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Desenvolvimento de novas leveduras para o desafio da fermentação alcoólica

Osmar Vaz de Carvalho Netto

[email protected]

Laboratório de Genômica e ExpressãoInstituto de Biologia - UNICAMP

V Semana de Fermentação Alcoólica - Jayme Rocha de Almeida

Alterar características genéticas da linhagem

Banco de linhagens com características desejáveis

Desenvolvimento de linhagens utilizadas para produção de etanol geneticamente melhoradas

Levedura Saccharomyces cerevisiae

Estrutura do DNA elucidada em 1996

Science, 1996

Introdução

EtanolCana de açúcar

Cerveja

Vinho

Pão

Massa

Uva

Malte

Processos biológicos de Saccharomyces cerevisiae

Estratégia da produção de etanol

S. cerevisiae Piskur, Trends in GeneticsVol.22 No.4 April 2006.

Processo pouco eficiente(energético)

Glicose reprime respiração Etanol

Glicose

Habilidade de produção eresistência

Evolução das leveduras

As linhagens desenvolveram estruturas especializadas para

fermentar

- Física (estrutura e organização da célula)

- Genética (DNA e proteínas)

DNA

RNA

Proteína ADH1

Estrutura genética

~ 6000 genes

~ 6000 proteínas

Metabolismo:

Estrutura: CWP2 Manoproteína, principal constituinte da parede celular

Acetaldeído Etanol

ADH1

Regulação: SPT15 Fator que promove a ativação de outros genes

Funções das proteínas

Estímulo para ativar a produção da proteína

AçúcarEtanol

Temperatura

Como as proteínas são produzidas no momento certo?

RNA

Expressão gênica

Proteína

Vias metabólicas de S. cerevisiae

Formas de manipulações genéticas de leveduras

Identificação de uma linhagem com

características de interesse e transferência das

informações para outras linhagens e/ou

manipulação direta

Engenharia metabólica reversa

Engenharia metabólica aleatória Modificações generalizadas e identificação das

linhagens com as características de interesse

Engenharia evolutiva Cultivo constante sob estresse e seleção

de linhagens

Engenharia metabólica direta Mudanças específicas em regiões conhecidas

de interesse

Exemplo de manipulação de leveduras de vinho

Etanol

Glicerol

Metabolic EngineeringVol. 9 (4), Pages 364-378

SaúdeLei seca

Melhora o corpo do vinho

Exemplo de manipulação de leveduras de cerveja

MET14SSU1

Aumento da expressão gênica

Antioxidante

Preserva o sabor da bebida

Exemplos de manipulação de leveduras para etanol celulósico

CeluloseHemicelulose Glicose

XiloseArabinose

Ha et al., 2010. PNAS, v.108, n.2

Características da produção de etanol no Brasil

Reciclo de células durante toda a safra

Caldo de cana-de-açúcar não é estéril

Grande quantidade de contaminantes, competição dinâmica

A maioria dos contaminantes não possui características de

fermentação desejáveis

Seleção de linhagens diretamente das Usinas a partir dos anos 90

PE-2 é uma das mais adotadas e adaptadas ao processo fermentativo

Linhagens selecionadas

Linhagens selecionadas

Características desejáveis:

- Alto rendimento e produtividade

- Vigor durante o processo fermentativo

Adaptado de Basso et al., 2008.

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

Popu

laçã

o de

cél

ulas

(%)

Dias

PE-2

Outras linhagens

Manipulação e estudo de linhagens

Nós acreditamos que esta linhagem pode ficar ainda melhor através de

manipulações genéticas pontuais

Linhagens estudadas : laboratório

importância clínica

diferentes origens tecnológicas (cerveja, vinho)

Não possuem aplicação direta!

Obstáculos

Caracterização genética de linhagens

Qualquer trabalho de manipulação genética de determinada

linhagem deve ser precedido por um estudo detalhado sobre

a estrutura, organização e controle

do genoma

Passo 1: Caracterização da composição e estrutura do genoma de PE-2

Passo 2: “Domesticação” de linhagem PE-2

Passo 3: Caracterização da expressão gênica de PE-2 durante a fermentação

Passo 4: Desenvolvimento de linhagens derivadas de PE-2 geneticamente melhoradas

Etapas do desenvolvimento de linhagens melhoradas(baseadas em PE-2)

Forneceu informações para estudos de expressão e manipulação gênica

Genome Res. 2009 Dezembro; 19 (12): 2258–2270.

Primeiro passo: caracterização da composição eestrutura do genoma de PE-2

Plasticidade para variar o número e a

organização dos genes

Região central conservada

Região periférica variável

Características do genoma de PE-2

Novo gene

Produção de novas proteínas


Linhagem de laboratório

PE-2

Duplicação

Produção de proteínas em quantidades maiores



PE-2

Alteração do gene

Produção de diferentes proteínas



PE-2

Alteração no estímulo

Produção de uma mesma proteína sob diferentes estímulos



PE-2

Segundo passo: “domesticação” de PE-2

Objetivos:

- Facilitar a manipulação genética da linhagem

- Utilizar marcas da própria linhagem

- Ser o mínimo invasivo o possível

Transformação (manipulação) de leveduras

Geneticina Nova característica

+

Nova característicaGeneticina

Nova característica Gene repórter Geneticina

Meio de cultivo com antibiótico

PE-2 URA3GEA2 TIM9

GEA2 TIM9PE-2 domesticada

Segundo passo: “domesticação” de PE-2

GEA2 TIM9

Meio semUracila

Meio semUracila

GEA2 TIM9URA3 Nova característica

+URA3 Nova característica

Gene repórter

Passo 1: Caracterização da composição e estrutura do genoma de PE-2 (Finalizado)

Passo 2: “Domesticação” de linhagem PE-2 (Finalizado)

Etapas do desenvolvimento de linhagens melhoradas(baseadas em PE-2)

- Determinar em que quantidade e momento os genes são ativados

durante a fermentação

- Selecionar genes e ativadores para serem urtilizados nos estudos de

manipulação genética

Terceiro passo: objetivos do estudo

Início: pressão osmótica

Final: toxicidade de etanol

0

4

8

12

16

20

1 4 7 10 12 15

Conc

entr

ação

(%)

Horas

Açúcar

Etanol

900 m3

Usina Nova AméricaMaracaí-SP

Coleta das amostras e identificação da quantidade de proteína produzida

Determinar o número de RNAs de cada gene

RNA-Seq

Fermentação industrial

6 pontos: começo ao fim0

4

8

12

16

20

1 4 7 10 12 15Co

ncen

traç

ão (%

)

Horas

Açúcar

Etanol

DNA

RNA

Proteína

Exemplos de valores de expressão gênica

C4 A1 R3

Seqs mapeadas: 50 Seqs mapeadas: 500Seqs mapeadas: 5

Início da fermentação: 2 horas de processo

100 X >

10 X > R3 C4

A1

Nível de expressão do gene R3 varia 10 vezes ao longo da fermentação

R3R3

Seqs mapeadas: 50Seqs mapeadas: 500

Início da fermentação – 2 horas Final da fermentação – 15 horas

Passo 4: Desenvolvimento de linhagens derivadas

de PE-2 geneticamente manipuladas

Sabemos onde os genes e as regiões regulatórias estão localizadas

Temos uma linhagem preparada para receber as informações de interesse

Temos as informações de interesse

Primeira fase do desenvolvimento das linhagens

Alguns genes são regulados em resposta a condições de estresses

Etanol- +

5 50 500 1000

Número de RNAs:

Nesta situação, se a expressão de um gene específico de resposta a

estresse está aumentando, ele deve estar protegendo a célula contra

os danos causados pelo estresse

O que aconteceria com a pré-ativação da expressão desse gene

antes do estresse ser sentido pela célula?

Genes regulados em resposta a estresse - Hipóteses

Etanol- +

Seleção de alguns genes de interesse

10

100

1000

10000

100000

1 4 7 10 12 15

RPKM

(Log

10)

Tempo (horas)

R3

G1

D2

H2

T2

H1

Y6

Y4

M1

N4

Inicialmente, 10 genes foram selecionados

Variação da quantidade de proteína: 2 a 96 vezes

Estes genes foram selecionados para serem utilizados em ensaios de

manipulação visando a alteração do padrão de expressão gênica

1- Aumentar a quantidade de proteína produzida

2- Ativar a produção antes da levedura sentir o estresse

Quais ativadores utilizar?

Seleção de alguns genes de interesse

Valor constante durante a fermentação

Diferentes níveis de valor entre os ativadores selecionados

Seleção dos ativadores

Valor médio

26180

13060

10790

6170

1640

730

465

10

100

1000

10000

100000

1 4 7 10 12 15

RPKM

(Log

10)

Tempo (horas)

S1

A1

F1

T1

C4

P1

I2

10

100

1000

10000

100000

1 4 7 10 12 15

RPKM

(Log

10)

Tempo (horas)

R3

G1

D2

H2

T2

H1

Y6

Y4

M1

N4

Estratégia para alteração dos ativadores

KanMX4 pC4Produto alvo

DNA original H2

KanMX4 pC4 H2DNA com a regiãoativadora alterada

Gene repórter

Região ativadora

+

Alteração da quantidade de proteína produzida

30 linhagens: 10 genes / 3 diferentes ativadores cada

Expressão gênica esperada

KanMX4 pC4 H2 Elevada

KanMX4 pT1 H2 Bem elevada

KanMX4 pA1 H2 Altamente elevada

Ensaios de competição

30 linhagens alteradas (marcadas com antibiótico Kan)

Caldo de cana de açúcar (18%) a 30C

YPD+Kan YPD

400 800

Razão = 0.5Razão: Colônias resistentes a Kan (400)Total de colônias (meio rico) (800)

Inóculo inicial: ~50% cada

X PE-2 + KanMX4 pT1 H2

Ciclo 1

0.5% 0.5% 0.5% 0.5%

Ciclo 5

0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5%

Ciclo 10

0.5%

Diainicial

Ensaios de competição

X PE-2 + KanMX4 pT1 H2

Ensaio de competição – controle

X

Razão: Colônias resistentes a Kan

Total de colônias (meio rico)

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10

Razã

o

Ciclo

Parental vs. Parental+Kan

PE-2 PE-2 KanMX4+

Vigor de crescimento durante a competição

Efeito negativo: 5 de 30

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10

Razã

o

Ciclo

Y4 pT1

H2 pT1

Efeito neutro: 16 de 30

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10

Razã

o

Ciclo

H1 pC4

D2 pS1

Efeito positivo: 9 de 30

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10

Razã

o

Ciclo

R3 pS1

H2 pC4

Linhagens com efeito neutro ou positivo

Etanol Açúcar Temperatura

30C

34C

37C

40C

17%

23%

20%

26%

15%

19%

17%

21%

Ensaios de tolerância a estresses: XPE-2 Modificada

Ensaios fermentativos para as linhagens com efeitoneutro ou positivo (perspectivas)

0

15

30

45

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Etan

ol (g

/L)

Horas

PE-2

LGE1

0

15

30

45

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Etan

ol (g

/L)

Horas

PE-2

LGE2

0

15

30

45

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Etan

ol (g

/L)

Horas

PE-2

LGE3

0

15

30

45

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Etan

ol (g

/L)

Horas

PE-2

LGE4

Tolerância a estresses

Desempenho fermentativo

=

=

Características desejadas das linhagens desenvolvidas

LGE2

LGE3

LGE6

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

Popu

laçã

o de

cél

ulas

(%)

Dias

PE-2

Outras linhagens

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200

Popu

laçã

o de

cél

ulas

(%)

Dias

PE-2 derivada

Outras linhagens

76% 90%

Aumento da

produção!

- Vigor

- Rendimento

- Produtividade

Vantagem das linhagens desenvolvidas (perspectivas)

- Cultivo de 6000 leveduras individuais

- Coleta de amostras

- Detecção de compostos presentes no meio

(etanol, sacarose, glicerol, entre outros)

- Seleção por competição (Engenharia Evolutiva)

Sistema automatizado paracultivo de leveduras

Dornas com alta concentração de açúcares

Condição típica Dornas em temperaturas elevadas

Leveduras floculadas

X

Outras condições analisadas

Leveduras floculadasCondição típica X

Dornas em temperaturas elevadasCondição típica X

Dornas com alta concentração de açúcaresCondição típica X

A

B

C

PE-2 CAT-1 Linhagem específica da Usina

Linhagens de interesse para melhoramento genético

- Novas linhagens selecionadas

- Linhagens de outros processos

(vinho, cerveja, cachaça ...)

- Adicionar novas características em

linhagens previamente melhoradas

(PE-2, CAT-1)

Agradecimentos

Prof. Lucas Argueso

Prof. Gonçalo Pereira

Marcelo CarazzolleLuciana Mofatto

Aline RodriguesMarina PessoaNádia SampaioPedro Tizei

Paulo TeixeiraFelipe GalzeraniSílvio AndriettaMaria da Graça Andrietta

Osmar Vaz de Carvalho Netto – [email protected]

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