% (KAS, 1997). O tamanho de partícula, a densidade, a viscosidade, o grau de

deacetilação e a massa molecular constituem importantes características da quitosana

que podem influenciar nas propriedades das formulações farmacêuticas.

2.1.3.2. Alginato

O alginato de sódio é um polissacarídeo linear (Figura 3) obtido a partir de algas

marrom ou bactérias e é composto por resíduos dos ácidos β-D-manurônico e α-L-


11

gulurônico na forma de sal de sódio, unidos por ligações glicosídicas e distribuídos em

diferentes proporções ao longo da cadeia.

Figura 3. Fórmula estrutural do alginato.

Esse polímero tem sido utilizado há muitos anos na indústria de alimentos e de

bebidas como espessante e estabilizador coloidal (JOHNSON et al., 1998). Além disso,

este material apresenta crescentes aplicações na indústria de biotecnologia e possui

propriedades únicas o que viabilizam como matriz em sistemas de liberação. Essas

propriedades incluem: 1 – formação de ambiente matricial relativamente inerte, 2 –

processo de encapsulação a temperatura ambiente livre de solventes orgânicos, 3 – alta

porosidade do gel que permite alta velocidade de liberação de macromoléculas, 4 –

capacidade de controlar a porosidade com procedimentos de revestimento simples

(SEZER; AKBUGA, 1999).

O alginato possui propriedade mucoadesiva que poderia proporcionar uma

vantagem na liberação de fármacos em superfícies mucosas. Vários estudos têm

mostrado que polímeros com carga constituem bons agentes mucoadesivos

(CHICKERING, MATHIOWITZ, 1995). Tem sido relatado que polímeros

polianiônicos são bioadesivos mais efetivos que polímeros policatiônicos ou não-

iônicos. Alginato com o seu grupo carboxílico é classificado como um polímero

mucoadesivo aniônico e, em particular, as micropartículas de alginato têm apresentado

essas propriedades (CRAIG, TAMBURIC, 1997).

Em estudos de mucoadesão conduzidos por CHICKERING et al., a força

adesiva entre vários polímeros diferentes e o epitélio intestinal foi avaliada e mostraram

que o alginato tem maior força adesiva quando comparado com outros polímeros tais

como poliestireno, quitosana, carboximetilcelulose e ácido poli-(láctico)

(CHICKERING et al., 1992, CHICKERING, MATHIOWITZ, 1995). Posteriormente,


12

WITTAYA-AREEKUL et al. (2006) testaram a mucoadesividade de micropartículas de

alginato revestida com quitosana. As micropartículas sem o revestimento apresentaram

mucoadesão de 43% (número de partículas que permaneceram ligadas à superfície

mucosa) enquanto as micropartículas revestidas com 0,5, 1,0 e 1,5% de quitosana

promoveram o aumento da mucoadesão para 52, 82 e 88%, respectivamente.

2.1.4. Principais métodos para obtenção das micropartículas de alginato/quitosana

s micropartículas de alginato/quitosana podem ser preparadas gotejando ou

nebulizando uma solução de alginato contendo o fármaco sobre uma solução de

quitosana. Em geral, partículas maiores que 1 mm podem ser preparadas pelo uso de

uma seringa com agulha ou pipeta (WEE, GOMBOTZ, 1994; AUSTIN et al., 1996;

ELÇIN, 1995). O tamanho das partículas formadas é dependente do diâmetro da agulha

e da viscosidade da solução de alginato. Agulhas de diâmetro maiores e soluções mais

viscosas produzem partículas com diâmetro maior. A viscosidade pode influenciar

também a morfologia das partículas que se tornam mais esféricas com o aumento da

viscosidade (BADWAN et al., 1985). As partículas formadas são deixadas em contato

com a solução para reticulamento por um curto período de tempo, geralmente alguns

minutos, antes de serem lavadas com água destilada. O reticulamento ou crosslinking

ocorre através da formação de uma membrana coacervada complexa quando uma

solução de alginato é gotejada diretamente em uma solução de cloreto de cálcio e

quitosana (WITTAYA-AREEKUL et al., 2006).

Há três métodos bem conhecidos para preparar micropartículas de alginato

menores que 0,2 mm de diâmetro: atomização, emulsificação e coacervação. O mais

comumente usado é o método de atomização ou spray sobre uma solução de

crosslinking usando um sistema de extrusão e com pequeno orifício. Inúmeras variações

deste método são propostas por diferentes grupos de pesquisa (KWOK et al., 1991;

WEE et al., 1995; BOWERSOCK et al., 1996). O tamanho dessas micropartículas pode

ser controlado pela pressão do sistema de extrusão, pelo fluxo que bombeia a solução de

alginato de sódio que vai ser nebulizado e pela distância entre o orifício e a superfície da

solução de crosslinking. As microgotas da solução de alginato contendo o fármaco

originarão as micropartículas após crosslinking com agente apropriado.

A


13

2.1.5. Mecanismo de liberação do ativo microencapsulado

Os mecanismos de liberação de um ativo a partir das matrizes poliméricas são

governados predominantemente por três fatores: tipo e morfologia do polímero e

presença de excipientes no sistema. Várias revisões foram relatadas na literatura sobre

os mecanismos e os aspectos matemáticos que modelam a liberação de fármacos a partir

de matrizes poliméricas. (BRANNON-PEPPAS, 1997). De acordo com estes estudos a

liberação pode ocorrer por difusão e/ou erosão do polímero ou intumescimento.

A substância encapsulada pode ser liberada por ação mecânica, a partir do

rompimento do revestimento exterior através de pressão, quando suas membranas forem

susceptíveis a isso. Outra possibilidade é provocar o rompimento submetendo as

microcápsulas a variações físico-químicas do meio em que se encontram, como, por

exemplo, alterações de temperatura ou pH (SOUZA, 2001). Em uma loção cosmética

para o corpo, por exemplo, as microcápsulas que contêm a fragrância são rompidas,

liberando-a, pela pressão dos dedos durante a aplicação na pele (ruptura mecânica). Já

em um medicamento oral, para que a mucosa do estômago seja protegida do contato

com o princípio ativo e este seja liberado apenas no local exato de sua absorção (no

intestino), pode-se usar um agente encapsulante que só se dissolva em meio alcalino

(como o intestinal) (PORTE, COUARRAZE, 1994).

2.2. Cinética de liberação in vitro

Na cinética de liberação in vitro as condições fisiológicas de temperatura, meio

de dissolução e agitação são simuladas a fim de se determinar a capacidade da

formulação liberar o ativo em função do tempo (BERKLAND et al., 2001).

Dentre os modelos mais empregados para este fim, destacamos as células de

difusão do tipo FRANZ (FRANZ, 1975). Elas são compostas basicamente de:

compartimento doador, onde será depositado o fármaco em estudo e compartimento

receptor, local que contém uma solução na qual a droga será difundida. Entre estes dois

compartimentos se interpõe a membrana (sintética, tecido animal ou humano) que tem o

papel de barreira à permeação ou difusão através da pele (Figuras 4 e 5).


14

Figura 4. Figura ilustrativa de uma célula de difusão.

Figura 5. Fotografia de uma célula de difusão in vitro (tipo Franz)

Estas células simulam o fenômeno de passagem percutânea da droga in vivo

(SESTER, 1997). No entanto, os parâmetros que envolvem esta metodologia como a

natureza da membrana, temperatura, dose e agitação devem ser bem monitorados para

uma boa correlação in vitro/in vivo. Para a manutenção de temperaturas próximas as da

pele as células são dotadas de compartimento receptor de duas paredes com um banho

termostatizado, possibilitando temperaturas controladas, mimetizando assim, as

condições fisiológicas da pele. O fármaco que conseguir ultrapassar a barreira é

monitorado através da quantificação das amostras coletadas do fluido presente no

compartimento receptor.

Os principais parâmetros a serem determinados são: a escolha da membrana que

deve ser feita em função das propriedades físico-químicas do princípio ativo; a fase

receptora que deve ter composição tal que permita a solubilização do princípio ativo e


15

volume suficiente para respeitar as condições “Sink”, e as condições operatórias do

ambiente circundante (SEILLER, MARTINI, 1996).

As células podem ser de dois tipos:

♦ Células de difusão estática: sem renovação do meio de difusão;

♦ Células de difusão dinâmica: com renovação do meio de difusão.

As células de difusão dinâmica são mais empregadas, pois evitam uma saturação

em nível da camada de difusão em contato com a membrana, sob simples agitação ou

circulação do meio (BARRY, 1983).

2.3. Via tópica

2.3.1. Anatomia e fisiologia da pele

A pele constitui uma via potencial de administração de fármacos devido ao fácil

acesso e à sua grande superfície. Representa um dos órgãos mais extensos do corpo,

cobrindo uma superfície de aproximadamente 1,73 m2 sendo banhada por 1/3 do

sangue, correspondendo a 5% da massa corporal (BARRY,1983; CHIEN, 1992).

A pele funciona como uma barreira de proteção. Separa órgãos vitais do meio

exterior, protege o organismo de substâncias estranhas de natureza química, física e

microbiológica e impede a saída de compostos fisiológicos como a água. Ela também

desempenha um importante papel na manutenção da temperatura corporal e na

regulação da pressão sangüínea (JASS, ELIAS, 1991).

É um órgão de revestimento complexo e heterogêneo, composto essencialmente

de três grandes camadas de tecidos: a epiderme, a derme e o tecido subcutâneo ou

hipoderme (Figura 6).


16

Figura 6. Representação esquemática da estrutura da pele (adaptado de SAMPAIO;

RIVITTI, 2001).

A epiderme é recoberta pela camada córnea e possui espessura entre 0,1 a 0,2

mm. Representa a principal barreira a penetração, não contém vasos sangüíneos e é

formada basicamente por tecido epitelial estratificado, queratinizado ou não. Possui uma

película de material emulsificado composto por complexo de sebo, suor e lâmina córnea

descamativa, além de uma capa gasosa chamada manto gasoso, constituída

principalmente por vapores de água provenientes da volatilização corporal (MOSER et

al., 2001).

A epiderme é dividida em duas camadas: o estrato córneo e a epiderme viável. O

estrato córneo constitui a camada mais superficial da pele e possui uma estrutura

estratificada, hidrófila-lipófila, formada por células sem vitalidade chamadas

corneócitos (WILLIAMS, BARRY, 1992). Essas células, achatadas de formato

hexagonal, são compostas por queratina e água envolvidas por um envelope protéico e

bicamadas lipídicas sobrepostas, que incorporam água em sua estrutura, como mostra a

Figura 7 (BUCK, 2004).


17

Figura 7. Representação esquemática da bicamada lipídica do corneócito (adaptado de

BUCK, 2004).

A epiderme viável é subdividida em quatro partes: estrato lúcido, estrato

granuloso, estrato espinoso e estrato germinativo ou basal. Nas regiões palmar e plantar,

entre as camadas granulosa e córnea, encontra-se mais uma, a lúcida. A epiderme viável

contém queratinócitos em vários estágios de diferenciação, melanócitos, células de

Langerhans (importante no reconhecimento de antígenos e resposta imune) e células

Merkel (envolvidas na percepção sensorial) (ASBILL, MICHNIAK, 2000).

Na camada basal originam-se as células epidérmicas, que vão sofrendo

modificações graduais na forma e na composição química, passando pelos estratos

espinhoso, córneo, granuloso, e pouco a pouco ganham a superfície até se tornarem

anucleadas no estrato córneo e se esfoliarem. Ocorre, assim, um deslocamento

permanente e repetido de células, que da camada basal atingem gradualmente a

superfície da epiderme, para se desprenderem já mortas. O ciclo de ceratinização, ou

corneificação, consiste na transformação de células epiteliais em células córneas, mortas

(BECHELLI, CURBAN, 1975).

É separada da derme pela junção dermo-epidérmica e suas quatro camadas, do

interior para a superfície, representam a transformação de um queratinócito basal ou

germinativo em um queratinócito córneo ou corneócito (ASBILL, MICHNIAK, 2000,

BUCK, 2004, WILLIAMS, BARRY, 1992).


18

A derme, segunda camada da pele, possui espessura entre 2 mm e 4 mm, sendo

constituída de uma matriz de proteínas fibrosas imersas num tecido coloidal amorfo.

Apresenta-se rica em capilares sangüíneos, canais linfáticos e terminações nervosas,

além de conter os segmentos inferiores das glândulas sebáceas e folículos pilosos. A

elasticidade da derme é atribuída às fibras protéicas presentes, incluindo colágeno (tipo

I e III) e elastina. A derme contém também fibroblastos, macrófagos, mastócitos e

leucócitos. Ela executa assim, papel de sustentação e de nutrição e divide-se em duas

partes: derme papilar ou tecido conjuntivo frouxo e derme reticular ou tecido conjuntivo

denso (WILLIAMS; BARRY, 1992; FOLDVARI, 2000, MOSER et al., 2001).

A hipoderme está localizada abaixo da derme é formada por tecido conjuntivo

frouxo e contém células adiposas que desempenham papel de proteção mecânica, de

conservação da temperatura corporal e de reserva de calorias (WILLIAMS, BARRY,

1992).

A pele contém ainda, dois tipos de órgãos anexos: as glândulas sudoríparas,

constituídas por um longo tubo que penetra na hipoderme, e o aparelho pilossebáceo,

constituído por uma depressão cutânea (o folículo piloso ou FP), no qual o pêlo insere-

se, e por uma bainha que o circunda, por onde escoa o sebo secretado pela glândula

sebácea, preenchendo os espaços livres da bainha.

2.3.2. A função barreira da pele

A função barreira da pele é principalmente atribuída ao estrato córneo que

apresenta permeabilidade à água 1000 vezes menor que a maioria das outras membranas

biológicas. Essa camada superficial possui espessura entre 10 µm e 20 µm e é altamente

hidrofóbica, formada por 10 a 15 camadas de corneócitos interligados por ligações

chamadas desmossomos que constituem uma barreira para prevenir a perda de fluidos

do corpo e a absorção de compostos estranhos (FOLDVARI, 2000).

O estrato córneo, ao contrário das outras membranas biológicas, não é composto

por fosfolipídios, mas é rico em ceramidas e lipídios neutros que estão arranjados em

uma bicamada lipídica (conforme mostrado na Figura 7). Assim, a função barreira da

pele parece também depender do teor e da composição dos lipídios e, em particular, do

arranjo estrutural das matrizes lipídicas intercelulares e da bicamada lipídica que

envolve as células do estrato córneo (SUHONEN et al., 1999).


19

Os principais lipídios intercelulares são as ceramidas (41%), o colesterol (27%)

e seus ésteres (10%), os ácidos graxos (9%) e uma pequena fração de sulfato de

colesterol (2%). Estudos em que lipídios relativamente polares e não polares foram

seletivamente extraídos com éter de petróleo e acetona, respectivamente, indicaram que

os lipídios mais polares são mais importantes para a integridade da barreira da pele

(FOLDVARI, 2000). Um grupo estruturalmente heterogêneo contendo sete ceramidas

diferentes representa os lipídios mais polares presentes no estrato córneo e, devido às

suas cadeias alifáticas saturadas e longas, parecem ser adequados para a formação das

membranas impermeáveis altamente ordenadas que promovem resistência às variações

na temperatura, exposição à radiação UV e à oxidação pelo ar (SUHONEN et al., 1999).

Embora o estrato córneo represente a principal barreira da pele, sabe-se que na

ausência de integridade desta camada, uma outra barreira à permeação de fármacos

permanece em outra camada da pele, a epiderme viável. A função de barreira da

epiderme viável está principalmente relacionada aos canais lipídicos intercelulares e aos

vários fenômenos de partição (FOLDVARI, 2000, ASBILL, MICHNIAK, 2000).

2.3.3. Penetração de fármacos através da pele

A pele tem a função essencial de proteger o organismo da desidratação e das

agressões exteriores. Ela pode ser, desta forma, mais ou menos permeável às

substâncias químicas e permitir a passagem de fármacos em certas condições, podendo

ser considerada uma interface terapêutica. A permeação das camadas que formam a pele

ocorre por difusão passiva através de duas vias: a via transepidérmica, que compreende

a penetração transcelular (através das células) e a penetração intercelular (entre as

células), e via apêndice (através dos folículos pilosos e glândulas sudoríparas) (Figura

8).


20

Figura 8. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de substâncias

(vias intercelular e transcelular) através do estrato córneo (adaptado de BARRY, 2001).

Tem havido grande discussão nas últimas décadas sobre qual via apresentaria

ação predominante na penetração de substâncias na pele, mas evidências experimentais

sugerem que sob condições normais a via predominante é a intercelular, ou seja,

difundindo-se pela bicamada lipídica entre as células (HADGRAFT, 2004). Entretanto,

de uma forma geral, substâncias polares e não polares podem se difundir através dos

variados mecanismos.

A bicamada lipídica forma uma fase contínua dentro do estrato córneo e

constitui a principal via para moléculas pequenas e não carregadas atravessarem esta

barreira (BUCK, 2004). A distância difusional percorrida por essas moléculas nesta via

é muito maior que a espessura do estrato córneo (10-20µm) e têm sido estimada em

aproximadamente 500µm. Além disso, esse espaço intercelular contém lipídios

estruturados, por isso o fármaco permeante tem que atravessar uma variedade de

domínios hidrofílicos e lipofílicos antes de alcançar a epiderme viável (HADGRAFT,

2004).

A via intracelular é geralmente a via predominante para moléculas mais polares

(hidrofílicas), já que os componentes celulares são predominantemente de natureza

aquosa (BUCK, 2004). Nesta via, as moléculas atravessam diretamente o estrato córneo

e a barreira limitante são as bicamadas lipídicas que também devem ser atravessadas.


21

A via apêndice (Figura 9) possui área superficial bastante pequena,

correspondendo a aproximadamente 0,1% da superfície da pele e, segundo alguns

autores, contribui, de forma insignificante para a penetração das substâncias na pele

(SUHONEN et al., 1999, BARRY, 2001). Contudo, ela sido utilizada para o transporte

rápido de várias moléculas, incluindo principalmente algumas macromoléculas e íons, já

que os apêndices oferecem poros criando um desvio à barreira do estrato córneo

(SUHONEN et al., 1999, BARRY, 2002).

Figura 9. Representação esquemática dos mecanismos de penetração de substâncias

(via transepidérmica e via apêndice) através da pele humana, 1 = glândula sebácea, 2 =

via transepidérmica e 3 = folículo piloso (adaptado de BARRY, 2002).

Desta forma, as três vias não são utilizadas exclusivamente e, a maioria das

moléculas, atravessará o estrato córneo utilizando uma combinação delas (BUCK,

2004).

Então, embora a pele constitua uma barreira muito eficaz, ela pode ser

atravessada por pequenas quantidades de substâncias capazes de penetrar nas camadas

córneas e, em alguns casos, chegar a uma absorção sistêmica. Nesse processo, o estrato

córneo constitui a principal barreira, enquanto a epiderme e a derme se comportam

como um gel aquoso, apresentando assim, efeito reservatório. As doses diárias passíveis

de absorção pela pele são bastante baixas, o que requer a administração de fármacos de

grande potência para obtenção do efeito desejado. Além disso, um bom fármaco para

administração cutânea deve apresentar baixa massa molecular, boa solubilidade em


22

água e em óleo e não deve ser irritante ou sensibilizante cutâneo. É importante conhecer

exatamente o grau de penetração, pois para determinados princípios ativos, uma

penetração profunda pode provocar intoxicações (BONNABRY et al.,1999).

2.3.4. Capacidade de Hidratação da Pele

A pele possui um “manto natural” formado pelo sebo cutâneo, produzido pela

glândula sebácea, que juntamente com o suor, forma uma emulsão denominada

“emulsão epicutânea” ou filme hidrolipídico. Este sebo é de extrema importância para a

pele por possuir uma composição graxa variada (triglicerídeos, ácidos graxos livres,

ceras, esteróis, esqualeno e parafinas), conseqüentemente esse “manto natural” atua

como barreira protetora que tem como principal função manter a pele hidratada,

saudável e jovem. Os ácidos graxos livres presentes nesse sebo proporcionam, uma

capacidade bactericida e fungicida (OLIVEIRA, 2003; BLOISE, 2003).

A pele é constantemente exposta às agressões externas como calor, sol, poluição

as quais podem provocar mudanças nas propriedades de proteção do sebo, aumentando

a perda transepidérmica de água (TEWL), deixando a pele ressecada (BLOISE, 2003).

A água age como um plastificante em associação com as proteínas e materiais solúveis

sendo assim, a sua presença na camada córnea é de fundamental importância para a

manutenção de suas propriedades físicas de flexibilidade e elasticidade (BLANK, 1976;

ROSSI, VERGNANINI, 1997).

Existem dois principais mecanismos de hidratação: oclusão e umectação. O teor

de hidratação é um dos fatores mais importantes para se manter as condições ideais da

pele. A pele deficiente em hidratação torna-se seca e frágil, resultando em rachaduras da

camada córnea (JONES, BROWN, 1992).

Essas condições são geralmente agravadas devido às instabilidades climáticas,

comumente associada à baixa umidade em climas tropicais quentes ou baixas

temperaturas em climas mais frios. O uso excessivo de detergente, disfunções

metabólicas ou simplesmente o tipo de pele, podem também influenciar no teor de

hidratação da pele (JONES, BROWN, 1992).


23

O estrato córneo é a principal barreira contra a perda transepidérmica de água.

Na verdade, o conteúdo de água da pele está diretamente relacionado com sua

aparência, elasticidade e maciez. O efeito hidratante de uma emulsão pode ser direto,

quando esta contribui na retenção de água no estrato córneo, e/ou pode ser indireto

quando a mesma impede ou diminui a perda transepidérmica de água (ROSSI,

VERGNANINI, 1997).

2.3.5. Avaliação da hidratação cutânea

A comprovação dos efeitos biológicos das chamadas formulações hidratantes é

de grande interesse, pois manter a pele hidratada retarda o envelhecimento cutâneo bem

como previne ou trata certas doenças de pele (GASPAR et al., 2001). As formulas

hidratantes podem agir seja evitando a perda de água formando uma barreira contra a

evaporação superficial (oclusiva), seja hidratando o estrato córneo pela água contida no

produto aplicado ou pela absorção da água da amostra (umectante) (NAVARRO et al.,

2002). O óleo vegetal quando aplicado na pele, devido a sua tensão superficial e

imiscibilidade com a água, não forma uma película contínua. Ele se dispõe em gotículas

nos espaços interfoliculares e entre os poros sudoríparos. Consequentemente, a

perspiração não é impedida e a pele também não se torna seca, pois, o óleo incorporado

na camada córnea impede a descamação, tornando-a mais macia (OLIVEIRA et al.,

1995).

Há algum tempo os dermatologistas, para avaliar a eficácia de um produto

hidratante, baseavam-se, na maioria das vezes, apenas na observação clínica, o que,

devido a sua subjetividade, pode ser um método pouco preciso. Com os avanços

tecnológicos, surgiram metodologias não invasivas, que estão sendo bastante utilizadas

e não causam agressão ou desconforto aos voluntários envolvidos nos estudos da análise

qualitativa ou quantitativa dos reais efeitos dos produtos cosméticos (GASPAR et al.,

2001).

Esses métodos são baseados em diversos princípios; propriedades elétricas,

mecânicas, térmicas e espectrofotométricas. Cada método pode proporcionar vantagens

e desvantagens, mas, sem dúvida, os métodos eletrométricos se tornaram os mais


24

utilizados devido a confiabilidade, baixo custo e facilidade de operação. O seu princípio

baseia-se na determinação das alterações de natureza elétrica tais como: impedância,

condutância e capacitância, mensuráveis no estrato córneo. Sendo que a capacitância é o

método mais empregado, pois é capaz de medir o conteúdo aquoso do estrato córneo

com corrente de baixa freqüência, enquanto a condutância precisa de corrente de alta

freqüência. Além disso, a utilização da medida da capacitância para abordagem da

hidratação cutânea parece ser menos afetada pela temperatura e umidade relativa que

quando comparada a outros métodos citados (GASPAR et al., 2001; DE PAULA,

2001).

A corneometria é o método de referência mais estudado e utilizado na avaliação

da eficácia dos produtos de aplicação tópica. A medição é efetuada na pele pelo

equipamento corneometer® que possui uma sonda, a qual é colocada

perpendicularmente à superfície cutânea, onde se encontram dois circuitos paralelos

(condensadores). Uma mola no interior assegura o estabelecimento do contato à pressão

constante, evitando assim, fenômenos adicionais de oclusão, enquanto uma membrana

de polietileno evita o contato entre os elementos condutores da sonda e a pele. A

modificação da capacitância registrada pelo corneômetro, será, assim, função do

conteúdo em água do estrato córneo com o qual está em contato. Os valores do

conteúdo aquoso do estrato córneo são expressos em unidades arbitrarias (UA),

parecendo existir relação próxima no intervalo de 60-120 UA onde se estima que 1 UA

corresponda a 0,2-0,9 mg de água, determinada por método gravimétrico, por grama de

estrato córneo anidro (GASPAR et al., 2001).

2.4. Ácido retinóico

Retinóides é o termo genérico utilizado para os compostos naturais e sintéticos

com atividades biológicas similares as da vitamina A. O termo vitamina A é utilizado

para referir-se ao retinol, forma álcool desta vitamina. Se houver uma função aldeído

em lugar de álcool, no grupo polar terminal da molécula da vitamina A, tem se o retinal,

e se houver esterificação tem-se o palmitato de retinila. Caso haja um grupo carboxila,

tem-se o ácido retinóico. Existem dois isômeros do ácido retinóico: ácido 11 – trans-


25

retinóico ou tretinoína (Figura 10) e o ácido 13 – cis – retinóico ou isotretinoína (Figura

11) (HERMITTE, 1992).

Figura 10. Estrutura química da tretinoína.

z

Figura 11. Estrutura química da isotretinoína.

Os retinóides têm como função atuar na proliferação e diferenciação celular, na

produção do sebo e na síntese de colágeno. Eles têm sido utilizados em diferentes níveis

farmacológicos para o tratamento de várias disfunções dermatológicas com acne, rugas

e distúrbios de queratinização incluindo psoríase. Recentemente, o retinol e o ácido

retinóico foram descobertos como úteis no tratamento de estrias e celulite (SHAPIRO,

SALIOU, 2001).

Por causa de seus efeitos colaterais muito pronunciados quando administrado

sistemicamente o AR é quase que exclusivamente utilizado pela via tópica, resultando

em pouco ou quase nenhum AR absorvido sistemicamente. Mesmo assim sua aplicação

tópica é limitada por várias desvantagens como irritação da pele, muito pouco solúvel

em água, e altamente instável na presença de água e luz. Sua insolubilidade pode limitar

sua veiculação em alguns veículos e sua foto-sensibilidade pode fazer com que a

aplicação tópica se torne ineficiente. Além de que quando aplicado topicamente o AR

pode provocar irritação local como eritema, descamação e queimação e ainda provocar

maior sensibilidade a exposição solar. Para minimizar todas essas desvantagens do AR

vários autores incorporaram o AR em lipossomas para diminiur sua ação irritante sobre

a pele, maximizar sua acumulação na pele e ainda prevenir sua degradação rápida

(SINICO et al, 2005).


26

Diferentes autores demonstraram in vitro um aumento o AR acumulado na pele

e in vivo uma diminuição na irritação após o tratamento com lipossomas. FOONG et al.

demonstraram uma melhor concentração do AR na epiderme e na derme após a

aplicação de lipossomas em comparação com cremes convencionais. MASINI et al.

acharam que a porcentagem do AR na epiderme e na derme após a aplicação de

formulações lipossomais foram significantemente maiores do que as formulações em

gel. SCHAFER-KORTING demonstraram que formulações lipossomais menos

concentradas do que as formulações comerciais tópicas tiveram a mesma eficácia e uma

menor irritação na pele (SINICO et al, 2005).

O ácido retinóico apresentou também ação tratamento de estrias, onde uma

diminuição da extensão e da amplitude das marcas em 80% das pacientes foi verificada

(FISHER et al., 1997; ELSON, 1994; KANG et al., 1996). Sua utilização tópica

demonstrou ainda, efeitos benéficos no tratamento de lesões hiperpigmentadas de vários

tipos tais como aquelas associadas com dano solar em pacientes brancos e aquelas

causadas por inflamação ou melasma em pacientes negros e também no tratamento de

celulite (SHAPIRO; SALIOU, 2001; RAFAL et al., 1992; BULENGO-RANSBY et al.,

1993; KLIGMAN, et al., 1999).

Há ainda um grande interesse na utilização do ácido retinóico para o tratamento

de doenças dermatológicas como acne e psoríase. Ele tem sido utilizado como primeira

linha de tratamento tópico para acne inflamatória e não-inflamatória há 3 décadas,

atuando nos três dos quatro fatores patogênicos da acne (BRISAERT et al., 2001;

LUPO, 2001).

A acne é a doença de pele mais comum em humanos e afeta mais de 80% da

população em diferentes graus (SHAPIRO; SALIOU, 2001). A etiologia da acne é

multifatorial apresentando principalmente seborréia, hiperqueratinização folicular,

colonização bacteriana pela Propionibacterium acnes (P. acnes) e inflamação na

patogênese (YONKOSKY, POCHI, 1986). O ácido retinóico atua normalizando a

descamação folicular resultante da hiperqueratinização anormal do epitélio folicular

promovendo o fluxo do sebo dos comedões pré-existentes, inibindo a formação de

novos comedões e reduzindo assim o crescimento da P. acnes. Acredita-se que esses

efeitos promovidos pelo ácido retinóico são mediados pelo seu receptor na pele, o RAR-

α (LEYDEN; SHALITA, 1986).


27

2.4.1. Aspectos toxicológicos do ácido retinóico tópico

2.4.1.1. A dermatite retinóide

Como efeitos adversos da utilização tópica do ácido retinóico, a dermatite

retinóide é relatada em grande parte dos pacientes submetidos à terapia convencional

com ácido retinóico, evento caracterizado por eritema macular, inflamação localizada,

xerose e discreta descamação, sinais que correspondem histologicamente as alterações

na camada córnea e hiperplasia epidérmica (KANG; VOORHEES, 1998). Essas

alterações histológicas resultam, em princípio, na proliferação aumentada de

queratinócitos e levam à descamação, ocorrendo também a supressão da atividade das

glândulas sebáceas com conseqüente diminuição da produção do sebo, que resultaria na

xerose. Uma vez que esses efeitos acompanham a aplicação tópica do ácido retinóico,

muitos autores têm acreditado que este tipo de irritação dérmica seria o responsável por

alguns dos efeitos dos retinóides. Atualmente, alguns estudos nos tratamentos de

fotoenvelhecimento têm mostrado a ação específica deste fármaco sob receptores

endógenos. Em 1995, GRIFFITHS; VOORHEES demonstraram que não houve

diferença significativa na eficácia clínica no tratamento do fotoenvelhecimento

utilizando concentrações de 0,025% e 0,1%. Contudo o grau de irritação diferiu bastante

entre os dois grupos, mostrando que não há qualquer correlação entre a eficácia clínica e

o nível de irritação. Desta forma, seria totalmente desnecessário forçar o uso do ácido

retinóico a ponto de desenvolver dermatite retinóide ativa para alcançar máxima

melhora clínica da pele envelhecida. Alguns estudos realizados têm demonstrado que a

hiperplasia epidérmica e a descamação têm ação mediada por receptores, mas a ativação

destes receptores não parece estar associada com o eritema e o desconforto (queimação,

ardor, prurido etc.) da dermatite retinóide (GRIFFITHS et al, 1993; FENG et al., 1997;

KANG; VOORHEES, 1998). Em 1997, THACHER et al. observaram em seu estudo

que o aparecimento de citotoxidade em cultura de células não estava relacionado com o

aparecimento de hiperplasia epidérmica. Este fato pode levar a acreditar que a melhora

clínica pode ser alcançada sem o uso excessivo do fármaco, minimizando desta maneira

a ocorrência de irritação na pele. Apesar de algum grau de descamação ser inevitável

devido à ativação de receptores, o efeito associado ao eritema pode ser evitado,

melhorando a segurança da utilização do ácido retinóico tópico e a aceitação pelo

paciente.


28

2.4.1.2. A absorção sistêmica

Com relação aos efeitos adversos sistêmicos, a aplicação tópica não apresentou

absorção percutânea capaz de alterar significativamente os níveis endógenos desta

substância e de seus metabólitos (LATRIANO et al., 1997). Entretanto, vários relatos

de casos individuais de defeitos congênitos associados com a utilização de ácido

retinóico tópico durante o primeiro trimestre de gestação foram descritos na literatura

(LIPSON et al., 1993; CAMERA; PEGLIASCO, 1992). Contudo, estudos realizados

em pacientes utilizando veículos tópicos contendo este fármaco não mostraram o

aparecimento de malformações congênitas atribuídas ao produto (JICK et al., 1993;

WALS et al., 1991).

2.4.2. Estabilidade do ácido retinóico

Devido à presença de ligações duplas conjugadas, retinóides em geral são

compostos instáveis, facilmente oxidados ou isomerizados especialmente na presença de

oxidantes (incluindo o ar), luz e calor excessivo. Eles são também sensíveis a ácidos

fortes e solventes que possuam oxigênio ou peróxido dissolvido (GATTI et al., 2000).

Solventes anidros contendo traços de ácido provocam modificações estruturais nos

retinóides e por isso a utilização de ácidos fortes deve ser evitada. Soluções alcalinas

geralmente não promovem alterações estruturais desses compostos (GATTI et al.,

2000).

O ácido retinóico sofre extensa degradação quando exposto a luz para produzir

diferentes isômeros principalmente em soluções alcoólicas (HWANG et al., 2004; LIM

et al., 2004; IOELE et al., 2005).

Estudos de estabilidade de várias formulações comerciais contendo ácido

retinóico foram também realizados. Os efeitos da temperatura e da exposição à luz

foram avaliados sendo encontrada notável degradação (GATTI et al., 2000; NYRADY

et al., 2002). Uma loção deste fármaco contém somente 30% da concentração inicial

após 10 minutos de irradiação (BRISAERT, PLAIZIER-VERCAMMEN, 2000;

BRISAERT et al., 2001). Cremes e soluções contendo ácido retinóico e conservadas

sob proteção da luz em temperatura de 2-8 ºC apresentam aproximadamente 86-87% da

concentração inicial deste fármaco após 90 dias, enquanto que nas temperaturas de 37 e


29

50 ºC apresentam 57-72% da concentração inicial (GATTI et al., 2000). A

fotoestabilidade do gel contendo 0,1% ácido retinóico encapsulado em micropartículas

(Retin-A micro®) e do gel de ácido retinóico 0,025% (Retin-A®), isolado ou em

combinação com eritromicina-peróxido de benzoíla, foi avaliada por NYRADY et al.

(2002) que recuperaram 87% do ácido retinóico veiculado em micropartículas e apenas

41% dele no gel 0,025% após 24 horas. Na presença de eritromicina-peróxido de

benzoíla, o gel de ácido retinóico 0,025% apresentou valores ainda mais baixos,

correspondente a 11% da concentração inicial após 24horas. Por isso, muitos autores

têm sugerido sua veiculação em sistemas de liberação tais como lipossomas

(MONTENEGRO et al., 1996; BRISAERT et al., 2001; SHIMIZU et al., 2003;

CONTRERAS et al., 2005; SINICO et al., 2005), microemulsões (TROTTA et al.,

2003; HWANG et al., 2004), niossomas (MANCONI et al., 2002; DESAI; FINLAY,

2002), micropartículas (JEONG et al., 2003; CIRPRANLI et al., 2005; CHOI et al.,

2001) entre outros.

Sistemas de liberação do tipo lipossomas para veiculação do ácido retinóico têm

sido desenvolvidos por diversos autores até o momento (MONTENEGRO et al., 1996;

BRISAERT et al., 2001; MANCONI et al., 2002; SHIMIZU et al., 2003;

CONTRERAS et al., 2005; SINICO et al., 2005). Lipossomas contendo ácido retinóico

foram estudados por MONTENEGRO et al. (1996), que avaliaram o perfil de liberação

e a permeação a partir destas preparações, mostrando-se favoráveis à utilização tópica.

Lipossomas foram também utilizados por BRISAERT et al. (2001) para encapsulação

deste fármaco obtendo-se uma boa estabilidade química com menor fotodegradação e

alta liberação. SHIMIZU et al. (2003) incorporaram glicosídeos derivados da soja na

composição de lipossomas de ácido retinóico e constataram um aumento da estabilidade

do fármaco. CONTRERAS et al. (2005) utilizaram hidrogéis de ácido retinóico

encapsulados em lipossomas e obtiveram um perfil de liberação mais controlado,

resultando na diminuição dos efeitos colaterais da aplicação tópica. SINICO et al.

(2005) compararam lipossomas com carga positiva e negativa. Os estudos in vitro

demonstraram que os lipossomas carregados negativamente proporcionaram melhor

retenção do fármaco nas camadas da pele. Alternativamente aos lipossomas, os

niossomas também tem sido utilizados para controlar a liberação do AR e conferir

estabilidade de maneira similar aos lipossomas, mas com menor custo e maior

estabilidade (MANCONI et al., 2002; DESAI; FINLAY, 2002).


30

Microemulsões tem sido o veículo de escolha utilizado por alguns autores

(TROTTA et al., 2003; HWANG et al., 2004). TROTTA et al. (2003) avaliaram as

microemulsões contendo ácido retinóico através da realização de ensaios de permeação

e de retenção in vitro considerando-as como uma boa alternativa para administração

tópica.

2.5 Efeitos do ácido retinóico no envelhecimento cutâneo

Todos os organismos chegam a uma fase regressiva de seu ciclo vital, que se

manifesta por modificações anatômicas e fisiológicas a qual é conhecida como

envelhecimento (ESTEVE, 1990). A pele, sendo um órgão de superfície, sofre as

agressões do meio ambiente e, particularmente, das radiações solares as quais têm um

papel relevante no envelhecimento cutâneo. O processo de envelhecimento altera a

estrutura e a função dos órgãos e, no caso da pele, que é um órgão externo, modifica

também seu aspecto. Os sinais clínicos e fisiológicos do envelhecimento cutâneo são

numerosos e variados. O envelhecimento cutâneo pode ser dividido em componentes

intrínsecos (cronológicos) e extrínsecos (LÉVÈQUE, 1997).

O envelhecimento cutâneo intrínseco é resultante do declínio nas funções e

capacidades fisiológicas que garantem o bom funcionamento do organismo.

Clinicamente, o envelhecimento intrínseco é atrófico e resulta na perda progressiva da

elasticidade, na atrofia da pele e no aumento das linhas de expressão. As principais

características histológicas são a atrofia epidérmica, o achatamento da junção dermo-

epidérmica, atividade metabólica mais lenta e o aumento do tamanho dos corneócitos

com a idade. Especificamente, o estrato córneo permanece relativamente inalterado,

mas a epiderme afina-se com um achatamento da junção dermo-epidérmica que é

refletida por um aumento da fragilidade da pele. Há considerável diminuição na

espessura da derme e na vascularização, assim como, uma redução no número e

capacidade biossintética de fibroblastos. Finas fibras elásticas dérmicas espessam com a

idade e, então, desaparecem (GILCHREST, 1996; LÉVÈQUE, 1997; STILLER et al.,

1996).

O termo envelhecimento extrínseco e fotoenvelhecimento são freqüentemente

utilizados como sinônimos embora, outros fatores extrínsecos, diferentes da radiação

solar, possam afetar a pele como: poluição atmosférica, hábito de fumar e metabólitos


31

de substâncias ingeridas ou inaladas. As mudanças clínicas visíveis no foto-

envelhecimento causadas pelos efeitos acumulativos da exposição solar freqüente e

prolongada, especificamente radiação UV, podem abranger: irregularidades de

pigmentação, rugas, uma variedade de lesões malignas e alteração na estrutura e na

função da epiderme e da derme. A espessura da epiderme pode aumentar ou diminuir

correspondendo a áreas de hiperplasia ou atrofia severa, respectivamente. Na pele

severamente fotodanificada, há perda da polaridade epidérmica (maturação ordenada) e

os queratinócitos podem apresentar atipia especialmente nas camadas mais inferiores da

epiderme. Mudanças profundas ocorrem na derme, como degeneração do colágeno,

deposição de material elástico anormal refletindo em rugas, sulcos e coloração

amarelada da pele e, ainda, redução dos glicosaminoglicanos. Há um espessamento,

uma aglomeração e uma degradação de fibras elásticas. A microcirculação também é

afetada, os vasos sangüíneos tornam-se dilatados, tortuosos e muito escassos

(GILCHREST, 1996; LÉVÈQUE, 1997; RIDGE, 1990; STILLER et al., 1996).

O ácido retinóico repara os danos causados pelo foto-envelhecimento

restaurando e limitando a progressão do dano já existente. Ele bloqueia a indução UV

da matriz das metaloproteinases, enzimas responsáveis pela quebra do colágeno, o

maior constituinte da derme. O acido retinóico também estimula a proliferação dos

queratinócitos e dos fibroblastos. Mais colágeno deixa a pele mais espessa e mais

resistente a traumas. Maior proliferação de queratinócitos resulta em desprendimento

dos queratinócitos maduros resultando em uma pele mais macia. Uma maior produção

de colágeno pode explicar o desaparecimento de linhas finas e rugas (GRIFFITHS;

VOORHEES, 1995).

KLIGMAN et al. (1986) relataram o primeiro estudo para verificação da eficácia

de um creme contendo ácido retinóico na reversão dos danos solares sobre a pele facial.

Foram observadas alterações clínicas discretas, embora, fragmentos de biópsia da pele

apresentassem muitos efeitos histológicos como: espessamento da epiderme

previamente atrófica, eliminação de displasia e atipia, dispersão mais uniforme da

melanina e a formação de colágeno dérmico e novos vasos sanguíneos.

3. Objetivos

_______________________________________________________________Objetivos

33

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

Microencapsular o ácido retinóico juntamente com o óleo de babaçu para uso

tópico a fim de diminuir seus efeitos indesejáveis na pele.

3.2. Específicos

♦ Obter microcápsulas de alginato e alginato/quitosana contendo ácido retinóico e

óleo de babaçu;

♦ Desenvolver e validar a medologia analítica de quantificação do ácido retinóico a

partir das microcápsulas desenvolvidas;

♦ Otimizar as microcápsulas para tamanho e eficiência de encapsulação adequados

à via de administração;

♦ Realizar a caracterização físico-química das microcápsulas obtidas;

♦ Incorporar as microcápsulas em gel natrosol®;

♦ Estudar a liberação in vitro das microcápsulas utilizando membrana artificial;

♦ Aplicar a metodologia analítica de quantificação do ácido retinóico em cinéticas

de liberação in vitro.

4. Artigo I

________________________________________________________________Artigo I

35

Desenvolvimento e caracterização de microcápsulas de alginato/quitosana

contendo ácido retinóico e óleo de babaçu

Velloso, F. T.1,2, Ferraz, R. S. 2, Lira, A. A. M. 3, Santana, D. P.1, Santos-

Magalhães, N.S.2

1Núcleo de Desenvolvimento Farmacêutico e Cosmético, Universidade Federal de

Pernambuco, Recife, Brasil 2Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami, Universidade Federal de Pernambuco,

Recife, Brasil 3Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico, Universidade Federal de Sergipe,

São Cristóvão, Brasil

RESUMO

O ácido retinóico (AR) tem sido largamente utilizado na terapia tópica de acne,

foto-envelhecimento, psoríase, celulite e estrias. Entretanto, apesar de seus efeitos

benéficos provoca irritação local manifestada na forma de eritema, queimação, coceira,

secura e descamação da pele, além de ser instável na presença de ar e luz e pobremente

solúvel na água. Microcápsulas (MC) de alginato/quitosana foram preparadas com o

propósito de proteger e promover uma liberação controlada do AR minimizando sua

irritação cutânea. O óleo de babaçu foi acrescentado para evitar o ressecamento da pele

causado pelo AR. A caracterização das MC, a interação fármaco-polímero-óleo e o

perfil de liberação in vitro foram investigados. As MC apresentaram forma esférica,

diâmetro em torno de 400 µm e taxa de encapsulação dependente da concentração de

AR, da concentração de quitosana e do solvente utilizado. A liberação in vitro também

foi afetada pela concentração de quitosana. As MC com maiores concentrações de

quitosana apresentaram perfil de liberação mais sustentado. Assim as microcápsulas

desenvolvidas podem ser boas candidatas para sistemas de liberação controlada do AR

na pele melhorando a terapia tópica com o AR.

Palavras chave: microcápsulas, ácido retinóico, óleo de babaçu, alginato, quitosana

________________________________________________________________Artigo I

36

ABSTRACT

Retinoic acid (RA) has been widely used for dermatological applications, such

as acne, photo damage, psoriasis, cellulite and striae. However despite many beneficial

effects, the topical application of RA is limited by severe local irritation manifested as

mild erythema, peeling, itching, dryness and burning and also its light and air expoisure

instability and its poor water solubility. Alginate coating chitosan microparticles were

prepared with the purpose of protect and provide a controlled release of the RA

minimizing cutaneous irritation. The babassu oil was used to reduce side effects of RA.

Microparticles characterization, drug-polymer interaction and in vitro drug release

profile was investigated. Microcapsules presented spherical shape, mean diameter of

about 400 µm and variable drug loading capacity as a function of polymers and drug

concentrations. The in vitro release of RA was also affected by chitosan concentration.

Microcapsules with higher chitosan concentration resulted in microparticles with more

controlled profile. Than, the microcapsules developed in this work can be a good

candidate to deliver RA in the skin, improving the topical therapy with retinoids.

Keywords: microcapsules, retinoic acid, babassu oil, alginate, chitosan

________________________________________________________________Artigo I

37

1. INTRODUÇÃO

Ácido retinóico (AR), também chamado de vitamina A ácida, tem sido

largamente utilizado em formulações dermatológicas para o tratamento de acne,

psoríase, distúrbios de queratinização e também em formulações cosméticas com a

finalidade de reduzir os efeitos de fotoenvelhecimento, celulite e estrias (SHAPIRO,

SALIOU, 2001). Entretanto, apesar de seus efeitos benéficos provoca irritação local

manifestada na forma de eritema, queimação, coceira, secura e descamação da pele

(SINICO et al., 2005).

A irritação causada na pele pelo AR é um fator limitante para a continuidade do

tratamento pelo paciente. O AR diminui o tamanho das glândulas sebáceas assim como

a sua secreção fazendo com que ele seja bastante atrativo para tratamento de acne

(LEWIN et al.,1994), porém para tratamentos de psoríase, celulite, estrias e rugas não é

interessante que a pele fique ressecada. Sendo assim, a incorporação de emolientes

atuaria favoravelmente para diminuição do ressecamento da pele causado pelo AR.

O AR além de ser instável na presença de ar e luz é pouco solúvel na água. A

baixa solubilidade limita sua incorporação em certos veículos e a fotosensibilidade

pode promover uma terapia tópica ineficaz (LEHMAN et al.,1988). Para suplantar

esses inconvenientes e aumentar a eficácea terapêutica do AR, várias formulações

foram propostas como, por exemplo, complexo de inclusão em β-ciclodextrina

(AMDIDOUCHE et al., 1994), gel (SHIN et al., 2005), lipossomas (BRISAERT et al.,

2001; CONTRERAS et al., 2005; IOELE et al., 2005; SINICO et al., 2005), niossomas

(DESAI; FYNLAY, 2002), nanoemulsão (JENNING et al., 2000), microemulsões

(HWANG et al., 2004), nanopartículas (EZPELETA et al., 1995), nanopartículas

lipídicas (LIM et al., 2004) e micropartículas (CIRPRANLI et al., 2005; LIRA et al.,

2007; ROSSLER et al., 1994; TROTTA et al., 2003).

As micropartículas são sistemas poliméricos de liberação controlada, sustentada

ou prolongada de fármacos ou substâncias biologicamente ativas. Elas podem ser de

dois tipos: matriciais conhecidos como microesferas ou reservatórios conhecidos como

microcápsulas (cápsulas ocas ou com cavidade oleosa). As micropartículas

proporcionam proteção a substâncias lábeis e promovem liberação controlada de

princípios ativos (BENITA, 2006). De acordo com a rigidez da parede desses sistemas

uma liberação controlada é possível, o que é bastante importante no caso dos fármacos

que provocam irritação na pele, pois estes promovem a obtenção de efeitos terapêuticos

________________________________________________________________Artigo I

38

com a utilização de doses menores e diminuição dos efeitos colaterais, tornando-o

viável clinicamente.

Desta forma o uso das microcápsulas (MC) pode ser uma alternativa viável para

veicular o ácido retinóico a fim de melhorar a estabilidade e minimizar a irritação

produzida na pele através da obtenção de uma liberação controlada. Além disso, o uso

de óleo de babaçu como cavidade interna oleosa de microcápsulas pode auxiliar na

diminuição do ressecamento provocado pelo ácido retinóico na pele.

O objetivo deste estudo foi, portanto, desenvolver uma formulação tópica de

ácido retinóico encapsulado em microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de

babaçu, incorporá-las em gel natrosol® e avaliar a cinética de liberação in vitro

utilizando células de difusão de Franz para obtenção de perfil sustentado.

________________________________________________________________Artigo I

39

2. MATERIAIS E MÉTODO

2.1. Materiais

Ácido retinóico grau farmacêutico (Purifarma, São Paulo, Brasil), alginato,

quitosana e polissorbato 80 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), etanol (Vetec, Rio de

Janeiro, Brasil), ácido acético (Merck, Darmstadt, Alemanha), óleo de babaçu (Volp,

São Paulo, Brasil), hexano (Synth, São Paulo, Brasil), metanol grau HPLC (J.T.Baker,

USA), clorofórmio e diclorometano (Merck, Darmstadt, Alemanha), dihidrógenofosfato

de sódio, hidróxido de sódio e cloreto de cálcio grau analítico (Vetec Rio de Janeiro,

Brasil), metilparabeno e EDTA dissódico (DEG, São Paulo, Brasil); Natrosol® e

propilenogicol (Codossal, São Paulo, Brasil).

2.2. Obtenção de microcápsulas de alginato e microcápsulas de alginato/quitosana


No estudo de pré-formulação microcápsulas de alginato de sódio sem

revestimento de quitosana (microcápsulas de alginato) contendo ácido retinóico e óleo

de babaçu foram obtidas através da técnica de coacervação complexa em etapa única

(WITTAYA-AREEKUL et al. 2006) utilizando cloreto de cálcio e um solvente

apropriado para solubilizar o AR. As microcápsulas foram obtidas por nebulização

(atomizador spray, BP 5.0, Biotecnosis do Brasil, Rio de Janeiro, Brasil), filtradas a

vácuo, lavadas com água destilada e liofilizadas (Liofilizador - EZ-DRY, FTS System,

New York, USA).

Após otimização do processo, microcápsulas de alginato revestidas pela

quitosana (microcápsulas de alginato/quitosana) contendo ácido retinóico e óleo de

babaçu foram obtidas pela técnica a nteriormente descrita para as microcápsulas de

alginato, sendo a quitosana (deacetilada com ácido acético) adicionada a solução de

cloreto de cálcio. Depois de obtidas, as microcápsulas de alginato/quitosana foram

incorporadas em gel natrosol® para ensaios de liberação in vitro. O gel natrosol® foi

preparado pelo aquecimento de metilparabeno, EDTA dissódico e propilenoglicol com.

________________________________________________________________Artigo I

40

um pouco de água até completa solubilização O natrosol® foi pulverizado na mistura e

deixado sob agitação média por 30 minutos ou até ficar consistente.

2.3. Caracterização físico-química das microcápsulas de alginato e


2.3.1. Rendimento das microcápsulas

As microcápsulas de alginato ou de alginato/quitosana contendo ácido retinóico

e óleo de babaçu liofilizadas foram pesadas e o rendimento do processo foi calculado

através da razão entre a quantidade de MC obtidas e a quantidade teórica de MC

expressa em porcentagem. A quantidade teórica das microcápsulas foi baseada na

quantidade total inicial de alginato, óleo de babaçu e AR.

2.3.2. Tamanho e morfologia das microcápsulas

Para a determinação do tamanho das microcápsulas de alginato e

alginato/quitosana contendo ácido retinóico e óleo de babaçu foi utilizado o método de

difração de laser (analisador de tamanho de partícula LSTM 13 320, Beckman Coulter,

EUA). A morfologia das microcápsulas de alginato/quitosana foi avaliada por

microscopia ótica (câmera digital Sony, modelo DSC-T100) e microscopia eletrônica

de varredura (microscópio JEOL, Tókio, Japão) após metalização das amostras com

ouro coloidal.

2.3.3. Taxa de encapsulação das microcápsulas

As microcápsulas contendo ácido retinóico e óleo de babaçu (0,5 g) foram

dispersas em solução tampão pH 7,4 e submetidas a agitação ultra-som (Vibra Cell,

BRANSON, EUA) por 2 minutos, sendo mantidas sob agitação magnética por 12 h após

dispersão em hexano. O ácido retinóico foi separado pelo processo de partição

________________________________________________________________Artigo I

41

adicionando-se hexano. O conteúdo orgânico foi transferido para um balão volumétrico

e o volume foi completado com hexano para 50 mL. As amostras obtidas foram

convenientemente diluídas com metanol e analisadas por cromatografia líquida de alta

eficiência. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

2.3.4. Estudo de interação entre o ácido retinóico e constituintes das microcápsulas

utilizando espectroscopia em IV com transformada de Fourier (FTIR)

A análise da interação entre o AR e os constituintes das microcápsulas de

alginato/quitosana foi efetuada através de espectroscopia de infravermelho. Amostras

das microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico, fármaco isolado,

óleo de babaçu, quitosana, alginato, microcápsulas de alginato/quitosana brancas (sem

o AR) e das misturas físicas de AR-quitosana (1:1 p/p), óleo-AR (1:1 p/p) e alginato-

AR (1:1 p/p) foram avaliadas utilizando método de pastilhas de KBr (espectrofotômetro

FTIR F 566, Bruker I).

2.4. Estudo de liberação in vitro das microcápsulas de alginato/quitosana contendo

ácido retinóico disperso em óleo de babaçu

O estudo de liberação in vitro do AR a partir das formulações foi realizado com

células de difusão do tipo FRANZ com área difusional de 1,15 cm2, volume de 6 mL e

utilizando membranas sintéticas hidrofílicas (ME 25/21 ST, 0,45 µm ± 0,5 µm). O

compartimento receptor foi preenchido com tampão fosfato pH 7,4 e etanol (70:30) em

um sistema composto de seis células individuais conectados a um banho termostatizado

à 37°C ± 0,5°C sob agitação constante de 100 rpm por um período de 48 hs. As

membranas foram colocadas cuidadosamente entre o compartimento doador e receptor

de forma que ficassem em contato com a solução receptora. Todas as membranas foram

previamente umedecidas (1 hora antes do experimento) com a solução receptora. No

compartimento doador uma amostra de microcápsulas contendo 0,025% do fármaco

incorporadas em 0,4 g gel natrosol® foi colocada sobre a membrana artificial de cada

célula. Em períodos de tempos pré-determinados (1,5; 3; 5; 7; 10; 24; 48 hs) todo o

________________________________________________________________Artigo I

42

líquido do compartimento receptor foi coletado e imediatamente reposto. O ácido

retinóico liberado foi quantificado em cromatografia líquida de alta eficiência.

2.5. Condições cromatográficas para a quantificação do AR por cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE)

As análises cromatográficas de quantificação do ácido retinóico foram efetuadas

em cromatógrafo SPD 10 AVP, equipado com detector UV-VIS operando a 350 nm

com bomba LC-10 ADVP e programa LC-10 (Shimadzu, Kyoto, Japão). A separação

foi realizada em coluna C18 de fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 150 x 4,6 mm

(5µm). A fase móvel foi constituída por metanol e ácido acético glacial a 1% (85:15

v/v) com fluxo de 1,8 mL/min e volume de injeção de 20 µL.

________________________________________________________________Artigo I

43

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Obtenção de microcápsulas de alginato e microcápsulas de alginato/quitosana


O alginato de sódio e a quitosana são polímeros naturais que tem sido bastante

utilizados para a obtenção de micropartículas (MURATA et al., 1993a,b; SEZER;

AKBUGA, 1999a,b; WITTAYA-AREEKUL et al., 2006). A técnica utilizada é

chamada coacervação complexa (WITTAYA-AREEKUL et al., 2006) onde uma

membrana é formada na interface entre as soluções de alginato e quitosana quando a

solução de alginato é gotejada diretamente em uma solução de cloreto de cálcio

misturada com quitosana. A malha polimérica de alginato é formada tanto pela reação

com quitosana quanto pela reação com íons cálcio (WITTAYA-AREEKUL et al.,

2006).

Para se obter uma liberação adequada de fármacos as micropartículas de

quitosana são frequentemente reticuladas através de crosslinking químico com

glutaraldeído (JAMEELA, JAYAKRISHMAN, 1995; BERTHOLD et al., 1996,

GENTA et al., 1997). Entretanto, resíduos desse agente químico nas micropartículas

pode causar irritação nas mucosas e induzir efeitos colaterais indesejáveis. Por outro

lado a quitosana pode formar géis com ânions não tóxicos como o alginato de sódio

através de crosslinking iônico (ANAL, STEVENS, 2005). A rigidez da parede de

micropartículas provoca uma liberação mais controlada o que é bastante importante no

caso dos fármacos que provocam irritação na pele, pois estes promovem a obtenção de

efeitos terapêuticos com a utilização de doses menores e diminuição dos efeitos

colaterais, tornando-o viável clinicamente.

No estudo de pré-formulação foram desenvolvidas microcápsulas de alginato de

sódio (2%) sem o revestimento de quitosana (microcápsulas de alginato) contendo

ácido retinóico disperso em óleo de babaçu através da modificação do método proposto

por WITTAYA-AREEKUL et al. (2006).

No estudo de pré-formulação foi variada a quantidade de óleo de babaçu (20 a

40%) necessária para se obter uma emulsão estável na etapa inicial do processo de

produção das microcápsulas de alginato, com sensorial agradável e com rendimento

elevado. O rendimento do processo, a estabilidade da emulsão (ausência de separação

________________________________________________________________Artigo I

44

de fases por um período de 3 hs) e o aspecto sensorial (espalhabilidade, suavidade de

toque e hidratação da pele) foram avaliados (Tabela 1).

Tabela 1. Avaliação da influência da porcentagem de óleo babaçu no rendimento do

processo de obtenção das microcápsulas de alginato.

Óleo de babaçu (%) Rendimento (%) Sensorial Estabilidade da emulsão

20 79,84 ++ +++

30 77,20 +++ +++

40 75,32 + +++

* Sensorial = espalhabilidade, suavidade no toque e hidratação. ** Estabilidade da emulsão (+) = visualização de separação de fases; (++) = visualização de separação de fases no período de 3 hs; (+++) = ausência de separação de fases;

Dos resultados é possível observar que quanto maior a porcentagem de óleo de

babaçu na formulação (40%) menor é o rendimento (75%). Isso se deve a um aumento

na viscosidade da emulsão inicial implicando em maior perda de material durante o

processo de obtenção das microcápsulas. Apesar da formulação de microcápsulas de

melhor rendimento (~ 80%) ter sido obtida com 20% de óleo, o sensorial das mesmas

não é tão agradável quanto ao das microcápsulas com 30% de óleo de babaçu, as quais

propiciam um toque de maior suavidade e hidratação. A formação da emulsão foi

estável em todas as formulações.

A influência da adição de AR (0,1%) no rendimento das microcápsulas de

alginato contendo óleo de babaçu (20 a 40%) foi avaliada e os resultados estão

apresentados na Tabela 2. A presença do ácido retinóico a 0,1% diminuiu o rendimento

das microcápsulas de alginato que passa de 79% para 75% na formulação com de óleo

de babaçu a 20% e de 75% para 70% na formulação com de óleo de babaçu a 40%

(Tabelas 1 e 2).

Tabela 2. Avaliação da influência da presença do AR (0,1%) no rendimento das

microcápsulas de alginato com concentrações variadas de óleo de babaçu.

Óleo (%) Rendimento (%)

20 75,34

30 74,75

40 70,44

________________________________________________________________Artigo I

45

Da análise dos resultados dessa etapa de pré-formulação, a taxa de óleo de

babaçu foi fixada em 30% a fim de promover rendimento elevado e boa hidratação da

pele na aplicação tópica. Na etapa seguinte, microcápsulas de alginato contendo óleo de

babaçu a 30% foram preparadas com diferentes concentrações de AR (0,1%; 0,25% e

0,5%). O rendimento, a taxa de encapsulação do AR (Tabela 3) e o tamanho médio das

microcápsulas foram determinados (Tabela 4).

Tabela 3. Influência da concentração de AR no rendimento e na taxa de encapsulação

das microcápsulas de alginato contendo óleo de babaçu (30 %).

Formulação AR (%) Rendimento (%) Taxa de encapsulação (%)

F1 0,10 74,75 23,32 ± 0,018

F2 0,25 71,26 26,93 ± 0,065

F3 0,50 74,80 51,67± 0,028

AR solubilizado em etanol

Tabela 4: Apresentação dos resultados dos tamanhos das microcápsulas de alginato.

Formulação d10 d50 d90

F1 111,8 329,5 742,8

F2 108,2 284,7 731,5

F3 106,1 324 766,9

d10 = 10% das microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm; d50 = 50% das microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm;

d90 = 90% das microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm

O rendimento do processo correspondeu a mais de 70% para todas as

formulações. A taxa de encapsulação aumentou com o aumento da quantidade de ácido

retinóico. O aumento na concentração de AR de 0,1% para 0,5% aumentou a taxa de

encapsulação de 23% para 52%, Estes dados estão de acordo com SEZER; AKBUGA

(1999a,b) e ANAL, STEVENS (2005). Eles perceberam que com o aumento da

concentração do fármaco havia um aumento na taxa de encapsulação.

Nas formulações F1, F2, e F3 o tamanho médio das partículas foi de 384, 359 a

387 µm para F1, F2 e F3 respectivamente. Existem muitos trabalhos na literatura onde

esse método é empregado por diferentes grupos para obtenção de micropartículas com

diâmetro menor que 200 µm (WEE; GOMBOTZ; FANSLOW, 1995; BOWERSOCK et

al., 1996; GOMBOTZ; WEE, 1998). O tamanho dessas microcápsulas pode ser ajustado

________________________________________________________________Artigo I

46

mediante o controle da pressão do sistema de extrusão, da velocidade do fluxo da

solução de alginato de sódio que vai ser nebulizado e da distância entre o orifício e a

superfície da solução de cloreto de cácio (GOMBOTZ; WEE, 1998). Embora esses

parâmetros pudessem ser utilizados para obtenção de partículas com uma faixa de

distribuição de tamanho mais estreita, algumas limitações tecnológicas impediram a

otimização do processo.

Fundamentado nos resultados do estudo de pré-formulação, diferentes

formulações de microcápsulas de alginato (2%) revestido pela quitosana (microcápsulas

de alginato/quitosana) contendo ácido retinóico e óleo de babaçu (30%) foram obtidas

variando-se as concentrações do ácido retinóico (0,1; 0,25 e 0,5%), da quitosana (0,05 e

0,1%) e do tipo de solvente utilizado na solubilização do ácido retinóico (etanol,

diclometano e clorofórmio).

3.2. Caracterização físico-química de microcápsulas de alginato/quitosana


3.2.1. Determinação do rendimento, da taxa de encapsulação e do tamanho de

partículas das microcápsulas de alginato/quitosana contendo do ácido retinóico e

óleo de babaçu

O rendimento, a taxa de encapsulação do AR (Tabela 5) e o tamanho das

microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico e óleo de babaçu foram

determinados (Tabela 6).

________________________________________________________________Artigo I

47

Tabela 5. Valores do rendimento do processo e da taxa de encapsulação das

microcápsulas de alginato/quitosana contendo 2% de alginato e 30% de óleo.

Formulação Solvente AR (%)

Quitosana (%)

Rendimento (%)

Taxa de Encapsulação

(%)

F4 Et-OH 0,1 0,05 74,06 7,96 ± 0,03 F5 Et-OH 0,1 0,1 75,25 14,48 ± 0,84 F6 Et-OH 0,25 0,05 72,83 18,68 ± 0,033 F7 Et-OH 0,25 0,1 73,17 24,04 ± 0,018 F8 Et-OH 0,5 0,05 74,98 22,82 ± 0,45 F9 Et-OH 0,5 0,1 76,18 44,32 ± 0,01 F10 CH2CL2 0,5 0,1 71,86 73,18 ± 0,07 F11 CHCL3 0,5 0,1 70,80 78,22 ± 0,01

Em todas as formulações o rendimento obtido foi acima de 70%. Concentrações

crescentes de fármaco e de quitosana resultaram em aumentos significativos na taxa de

encapsulação que variou de aproximadamente 8% a 44% quando o etanol foi utilizado

como solvente o que também foi percebido pelos autores SEZER, AKBUGA (1999a,b)

e ANAL, STEVENS, (2005).

A utilização de solventes mais apolares levou há aumentos ainda maiores na taxa

de encapsulação sendo de 73% para o diclorometano e 78% para o clorofórmio. Esses

resultados podem ser explicados pela maior solubilidade do AR em clorofórmio e

diclorometano com relação ao etanol, desta forma há uma melhor solubilização do AR

fazendo com que este fique mais homogeneamente disperso na emulsão e seja melhor

incorporado na matriz de alginato ficando assim protegido do contato com o ambiente

externo.

________________________________________________________________Artigo I

48

Tabela 6. Apresentação dos resultados dos tamanhos das microcápsulas.

Formulação d10 d50 d90

F4 137 386,2 842

F5 118 354 1051

F6 142 384 874

F7 129 380 993

F8 124 341 776

F9 127 355 767

F10 146 433 1049

F11 128 412 922

d10 = 10% das microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm; d50 = 50% das

microcápsulas apresentam tamanho < que (...) µm; d90 = 90% das microcápsulas

apresentam tamanho < que (...) µm

Nas formulações F4-F11 o tamanho médio das partículas variou de 400 a 480 nm.

Como explicado anteriormente, para as formulações de alginato, limitações

tecnológicas não permitem a otimização do processo para a produção de uma faixa de

distribuição de tamanhos mais estreita

3.2.1. Morfologia das microcápsulas

As fotografias obtidas por microscopia óptica das microcápsulas de

alginato/quitosana contendo AR e óleo de babaçu, antes da liofilização, estão

apresentadas na Figura 1, onde podem ser visualizadas microcápsulas esféricas e com

uma pequena saliência decorrente do processo de gotejamento.

A morfologia das microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico

(0,5 %) e óleo de babaçu, após liofilização, foi também avaliada por microscopia

eletrônica de varredura (Figura 2). As microcápsulas são esféricas com superfície

rugosa (A). Na Figura 2B, após corte transversal, é possível observar a matriz de

alginato e a perda da cavidade oleosa caracterizando um sitema reservatório. Pode ser

enfatizado que não há visualização de cristais de AR na superfície das microcápsulas,

corroborando a taxa de encapsulação elevada para essa formulação (F11).

________________________________________________________________Artigo I

49

Figura 1. Fotografias das microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico

a 0,5 % e óleo de babaçu a 30 % (F11): A) microcápsulas esféricas; B) microcápsulas

com pequena saliência decorrente do processo de gotejamento. (100 ×).

A

B

Figura 2. Fotomicrografias de microcápsulas de alginato/quitosana contendo AR a 0,5

% e cavidade preenchida com óleo de babaçu a 30 % (F11). Microscopia eletrônica de

varredura.

________________________________________________________________Artigo I

50

3.3.3. Estudo de interação entre o ácido retinóico e constituintes das microcápsulas

de alginato/quitosana contendo do ácido retinóico e óleo de babaçu utilizando

espectroscopia em IV com transformada de Fourier (FTIR)

Os espectros em infravermelho obtidos a partir da mistura física de óleo de

babaçu e AR comparado aos de óleo de babaçu e AR isolados estão representados na

Figura 3. Na mistura física, alterações e deslocamentos das bandas nas regiões entre

1310 e 1046 cm-1 foram observadas. As bandas em 1335 cm-1 e 1310 cm-1 (estiramento

C-O do grupamento carboxílico) presentes tanto no óleo de babaçu como no AR

fundiram-se na mistura física. A banda 1036 cm-1 (deformação O-H) presente no óleo

de babaçu e no ácido retinóico, respectivamente, desapareceu na mistura física. As

bandas em 808 cm-1 (estiramento C-C) e 551 cm-1 (deformação C-C) presentes no óleo

de babaçu foram deslocadas e intensificadas na mistura física, enquanto que a banda em

487 cm-1 (deformação C-C) deslocou-se e diminuiu de intensidade na mistura física. A

banda em 758 cm-1 (estiramento =C-H) presente na mistura física resultou da fusão de

várias bandas tanto do AR quanto do óleo de babaçu, indicando, portanto, uma

interação e/ou solubilização do fármaco no óleo de babaçu.

________________________________________________________________Artigo I

51

Figura 3. Espectro comparativo de FTIR do AR (linha contínua), do óleo de babaçu

(linha tracejada) e da mistura física AR e óleo de babaçu 1:1 (p/p). (linha pontilhada). A

= estrutura do AR.

Os espectros FTIR obtidos a partir do AR e das microcápsulas de

alginato/quitosana contendo ou não fármaco estão apresentados na Figura 4. Os

espectros das microcápsulas de alginato/quitosana e das microcápsulas de

alginato/quitosana brancas são bastante semelhantes, diferindo apenas pela presença da

banda 676 cm-1 pertencente ao AR. Constata-se, assim, a fraca presença do AR na

superfície das microcápsulas.

Alterações foram observadas nas bandas 1170 – 1130 cm-1, vibrações C-O-N

atribuídas a ligações C-N e O=C-N, indicando uma forte interação entre os grupos

carboxilas do AR e os grupos aminas da quitosana, provavelmente por uma ligação

amida como sugerido por Lira et al., (2007). Esses autores propuseram uma interação

________________________________________________________________Artigo I

52

entre o AR e a quitosana formando retinoatos ou retinoamidas em microparticulas de

quitosana preparadas utilizando tripolifosfato como agente de reticulação. A presença

de AR na superfície pode fazer com que a taxa de encapsulação seja diminuída nas MC

com quitosana com solventes menos polares (etanol) quando comparadas a aquelas sem

o revestimento de quitosana pela possível interação do AR com a quitosana como LIRA

(2007) sugeriu.

Figura 4. Espectros FTIR das microcápsulas de alginato/quitosana com AR (0,5%)

(linha contínua) e sem AR (brancas) (linha tracejada) em comparação com o AR puro

(linha pontilhada). A = alginato, B = quitosana.

4000 3000 2000 1000

0,3

0,6

0,9A

1690

757

1334

131 1

791

530

500

700602

649

833

101 4

952

1092

1067

1132

1154

1 243

1378

1410

1442

1518

1572

1619

1745

1954

2 919

3007

3045

3327

Tra

nsm

itan

ce

(%

)

W ave nu m b ers (cm -1

)

4 0 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0

0 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0 B

1 4 4 7

1 7 3 9

1 6 8 0

1 5 9 2

1 5 0 6

1 3 7 9

1 4 1 4

1 3 3 01 3 0 3

1 2 6 1

1 1 7 81 1 3 6

1 0 8 3

1 0 2 7

9 6 49 0 7

8 3 6

8 2 2

7 5 5

6 9 1

6 4 76 0 1

4 8 5

4 5 7

5 0 6

Tra

nsm

itan

ce (

%)

W a v e n u m b e r s ( c m- 1

)

5 3 0

1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Tra

nsm

ita

nce

(%

)

Wavenumbers (cm-1)

________________________________________________________________Artigo I

53

3.3.4 Estudo do perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir de

microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu

As microcápsulas de alginato preparadas com diferentes concentrações de

quitosana (0,05% - F8 e 0,1% - F11) foram avaliadas no estudo de liberação in vitro e os

resultados obtidos estão apresentados na Figura 5.

As microcápsulas que utilizaram solução de quitosana mais concentrada

resultaram em um perfil de liberação mais sustentado provavelmente devido ao maior

enrijecimento da parede pela reação de crosslinking mais intensa. Esses resultados estão

de acordo com SEZER; AKBUGA (1999a,b) que verificaram que o aumento da

concentração de quitosana afetou as propriedades das partículas obtidas, resultando em

liberação mais controlada.

Aproximadamente 67% do fármaco foi liberado a partir das microcápsulas

preparadas com quitosana a 0,05% e em torno de 45% daquelas preparadas com

quitosana a 0,1% ao final de 48 h. Uma diferença pode ser observada claramente nos

perfis de liberação das duas formulações a partir de 12 h da cinética. Essa liberação

mais controlada obtida será vantajosa para veiculação do ácido retinóico na pele,

diminuindo, provavelmente a irritação cutânea assim como para obtenção de uma

eficácia terapêutica utilizando doses menores. No entanto, a variação experimental foi

elevada (intersecção dos desvios padrões), sendo necessários estudos mais aprimorados

para aplicação de microcápsulas de alginato/quitosana com cavidade interna de óleo de

babaçu como veículo para o ácido retinóico por via tópica.

________________________________________________________________Artigo I

54

Figura 5. Perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das microcápsulas de

alginato/quitosana contendo óleo de babaçu. As formulações utilizadas foram as F11

[AR (0,5%) e Q (0,1%)] e F8 [AR (0,5%) e Q (0,05%)].

________________________________________________________________Artigo I

55

CONCLUSÃO

A utilização da técnica de coacervação complexa com cloreto de cálcio permitiu

a obtenção de microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico e óleo de

babaçu, utilizado como promotor de oclusão da pele evitando assim o ressecamento

causado pelo AR na pele. As microcápsulas obtidas no presente estudo são

economicamente viáveis, sendo de fácil e rápida obtenção e utiliza um componente de

interesse econômico do Nordeste do país, o óleo de babaçu. Pela biocompatibilidade,

baixo custo e alta disponibilidade do alginato e quitosana, as microcápsulas

desenvolvidas podem ser boas candidatas para sistema de liberação controlada do AR

na terapia tópica. Esses sistemas serão reavaliados quanto ao perfil de cinética de

liberação in vitro e permeação cutânea do ácido retinóico para uma futura aplicação

tópica.

________________________________________________________________Artigo I

56

REFERÊNCIAS

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6. Anexos

Artigo II

_______________________________________________________________Artigo II

73

Desenvolvimento e validação de método analítico em CLAE-UV para a

quantificação de ácido retinóico e doseamento em microcápsulas de alginato e

quitosana

Velloso, F. T.1,2, Ferraz, R. S.2, Lira, A. A. M.3, Santana, D. P.1, Santos-Magalhães,

N.S.2*

1Núcleo de Desenvolvimento Farmacêutico e Cosmético, Universidade Federal de

Pernambuco, Recife, Brasil. 2Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami, Universidade Federal de Pernambuco,

Recife, Brasil. 3Laboratório de Desenvolvimento Farmacotécnico, departamento de Fisiologia,

Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão, Brasil.

* Autor para correspondência:

Nereide Stela Santos Magalhães

Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

Grupo de Sistemas de Liberação Controlada de Medicamentos (SLC)

Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)

Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária,

50670-901, Recife, PE, Brazil

Tel: +55-81-21268587; fax: +55-81-21268485

E-mail address: [email protected]

_______________________________________________________________Artigo II

74

RESUMO

O ácido retinóico (AR) tem sido utilizado para o tratamento de acne severa, rugas,

estrias e celulite, no entanto, provoca irritação na pele e sofre rápida degradação quando

exposto à luz e ao calor. Métodos analíticos rápidos para quantificação do AR são,

portanto, necessários para ensaios de cinética de liberação in vitro. Nesse contexto, o

objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método rápido e sensível para o

doseamento do AR em microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu

dispersas em gel natrosol® por cromatografia líquida de alta eficiência associada à

espectroscopia UV e aplicá-lo na avaliação do perfil de liberação in vitro dessas

formulações. As análises foram realizadas em modo isocrático, em comprimento de

onda de 350 nm e utilizando coluna C18 de fase reversa 150 x 4,6 mm (5µm). A fase

móvel foi constituída de metanol e ácido acético 1% (85:15 v/v) com fluxo de 1,8

mL/minuto. A faixa de linearidade do estudo foi de 0,5 a 60 µg/mL (r2 = 0,999). O

método validado mostrou-se sensível, específico, exato, preciso, de baixo custo e o

tempo de retenção do AR foi de 5,8 ± 0,4 minutos sendo, desta forma, mais rápido do

que os relatados na literatura.

Unitermos: validação, CLAE-UV, ácido retinóico, microcápsulas, liberação in vitro.

_______________________________________________________________Artigo II

75

ABSTRACT

All-trans retinoic acid (RA) has been used in the treatment of severe acne, wrinkles,

striae and cellulite. However, it induces skin irritation and rapidly suffers degradation

under light and high temperate exposure. Rapid analytical methods to quantify retinoic

acid are therefore mandatory. In this framework, the aim of this study was to develop

and validate a rapid and responsive method to quantify the RA in microcapsules of

chitosan and alginate containing babassu oil dispersed in natrosol® hydrogel using high

performance liquid chromatography (HPLC). Furthermore this method was used to

quantify in vitro release kinetics of RA from microcapsules. The analyses have been

carried through an isocratic HPLC-UV method at 350 nm using a C18 150 x 4,6 mm

(5µm) reversed-phase column and a mobile phase constituted of methanol and 1%

acetic acid (85:15) at a flow rate of 1.8 mL/min. The linearity range was 0.5-60 µg/mL

(r2 = 0.999). The validated HPLC-UV method was responsive, specific, accurate,

precise, economic and the RA retention time was 5.8 ± 0.4 minutes, being therefore,

faster than that one previously reported.

Keywords: validation, HPLC, all-trans retinoic acid, microcapsules, in vitro release

_______________________________________________________________Artigo II

76

1. INTRODUÇÃO

O ácido retinóico tem como função fisiológica atuar na proliferação e

diferenciação celular, na produção do sebo e na síntese de colágeno (Kligman et al.,

1986). Ele tem sido utilizado em diferentes níveis farmacológicos para o tratamento de

várias disfunções dermatológicas como acne, rugas e distúrbios de queratinização

incluindo psoríase. Recentemente, foi descoberto como útil no tratamento de estrias e

celulite (Shapiro, Saliou, 2001).

Apesar da comprovada eficácia do ácido retinóico, ele apresenta algumas

desvantagens que limitam fortemente a sua utilização, tais como a baixa solubilidade

em água, a instabilidade na presença de luz e oxigênio e a ocorrência de reações de

irritação local tais como eritema, xerose e discreta descamação (Lehman et al., 1988).

As microcápsulas são sistemas de liberação que têm se destacado por

proporcionarem proteção a materiais instáveis, liberação lenta ou sustentada de

princípios ativos e ainda uma liberação sítio-específico (Benita, 2006). As

microcápsulas podem ser alternativas viáveis para veicular ácido retinóico na pele a fim

de minimizar a irritação produzida quando utilizado topicamente, devido a sua liberação

prolongada, além de conferir maior estabilidade à molécula (Dinarvand et al., 2003).

Para avaliar se as microcápsulas são capazes de prevenir os efeitos indesejáveis do AR

na pele é preciso fazer um estudo de permeação e retenção cutânea, porém

primeiramente é necessário estudar seu perfil de liberação in vitro. Na cinética de

liberação in vitro as condições fisiológicas de temperatura, meio de dissolução e

agitação são simuladas a fim de se determinar a capacidade da formulação liberar o

ativo em função do tempo (Berkland et al., 2001).

O grande desafio para a quantificação de fármacos em amostras derivadas de

estudo de cinética de liberação in vitro consiste em reduzir o tempo de análise devido à

elevada quantidade de amostras a serem avaliadas. No caso específico do ácido

retinóico, o armazenamento das amostras e análises de longa duração podem ocasionar

perda de estabilidade ou aparecimento de produtos de degradação, sendo necessário o

desenvolvimento de métodos rápidos, específicos e que permitam a utilização dos

mesmos parâmetros cromatográficos tanto para a análise da forma farmacêutica quanto

para as amostras da cinética de liberação in vitro.

Alguns métodos analíticos estão relatados na literatura para a quantificação de

ácido retinóico em diversas preparações farmacêuticas (Ezpeleta et al., 1996; Brisaert,

_______________________________________________________________Artigo II

77

Plaizier-Vercammen, 2000; Brisaert et al., 2001; Trotta et al., 2003 Lim et al., 2004;

Hwang et al., 2004; Contreras et al., 2005). No entanto, os tempos de retenção são

elevados variando de 7,95 a 18 minutos, o que não é conveniente para a análise do ácido

retinóico visto que este sofre rapidamente degradação quando exposto à luz ou ao calor,

além da grande quantidade de amostras a serem analisadas decorrentes de estudo de

cinética de liberação in vitro.

Fundamentado na revisão dos métodos de quantificação do ácido retinóico por

CLAE-UV em modo isocrático ou gradiente, utilizando na sua grande maioria

acetonitrila como solvente com tempos de retenção igual ou superior a 8 minutos, o

objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método analítico por CLAE-UV

para quantificar o ácido retinóico, de forma rápida e sensível em microcápsulas de

alginato/quitosana contendo óleo de babaçu dispersas em gel natrosol®. O método foi

aplicado para quantificar o ácido retinóico em cinéticas de liberação in vitro.

_______________________________________________________________Artigo II

78

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Reagentes e materiais

Ácido retinóico grau farmacêutico (Purifarma São Paulo, Brasil), alginato,

quitosana e polissorbato 80 (Sigma-Aldrich, St.Louis, USA), etanol (Vetec Rio de

Janeiro, Brasil), ácido acético (Merck Darmstadt, Alemanha), óleo de babaçu (Volp,

São Paulo, Brasil), hexano (Synth, São Paulo, Brasil), metanol grau HPLC (J.T. Baker,

USA), fosfato de potássio monobásico, hidróxido de sódio e cloreto de cálcio grau

analítico (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil), metilparabeno e EDTA dissódico (DEG, São

Paulo, Brasil); Natrosol® e propilenogicol (Codossal São Paulo, Brasil).

2.2. Condições cromatográficas

As análises cromatográficas de quantificação do ácido retinóico foram efetuadas

em cromatógrafo SPD 10 AVP, equipado com detector UV-VIS operando a 350 nm

com bomba LC-10 ADVP e programa LC-10 (Shimadzu, Kyoto, Japão). A separação

foi realizada em coluna C18 de fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 150 x 4,6 mm

(5µm). A fase móvel foi constituída por metanol e ácido acético glacial a 1% (85:15

v/v) com fluxo de 1,8 mL/min e volume de injeção de 20 µL.

2.3. Validação do método analítico para o ácido retinóico

A metodologia analítica foi validada de acordo com a RE 899 de 29 de maio de

2003 – ANVISA (Brasil, 2003).

_______________________________________________________________Artigo II

79

2.3.1. Curva analítica do ácido retinóico

Foi pesado, exatamente, o equivalente a 5 mg de ácido retinóico e dissolvido em 5

mL de metanol (1 mg/mL). Alíquotas desta solução foram diluídas em metanol para

obter concentrações correspondentes a 0,5, 2, 5, 10, 20, 40 e 60 µg/mL. As soluções

foram analisadas por CLAE-UV e os resultados obtidos foram relacionados em um

gráfico da concentração da solução em função da área sob pico. As curvas foram

efetuadas em triplicata (n=3) e uma curva média foi obtida.

2.3.1.1. Linearidade

A avaliação da linearidade do método analítico, ou seja, a proporcionalidade entre

a concentração e a resposta foi efetuada mediante a obtenção de três curvas autênticas,

do cálculo do coeficiente de variação (CV%) entre os pontos da curva e do coeficiente

de correlação linear (r2).

2.3.2. Seletividade

A seletividade do método foi verificada pela análise de possíveis interferentes

experimentais. Dessa forma, foram analisados todos os componentes da formulação a

partir de microcápsulas de alginato/quitosana, contendo ou não fármaco, incorporadas

em gel natrosol®.

2.3.3. Precisão e exatidão

As amostras para avaliação da precisão e exatidão foram preparadas da seguinte

forma: microcápsulas brancas (sem AR) foram impregnadas com quantidades

conhecidas de ácido retinóico. O fármaco foi recuperado através de extração com

hexano e tampão pH 7,4 com sonicação prévia das amostras. Amostras com

concentrações de ácido retinóico de 10, 20 e 30 µg/mL foram injetadas em triplicata

_______________________________________________________________Artigo II

80

(n=3). A exatidão (E %) foi calculada a partir dos erros relativos entre as concentrações

obtida e teórica. A precisão foi calculada a partir do coeficiente de variação (CV%).

2.4 Obtenção das microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico e

óleo de babaçu

As microcápsulas de alginato de sódio e quitosana foram obtidas através da

técnica de coacervação complexa em etapa única (WITTAYA-AREEKUL et al. 2006).

2.5. Estudo de liberação in vitro das microcápsulas

O estudo de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das formulações foi

realizado em células de liberação do tipo FRANZ com área difusional de 1,15 cm2 e

volume de 6 mL, utilizando membranas sintéticas hidrofílicas (ME 25/21 ST, 0,45 µm ±

0,5 µm). O compartimento receptor foi preenchido com tampão fosfato pH 7,4 e etanol

(70:30) em um sistema composto de seis células individuais conectados a um banho

termostatizado à 37°C ± 0,5°C sob agitação constante de 100 rpm por um período de 48

hs. As membranas foram colocadas cuidadosamente entre o compartimento doador e o

receptor de forma que ficassem em contato com a solução receptora. Todas as

membranas foram previamente umedecidas (1 hora antes do experimento) com a

solução receptora. No compartimento doador uma amostra de microcápsulas (0,025%

de AR) incorporadas em gel natrosol® (0,4 g) foi colocada sobre a membrana artificial

de cada célula. Em períodos de tempos pré-determinados todo o líquido do

compartimento receptor foi coletado e imediatamente reposto. O ácido retinóico

liberado foi quantificado em CLAE-UV através do método analítico desenvolvido e

validado previamente.

_______________________________________________________________Artigo II

81

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Validação do método analítico para o ácido retinóico

O desenvolvimento do método analítico envolve a otimização de vários estágios

como a preparação da amostra, a separação cromatográfica e a quantificação.

Parâmetros como a fase móvel, o fluxo, a coluna cromatográfica e o comprimento de

onda de detecção devem ser pré-estabelecidos com critério. A validação do método

analítico é importante porque garante o sucesso da utilização da metodologia

desenvolvida além de detectar erros de procedimento analítico e oferecer evidências

comprovadas da eficiência do método (Causon, 1997).

No presente trabalho, o pico de absorção máxima do ácido retinóico dissolvido em

metanol ocorreu em 350 nm, valor similar àqueles relatados na literatura em 350-352

nm (Brisaert, Plaisier-Vercammen, 2000). Valores ligeiramente diferentes decorrentes

de dissolução, solvatação, pontes de hidrogênio, interação com o solvente e temperatura

podem ocorrer (Berbenni et al., 2001).

3.1.1. Linearidade

Os dados das curvas analíticas autênticas estão representados na Tabela I. A

linearidade da curva analítica na faixa de 0,5 a 60 µg/mL foi obtida a partir do ajuste de

regressão linear (r2= 0,999). Segundo a ANVISA (Brasil, 2003), o coeficiente de

correlação linear deve ser igual ou superior a 0,99. Sendo assim, o valor de r2 obtido na

análise do ácido retinóico pelo método CLAE-UV desenvolvido obedece aos limites

estabelecidos.

_______________________________________________________________Artigo II

82

TABELA I - Dados das curvas analíticas autênticas.

Ácido retinóico (µg/mL)

0,5 2 5 10 20 40 60

1

2

3

Média

DP

CV%

248116

242705

242479

244433

3191

1,31

285914

285003

286280

285732

658

0,23

773357

782991

789302

781883

8030

1,03

1331295

1327976

1321824

1327031

4806

0,36

2669056

2644804

2641697

2651852

14980

0,56

5345501

5334693

5347198

5342464

6783

0,13

7184232

7857837

7860449

7634173

389662

5,10

O cromatograma típico obtido a partir das condições de análise de quantificação

do ácido retinóico está representado na Figura 1. O tempo de retenção para o ácido

retinóico foi de 5,8 ± 0,4 minutos.

_______________________________________________________________Artigo II

83

FIGURA 1. Representação do cromatograma do ácido retinóico obtido por CLAE-UV

a 350 nm. As análises foram realizadas em cromatógrafo SPD 10 AVP com detector

UV-VIS, bomba LC-10 ADVP e programa LC-10 (Shimadzu, Kyoto, Japão). Coluna

C18 de fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 150 x 4,6 mm (5µm) e fase móvel

constituída de metanol e ácido acético a 1% (85:15 v/v) com fluxo de 1,8 mL/minuto e

volume de injeção de 20 µL.

O tempo de retenção do ácido retinóico (5,8 min) encontrado no presente trabalho

com método CLAE-UV modo isocrático foi 2,15 minutos menor em relação ao menor

tempo citado na literatura de 7,95 minutos para um método CLAE-UV modo gradiente

_______________________________________________________________Artigo II

84

(Contreras et al., 2005). Este ganho na diminuição do tempo é bastante significativo

para estudo de cinética de liberação in vitro, onde uma quantidade considerável de

amostras deve ser analisada.

De fato, analisando trabalhos anteriores, o ácido retinóico foi quantificado por

CLAE-UV em nanopartículas de gliadin utilizando fase móvel constituída por metanol e

acetato de amônio10 mM (75:25 v/v) com fluxo de 1,8 ml/min em comprimento de

onda 350 nm. O tempo de retenção do ácido retinóico foi de 8,34 min (Ezpeleta et al.,

1996).

Brisaert e Plaizier-Vercammen (2000) avaliaram a degradação do ácido retinóico

em loção utilizando método CLAE-UV modo gradiente com fase móvel constituída de

metanol, água e ácido acético (75:12,5:1 v/v) variando para acetonitrila, água e ácido

acético (80:20:1 v/v) com a função de separar seus isômeros, sendo o fluxo modificado

de 1,8 para 1 mL/min. O comprimento de onda variou de 320 a 350 nm e o tempo de

retenção obtido para o ácido retinóico foi em torno de 15 minutos em 403 nm.

A estabilidade do ácido retinóico incorporado em lipossomas e sua cinética de

liberação in vitro foi avaliada por CLAE-UV em 350 nm com fase móvel constituída de

acetonitrila e ácido acético a 1% (80:20 v/v) e fluxo de 1 mL/min. O tempo de retenção

do ácido retinóico não foi especificado (Brisaert et al., 2001).

O método isocrático CLAE-UV utilizado por Trotta et al. (2003) teve como fase

móvel acetonitrila, metanol, ácido acético e água (45:40:1:14). O tempo de retenção foi

de 12,3 minutos.

Lim et al. (2004) avaliou a estabilidade do ácido retinóico em nanopartículas. O

método CLAE-UV utilizado teve como fase móvel acetonitrila, metanol e acetato de

amônio a 2,5% (50,6:24,4:25,6 v/v). O comprimento de onda utilizado foi 340 nm,

fluxo de 1 mL/min, e tempo de retenção para o ácido retinóico foi 17,5 minutos. A faixa

de linearidade obtida foi entre 0,1 e 5 µg/mL (r2 = 0,999).

A estabilidade do ácido retinóico foi avaliada em microemulsão através de CLAE-

UV com coluna C18 de fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 250 x 4,6 mm (5µm). A

fase móvel foi composta de acetonitrila, metanol, água com 2,5% de acetato de amônio

(50,6:24,4:25,6 v/v), fluxo de 1 mL/min, volume de injeção 20 µg/mL. A linearidade foi

de 0,1-5 µg/mL (r2 = 0,999) e o tempo de retenção do ácido retinóico foi em torno de 18

minutos (Hwang et al., 2004).

Mais recentemente, Contreras et al. (2005) avaliaram a liberação in vitro do ácido

retinóico a partir de lipossomas incorporados em hidrogel (carbopol®) e de sua forma

_______________________________________________________________Artigo II

85

livre em células de Franz, além de ter avaliado sua permeação em pele abdominal de

rato. O método de quantificação por CLAE-UV utilizado foi em modo gradiente com

fase móvel composta de uma mistura de ácido acético glacial 1,8% pH=3,9 (A) e

metanol (B). O gradiente foi de 85% de B e 15% de A nos 3 primeiros minutos da

corrida, variando para 97% de B e 3% de A entre 3 e 8 minutos e retornando para 85%

de B e 15% de A entre 8 e 10 minutos. O fluxo foi de 1 mL/min e o comprimento de

onda utilizado foi 345 nm. O tempo de retenção para o ácido retinóico foi em torno de

7,95 minutos.

3.1.2. Precisão e exatidão

Os resultados referentes à avaliação da precisão e da exatidão inter e intra-ensaio,

realizada em dias diferentes por analistas diferentes, para o ácido retinóico estão

apresentados nas Tabelas II e III. A ANVISA (Brasil, 2003) recomenda que o CV% e o

E% não excedam 5%. Assim, os valores encontrados atendem aos limites estabelecidos.

TABELA II - Valores obtidos na avaliação da precisão e exatidão intra-ensaio.

Concentração teórica

de AR (µg/mL)

Concentração obtida

de AR (µg/mL)

Precisão

(CV%)

Exatidão

(E%)

10 9,96 0,20 99,64

20 20,10 1,12 100,49

30 29,79 1,52 99,30

TABELA III - Valores obtidos na avaliação da precisão e exatidão inter-ensaio.

Concentração teórica

de AR (µg/mL)

Concentração obtida de

AR (µg/mL)

Precisão

(CV%)

Exatidão

(E%)

10 9,74 3,59 97,43

20 19,66 3,44 98,30

30 28,79 2,59 95,96

_______________________________________________________________Artigo II

86

3.1.3. Seletividade

A seletividade do método é a capacidade de avaliar, de forma inequívoca, as

substâncias em exame na presença de componentes que possam interferir com a sua

determinação em uma amostra. A seletividade avalia o grau de interferência de espécies

como, por exemplo, outros ingredientes ativos, excipientes, impurezas e produtos de

degradação bem como outros compostos de propriedade similares que possam estar

presentes (Brasil, 2003).

Com relação à seletividade do método desenvolvido para análise do ácido

retinóico, não foram observados interferentes em nenhuma das amostras analisadas

(Figura 2), portanto, o método é seletivo para a quantificação do ácido retinóico a partir

das microcápsulas incorporadas em gel natrosol®.

FIGURA 2. Cromatogramas da análise das microcápsulas de alginato/quitosana

incorporadas em gel natrosol® sem fármaco (A) e das microcápsulas de

alginato/quitosana incorporadas em gel natrosol® com fármaco (B) com ácido retinóico

disperso em óleo de babaçu (B).

_______________________________________________________________Artigo II

87

3.2 Aplicação do método validado na avaliação da cinética de liberação in vitro do

ácido retinóico a partir de microcápsulas de alginato/quitosana incorporadas em

gel natrosol®

As microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico disperso em óleo

e babaçu foram preparadas com diferentes concentrações de quitosana (0,05% e 0,1%) e

os resultados da cinética de liberação in vitro estão apresentados na Figura 3.

Aproximadamente 75% do fármaco foi liberado a partir das microcápsulas com

quitosana a 0,05% e apenas 45% daquelas com quitosana a 0,1% em 48 h.

FIGURA 3. Perfil de liberação in vitro do ácido retinóico a partir das microcápsulas de

alginato/quitosana contendo óleo de babaçu.

_______________________________________________________________Artigo II

88

4. CONCLUSÃO

O método CLAE-UV isocrático desenvolvido e validado no presente trabalho foi

simples, seletivo, exato, preciso, mais rápido e econômico do que os métodos propostos

na literatura para a quantificação do ácido retinóico. Além disso, o solvente utilizado na

fase móvel (metanol) é menos oneroso que a acetonitrila utilizada na maioria dos

trabalhos prévios. Este método foi de grande valia para o doseamento do ácido retinóico

a partir de microcápsulas de alginato/quitosana contendo óleo de babaçu dispersas em

gel natrosol®, além de ser específico para a quantificação de amostras oriundas de

estudo de cinética de liberação in vitro sem a necessidade de técnicas adicionais de

extração e com tempo de análise inferior aos da literatura. Este método será importante

para o desenvolvimento e otimização de formulações de hidrogéis contendo

microcápsulas de alginato/quitosana contendo ácido retinóico e óleo de babaçu e para

promover a futura elucidação de seu mecanismo de permeação e retenção cutânea.

_______________________________________________________________Artigo II

89

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