delimitaÇÃo dos grupamentos serotoninÉrgicos/nÚcleos da ... · décadas depois, com base em...
TRANSCRIPT
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
DELIMITAÇÃO DOS GRUPAMENTOS
SEROTONINÉRGICOS/NÚCLEOS DA RAFE DO MOCÓ (Kerodon
rupestris): CITOARQUITETURA E IMUNOISTOQUÍMICA PARA
SEROTONINA
NATAL-RN
2010
2
JOACIL GERMANO SOARES
DELIMITAÇÃO DOS GRUPAMENTOS
SEROTONINÉRGICOS/NÚCLEOS DA RAFE DO MOCÓ (Kerodon
rupestris): CITOARQUITETURA E IMUNOISTOQUÍMICA PARA
SEROTONINA
Dissertação de Mestrado submetida ao
Programa de Pós-graduação em
Psicobiologia da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, como pré-requisito
para obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Miriam Stela M O Costa
NATAL-RN
2010
3
4
AGRADECIMENTOS
Nada no mundo seria possível sem a grande contribuição de nossos Pais, o meu
agradecimento e reconhecimento a Alzira Germano e Moacir Quintino, por todos os
ensinamentos e por sempre colocar o conhecimento e os estudos em primeiro lugar, essa é
a herança que levo pro resto de minha vida;
A minha grande companheira e esposa Dora, teus olhos vão alem do horizonte e
me guiam por esse mundo cheio de perturbações, sinceramente não sei o que seria de mim
sem você. Te amo muito;
A meus irmãos Júlia, Jáder, Janete, Jocélia e Juarez que sempre se mantêm unidos
e apoiando uns a os outros, muito obrigado pela colaboração;
A equipe da S.O.S Animais pela compreensão das ausências e principalmente a
Dra. Ademilde pela cobertura e apoio durante esse período;
A Professora Miriam Stela pela paciência, dedicação a neuranatomia – o que
particularmente me deixa ainda mais eufórico em continuar nessa área, e pelos grandes
ensinamentos que levarei comigo sempre;
Ao professor Eulâmpio de quem há muito tenho grande admiração, não só por ter
me encaminhado para bases da morfologia, mas também pela pessoa que é;
A Médica Veterinária Professora Viviane Medeiros por mostrar o programa de
pós graduação em Psicobiologia, essa considero minha madrinha de mestrado;
A todos os meus colegas de mestrado pelo breve, mas caloroso convívio;
A turma do LabNeuro: Twyla (Twylão), André (Deco), Rovena (Popotis), Janaína
(Filé de Borboleta), Renata (Por motivos superiores vai ficar sem o apelido), Nayra
(Nayrão), Kayo (Harvard), Paulo (Paulo Mesmo), Rayane (Bartirão), Rodolfo (Rô),
Gilberto (Gil), Fausto (Fau), Katia, Alane (Olá enfermeira!), Adriana (Paciência do mundo
todo), Francimar, Ana Carla, que fazem com que nossos momentos juntos se tornem
insuperavelmente “acanalhados”;
A Regina pelo preparo das soluções e tudo mais que cerca a diversão do
LabNeuro;
Aos professores Jeferson, Expedito, Judney e Ruthnaldo pela contribuição;
Àquele que não é um todynho, mas é meu companheiro de aventuras, Leandro,
muito obrigado pelos bons momentos de aventuras nas pegas sem sucesso dos mocós e por
me dar a certeza que agora tenho outra casa em Natal. Pelo convívio com seus pais
Luciano e Rosaura, e pelas longas e cansativas conversas com Laerte;
Ao Ibama, pela autorização e licença para realização deste trabalho;
5
Ao CNPq pelo apoio financeiro;
A Deus o ser superior que nos rege, por ter me dado todas essas pessoas acima
que fazem dos meus sonhos realidade.
.
6
RESUMO
A serotonina ou 5-hidroxitriptamina (5-HT) é uma substância encontrada em
muitos tecidos do organismo, inclusive no sistema nervoso como neurotransmissor, onde
pode exercer ações pós-sinápticas variadas. Dentro do neuro-eixo, a localização dos
neurônios 5-HT é quase absoluta nos núcleos da rafe do tronco encefálico, de tal maneira
que 5-HT neuronal pode ser considerada um marcador dos núcleos da rafe. Os núcleos da
rafe estão localizados no tronco encefálico, na linha média ou suas proximidades. Os
grupamentos serotoninérgicos foram originalmente classificados alfanumericamente como
B1 a B9 no sentido caudorrostral no rato e podem ser divididos em grupos superior e
inferior. Neste trabalho a distribuição dos neurônios serotoninérgicos foi estudada com
imunoistoquímica no cérebro do mocó (Kerodon rupestris), uma espécie de roedor
endêmica da região Nordeste do Brasil. A localização citoarquitetônica dos neurônios
serotoninérgicos foi estabelecida em séries de secções coronais e sagitais adjacentes
submetidas a coloração pelo método de Nissl e imunoistoquímica para 5-HT. Assim, foram
delimitados os núcleos da rafe linear rostral, linear caudal, dorsal, mediano, paramediano e
pontino da rafe e grupamento B9, compondo o grupo rostral, e os núcleos interpósito,
magno, obscuro e pálido, compondo o grupo caudal, comparável ao que já foi descrito para
outras espécies de mamíferos.
Palavras-chaves: imunoistoquímica, mocó, núcleos da rafe, roedor, serotonina,
tronco encefálico.
7
ABSTRACT
Serotonin or 5-hydroxytryptamine (5-HT) is a substance found in many tissues of
the body, including as a neurotransmitter in the nervous system, in which may exert varied
post-synaptic actions. Inside the neuro-axis, the location of 5-HT neurons is almost
restricted to the raphe nuclei of the brainstem, such that 5-HT-immunoreactivity can be
considered a marker of the raphe nuclei. The raphe nuclei are located in the brainstem, at
or near the midline. The serotonergic groups were originally alphanumerically classified as
B1 to B9 towards caudorrostral in rats and can be divided into upper and lower groups. In
this study the distribution of serotonergic neurons was studied using
immunohistochemistry in the brain of the rock cavy (Kerodon rupestris), a species of
rodent endemic to Northeastern Brazil. The cytoarchitectonic location of serotonergic
neurons was established in series of adjacent coronal and sagittal sections stained by the
Nissl method and immunohistochemistry for 5-HT. Thus, we defined the raphe rostral
linear, caudal linear, dorsal, median, and paramedian pontine raphe nuclei, and B9 cluster,
constituting the rostral group, and the interpositus, magnus, obscure and palidus,
constituting the caudal part of the group, comparable to which has been described for other
mammalian species.
Keywords: brainstem, immunohistochemistry, raphe nuclei, rock cavy, rodent, serotonin.
8
LISTA DE ABREVIATURAS
10N Núcleo do n. vago
12N Núcleo n. hipoglosso
3N Núcleo n. óculo motor
4N Núcleo n. troclear
4V Quarto ventrículo
5-HT Serotonina
5-HT IR Neurônios imunorreativos a serotonina
5N Núcleo do n. trigêmeo
6N Núcleo do n. abducente
7N Núcleo do n. facial
AP Área postrema
Aq Aqueduto
B9 Região supralemniscal
CLi Núcleo linear caudal da rafe
cp Pedúnculo cerebral
DRC Núcleo dorsal da rafe – parte caudal
DRD Núcleo Dorsal da Rafe – Parte dorsal
DRL Núcleo Dorsal da Rafe – Parte lateral
DRV Núcleo Dorsal da Rafe – Parte ventral
Dtg Núcleo tegmental dorsal
dtgx Decussação tegmental dorsal
Gi Núcleo reticular gigantocelular
IC Colículo Inferior
ifp Fascículo longitudinal da ponte
9
IO Complexo olivar
IP Núcleo interpenducular
mcp Peduculo cerebelar médio
MG Núcleo Geniculado Medial
ml Lemnisco medial
mlf Fascículo longitudinal medial
MnR Núcleo mediano da rafe
NR Núcleo rubro
PAG Substancia cinzenta periaquedutal
PB Pós Bregma
PBP Núcleo pigmentado parabraquial
PDR Núcleo Dorsal da Rafe – Parte posterior
PMnR Núcleo paramediano da rafe
Pn Núcleo pontino
PnC Núcleo reticular pontino
PnR Núcleo potino da rafe
Pr Núcleo prepósito
py Trato piramidal
R Núcleo Rubro
RIP Núcleo interpósito da rafe
RLi Núcleo linear rostral da rafe
RMg Núcleo magno da rafe
ROb Núcleo obscuro da rafe
RPa Núcleo pálido da rafe
RtTg Núcleo reticulo tegmental da ponte
10
SC Colículo Superior
SGe Núcleo supragenual
SN Substancia negra
SolC Núcleo do tracto solitário
tfp Fibras transversas da ponte
Tg Núcleo tegmental ventral
ts Tracto tecto espinal
Tth Tracto trigeminotalâmico
Tz Corpo trapezóide
tz Corpo trapezóide
Ve Núcleo vestibular
vtgx Decussação tegmental ventral
xscp Decussação do pedúnculo cerebelar superior
11
SUMÁRIO
Conteúdo Página
INTRODUÇÃO....................................................................................................... 11
JUSTIFICATIVA.................................................................................................... 20
OBJETIVOS............................................................................................................ 21
METODOLOGIA.................................................................................................... 22
Sujeitos............................................................................................................... 22
Procedimentos.................................................................................................... 22
Anestesia.................................................................................................. 22
Perfusão .................................................................................................. 22
Remoção dos encéfalos............................................................................ 23
Imunoistoquímica.................................................................................... 24
RESULTADOS....................................................................................................... 26
DISCUSSÃO........................................................................................................... 55
CONCLUSÕES..................................................................................................... 58
CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................. 22
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 61
ANEXOS................................................................................................................. 66
12
INTRODUÇÃO
A serotonina ou 5-hidroxitriptamina, abreviadamente 5-HT foi reconhecida pela
primeira vez como uma substância vasoconstritora encontrada no sangue. Da combinação
de “serum” e “tonus”, derivou-se a palavra serotonina. A estrutura molecular da 5-HT foi
desvendada em meados do século XX e em seguida foi identificada em vários tecidos,
inclusive o sistema nervoso central de vertebrados e invertebrados e reconhecida como
neurotransmissor (Twaroge e Page, 1953; Bogdansky et al., 1956; ver Jacobs e Azmitia,
1992).
A 5-HT é sintetizada a partir da hidroxilação e descarboxilação do aminoácido
triptofano pela enzima triptofano hidroxilase, cuja ação é limitada pelo teor de triptofano.
Esta enzima adiciona um grupo hidroxila, produzindo 5-hidroxitriptofano (5-HTP). Em
seguida a enzima aminoácido descarboxilase retira o grupo carboxila formando assim a 5-
HT. Como todo neurotransmissor aminérgico, a 5-HT é armazenada em vesículas
sinápticas e liberadas por exocitose sob o controle do cálcio, ou pode estar associada a
outros neurotransmissores, tais como dopamina, noradrenalina, acetilcolina, etc. A
inativação da 5-HT ocorre por um mecanismo específico, que permite a recaptação da 5-
HT liberada a partir do espaço extracelular. Um mecanismo adicional para inativação da 5-
HT é sua degradação enzimática pela monoaminooxidase A (MAOA), de cuja ação resulta
o ácido 5-hidroxi-indolacético (5-AHIA). Posteriormente sofre ação da enzima triptofano
aldeido-desidrogenase, resultando em ácido 5-hidroxi-indólico (5-HIAA) (Von Bohlen und
Halbach e Dermietzel, 2006).
A localização de grandes neurônios formando agregados na linha média do tronco
encefálico chamou a atenção de anatomistas desde o tempo de Ramón y Cajal, o qual
descreveu estas células como grandes neurônios multipolares, de projeções indefinidas
(Ramón y Cajal, 1911). Décadas depois, com base em estudo citoarquitetônico, os núcleos
da rafe foram inicialmente descritos no gato, como um conjunto de 8 núcleos ao longo da
linha média, do mesencéfalo à transição bulbo-espinal, assim denominados, do sentido
rostral para caudal: núcleos lineares rostral e caudal da rafe, dorsal da rafe, central superior
(ou mediano) da rafe, pontino da rafe, magno da rafe, pálido da rafe e obscuro da rafe
(Taber et al., 1960).
O interesse no estudo da morfologia e funções dos núcleos da rafe foi despertado
após o surgimento da descrição de um sistema de neurônios monoaminérgicos no tronco
encefálico do rato, evidenciados pela técnica de fluorescência induzida por formaldeído
13
(Falk et al., 1962; Dahlström e Fuxe, 1964; 1965). Embora fosse notada uma extensa
superposição entre os neurônios supostamente produtores de 5-HT e os núcleos da rafe, os
grupamentos serotoninérgicos então evidenciados foram designados como grupamentos B1
a B9 no sentido caudorrostral (Dahlström e Fuxe, 1964). Com a introdução da técnica
imunoistoquímica, esta classificação foi integrada com a nomenclatura citoarquitetônica do
sistema da rafe (Steinbush et al., 1978; Steinbush, 1981; Törk, 1985). Embora os principais
grupos celulares do sistema serotoninérgico sigam as divisões citoarquitetônicas dos
núcleos da rafe, essa superposição não é exata, considerando que numerosos neurônios 5-
HT-IR estão presentes em outros setores da formação reticular, além dos limites dos
núcleos da rafe, embora aparentemente contínuos com os aglomerados de células 5-HT-IR,
bem como alguns neurônios não serotoninérgicos estão presentes nos núcleos da rafe
(Törk, 1985; Harding et al., 2004).
Como outros neurotransmissores, a 5-HT pode exercer ações pós-sinápticas
variadas, dependendo das características do receptor com o qual interage. Os primeiros
registros da presença de receptores de 5-HT no sistema nervoso central datam dos anos 50,
mas sua confirmação ocorreu quatro décadas mais tarde. Utilizando técnicas de biologia
molecular, que utiliza os recursos de clonagem, com base nas suas características
estruturais e farmacológicas, foram identificadas sete classes de receptores de 5-HT – 5-
HT1 a 5-HT7, com 14 subtipos identificados até agora. É sabido que a estrutura
quaternária dos receptores de 5-HT consiste de pelo menos 3 constituintes: o transportador,
o canal iônico acoplado ao ligante e o receptor acoplado a proteína G, este último
compreendendo o grupo mais numeroso (Vergé e Calas, 2000; Hoyer et al., 2002; Von
Bohlen und Halbach e Dermietzel, 2006, Pontes et al., 2010).
A diversidade de receptores, associada à distribuição difusa da inervação
serotoninérgica explica a variedade de funções em que a 5-HT está envolvida, incluindo
regulação do ciclo sono-vigília, controle dos sonhos, alerta e atenção, memória e
aprendizagem, controle do humor, comportamento alimentar, comportamento sexual,
termorregulação, processamento sensorial nociceptivo, regulação circadiana, entre outras.
Além disso, disfunção da 5-HT tem sido associada a variados processos neuropatológicos,
tais como distúrbios do sono, ansiedade, depressão, agressividade, bulimia e anorexia, bem
como doenças neurodegenerativas, como doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington
(Jacobs e Azmitia, 1992; Vertes et al., 1999; Kandel, 2000; Vergé e Calas, 2000; Carlson,
2002; Takase e Nogueira, 2008).
Conforme mencionado anteriormente, os neurônios serotoninérgicos no encéfalo
14
estão localizados predominantemente no tronco encefálico, ao longo da linha mediana ou
próximo a ela, caracterizando os núcleos da rafe. Contudo, nem todos os neurônios da rafe
contêm 5-HT, e a proporção de neurônios produtores de 5-HT dentro de cada núcleo varia
consideravelmente (Törk, 1985; Harding et al., 2004). Entre outras substâncias encontradas
nos núcleos da rafe, podem ser citadas substância P, hormônio liberador de tireotropina
(TRH), noradrenalina e ácido gama-amino-butírico (GABA), podendo estar co-localizadas
ou não com 5-HT (Jacobs e Azmitia, 1992; Charara e Parent, 1998). Além disso, alguns
poucos neurônios serotoninérgicos estão fora dos núcleos da rafe, como por exemplo, em
relação com o lemnisco medial, ou em setores da formação reticular (Jacobs e Azmitia,
1992; Charara e Parent, 1998). Por isso, os grupamentos serotoninérgicos foram
originalmente classificados alfanumericamente como B1 a B9 no sentido caudo-rostral no
rato (Dahlstrom e Fuxe, 1964), podendo ser correlacionados com os núcleos da rafe, os
quais costumam ser divididos em grupos superior e inferior (Fig. 1).
Figura 1. Grupamentos serotoninérgicos B1 a B9, segundo Dahlstrom e Fuxe,
1964.
O grupo superior consiste de 4 núcleos principais: o núcleo linear caudal (CLN,
B8), núcleo mediano da rafe (MRN, B8 e B5, previamente referido como núcleo central
superior) e células deslocadas lateralmente no núcleo pontino centralis oralis, os neurônios
laterais do B9 situando-se imediamente dorsal ao lemnisco medial e o núcleo dorsal da rafe
(DRN, B7 e B6). O mais rostral dos núcleos da rafe, definido citoarquitetonicamente e
designado núcleo linear rostral contém apenas raros neurônios serotoninérgicos, sendo
predominantemente dopaminérgico (Törk, 1985). O grupo inferior consiste de 5 núcleos
principais: núcleo obscuro da rafe (NRO, B2), núcleo pálido da rafe (NRPa, B1 e B4),
15
núcleo magno da rafe (NRM, B3), os neurônios do bulbo ventrolateral [núcleo
paragigantocelular lateral (LPGN) e o núcleo reticular intermédio (IRN), B1/B3] e a área
postrema (Brodal e Walberg, 1960; Brodal, 1984; Jacobs e Azmitia, 1992; Harding et al.,
2004). A anatomia destes grupos foi revisada em muitas espécies, inclusive em rato
(Parent, 1981; Lidov e Molliver, 1982; Takeuchi et al., 1982; Törk, 1985; Paxinos e
Watson, 2007), coelho (Bjarkam et al., 1997), gato (Takeuchi et al., 1982; Jacobs et al.,
1984), humanos (Törk, 1990) e macacos do Novo e Velho Mundo (Felten et al., 1974;
Felten e Sladek, 1983; Azmitia e Gannon, 1983; Hornung e Fritschy, 1988). A
sistematização mais recente dos núcleos da rafe (grupamentos serotoninérgicos) no cérebro
do rato, de acordo com Paxinos e Watson (2007), indica a existência de 10 grupamentos
nucleares da rafe, em sequência rostrocaudal: no mesencéfalo, os núcleos linear rostral da
rafe (RLi), linear caudal da rafe (Cli), dorsal da rafe (DR), mediano da rafe (MnR) e
paramediano da rafe (PMnR). Na ponte, os núcleos pontino da rafe (PnR) e interpósito da
rafe (RIP). Por último, no bulbo, os núcleos magno da rafe (RMg), pálido da rafe (RPa) e
obscuro da rafe (Rob) (Paxinos e Watson, 2007).
Embora haja um número substancial de células não-serotoninérgicas nos núcleos
da rafe, é reconhecido que as longas projeções ascendentes e descendentes são oriundas de
neurônios serotoninérgicos (Jacobs e Azmitia, 1992; Charara e Parent, 1998; Halberstadt e
Balaban, 2006). As fibras serotoninérgicas são finas, pouco mielinizadas e altamente
colateralizadas. Parece haver uma tendência evolutiva, observando-se que nas espécies em
escala evolutiva “superior”, como os primatas, além da localização mediana, surgem
neurônios localizados mais lateralmente (lateralização) e uma grande parte das fibras
serotoninérgicas são mielinizadas (Jacobs e Azmitia, 1992; Bjarkam et al., 1997).
O estudo da hodologia dos núcleos da rafe é bastante complexo, considerando que
esta longa cadeia de núcleos recebe aferentes de, bem como se projetam para, virtualmente
todas as regiões do sistema nervoso central, embora com densidades variáveis (Törk, 1985;
1990; Jacobs e Azmitia, 1992; Harding et al., 2004).
Diversos estudos em diferentes espécies revelaram um padrão de organização nas
projeções dos núcleos serotoninérgicos, estabelecendo-se a divisão dessas eferências em
três direções: projeções ascendentes, projeções para o tronco encefálico e cerebelo e
projeções descendentes. As projeções ascendentes são dirigidas ao cérebro e provêm
principalmente de neurônios dos núcleos serotoninérgicos rostrais, como o núcleo dorsal
da rafe, o núcleo mediano da rafe, a região supralemniscal (B9) e áreas adjacentes.
Praticamente todo córtex cerebral recebe inervação serotoninérgica, observando-se uma
16
maior densidade nos córtices perirrinal, occipital, córtex frontal, giro do cíngulo, área
entorrinal, área amigdalóide e hipocampo. Entre as estruturas subcorticais recipientes de
terminais serotoninérgicos destacam-se tubérculo e bulbo olfatórios, substância inominada,
núcleos accumbens e pálido ventral, corpo amigdalóide, claustrum, núcleos septais e
núcleo intersticial da estria terminal. No hipotálamo, os principais alvos das projeções
serotoninérgicas são os núcleos supraquiasmático, pré-mamilares, supra-óptico e
paraventricular, região infundibular e áreas pré-óptica lateral, hipotalâmica lateral e
hipotalâmica posterior. No tálamo as projeções serotoninérgicas são distribuídas
principalmente para os núcleos intralaminares e da linha média, incluindo o núcleo
paraventricular, o médio-dorsal, núcleos anteriores e o complexo geniculado lateral dorsal,
incluindo o folheto intergeniculado. No subtálamo, o núcleo subtalâmico é inervado e, no
epitálamo, as projeções serotoninérgicas alcançam a glândula pineal, o órgão
subcomissural e os núcleos habenulares. As projeções dos núcleos serotoninérgicos rostrais
se estendem caudalmente até estruturas mesodiencefálicas, como a área pré-tetal, e mesmo
mesencefálicas e pontinas, como o núcleo tegmentar látero-dorsal, a substância cinzenta
central, a substância negra parte compacta, o locus ceruleus e outros núcleos da rafe
(Azmitia e Segal, 1978; Kent e Sladek, 1978; Moore et al., 1978; Steinbusch, 1981; Törk,
1985; Imai et al, 1986; Vertes, 1991; Jacobs e Azmitia, 1992; Vertes e Kocsis, 1994; Baker
e Halliday, 1995; Vertes et al., 1999, Cavalcante et al, 2002; Pinato et al, 2007).
Embora haja uma certa superposição, uma distribuição diferencial da inervação
serotoninérgica proveniente dos núcleos dorsal e mediano da rafe já havia sido sugerida em
um estudo autorradiográfico (Azmitia e Segal, 1978) e melhor analisada em estudos de
PHA-L (Vertes, 1991; Vertes et al., 1999). Assim, fibras do núcleo mediano da rafe
distribuem-se principalmente para estruturas medianas e paramedianas, enquanto o dorsal
da rafe se projeta primariamente para estruturas mais laterais e a área B9 parece projetar-se
principalmente para o córtex frontal (Vertes, 1991; Vertes et al., 1999). Um outro exemplo
de projeção diferencial é visto nos centros circadianos, em que o núcleo mediano da rafe se
projeta para o núcleo supraquiasmático e o dorsal da rafe para o folheto intergeniculado
(Meyer-Bernstein e Morin, 1996; Moga e Moore, 1997; Hay-Schmidt et al., 2003).
Para o tronco encefálico e cerebelo as projeções provêm principalmente dos
núcleos pontino e magno da rafe, embora também participem núcleos mais rostrais e
caudais (Törk, 1985; Harding et al., 2004). Como exemplo de áreas rafe-recipientes no
tronco encefálico temos: colículo superior, área tegmentar ventral, complexo
interpeduncular, substância negra, locus ceruleus e núcleo olivar inferior. Incluem-se
17
também núcleos de nervos cranianos tais como os núcleos motores dos nervos facial e
trigêmeo, núcleos sensitivos como do trato espinal do trigêmeo, núcleo do trato solitário,
núcleos cocleares e núcleos vestibulares (Steinbusch, 1981; Brodal, 1984; Törk, 1985;
Halberstadt e Balaban, 2003; 2006; Harding et al., 2004; Lee et al., 2008). No cerebelo os
axônios serotoninérgicos atingem os núcleos centrais, bem como o córtex, e são
provenientes principalmente do núcleo magno da rafe (Steinbusch, 1981; Brodal, 1984;
Törk, 1985; Halberstadt e Balaban, 2003; 2006; Harding et al., 2004).
A medula espinal recebe inervação serotoninérgica que incide nas colunas ventral
e dorsal proveniente principalmente dos núcleos magno, pálido e obscuro da rafe
(Steinbusch, 1981; Bowker et al., 1982; Brodal, 1984; Törk, 1985). A figura 1 é um
esquema dos grupos serotoninérgicos segundo a nomenclatura alfa-numérica e dos núcleos
da rafe e suas projeções para o SNC.
Os núcleos dorsal e mediano da rafe recebem aferências de áreas muito amplas,
principalmente dos córtices pré-frontal, cingulado anterior, insular, orbital lateral, orbital
medial, orbital ventral, infralímbico, peduncular dorsal e tênia tecta, núcleo amigdalóide,
prosencéfalo basal, núcleos habenulares, vários núcleos hipotalâmicos, tálamo, incluindo o
núcleo paraventricular, zona incerta e núcleo subtalâmico (Törk, 1985; Peyron et al., 1998)
e retina (Fite et al., 1999; 2003; Frazão et al., 2008).
As conexões aferentes do núcleo obscuro da rafe provem principalmente da
formação reticular e substância cinzenta periaquedutal (Törk, 1985; Jacobs e Azmitia,
1992; Nogueira et al., 1999).
Em geral, a maior parte das conexões aferentes para os núcleos magno, obscuro e
pálido da rafe provém da formação reticular e substância cinzenta central do mesencéfalo.
O núcleo magno da rafe recebe adicionalmente projeções do grupamento B9, núcleos
dorsal e mediano da rafe, e densa inervação de substância P e neurotensina. O núcleo
pálido da rafe recebe aferências proveniente das áreas pré-ópticas medial, lateral e
mediana, áreas hipotalâmicas anterior, dorsal, lateral e posterior, núcleos paraventricular e
periventricular do hipotálamo, zona incerta, substância cinzenta central, formação reticular
do tronco encefálico, núcleo do trato espinal do trigêmeo e medula espinal (Jacobs e
Azmitia, 1992; Nogueira et al., 1999).
18
Figura 2. Esquema demonstrando as conexões eferentes dos núcleos da rafe.
O sujeito experimental
O mocó (Kerodon rupestris), Wied, 1820 é um roedor encontrado nos estados do
Nordeste e norte de Minas Gerais, habitando preferencialmente a caatinga do semi-árido
do Nordeste Brasileiro.
Taxonomicamente, o mocó é classificado na superfamília Cavioidea, família
Caviidae, subfamília Caviinae, gênero Kerodon, juntamente com Cavia, Galea e
Microcavia (Cabrera, 1961; Lacher, 1981).
Estudos morfológicos (Silva Neto, 2000) e de biologia molecular (Rowe e
Honeycutt, 2002) firmaram o gênero Kerodon irmanado com a família Hydrochaeridae, à
qual também pertence a capivara (Hydrochaeris) e estreitamente alinhado com a
subfamília Dolichotinae.
Animais da familia Caviidea são dotados de uma grande versatilidade de
adaptação aos mais diversos tipos de ambientes, embora se caracterizem como mamíferos
terrestres, podendo ser arborícolas, rupícolas e terrícolas. Com a dentição desprovida de
caninos, costumam ser herbívoros. Os mais diversos tipos de placentação podem ser
encontrados. Possuem três dedos nos membros pélvicos e cauda completamente atrofiada
(Moojen, 1952).
A subfamilia Caviinae é composta por quatro gêneros: Kerodon, Galea, Cavia e
Microcavia. A este grupo pertencem pequenos animais já reconhecidamente domésticos,
como a cobaia, ou porquinho da índia (Cavia porcellus). Geralmente vivem em pequenas
colônias feitas em buracos na terra, ou usam cavidades nas bordas das rochas. Possuem
hábitos gregários e diurnos (Crandall, 1964).
19
Os mocós, especificamente, pertencem ao gênero Kerodon, o qual possui muitas
semelhanças com os gêneros Cavia e Galea. Seu ambiente é estritamente especializado,
habitando locais rochosos com fendas e rachaduras, onde se abrigam dos predadores e
passam boa parte do tempo. São excelentes saltadores, escalando rochas e galhos de
árvores, de onde retiram sua alimentação, composta principalmente de cascas de árvores,
ou na falta destas, gramíneas em geral, sendo as árvores mais procuradas o mufumbo
(Cobretum leprosum), faveleira (Cnidoscolus phyllacanthus) e a parreira brava
(Cissampelos pareira), ao contrário de outros caviinaes que possuem hábitos terrestres e
comem relva (Carvalho, 1969; Lacher, 1981).
O mocó tem coloração cinza clara com pelos pretos e amarelos ou esbranquiçados
na região dorsal, castanho-ferruginoso na região caudal e um pouco acastanhada nas patas
e branco na região cervical. Os adultos podem medir aproximadamente 40 cm e pesar até 1
quilograma de peso vivo (Moojen, 1952; Carvalho, 1969). As patas são dotadas de coxins
calosos pouco excedidos pelas unhas rígidas que lhes dão habilidades de escalar e saltar
(Moojen, 1952). Tem olfato e audição muito aguçados, podendo detectar seu predador a
uma longa distância (Carvalho, 1969).
Figura 3. Mocó (Kerodon rupestris) sobre galhos em ambiente natural. (fonte:
internet)
20
O mocó atinge a idade adulta com 200 dias. A reprodução ocorre durante todo o
ano, não apresentando sazonalidade, com exceção do período que vai de abril a junho. As
fêmeas apresentam um cio pós-parto, podendo acasalar poucas horas após o parto. O mocó
tem um período médio de gestação de 65 ± 1,34 dias, com um número médio de filhotes
por gestação 1,28 ± 0,09, peso médio da matriz pós-parto 724,73 ± 13,08 g, sendo o índice
de abortos de 6,89% (Pinheiro, 1985). Apesar das poucas crias por parto, o curto período
gestacional garante uma elevada produção de crias durante o ano (Lacher, 1981). Mesmo
sendo curto, esse período gestacional do mocó é o mais longo entre os caviinaes, além do
que é o menor tamanho de ninhada, o mais baixo peso de filhotes e o mais longo tempo
para maturidade sexual (Roberts et al, 1984)
Os estudos de placentação em mocós indicam a presença de um útero bicórneo,
uma placenta corioalantoidea discoidal e labiríntica, com barreira placentária hemocorial
de subtipo hemomonocorial separando o fluxo sanguíneo materno-fetal do tipo
contracorrente (Oliveira, 2007).
Quanto ao padrão da sua atividade motora, registros de observações dão conta de
que nos dias mais escuros o mocó sai para se alimentar pela manhã e à tarde, enquanto que
nos dias mais claros sua atividade se concentra no período noturno, podendo também durar
o dia inteiro quando da ocorrência de chuvas (Carvalho, 1969). Outras observações
indicam atividade de forrageio ao longo do dia e da noite (Lacher, 1981). Em um estudo
em condições controladas de laboratório, foi detectado que o mocó é ativo ao longo das 24
horas do dia, embora sua atividade seja intensificada nas fases do amanhecer e entardecer,
sugerindo um comportamento predominantemente crepuscular (Sousa e Menezes, 2006).
Alguns núcleos e projeções vêm sendo estudados nessa espécie, dentre eles
destacam-se as projeções retinianas e caracterização imunoistoquímica do núcleo
supraquiasmático e folheto intergeniculado, projeções aferentes para o núcleo médio dorsal
do tálamo e projeções retinianas para o núcleo paraventricular do tálamo (Nascimento Jr,
et al, 2008, 2010 e 2010).
21
JUSTIFICATIVA
Levando-se em consideração a importância dos núcleos da rafe, enquanto o
sistema neuronal que detém a maior concentração de 5-HT no encéfalo, atuando como relé
de integração de vários sistemas, é de suma importância a sua caracterização anatômica
numa espécie pouco estudada, abrindo um amplo campo de estudos e uma oportunidade
única de desenvolver pesquisas tendo como modelo animal um roedor característico e
muito próprio da região Nordeste do Brasil. Este estudo fornecerá a base para estudos
posteriores nos aspectos hodológico e funcional do sistema nervoso.
Melhor conhecer o sistema nervoso de uma espécie é melhor conhecer seu
comportamento e, conseqüentemente, entender as devidas modificações que porventura
tenham ocorrido para que este tenha se adaptado ao meio ambiente rústico ao qual
pertence. E assim, permitir o desenvolvimento de técnicas de manejo que visem a criação
em cativeiro ou que propicie melhores condições ao ambiente que permitam a conservação
desta espécie.
22
OBJETIVOS
Objetivo geral
Identificar através de imunoistoquimica para 5-HT os núcleos da rafe no cérebro
do mocó (Kerodon rupestris).
Objetivos específicos
1. Identificar os núcleos da rafe, baseado no seu conteúdo em 5-HT, por
comparação com outras espécies já estudadas, tomando como base para a
nomenclatura o que fora descrito no rato;
2. Delimitar citoarquitetonicamente os núcleos da rafe;
23
METODOLOGIA
Sujeitos:
Foram utilizados 4 mocós adultos jovens, obtidos por meio de captura no
município norterriograndense de Serra Negra do Norte, mediante autorização do IBAMA
(Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis, SISBIO no.
21440-1). O projeto foi aprovado no Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da
UFRN, protocolo no. 043/2009. Todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar dor
e sofrimento aos animais, desde a captura aos procedimentos experimentais, seguindo
estritamente as normas estabelecidas pelo National Research Council of the National
Academy publicadas no livro “Guidelines for the Care and Use of Mammals in
Neuroscience and Behavioral Research”. Uma versão em formato pdf está disponível
gratuitamente no site da Sociedade de Neurociência e Comportamento (SBNeC) –
http://www.sbnec.gov.br/links.
Após a captura, os animais foram alojados no Centro de Biociências, UFRN, em
um recinto de alvenaria e tela de arame, medindo 3,00 x 2,00 x 2,60 m, onde ficaram
expostos a luminosidade, temperatura e umidade naturais, com água e comida ad libitum,
permanecendo aí durante o gradativo período de utilização dos mesmos, tendo em vista
que o contingente de animais não pode ser processado em um único dia. No dia anterior ao
experimento os animais foram transferidos para gaiolas medindo 0,90 x 0,60 x 0,75m.
Todos os procedimentos foram realizados no laboratório de Neuranatomia,
departamento de Morfologia, UFRN, vinculado ao Programa de pós-graduação em
Psicobiologia.
Procedimentos:
Anestesia
Os animais receberam como medicação pré-anestésica cloridrato de tramadol e
xilazina, ambos na dose de 5 mg/Kg por via intramuscular. O tramadol é um opióide
necessário para potenciar o efeito da analgesia adequada ao procedimento. A xilazina é um
relaxante muscular. Decorridos 10 minutos, os animais foram induzidos e mantidos em
anestesia inalatória com isoflurano e oxigênio 100% administrado através de máscara, até
atingir o plano anestésico, ou seja, terceiro plano do terceiro estágio de Guedel (Massone,
2008).
Perfusão
Ao atingir o plano anestésico, cada animal foi submetido a perfusão transcardíaca,
que compreende os seguintes passos:
24
1. Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame sob ponto de água.
2. Toracotomia, com incisão de pele, músculos e todas as costelas, sendo estes removidos
em bloco, para exposição do coração.
3. Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha de 16G (1,6 x 17 mm), a
qual é direcionada para a artéria aorta, seguindo-se uma incisão no átrio direito. A
agulha é conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer), passando-se 300 ml de
solução salina a 0,9% em tampão fostato 0,1M, pH 7,4 com heparina (Parinex,
Hipolabor, 2ml/1000 ml de solução salina), seguida de 700ml de solução de
paraformaldeido 4%, glutaraldeído 0,05% e ácido pícrico 0,2% em tampão fostato
0,1M, pH 7,4 (Zamboni e De Martino, 1967).
Remoção dos encéfalos e microtomia
Concluída a perfusão, dois animais foram posicionados no aparelho estereotáxico
para roedores. Depois de fazer uma incisão
longitudinal na pele e rebatê-la
lateralmente, fez-se a limpeza da superfície
óssea, facilitando a visualização do bregma
e do lambda, os quais foram nivelados na
mesma altura dorsoventral, ajustando-se a
barra dos incisivos, padronizando assim o
plano de corte coronal para todos os
animais. Após anotação das coordenadas
do bregma e do lambda, o osso da calota
craniana foi removido com o uso de broca
e trocater, expondo-se o encéfalo. Ainda no
aparelho estereotáxico, o encéfalo foi
seccionado em 3 blocos, através de 2
secções coronais: uma no no nível do
bregma e outra no nível do lambda. Os
encéfalos foram retirados delicadamente
para evitar danos, preservando os olhos e
nervos ópticos, e em seguida fotografados.
Logo após, os três blocos foram
armazenados em uma solução de sacarose
a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, a 4 ºC, até serem submetidos a microtomia. Os
Figura 4. Mocó (Kerodon rupestris)
posicionado no aparelho estereotáxico.
Figura 5. Encéfalo de mocó (Kerodon
rupestris) sendo seccionado em três
blocos.
25
encéfalos de 2 animais foram submetidos a uma secção no plano mediano, separando-se os
2 hemisférios cerebrais, direito e esquerdo, os quais foram seccionados no plano sagital.
O encéfalo congelado por gelo seco foi seccionado em micrótomo de
deslizamento, obtendo-se secções coronais ou sagitais com espessura de 30 µm. Estas
foram distribuídas seqüencialmente em seis compartimentos, em um meio liquido
contendo tampão fostato 0,1M, pH 7,4 , cada compartimento contendo 1 de 6 secções,
mantendo a distância entre uma secção e a seguinte de aproximadamente 180 µm. Os
cortes de uma série foram armazenados em tampão fostato 0,1M, pH 7,4 e imediatamente
montados em lâminas gelatinizadas e submetidas a coloração pelo método de Nissl com
corante Thionina, para facilitar a demarcação das estruturas. Os cortes das demais séries
foram coletadas em solução anticongelante e conservadas a -20 ºC até a realização das
reações imunoistoquímicas.
Imunoistoquímica
Cortes de uma série foram submetidas a imunoistoquímica para 5-HT. Após 3
lavagens de 10 minutos cada, em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 em agitador orbital, as
secções foram submetidas ao pré-tratamento para abolição de artefatos e recuperação de
antigenicidade com boridreto de sódio e água oxigenada.
O próximo passo foi colocar as secções em contato com o anticorpo anti-5-HT
obtido em coelho (Sigma) diluído em tampão fosfato contendo Triton X-100 a 0,4% a uma
diluição de 1:5000, contendo soro normal de cabra a 2%, permanecendo em incubação por
12 a 72 horas em rotor com rotação lenta. Ao fim deste período os cortes foram colocados
em contato com o anticorpo secundário anti-coelho obtido em cabra (Jackson Labs) diluído
a 1:1000 no mesmo veiculo anterior, por 90 minutos à temperatura ambiente, sob agitação
lenta, em rotor. Em seguida os cortes foram colocados na solução do complexo avidina-
Figura 6. Encéfalo de mocó (Kerodon rupestris) vista dosal (a) e ventral (b).
a
b
26
biotina-HRP (Protocolo ABC, Kit elite da Vector), numa diluição de 1:100 em Triton X-
100 a 0,4%, contendo NaCl. Para visualização da reação, as secções foram postas em meio
contendo peróxido de hidrogênio (H2O2), como substrato e a 3,3’,4,4’tetrahidrocloreto-
diaminobenzidina (DAB), utilizada como cromógeno. A H2O2 foi oferecida indiretamente,
colocando-se na solução glicose oxidase e -D-glicose, provocando uma reação em que a
primeira agindo sobre a segunda libera H2O2 (Itoh et al., 1979). Esta reação dura em torno
de 15 minutos. Entre as etapas e ao final, os cortes foram lavados por 3 vezes em tampão
fostato 0,1M, pH 7,4 em agitador orbital. Os cortes foram montados em lâminas
gelatinizadas, as quais após secarem à temperatura ambiente, foram imersas em solução de
tetróxido de ósmio a 0,05% para intensificar a reação. Após as etapas de desidratação, em
baterias de álcool de graduação crescente até o álcool absoluto, e diafanização em xilol,
foram montadas as lamínulas. As demais séries foram utilizadas para repetição de
imunoistoquímica para 5-HT, ou utilizadas em outros projetos.
As secções do tronco encefálico, coradas por Nissl e as imunocoradas para 5-HT
foram examinadas ao microscópio óptico (Olympus BX41) em campo claro. Imagens
digitais foram obtidas de secções representativas usando uma videocâmara digital (Nikon
DXM1200). As imagens foram analisadas, corrigidas minimamente para brilho e contraste,
e montadas usando o programa Adobe Photshop 7.0. Os resultados estão documentados em
fotomicrografias e gráficos.
27
RESULTADOS
No presente estudo a imunoistoquímica para 5-HT foi utilizada para, em
consonância com a técnica de Nissl em secções adjacentes, delimitar os núcleos da rafe.
Encontramos neurônios imunorreativos para 5-HT (5-HT-IR) ao longo de todo tronco
encefálico, predominantemente na linha mediana, desde o nível da porção média do núcleo
interpeduncular até a transição bulbo-espinal.
No sentido rostrocaudal, os primeiros neurônios 5-HT-IR no encéfalo do mocó
aparecem no nível de aproximadamente 6,7 mm posteriormente ao bregma (PB), em
território mesencefálico, coincidindo com a presença do colículo superior, núcleo
geniculado medial, substância negra, núcleo rubro e núcleo interpeduncular. Esses
neurônios 5-HT-IR formam um pequeno grupamento situado ventralmente à substância
cinzenta periaquedutal, núcleo do nervo óculo-motor (III par craniano) e fascículo
longitudinal medial, mais precisamente localizado entre a decussação tegmental dorsal,
dorsalmente, e a decussação tegmental ventral, ventralmente, através da qual se separa do
núcleo interpeduncular (Fig. 7). Pela localização e relações, identificamos esse grupamento
neuronal como o núcleo linear rostral da rafe (RLi), o qual se estende caudalmente até o
nível 6,8 mm PB, nível no qual também tem início rostralmente o núcleo dorsal da rafe
(DR), correspondendo a sua parte dorsal (DRD), do qual se separa pelo lemnisco medial, e
ventralmente se encontra a decussação tegmental ventral. Coincide também com o
aparecimento de outro aglomerado em forma de arco, de células 5-HT-IR, imersas entre as
fibras do lemnisco medial, situado lateralmente ao núcleo interpeduncular, reconhecido
como o grupamento B9 (núcleo supralemniscal) (Fig. 8).
Mais caudalmente, a aproximadamente 7,2 mm PB, o RLi dá lugar a um
grupamento mais vultoso de células 5-HT-IR, o núcleo linear caudal da rafe (CLi). Estas
células estão dispostas de forma esparsa, sendo atravessadas pelas fibras da decussação do
pedúnculo cerebelar superior. Lateralmente ao CLi estão as fibras do trato tecto-espinal.
Dorsalmente encontra-se sucessivamente o fascículo longitudinal medial, o núcleo do
nervo óculo-motor e o DR, já acrescido das porções lateral (DRL), ventral (DRV), e
posterior (PDR). Ventralmente ao CLi está o núcleo interpeduncular, lateralmente ao qual
encontra-se o grupamento serotoninérgico B9 (núcleo supralemniscal), caracteristicamente
situado imerso no lemnisco medial (Fig. 9).
Prosseguindo no sentido caudal, a aproximadamente 7,9 mm PB, o CLi é
deslocado dorsalmente e entre ele e o núcleo interpeduncular, já reduzido de tamanho,
28
interpõe-se um outro aglomerado de neurônios 5-HT-IR, reconhecido como o núcleo
mediano da rafe (MnR). De cada lado deste, neurônios 5-HT-IR, frouxamente organizados
em coluna vertical, constituem o núcleo paramediano da rafe (PMnR). Neste nível, o
grupamento B9 continua presente e o DR assume maiores dimensões, com todas as
subdivisões encontradas na secção anterior (Fig. 10).
No nível a seguir examinado, quando o núcleo interpeduncular é totalmente
substituído pelos núcleos pontinos, na altura de aproximadamente 8,5 mm PB, o CLi não
está mais presente, sendo todo espaço na linha média ventral ao DR e dorsal aos núcleos
pontinos, ocupado pelos MnR e PMnR. Neste nível, que coincide com a presença do
núcleo do nervo troclear (IV par craniano), o DR assume suas maiores dimensões. Dorso
lateralmente ao lemnisco medial continua presente o grupamento B9 (Fig. 11).
Num nível imediatamente caudal, a 8,8 mm PB, a configuração é bastante
semelhante, exceto pelo reduzido tamanho de B9 (Fig. 12).
A aproximadamente 9,2 mm PB, coincidente com o aparecimento dos núcleos
tegmentais na substância cinzenta periaquedutal, o DR aparece reduzido com as divisões
DRD e DRV, é seguido ventralmente pelos MnR e PMnR e ainda estão presentes raros
neurônios 5-HT-IR compondo o B9 (Fig. 13).
No nível do limite caudal dos colículos superiores, na altura de aproximadamente
9,4 mm PB, o DR ainda está presente, com as divisões DRD e DRV, e ventralmente a ele,
localizam-se os MnR e PMnR (Fig. 14). Os MnR e PMnR estendem-se até
aproximadamente 9,5 mm PB, juntamente com DRD e DRV (Fig. 15).
Em nível pontino, tendo como referência a presença do núcleo do nervo
abducente (VI par craniano), a aproximadamente 10,0 mm PB, encontramos ainda
neurônios do DR, compondo sua porção caudal (DRC) e, ventralmente a este, na linha
mediana, visualizamos um grupamento de neurônios 5-HT-IR, o qual identificamos como
o núcleo pontino da rafe (PnR) (Fig. 16).
Mais caudalmente, a aproximadamente 10,3 mm PB, na altura do núcleo
prepósito, encontramos o pólo caudal do DRC e, ventralmente, surgem os aglomerados de
neurônios 5-HT-IR que compõem os núcleos interpósito da rafe (RIP) e o magno da rafe
(RMg) (Fig. 17). O RIP continua caudalmente até aproximadamente a 11,2 mm PB,
juntamente com RMg (Figs. 17, 18 e 19). A aproximadamente 11,3 mm PB, o RMg
aparece sozinho e mais vultoso (Fig.20).
Dos níveis a 11,5 a 12,2 mm PB aproximadamente, quando se visualiza as fibras
do nervo facial (VII par), a linha mediana da ponte é ocupada por uma dupla faixa vertical
29
de neurônios 5-HT-IR, correspondendo em sua maior extensão ao núcleo obscuro da rafe
(ROb), dorsalmente, e em menor extensão, ainda o RMg, ventralmente (Figs. 21, 22 e 23).
A partir do nível 12,0 mm PB (Fig. 22) o RMg apresenta extensões laterais de neurônios 5-
HT-IR, dorsalmente às pirâmides, atingindo o maior volume dos níveis 12,8 mm a 13,7
mm PB (Figs. 24, 25 e 26).
Mais caudalmente, numa extensão que vai de aproximadamente 12,8 mm até 14,2
mm PB, além do ROb e do RMg, surge um pequeno grupamento de neurônios 5-HT-IR,
interposto entre as pirâmides, reconhecido como o núcleo pálido da rafe (RPa) (Figs. 24 a
28). O RPa, juntamente com o ROb, ainda se estende até aproximadamente 15,3 mm PB
(Fig. 29) e o ROb sozinho estende-se até a porção fechada do bulbo, em níveis de presença
dos núcleos dos nervos cranianos hipogloso (XII par) e vago (X par), a aproximadamente
16,6 mm PB (Figs. 30 e 31).
A figura 32 mostra os grupamentos serotoninérgicos distribuídos ao longo da
linha mediana do tronco encefálico em uma secção sagital mediana.
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
DISCUSSÃO
Pelo uso da técnica imunoistoquímica para revelar os neurônios produtores de 5-
HT no tronco encefálico do mocó, foi possível analisar a distribuição e topografia dos
neurônios marcados. Além disso, a comparação direta com material corado por técnica de
Nissl em secções alternadas, permitiu relacionar as células 5-HT-IR com os territórios
citoarquitetônicos relativos ou não aos núcleos da rafe no tronco encefálico do mocó. Os
resultados revelaram que a organização deste complexo nuclear foi essencialmente similar
ao que tem sido previamente descrito em outros mamíferos.
Por comparação com a organização do rato (Paxinos e Watson, 2007), com base
nas referências citoarquitetônicas, identificamos no mocó, no sentido rostrocaudal os
núcleos linear rostral da rafe, linear caudal da rafe, supralemniscal (B9), dorsal da rafe,
mediano da rafe, paramediano da rafe, pontino da rafe, interpósito da rafe, obscuro da rafe
e pálido da rafe.
O sistema serotoninérgico em associação com os núcleos da rafe também foi
estudado com imunoistoquímica para 5-HT no encéfalo de primatas como humano e
Macaca fascicularis, tendo sido identificados no grupo rostral, o núcleo dorsal da rafe (B7
e B6), central superior (B8, B5 e parte de B7) e supralemniscal (B9) e o grupo caudal,
consistindo dos núcleos magno da rafe (B3), obscuro da rafe (B2) e pálido da rafe (B1)
(Azmitia e Gannon, 1986). No sagui também foram identificados os núcleos do grupo
anterior – núcleos linear caudal , mediano da rafe, dorsal da rafe e pontino da rafe e os do
grupo posterior – núcleos magno da rafe, obscuro da rafe e pálido da rafe, além de
grupamentos serotoninérgicos extra-rafe, como o grupamento B9, em associação com o
lemnisco medial, alguns neurônios serotoninérgicos no núcleo interpeduncular, um número
substancial de células localizados lateral ao MnR na formação reticular no mesencéfalo
caudal e ponte rostral, na formação reticular bulbar, núcleo prepósito do hipoglosso e
outros (Hornung e Fritschy, 1988).
A distribuição, morfologia e subdivisões nucleares também foram estudados com
imuno-histoquímica para 5-HT, no sistema serotoninérgico nos encéfalos de um grande
número de espécies africanas, tais com um grande roedor noturno, o rato cachorro (greater
canerat) (Dwarika et al., 2008), a girafa (Badlangana et al., 2007), o gerbil africano
(highveld gerbil, Tatera brantsii) (Moon et al., 2007), em duas espécies de toupeiras
africanas (cape dune mole rat, Bathyergus suillus e highveld mole rat, Cryptomys
hottentotus pretoriae) (Da Silva et al., 2006; Bhagwandin et al., 2008; Bux et al., 2010),
57
morcegos microchiroptera (Maseko e Manger, 2007; Kruger et al., 2010) e megachiroptera
(Dell et al., 2010), rock hyrax (Maseko et al., 2007; Gravett et al., 2009), musaranho
elefante, um mamífero da ordem Macroscelidea (Pieters et al., 2010). Nos encéfalos dessas
espécies, os neurônios serotoninérgicos foram agrupados em um grupamento rostral,
essencialmente mesencefálico-pontino e um grupamento caudal, essencialmente bulbar.
No grupamento rostral foi incluído o núcleo linear caudal da rafe como o aglomerado mais
rostral de células, não se referindo a existência de um núcleo linear rostral da rafe, seguido
do grupo B9 (supralemniscal), o núcleo dorsal da rafe e o núcleo mediano da rafe. O
núcleo dorsal da rafe é dividido em 6 subnúcleos distintos, designados dorsal,
interfascicular, ventral, lateral, periférico e caudal. No grupamento caudal foi distinguido o
núcleo magno da rafe, o núcleo pálido da rafe, o núcleo obscuro da rafe e os grupamentos
bulbares ventrolaterais rostral e caudal.
O sistema serotoninérgico também foi estudado em duas espécies de marsupiais, o
gambá (Didelphis virginiana, Martin et al., 1985) e no wallaby (Macropus eugenii,
Ferguson et al., 1999). Como em mamíferos eutérios foi visto que o tronco encefálico
dessas espécies contém grupos de neurônios 5-HT-IR na linha média: o grupamento
rostral, compreendendo os núcleos linear caudal, mediano, dorsal e pontino da rafe, e
neurônios no núcleo interpeduncular, e o grupamento caudal, incluindo os núcleos magno,
obscuro e pálido da rafe, bem como células situadas mais lateralmente, reunidas no
grupamento B9, nas proximidades do núcleo tegmental pedúnculo-pontino e bulbo
ventrolateral (Ferguson et al., 1999).
Diferentemente dos autores acima citados, nós identificamos no tronco encefálico
do mocó um pequeno grupo de neurônios 5-HT-IR localizados no pólo caudal do núcleo
linear rostral da rafe. No nosso material, o núcleo dorsal da rafe pôde ser dividido em
partes dorsal, lateral, ventral e posterior, por analogia com as divisões estabelecidas no
núcleo dorsal da rafe do rato por Paxinos e Watson (2007). No que se refere à
lateralização, é importante destacar que, além do grupamento B9, não evidenciamos outros
aglomerados distanciados da linha média, sem continuidade com os grupamentos da linha
média.
Analisando os nossos resultados, em comparação com os dados da literatura,
podemos constatar que a organização dos neurônios serotoninérgicos no tronco encefálico
do mocó é muito similar à encontrada em outras espécies de roedores, assim como entre
outros mamíferos, com algumas pequenas variações, muitas das quais podem ser atribuídas
a critérios de nomenclatura. Isto reforça a sugestão de que o sistema serotoninérgico é um
58
sistema de neurotransmissores antigo e evolutivamente bem conservado (Parent, 1981).
Estudos prévios examinaram espécies mais aproximadas da ordem Rodentia
(Moon et al., 2007) mostrando que diferenças no fenótipo e história de vida também não
levam a alterações na complexidade nuclear. Analisando-se a diversidade das espécies
estudadas observa-se que a extensão da divergência evolutiva também não é um indicador
das diferenças na complexidade nuclear dos sistemas em estudo dentro da mesma ordem
de mamíferos. Assim, é possível concluir que para a ordem Rodentia, variações no
fenotipo, história de vida, estilo de vida e tamanho cerebral não levam a alterações na
complexidade nuclear do sistema serotoninérgico.
Desta forma o presente trabalho representa uma contribuição sob a forma de
fornecer subsídios para investigações futuras usando o mocó como modelo experimental
voltadas para aumentar a compreensão do papel funcional do sistema serotoninérgico.
59
CONCLUSÕES
Os resultados do presente trabalho, analisados à luz de trabalhos prévios, nos
permitem chegar às seguintes conclusões com relação ao sistema serotoninérgico/núcleos
da rafe do mocó:
1º. A imunoistoquímica para 5-HT foi eficiente para a marcação dos
neurônios serotoninérgicos presentes na rafe do mocó e juntamente com a
técnica de Nissl de seções adjacentes teve papel essencial na delimitação
dos núcleos da rafe;
2º. O sistema serotoninérgico do mocó é composto de 11 núcleos, nomeados
no sentido rostrocaudal de: linear rostral, linear caudal, dorsal da rafe,
mediano, paramediano, supralemniscal (B9), pontino, interpósito, magno,
pálido e obscuro;
3º. Os núcleos da rafe estão distribuídos ao longo da linha média do tronco
encefálico, exceto o grupamento B9 que desloca lateralmente, desde o
mesencéfalo caudal até o limite bulbo-espinal;
4º. De uma forma geral os núcleos da rafe serotoninérgicos se assemelham
aos núcleos do mesmo nome encontrados em outros mamíferos já
estudados, com exceção do linear rostral, o qual não é referido como um
núcleo serotoninérgico nas espécies já estudadas.
60
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS
O mocó (Kerodon rupestris) vem sendo utilizado como modelo experimental no
Programa de pós graduação em Psicobiologia da UFRN desde 2003, sendo utilizado no
Laboratório de Neuranatomia desde 2004.
Estudos com o mocó foram realizados nas linhas de caracterização de ritmos
circadianos, organização do sistema de temporização circadiana e projeções retinianos,
tendo originado produtos como teses de doutorado, dissertações de mestrado e trabalhos de
conclusão de curso e publicações em revistas científicas de indexação internacional.
Atualmente estão em andamento uma tese de doutorado, abordando aspectos
anatômicos do olho e neuroquímicos da retina, relacionados com o sistema de
temporização circadiana, uma dissertação de mestrado, caracterizando o sistema
dopaminérgico e a presente dissertação sobre o sistema serotoninérgico no mocó (Kerodon
rupestris).
Devemos levar em consideração que este é o primeiro trabalho que visa estudar o
sistema serotoninérgico nesse modelo experimental, dando continuidade a uma serie de
estudos que visam o mapeamento das estruturas cerebrais nessa espécie.
Nosso trabalho mostra uma estreita relação com o sistema serotoninérgico de
outras espécies de mamíferos já estudados, com poucas variações entre elas, o que mostra
a constância na apresentação desses núcleos da rafe, que vem resistindo ao longo da
evolução, e para a ordem Rodentia, variações de fenótipo e ambientais não interferem na
complexidade da organização nuclear do sistema serotoninérgico.
O presente trabalho se mostra como uma ferramenta essencial para estabelecer o
mocó como sujeito experimental para o desenvolvimento de pesquisas que visem o sistema
serotoninérgico, tanto nas suas bases fisiológicas, como na área de patologias que
envolvem esse complexo sistema.
Os mecanismos funcionais e a hodologia devem ser estudados a fim de
compreender a fundo as inter-relações entre os neurotransmissores e estruturas anatômicas
das varias espécies estudadas, sejam elas roedores, marsupiais, primatas humanos ou não
humanos.
Esse trabalho representa o inicio de uma linha de pesquisa voltada para o
conhecimento dos centros serotoninérgicos no mocó e em outras espécies correlatas ou
não, com o intuito de contribuir para esclarecimentos da anatomia e fisiologia de um dos
maiores relés de integração nervosa. Dessa forma a continuidade desse estudo pode ocorrer
61
a partir de uma série de possibilidades, tais como:
Caracterização neuroquímica de todos os núcleos da rafe;
Estudo da morfometria dos núcleos da rafe e de suas células;
Estudo funcional dos núcleos da rafe/grupamentos serotoninérgicos;
Estudo hodológicos do sistema serotoninérgico/rafe;
Estudos filogenéticos e ontogenéticos;
Contribuir com o “Projeto Atlas” do mocó.
62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1
Azmitia, E.C., Gannon, P.J., 1983. The ultrastructural localization of serotonin
immunoreactivity in myelinated and unmyelinated axons within the medial forebrain
bundle of rat and monkey. J. Neurosci. 3, 2083-2090.
Azmitia, E.C., Segal, M., 1978. An autoradiographic analysis of the differential ascending
projections of the dorsal and median raphe nuclei in the rat. J. Comp. Neurol. 179, 641-
666.
Badlangana, N.L., Bhagwandin, A,, Fuxe, K., Manger, P.R., 2007. Distribution and
morphology of putative catechollaminergic and serotonergic neurons in the medulla
oblongata of a sub-adult giraffe, Giraffa camelopardalis. J. Chem. Neuroanat. 34, 69-79.
Baker, K.G., Halliday, G.M., 1995. Ascending noradrenergic and serotoninergic systems in
the human brainstem. Neurotransmitters in the human brain. Plenum Press, New York, pp.
155-171.
Bhagwandin, A., Fuxe, K., Bennet, N.C., Manger, P.R., 2008. Nuclear organization and
morphology of cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic neurons in the
brains of two species of African mole-rat. J. Chem. Neuroanat. 35, 371-387.
Bjarkam, C.S., Sorensen, J.C., Geneser, F.A., 1997. Distribution and morphology of
serotonin-immunoreactive neurons in the brainstem of the New Zealand white rabbit. J.
Comp. Neurol. 380, 507-519.
Bogdanski, D.F, Pletscher A, Brodie B.D., Udenfriend, S. 1956. Identification and assay of
serotonin in brain. J. Pharmacol. Exp. Theor. 117, 82-88.
Bowker, R.M., Westlund, K.N., Sullivan, M.C., Coulter, J.D., 1982. Organization of
descending serotoninergic projections to the spinal cord. Prog. Brain Res. 57, 239-265.
Brodal, A., 1984. A formação reticular e alguns núcleos correlatos. In: Anatomia
Neurológica com Correlações Clínicas. Livraria Roca Ltda, São Paulo, pp. 86-87.
Brodal, E.T.A, Walberg, F., 1960. The nuclei of brain stem in the cat. II Efferent
connections. J. Comp. Neurol. 114, 239-259.
Burt, A.M., 1995. Neuroanatomia. Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, pp. 86-87.
Bux, F., Bhagwandin, A., Fuxe, K., Manger, P.R., 2010. Organization of cholinergic,
putative catecholaminergic and serotonergic nuclei in the diencephalon, midbrain and pons
of sub-adult male giraffes. J. Chem. Neuroanat. 39, 189-203.
Cabrera, A. 1961. Catalogo de los mamíferos de América del Sur. II. (Sirenia,
Perrissodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Cetacea). Revista del Museo Argentino de
Ciencias Naturales “BernardinoRivadavia”, Ciencias Zoológicas. 4:309-732.
Carlson, N.R., 2002. Fisiologia do comportamento. Editora Manole, São Paulo, pp. 124-
125.
Carvalho JMC. 1969.Notas de viagem de um zoólogo à região das caatingas e áreas
limítrofes. Fortaleza, Imprensa Universitária do Ceará.
_________________________ 1 De acordo com as normas da revista Journal of Chemical Neuroanatomy, para a qual foi submetido o artigo
correspondente.
63
Cavalcante, J. S., Alves, A.S., Costa, M.S.M.O., Brito, L. R. G., 2002. Differential
distribution of afferents containing serotonin and neuropeptide Y within the marmoset
suprachiasmatic nucleus. Brain Res. 927, 200-203.
Charara, A., Parent, A., 1998. Chemoarchitecture of the primate dorsal raphe nucleus. J.
Chem. Neuroanat 72, 111-127.
Crandall, L. S. 1964. Family caviidae, In: Manangement of the wild mammals captivity.
Chicago: Unversity of Chicago Press. Pp. 247-250.
Dahlstrom, A., Fuxe, K., 1964. Evidence for the existence of monoamine-containing
neurons in the central nervous system. I. Demonstration of monoamines in the cell bodies
of brain stem neurons. Acta Physiol. Scand. 62 (suppl. 232), 1-55.
Dahlstrom, A., Fuxe, K., 1965. Evidence for the existence of monoamine-containing
neurons in the central nervous system. II. Experimentally induced changes intraneuronal
amine levels of bulbo-spinal neuron systems. Acta Physiol. Scand. 64 (suppl. 247),1-36.
Da Silva, J.N., Fuxe, K., Manger, P.R., 2006. Nuclear parcellation of certain
immunohistochemically identifiable neuronal systems in the midbrain and pons of the
Highveld molerat (Cryptomys hottentotus). J. Chem. Neuroanat. 31, 37-50.
Dell, L.-A., Kruger, J-L., Bhagwandin, A., Jillani, N.E, Pettigrew J.D., Manger P.R., 2010.
Nuclear organization of cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic systems
in the brain of two megachiropteran species. J. Chem. Neuroanat. 40, 177-195.
Dwarika, S., Maseko, B.C., Ihunwo, A.O., Fuxe, K., Manger, P.R., 2008. Distribution and
morphology of putative catecholaminergic and serotonergic neurons in the brain of the
greatr canerat, Thryonomys swinderianus. J. Chem. Neuroanat. 35, 108-122.
Falck, B., Hillarp, N.A., Thieme, G., Torp, A., 1962. Fluorescence of catecholamines and
related compounds condensed with formaldehyde. J. Histochem. Cytochem. 10, 348-354.
Felten, D.L., Laties, A.M., Carpenter, M.B., 1974. Monoamine-containing cell bodies in
the squirrel monkey brain. Am. J. Anat. 139, 153-166.
Felten, D.L., Sladek, J.R., 1983. Monoamine distribution in primate brain. V. Monoamine
distribution in primate brain. V. Monoaminergic nuclei: anatomy, pathways and local
organization. Brain Res. Bull. 10, 171-284.
Ferguson, L.A., Hardman, C.D., Marotte, L.R., Salardini, A., Halasz, P., Vu, D., Waite,
P.M.E., 1999. Serotonergic neurons in the brainstem of the wallaby, Macropus eugenii. J.
Comp. Neurol. 411, 535-549.
Fite, K.V., Janusonis, S., Foote, W., Bengston, L., 1999. Retinal afferents to the dorsal
raphe nucleus in rats and mongolian gerbils. J. Comp. Neurol. 414, 469-484.
Fite, K.V., Birkett, M.A., Smith, A., Janusonis, S., McLaughlin, S., 2003. Retinal ganglion
cells projecting to the dorsal raphe and lateral geniculate complex in Mongolian gerbils.
Brain Res. 973, 146-150.
Frazão, R., Pinato, L., Silva, A. V., Brito, L. R. G., Oliveira, J. A., Nogueira, M. I., 2008.
Evidence of reciprocal connections between the dorsal raphe nucleus and the retina in the
monkey Cebus paella. Neuroscience Letters. 430, 119–123.
Fuxe, K., 1965. Evidence for the existence of monoamine neurons in the central nervous
system. IV. The distribution of monoamine terminals in the central nervous system. Acta
Physiol. Scand. 64 (suppl 247), 37-85.
64
Gravett, N., Bhagwandin. A., Fuxe, K., Manger, P.R., 2009. Nuclear organization and
morphology of cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic neurons in the
brain of the rock hyrax, Procavia capensis. J. Chem. Neuroanat. 38, 57-74.
Gurtler, H., Ketz, H.A., Kolb, E., Schoroder, L., Seidel, H., 1987. Coração e Circulação.
In: Fisiologia veterinária. Ed Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, pp. 257-288.
Halberstadt, A.L., Balaban, C.D., 2003. Organization of projections from the raphe nuclei
to the vestibular nuclei in rats. Neuroscience 120, 573–594.
Halberstadt, A.L., Balaban, C.D., 2006. Serotonergic and nonserotonergic neurons in the
dorsal raphe nucleus send collateralized projections to both the vestibular nuclei and the
central amygdaloid nucleus. Neuroscience 140, 1067–1077.
Harding, A., Paxinos, G., Halliday, G., 2004. The serotonin and tachykinin systems, in:
Paxinos, G. (Ed.), The rat nervous system. Elsevier, Amsterdam, pp. 1205-1256.
Hay-Schmidt, A., Vrang, N., Larsen, P.J., Mikkelsen, J.D., 2003. Projections from the
raphe nuclei to the suprachiasmatic nucleus of the rat. J. Chem. Neuroanat. 25, 293-310.
Hornung, J.P., Fritschy, J.M., 1988. Serotonergic system in the brainstem of the marmoset:
a combined immunocytochemical and three-dimensional reconstruction study. J. Comp.
Neurol. 270, 471-487.
Hoyer, D., Hannon, J.P., Martin, G.R., 2002. Molecular, pharmacological and functional
diversity or 5-HT receptors. Pharmacol. Biochem. Behav. 71, 533-544.
Imai, H., Steindler, D.A., Kitai, S.T., 1986. The organization of divergent axonal
projetions from the midbrain raphe nuclei in the rat. J. Comp. Neurol. 243, 363-380.
Itoh, K., Konish, A., Nomura, S., Mizuno, N., Nakamura, Y., Sugimoto, T., 1979.
Application of coupled oxidation reaction to electron microscopic demonstration of
horseradish peroxidase: cobalt-glucose oxidase method. Brain Res. 175, 341-346.
Jacobs, B.L., Azmitia, E.C., 1992. Structure and function of the brain serotonin system.
Physiol. Rev. 72, 165-229.
Jacobs, B.L., Gannon, P.J., Azmitia, E.C., 1984. Atlas of serotonergic cell bodies in the cat
brainstem: an immunocytochemical analysis. Brain Res. Bull. 13, 1-31.
Kandel, E.R. 2000. Disorders of mood: depression, mania and anxiety disorders, in:
Kandel, E.R., Schwartz, J.H., Jessell, T.M. (Eds.), Principles of neural science. Mcgraw-
Hill, New York, pp. 1216-1219.
Kent, O.L., Sladek, J.R., 1978. Histochemical, pharmacological and
microspectrofluorometric analysis of new sites of serotonin localization in the rat
hypothalamus. J. Comp. Neurol. 180, 221-236.
Kruger, J.-L., Dell, L.-A., Bhagwandin, A., Jillani, N.E., Pettigrew, J.D., Manger, P.R.,
2010. Nuclear organization of cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic
systems in the brains of five microchiropteran species. J. Chem. Neuroanat. 40, 210-222.
Lacher Jr., T.E. 1981. The comparative social behavior os Kerodon rupestres and Galea
spixii and the evolution of behavior in the caviidea. Bulletin of Carnegie Museum Natural
History. 17: 1-71.
Lee, S., Lee, H.S., Waterhouseb, B.D., 2008. The collateral projection from the dorsal
raphe nucleus to whisker-related, trigeminal sensory and facial motor systems in the rat.
Brain Res., 1214, 11–22.
65
Lidov, H.G.W., Molliver, M.E., 1982. Immunohistochemical study of the development of
serotonergic neurons in the rat CNS. Brain Res. Bull. 9, 559-604.
Martin, G.F., DeLorenzo, G., Ho, R.H., Humbertson, A.O. Jr, Waltzer, R., 1985.
Serotonergic innervations of the forebrain in the North American opossum. Brain Behav.
Evol. 26, 196-228.
Maseko BC, Manger PR. 2007. Distribution and morphology of cholinergic,
catecholaminergic and serotonergic neurons in the brain of Schreiber’s long-fingered bat,
Miniopterus schreibersii. J Chem Neuroanat 34:80-94.
Maseko, B.C., Bourne, J.A., Manger, P.R., 2007. Distribution and morphology of
cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic neurons in the brain of the
Egyptian rousette flying fox, Rousettus aegyptiacus. J. Chem. Neuroanat. 34, 108-127.
Massone, F., 2008. Anestesiologia Veterinária: Farmacologia e Técnicas. Guanabara
Koogan, Rio de Janeiro, 571 pp.
Meyer-Bernstein, E.L., Morin, L.P., 1996. Diferential serotonergic innervations of the
suprachiasmatic nucleus and the intergeniculate leaflet and its role in circadian rhythm
modulation. J. Neurosci. 16, 2097-2111.
Moga, M.M., Moore, R.Y., 1997. Organization of neural inputs to the suprachiasmatic
nucleus in the rat. J. Comp. Neurol. 389, 508-534.
Moojen, J. 1952. Os roedores do Brasil. Rio de Janeiro: Mininstério da Educação e Saúde/
Instituto Nacional do Livro. pp. 214. (biblioteca científica brasileira. Série A - II)
Moon, D.-J, Maseko, B.C., Ihunwo, A.O., Fuxe, K., Manger, P.R., 2007. Distribution and
morphology of catecholaminergic and serotonergic neurons in the brain of the highveld
gerbil, Tatera brantsii. J. Chem. Neuroanat. 34, 134-144.
Moore, R.Y., Halaris, A.E., Jones, B.E., 1978. Serotonin neurons of the midbrain raphe:
ascending projections. J. Comp. Neurol. 180, 417-438.
Nascimento Jr, E. S., Duarte, R. B., Silva, S. F., Engelberth, R. C. G. J., Toledo, C. A. B.,
Cavalcante, J. S., Costa, M. S. M. O. 2008. Retinal projections to the thalamic
paraventricular nucleus in the rock cavy (Kerodon rupestris). Brain Res. 1241, 56-61.
Nascimento Jr, E. S., Souza, A. M., Duarte, R. B., Magalhães, M. A. F., Silva, S. F.,
Cavalcante, J. C., Cavalcante, J. S., Costa, M. S. M. O. 2010. The suprachiasmatic nucleus
and the intergeniculate leaflet in the rock cavy (Kerodon rupestris): Retinal projections and
immunohistochemical characterization. Brain Res. 1320, 34-46.
Nascimento Jr, E. S., Cavalcante, J. S., Cavalcante, J. C., Costa, M. S. M. O. 2010. Retinal
afferents to the thalamic mediodorsal nucleus in the rock cavy (Kerodon rupestris).
Neuroscience Letters. 475, 38–43.
Nogueira, M.I., Rezende, B.D., Ribeiro do Vale, L.E., Bittencourt, J.C., 1999. Afferent
connections of the caudal raphe pallidus nucleus in rats: a study using the fluorescent
retrograd tracers fluorogold and true-blue. Ann. Anat. 181, 35-45.
Oliveira, M.F. 2003. Placentação em mocós, Kerodon ruprestris, Wied 1820. Tese
(Doutorado em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres). Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. São Paulo, SP.
66
Parent, A., 1981. Comparative anatomy of the serotoninergic systems. J. de Physiologie
77, 147-156.
Parent, A., Descarries, L., Beaudet, A., 1981. Organization of ascending serotonin systems
in the adult rat brain. A radioautographic study after intraventricular administration of
[3H]5-HT. Neuroscience 6, 115-138.
Paxinos, G, Watson, C., 2007. The rat brain in stereotaxic coordinates. 2ª Ed. Academic
Press, San Diego.
Peyron, C., Petit, J.M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P.H., 1998. Forebrain afferents to
the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.
Neuroscience 82, 443-468.
Pieters, R.P., Gravett, N., Fuxe, K., Manger, P.R., 2010. Nuclear organization of
cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic nuclei in the brain of the eastern
rock elephant shrew, Elephantulus myurus. J. Chem. Neuroanat. 39, 175-188.
Pinato, L., Allemandi, W., Abe, L. K., Frazão, R., Cruz-Rizzolo, R. J., Cavalcante, J. S.,
Costa, M.S.M.O., Nogueira, M. I. A., 2007. A comparative study of cytoarchitecture and
serotonergic afferents in the suprachiasmatic nucleus of primates (Cebus apella and
Callithrix jacchus) and rats (Wistar and Long Evans strains). Brain Res. 1149, 101-110.
Pinheiro, M. J. P.; Andrade, S. A.; Cunha, J. N. 1989.Preservação e exploração de animais
silvestres nativos: preá, cutia e mocó. Caatinga. 6. 28-49,
Pontes, A.L.B.; Engelberth, R.C.G.J.; Nascimento Jr, E.S.; Cavalcante, J.C.; Costa,
M.S.M.O.; Pinato, L.; Toledo, C.A.B.; Cavalcante, J.S. 2010. Serotonin and circadian
rhythms. Psychology & Neuroscience 3, 1-49.
Ramon y Cajal, S., 1911. Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des vertebres II.
Malone, Paris.
Roberts, M.; Malini, AK, E.; Deal, M. 1984.The reprodutive biology of the rock cavy,
Kerodn rupestris, in captivity: A study of reproductive adaptation in a trophic specialist.
Mammalia.48. 253-266.
Rowe, D.L., Honeycutt, R.L., 2002. Phylogenetic relationships, ecological correlates, and
molecular evolution within the Cavioidea (Mammalia, Rodentia). Mol. Biol. Evol. 19, 263-
277.
Silva Neto, E.J., 2000. Morphology of the regions ethmoidalis and orbitotemporalis in
Galea musteloides Meyen 1832 and Kerodon rupestris (Wied-Neuwied 1820) (Rodentia:
Caviidae) with comments on the phylogenetic systematics of the Caviidae. J. Zool. Syst.
Evol. Research 38, 219-229.
Sousa, R.A., Menezes, A.A.L. 2006. Circadian Rhythms of motor activity of the Brazilian
rock cavy (Kerodon rupestris) under artificial photoperiod. Biol Rhythm. Res. 3: 443-450.
Steinbusch, H.W.M., 1981. Distribution of serotonin-immunoreactivity in the central
nervous system of the rat-cell bodies and terminals. Neurocience 6, 557-618.
Steinbusch, H.W.M., Verhofstad, A.A., Joosten, H.W., 1978. Localization of serotonin in
the central nervous system by immunohistochemistry: description of a specific and
sensitive technique and some applications. Neuroscience 3, 811-819.
67
Taber, E., Brodal, A., Walberg, F., 1960. The raphe nuclei of the brain stem in the cat. I.
Normal topography and cytoarchitecture and general discussion. J. Comp. Neurol. 114,
161-167.
Takase, L.F., Nogueira, M.I., 2008. Patterns of fos activation in rat raphe nuclei during
feeding behavior. Brain Res. 1200, 10-18.
Takeuchi, Y., Kimura, H., Sano, Y., 1982. Immunohistochemical demonstration of the
distribution of serotonin neurons in the brainstem of the rat and the cat. Cell Tissue Res.
224, 247-267.
Törk, I., 1985. Raphe nuclei and serotonin containing systems, in: Paxinos, G. (Ed.), The
rat nervous system. Ed Academic Press Australia, Sidney, pp. 43-78.
Törk, I., 1990. Anatomy of the serotonergic system. Ann. N. Y. Acad. Sci. 600, 9-35,
1990.
Twarog, B.M., Page, I.H., 1953. Serotonin content of some mammalian tissues and urine
and a method for its determination. J. Physiol. 175, 157-161.
Vergé, D., Calas, A., 2000. Serotoninergic neurons and serotonin receptors: gains from
cytochemical approaches. J. Chem. Neuroanat. 18, 41-56.
Vertes, R.P., 1991. A PHA-L analysis of ascending projections of the dorsal raphe nucleus
in the rat. J. Comp. Neurol. 313, 643-668.
Vertes, R.P., Kocsis, B., 1994. Projections of the dorsal raphe nuclei to the brainstem:
PHAL analysis in the rat. J. Comp. Neurol. 340, 11-26.
Vertes, R.P., Fortin, W.J., Crane, A.M., 1999. Projections of the median raphe nucleus in
the rat. J. Comp. Neurol. 407, 555-582.
Von Bohlen und Halbach, O., Dermietzel, R., 2006. Neurotransmitters and
Neuromodulators. Wiley-VCH, Weinheim, Germany, pp. 132-143.
Zamboni, L., De Martino, L., 1967. Buffered picric acid formaldehyde: A new rapid
fixative for electron microscopy. J. Cell Biol. 35, 148A.
ANEXOS
Artigo a ser submetido à revista Journal of Chemical Neuroanatomy.
68
Nuclear organization of serotonergic system in the brain of the rock cavy (Kerodon
rupestris)
Joacil G Soares*, José R L P Cavalcanti, Francisco G Oliveira, André L B Pontes, Twyla
B Sousa, Leandro M Freitas, Jeferson S Cavalcante, Expedito S Nascimento Jr, Judney C
Cavalcante, Miriam S M O Costa.
Departments of Morphology and Physiology, Laboratory of Neuroanatomy, Bioscience
Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil
With ____ pages and ____ figures.
*Corresponding author:
Joacil Germano Soares
Department of Morphology/Laboratory of Chronobiology, Bioscience Center, Federal
University of Rio Grande do Norte, 59072-970, Natal-RN, Brazil.
Telephone Number: 55 84 32153431
Fax: 55 84 2119207
E-mail address: [email protected]
69
ABSTRACT
Serotonin or 5-hydroxytryptamine (5-HT) is a substance found in many tissues of the
body, including as a neurotransmitter in the nervous system, in which may exert varied
post-synaptic actions. Inside the neuro-axis, the location of 5-HT neurons is almost
restricted to the raphe nuclei of the brainstem, such that 5-HT-immunoreactivity can be
considered a marker of the raphe nuclei. The raphe nuclei are located in the brainstem, at
or near the midline. The serotonergic groups were alphanumerically in caudorostral
direction classified as B1 to B9 groups in the rat. In this study the distribution of
serotonergic neurons was studied in the brain of the rock cavy (Kerodon rupestris), a
species of rodent endemic to Northeastern Brazil. The cytoarchitectonic location of
serotonergic neurons was established in series of adjacent coronal and sagittal sections
stained by the Nissl method and 5-HT immunohistochemistry. Thus, we defined the
following nuclei: rostral linear raphe, caudal linear raphe, dorsal raphe, median raphe,
paramedian raphe, pontine raphe nuclei, and B9 cluster, constituting the anterior group,
and raphe interpositus, raphe magnus, raphe pallidus and raphe obscurus nuclei,
constituting the inferior group, comparable to which has been described for other
mammalian species.
Keywords: brainstem, immunohistochemistry, raphe nuclei, rock cavy, rodent, serotonin.
70
INTRODUCTION
The location of large neurons forming clusters at the midline of the brainstem has
attracted the attention of anatomists since the time of Ramón y Cajal, who described these
cells as large multipolar neurons, with uncertain projections (Ramon y Cajal, 1911).
Decades later, based on cytoarchitectonic study, the raphe nuclei in the cat were first
described as a set of eight nuclei along the midline, from the midbrain to the bulbospinal
transition, so called from rostral to caudal direction: rostral linear nucleus of the raphe,
caudal linear nucleus of the raphe, dorsal raphe nucleus, superior central (or median) raphe
nucleus, pontine raphe nucleus, raphe magnus nucleus, raphe palllidus nucleus and raphe
obscurus nucleus (Taber et al., 1960).
The interest in studying the morphology and functions of the raphe nuclei was
sparked after the description of a system of monoaminergic neurons in the rat brainstem,
evidenced by the technique of formaldehyde-induced fluorescence (Falk et al., 1962;
Dahlström and Fuxe, 1964; 1965). Although it had been noted a large overlap between
putatively producing serotonin (5-HT) neurons and the raphe nuclei, the then evidenced
serotonergic groups were designated as B1 to B9 groups from caudal to rostral direction
(Dahlström and Fuxe, 1964; Fuxe, 1965). With the introduction of immunohistochemical
techniques, this classification was integrated with the cytoarchitectonic nomenclature of
the raphe system (Steinbusch et al., 1978; Steinbusch, 1981; Törk, 1985). While the main
cell groups in the serotonin system follow the cytoarchitectonic divisions of the raphe
nuclei, the overlap is not precise, since many neurons 5-HT-IR is present in other sectors
of the reticular formation, beyond the boundaries of the raphe nuclei, although apparently
continuous with the clusters of 5-HT-IR cells, as well as, some non-serotonergic neurons
are present in the raphe nuclei (Törk, 1985, Harding et al., 2004).
The diversity of receptors on which it operates, together with the widespread
distribution of serotonergic innervation explains the variety of functions in which 5-HT is
involved, including regulation of sleep-wake cycle, dream control, arousal and attention,
memory and learning, mood control, feeding behavior, sexual behavior, thermoregulation,
nociceptive sensory processing, circadian regulation, among others. Moreover, the 5-HT
dysfunction has been associated with several neuropathological processes, such as sleep
disturbances, anxiety, depression, aggression, anorexia and bulimia, as well as
neurodegenerative diseases, such as, Alzheimer, Parkinson and Huntington diseases
(Jacobs and Azmitia, 1992; Vergé and Calas, 2000; Cools et al., 2008; Takase and
71
Nogueira, 2008).
As earlier mentioned, the serotonergic neurons in the brain are located
predominantly in the brainstem along the midline or near to it, featuring the raphe nuclei.
However, not all raphe neurons contain 5-HT, and the proportion of neurons that produce
5-HT in each location varies considerably (Törk, 1985; Harding et al., 2004). Among other
substances found in the raphe nuclei may be cited substance P, thyrotropin-releasing
hormone (TRH), norepinephrine and gamma-aminobutyric acid (GABA) and may be co-
located or not with 5-HT (Jacobs and Azmitia , 1992; Charara and Parent, 1998).
Moreover, a few serotonergic neurons are out of the raphe nuclei, as for example in the
vicinity of the medial lemniscus, or sectors of the reticular formation (Jacobs and Azmitia,
1992; Charara and Parent, 1998). Therefore, serotonergic groups were originally
alphanumerically classified as B1 to B9 from medulla to midbrain in the rat (Dahlstrom
and Fuxe, 1964) and may be correlated with the raphe nuclei, which are usually divided
into superior and inferior groups. The superior group consists of four main nuclei: the
caudal linear raphe nucleus (CLi, B8), median raphe nucleus (MnR, B8 and B5, previously
referred to as the central superior nucleus) and laterally displaced cells in the pontine
nucleus centralis oralis, the lateral neurons of B9 group, located just dorsal to the medial
lemniscus and the dorsal raphe nucleus (DR, B7 and B6). The most rostral of the raphe
nuclei, as cytoarchitectonicly defined, is called rostral linear raphe nucleus and contains
only rare serotonergic neurons, being predominantly a dopaminergic nucleus (Törk, 1985).
The inferior group consists of five main nuclei: the raphe obscurus nucleus (ROb, B2),
raphe pallidus nucleus (RPa, B1 and B4), raphe magnus nucleus (RMg, B3), neurons in the
ventrolateral medulla, including nucleus lateral paragigantocelular and intermediate
reticular nucleus (B1/B3) and area postrema (Brodal and Walberg, 1960; Jacobs and
Azmitia, 1992, Harding et al., 2004). The anatomy of these groups has been reviewed in
many species, including rats (Parent et al. 1981; Lidov and Molliver, 1982; Takeuchi et al.,
1982; Törk, 1985; Paxinos and Watson, 2007), rabbit (Bjarkam et al ., 1997), cat
(Takeuchi et al., 1982; Jacobs et al., 1984), humans (Törk, 1990; Hornung, 2003) and
monkeys of the New and Old World (Felten et al. 1974; Felten and Sladek, 1983; Azmitia
and Gannon, 1983; Hornung and Fritschy, 1988).
The most recent systematization of the raphe nuclei (serotonergic groups) in the
rat brain, according to Paxinos and Watson (2007), indicates the existence of 10 nuclear
neuron clusters, in rostrocaudal sequence: in the midbrain, the rostral linear raphe nucleus
(RLi), caudal linear raphe nucleus (CLi), dorsal raphe nucleus (DR), median raphe nucleus
72
(MnR) and paramedian raphe nucleus (PMnR). On the pons, the pontine raphe nucleus
(PnR) and raphe interpositus nucleus (RIP). Finally, in the medulla, the raphe magnus
nucleus (RMg), raphe pallidus nucleus (RPa) and raphe obscurus nucleus (ROb) (Paxinos
and Watson, 2007).
Although there are a substantial number of non-serotonergic cells in the raphe
nuclei, it is recognized that the long ascending and descending projections from neurons
are serotonergic (Jacobs and Azmitia, 1992; Charara and Parent, 1998; Halberstadt and
Balaban, 2006). Serotonergic fibers are thin, barely myelinated and highly collateralized.
There seems to be an evolutionary trend, noting that in primate species, in addition to the
midline location, there are neurons located more laterally (lateralization) and a large
proportion of serotonergic fibers are myelinated (Jacobs and Azmitia, 1992; Bjarkam et al.,
1997).
The rock cavy (Kerodon rupestris) is a rodent species found in the semi-arid
caatinga of Northeast Brazil. According to traditional taxonomic classification based on
morphological and behavioral aspects, the rock cavy is classified in the superfamily
Cavioidea, Caviidae family, subfamily Caviinae, gender Kerodon along with Cavia, Galea
and Microcavia (Cabrera, 1961; Lacher Jr, 1981; Silva Neto, 2000). Morphological (Silva
Neto, 2000) and molecular biology (Rowe and Honeycutt, 2002) studies signed the gender
Kerodon sistered with Hydrochaeridae family, to which also belongs the capybara
(Hydrochaeris) and closely aligned with the Dolichotinae subfamily.
Regarding the rock cavy motor activity pattern, records of field observations show
that on dark days these animals out to feed in the morning and afternoon, while on bright
days the activity is concentrated during the night. Other observations indicate foraging
activity throughout the day and night (Lacher Jr, 1981).
In a controlled laboratory conditions study, it was discovered that the rock cavy is
active throughout the 24-hour day, although its activity is enhanced in sunrise and sunset
phases, suggesting a predominantly crepuscular behavior (Sousa and Menezes, 2006).
This study was carried out aiming to identify by 5-HT immunohistochemistry and
cytoarchitecture by Nissl technique, the serotonergic neuronal groups associated to raphe
nuclei in the brain of the rock cavy (Kerodon rupestris). This study will provide a basis for
posterior studies on hodological and functional aspects on these neuronal groups in this
species.
73
MATERIAL AND METHODS
Four male and female young adult rock cavies, weighting from 300 to 400 g, from
countryside municipalities of the state of Rio Grande do Norte, Brazil, were used. The
animals were captured after permission from the Brazilian Environmental Agency
(IBAMA, licenses 21440-1). Approval for the experiments was obtained from the local
Animal Ethics Experimentation Committee and conformed to National Institutes of Health
(NIH) guidelines. All efforts were made to minimize the number of animals and their
suffering.
The animals were housed in 3.00 x 2.00 x 2.60 m masonry cages, with four wire screen
walls, ceramic tile ceiling and natural soil floor with creeping vegetation and rocks,
simulating the animal’s natural habitat. The animals were exposed to environmental
temperature, air humidity and light, with unlimited access to food and water.
Each animal was pre-anesthetized with an intramuscular injection of tramadol chloridate
and xylazine, both 5 mg/Kg and maintened with gas isofluoran and oxygen 100%. Upon
deep anesthesia they were perfused using a cannula positioned in the aorta and connected
to a peristaltic pump (Cole-Parmer) with 300 ml of 0.9% saline solution in 0.1M phosphate
buffer, pH 7.4, containing heparin (Parinex, Hipolabor, Sabará, MG, Brazil, 2ml/1000ml of
saline solution) for around 5 minutes. Next, 700 ml of a 4% paraformaldehyde, 2% picric
acid and 0.05% glutaraldehyde in 0.1M phosphate buffer, pH 7.4 fixative solution
(Zamboni and De Martino, 1967) was pumped, half of the solution with a 6.0 ml/minute
flow rate and the other half 3.0 ml/minute, the entire procedure spending 30 minutes.
After perfusion, two animals were placed in the stereotaxic frame and the incisor bar was
adjusted until the lambda and bregma were at the same height. The skull bones were
removed to expose the dorsal surface of the encephalon, which was sectioned into 3 blocks
by means of two coronal sections: one at the bregma level and the other at the lambda
level. Finally, the encephalon was removed from the skull, stored in 30% sucrose solution
in 0.1M phosphate buffer, pH 7.4, for 24 to 48 hours, and then sectioned by dry ice
freezing in sliding microtome, obtaining coronal sections of 30 µm. The brains of two
animals were sectioned at the sagittal plane. In both cases, the sections were collected
sequentially into 6 compartments, each one containing one of every 6 sections, thereby
representing a serial sequence with a distance of 0.18 mm between the sections.
Sections from on series were immediately mounted on gelatin coated glass slides
and Nissl stained with thionin, to visualize the cytoarchitectonic delimitation of neuronal
74
groups. Sections from another series were submitted to immunohistochemistry to reveal 5-
HT. All the immunohistochemical procedures were performed at room temperature. The
sections, previously submitted to pre-treatment with sodium borohydride and hydrogen
peroxide (H2O2), were placed in contact with the antibody rabbit anti-5-HT (Sigma,
1:5000) and 2% of normal goat serum in 0,4% Triton X-100 in a rotator for 18 hours,
followed by incubation in the secondary antibody, consisting of 1:1000 dilution of
biotinylated goat anti-rabbit (Jackson Immunoresearch Labs.) under gentle shaking in a
rotator, for 90 minutes. To visualize the reaction, the sections underwent a 90 minutes
incubation in avidin-biotin- HRP complex (Vector Elite ABC kit). This was followed by
the final reaction in medium containing H2O2 as substrate and diaminobenzidine (DAB) as
chromogen. The H2O2 was offered indirectly, by placing oxidase glucose and ß-D glucose
into the solution, causing a reaction in which the first acting on the second releases H2O2
(Itoh et al., 1979). At the beginning, between one step and another and at the end, the
sections were thoroughly washed with 0.1M phosphate buffer, pH 7.4. The sections were
mounted on previously gelatinized glass slides, which, after drying at room temperature,
were submersed rapidly in a solution of 0.05% osmium tetroxide to intensify the reaction.
As control for staining specificity, a number of sections were submitted to
immunohistochemical reactions omitting the primary or secondary antibodies.
The 5-HT-immunostained and Nissl-stained sections of the rock cavy brainstem
were analyzed under optical microscope (Olympus BX41) on bright field. Digital images
were obtained of representative sections using a digital video camera (Nikon DXM1200)
coupled to the microscope. The images were analyzed, corrected minimally for brightness
and contrast, and mounted using Adobe Photoshop 7.0 software. The results are
documented in photomicrographs and diagrams.
75
RESULTS
In this study, 5-HT immunohistochemistry was used to, in conjunction with the
Nissl technique in adjacent sections, delimitate the raphe nuclei in the rock cavy. The
distribution of 5-HT-IR neurons is shown in photomicrographs of Nissl and
immunostained coronal and sagittal sections taken from a representative animal. We found
5-HT immunoreactive (5-HT-IR) neurons throughout the brainstem, predominantly in the
midline, from the level of the middle portion of the interpeduncular nucleus to the
spinomedullary transition.
In the rostrocaudal direction, the first 5-HT-IR neurons in the rock cavy brain
appear at the level of approximately 6.7 mm posterior to bregma (pb) in mesencephalic
ground, coinciding with the presence of the superior colliculus, medial geniculate nucleus,
substantia nigra, red nucleus and interpeduncular nucleus. These neurons 5-HT-IR form a
small cluster located ventral to the periaqueductal gray, nucleus of the oculomotor nerve
(cranial nerve III) and medial longitudinal fasciculus, more precisely located between the
dorsal tegmental decussation, dorsally and the ventral tegmental decussation and the
interpeduncular nucleus, ventrally (Fig. 1). Based in the location and the relationships, we
identified this grouping as the rostral linear raphe nucleus (RLi), which extends caudally to
the level 6.8 mm pb. This level is also marked by the beginning of the dorsal portion of the
dorsal raphe nucleus (DR), incrusted in the ventral periaqueductal gray. It also coincides
with the appearance of another arc shaped neuronal group of 5-HR-IR cells, immersed
among the fibers of the medial lemniscus, lateral to the interpeduncular nucleus,
recognized as the B9 group (supralemniscal nucleus) (Fig. 2).
More caudally, approximately 7.2 mm bp, the RLi is replaced by a bulkier cluster
of 5-HT-IR cells, the caudal linear raphe nucleus (CLi). These cells are arranged in a
scattered way, being traversed by the fibers of the decussation of the superior cerebellar
peduncle. Lateral to CLi are the fibers of the tectospinal tract. Dorsally is successively
found the medial longitudinal fasciculus, the nucleus of the oculomotor nerve and the DR,
at this point exhibiting the lateral (DRL), ventral (DRV) and posterior (DRP) portions.
Ventral to the CLi is the interpeduncular nucleus, lateral to which is the serotonergic
grouping B9 (supralemniscal nucleus), characteristically located immersed in medial
lemniscus (Fig. 3).
Proceeding caudally, approximately 7.9 mm pb, the CLi is displaced dorsally and
between it and the interpeduncular nucleus, already reduced in size, bringing up another
76
cluster of 5-HT-IR neurons, recognized as the median raphe nucleus (MnR). On each side
of this, 5-HT-IR neurons, loosely arranged in vertical columns, constitute the paramedian
raphe nucleus (PMnR). At this level, the B9 group is still present and the DR assumes
larger dimensions, with all the subdivisions found in the previous section (Fig. 4).
At the next level, in which the interpeduncular nucleus is completely replaced by
the pontine nuclei, at approximately 8.5 mm pb, the CLi is no longer present, and all space
in the midline ventral to the DR and dorsal to the pontine nuclei, is occupied by MnR and
PMnR. At this level, which coincides with the presence of the nucleus of trochlear nerve
(cranial pair IV), the DR assumes its largest dimensions. Laterally, dorsal to the medial
lemniscus, there remains the B9 group (Fig. 5).
At approximately 8.8 mm pb level, the setting is very similar except for the small
size of B9 (Fig. 6).
At approximately 9.2 mm pb, coincident with the appearance of tegmental nuclei
in the periaqueductal gray, the DR appears to be size reduced with the DRD and DRV
divisions, is followed ventrally by MnR and PMnR, and rare 5-HT-IR neurons composing
the B9 are still present (Fig. 7).
At the caudal limit of the superior colliculi, around 9.4 mm pb, the DR is still
present, with the divisions DRD and DRV, and ventrally to it, the MnR and PMnR are
located (Fig. 8). The MnR and PMnR extend to approximately 9.5 mm pb, along with
DRD and DRV (Fig. 9).
At pontine level, with reference to the presence of the nucleus of the abducens
nerve (cranial pair VI), approximately 10.0 mm pb, we found some neurons in the DR,
making its caudal portion (DRC), and ventral to this, we noted in the midline, a cluster of
5-HT-IR neurons, which we identify as the pontine raphe nucleus (PnR) (Fig. 10).
More caudally, at approximately 10.3 mm pb, at level of the prepositus nucleus,
we found the caudal pole of the DRC and, ventrally, there were clusters of 5-HT-IR
neurons nuclei that make up the raphe interpositus nucleus (RIP) and the raphe magnus
nucleus (RMg) nuclei (Fig. 11). RIP continues caudally to approximately 11.2 mm pb,
along with RMg (Figs. 11, 12 and 13). At approximately 11.3 mm pb, the RMg appears
alone and bulkier (Fig. 14).
Approximately from 11.5 to 12.2 mm pb levels, when viewing the fibers of the
facial nerve (cranial pair VII), the midline of the pons is occupied by a double vertical
band of 5-HT-IR neurons, corresponding to its greater extent to the raphe obscurus nucleus
(ROb), dorsally, and to a lesser extent, also the RMg, ventrally (Figs. 15, 16 and 17). At
77
12.0 mm pb level (Fig. 16) the RMg shows lateral extensions of 5-HT-IR neurons, dorsally
to the pyramids, reaching higher volume from 12.8 mm to 13.7 mm pb levels (Figs. 18, 19
and 20).
More caudally, at a length ranging from approximately 12.8 mm to 14.2 mm pb
levels, besides the ROb and RMg, there is a small cluster of 5-HT-IR neurons, interposed
between the pyramids, recognized as the raphe pallidus nucleus (RPa) (Figs. 18 to 22). The
RPa, along with ROb, even extends to approximately 15.3 mm pb (Fig. 23) and ROb alone
extends to the closed portion of the medulla oblongata, levels corresponding to the
presence of the nuclei of cranial nerves hypoglossal (XII cranial pair) and vagus (X cranial
pair), at approximately 16.6 mm pb (Figs. 24 and 25).
78
DISCUSSION
By use of immunohistochemical technique to reveal the 5-HT-producing neurons,
it was possible to analyze the distribution and topography of labeled neurons. Moreover,
direct comparison with Nissl stained material in alternating sections, allowed to associate
5-HT-IR cells with respect cytoarchitectonic territories related or not the raphe nuclei in
the rock cavy brainstem. The results revealed that the organization of this nuclear complex
was essentially similar to what has previously been described in other mammals. By
comparison with the organization of the rat brain (Paxinos and Watson, 2007), based on
cytoarchitectonic references, we identified in the rock cavy, in rostrocaudal direction, the
rostral linear raphe nucleus, the caudal linear raphe nucleus, the supralemniscal group
(B9), the dorsal raphe nucleus, the median raphe nucleus, the paramedian raphe nucleus,
the pontine raphe nucleus, the raphe interpositus nucleus, the raphe pallidus nucleus, the
raphe magnus nucleus and the raphe obscurus nucleus.
The serotonergic system in association with the raphe nuclei was also studied
using immunohistochemistry for 5-HT in the brain of human and Macaca fascicularis
primates, in which were identified in the rostral group, the dorsal raphe nucleus (B6 and
B7), superior central (B8, B5 and B7 in part) and supralemniscal (B9) and the caudal
group, consisting of the raphe magnus nucleus (B3), the raphe obscurus nucleus (B2) and
raphe pallidus nucleus (B1) (Azmitia and Gannon, 1986; Hornung, 2003). In the marmoset
brain was also identified the nuclei of the anterior group - caudal linear raphe nucleus,
median raphe nucleus, dorsal raphe nucleus and pontine raphe nucleus, and the posterior
group - raphe magnus nucleus, raphe obscurus nucleus and raphe pallidus nucleus, in
addition extra-raphe serotonergic groups, such as the supralemniscal B9 group, a few
serotonergic neurons in the interpeduncular nucleus, a substantial number of cells located
lateral to median raphe nucleus, in the reticular formation of the caudal midbrain and
rostral pons, in the bulbar reticular formation, nucleus prepositus and others (Hornung and
Fritschy, 1988).
The distribution, morphology and nuclear subdivisions were also studied with 5-
HT immunohistochemistry in the serotonergic system in the brains of a large number of
African species, such as a large nocturnal rodent, the dog rat (Greater canerat) (Dwarika et
al ., 2008), giraffe (Badlangana et al., 2007), the African gerbil (highveld gerbil, Tatera
brantsii) (Moon et al., 2007), in two species of African mole rat (Cape dune mole rat, and
Bathyergus suillus highveld mole rat, Cryptomys hottentotus pretoriae) (Da Silva et al.,
79
2006; Bhagwandin et al., 2008; Bux et al., 2010), microchiroptera bats (Maseko and
Manger, 2007; Kruger et al., 2010) and megachiroptera bats (Dell et al., 2010), rock hyrax
(Maseko et al., 2007; Gravett et al., 2009), elephant shrew, a mammal of the order
Macroscelidea (Pieters et al., 2010). In the brains of these species, the serotonergic neurons
were grouped in a rostral cluster, mesencephalic-pontine and a caudal cluster, essentially
bulbar. In the rostral group were included the caudal linear raphe nucleus as the most
rostral cluster of 5-HT-IR cells, not reporting the existence of a rostral linear raphe
nucleus, followed by group B9 (supralemniscal), the dorsal raphe nucleus and median
raphe nucleus. The dorsal raphe nucleus is divided into six distinct subnuclei, called dorsal,
interfascicular, ventral, lateral, and peripheral ones. In the caudal group was recognized
the raphe magnus nucleus, the raphe pallidus nucleus, the raphe obscurus nucleus and
rostral and caudal ventrolateral medullary groupings.
The serotonergic system was also studied in two species of marsupials, the
opossum (Didelphis virginiana, Martin et al., 1985) and the wallaby (Macropus eugenii,
Ferguson et al., 1999). As was seen in eutherian mammals, the brainstem of these species
contains groups of 5-HT-IR neurons in the midline: the rostral cluster, comprising the
caudal linear raphe nucleus, median raphe nucleus, pontine raphe nucleus and dorsal raphe
nucleus, neurons in the interpeduncular nucleus, and the caudal cluster, including the raphe
magnus nucleus, the raphe pallidus nucleus and the raphe obscurus nucleus, as well as cells
located more laterally, met in the B9 group, others located near the pedunculopontine
tegmental nucleus, and ventrolateral medulla (Ferguson et al., 1999).
Unlike the aforementioned authors, we identified in the rock cavy brainstem a
small group of 5-HT-IR neurons located in the caudal pole of the rostral linear raphe
nucleus. In our material, the dorsal raphe nucleus could be divided into dorsal, lateral,
ventral, posterior and caudal parts, by analogy with established divisions in the dorsal
raphe nucleus of rats by Paxinos and Watson (2007). With regard to lateralization, it is
important to note that besides the B9 grouping, no other clusters apart from the midline,
without continuity with the groups from the midline were found.
Analyzing our results in comparison with literature data, we note that the
organization of serotonergic neurons in the brainstem of the rock cavy is very similar to
that found in other rodent species and even among mammals. Some small variations, many
of which can be attributed to nomenclature criteria could be detected. This reinforces the
suggestion that the serotonergic system is an ancient system of neurotransmitters and
evolutionarily well conserved (Parent, 1981).
80
Previous studies have examined closed species of the order Rodentia (Moon et al.,
2007) showing that differences in phenotype and life history does not lead to changes in
nuclear complexity. Analyzing the diversity of species it is worth to note that the extent of
evolutionary divergence is also not an indicator of differences in complexity of nuclear
systems under study within the same order of mammals. Thus it is possible to conclude
that whithin the order Rodentia, variations in phenotype, life history, lifestyle and brain
size do not lead to changes in nuclear complexity of the serotonergic system.
Thus this work represents a contribution in providing foundations for future
investigations using the rock cavy as an experimental model aimed at increasing our
understanding on the functional role of the serotonergic system.
The results of this study, analyzed in light of previous studies, allow to conclude
that the serotonergic system of the rock cavy consists of 11 nuclei, named in the
rostrocaudal direction: the rostral linear raphe nucleus, the caudal linear raphe nucleus, the
dorsal raphe nucleus, the median raphe nucleus, the paramedian raphe nucleus, the
supralemniscal group (B9), the pontine raphe nucleus, the raphe interpositus nucleus, the
raphe magnus nucleus, the raphe pallidus nucleus and the raphe obscurus nucleus. The
raphe nuclei are distributed along the midline of the brainstem, from the caudal midbrain to
the bulbospinal limit, except the B9 grouping, laterally situated. In general, the
serotonergic raphe nuclei resemble the homonime nuclei of already found in other rodents
studied, except the rostral linear, which is not mentioned as a serotonergic nucleus.
81
REFERENCES
Azmitia, E.C., Gannon, P.J., 1983. The ultrastructural localization of serotonin
immunoreactivity in myelinated and unmyelinated axons within the medial forebrain
bundle of rat and monkey. J. Neurosci. 3, 2083-2090.
Azmitia, E.C., Gannon, P.J., 1986. Anatomy of the serotonergic systems in the primate and
sub-primate brain. Adv. Neurol.43, 407-468.
Badlangana, N.L., Bhagwandin, A,, Fuxe, K., Manger, P.R., 2007. Distribution and
morphology of putative catechollaminergic and serotonergic neurons in the medulla
oblongata of a sub-adult giraffe, Giraffa camelopardalis. J. Chem. Neuroanat. 34, 69-79.
Bhagwandin, A., Fuxe, K., Bennet, N.C., Manger, P.R., 2008. Nuclear organization and
morphology of cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic neurons in the
brains of two species of African mole-rat. J. Chem. Neuroanat. 35, 371-387.
Bjarkam, C.S., Sorensen, J.C., Geneser, F.A., 1997. Distribution and morphology of
serotonin-immunoreactive neurons in the brainstem of the New Zealand white rabbit. J.
Comp. Neurol. 380, 507-519.
Brodal, E.T.A, Walberg, F., 1960. The nuclei of brain stem in the cat. II Efferent
connections. J. Comp. Neurol. 114, 239-259.
Bux, F., Bhagwandin, A., Fuxe, K., Manger, P.R., 2010. Organization of cholinergic,
putative catecholaminergic and serotonergic nuclei in the diencephalon, midbrain and pons
of sub-adult male giraffes. J. Chem. Neuroanat. 39, 189-203.
Cabrera, A., 1961. Catalogo de los mamíferos de América del Sur. II. (Sirenia,
Perrissodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Cetacea). Revista del Museo Argentino de
Ciencias Naturales “BernardinoRivadavia”, Ciencias Zoologicas. 4, 309-732.
Charara, A., Parent, A., 1998. Chemoarchitecture of the primate dorsal raphe nucleus. J.
Chem. Neuroanat 72, 111-127.
Cools, R., Roberts, A.C., Robbins, T.W., 2008. Serotonergic regulation of emotional and
behavioural control processes. Trends Cogn. Sci. 12, 31-40.
Dahlstrom, A., Fuxe, K., 1964. Evidence for the existence of monoamine-containing
neurons in the central nervous system. I. Demonstration of monoamines in the cell bodies
of brain stem neurons. Acta Physiol. Scand. 62 (suppl. 232), 1-55.
Dahlstrom, A., Fuxe, K., 1965. Evidence for the existence of monoamine-containing
neurons in the central nervous system. II. Experimentally induced changes intraneuronal
amine levels of bulbo-spinal neuron systems. Acta Physiol. Scand. 64 (suppl. 247),1-36.
Da Silva, J.N., Fuxe, K., Manger, P.R., 2006. Nuclear parcellation of certain
immunohistochemically identifiable neuronal systems in the midbrain and pons of the
Highveld molerat (Cryptomys hottentotus). J. Chem. Neuroanat. 31, 37-50.
Dell, L.-A., Kruger, J-L., Bhagwandin, A., Jillani, N.E, Pettigrew J.D., Manger P.R., 2010.
Nuclear organization of cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic systems
in the brain of two megachiropteran species. J. Chem. Neuroanat. 40, 177-195.
Dwarika, S., Maseko, B.C., Ihunwo, A.O., Fuxe, K., Manger, P.R., 2008. Distribution and
morphology of putative catecholaminergic and serotonergic neurons in the brain of the
greatr canerat, Thryonomys swinderianus. J. Chem. Neuroanat. 35, 108-122.
82
Falck, B., Hillarp, N.A., Thieme, G., Torp, A., 1962. Fluorescence of catecholamines and
related compounds condensed with formaldehyde. J. Histochem. Cytochem. 10, 348-354.
Felten, D.L., Laties, A.M., Carpenter, M.B., 1974. Monoamine-containing cell bodies in
the squirrel monkey brain. Am. J. Anat. 139, 153-166.
Felten, D.L., Sladek, J.R., 1983. Monoamine distribution in primate brain. V. Monoamine
distribution in primate brain. V. Monoaminergic nuclei: anatomy, pathways and local
organization. Brain Res. Bull. 10, 171-284.
Ferguson, L.A., Hardman, C.D., Marotte, L.R., Salardini, A., Halasz, P., Vu, D., Waite,
P.M.E., 1999. Serotonergic neurons in the brainstem of the wallaby, Macropus eugenii. J.
Comp. Neurol. 411, 535-549.
Fuxe, K., 1965. Evidence for the existence of monoamine neurons in the central nervous
system. IV. The distribution of monoamine terminals in the central nervous system. Acta
Physiol. Scand. 64 (suppl 247), 37-85.
Gravett, N., Bhagwandin. A., Fuxe, K., Manger, P.R., 2009. Nuclear organization and
morphology of cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic neurons in the
brain of the rock hyrax, Procavia capensis. J. Chem. Neuroanat. 38, 57-74.
Halberstadt, A.L., Balaban, C.D., 2006. Serotonergic and nonserotonergic neurons in the
dorsal raphe nucleus send collateralized projections to both the vestibular nuclei and the
central amygdaloid nucleus. Neuroscience 140, 1067–1077.
Harding, A., Paxinos, G., Halliday, G., 2004. The serotonin and tachykinin systems, in:
Paxinos, G. (Ed.), The rat nervous system. Elsevier, Amsterdam, pp. 1205-1256.
Hornung, J.-P., 2003. The human raphe nuclei and the serotonergic system. J. Chem.
Neuroanat. 26, 331-343.
Hornung, J.-P., Fritschy, J.M., 1988. Serotonergic system in the brainstem of the
marmoset: a combined immunocytochemical and three-dimensional reconstruction study.
J. Comp. Neurol. 270, 471-487.
Itoh, K., Konish, A., Nomura, S., Mizuno, N., Nakamura, Y., Sugimoto, T., 1979.
Application of coupled oxidation reaction to electron microscopic demonstration of
horseradish peroxidase: cobalt-glucose oxidase method. Brain Res. 175, 341-346.
Jacobs, B.L., Azmitia, E.C., 1992. Structure and function of the brain serotonin system.
Physiol. Rev. 72, 165-229.
Jacobs, B.L., Gannon, P.J., Azmitia, E.C., 1984. Atlas of serotonergic cell bodies in the cat
brainstem: an immunocytochemical analysis. Brain Res. Bull. 13, 1-31.
Kruger, J.-L., Dell, L.-A., Bhagwandin, A., Jillani, N.E., Pettigrew, J.D., Manger, P.R.,
2010. Nuclear organization of cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic
systems in the brains of five microchiropteran species. J. Chem. Neuroanat. 40, 210-222.
Lacher Jr., T.E., 1981. The comparative social behavior of Kerodon rupestris and Galea
spixii and the evolution of behavior in the caviidea. Bulletin of Carnegie Museum Natural
History. 17, 1-71.
Lidov, H.G.W., Molliver, M.E., 1982. Immunohistochemical study of the development of
serotonergic neurons in the rat CNS. Brain Res. Bull. 9, 559-604.
Martin, G.F., DeLorenzo, G., Ho, R.H., Humbertson, A.O. Jr, Waltzer, R., 1985.
Serotonergic innervations of the forebrain in the North American opossum. Brain Behav.
83
Evol. 26, 196-228.
Maseko BC, Manger PR. 2007. Distribution and morphology of cholinergic,
catecholaminergic and serotonergic neurons in the brain of Schreiber’s long-fingered bat,
Miniopterus schreibersii. J Chem Neuroanat 34:80-94.
Maseko, B.C., Bourne, J.A., Manger, P.R., 2007. Distribution and morphology of
cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic neurons in the brain of the
Egyptian rousette flying fox, Rousettus aegyptiacus. J. Chem. Neuroanat. 34, 108-127.
Moon, D.-J, Maseko, B.C., Ihunwo, A.O., Fuxe, K., Manger, P.R., 2007. Distribution and
morphology of catecholaminergic and serotonergic neurons in the brain of the highveld
gerbil, Tatera brantsii. J. Chem. Neuroanat. 34, 134-144.
Parent, A., 1981. Comparative anatomy of the serotoninergic systems. J. de Physiologie
77, 147-156.
Parent, A., Descarries, L., Beaudet, A., 1981. Organization of ascending serotonin systems
in the adult rat brain. A radioautographic study after intraventricular administration of
[3H]5-HT. Neuroscience 6, 115-138.
Paxinos, G, Watson, C., 2007. The rat brain in stereotaxic coordinates. 2ª Ed. Academic
Press, San Diego.
Pieters, R.P., Gravett, N., Fuxe, K., Manger, P.R., 2010. Nuclear organization of
cholinergic, putative catecholaminergic and serotonergic nuclei in the brain of the eastern
rock elephant shrew, Elephantulus myurus. J. Chem. Neuroanat. 39, 175-188.
Ramon y Cajal, S., 1911. Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des vertebres II.
Malone, Paris.
Rowe, D.L., Honeycutt, R.L., 2002. Phylogenetic relationships, ecological correlates, and
molecular evolution within the Cavioidea (Mammalia, Rodentia). Mol. Biol. Evol. 19, 263-
277.
Silva Neto, E.J., 2000. Morphology of the regions ethmoidalis and orbitotemporalis in
Galea musteloides Meyen 1832 and Kerodon rupestris (Wied-Neuwied 1820) (Rodentia:
Caviidae) with comments on the phylogenetic systematics of the Caviidae. J. Zool. Syst.
Evol. Research 38, 219-229.
Sousa, R.A., Menezes, A.A.L. 2006. Circadian rhythms of motor activity of the Brazilian
rock cavy (Kerodon rupestris) under artificial photoperiod. Biol. Rhythm Res. 3, 443-450.
Steinbusch, H.W.M., 1981. Distribution of serotonin-immunoreactivity in the central
nervous system of the rat-cell bodies and terminals. Neurocience 6, 557-618.
Steinbusch, H.W.M., Verhofstad, A.A., Joosten, H.W., 1978. Localization of serotonin in
the central nervous system by immunohistochemistry: description of a specific and
sensitive technique and some applications. Neuroscience 3, 811-819.
Taber, E., Brodal, A., Walberg, F., 1960. The raphe nuclei of the brain stem in the cat. I.
Normal topography and cytoarchitecture and general discussion. J. Comp. Neurol. 114,
161-167.
Takase, L.F., Nogueira, M.I., 2008. Patterns of fos activation in rat raphe nuclei during
feeding behavior. Brain Res. 1200, 10-18.
Takeuchi, Y., Kimura, H., Sano, Y., 1982. Immunohistochemical demonstration of the
distribution of serotonin neurons in the brainstem of the rat and the cat. Cell Tissue Res.
84
224, 247-267.
Törk, I., 1985. Raphe nuclei and serotonin containing systems, in: Paxinos, G. (Ed.), The
rat nervous system. Ed Academic Press Australia, Sidney, pp. 43-78.
Törk, I., 1990. Anatomy of the serotonergic system. Ann. N. Y. Acad. Sci. 600, 9-35,
1990.
Vergé, D., Calas, A., 2000. Serotoninergic neurons and serotonin receptors: gains from
cytochemical approaches. J. Chem. Neuroanat. 18, 41-56.
Zamboni, L., De Martino, L., 1967. Buffered picric acid formaldehyde: A new rapid
fixative for electron microscopy. J. Cell Biol. 35, 148A.