desafios e perspectivas no diagnóstico laboaratorial das rickettsioses

Desafios e Perspectivas no Diagnóstico Laboratorial das

Rickettsioses

Laboratório de Referência Nacional para Rickettsioses Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses

Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ

Daniela Tupy de Godoy, DSc, MV.

Campinas, 11 de outubro de 2013

Quarta-feira, 16 de Outubro de 13

FEBRE MACULOSA BRASILEIRA


Febre Maculosa Brasileira

1) Doença curável

Evolução terapêutica com excelente resposta tratamento, com a introdução da tetraciclina e posteriormente doxiciclina (considerada droga de 1a escolha)

2) Elevada letalidade

DesconhecimentoRetardo tratamentoDiagnóstico de Exclusão



3) História epidemiológica

Contato com carrapatos

4) Sempre considerar:

Em caso de febre, cefaléia, mesmo sem exantema, desde que existam dados clínico-epidemiológicos compatíveis

5) Outras rickettsioses “sensu lato”

Bartoneloses, febre Q, ehrlichioses, rickettsioses do grupo do tifo e outras rickettsias.


Desafios

1. Diagnóstico diferencial com dengue, leptospiroses, malária, entre outras doenças;

2. Falta de atenção e/ou inadequada utilização dos testes diagnósticos

3. Qualidade das amostras recebidas

4. Pacientes negros

5. Caracterização molecular (escassez)

6. Ecotourismo

7. Novos “agentes”


Diagnóstico Laboratorial Específico


Diagnóstico Laboratorial Específico

Isolamento Técnica suspensa – necessidade de laboratório NB3

Testes sorológicos Detecção de anticorpos Diagnóstico retrospectivo - fase aguda sem anticorpo detectável Gênero específico

Histopatológico associado à imunohistoquímica

Testes moleculares PCR convencional, nested, touchdown PCR em tempo real


Testes sorológicos

Padrão Ouro!!

Diagnóstico retrospectivo

• Amostras pareadas

• P - 1:64

• Aumento de 4x nos títulos de Ig


PCR convencional

Alvos:

gltA – citrate synthase

ompA – outer membrane protein A

ompB – outer membrane protein B

17kDa – rickettsial genus–specific 17-kDa antigen gene


PCR convencional

Alvos:

gltA – citrate synthase

ompA – outer membrane protein A

ompB – outer membrane protein B

17kDa – rickettsial genus–specific 17-kDa antigen gene

100% Sensibilidade


Surto Itaipava – RJ2005

Laboratório A B C D E

Paciente F, 36 M, 41 M, 58 M, 61 F, 38

Leucócitos 5.700 SD 3.400 15.400 1.600

Plaquetas 66.000 36.000 20.000 98.000 32.000

RX tórax SD IIB IIB IIB IIB

Amostra 1 N (15/10) N (20/10) N (26/10) N (27/10) N (31/10)

Amostra 2 P (3/11) P (31/11) SD P N*

PCR Amostra esgotada

Amostra esgotada

P P P

Óbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostraÓbito/ IIB: Infiltrado Intersticial Bilateral/ SD: Sem dados/ P: Positivo/ N: Negativo/ * 4º amostra


Imunohistoquímica

Caso fatal de FMB

Mulher, 37 anos

Biópsia de pele e espécimes da autópsia.


Outras rickettsioses


PCR convencional

Gênero Ehrlichia/Anaplasma

rrs (16S rRNA) e groESL (heat shock operon)

Gênero Bartonella

16S rRNA, região intergênica 16S -23S rRNA (ITS), gltA, riboflavina sintase (ribC), groEL, FtsZ, subunidade beta da RNA polimerase (rpoB). Nested – proteína 31-kDa (Pap31)

Coxiella burnetii

IS1111 transposase (também conhecido como htpAB)


Multiplex PCR

Rickettsia sp + Ehrlichia sp + Anaplasma sp

Vigilância epidemiológica:

• Co-infecção

• Seres – humanos

• Animais


Perspectivas no Diagnóstico Laboratorial


PCR em Tempo Real

Kato et al., 2013


Rickettsia spPanR8_FPanR8_RPanR8_P

Rickettsia rickettsiiRRi6_FRRi6_RRRi6_P


PCR em Tempo Real

Kato et al., 2013


Rickettsia spPanR8_FPanR8_RPanR8_P

Rickettsia rickettsiiRRi6_FRRi6_RRRi6_P

Sequenciamento

R. conorii conoriiR. parkeriR. felis


PCR em Tempo Real

Schneeberger et al., 2010/ Buss et al., 2012/ Diaz et al., 2012

Gênero Bartonella

Alvo gltABartGltAF

BartGltAR1/BartGltAR2 BartGltaP

Alvo ssrAssrA-F ssrA-RssrA-P

Coxiella burnetii

Cox_FCox_RCoxbur


PCR em Tempo Real

Plataforma de Desenvolvimento de Tecnologia e Insumos para Saúde – PDTIS

Fundação Oswaldo Cruz

Point of Care

➟ “Lab on a chip” - miniaturização.

- microfluídica.

Análise patentária


Aptâmeros

Aptâmeros são pequenos oligonucleotídeos de cadeia simples (tipicamente 15 - 50 bases) que assumem conformações estáveis “in vivo” e se ligam fortemente aos alvos específicos de proteína ou não proteína.


Aptâmeros

Tem sido demonstrado que aptâmeros possuem afinidade e especificidade de forma superior para o alvo pretendido do que outros ligantes.

Geralmente os aptâmeros proporcionam uma maior sensibilidade em reconhecer os seus alvos de proteína, oferecendo assim, potencial para a concepção de ensaios diagnósticos específicos mais sensíveis, capazes de proporcionar diagnóstico precoce

2013 – Projeto aprovado


International Journal of Tropical Disease & Health


Obrigada

Dra Elba R S Lemos

[email protected] do Laboratório

Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses

Dra Daniela Tupy de Godoy

[email protected] Visitante

Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses


mailto:[email protected]




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