Aplicação de Lipídios na Microencapsulação Produção, Caracterização e Aplicações

Carlos Grosso

Dep. de Alimentos e Nutrição – Fac. de Engenharia de Alimentos UNICAMP – Campinas – São Paulo

grosso@fea.unicamp.br

Florianópolis, 12 a 14 de novembro, 2013

Main purposes of microparticles

Microencapsulation

Core Protection

Controlled Release

Process yield

Efficiency of encapsulation

Release profile

Surface and cross section morphology

Mean size and Size distribution

Microencapsulation

Physical rupture

Temperature

Diffusion

Trigger Mechanisms

Fonte: REINECCIUS, 1995

Dissolution

Biodegradation

Adaptado de: V. Popov; Nanotechology – Food and Cleaning Applications – EFFOST – 2007, Lisboa

Escala de Tamanho

Ativo Parede Ativo Matriz

Estruturas e nomenclatura

(Sistema reservatório) (Sistema monolítico)

PARTÍCULAS

MICROPARTÍCULAS

Microcápsula Microesfera

Alimentos ácidos

Probióticos e Bactérias

Aminoácidos

Ingredientes para Alimentação Animal

Soluções aquosas e alcoólicas

Pigmentos e corantes

Óleos Comestíveis

Minerais e Vitaminas

Enzimas

Frutas, grãos e sementes

Flavors e Óleos Essenciais

Ingredientes Funcionais

Extratos Vegetais

Agentes de fermentação

Ácidos Graxos Essenciais

Aplicação na Industria de Alimentos

Adaptado de Microencapsulation in Food applications – IFT Meeting, 2008 – New Orleans

ESTABILIDADE

PROTEÇÃO/BARREIRA

PERMEAÇÃO/LIBERAÇÃO

. . .

FUNÇÃO NA PARTÍCULA

Materiais de parede

Proteínas Princípio: matriz seca ou úmida

Lipídios Princípio: emulsão, ponto de fusão

Carboidratos Amidos, Gomas, Celulose e derivados

Princípio: matriz seca ou úmida

O recheio é sólido ou líquido?

Hidrofílico ou hidrofóbico?

Tamanho final desejado para a partícula

Quantidade necessária de recheio

Condições de processamento, estocagem, distribuição e consumo

Como deverá ser a liberação do recheio?

Qual método de encapsulação a ser usado?

Adaptado de: Microencapsulation in Food applications – IFT Meeting, 2008 – New Orleans

Questões Críticas!

Produção de

micropartículas por

por spray chilling

Micropartículas Lipídicas

Atomização a frio

Formatação das partículas

Similar ao Spray Drying

Fase contínua são os lipídeos fundidos

Spray Chilling

Micropartículas lipídicas sólidas

Sistemas coloidais de liberação

Emulsões

Lipossomas

Alternativa

(Siekmann and Westesen, 1992; Muller et al, 2000)

Spray Chilling

Processo brando

Capacidade para produzir grande quantidade

Comercialmente viável

Bastante utilizado em nível industrial

Rapidez e segurança

Melhorar a estabilidade ao aquecimento

Retardar a liberação em meio aquoso

VANTAGENS

Spray Chilling

Materiais de parede são bem tolerados

Não apresentam toxicidade aguda ou crônica,

Ativos hidrofílicos ou hidrofóbicos,

Liberação modulada

Excelente estabilidade física,

Produção em grande escala é possível

Flexibilidade quanto ao ajuste do tamanho.

VANTAGENS

Spray Chilling

Produtos hidrofílicos:

como minerais, vitaminas, enzimas,

acidulantes,

Produtos voláteis e sensíveis a altas temperaturas,

Produtos hidrofóbicos:

flavours, óleos essenciais, entre

outros

Spray Chilling

Lipídeos

(Reithmeier et al, 2001).

Fosfolipídeos

Misturas

Ácidos graxos Ceras

Glicerídeos

Ajustar o ponto de fusão da matriz

Diferentes composições de matriz – melhor retenção do ativo

MATERIAIS DE PAREDE

Spray Chilling

A atomização a frio pode ser

dividida nas seguintes

etapas

Spray Chilling

Emulsão/Dispersão

Lipídios com PF de 45ºC a 122ºC

Spray Chilling

Ar

Amostra

Atomização ou aspersão das gotas

Spray Chilling

Contato com o ar frio

Solidificação do lipídeo

Enrijecimento da matriz da parede

T Tfusão

Spray Chilling

Spray Chilling

Sais organicos e inorgânicos

Ingredientes de textura

Enzimas

Aromas, etc

Spray Chilling

Diâmetro médio característico de

produtos atomizados (1 – 100 microns)

São insolúveis em água

Liberação:

quanto maior a

solubilidade do ativo

=

mais pronunciada é a

liberação

(efeito “burst”)

CARACTERÍSTICAS

Spray Chilling

Capacidade limitada de armazenamento do ativo,

Expulsão do ativo durante a estocagem,

Quantidade de ativo superficial.

Limitações

Spray Chilling

Expulsão do ativo

tempo

Redução das regiões amorfas

Transições polimórficas

Carregadores Lipídicos

Nanoestruturados (NLC)

Lípideo sólido + Óleo

Aumentar a capacidade de carga

Minimizar a expulsão do recheio

ALTERNATIVA

Spray Chilling

Ponto de amolecimento – “Melting Point”

método do tubo capilar aberto (Cc 3-25 da AOCS, 1990)

Difração de Raios-X – define a forma polimórfica

Avaliação Calorimétrica (DSC): modificações: físicas,

fracionamento, hidrogenação e interesterificação.

Distribuição de tamanho e diâmetro médio

Morfologia das micropartículas

Eficiência de encapsulação

Perfil de liberação do ativo

Spray Chilling

Caracterização das partículas

Micropartículas lipídicas sólidas contendo compostos hidrossolúveis com diferentes

massas molares: produção, caracterização e perfis de liberação.

H. N. M., Chambi; I. D., Alvim; D. Barrera-Arellano ; C. R. F., Grosso

Materiais

• Ácido esteárico (C18:0, p.f. = 69,6 °C)

• Ácido oléico (C18:1, p.f. = 13,4 °C)

• Ácido láurico (C12:0, p.f. = 44,0 oC)

• D-glicose anidra

• Caseína (proteína : 88,6 ± 2.0%; cinza: 2.51 ± 0.02%; umidade: 11.01 ± 0.08% base seca, material obtido por precipitação ácida)

• Caseína Hidrolisada

• Triesterato de sorbitana (Dhaytan S60, HLB: 2.1)

Proporções de AE/AL e AE/AO • AE/AL 57/43 (w/w, %)

• AE/AO nas proporções 50/50 (w/w, %).

• pontos de fusão em torno de 56,8°C.

Fatty Acid Data Book (Unichema International, 1987).

Caracterização das micropartículas lipídicas sólidas

Eficiência de encapsulação

Diâmetro médio das partículas

Morfologia e distribuição do hidrolisado de caseína nas micropartículas lipídicas

Materiais

1 2 3

16.9 kDa

14.4 kDa

10.7 kDa

8.6 kDa

6.2 kDa

Eletroforese SDS-PAGE da caseína ácida comercial e do hidrolisado de caseína. Coluna 1 – Padrão contendo proteínas de diferentes massas moleculares; coluna 2 - caseína hidrolisada e coluna 3 - caseína comercial.

Resultados

Planejamento experimental fatorial 23 com três pontos centrais e tempos de liberação de 50% da glicose, em água e a temperatura ambiente (T50) e respectivos coeficientes de correlação (R2) obtidos no planejamento experimental.

a p/p; b Mistura lip í dica (AE/AL ou AE/AO, p/p lipidico ); c( Lip í dio/sol glicose, p/p), d (p/p lip í dico ),

Vari á veis Resposta

Ensaios Sol. Gli .

(%) a Lip

b /Sol. gli

c Surfactante (%)

d T50 (min)

Este á rico/ Laurico Este á rico/Ol é ico

1 50 70/30 3,0 5,8 (0,986) 21,4 (0,973)

2 50 70/30 7,0 29,5 (0,980) 44 ,7 (0,943)

3 50 90/10 3,0 2,2 (0,967) 27,7 (0,975) 4 50 90/10 7,0 20,9 (0,957) 44,7 (0,912)

5 70 70/30 3,0 3,6 (0,967) 12,3 (0,967)

6 70 70/30 7,0 5,4 (0,979) 16,2 (0,979)

7 70 90/10 3,0 2,2 (0,977) 34,7 (0,954)

8 70 90/10 7,0 9,5 (0,979) 20,4 (0,958)

9 60 80/20 5,0 5,3 (0,986) 131,8 (0,921)

10 60 80/20 5,0 4,0 (0,965) 123,0 (0,929)

11 60 80/20 5,0 8,3 (0,976) 128,0 (0,925)

a p/p; b Mistura lip í dica (AE/AL ou AE/AO, p/p lipidico ); c( Lip í dio/sol glicose, p/p), d (p/p lip í dico ),

Vari á veis Resposta

Ensaios Sol. Gli .

(%) a Lip

b /Sol. gli

c Surfactante (%)

d T50 (min)

Este á rico/ Laurico Este á rico/Ol é ico

1 50 70/30 3,0 5,8 (0,986) 21,4 (0,973)

2 50 70/30 7,0 29,5 (0,980) 44 ,7 (0,943)

3 50 90/10 3,0 2,2 (0,967) 27,7 (0,975) 4 50 90/10 7,0 20,9 (0,957) 44,7 (0,912)

5 70 70/30 3,0 3,6 (0,967) 12,3 (0,967)

6 70 70/30 7,0 5,4 (0,979) 16,2 (0,979)

7 70 90/10 3,0 2,2 (0,977) 34,7 (0,954)

8 70 90/10 7,0 9,5 (0,979) 20,4 (0,958)

9 60 80/20 5,0 5,3 (0,986) 131,8 (0,921)

10 60 80/20 5,0 4,0 (0,965) 123,0 (0,929)

11 60 80/20 5,0 8,3 (0,976) 128,0 (0,925)

Resultados

Eficiências de encapsulação e diâmetros médios para micropartículas lipídicas contendo glicose obtidas segundo o planejamento experimental.

a M é dia ± desvio padrão.

Eficiência de encapsula ç ão ( % ) Diâmetro ( m m) a

Ensaios AE/AL AE/AO AE/AL AE/AO 1 100 100 15,4 6,6 23,2 8,3 2 100 82,9 21,0 9,2 24,4 7,9 3 77,6 95,6 21,4 10,5 17,2 6,5

4 91,1 100 17,9 6,8 16,7 5,4 5 100 76,4 13,5 6,1 15,8 8,0 6 100 100 17,2 9,2 14,7 7,1 7 99,6 100 16,6 10,6 12,6 6,8 8 100 99,6 14,5 7,5 15,9 8,4 9 96,0 99,5 15,1 8,6 16,1 8,8

10 94,0 95,2 12,3 6,4 13,8 8,7 11 100 96,6 13,0 6,7 16,8 8,3

a M é dia ± desvio padrão.

Eficiência de encapsula ç ão ( % ) Diâmetro ( m m) a

Ensaios AE/AL AE/AO AE/AL AE/AO 1 100 100 15,4 6,6 23,2 8,3 2 100 82,9 21,0 9,2 24,4 7,9 3 77,6 95,6 21,4 10,5 17,2 6,5

4 91,1 100 17,9 6,8 16,7 5,4 5 100 76,4 13,5 6,1 15,8 8,0 6 100 100 17,2 9,2 14,7 7,1 7 99,6 100 16,6 10,6 12,6 6,8 8 100 99,6 14,5 7,5 15,9 8,4 9 96,0 99,5 15,1 8,6 16,1 8,8

10 94,0 95,2 12,3 6,4 13,8 8,7 11 100 96,6 13,0 6,7 16,8 8,3

Resultados

Porcentagem de proteína liberada para as misturas lipídicas AE/AL e AE/AO. CH: caseína hidrolisada; CC: caseína comercial; T3: tratamento 3

(tabela 1); T9: tratamento 9

Os valores apresentados ao lado das barras no gráfico representam a média de três repetições (desvio padrão).

24,6

(1,6)

43,6(1,2)

0,0(0,0)

29,3(3,7)

49,4(0,5)

58,4(0,2)

6,1(1,0)

55,2(3,2)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CH(T3) CC(T3) CH(T9) CC(T9)

Fonte protéica (Tratamento)

AE/AL AE/AO

Pro

teín

a Li

be

rad

a (%

)

Resultados

MEV: Micropartículas Lipídicas (contendo hidrolisado de caseína) a e b - Mistura lipídicas AE/AL c e d – Mistura lipídicas AE/OL

barras = 10 µm

A B

C D

Resultados

Microscopia confocal Micropartículas lipídicas contendo caseína

hidrolisada (matriz AE/AL)

Nile Red

FITC

sobreposição

Resultados

Micropartículas lipídicas encapsuladas por gelificação iônica

R. Mukai-Corrêa ; C. R. F., Grosso

Materiais

•Gordura extraída de Pacu (Piaractus mesopotamicus); •Ácido esteárico (C18:0, p.f. 69,6 °C,); •Alginato de sódio; •Goma gelana; •Pectina cítrica (BTM) amidada; •Cloreto de cálcio dihidratado; •D- glicose anidra; • Isolado protéico de soro de leite; •Monoestearato de sorbitana, triestearato de

sorbitana, poliglicerol polirricinoleato

Ponto de fusão das misturas de gordura de peixe (GP) e ácido esteárico (AE).

S= Sólido; L= Líquido

Temperatura (° C)

25 35 40 45 50

70:30 S S S S L 80:20 S S L L L 90:10 S L L L L

GP: AE (%)

Planejamento experimental (variáveis numéricas e codificadas) e respostas de eficiência de encapsulação (E.E) e liberação após 60 minutos (LIB60’), para avaliação da produção de micropartículas lipídicas contendo glicose

* Os números entre parênteses representam as variáveis codificadas.

Variáveis * Respostas

Ensaio GLY (%) LIP/GLY (%)

E.E. (%) LIB60’(%)

1 80(+1) 60/40 (+1) 93,89 65, 25 2 80(+1) 80/20 ( - 1) 97,85 41,11 3 50 ( - 1) 60/40 (+1) 98,43 33,53 4 50 ( - 1) 80/20 ( - 1) 100,00 26,75 5 65 ( 0 ) 70/30 ( 0 ) 97,55 13,70 6 65 ( 0 ) 70/30 ( 0 ) 96,10 15,57 7 65 ( 0 ) 70/30 ( 0 ) 96,10 11,69

Planejamento experimental (variáveis numéricas e codificadas) e respostas de eficiência de encapsulação (E.E) e liberação após 60 minutos (LIB60’),para avaliação da produção de micropartículas lipídicas contendo proteína.

Os números entre parênteses representam as variáveis codificadas

Variáveis * Respostas

Ensaio WPI (%) LIP/WPI (%) E.E. (%) LIB60’(%)

1 40(+1) 70/30 (+1) 100,00 59,11

2 40(+1) 90/10 ( - 1) 81,99 22,08

3 8 ( - 1) 70/30 (+1) 87,20 44,36

4 8 ( - 1) 90/10 ( - 1) 94,41 28,50

5 24 ( 0 ) 80/20 ( 0 ) 97,23 76,48

6 24 ( 0 ) 80/20 ( 0 ) 93,13 86,97

7 24 ( 0 ) 80/20 ( 0 ) 93,49 87,51

Valores médios e respectivos desvios padrões de eficiência de encapsulação dos compostos hidrofílicos (EE). sólidos totais e diâmetros médios (mm) dos sistemas geleificados contendo micropartículas (MP) ou emulsão lipídica (EM) com glicose (GLY) ou proteína (WPI).

Sistema Tratamento EE (%)

Sólidos totais

(%)

Diâmetro m édio ( m m)

GLY - MP 47,9 ± 6, 5 5,4 ± 0, 6 296,2 ± 199,2 GLY - EM 1, 2 ± 0,2 5 , 0 ± 0, 3 145,8 ± 1 18,8 WPI - MP 67,8 ± 7, 6 5,2 ± 0, 3 330,4 ± 196,9

PECTINA

WPI - EM 63, 9 ± 1, 9 5,1 ± 0, 1 273,9 ± 200,1

GLY - MP 62,7 ± 7,3 5,1 ± 0,2 164,6 ± 145,8

GLY - EM 3, 7 ± 0,2 5, 5 ± 0, 2 161,7 ± 147,7

WPI - MP 70, 6 ± 5,2 4, 4 ± 0,4 149,1 ± 111,3 PE/GE/AL

WPI - EM 74, 7 ± 2, 4 5,2 ± 0,0 2 155,8 ± 118,3

A

10 m m

B

10μm

Microscopia ótica das micropartículas lipidicas. A – conteúdo de glicose; B – conteúdo de proteína. Aumento de 12,5x (barra = 10µm)

Micropartículas gelificadas com pectina: matriz com micropartículas lipídicas contendo proteína

Micropartículas gelificadas de pectina: matriz contendo mistura lipídica com proteína

500x 10 kV 10µm500x 10 kV 10µm 500x 10 kV 10µm500x 10 kV 10µm

mistura lipídica com proteína mistura lipídica com glicose

MEV de micropartículas gelificadas com pectina

pectina/ gelana/ alginato

pectina

Emulsão lipídica

0 50 100 150 200 2500

10

20

30

40

50

gly

wpi

wpiEM

Lib

era

çã

o (

%)

Tempo (minutos)

0 50 100 150 200 2500

10

20

30

40

50

gly

wpi

wpiEM

Lib

era

çã

o (

%)

Tempo (minutos)

A – sistema com pectina; B - sistema com pectina/gelana/alginato.

B A

Liberação (%) da glicose (gly) e da proteína (wpi), retida em micropartículas lipidicas ou em emulsão lipídeo+proteína (wpi-EM), encapsuladas em matrizes de gel, úmidas.

Material Characterization

Low Metoxyl Amidated Pectin (CP Kelco – Limeira, BR)

81.3 ± 1.2% galacturonic acid, 30.4 ± 1.6% sterification degree 10.4 ± 1,0% amidation degree.

Sodium Alginate (Manugel DMB, FMC – Campinas, BR)

Protein content: 80.5 ± 0.3% Moisture content: 7.2 ± 0.3%

Lipids: 7.6 ± 0.3% Ash: 3.9 ± 0.1%

Model Oil 16:0 (palmitic) – 10.04%, 18:0 (stearic) – 5.13%, 18:1

(oleic) – 20.17%, 18:2 (linoleic) – 50.68%, 18:3 (linolenic) – 10.18%

Material Characterization

Whey protein concentrated (WPC, Arla Foods – Cordoba, AR)

Protein content: 80.5 ± 0.3% Moisture content: 7.2 ± 0.3%

Lipids: 7.6 ± 0.3% Ash: 3.9 ± 0.1%

White Egg – Ovalbumin (Saltos Alimentos – Salto, BR)

Protein content: 90.5 ± 0.8% Moisture content: 6.7 ± 0.4%

Lipids: 0.40 ± 0.06% Ash: 5.0 ± 0.1%

WPC – b-lactoglobulin ( 50%)

MW - 18.3 kDa 162 aa residues One Thiol group

Two disulfide bonds Resistant to proteolysis by gastric proteases

White Egg - Ovalbumin (50 – 65%)

MW - 45 kDa 365 aa residues Four Thiol group

One disulfide bonds Monomeric phosphoglycoprotein

Globular Proteins

Methods

Emulsion: 2% LMAP or 2% Alginate, 1,65% sun flower oil (w/w solution) 14,000 rpm/3 min

Double fluid atomizer, calcium chloride solution 2%, 30 min (hardening time).

Particle Production

Particle Recovering

2, 4, 6 and 8 % of protein in solution, 30 min

Methods

Morphology: Optical Microscopy and SEM

Mean Size: Light scattering (Mastersizer)

Calcium content and real density

Protein and moisture content (AOAC, 2006)

Confocal microscopy and electrophoresis

Particle Characterization

Zeta potential o f solutions: Zetasizer Nano-Z

Peroxide values – stability during 28 days at 45 oC

3 4 5 6 7

-40

-20

0

20

40

OVA

OVA WPC (1:1)

WPC

Zeta

Pote

nti

al

(mV

)

pH

Results – Zeta Potential

3 4 5 6 7

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

Zet

a P

ote

nti

al (

mV

)

pH

ALG + OIL

ALG

3 4 5 6 7

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

Zet

a P

oten

tial

(m

V)

pH

PEC + OIL

PEC

Results – Calcium content (DB) and density

Ppectin – 1.435 ± 0.02 mmol Ca/mg of particles (d.b.)

Palginate – 2.475 ± 0.01 mmol Ca/mg of particles (d.b.)

Ppectin – 1.097 ± 0.006 g/cm3

Palginate – 1.214 ± 0.007 g/cm3

Results – oil stability

CP Kelco e FMC pela doação dos polissacarídeos

A todos os alunos que contribuíram para este trabalho

A Yara Fagnani pelas microscopias

A Organização do evento pela oportunidade

E

Aos presentes pela audiência

Agradecimentos