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INSTITUTO OSWALDO CRUZ Doutorado em Biologia Parasitária

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

DE Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii

DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO

METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ.

SOLANGE DO PERPÉTUO SOCORRO EVANGELISTA COSTA

Rio de Janeiro/RJ

2008

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

ii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Parasitária

SOLANGE DO PERPÉTUO SOCORRO EVANGELISTA COSTA

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptococcus

neoformans e Cryptococcus gattii DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO

METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ

Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como

parte dos requisitos para obtenção do título de

Doutor em Ciências, área de concentração em

Biologia.

Orientadores: Dr. Bodo Wanke (IPEC/FIOCRUZ) Dr. José Luiz Martins do Nascimento (ICB/UFPA)

RIO DE JANEIRO 2008

Ficha catalográfica elaborada pela

Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ

C837 Costa, Solange do Perpétuo Socorro Evangelista

Isolamento e caracterização molecular de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii de fontes ambientais na região metropolina de Belém, Pará / Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa. – Rio de Janeiro, 2008.

xviii, 161 f. : il. ; 30 cm.

Tese (doutorado) – Instituto Oswaldo Cruz, Pós-Graduação em Biologia Parasitária, 2008.

Bibliografia: f. 116-142

1.Cryptococcus neoformans. 2. Cryptococcus gattii. 3. Fontes ambientais. 4. Mating type. 5. Caracterização molecular - Pará. I. Título.

CDD 619.811 5

iii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-graduação em Biologia Parasitária

SOLANGE DO PERPÉTUO SOCORRO

EVANGELISTA COSTA

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptococcus

neoformans e Cryptococcus gattii DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO

METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ

ORIENTADOR (ES): Prof. Dr. Bodo Wanke (IPEC/FIOCRUZ)

Prof Dr. José Luiz Martins do Nascimento (ICB/UFPA)

Aprovada em: 03/10/2008 EXAMINADORES Profª. Dra. Tânia Maria Pacheco Schubach – Presidente e Revisora (Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos/ IPEC/Fiocruz) Profª. Dra Cíntia de Moraes Borba - Membro (Departamento de Micologia/IOC/Fiocruz) Prof. Dr. Ricardo Pereira Igreja - Membro (Faculdade de Medicina/UFRJ) Profª. Dra. Rita Catarina Medeiros de Sousa - Suplente (Hospital Universitário João de Barros Barreto/UFPA)

Profª. Dra. Luciana Trilles - Suplente (Laboratório de Micologia/IPEC/Fiocruz)

Rio de Janeiro, 03 de outubro de 2008

iv

Aos meus pais queridos

Hilson e Raimunda

pelas oportunidades que propiciaram a todos os filhos,

priorizando a educação e pelo

carinho e apoio incondicional

Ao meu esposo Rosildo Paiva,

por sua compreensão, companheirismo, incentivo

e incansável apoio durante esta jornada.

A Rafael e Rodrigo,

filhos amados, pelo carinho e compreensão

dos momentos ausentes para realização deste trabalho.

Carinhosamente dedico.

v

AGRADECIMENTOS

Às famílias que com muita boa vontade permitiram acesso a seus

domicílios, e permissão para coleta das amostras imprescindíveis para realização do

estudo.

Ao Dr. Bodo Wanke, orientador, que com sabedoria, paciência, estímulo e

valiosas críticas e sugestões tornou possível a realização deste trabalho. A Dra.

Márcia dos Santos Lazéra, grande colaboradora deste estudo pelas valiosas críticas

e sugestões. Agradeço a ambos pelos ensinamentos, apoio e amizade que recebi

em todos os momentos.

Ao Dr. José Luiz Martins do Nascimento, orientador que me apoiou e

incentivou à realização desta pós-graduação e coordenou o Programa de

Qualificação Interinstitucional.

À Dra. Rita Catarina Medeiros Sousa, incentivadora e colaboradora na

indicação de pacientes. E ao Dr. Maurício Perez da UFRJ pela orientação estatística.

À coordenadora do Curso de Curso de Pós-graduação em Biologia

Parasitária Dra. Ana Maria Coimbra Gaspar, à secretária Luciane Vieira

Wandermurem e demais funcionários pelo apoio e preciosas orientações recebidos

no decorrer desta pós-graduação.

À direção do Instituto de Ciências Biológicas (UFPA) que me liberou das

atividades acadêmicas em vários períodos para realização desta pós-graduação e a

Pró-reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Pará (UFPA) pelo suporte

administrativo do programa PQI.

À Dra. Paula Beatriz de Araújo (UFRS) que gentilmente identificou o

espécime do artrópode.

Aos funcionários do Museu Paraense Emílio Goeldi, Sr. Antônio Sérgio

Lima pela gentileza na identificação do espécime botânico e ao Sr. Marcelo Thales

pela elaboração do mapa apresentado neste trabalho.

Aos professores da UFPA Dr. Cristovam Picanço Diniz, Dr. José Luiz

Martins do Nascimento, Dr. Luís Carlos Silveira e Dra. Maria da Conceição Pinheiro,

e ao Dr. Cláudio Tadeu Daniel Ribeiro e Dr. Ricardo Lourenço (Fiocruz), pelo

empenho na realização desta pós-graduação.

Aos professores do Curso de pós-graduação pelos ensinamentos e

incentivo.

vi

À Dra. Liane de Castro do Laboratório de Imunodiagnóstico (IPEC/Fiocruz),

e ao grupo do Laboratório de Virologia (IPEC/Fiocruz) pelas facilidades ao acesso e

utilização de espaço físico e equipamentos destes laboratórios.

À Dra. Marília Martins Nishikawa (INCQS/Fiocruz), sempre disposta a

ajudar; pela amizade e apoio imprescindível na identificação bioquímica dos

isolados.

À equipe do Laboratório de Micologia Ambiental (IPEC), Bernardina P.

Morales e Luciana Trilles pela valiosa colaboração no estudo molecular, Cláudia

Fauci Bezerra, Regina Célia Macedo e Gláucia G. Barbosa pelo apoio em várias

etapas do estudo ambiental. E aos demais funcionários e estagiários do IPEC

responsáveis pelo suporte técnico deste estudo.

Às estudantes de iniciação científica Gabriela Ramalho e Érica pelo apoio

a secretária Zélia Magalhães Silva pelo apoio administrativo.

Aos colegas de turma do doutorado, Aldo Valente, Ana Maria Ventura, Ana

Iecê, Eliete Araújo, Éster Miranda, Elizabeth Salbé T. da Rosa, Sâmia Demachi,

Vânia Noronha, pelo apoio e aos colegas Gionovaldo Lourenço e Wallace Santos

com os quais compartilhei várias etapas de trabalho nesta maravilhosa área de

estudo que é a Micologia.

Aos colegas do Laboratório de Micologia (UFPA) Dr. Antonio Hernández

Gutiérrez e ao biólogo José Carlos de Azevedo que me auxiliou em algumas coletas,

pelo suporte durante minha ausência ao longo das etapas deste estudo.

Aos meus irmãos, cunhados, sobrinhos e sogros pelo carinho e incentivos

constantes. E aos amigos e colegas de trabalho pelo apoio.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pelo apoio financeiro concedido através de bolsa de estudo e passagens

durante as missões de estudo.

A todos que de forma direta ou indireta contribuíram com dados

fundamentais para a construção deste trabalho.

A Deus, pelo dom da vida, saúde fé e esperança em dias sempre

melhores.

Minha gratidão

vii

SUMÁRIO

RESUMO xviii

ABSTRACT xix

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO DE LITERATURA 5

2.1 HISTÓRICO 5

2.2 O FUNGO: ASPECTOS MORFOLÓGICOS E TAXONOMIA 9

2.3 EPIDEMIOLOGIA DA CRIPTOCOCOSE E ECOLOGIA DE SEUS

AGENTES.

14

2.3.1 Em relação à distribuição geográfica 14

2.3.2 Em relação aos sorotipos 19

2.3.3 Epidemiologia Molecular 23

2.3.4 Ecologia dos agentes 28

2.4 VIRULÊNCIA EM C. neoformans E C. gattii 36

2.5 CRIPTOCOCOSE 42

2.5.1 Aspectos Clínicos 43

2.5.2 Agentes Antifúngicos 46

3. RELEVÂNCIA 52

4. OBJETIVOS 54

5. MATERIAIS E MÉTODOS 55

5.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE

ÁRVORES E EXCRETAS DE AVES NA ÁREA URBANA DE BELÉM

55

5.2 ESTUDOS DE FONTES AMBIENTAIS A PARTIR DE DOMICÍLIOS

DE PACIENTES COM CRIPTOCOCOSE

55

5.2.1 Seleção dos domicílios 55

5.2.1.1 Critérios de Inclusão 56

5.2.1.2 Critérios de exclusão 56

5.3 ÁREA DE ESTUDO 56

5.4 VISITA AO DOMICÍLIO E COLETA DAS AMOSTRAS 59

5.4.1 Entrevista 59

5.4.2 Ficha Ambiental 59

5.4.3 Coleta das Amostras 59

5.5 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS 60

5.5.1 Isolamento das colônias 60

viii

5.5.2 Identificação fenotípica 61

5.5.2.1 Síntese de melanina (atividade fenoloxidase) 61

5.5.2.2 Termotolerância 61

5.5.2.3 Sensibilidade à cicloheximida 61

5.5.2.4 Sorotipagem 61

5.5.2.5 Assimilação de compostos de Carbono e Nitrogênio 62

5.5.2.6 Meio CGB 62

5.5.3 Identificação Molecular 63

5.5.3.1 Extração de DNA 63

5.5.3.2 Determinação do mating type. 64

5.5.3.3 Tipagem Molecular 65

6 RESULTADOS 66

6.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE

ÁRVORES E EXCRETAS DE AVES EM DOIS BAIRROS DE

BELÉM/PA

66

6.2 ESTUDO DE FONTES SPRÓBIAS RELACIONADAS AOS CASOS-

INDICE SELECIONADOS

68

6.3 ANÁLISE DAS AMOSTRAS COLETADAS 70

6.4 DESCRIÇÃO DOS CASOS-ÍNDICE DE CRIPTOCOCOSE, SEUS

DOMICÍLIOS E RESULTADOS DA INVESTIGAÇÃO DOMICILIAR

POR C. neoformans E OU C. gattii.

74

6.4.1 Caso índice 1 74

6.4.2 Caso-índice 2 74







6.5 ANÁLISE DOS ISOLADOS QUANTO À FONTE DE ISOLAMENTO,

DISTRIBUIÇÃO

84

6.6 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS 87

6.7 ANÁLISE MOLECULAR 89

6.7.1 Tipo sexuado 89

6.7.2 Análise da tipagem molecular 91

ix

7 DISCUSSÃO 95

8 CONCLUSÕES 112

9 PERSPECTIVAS 115

REFERÊNCIAS 116

APÊNDICES 143

APÊNDICE 1 144

APÊNDICE 2 149

ANEXOS 156

ANEXO 1 157

ANEXO 2 159

ANEXO 3 160

ANEXO 4 161

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 6.1 - Número e caracterização de isolados oriundos de fontes

ambientais da cidade de Belém/PA.

66

Tabela 6.2 - Dados meteorológicos de Belém/PA, referentes ao período de

coleta.

67

Tabela 6.3 - Perfil e procedência dos casos selecionados para o estudo

ambiental.

66

Tabela 6.4 - Distribuição das amostras analisadas de acordo com os

casos-índice e seus domicílios e controles

71

Quadro 6.1 - Características gerais dos domicílios de pacientes e controles

dos quais foram obtidos isolados de C. neoformans (Cn) e C.

gattii (Cg) e das amostras coletadas contaminadas.

73

Tabela 6.5 - Distribuição de Cryptococcus neoformans de acordo com o

tipo de substrato, e UFC/g relativos ao caso-índice 2.

76

Tabela 6.6 - Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii obtidos

do domicílio do caso-índice 3 e domicílios controles, de acordo

com o tipo de substrato, domicílio (paciente ou

controle)/ambiente, espécie isolada, UFC/g e número de

colônias analisadas.

80

Tabela 6.7 - Número de isolados e densidade de colônias fenoloxidase

positivas, de acordo com o tipo de substrato, relativos ao

caso-índice 7.

83

Tabela 6.8 - Distribuição de Cryptococcus spp. de acordo com o tipo de

substrato, espécie isolada e UFC/g relativos ao caso-índice 8.

84

Tabela 6.8 - Distribuição de Cryptococcus spp. de acordo com o tipo de

substrato, espécie isolada e UFC/g relativos ao caso-índice 8.

79

Tabela 6.9 - Freqüência de Isolamento de Cryptococcus neoformans e C.

gattii de acordo com o material analisado.

86

Tabela 6.10 - Freqüência de C. neoformans e C. gattii identificados pelo

teste de CGB de acordo com os casos-indice.

88

Tabela 6.11 - Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii quanto

ao tipo sexuado e caso-índice.

89

Tabela 6.12 - Distribuição do tipo sexuado de acordo com a fonte de

isolamento.

91

xi

Tabela 6.13 - Perfil dos isolados ambientais após caracterização dos tipos

moleculares analisados por PCR-RFLP.

92

Tabela 6.14 - Distribuição dos genótipos identificados por caso-índice. 92

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 5.1 - Mapa de localização da Região Metropolitana de Belém. 57

Figura 6.1- Figura 6.1- Eletroforese em gel de agarose ilustrando a

identificação do tipo sexuado com primers MATα1- MATα2 e

MAT a1- MAT a2 dos isolados ambientais de C. neoformans e

C. gattii de uma área da cidade de Belém/Pará, por PCR.

Linhas – 1 e 11: Peso molecular 100pb; 2: LMM 1082; 3: LMM

1083; 4: LMM 1084; 5: LMM1088; 6: LMM 1089; 7: LMM 1090;

8: ATCC 28957 padrão MATα ; 9: ATCC 28958 padrão MATa;

10: Controle negativo.

67

Figura 6.2 - Figura 6.2 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a

identificação do tipo molecular (VNI e VGII) dos isolados

ambientais de uma área da cidade de Belém. Linhas – 1: LMM

1082; 2: LMM 1083, 3: LMM 1084, 4: LMM 1087, 5: LMM

1088, 6: LMM 1089, 7: LMM 1090. Isolados padrões, de 8 a

11 (VNI-VNIV) de 12 a 15 (VGI-VGIV); 16: controle negativo;

M: peso molecular 100pb. Isolados 1 a 6 correspondem a C.

neoformans VNI e o isolado 7 corresponde a C. gattii VGII.

68

Figura 6.3 - Tatuzinhos de jardins (Arthropoda), coletados em peridomicílio

relativo ao caso-índice 2.

75

Figura 6.4 - A e B: Aspecto de colônias de C. neofromans isoladas em

placas de Petri após processamento dos tatuzinhos.

75

Figura 6.5 - Aspecto externo do peridomicílio relativo ao caso-índice 3. 77

Figura 6.6 - Aspecto externo de casa da mãe e vizinha à casa da paciente

(caso-índice 3) com positividade para C. neoformans e C. gattii.

77

Figura 6.7 - Detalhe da porta de entrada do domicílio da paciente (caso-

índice 3), presença de basidioma.

78

Figura 6.8- Entrada da vila onde foram obtidos isolados ambientais de C.

neoformans e C. gattii relativos ao caso-índice 3.

78

Figura 6.9 - Aspecto externo junto ao domicílio do paciente (caso-índice 7),

observar presença de basidiomicetos.

82

Figura 6.10 - Aspecto externo de domicílio de paciente (caso-índice 7) com

criptococose neoformans, ao fundo, cuja poeira foi positiva

xiii

para C. neoformans e C. gattii. 83

Figura 6.11 - Aspecto de colônias fenoloxidase positivas (marrons),

sugestivas de C. neoformans ou C. gattii.

87

Figura 6.12- Percentual de amostras positivas com isolamento de C.

neoformans e/ou C. gattii.

88

Figura 6.13 - Freqüência de C. neoformans e C. gattii, de acordo com o

caso-índice identificados pelo teste de CGB.

89

Figura 6.14 - Distribuição do tipo sexuado dos isolados de acordo com o

caso-índice.

90

Figura 6.15 - Percentual de C. neoformans e C. gattii de acordo com o tipo

sexuado.

90

Figura 6.16 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo

sexuado com primers MATα1- MATα2 e MAT a1- MAT a2 de seis

isolados ambientais de C. neoformans da região metropolitana de

Belém/Pará, por PCR. Linhas – 1 e 11: Peso molecular; 2: PA11; 3:

PA6; 4: PA36; 5: ATCC 28957 padrão MATα; 6: ATCC 28958

padrão MATa; 7: PA 134; 8: PA 102; 9: PA 158; 10: Controle

negativo

91

Figura 6.17 - Percentual dos isolados analisados conforme tipo molecular. 92

Figura 6.18 - Distribuição dos genótipos de acordo com a fonte de

isolamento.

93

Figura 6.19 - Figura 6.19 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a

identificação do tipo molecular (VNIV, VGII e VNI) de alguns isolados

ambientais (PA 16 a PA 214) de C. neoformans e C. gattii da região

metropolitana de Belém/Pará, obtidos por PCR/RFLP. Padrões (VNI-

VNIV e VGI-VGIV) estão representados pelos isolados LMM 794 a

LMM 801.

93

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES

AIDS/SIDA: Síndrome de Imunodeficiência Adquirida

AFLP: amplifield fragment lengt polymorphism

ATCC: American Type Cuture Collection

ºC: graus Celsius

CCP: criptococose cutânea primária

CGB: Ágar Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol

CIM:: concentração inibitória mínima

CLSI: Clinical and Laboratory Standarts Institute

CO2: dióxido de carbono

DNA: ácido desoxirribonucléico

dNTP: de desoxirribonucleosídeo(s) Trifosfato(s)

EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético

FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz

g: grama

GalXM: Galactoxilomanana

GXM: Glucuroxilomanana

h: hora

HAART: hight active antiretroviral therapy

HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana

HUJBB: Hospital Universitário João de Barros Barreto

IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IGS: seqüência espaçadora intergênica

INCQS: Instituto Nacional de Controle de Qualidade e Saúde

IPEC: Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas

ITS: seqüência espaçadora interna

IV: intravenosa

Kb: kilobases = 1000 bases

LCR: líquor céfalo-raquidiano

LES: lúpus eritematoso sistêmico

M: Molar

MB: megabases = 106 bases

MgCl2: cloreto de Magnésio

min: minuto

xv

mL: mililitro

mm: milímetro

mM: milimolar

N: Norte

NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standarts

NE: Nordeste

ng: nanograma

NaOH: Hidróxido de sódio

NaCl: cloreto de sódio

NSA: niger seed agar - ágar Níger

pb: pares de base

PCR: polymerase chain reaction – reação em cadeia da polimerase

pH: potencial hidrogeniônico

PLB: fosfolipase B

P/V: peso/volume

RAPD: Randon Amplification of Polymorphic DNA- amplificação randômica de DNA

polimórfico

RFLP: Restriction Fragment Length Polimorphism – fragmentos de DNA gerados por

enzima de restrição

RMB: região metropolitana de Belém

rpm: rotações por minuto

S: Sul

SC: Sabouraud com cloranfenicol

SDS: dodecilsulfato de sódio

SNC: Sistema nervoso central

sp: espécie

TBA: agar azul tripano

Tris: 2-amino-2hidroxidometilpropano-1,3-diol

U: unidade de atividade

UFC: unidade formadora de colônia

UFPA: Universidade Federal do Pará

UV: ultravioleta

var: variedade

VO: via oral

xvi

µm: micrômetro

µL: microlitro

µg: micrograma

µM: micromolar

xvii

RESUMO

Os agentes da criptocococose são atualmente reconhecidos como duas espécies do gênero Cryptococcus: C. neoformans e C. gattii. Enquanto C. neoformans é uma levedura haplóide de distribuição universal, ecologicamente associada à excretas de aves, notadamente pombos e guano de morcegos; apresenta-se geralmente como agente oportunista e causa meningoencefalite em hospedeiros imunocomprometidos, C. gattii é em geral restrito a regiões tropicais e subtropicais, com habitat predominantemente associado a vegetais em decomposição, comporta-se como agente primário e como tal atinge em sua maioria pacientes imunocompetentes. Ambas as espécies são capsuladas e apresentam predileção pelo Sistema Nervoso Central (SNC), constituindo-se na principal causa de meningite por fungos. No Brasil, a criptococose neoformans ocorre em todas as regiões, enquanto a criptococose gattii surge como importante endemia nas regiões Norte e Nordeste. O objetivo deste estudo foi investigar fontes sapróbias dos agentes de criptococose na região metropolitana de Belém/PA (RMB) com ênfase em ambientes domiciliares relacionados a casos de criptococose diagnosticados no Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB), no período de 2004 a 2005 para avaliar possíveis relações do ciclo de vida deste fungo com as infecções humanas. Nos domicílios e peridomicílios investigados foram coletadas 186 amostras constituídas principalmente de poeira intradomiciliar, fragmentos de madeira e raspados de ocos vegetais. Após processamento das amostras foram obtidos 220 isolados de C. neoformans e/ou C. gattii identificados com base em características fenotípicas e moleculares. Também foram analisadas amostras de oco de árvores ornamentais e excretas de gaiolas de aves de uma loja na área urbana de Belém. Maior positividade foi observada em poeira intradomicliar, seguida de madeira em decomposição e artrópodes. Isoladamente, C. neoformans foi obtido de tatuzinhos de jardins (Cubaris murina), raspado de madeira, poeira intradomiciliar e C. gattii foi isolado de poeira intradomiciliar. Em conjunto, ambas as espécies foram isoladas de poeira intradomiciliar em várias ocasiões. A amplificação do gene do feromônio revelou predominância de isolados MATα sobre isolados MATa, sendo C. neoformans MATα (45%) C. neoformans MATa (32,8%), C. gattii MATα (22,7%) e MATαa (0,5%). A PCR/RFLP do gene URA5 agrupou a maioria dos isolados no tipo molecular VNI (45%), seguido de VNIV (32%) e VGII (23%). O estudo de ocos vegetais e excretas de aves em área urbana de Belém permitiu detectar a presença de C. neoformans (VNI) em excretas de aves e C. neoformans (VNI) e C. gattii (VGII) foram isolados de rapados de oco de Senna siamea, onde compartilhavam o mesmo nicho ecológico. Aspectos clínicos e informações do ambiente domiciliar e peridomicílio do paciente foram descritos e discutidos no trabalho. Os resultados obtidos revelam achados inéditos, como a ocorrência de C. gattii em poeira intradomiciliar, e compartilhamento de ambas as espécies em oco vegetal, na cidade de Belém. Revelam a presença de isolados MATα e MATa, na Amazônia Oriental e, além disto, acrescentam novas informações às poucas disponíveis sobre a ecologia e biologia molecular de C. neoformans e C. gattii na região norte do Brasil.

xviii

ABSTRACT

The principal agents of cryptococcosis are now identified as two species of the genus Cryptococcus: C. neoformans and C. gattii. While C. neoformans is an haploid yeast, cosmopolitan, ecologically associated with avian droppings, principally pigeons and bat guano, behaves as an opportunistic agent, major cause of fungal meningoencephalitis in immunocompromised patients, C. gattii is usually restricted to tropical and subtropical regions, predominantly associated decomposing wood of trees and usually behaves as a primary agent, consequently attaining immunocompetent individuals. Both species present as capsulated yeasts and have a predilection for the central nervous system (CNS), constituting the principal etiologic agent of fungal meningitis. In Brazil, opportunistic cryptococcosis occurs in all the regions, while the primary infection prevails as a systemic endemic mycosis in the North and Northeastern regions. The aim of this study was to investigate saprobic sources of these agents in the Metropolitan Area of Belém, emphasizing the dwellings and their sourroundings related to cases of cryptococcosis diagnosed at the University Hospital João de Barros Barreto (UHJBB), during the period of 2004 to 2005 to analyzing possible correlation between environmental isolations of this fungus with human infections. One hundred and eighty six environmental samples were collected in and around eight selected dwellings, constituted mainly of indoor dust, wood debris and scrapings of hollow trees. After sample processing, 220 isolates were obtained, identified on the basis of phenotypic and molecular characteristics. Samples of hollows of ornamental trees and caged psittacine bird droppings of avian stores in the urban area of Belém were also studied. The most contaminated environmental samples were indoor dust, followed by decaying wood and arthropods. Cryptococcus neoformans was isolated alone from snow bugs, planed wood and indoor dust and C. gattii was also isolated alone from indoor dust. Both species were isolated together from indoor dust in several occasions. Amplification of the pheromone gene revealed predominance of mating type α isolates, with C. neoformans MATα (45 %), C. neoformans MATa (32,8 %) and C. gattii MATα (23,7 %) and MATαa (0,5%). PCR/RFLP of the URA5 gene grouped the majority of the isolates into the molecular type VNI (45%), followed by VNIV (32%) and VGII (23%). The study of hollow trees and psittacine bird droppings in the urban area of Belém revealed the occurrence de C. neoformans VNI in the psittacine bird droppings and both species, C. neoformans VNI and C. gattii VGII, in a hollow tree of a Senna siamea, sharing the same ecological niche. Clinical aspects of the patients and informations on their dwellings and respective surroundings were described and discussed. These results revealed unprecedented findings, as the occurrence of C. gattii in indoor dust. Also the occurrence of MATα and MATa isolates and the presence of both species in a common hollow tree in the Belém city are noteworthy. Furthermore, we add new information about the ecology and molecular biology of C. neoformans and C. gattii in the North region of Brazil.

1

1. INTRODUÇÃO

Os fungos são organismos eucariontes, heterotróficos, com nutrição por

absorção e exibem marcada habilidade para utilizar praticamente qualquer tipo de

fonte de carbono como alimento. Estão amplamente distribuídos no ambiente,

estando presentes nos diferentes ecossistemas terrestres e aquáticos, dispersando-

se sob a forma de esporos e/ou fragmentos de hifas, por diversas vias, entre as

quais, o ar, a água e numerosos vetores como insetos, pássaros e o homem. Seu

diversificado aparato enzimático os capacita a colonizar diversos tipos de substratos

de origem animal, vegetal, e até compostos sintéticos como plástico.

A estratégia de nutrição permite classificá-los em três modos básicos de vida:

os sapróbios, que obtêm nutrientes de organismos mortos, desempenhando

importante papel ecológico como recicladores da matéria orgânica; os parasitas,

que obtêm seus nutrientes de organismos vivos, e aqueles que vivem em

associação simbiótica, como os fungos liquenizados, que mantêm associação com

algas ou cianobactérias, as micorrizas, resultantes da associação entre fungos e

raízes da maioria das plantas, e ainda os fungos endofíticos, presentes em folhas e

caules de plantas saudáveis (ALEXOPOULOS et al., 1996).

Estima-se que existam em torno de 1,5 milhões de espécies de fungos

(HAWKSWORTH, 1991), das quais aproximadamente 100 000 espécies estejam

descritas (HAWKSWORTH, 2004). A enorme discrepância entre o número de

espécies conhecidas versus o de espécies estimadas parece estar relacionada a

métodos de amostragens inadequados em várias partes do mundo, especialmente

nas regiões tropicais e subtropicais (ALEXOPOULOS et al., 1996), onde grande

parte da diversidade biológica pode ser extinta antes mesmo de ser conhecida.

Enquanto as fitopatologias micóticas são atribuídas à grande número de

espécies de fungos, as patologias micóticas em animais são causadas por

relativamente poucas espécies. Segundo Perfect (2006), das espécies descritas,

cerca de 270 são reconhecidas como causadoras de doenças em vertebrados e

humanos. Podem causar infecções que variam desde sistêmicas e potencialmente

fatais a infecções com localização superficial, cutânea e subcutânea.

Classicamente, os fungos causadores de micoses humanas são divididos em

dois grupos: 1) patógenos primários, capazes de infectar indivíduos saudáveis, e

2) patógenos oportunistas. Entre os patógenos primários se notabilizam os

agentes de micoses sistêmicas, capazes de infectar indivíduos saudáveis, incluem

2

espécies termotolerantes, dimórficas, com habitat restrito e distribuição geográfica

limitada a regiões endêmicas, e as infecções geralmente são adquiridas via

inalação. Incluem espécies causadoras da paracoccidioidomicose, histoplasmose,

coccidioidomicose e blastomicose e a infecção é referida como micose sistêmica,

pela capacidade do fungo disseminar-se no hospedeiro, infectando um ou diversos

órgãos. Segundo Lazéra et al., (2005) a criptococose por Cryptococcus gattii,

apesar de não ser um fungo dimórfico, tem comportamento de patógeno primário.

Entre os patógenos oportunistas se notabilizam fungos que causam lesões sob

certas circunstâncias, em pacientes com susceptibilidade alterada, ou após

implantação traumática do fungo. Tais fungos são ubíquos ou endógenos,

termotolerantes, em geral monomórficos, cuja via de infecção é variada, produzindo

manifestações cutâneas, subcutâneas ou sistêmicas, conforme a porta de entrada e

sua disseminação no hospedeiro. Exemplificando, podem ser citados Candida spp,

Aspegillus spp, Zygomycetes e Cryptococcus neoformans.

Duas espécies patogênicas do gênero Cryptococcus causam a criptococose:

C. neoformans e C. gattii. Esta micose é de distribuição universal, atinge humanos e

uma grande variedade de animais, tem evolução subaguda ou crônica, e pode ser

fatal quando não diagnosticada e tratada corretamente. Até a década de 1980 a sua

incidência era considerada baixa, ocorrendo principalmente em pacientes com

neoplasias hematológicas (linfomas, leucemias), colagenoses (principalmente lúpus

eritematoso sistêmico-LES), transplantados e indivíduos em uso de corticosteróides.

Com o advento da aids, o número de casos aumentou significativamente,

principalmente devido à imunodepressão do hospedeiro (KWON-CHUNG &

BENNETT, 1992; CASADEVALL & PERFECT, 1998).

A criptococose por C. neoformans destaca-se pela sua relação oportunista

com indivíduos imunocomprometidos, sendo importante causa de infecção e risco de

vida em pacientes com aids (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Entretanto, o

diagnóstico de meningoencefalite criptocócica em indivíduos sem comprometimento

imunológico é relevante em áreas tropicais e subtropicais (CORRÊA et al., 1999;

CAVALCANTI, 1997; SANTOS, 2000; MARTINS, 2003). Além disso, observações

mais recentes mostraram que a criptococose por C. gattii pode ocorrer em regiões

de clima temperado, inclusive com surtos epidêmicos (KIDD et al., 2004) na cidade

de Vancouver, British Columbia, Canadá.

As duas espécies atualmente reconhecidas como agentes da criptococose, C.

neoformans e C. gattii, representam sua forma anamórfica, caracterizadas por

3

leveduras capsuladas, com reprodução por brotamento e identificadas por um

conjunto de características fisiológicas e bioquímicas (KWON-CHUNG & BENNETT,

1992; KWON–CHUNG et al., 2002). A reprodução sexuada (estado teleomorfo)

destes basidiomicetos foi obtida in vitro através de pareamento de isolados

haplóides (KWON-CHUNG, 1975). O ciclo sexuado é realizado através de

conjugação das células haplóides MATαααα e MATa, seguida da produção de hifa

dicariótica com grampo de conexão, septo tipo doliporo sem parentossomos. Os

esporos produzidos, denominados basidiosporos, são uninucleados, com diferenças

morfológicas entre as espécies (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).

A epidemiologia da criptococose reflete o comportamento ecológico distinto

das duas espécies. Cryptococcus neoformans tem distribuição geográfica universal,

com ampla disseminação em ambientes urbanos relacionados a habitats de aves,

principalmente pombos e psitacídeos (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992;

PASSONI et al., 1998; FILIÚ et al., 2002). Também já foram descritas outras fontes,

como madeira em decomposição e poeira domiciliar (LAZÉRA et al., 1996;

PASSONI, 1999). Cryptococcus gattii tem distribuição geográfica mais restrita,

prevalecendo em regiões tropicais e subtropicais. Todavia, recentemente esta

espécie foi demonstrada em região de clima temperado, causando um prolongado

surto epidêmico (KIDD et al., 2004) na cidade de Vancouver, Canadá, atingindo

humanos e vários animais silvestres e domésticos.

A aplicação de técnicas moleculares na identificação destas espécies tem

oferecido novas informações para estudos taxonômicos e epidemiológicos,

fornecendo características sobre a distribuição e o grau de relacionamento dentro de

uma população, permitindo, por exemplo, distinguir entre uma recidiva e re-infecção,

(HAYNES et al., 1995).

A Região Metropolitana de Belém (RMB), constituída pelos municípios de

Belém, Ananindeua, Marituba, Benevides e Santa Bárbara do Pará, está situada no

estado do Pará, região norte do Brasil, junto à foz do majestoso rio Amazonas.

Caracterizada por clima tropical, com umidade relativa do ar de 85%, propício ao

desenvolvimento da biodiversidade fúngica. Casos de criptococose na região são

continuadamente diagnosticados e registrados no Hospital Universitário João de

Barros Barreto (HUJBB), embora na literatura científica pouco se tenha divulgado,

tanto em aspectos clínicos dos pacientes quanto de aspectos ecológicos dos

agentes, destacando-se o relato de 19 casos de criptococose em crianças, das quais

4

9 foram causadas por C. gattii, sugerindo que o estado do Pará constitui uma região

de alta endemicidade da criptococose por esta espécie (CORRÊA et al., 1999).

O conhecimento da ecologia dos fungos patogênicos aos humanos torna-se

cada dia mais relevante para melhor entendimento da patogenia e controle das

infecções que causam, motivando a realização deste estudo.

5

2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 HISTÓRICO Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vuillemin foi identificado como

patógeno humano há pouco mais de 110 anos, quando os médicos alemães, Busse

em 1894 e Buschke em 1895, separadamente, descreveram o caso de uma paciente

do sexo feminino de 31 anos com uma lesão na tíbia e isolaram o agente em cultivo.

Busse denominou o organismo isolado da lesão de Saccharomyces hominis e a

infecção de saccharomycosis hominis enquanto Buschke descreveu o

microrganismo como um coccídio. Estes médicos descreveram pela primeira vez

aspectos da clínica, patologia e micologia da criptococose e seu agente. Na mesma

época, em 1894, na Itália, Sanfelice isolou uma levedura capsulada de suco de

pêssego, denominada por este de Saccharomyces neoformans. No final do século

XIX três relevantes observações tinham sido reconhecidas: 1) a recuperação do

microrganismo a partir de lesões em humanos e animais, estabelecendo seu

potencial patogênico; 2) o isolamento do microrganismo a partir de fonte ambiental,

estabelecendo seu ciclo sapróbio, de vida livre; e 3) o cultivo do microrganismo in

vitro, demonstrando sua patogenicidade para animais de laboratório (CASADEVALL

& PERFECT, 1998).

No início de 1900 foram descritos muitos relatos de infecções por C.

neoformans atingindo vários órgãos, principalmente cérebro, pulmões e pele. A

histopatologia da infecção em humanos foi descrita em detalhe, ressaltando-se em

alguns casos a ausência de resposta inflamatória. A ausência de uma terapia efetiva

contribuía para um prognóstico desfavorável. Muitos relatos clínicos incluíam

experimentos com animais de laboratório na busca de evidências sobre a via de

infecção e eficácia de drogas, sem sucesso. O isolamento de C. neoformans de

lesão pulmonar de um cavalo (FROTHINGHAM, 1902 apud CASADEVALL &

PERFECT, 1998), revelou seu caráter zoopatogênico. A primeira observação do

fungo em meninges humana foi detectada em 1905 por Von Hansemann (apud

KWON-CHUNG & BENNETT, 1992), o qual descreveu a doença como tuberculose

com leveduras em cistos gelatinosos. Em 1931 Freeman (apud CASADEVALL &

PERFECT, 1998) publicou uma revisão com informações clínicas, patológicas e

microbiológicas e propôs o trato respiratório como rota mais comum da infecção

humana. Desde a descoberta desta micose, vários nomes para o fungo e para a

infecção haviam sido propostos, quando Vuillemin (apud KWON-CHUNG &

6

BENNETT, 1992) em 1901 reclassificou a levedura isolada por Busse como

Cryptococcus hominis e a de Sanfelice como C. neoformans. Estes microrganismos

não formavam ascosporos e nem fermentavam açúcares como aqueles

pertencentes ao gênero Saccharomyces. Em 1935, Benham (apud KWON-CHUNG

& BENNETT, 1992) realizou um estudo com 22 leveduras isoladas de humanos,

onde concluiu que todos os isolados humanos provavelmente pertenciam à espécie

chamada Cryptococcus hominis, com duas variedades. Em 1950 Benham propôs a

denominação criptococose ao invés de torulose e Cryptococcus neoformans como

nomen conservandum (apud KWON-CHUNG & BENNETT, 1992), resolvendo assim

uma grande confusão que havia em torno desta terminologia. Neste período, o termo

C. neoformans foi rapidamente absorvido na literatura médica e micológica e a

criptococose havia sido descrita em infecções humanas e animais. Nos anos

subseqüentes, significantes avanços foram registrados no conhecimento da biologia,

ecologia e patologia do agente (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

O primeiro isolamento de C. neoformans a partir de fontes ambientais foi

reportado por Emmons em 1951, que isolou o fungo de solo contaminado com

excretas de aves, em particular de pombos, fundamentando o conceito de que a

infecção é adquirida a partir de ambiente contaminado. Estes achados suscitaram

uma série de estudos sobre fontes sapróbias de C. neoformans, pois, até então, o

isolamento provinha de tecidos e fluidos orgânicos do homem e de animais

suscetíveis. Desde então, o isolamento de C. neoformans tem sido reportado

mundialmente. Importante contribuição foi apresentada em 1962, por Staib (apud

KWON-CHUNG & BENNETT, 1992), com a descrição de colônias marrons

produzidas por C. neoformans quando cultivado em meio contendo sementes

Guizotia abyssinica, conhecidas como sementes de níger, possibilitando o

desenvolvimento de um meio seletivo para esta levedura e, conseqüentemente,

estimuou a proliferação de estudos buscando conhecer o habitat e ecologia do

fungo.

O aumento de casos de criptococose levou ao reconhecimento deste

organismo como agente oportunista. A introdução da cortisona como terapia para

várias doenças, principalmente linfoproliferativas, como linfomas e leucemias, foram

associadas com o risco de adquirir a criptococose (CASADEVALL & PERFECT,

1998).

Estudos de anatomia patológicas (BACKER, 1952, apud CASADEVALL &

PERFECT, 1998; BACKER & HAUGEN, 1955, apud CASADEVALL & PERFECT,

7

1998) em pacientes com ou sem criptococose meníngea, evidenciaram uma rota

pulmonar para infecção, sugerindo que uma pneumonia criptocócica assintomática

seria uma infecção comum em pacientes normais.

Introduzida no final de 1950 a anfotericina B, foi a primeira droga eficaz contra

C. neoformans. Mais tarde foi descoberta a 5-fluorocitosina que, em conjunto com a

anfotericina B, revolucionaram a terapia da criptococose, reduzindo a mortalidade de

100% para aproximadamente 25 a 30%. No final da década de 80, a introdução de

um novo antifúngico de uso oral, o fluconazol, simplificou o tratamento da

criptococose (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

Em 1935 Benham publicou estudo sobre caracterização morfológica e

antigênica, o que conduziu à descrição dos sorotipos A, B, e C por Evans e

colaboradores (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Em 1968 foi descrito o sorotipo

D (WILSON et al., 1968 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998).

No início da década de 70, importante estudo realizado por Shadomy

(1970 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998) relatou a presença de hifa com

grampo de conexão em dois isolados de cepas de C. neoformans. Grampos de

conexão são estruturas distintivas do filo Basidiomycota, cuja função é manter a

condição dicariótica de hifas férteis denominadas dicarióticas. Embora C.

neoformans tenha sido isolado em 1894, seu ciclo completo só foi descrito em 1975,

quando Kwon-Chung descobriu que C. neoformans apresentava dois tipos sexuados

(mating type), denominados α e a, e através do cruzamento entre cepas compatíveis

produziu o estado teleomorfo da levedura, que foi descrita no gênero Filobasidiella.

A aplicação de métodos moleculares no estudo de C. neoformans iniciou-se

no final da década de 1980 e início da década de 1990 sendo tais métodos

intensamente utilizados nas investigações subseqüentes. Estas novas ferramentas

permitiram a identificação, clonagem e caracterização de muitos genes, entre os

quais: produtores da melanina (WILLIAMSON, 1994) de cápsula (CHANG & KOWN-

CHUNG, 1994), genes relacionados ao tipo sexuado e virulência, (MOORE &

EDMAN, 1993), genes ribossomais, entre outros. Com o aumento da incidência da

criptococose, centenas de cepas clínicas foram isoladas e, em seguida, analisadas

por tipagem molecular, revelando grande diversidade genética entre estas

(CASADEVALL & PERFECT, 1998).

Embora o primeiro isolamento de Cryptococcus neoformans a partir de fontes

ambientais fosse reportado por Emmons em 1951, tratava-se da var. neoformans.

Somente em 1990 foi descrito o isolamento de C. neoformans var. gattii associado a

8

restos vegetais de Eucalyptus camaldulensis na Austrália (ELLIS & PFEIFFER,

1990a). A identificação de árvores de eucalipto como nicho ecológico natural de C.

neoformans possibilitou um melhor entendimento do relacionamento das variedades,

o ambiente e a patogênese. Em 1970 Vanbreuseghem e Takashio (apud

CASADEVALL & PERFECT, 1998) estudaram uma cepa atípica de C. neoformans

então proposta como C. neoformans var. gattii. No entanto, esta variedade não foi

amplamente aceita, devido sua descrição ter se baseado somente na morofologia, o

que pôde ser comprovado através dos estudos sobre compatibilidade entre os tipos

sexuados (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).

A importância médica de C. neoformans aumentou drasticamente em

conseqüência da pandemia da aids. A associação da criptococose com infecção e

imunossupressão do HIV, estimulou o estudo da imunologia e patogênese desta

micose. Antígenos polissacárides foram associados com uma variedade de efeitos

deletérios sobre o sistema imune do hospedeiro e estudos focalizaram a interação

célula-hospedeiro. No final de 1990 a criptococose tornou-se uma infecção comum

em muitas partes do mundo (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

Cientistas do Instituto de Pesquisa Genômica (TIGR) e do Centro de

Tecnologia do Genoma da Universidade de Standford, Califórnia, em colaboração

com outros centros de pesquisa, iniciaram o projeto de seqüenciamento do genoma

de C. neoformans. Conforme Kwon-Chung et al. (2000), o projeto iniciou em maio de

2000 e a cepa JEC21 também denominada B-4500 foi selecionada para ter o

genoma sequenciado por ser o único isolado MATα de um par isogênico que pode

ser usado para análises de genética clássica, e a técnica utilizada foi o

seqüenciamento por shotgun. Em 2005, Loftus et al., anunciam que o genoma de

duas cepas de C. neoformans, sorotipo D, MATα, registradas como JEC21 e B-3501

foi completado. A seqüência de nucleotídeos de 14 cromossomos, compreendendo

um total de ~20 Megabases de DNA, foi determinada para estas duas cepas. Loftus

et al. (2005) identificaram um total de 6572 genes codificadores de proteínas e

observam que a organização gênica de C. neoformans é consideravelmente mais

complexa que aquela dos Ascomycetes, cujas seqüências genômicas estão

disponíveis e comparáveis àqueles observados em Arabadopsis thaliana ou

Caenorhabdis elegans. Revelam ainda que o genoma é rico em transposons (~ 5%

do genoma), a maioria destes agrupados em cada cromossomo em blocos únicos

que abrangem de 40 a 100 kb e que podem representar seqüências independentes

na região centromérica. Transposons também estão agrupados em região contígua

9

ao rDNA e dentro do locus MAT. Segundo os autores, a presença de transposons

pode levar à instabilidade cariotípica e a variação fenotípica. Embora as duas cepas

analisadas sejam consideravelmente diferentes o estudo mostrou que há pouca

diferença em seu conteúdo genético. As cepas JEC21 e B-3501 compartilham 50%

de seus genomas, enquanto os 50 % restantes contem aproximadamente 0,5% de

polimorfismo.

O conhecimento do genoma de C. neoformans promove nova percepção

deste importante patógeno. Para Loftus et al. (2005) com estes resultados foi

estabelecida uma plataforma gênica para um estudo posterior deste patógeno

visando explorar as bases moleculares de sua virulência e revelar diferenças entre

as estratégias de virulência de C. neoformans e outros fungos patogênicos. Segundo

Idnurm et al., (2005) a seqüência genômica de C. neoformans é um elo final que

permite uma análise completa da função e evolução do gene. E assim, a

comunidade científica tem agora um mandato para determinar por que e como o

fungo mantém sua patogenicidade, como se propaga e como entender sua biologia

no sentido mais amplo de suas relações parentais próximas e distantes.

2.2 O FUNGO: ASPECTOS MORFOLÓGICOS E TAXONOMIA

Nas primeiras décadas após a sua descoberta, muitas sinonímias foram

usadas tanto para a micose quanto para seu agente, o que gerou muita controvérsia

no meio científico. O nome C. neoformans dado para a forma anamórfica da

levedura foi considerado como binômio válido baseado na prioridade, pois Sanfelice

foi o primeiro a propor o nome específico em 1895. Em 1950 Benham propôs a

denominação criptococose ao invés de torulose e Cryptococcus neoformans como

nomen conservandum (apud KWON-CHUNG & BENNETT, 1992), resolvendo assim

a grande confusão em torno desta terminologia. A utilização de técnicas

moleculares tem contribuído para uma visão mais esclarecedora sobre a taxonomia

de Cryptococcus e outros fungos.

Baseado em reação de aglutinação dos antígenos capsulares a soros

hiperimunes, quatro fenótipos básicos foram identificados e denominados sorotipos

A, B, C e D (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992) e um híbrido AD. Em 1975, Kwon-

Chung descreveu a reprodução sexuada (teleomorfo) de C. neoformans, conseguida

in vitro através do cruzamento entre isolados haplóides compatíveis (MATα e

MATa). A espécie heterotálica foi denominada Filobasidiella neoformans (KWON-

CHUNG, 1976a). Com base na morfologia dos basidiosporos, foi descrita a espécie

10

F. bacillispora (KWON-CHUNG, 1976) e em seguida seu anamorfo C. bacillisporus

(KWON-CHUNG et al., 1978b), sendo considerado C. neoformans anamorfo de F.

neoformans. A descoberta do ciclo sexuado permitiu classificar o fungo no filo

Basidiomycota, onde também estão incluídos macromicetos conhecidos como

cogumelos, orelhas-de-pau, entre outros e patógenos de plantas conhecidos como

ferrugens e carvões. Posteriormente, foi descrita uma variedade distinta, C.

neoformans var. gattii (DE VROEY & GATTI, 1989), a partir de isolado obtido de

líquido cefalorraquidiano de um menino na África Central. Foi verificado que a

morfologia e fisiologia de C. neoformans var. gattii era idêntica a de C. bacillispora

mas diferente de C. neoformans. Em 1982b, em reavaliação taxonômica de

Filobasidiella e seus anamorfos, Kwon-Chung et al. propõem a redução de duas

para uma espécie, mantendo duas variedades: C. neoformans (Sanfelice) Vuillemin

var. neoformans (sorotipos A, D, AD) e seu teleomorfo F. neoformans var.

neoformans, e C. neoformans (Sanfelice) Vuillemin var. gattii Vanbreuseghem et

Takashio (synonimia: C. bacillisporus Kwon-Chung et Bennett) e seu teleomorfo F.

neoformans var. bacillispora. Os critérios que sustentaram esta proposta basearam-

se em diferenças morfológicas, bioquímicas, fisiológicas, ecológicas e de virulência,

tendo como principal marcador o meio de canavanina, glicina e bromotimol (CGB)

(KWON-CHUNG et al., 1982a) utilizado na diferenciação das variedades.

Com base em algumas evidências fenotípicas e genotípicas Franzot et al.

(1999), propuseram uma terceira variedade, denominada C. neoformans var. grubii,

para incluir somente o isolado sorotipo A, mantendo C. neoformans var. neoformans

para os isolados sorotipos D. Esta proposta não foi completamente aceita por vários

micólogos, necessitando de maiores investigações. Diaz et al. (2000), ao analisar

seqüências moleculares do espaço intergênico (ITS) do rDNA, concluíram que,

embora as cepas apresentem alto grau de relacionamento entre genótipos e

sorotipos, este relacionamento não foi exclusivo, assim como o sorotipo não foi

restrito a um particular grupo genotípico, e sugerem que C. neoformans var. grubii

não deva ser considerada uma variedade separada.

Em recente revisão filogenética, diferentes genes (URA5, CNLAC1, CAP59,

CAP64, IGS e ITS rRNA, mtLrRNA) de ambas as variedades foram analisados e

árvores filogenéticas foram construídas. Independente do marcador utilizado, C.

neoformans var. gattii mostrou ser grupo monofilético distinto e claramente

divergente de C. neoformans var. neoformans. Estudos de polimorfismo de DNA por

AFLP (amplified fragment lenght polimorphism) diferenciam C. neoformans var. gattii.

11

(BOEKHOUT et al., 2001, KWON-CHUNG et al., 2002, GAMS, 2005). Segundo

KWON-CHUNG et al. (2002) os resultados obtidos nestes estudos indicam que as

variedades são suficientemente distintas e devem ser consideradas como espécies

separadas.

Atualmente são reconhecidas duas espécies: Cryptococcus neoformans

(sorotipos A, D e AD) e Cryptococcus gattii (sorotipos B e C). Com base nas

características fenotípicas e genéticas de seus teleomorfos estes agentes estão

classificados no filo Basidiomycota, Classe Hymenomycetes, Ordem Tremellales,

família Tremellaceae, Gênero Filobasidiella (ALEXOPOULOS et al., 1996).

Anteriormente estavam classificados na ordem Filobasidialles e família

Filobasidiaceae (BOEKHOUT et al., 1998), entretanto, estudos de sistemática

molecular, por análise seqüencial da região D1/D2 do rDNA, suportam que

Filobasidiella neoformans var. neoformans e F. neoformans var. bacillispora (hoje

consideradas as espécies Filobasidiella neoformans e F. bacillispora) constituem um

grupo distinto, claramente divergente dentro de Tremellales, na ordem de 100%

(FELL et al., 2000). Assim, a ordem Tremellales inclui espécies que: (1) exibem ciclo

de vida dimórfico no qual há uma fase haplóide leveduriforme e uma fase dicariótica,

micelial e com grampo de conexão; (2) possuem septo doliporo; (3) produzem

basídio tremelóide; e (4) exibem um sistema de mating bifatorial modificado

(ALEXOPOULOS et al., 1996).

O gênero Cryptococcus inclui pelo menos 34 espécies cujos teleomorfos,

quando conhecidos, estão distribuídos nos gêneros Filobasidium, Filobasidiella,

Cystofilobasidium e outros gêneros teleomórficos dos Tremellales e Filobasidiales

(FELL & STAZELL-TALLMAN, 1998). A forma de levedura, de células globosas,

ovais ou apiculadas, é a forma assexual, cuja reprodução ocorre por brotamento. O

estágio sexual ou perfeito é caracterizado pela formação de basidiosporos, que são

produzidos através de cruzamento entre isolados com tipos sexuados compatíveis e,

até o momento, observado apenas in vitro.

A identificação do gênero Filobasidiella apresentado por Kwon-Chung & Fell

(1984) descreve o gênero como: na forma anamórfica apresentam-se como

leveduras haplóides, com reprodução assexuada por brotamento de células

globosas, ovaladas ou apiculadas, pseudomicélio ou micélio verdadeiro ausentes em

culturas haplóides, com crescimento em meio sólido geralmente mucóide, com

ausência de pigmentos carotenóides visíveis. As células são capsuladas e a

espessura da cápsula varia de acordo com o isolado e com fatores ambientais. Já

12

Casadevall & Perfect (1998) acrescentam que o tamanho da cápsula varia de acordo

com a cepa e as condições de cultura. Em isolados clínicos a cápsula varia de 50 a

100µm. A maioria das cepas produz cápsulas maiores nos tecidos que in vitro e este

fenômeno está relacionado à maior tensão de CO2 nos tecidos (GRANGER et al.,

1985, apud CASADEVALL & PERFECT, 1998) e/ou fatores nutricionais (LITMAN,

1958, apud CASADEVALL & PERFECT, 1998). O método mais comum para

visualização da cápsula é examinar o microrganismo em suspensão com tinta da

China.

Quando semeado em meios sólidos comuns, C. neoformans e C. gattii

produzem colônias de cor branca a creme, brilhantes, de textura mucóide, margem

lisa e inteira (KWON-CHUNG & FELL, 1984). Em meios de cultura contendo extrato

de semente de níger (Guizotia abyssinica) estas espécies produzem melanina,

originando colônias de coloração marrom escura (STAIB, 1962 apud KWON-CHUNG

& BENNETT, 1992). A difenoloxidase produzida por estas espécies é uma lacase,

relembra outras lacases em sua habilidade de oxidar substratos como difenol

aromático, grupo amino e catecolaminas nas posições orto, meta e para, mas não

em grupos monofiléticos como fenol, tiamina ou tirosina (POLACHECK et al., 1982,

WILLIAMSON, 1994).

O ciclo sexuado é realizado através de conjugação de células haplóides

compatíveis. A maioria dos isolados é auto-estéril e produz basidiosporos após

cruzamento com isolados sexualmente compatíveis. O heterotalismo é controlado

por um locus e dois alelos (MATαααα e MATa), surgindo após inoculação de células αααα e

a em meio extrato de ágar malte, ágar suco V8, ágar infusão de feno, ou ágar

extrato de levedura incubado à temperatura entre 25 e 37ºC. Hifa dicariótica com

grampo de conexão, septo tipo doliporo, sem parentossomos, são formados. A hifa

dicariótica produz célula basidiogênica denominada holobasídio, onde ocorre

cariogamia e meiose. Hifas haustorióides, irregularmente ramificadas, são

freqüentemente produzidas. Os basidiosporos produzidos em cadeia medem

aproximadamente 1,8 a 3 x 2 a 5 µm de diâmetro, são uninucleados, ovalados,

elípticos, cilíndricos, piriformes a globosos, com uma parede levemente rugosa.

Cada cadeia de basidiosporos pode conter mais que 20 esporos. Inicialmente os

esporos são secos e a cápsula não é visível até o esporo aumentar até duas vezes o

tamanho original e iniciar a multiplicação vegetativa por brotamento em profusão. O

brotamento dos basidiosporos resulta em colônias mucóides de células

13

representativas de αααα, a ou raramente ααααa (são células auto-férteis). Este processo

pode ser observado dentro de 1 a 2 semanas (KWON-CHUNG, 1998).

Morfologicamente as duas espécies exibem semelhanças na forma de

levedura ou anamórfica. Entretanto, diferenças fenotípicas são evidentes na fase

teleomórfica. Os basidiosporos de F. neoformans são esféricos, oblongos a elípticos

ou cilíndricos, com parede finamente rugosa, enquanto que em F. bacillispora são

baciliformes e de parede lisa (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

Entre outras características fenotípicas, estas leveduras não fermentam,

assimilam D-glucoranato e myo-inositol, mas não assimilam nitrato. Compostos

amilóides são produzidos. Reação de urease e azul de diazônio (diazonium blue) B

são positivas.

Outra característica muito utilizada para caracterizar as espécies é através do

teste de sorotipagem. A classificação sorológica baseia-se nas diferenças

antigênicas entre as cepas de C. neoformans e C. gattii. Os sorotipos A, B e C foram

descritos por Evans e Evans & Kessel (apud CASADEVALL & PERFECT, 1998)

utilizando reação de aglutinação e precipitação capsular com antissoro de coelho. O

sorotipo D foi descrito por Wilson et al. em 1968 (apud CASADEVALL & PERFECT,

1998). Em 1985 foi descrito o sorotipo AD, onde os determinantes antigênicos são

os mesmos encontrados nos sorotipos A e D (IKEDA et al., 1985, apud

CASADEVALL & PERFECT, 1998). Sorotipos A e D são detectados em C.

neoformans e sorotipos B e C compõem C. gattii. Raros isolados com ou sem

cápsula, não tipáveis, podem ser encontrados (MITCHELL & PERFECT, 1995).

Uma classificação baseada em oito antígenos, denominados de 1 a 8, cuja

identificação de cada sorotipo está baseada na presença de um ou mais dos 8

fatores antigênicos definidos pelos fatores séricos de reatividade, foi apresentada

por Ikeda (1982). Os reagentes sorológicos são produzidos e comercializados pelo

Laboratório Iatron, Tókio, Japão.

Cabe ressaltar que neste trabalho será adotada a taxonomia proposta por

Kwon-Chung et al., (2002), ou seja, C. neoformans com seu teleomorfo Filobasidiella

neoformans e C. gattii com seu teleomorfo Filobasidiella bacillispora. Assim, C.

neoformans var. grubii e C. neoformans var. neoformans, sorotipos A e D

respectivamente, serão referidos como C. neoformans, e C. neoformans var. gattii

(sorotipos B e C), será referido como C. gattii.

14

2.3. EPIDEMIOLOGIA DA CRIPTOCOCOSE E ECOLOGIA DE SEUS AGENTES.

2.3.1 Em relação à distribuição geográfica

A criptococose não é uma doença de notificação compulsória, o que dificulta

uma estimativa precisa de sua incidência. No Brasil, dados publicados pelo

Ministério da Saúde no período de 1980 a 2000 mostram que 4,4 % das infecções

oportunistas associadas à aids são por criptococose (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2000), sendo que estes dados se referem apenas aos casos definidores de aids.

A prevalência da infecção por C. neoformans em uma população parece

correlacionar com o número de indivíduos imunocomprometidos e o grau de

exposição ao patógeno (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

Até a metade do século 20 a criptococose era reportada esporadicamente,

tornando-se mais comum a partir do final de 1970 (CASADEVALL & PERFECT,

1998). Entre 1965 e 1975 o número médio de casos reportados nos Estados Unidos

foi de 104 por ano (KAUFMAN & BLUMER, 1977 apud CASADEVALL & PERFECT,

1998).

A partir de 1981 a incidência da criptococose em alguns países aumentou

dramaticamente em decorrência da pandemia da aids. Desde então a infecção pelo

vírus HIV tem sido relacionada com mais de 80% dos casos de infecção por

Cryptococcus (DROMER et al., 1996; HAJJEH et al., 1999 apud VIVIANI et al.,

2002). Nos Estados Unidos, a maioria dos estudos registrava prevalência da

criptococose em pacientes HIV positivos na ordem de 5 a 10 % (CASADEVALL &

PERFECT, 1998); na Europa Ocidental variou de 2-10%, enquanto que na África

Central e Sudeste da Ásia ficou em cerca de 5% (DROMER et al., 1996;

DISMUKES, 1988 apud VIVIANI et al. 2002). Achados neuropatológicos em

pacientes com aids revelaram um percentual de 3 a 14 % de indivíduos com lesões

cerebrais (MARTINEZ et al., 1995, apud CASADEVALL & PERFECT, 1998).

Durante a década de 1990 a prevalência declinou progressivamente,

primeiramente devido ao uso generalizado do fluconazol (NEWTON et al. 1995 apud

VIVIANI et al., 2002) e mais tarde com a introdução de eficiente terapia anti-retroviral

(HAART) que resultou no aumento significante no total de células CD4 e

reconstituição imune em pacientes que receberam este tratamento (KAPLAN et al.,

2000 apud MIRZA et al., 2003; MCNAUGTEN et al., 1999 apud MIRZA et al., 2003).

Em pesquisa conduzida no período de 1992 a 2000 em duas grandes áreas

metropolitanas dos Estados Unidos mostrou redução marcante da incidência da

criptococose. Na cidade de Atlanta a incidência anual entre pacientes com aids

15

sofreu um decréscimo de 66 por 1000 pacientes em 1992 para 7 casos por 1000

pacientes em 2000; em Houston a incidência variou de 23,6 casos por 100.000 em

1993 para 1,6 caso por 100.000 habitantes em 2000. Considerando o total de

pacientes pesquisados (1.491), 89% dos casos ocorreram em pessoas infectadas

pelo vírus HIV (MIRZA et al., 2003).

Desde o advento da aids a criptococose tem sido reportada mundialmente.

Em levantamento realizado no estado do Alabama no período de 1992-1994 foram

registrados 153 casos, dos quais 55% eram HIV - positivos 44% HIV - negativos e

um caso não identificado. A taxa global anual foi de 1,89 por 1.000.000 da

população (THOMAS et al., 1998) comprovando o vírus da imunodeficiência humana

(aids) como o mais importante fator de risco para a criptococose, embora outras

doenças subjacentes também tenham sido registradas, porém em menor proporção.

Hajjeh et al. (apud THOMAS et al., 1998) em vigilância conduzida nos estados de

São Francisco, Atlanta e Houston, detectaram a taxa de 5,26 por 100.000

habitantes.

A criptococose também tem sido reportada na Europa, Ásia e África com

prevalência equivalente aos Estados Unidos. Recentemente foi reportado um estudo

prospectivo da criptococose no continente europeu (VIVIANE et al., 2006), reunindo

655 casos provenientes de 17 países, onde 77% dos casos eram associados a

paciente HIV - positivo. Na França, Dromer et al. (1996) detectou uma freqüência de

4,8 a 7,5%. Na Itália, em pesquisa epidemiológica realizada no período de

Julho/1997 a Dezembro/1999 foram detectados 156 casos de criptococose, incluindo

24 recorrências reportadas por 20 hospitais em nove das 20 regiões italianas

estudadas. A maioria (94,2%) dos casos registrados foi em pacientes HIV positivos,

somente nove casos ocorreram em paciente HIV negativos sendo 147 casos

relacionados a pacientes infectados pelo HIV. Entre os não-europeus (10%), metade

eram africanos e metade da América Central e do Sul, todos HIV - positivos (VIVIANI

et al., 2002). No Reino Unido, estudo comparativo mostrou que a incidência da

criptococose teve aumento significativo de 83 casos no período de 1953 a 1981 para

322 entre 1982 a 1991, dos quais 201 associados a aids (KNIGHT et al., 1993).

Na região do sudoeste asiático e África a criptococose associada à aids

parece ser mais comum que na Europa e Estados Unidos. Na Tailândia foi

encontrada a taxa de 19% de criptococose associada à aids no período de 1994 a

1998 (CLARIYALERTSAK et al., 2001 apud BICANIC & HARRISON, 2005). Revisão

realizada por Holmes et al., 2003, revela que a prevalência da meningite criptocócica

16

em pacientes HIV - positivos foi de 25% na Etiópia, 12 a 50% na África do Sul e 6%

no Congo. Segundo Bicanic & Harrison, (2005), parece provável que a alta

incidência em partes da Ásia e África reflete diferenças na exposição em vez da

susceptibilidade do hospedeiro. Em conseqüência do aumento da criptococose

associada a aids tem ocorrido mudança na epidemiologia. Meningite criptocócica é

agora a principal causa de meningite adquirida por esta população à frente da

tuberculose e meningite bacteriana (HAKIN et al., GORDON et al., (2000) apud

BICANIC & HARRISON, 2005).

Na Oceania um estudo prospectivo realizado no período de 1994 a 1997

revelou uma incidência anual de 6,6 por 106 de habitantes na Austrália (8,0 no ano 1,

4,8 no ano 2 e 5,7 no ano 3) e 2,2 por 106 na Nova Zelândia (2,2 no ano 1, 1,9 no

ano 2 e 2,5 no ano 3). Dos 350 casos analisados, 98,3% apresentaram fator de

risco, com 60,8% associados a aids (CHEN et al., 2000). Esta investigação mostrou

importante variação regional na distribuição geográfica e epidemiologia de infecção

por C. neoformans registrando alta incidência nas regiões Northern Territory e

Queensland, dos quais a maioria relacionada a hospedeiros HIV-negativos,

levantando a possibilidade de exposição a fontes ambientais desconhecidas nestas

regiões.

Na América da Sul, Bava et al. (1997), em análise epidemiológica de 253

casos de criptococose diagnosticados em hospital de Buenos Aires (Argentina),

detectaram que a criptococose era rara no período de 1983 a 1988, duplicando no

segundo período (1989-1991) e no período de 1992 a 1993 teve um discreto

aumento enquanto que o número de casos não associados a aids manteve-se entre

0 a 3 durante o período estudado. Dos casos registrados, 198 estavam associados à

aids.

O primeiro caso de criptococose no Brasil foi registrado em 1941 por Almeida

& Lacaz (apud LACAZ et al., 2002b). Desde então outros casos começaram a ser

relatados esporadicamente. Como em outros países, a partir de 1980, coincidente

com o advento da aids, o número de casos aumentou vertiginosamente. Gonçalves

et al., (1986 apud LACAZ, 2002b) registraram 28 casos no Rio de Janeiro,

ressaltando que esta infecção estava em franca expansão. Análise retrospectiva de

308 casos publicados na literatura brasileira no período de 1981 a 1992 evidenciou

um acréscimo significativo no período. Doença predisponente foi relatada em 153

casos, confirmando a aids como principal fator predisponente com 110 casos.

Setenta por cento dos casos publicados provinham da região Sudeste, segundo os

17

autores decorrentes da maior densidade demográfica e facilidades diagnósticas

(OLIVEIRA NETTO et al., 1993). No estado do Pará, Corrêa et al., (1999),

registraram 78 pacientes diagnosticados com criptococose no Hospital Universitário

João de Barros Barreto no período de 1992 a 1998, chamando a atenção para 19

(24,3%) dos casos que ocorreram em crianças (pacientes com menos de 13 anos de

idade).

Os estudos epidemiológicos conduzidos na era pré-aids já indicavam que C.

neoformans apresentava distribuição mundial. Por outro lado, a criptococose por C.

gattii só foi descrita em 1972, em menino com meningoencefalite e sem evidência de

imunodepressão, na África Central. A partir de então, mostrou-se prevalente apenas

em regiões tropicais e subtropicais. Alta prevalência foi observada no sudeste

asiático, Zaire (atualmente República Democrática do Congo, África), Austrália,

sudeste da Califórnia, Brasil e Venezuela (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).

Incidência de C. gattii extremamente alta foi registrada na Austrália, onde a maioria

dos isolados era oriundo de pacientes aborígenes de zona rural (Northern Territory).

Do total 45 amostras clínicas mais de 80 % dos isolados foram C. gattii. Diferença

entre as regiões foi observada. C. gattii foi encontrado no percentual de 65% no sul

da Austrália e 95% no Território Norte. Trinta e um isolados foram recuperados de

indivíduo sem evidência de imunossupressão, dos quais 87% eram C. gattii (ELLIS,

1987). Mais recentemente, uma pesquisa prospectiva foi realizada em nível nacional

na Austrália e Nova Zelândia, regiões onde ambas as espécies são endêmicas,

reforçando achados anteriores. Na Austrália, C. gattii foi significantemente mais

comum em áreas rurais e semi-rurais. Imunodeficiência foi o maior fator de risco

para criptococose neoformans enquanto criptococose gattii esteve associada à

paciente imunocompetente (CHEN et al., 2000). Lui et al. (2006) analisaram 46

casos de criptococose diagnosticados em dois hospitais de Hong Kong (China)

durante 1995-2000, dos quais 20 (43,5%) eram pacientes aparentemente

imunocompetentes. De oito isolados destes pacientes imunocompetentes, três foram

C. gattii. Estudo retrospectivo no México revelou C. gattii em 75% dos 20 casos

analisados (LÓPEZ-MARTINEZ et al., 1996) e em outro estudo realizado no período

de 1989-1998 foram detectados 10,4% por C. gattii em 211 casos avaliados

(CASTAÑON-OLIVARES, et al. 2000). Ainda no México Garza-Garza et al. (1995)

examinaram 60 isolados de pacientes com aids, no período de 1991-1992, 51 eram

C. neoformans e 9 C. gattii.

18

Casos esporádicos de criptococose por C. gattii têm sido reportados de

alguns países de clima temperado como Áustria, Alemanha, Grécia e França

(VIVIANI et al., 2006), mas predominantemente de países de clima tropical ou

subtropical tais como, Espanha (COLOM et al., 2005); Argentina (BAVA et al., 1997),

Índia (JAIN et al., 2005), Botswana, Malawi (LIVINTSEVA et al., 2005), África do Sul

(MORGAN et al., 2006), Colômbia (ORDÓÑEZ & CASTAÑEDA, 2001; ESCANDÓN

et al., 2006) e, desta forma, C. gattii apresenta-se como espécie de distribuição mais

restrita a regiões de clima tropical e subtropical.

Porém, relatos recentes surpreenderam a comunidade científica com a

descrição de um prolongado surto de criptococose por C. gattii no Canadá, uma vez

que a região atingida apresenta clima temperado, na ilha de Vancouver, Canadá,

contrastante ao que tem sido descrito até o momento para esta espécie. Este surto

acometeu 38 casos humanos (92,1%) entre 1999 e 2001, a maioria

imunocompetente, sendo 58% do sexo masculino, 72% com lesão pulmonar, 26%

com lesão de SNC e letalidade e em torno de 10% (KIDD et al. 2004). Ainda em

relação ao surto de Vancouver, a micose foi também diagnosticada em 45 animais,

incluindo 18 gatos, 17 cães, seis golfinhos, dois furões e duas lhamas (STEPHEN et

al., 2002). Até a descrição deste surto, C. gattii era considerado de distribuição

geográfica restrita a regiões tropicais e subtropicais. A emergência desta espécie em

área temperada, com incidência relativamente alta é incomum, particularmente em

mamíferos marinhos evidenciando mudanças ecológicas e climáticas, e

conseqüentemente, também da distribuição geográfica de C. gattii (KIDD et al.,

2004). O aumento acelerado e global da temperatura no planeta no último século

sugere que o clima em algumas regiões do Canadá tornou-se favorável e permitiu a

colonização de C. gattii (KIDD et al., 2004). É possível que a ativação do ciclo

sexuado tenha propiciado recombinantes, surgimento de variantes virulentas,

dispersão através de propágulos sexuados (basidiosporos) e expansão geográfica

para novos habitats (FRASER et al., 2005). Além disso, a criptococose gattii passou

a ser doença de notificação compulsória no Canadá para a vigilância desta infecção

que continua a ocorrer em Vancouver, sugerindo que possa tornar-se endêmica (BC

CENTRE FOR DISEASE CONTROL, 2007). Embora o surto de criptococose

ocorrido em Vancouver seja o único com registro em humanos, surtos em animais já

haviam sido descritos, como pneumonia em cabras na Espanha (BARÓ et al., 1998)

e forma disseminada em psitacídeos de diferentes espécies em aviário no interior do

estado de São Paulo, onde 7 aves morreram (RASO et al., 2004).

19

No Brasil, estudos epidemiológicos e clínicos conduzidos em várias regiões

do país têm apresentado um perfil de predominância de C. gattii nas regiões Norte e

Nordeste. A criptococose da região conhecida como Meio Norte, estados do Piauí e

Maranhão, foi estudada por Cavalcanti (1997) no período de 1986 a 1995 onde 124

pacientes foram analisados clinicamente e 45 amostras foram isoladas do líquor e

analisadas. A pesquisa revelou que 88% dos casos foram observados em

hospedeiros sem evidência de imunodepressão, nativos e residentes na região, cuja

análise mostrou o predomínio de C. gattii com 71,1 % (32) e alta letalidade (40,6%).

Associados a aids foram encontrados 8% enquanto 4% apresentaram outras

condições predisponentes, estes com predomínio de C. neoformans com 28,9% (13)

e taxa de letalidade de 46,2%. Posteriormente, Martins (2003), em outro estudo na

mesma região, investigou 90 isolados clínicos, dos quais 45 eram C. neoformans e

41 eram C. gattii, chamando a atenção para a expressiva ocorrência da criptococose

infantil, sem associação com aids, concluindo que no Meio Norte esta apresentação

não é rara. Na região Norte merece destaque o estudo da criptococose infantil no

estado do Pará, com relato de 19 casos em pacientes sem evidência de

imunodepressão, causada por C. gattii, sugerindo que o estado constitui uma região

de alta endemicidade da criptococose por esta variedade (CORRÊA et al., 1999).

Um outro estudo, prospectivo e retrospectivo, realizado no Amazonas, descreveu 75

casos, dos quais 45 (60%) em indivíduos imunocompetentes e 25 (33,3%) em

crianças, a maioria imunocompetentes (SANTOS, 2000). No Centro-Oeste 123

casos de criptococose foram registrados no período de 1995 a 2005. Destes, 104

(84,5%) eram pacientes HIV positivos, 19 (15,4%) HIV negativos e 6 com outras

condições predisponentes. Em 77 casos foram identificados 69 (89,6%) C.

neoformans e 8 (10,4%) C. gattii (LINDENBERG, et al., 2008).

2.3.2 Em relação aos sorotipos

A distribuição geográfica dos sorotipos e das espécies é particularmente

interessante do ponto de vista eco-epidemiológico.

Em relação à distribuição dos sorotipos de origem clínica, um estudo de 725

isolados oriundos dos cinco continentes ressalta as diferenças epidemiológicas entre

as espécies. Os resultados mostraram o predomínio de C. neoformans sorotipo A,

variando de 50 a 94%, conforme a região geográfica. Dentre os isolados asiáticos a

prevalência do sorotipo A foi maior no Japão (95%) e menor no sudeste asiático

(50%). A exceção de alta prevalência do sorotipo A foi na África, onde apenas 1 em

20

cada 3 isolados obtidos anterior a 1970 era sorotipo A. Cryptococcus neoformans

sorotipo D foi mais comum na Dinamarca, Itália e Suíça (50%), moderadamente

comum na Alemanha (29%) e raramente encontrada em outras regiões (3 a 8 %),

ressaltando a alta prevalência na Europa, contrastando com sua raridade em outras

regiões. Entre os isolados de C. gattii, o sorotipo B foi 4,5 vezes mais prevalente que

o sorotipo C (KOWN-CHUNG & BENNETT, 1984 apud KOWN-CHUNG & BENNET,

1992).

Enquanto evidenciava-se o predomínio global do sorotipo A, por outro lado

também se observava a prevalência significativa do sorotipo B em muitas áreas

tropicais e subtropicais, como na Austrália, Brasil, Venezuela, sudeste asiático e sul

da Califórnia e a freqüência do sorotipo D na Europa. Em pesquisa prospectiva da

criptococose na Europa (Julho/1997 a Dezembro/1999) 311 isolados de C.

neoformans foram sorotipados, dos quais sorotipo A foi o mais representativo (51%),

seguido do sorotipo D (30%) e sorotipo AD (19%) (VIVIANI, et al., 2006)

DROMER et al. (1993, apud DROMER et al. 1994) através de estudo

nacional realizado na França analisaram 273 casos de criptococose entre 1990 e

1992 e foi possível detectar 17% das cepas eram sorotipo D, com distribuição

irregular nas regiões estudadas. Dos casos analisados, acima de 80% dos pacientes

eram HIV positivos. Na Espanha, estudo de 115 isolados clínicos concluiu que o

sorotipo A predominou em pacientes HIV positivos (59,3%), seguido do sorotipo D

(28,4%) e AD (12,3%). Os autores ressaltam o fato de que sorotipos D e AD foram

freqüentes no país, além do que o sorotipo D foi predominante em algumas regiões

como Valencia, com 100% (n=11) das cepas. Adicionalmente foram também

analisados 6 isolados de animais, os quais todos os sorotipos B e 33 ambientais,

das quais 79% (n=26) sorotipo A, 15% (n=5) sorotipo D e 6% (n=2) sorotipo AD

(BARÓ et al., 1999). O sorotipo D também apresentou elevada freqüência em Nova

York (USA), onde a análise de 40 isolados clínicos mostrou 39 tipáveis com taxas de

85% sorotipo A, 12,5% sorotipo D, e 2,5% sorotipo AD (STEENBERGEN &

CASADEVALL, 2000). Na Alemanha, o estudo de 25 isolados ambientais e clínicos

revelou que 13 dos isolados foram sorotipo A (62%), 5 sorotipo D (24%) e 3 sorotipo

AD (14%) (MISHRA, et al.1981). Dromer et al., (1994) relataram que na França

cerca de 17% dos pacientes são infectados com sorotipo D e na Itália um estudo

com 207 pacientes no período de 1972- 1995 mostrou prevalência de 71% (147

isolados) de isolados sorotipo D seguido de 24,6% (51) sorotipo A e 3,4% (7)

sorotipo AD (TORTRANO et al., 1997).

21

Pfeiffer & Ellis (1993 apud LACAZ et al., 2002b) estudaram 460 isolados

clínicos e ambientais de regiões da Austrália registraram o predomínio do sorotipo B

(274) seguido do sorotipo A (167) e sorotipo D (2), e ainda 17 não tipáveis,

confirmando a importância do sorotipo B nesta região.

Na Colômbia, Ordoñez & Castañheda (1994 apud LACAZ et al., 2002a),

registraram pela primeira vez o sorotipo C na América do Sul, a partir de um estudo

de 163 amostras clínicas. O sorotipo A representou 92% dos isolados clínicos

analisados (n=163) e 10% de fontes ambientais (n=23). Vinte e nove isolados

clínicos foram identificados como C. gattii, dos quais 11 sorotipo B e um sorotipo C.

Adicionalmente em outra investigação de 370 isolados clínicos, obtiveram 351

isolados C. neoformans sorotipo A e 1 sorotipo D. Entre os isolados de C. gattii 17

sorotipo B e 1 sorotipo C (ORDOÑEZ & CASTAÑHEDA, 2001).

No Brasil, Lacaz & Rodrigues (1983 apud LACAZ et al., 2002b) sorotiparam

25 isolados clínicos revelando o predomínio do sorotipo A com 56% (14), seguido do

sorotipo B com 36% (6) e sorotipo D com 8% (3).

Em ambiente urbano o sorotipo A pode ser considerado um poluente aéreo,

onde infecções e re-infecções exógenas são bastante comuns, atingindo grande

parte da população. No entanto, os casos clínicos da doença são raros em

indivíduos imunocompetentes, que demonstram elevada resistência natural a esta

variedade essencialmente oportunista. Casos humanos da micose causada por C.

gattii sorotipo B predominam nas regiões tropicais e subtropicais em indivíduos sem

evidência de imunodepressão, comportando-se como patógeno primário, sendo a

micose de ocorrência endêmica e focal (PASSONI, 1999).

Um dos mais completos estudos de sorotipagem foi realizado por Nishikawa

et al. (2003), demonstrando que a prevalência das espécies/sorotipos diverge de

acordo com as regiões brasileiras. Um total de 467 isolados de amostras clínicas e

ambientais foi examinado. Os autores verificaram que sorotipo A é prevalente nas

regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste enquanto que sorotipo B predominou no Norte

e Nordeste. No Sudeste o sorotipo A foi detectado em 98,3% de pacientes com aids

(172/175) e na região Nordeste 87,5% (28/31), enquanto que em pacientes sem

aids, no Sudeste detectou-se ~53% (8/15) e no Nordeste 9,75% (3/31). Por outro

lado, o sorotipo B esteve associado com aids em 12,5% (2/16) dos pacientes da

região Nordeste e apenas 1,7% (3/175) da região Sudeste. Houve predomínio forte

do sorotipo B em relação ao paciente sem aids com 87,5% (28/31) na região

Nordeste e 47% (7/15) na região Sudeste. Assim, evidencia-se a prevalência do

22

sorotipo B na região Nordeste, em paciente HIV negativo. Outros dados relevantes

foram a descoberta de um isolado sorotipo C, de paciente HIV-negativo do Rio de

Janeiro, além de uma alta taxa de sorotipo AD (1,3%) em relação ao sorotipo D

(0,4%). Não tipáveis representaram 1,93%.

Posteriormente, Casali et al., (2003) examinaram 105 amostras clínicas do

Rio Grande do Sul, sendo 93 (88,6%) de paciente HIV positivo. Destas, 91 foram

sorotipo A, juntamente com mais 4 isoladas de pacientes sem fator de risco. Entre os

isolados sorotipo B, dois foram recuperados de paciente HIV positivo e 11 de

pacientes imunocompetentes.

A raridade do sorotipo C parece ser mundial. Há poucos relatos na literatura,

sendo a maioria proveniente do sul da Califórnia (KWON-CHUNG & BENNETT,

1984 apud KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). No Brasil tem sido registrado

esporadicamente, somente em cepas clínicas (LACAZ & RODRIGUES, 1983 apud

LACAZ et al., 2002a; NISHIKAWA et al., 2003; BARRETO DE OLIVEIRA, et al.

2004). Recentemente, dois estudos realizados na África mostraram prevalência de

C. gattii sorotipo C de 13,7% (22/176) em Botswana e 13,3% (2/15) em Malawi,

todos isolados de amostras de pacientes com aids (LIVINTSEVA et al., 2005). Na

África do Sul, Morgan et al., (2006) analisaram 46 isolados de C. gattii recuperados

de pacientes atendidos no período de março/2002 a fevereiro/2004, dos quais 19

eram sorotipo B e 22 sorotipo C (50% de pacientes com aids e 50% de pacientes

sem comprovação de estado HIV positivo ou negativo).

Isolados híbridos ocorrem em uma freqüência apreciável tanto em isolados

clínicos quanto ambientais. Na América do Norte, híbridos AD ocorreram em 7,1 %

no ambiente e 2,4% em clínicas (LINTVINTSEVA et al., 2005), no Brasil 1,3%

(NISHIKAWA et al., 2003) e na Europa 19% (VIVIANI et al., 2006), cuja análise com

PCR fingerprinting representou um aumento significante de 30 % das cepas híbridas,

pois alguns isolados que foram sorotipados como sorotipos A e D eram de fato AD, o

que demonstra diferenças entre os métodos utilizados. Isto indica que

possivelmente a ocorrência de híbridos deva ser maior do que até o momento foi

evidenciado e que os métodos devem ser reavaliados. Considere-se ainda que

vários isolados não têm sido caracterizados (COGLIATI et al., 2001; NISHIKAWA et

al., 2003), os quais são definidos como não tipáveis. A maioria dos isolados híbridos

é AD, o que está condizente com o fato dos sorotipos A e D serem cosmopolita.

23

A busca das fontes naturais da infecção demonstra um perfil similar à

distribuição dos sorotipos dos isolados obtidos de pacientes na mesma região. Estes

dados são apresentados no tópico 2.3.4.

2.3.3 Epidemiologia Molecular

A utilização de técnicas de biologia molecular tem contribuído sobremaneira

para a compreensão da estrutura populacional, taxonomia, eco-epidemiologia,

patogenicidade, mecanismos de infecção e tratamento de infecções fúngicas.

Nas últimas três décadas modelos de análise molecular para eucariotos têm

sido desenvolvidos em alguns fungos, tais como Saccharomyces cerevisiae,

Neurospora crassa e Aspergillus nidulans (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Estes

estudos moleculares para fungos proporcionaram um avanço notável no

conhecimento da biologia molecular de C. neoformans, a ponto de ser utilizado como

um sistema modelo para estudo molecular de outros fungos patogênicos.

Atualmente várias técnicas de tipagem molecular têm sido utilizadas para

análise de um número limitado de isolados clínicos e ambientais. Estas técnicas

incluem análise de fragmentos de ácidos nucléicos gerados por enzimas de restrição

(RFLP – Restriction Fragment Length Polimorphism) (CURRIE et al., 1994; JAIN et

al., 2005), hibridização por Southern blot com sondas de DNA baseado em

seqüência de DNA repetitivo (VARMA et al., 1995), cariotipagem (PERFECT et al.,

1993), seqüenciamento de DNA (CASADEVALL et al., 1992), PCR-fingerprinting

(MEYER et al., 2003; MEYER et al., 1999, ESCANDÓN et al., 2006) análise de DNA

polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD – Random Amplification of

Polimorphic DNA) (YAMAMOTO et al., 1995; SORRELL et al., 1996; MEYER et al.,

2003; MEYER et al., 1999; JAIN et al., 2005) e, mais recentemente, análise de

polimorfismo de tamanho de fragmentos amplificados (AFLP - Amplified fragment

Length polimorphisms) (BOEKHOUT et al., 2001; TRILLES et al., 2003; BARRETO

DE OLIVEIRA et al., 2004). Estas metodologias têm evidenciado a heterogeneidade

genética entre isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans. A

existência de variabilidade genética é importante porque pode traduzir-se em

variabilidade fenotípica, tais como diferenças antigênicas, virulência ou na

susceptibilidade aos agentes terapêuticos (FRANZOT et al., 1997). Resultados

prévios referidos por Ellis et al. (2000) evidenciaram alta variação dentro de isolados

de C. neoformans oriundos dos Estados Unidos.

24

Cariotipagem por eletroforese de campo pulsado tem sido usado para separação de

cromossomos de C. neoformans e demonstraram significante variação no tamanho

de cromossomos polimórficos entre os isolados (PERFECT et al., 1989; PERFECT

et al., 1993). Estes achados sugerem que C. neoformans não tem se expandido

clonalmente a partir de um isolado, mas que tem estado sob alguma pressão

evolucionária, para a instabilidade do cariótipo e que estas leveduras desenvolveram

mecanismos que permitem o rearranjo cromossômico. Apesar da heterogeneidade

dos padrões cromossômicos entre vários isolados alguns podem manter um padrão

estável durante repetidas passagens in vitro por muitos anos e in vivo em modelos

animais durante curto tempo (PERFECT et al., 1989). Freqüentes deleções e

rearranjos cromossômicos têm sido associados não apenas com fungos, mas

também com protozoários, durante seu ciclo de vida, sugerindo que estas alterações

possam ocorrer com C. neoformans, quando em condições de estresse ou certas

pressões seletivas. Não se sabe se esta instabilidade é deletéria ou útil para a

sobrevivência da levedura, mas poderia explicar a diversidade cariotípica em C.

neoformans (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Estudos revelaram que 90% dos

isolados clínicos de C. neoformans têm um único cariótipo (PERFECT et al., 1993).

Franzot et al. (1998) observaram pequenas diferenças no tamanho do cromossomo

em dois isolados da mesma linhagem (ATCC 24067), mantidas em condições

laboratoriais em diferentes laboratórios e supõem que C. neoformans é capaz de

alterações rápidas in vitro, provavelmente como resultado de adaptação de

condições laboratoriais.

Varma & Kwon-Chung (1992), utilizando a técnica de hibridização de RFLP

com sonda UT-4p, que tem sido usada para discriminar a diversidade de C.

neoformans, mostraram que 21 dos 26 isolados tinham um padrão único de DNA e

que o fingerprint dos isolados dentro de um mesmo grupo de sorotipo foram mais

similares que aqueles de diferentes sorotipos. Os autores demonstraram a

habilidade desta sonda discriminar entre isolados em uma população bem como

dentro de um sorotipo.

O uso de tecnologia de PCR combinada com o uso de primers aleatórios

permite identificar fingerprints de DNA de diferentes isolados de fungos. Estes

procedimentos têm sido refinados e adaptados para o uso em C. neoformans

(HAYNES et al., 1995; MEYER et al., 1999). Quando realizados em laboratórios com

experiência nesta tecnologia e com controle correto de genotipagem pode distinguir

um isolado de outro em mais de 95% dos isolados. A técnica foi refinada e o uso de

25

oligonucleotídideos que são específicos para minissatélites (M13) e microssatélites

(GACA)4 ou para seqüências repetitivas simples designadas para hibridização

fingerprint convencional. PCR fingerprint combina a especificidade do fingerprint

convencional baseado na hibridização do DNA com a eficiência da PCR e tem sido

usada para amplificar seqüências de DNA repetitivas hipervariáveis de C.

neoformans. PCR fingerprint com primers oligonucleotídeos (GACA)4 e fago M13

têm sido usadas com sucesso (CASADEVALL & PERFECT, 1998; ELLIS et al.,

2000).

Estudos realizados por Meyer et al. (1999, 2003) utilizando métodos de PCR-

fingerprinting (RAPD-PCR com iniciador M13) e RFLP do gene URA5, permitiram

identificar os 8 tipos moleculares designados de VN (I, II, III, IV) para C. neoformans

e VG (I, II, III, IV) para C. gattii. Utilizando a técnica de AFLP, Boekhout et al. (2001),

identificaram genótipos de C. neoformans e C. gattii. Comparados, estes dois

métodos mostram correspondência entre si, bem como relação com sorotipos. Deste

modo, C. neoformans corresponde aos genótipos: VN1/AFLP1, sorotipo A;

VNII/AFLP1A, sorotipo A; VNIII/AFLP3, sorotipo AD; e VNIV/AFLP2, sorotipo D; e C.

gattii corresponde aos genótipos: VG1/AFLP4, sorotipo B; VGII/AFLP6, sorotipo B;

VGIII/AFLP5, sorotipo B; e VGIV/AFLP7, sorotipo C. Estes genótipos moleculares

têm sido encontrados em grupos (clusters) de acordo com a origem geográfica e

também com variável distribuição global (KIDD et al. 2003). Observa-se que

correspondência com sorotipos restringe-se ao predomínio observado nas séries

analisadas, mas não há padrão molecular específico de sorotipo, principalmente

para C. gattii (LAZÉRA et al., 2007).

Os tipos VNI e VGI predominam no mundo como agentes de criptococose,

mas na América Latina a distribuição e ocorrência de tipos moleculares de C. gattii

apresenta perfil diferente dos demais continentes (MEYER et al., 2003; TRILLES et

al., 2003; BOEKHOUT, 2001). Estudos moleculares de agentes patogênicos

contribuem para a compreensão da epidemiologia da criptococose no Brasil.

Isolados clínicos e ambientais no Brasil mostram considerável diversidade genética

de ambas as espécies, demonstrando ocorrência simultânea de diferentes

tipos/genótipos (VNI/AFLP1, VNIV/AFLP2 e VGII/AFLP6) em ocos de árvores; e que

diferentes gêneros de árvores e substratos de madeira, bem como tocas de animais,

podem ser fontes de infecções humanas. Estudo retrospectivo dos tipos moleculares

de C. neoformans e C. gattii circulantes no Brasil sugere diferenças regionais na

distribuição destes genótipos. Assim, as regiões Sul e Sudeste do Brasil apresentam

26

como tipo molecular predominante VNI, atingindo, sobretudo pacientes

imunocomprometidos, principalmente os com aids (CASALI et al., 2003; IGREJA et

al., 2004; MATSUMOTO et al., 2007). Diferentemente, no N e NE do Brasil o agente

mais comum é o tipo VGII sorotipo B, demonstrando ser endêmico na região,

causando doença principalmente em pacientes imunocompetentes. O mesmo tipo

molecular VGII foi o responsável pela epidemia no Canadá, identificado na grande

maioria dos isolados clínicos humanos, veterinários e ambientais (KIDD et al., 2004).

Franzot et al. (1997) através da técnica de RFLP com elementos repetitivos CNRE-1

e seqüência do gene URA5 compararam a diversidade genética de isolados

brasileiros e de Nova Iorque, sugerindo a origem clonal dos isolados brasileiros para

explicar a baixa diversidade genética entre os 51 isolados coletados no Rio de

Janeiro e Belo Horizonte. No estudo alguns isolados brasileiros apresentaram uma

relação estreita condizente com a dispersão global de certos isolados patogênicos.

Embora seja um método mais demorado, o seqüenciamento de genes

específicos tem sido usado para detectar polimorfismo de C. neoformans e, portanto,

diferenças entre os isolados. Uma única cópia do gene URA5 mostrou a existência

de substituições extensivas de pares de bases em isolados individuais e entre

espécies, alcançando 6% dos nucleotídeos da seqüência codificadora

(CASADEVALL et al., 1992). Estas substituições geralmente são encontradas na 3ª

posição do códon ou nos introns, portanto as proteínas não sofrem alteração

(CASADEVALL et al., 1992).

A técnica de PCR com primers específicos para os genes STE12α e MFα de

C. gattii foi utilizada para determinar mating types de C. gattii presente em várias

regiões da Austrália (HALIDAY et al.,1999). Os resultados mostraram diferenças

geográficas na distribuição dos alelos de mating type. A maioria dos isolados

ambientais foram MATα, porém MATa foi encontrado em duas áreas separadas, o

que evidenciou o contraste com C. neoformans uma vez que ambos mating types

foram encontrados em algumas populações de C. gattii inclusive em uma destas

áreas numa distribuição aproximada de 1:1 como esperado para uma recombinação

sexual.

Utilizando abordagem tradicional (cruzamento in vitro) e molecular (PCR com

primers específicos STE12α e STE20) Yan et al. (2002) analisaram 358 isolados

oriundos de quatro áreas geográficas dos Estados Unidos; todos os isolados

sorotipos A, B e C foram MATα e de 19 isolados sorotipo AD 14 foram AaDα, sendo

13 de São Francisco (EUA), demonstrando proporção significante de isolados auto-

27

férteis, diferente das de outras áreas. Análises de mating type entre os híbridos

indica que a maioria dos isolados AD são αADa e aADα (BARRETO DE OLIVEIRA

et al., 2004; CHATURVERDI et al., 2002; LINTVINTSEVA et al., 2005). Híbridos BD

têm sido produzidos em condições laboratoriais (KWON-CHUNG et al., 1982b) e,

embora se especule sobre sua ocorrência natural (CHATURVEDI et al., 2002), isto

não havia sido observado até recentemente quando Bovers et al., (2006)

descreveram a ocorrência natural de híbridos entre C. neoformans e C. gattii BD,

isolados de pacientes. Os autores discutem que todos os híbridos de C. neoformans

e C. gattii têm sorotipo D do isolado parental, sugerindo que isolados sorotipos D

sejam sexualmente mais compatíveis com outros genótipos que os outros genótipos

de C. neoformans e C. gattii e ressaltam que a hibridização inter-espécies pode

formar um super-patógeno, resultante da combinação das características de ambas

as espécies.

O predomínio do tipo sexuado MATα sobre o MATa foi inicialmente reportado

por Kwon-Chung & Bennett (1978) quando analisou 338 isolados (233 clínicos e 05

ambientais numa proporção de 30:1 entre os isolados clínicos e de 40:1 entre os

isolados ambientais. Somente em 2000 Lengeler et al. identificaram o primeiro

isolado de C. neoformans sorotipo A MATa, que até então se acreditava extinto.

Este isolado é estéril e é menos virulento que sorotipo A MATα. O sorotipo D,

freqüente na Europa Central (VIVIANI et al., 2006) apresenta os dois tipos sexuados

e tem sido a base para estudos de genética clássica da espécie, embora MATa seja

pouco freqüente. Em relação a C. gattii sorotipo B, endêmico em regiões tropicais,

subtropicais e recentemente em região temperada de Vancouver, a maioria dos

isolados têm sido MATα, com raros isolados MATa. A supremacia de isolados MATα

sobre MATa é corroborada por diversos estudos (CASALI et al., 2003; TRILLES et

al.,2003; JAIN et al., 2005; CARVALHO et al., 2007), e têm sido considerado de

maior virulência em modelos animais (KWON-CHUNG et al., 1992b). Em contraste

com esta afirmação Nielsen et al. (2003), analisando isolados sorotipos A MATα e

MATa, observaram virulência equivalente em modelos animais, pontuando que é

possível que isolados MATα possam ser mais virulentos em humanos e que, devido

às diferenças entre estes e os organismos estudados, esta diferença não tenha sido

detectada. Isto indica que mais estudos são necessários para explicar estes

contrastes.

Outra tecnologia usada recentemente é o Luminex xMAP, que tem sido

adaptada visando detecção de genótipos de C. neoformans e C. gattii (DIAZ et al.,

28

2005) que se baseia em microsferas codificadas em cores que permite detectar

aproximadamente 100 diferentes espécies em uma única reação. Esta tecnologia

tem sido usada para detecção de várias espécies de fungos e bactérias com

grandes possibilidades de se tornar um método eficiente de diagnóstico com alta

especificidade na identificação de C. neoformans e C. gattii (BOVERS et al., 2007).

Técnicas moleculares também têm sido utilizadas para caracterização dos

sorotipos como PCR-multiplex (ITO-KUWA et al., 2007; CARVALHO et al.., 2007),

PRC fingerprinting mostrou aumento na identificação de híbridos AD (VIVIANI et al.,

2006) em relação ao usual Crypto Check Kit. PCR-restriction enzyme analysis e

length polymorphism analysis foram descritos por Enache-Angoulvant et al., (2007),

ambos baseados na seqüência de um fragmento do gene CAP59 cujos resultados

demonstraram serem métodos confiáveis.

O uso de técnicas moleculares no estudo de C. neoformans e C. gattii tem

contribuído para um melhor entendimento da patogenicidade, epidemiologia,

mecanismos de transmissão e permitem estudos de análise da diversidade intra e

interespecífica, distinguir entre infecção por novas linhagens ou recidivas,

caracterizar sorotipos bem como isolados resistentes a antifúngicos.

2.3.4 Ecologia dos agentes

A natureza saprobiótica de C. neoformans é conhecida desde 1894 quando

Sanfelice isolou o agente a partir de suco de pêssego fermentado (CASADEVALL &

PERFECT, 1998). Novo relato desta natureza só foi acontecer em 1951 quando

Emmons, pesquisando Histoplasma capsulatum em amostras de solo da região da

Virgínia (EUA), incidentalmente isolou C. neoformans de 4 amostras ambientais

dentre 716 pesquisadas (EMMONS, 1951). Em 1955, o mesmo autor demonstrou

que cepas virulentas de C. neoformans foram comuns e abundantes em amostras de

excretas e restos de ninhos de pombos (EMMONS, 1955 apud PASSONI, 1999).

Como descritos em outro tópico, concomitantemente isolados clínicos de C.

neoformans também são reportados em vários países de todos os continentes,

confirmando a distribuição universal deste agente.

Os relatos de Emmons suscitaram dezenas de estudos sobre o tema e, desde

então, a literatura mundial tem reportado o isolamento de C. neoformans de

diferentes fontes naturais nos vários continentes, evidenciando sua ampla

distribuição em zonas tropicais e temperadas tais como: na África (AJELLO, 1956),

Ásia (TAYLOR & DUANGMANI, 1968; HSU et al., 1994) Oceania (FREY & DURIE,

29

1964), Europa (MISHRA et al., 1981) América do Norte (KOZEL & HERMERATH,

1984) e América do Sul (LAZÉRA et al., 1993; RUIZ et al., 1989; GRANADOS &

CASTAÑEDA, 2005; QUINTERO et al., 2005; CURO et al., 2005). Em paralelo,

infecções por C. neoformans também têm sido reportadas em todos os continentes.

Entretanto, dentro dos continentes, há regiões com maior concentração de C.

neoformans, resultando em maior prevalência local de criptococose, como por

exemplo, nos Estados Unidos acredita-se que a infecção é mais comum nos estados

do sudeste (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

Excretas de pombos e detritos encontrados em seu habitat representam o

substrato natural mais comumente associado a C. neoformans, (PAL, 1997;

MONTENEGRO & PAULA, 2000; BERNARDO et al., 2001; REOLON et al., 2004;

CERMEÑO et al., 2006). Entretanto, excretas de outras aves também têm sido

reportados, incluindo canários (GRISEO et al., 1995 apud CASADEVALL &

PERFECT, 1998; FILIÚ et al., 2002) papagaios (LOPEZ MATINEZ & CASTANON-

OLIVARES, 1995 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998; ABEGG et al., 2006)

periquitos (FILIÚ et al., 2002; ABEGG et al., 2006) galinhas (SWINNE et al., 1986

apud CASADEVALL & PERFECT, 1998), várias espécies Psitacine e Passerine

(LUGARINI et al., 2008) entre outros.

O fungo é mais evidente em excretas de pombos acumuladas por vários anos

em espaços urbanos abrigados, como em torres, prédios antigos, cúpulas, sacada

de janelas, além de estábulos em áreas rurais (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).

O solo também tem sido freqüentemente reportado como nicho ecológico de

C. neoformans (EMMONS, 1951; AJELLO, 1956; AJELLO, 1958); entretanto, a

maioria das investigações que detectaram C. neoformans em solo refere-se a

amostras coletadas em celeiros, aviários ou de áreas potencialmente contaminadas

com excretas de aves (AJELLO, 1956; AJELLO, 1958; MACHADO et al., 1993;

CURO et al., 2005; BARONI et al., 2006).

A presença do fungo em excretas de pombos e de aves tem sido explicada

pelo fato de que estas servem de meio seletivo para C. neoformans na natureza, por

conter alto conteúdo de substâncias nitrogenadas, tais como a creatinina (STAIB,

1962 apud, KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Cryptococcus neoformans utiliza

creatinina como fonte de nitrogênio, enquanto outras espécies deste gênero não o

fazem, exceto C. gattii que, embora não ocorra (ao menos não tem sido encontrado)

em excretas de pombos, in vitro utiliza creatinina melhor que C. neoformans

(POLACHECK & KWON-CHUNG, 1980). A enzima cretinina-deiminase encontrada

30

em ambas as espécies é responsável pelo catabolismo da creatinina, promovendo

sua conversão em metil-hidantoína e amônia. Diferenças na regulação desta enzima

podem influenciar na incapacidade de C. gattii colonizar excretas de aves. A

deiminase responsável pelo metabolismo da creatinina em C. neoformans é

reprimida pela amônia enquanto que em C. gattii não há esta repressão. Esta

regulação pode estar envolvida na conservação de energia e na obtenção de

metabólitos necessários à sobrevivência (POLACHECK & KWON-CHUNG, 1980). O

metabolismo da creatinina em C. neoformans resulta no acúmulo de amônia e

aumento do pH. A inibição da creatinina deiminase por amônia provavelmente

previne alcalinização não controlada do ambiente, o que poderia inibir o crescimento

(CASADEVALL & PERFECT, 1998). A sobrevivência e a multiplicação em excretas

de pombos dependem de vários fatores, incluindo o pH, umidade, temperatura, luz

solar e outros fatores bióticos (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Umidade elevada

restringe sua multiplicação e o fungo resiste à dessecação. Excretas secas e antigas

podem conter até 5x107 células fúngicas (EMMONS, 1962).

Tem sido postulado que C. neoformans não causa infecção em pombos,

provavelmente devido à elevada temperatura corporal (41,5 a 43,3ºC). Entretanto,

infecção disseminada foi descrita em pombo selvagem, bem como infecção

subcutânea em região ocular, onde a temperatura pode ser mais baixa (KWON-

CHUNG & BENNETT, 1992). Sorrell & Ellis (1997) consideram improvável que

pombos sejam a principal fonte de Cryptococcus spp. na natureza, pois somente

pequenas concentrações do microrganismo são encontradas em bico, patas e swab

retal; além disso, a temperatura corporal inibe a multiplicação; a alta concentração

de amônia nas excretas frescas também inibe o crescimento. Em contraste,

elevadas concentrações da levedura são encontradas em excretas envelhecidas de

pombos, cujo ambiente é desfavorável para a maioria dos outros microrganismos.

Com base na descoberta de certas espécies de eucalipto servirem de

nicho/habitat natural de C. gattii tem sido proposto que também o nicho natural de C.

neoformans seja um vegetal, cuja madeira em decomposição protegeria os

microrganismos das intempéries, permanecendo viáveis por vários anos. Diversos

mamíferos e aves em associação com tais plantas hospedeiras poderiam passar as

células de Cryptococcus spp. através de seu intestino e depositar células capsuladas

em suas excretas (ELLIS & PFEIFFER, 1990b). Achados consistentes de C.

neoformans em ocos de várias espécies vegetais no Rio de Janeiro reforçaram esta

idéia (LAZÉRA et al., 1996). Neste estudo o fungo foi recuperado de cássia rosa

31

(Cassia grandis), ficus (Ficus microcarpa), e cássia amarela (Senna multijuga) o que

subsidiou os autores a sugerirem que C. neoformans não está associado a um só

gênero ou espécie de árvore, mas com um nicho especializado resultante de

biodegradação natural da madeira resultando em substrato favorável para seu

desenvolvimento. Além disso, é possível que o estado teleomórfico possa ocorrer

neste tipo de habitat. Achado importante obtido por Lazéra et al. (2000) na cidade de

Teresina/Piauí foi o encontro de C. neoformans e C. gattii compartilhando o mesmo

oco (Cassia grandis), indicando um nicho comum para ambas espécies e sugerindo

uma possível ligação entre seus ciclos de vida na natureza. Baseados neste achado,

associado à capacidade de C. neoformans produzir lacase, uma enzima envolvida

na degradação da lignina por outros Basidiomycetes e na relação filogenética de C.

neoformans com Tremella, um gênero que apresenta algumas espécies associadas

à degradação da madeira e ao micoparasitismo, Lazéra et al. (2000) propuseram ser

este um nicho primário para este fungo.

Em diferentes regiões brasileiras, C. neoformans foi isolado de madeira em

decomposição, em árvores tropicais, nativas ou introduzidas no Brasil, como

jambolão (Sygygium jambolana), cacaueiro (Theobroma cacao), cabori (Miroxylum

peruiferum), Eucalyptus camaldulensis, sibipiruna (Caesalpinia peltophoroides), e

Anadenanthera peregrina (LAZÉRA et al., 1993; 2000; RESTREPO et al., 2000;

MONTENEGRO & PAULA, 2000, REIMÃO et al., 2007).

Menos freqüentemente C. neoformans tem sido isolado de outros substratos

tais como: de colônias de abelha (Apis mellifera) (ERGIN et al., 2004), sótão de casa

abandonada habitada por morcego (LAZÉRA et al., 1993) e poeira intradomiciliar

(PASSONI et al., 1998). Neste último estudo, Passoni e colaboradores analisaram

824 amostras de poeira intradomiciliar, solo e excretas de aves, coletadas em

domicílios, isolando C. neoformans de poeira intra e peridomiciliar e de gaiolas de

pássaros domésticos, com 13% de positividade, cujo principal fator associado com

contaminação domiciliar por C. neoformans foi a presença de aves no ambiente

doméstico ou próximo a casa. Em outro estudo, realizado em Burundi (África

Central), Swinne et al., (1989) isolaram C. neoformans do ambiente doméstico de 7

dos 20 domicílios de paciente com criptococose associada com HIV, demonstrando

que nesta região o paciente infectado pelo HIV é freqüentemente exposto a este

fungo. Através da exposição de placas de Petri com meio de cultura ou pela coleta

de ar com aparelhos coletores Andersen tem sido detectada a presença de C.

neoformans no ar atmosférico (RUIZ & BULMER, 1981; RUIZ et al., 1981;

32

PEDROSO et al., 2007), demonstrando que materiais muito particulados, frouxos e

secos podem ser prontamente aerossolizáveis e representar grande potencial de

risco para a saúde. Outro interessante estudo refere o isolamento de C. neoformans

do trato digestivo de baratas (SWINNE et al., 1991 apud CASADEVALL &

PERFECT, 1998).

Na Índia, Randhawa et al. (2003) reportaram o isolamento de C. neoformans

de amora preta indiana (Syzygium cumini) e Ficus religiosa, enquanto Nawange et

al. (2006) detectaram C. neoformans sorotipo A em Tamarindus indica, Mangifera

indica, e S. cumini.

Partículas viáveis de C. neoformans isoladas de excretas ressecadas de

pombos, do ar e do solo freqüentemente são menores que dois µm, tamanho

suficiente para se depositar nos alvéolos (NEILSON et al., 1977; RUIZ & BULMER,

1981). A partir do solo o fungo se dissemina através das correntes de ar ou distúrbio

mecânico. O isolamento de C. neoformans do ar (RUIZ & BULMER, 1981) e

evidências clínicas de que muitos casos de criptococose necropsiados têm um foco

primário no pulmão reforçam a idéia de que a infecção inicia pela inalação do fungo

(KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Durante a fase de reprodução sexual, ambas

as espécies produzem pequenos basidiosporos, os quais provavelmente podem ser

mais facilmente dispersados pelo ar que as células de leveduras e, portanto, talvez

sejam os mais importantes propágulos infectivos (SWINNE & DE VROEY, 1997).

Em suma, C. neoformans está presente em focos urbanos, associados a aves

em seus habitats, adaptados às construções humanas, como pombos, aves em

parques, lojas comerciais e domicílios, como periquitos e canários (PASSONI et al.,

1998; FILIÚ et al., 2002; BARONI et al., 2006) e ocos de árvores. Este agente

mostra-se amplamente adaptado ao viver humano, capaz de reproduzir-se por

expansão clonal e sobreviver em substratos secos, protegidos da iluminação direta.

É ubíquo e de fácil inalação através de formas dessecadas das leveduras presentes

no meio ambiente e, possivelmente, também de basidiosporos. O sorotipo A também

é encontrado em ambientes rurais e já foi encontrado em cacaueiro e árvore nativa

de mata amazônica, indicando habitats naturais em áreas preservadas ou com

pouca intervenção humana, provavelmente seu nicho ecológico primário (LAZÉRA

et., 2000; LAZÉRA et al., 2005). Estudo recente no Campus da FIOCRUZ no Rio de

Janeiro mostrou que pode sobreviver por muitos anos em oco de árvore em

ambientes urbanos (BARBOSA et al., 2007).

33

A presença de isolados do sorotipo AD sugere que os sorotipos A e D de C.

neoformans possam interagir no meio ambiente, reproduzir e produzir recombinantes

ou híbridos AD. Tanto o sorotipo D quanto o AD são encontrados em menor

freqüência do que o sorotipo A em habitats como ocos de árvores, excretas de

pombos e outras aves. De forma correspondente, estes sorotipos D e AD podem

também ser oportunistas, ocorrendo em diferentes regiões do Brasil (NISHIKAWA et

al., 2003; TRILLES et al., 2003; CASALI et al., 2003).

O fungo tem sido isolado do solo, embora não faça parte da microbiota normal

deste substrato (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Também tem sido isolado de

vários hospedeiros animais inferiores, como insetos e seus habitats (insect frass), e

amebas. Tem sido sugerido que Acanthamoeba polyphaga, uma ameba do solo,

possa interagir com C. neoformans no solo. Ruiz et al., (1982) demonstraram que

estes protozoários ingerem e matam o fungo. Trofozoítas de amebas, ácaros,

baratas (Periplaneta americana) e tatuzinhos de jardins (Metoponorthus pruinosus)

isolados de excretas de pombos ingerem C. neoformans e são descritos como

fungívoros (RUIZ et al., 1982; CASADEVALL & PERFECT, 1998; STEENBERGEN &

CASADEVALL, 2003). A associação entre C. neoformans e hospedeiros é

consistente com a ordem Tremellales, muitos dos quais são micoparasitas

(ALEXOPOULOS et al., 1996; KWON-CHUNG et al., 1995), sugerindo um possível

papel expandido como parasita na natureza (LIN & HEITMAN, 2006). RUIZ et al.

(1982) investigaram fatores bióticos que podem interferir na ecologia de C.

neoformans e demonstraram que bactérias isoladas de excretas de pombos,

notadamente Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis, exibem atividade anti-C.

neoformans em meios artificiais, sugerindo que certas bactérias encontradas nestes

substratos têm potencial apropriado de exercer um aparente efeito letal sobre a

população residente do fungo. Outro estudo demonstra que Escherichia coli e

Bacillus subtilis podem excretar toxinas que pode ser usada para o aumento da

imunidade local na árvore respiratória (WILLIAMS et al., 2004) ou sintetizam

antibiótico com atividade antifúngica (FAMEHIRO et al., 2002). FRASES et al. (2006)

demonstraram que Klebsiella aerogenes é capaz de prover C. neoformans com

precursores requeridos para síntese de melanina.

Estes achados sugerem que interações com hospedeiros naturais e outros

organismos no ambiente, podem influenciar a persistência, reprodução, morfologia e

distribuição de C. neoformans na natureza (RUIZ et al., 1982; LIN & HEITMAN,

2006).

34

Recentes estudos têm utilizado vários organismos ou grupos de organismos

tais como amebas (Achantmoeba castellanni) (STEENBERGEN, et al., 2001),

nematóides (Caenorbaditis elegans) (MYLONAKIS et al., 2002; TANG et al., 2005)

fungo mucilaginoso (Dictyostelium discoideum) (STEENBERGEN, et al., 2003),

mosca de fruta (Drosophyla melanogaster) (APIDIANAKIS et al., 2004) e lagarta

(Galleria mellonela) (MYLONAKIS et al., 2005) como hospedeiros do fungo para

estudos da virulência e relação patógeno-hospedeiro.

Pesquisadores australianos foram pioneiros no estudo da ecologia de C.

gattii. Ellis & Pfeiffer foram os primeiros a detectar o habitat natural de C. gattii

associado à Eucalyptus camaldulensis árvore nativa na Austrália, em 1990a, quando

foi isolado do ar, madeira, cascas, folhas, e restos vegetais situados sob a copa de E.

camaldulensis em floração. Segundo estes autores a distribuição global de E.

camaldulensis parece coincidir com a distribuição da micose por C. gattii (ELLIS &

PFEIFFER, 1990a). Posteriormente o fungo foi detectado em E. camaldulensis no sul

da Califórnia (PFEIFFER & ELLIS, 1991) e em ocos de E. tereticornis, também na

Austrália (PFEIFFER & ELLIS, 1992). Novos registros de árvores hospedeiras do fungo

incluíram Syncarpia glomulifera, E. microcorys, E. grandis, E. rudis, E. gomphocephala

e E. blakelki, nas diversas regiões da Austrália (KROCKENBERG et al., 2002; VILCINS

et al., 2002). Considerando que E. camalulensis foi extensivamente exportada da

Austrália para o Havaí, sudeste da Califórnia, México, Brasil, África e Ásia, levantou-se

a hipótese de que C. gattii tenha sido exportado para tais regiões em sementes

infectadas (PFEIFFER & ELLIS, 1990b).

A princípio, sugeriu-se que C. gattii tinha um hospedeiro específico pertencente

às angiospermas e que os propágulos do fungo estavam dispersos no ambiente por

um curto período de tempo (ELLIS & PFEIFFER, 1990a). O isolamento de C. gattii

também tem sido referido de árvores de Eucalyptus de outros países como Colômbia

(GRANADOS & CASTAÑEDA, 2005), México (LICEA et al., 1999) Brasil

(MONTENEGRO & PAULA, 2000), Índia (CHAKRABARTI et al., 1997) e Egito

(MAHMOUD, 1999), bem como Ficus soatensis, Croton bogotanus, Croton funkianus,

Coussapoa sp., Cupressus lusitanica, Pinus radiata, Acacia decurrens e Terminalia

catapa na Colômbia (CALEJAS et al., 1998; GRANADOS & CASTAÑEDA, 2005).

Investigações realizadas com amostras das regiões norte e nordeste do Brasil

demonstraram a ocorrência de C. gattii em oco de Moquilea tomentosa (oiti), Cassia

grandis (cássia rosa) e Ficus microcarpa (ficus) coletados em Teresina/Piauí, e de

Guettarda acreana, em floresta pluvial tropical na Amazônia Ocidental, no estado de

35

Roraima (LAZÉRA et al., 1998; LAZÉRA et al., 2000; FORTES et al., 2001). Também

foi encontrado na Colômbia, em algodoeiro de praia (CALLEJAS et al., 1998) e no

Canadá, em árvores como elmo, cedro, pinheiro e carvalho, mas não em eucalipto

(KIDD et al. 2004). A associação de C. gattii com madeira em decomposição tem

sido relatada em vários estudos o que sugere uma relação endofítica em comum

com outros fungos causadores da podridão da madeira (SORRELL, 2001).

Estes estudos mostram a contundente associação que há entre C. gattii e

vegetais, mas, como concluíram Lazéra et al. (2000), não há habitat ou associação

específica de C. gattii com árvores-hospedeiras, mas sim, padrões geográficos de

ocorrência do fungo em madeira em decomposição, substrato, onde ambas as

espécies, C. gattii e C. neoformans, podem estar presentes, isoladas ou juntas, em

diferentes proporções.

Recentemente Kidd et al., (2007) referiram pela primeira vez o isolamento de

C. gattii de amostras de água doce e salgada em pesquisa realizada no Canadá,

região onde tem sido freqüentemente reportado infecção por C. gattii. O estudo

obteve positividade em 27 de 132 amostras de água doce e em 4 das 19 amostras

de água salgada, representando 20% e 21%, respectivamente. Foi também

observada maior freqüência em água de lago que em rios e riachos, possivelmente

devido à menor dispersão na água parada, facilitando a obtenção de níveis

detectáveis do fungo. Ensaios para testar o potencial de sobrevivência de C. gattii

em água doce e salgada também foram realizados, demonstrando que água do mar,

filtrada ou não, sustenta maior taxa de sobrevivência do fungo, acima de um ano.

Ensaios de água do mar submetidos à temperatura ambiente e a 4º C demonstraram

que C. gattii sobrevive neste ambiente que simula as condições naturais das águas

de Vancouver. Para os autores estes achados indicam que C. gattii pode ser

transportado em corpos d’água, o que poderia explicar os mecanismos de

transmissão para os recentes casos de criptococose gattii em mamíferos ocorridos

no estreito de Geórgia em Vancouver (STEPHEN et al., 2002). Outras fontes

ambientais foram investigadas por Kidd et al. (2007) demonstrando a ocorrência de

C. gattii em amostras de solo e do ar.

Ocasionalmente, a ocorrência de C. gattii também tem sido demonstrada em

outros substratos tais como em poeira de sótão, relacionada com excretas de

morcego, no estado do Rio de Janeiro (LAZÉRA et al., 1993), bem como de

fragmentos de ninho de vespas (Polybia occidentalis) no Uruguai (GEZUELE et al.,

1993).

36

Restrepo et al. (2000), analisando estudos sobre fontes ambientais de C.

neoformans em várias regiões brasileiras, discutem que o ciclo de vida deste

microrganismo envolve uma origem em madeira em decomposição, com sucessivas

adaptações a diferentes espécies de árvores, e que mais tarde dispersaram-se e

adaptaram-se em ambientes com interferência humana, concluindo que distúrbios e

ação antrópica representam um papel importante na epidemiologia da criptococose

bem como na ecologia deste agente etiológico.

A epidemiologia da criptococose reflete o comportamento ecológico distinto

de C. neoformans, com distribuição geográfica universal e ampla disseminação em

ambientes urbanos relacionados a habitats de pombos e outras aves, principalmente

psitacídeos (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992; PASSONI et al., 1998; FILIÚ, et al.

2002). Além disso, já foram descritas outras fontes como madeira em decomposição

e poeira domiciliar (LAZÉRA et al. 1996; PASSONI, 1999).

Finalmente, é importante ressaltar que ambas as espécies, com diferentes

sorotipos, podem ocorrer separadamente ou simultaneamente compartilhando o

mesmo habitat, relacionado a processos de decomposição da madeira, um aspecto

novo do ciclo biológico destes agentes (LAZÉRA et al., 2005).

2.4 VIRULÊNCIA EM C. neoformans E C. gattii

A descrição dos fatores de virulência de um patógeno é de capital

importância. Em sua mais simples definição descrevem a infectividade relativa de

um microrganismo e sua habilidade de vencer as defesas naturais do hospedeiro.

Em fungos, a definição de certos fatores de virulência e dos genes correspondentes

pode ser mais complexa e menos bem definida que para bactérias (CASADEVALL &

PERFECT, 1998). Steele (1991) apud Casadevall & Perfect (1998) enfatiza que os

patógenos eucariotas geralmente não são transmissíveis de pessoa a pessoa e sua

evolução não tem necessariamente alcançado habilidades específicas para infectar

ou invadir o hospedeiro humano. A infecção fúngica geralmente decorre de um

encontro acidental no ciclo de vida do fungo. Para uma infecção fúngica o

hospedeiro pode estar em estado de imunodepressão ou não, dependendo da

particularidade do fungo e/ou da magnitude do inóculo (CASADEVALL & PERFECT,

1998).

A maioria dos fungos vive como sapróbios. Entretanto, entre os sapróbios

permanece um subgrupo de fungos patogênicos que podem causar infecções

37

agudas e crônicas em humanos. São sabróbios facultativos, portanto; raríssimos

fungos são parasitas obrigatórios para humanos.

Existe um conjunto de genes que compõem a virulência destes fungos

patogênicos e, provavelmente, são complexos, inter-relacionados e às vezes

específicos para gênero, espécie ou cepa (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

Diferentemente das potentes toxinas bacterianas, os agentes da criptococose não

parecem produzir produtos tóxicos que contribuam diretamente para sinais e

sintomas da criptococose (KOZEL, 1995).

Em geral, os fatores de virulência de Cryptococcus spp. têm sido

caracterizados usando C. neoformans como modelo patogênico. Segundo

Stteenbergen & Casadevall (2003) C. neoformans tem fatores de virulência bem

definidos que satisfazem os seguintes critérios: (1) propriedade associada ao

patógeno; (2) a inativação do gene diminui a virulência; e, (3) a complementação ou

restauração do gene ou produtos do gene restaura a virulência fúngica.

Cápsula polissacarídica

A cápsula é uma estrutura marcante que envolve a parede celular da célula

de C. neoformans conferindo-lhe uma morfologia distintiva em relação a outras

leveduras patogênicas. A cápsula é composta por pelo menos três componentes:

manoproteína, galactoxilomanana e glucuronoxilomanana (GMX). A GMX que

representa 90% dos componentes da cápsula e consiste de ligações lineares de (1-

3) α–D-manopironose com β-D-xilopiranosil, β-D-glucupiranosil-ácido urônico e

substituintes 6-О-acetil. Os sorotipos são determinados pela quantidade de xilose e

manose e o grau de О-acetilação (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003). Pelo

menos 4 genes capsulares individuais foram identificados, caracterizados e

nomeados como CAP64, CAP60, CAP59 e CAP10. Porém, os determinantes

genéticos da diferenciação dos sorotipos não são conhecidos (CHANG & KWON-

CHUNG, 1994, 1998, 1999; CHANG et al., 1996). A deleção ou mutagênese de

algum destes genes resulta em cepa mutante acapsulada e avirulenta. A

reintrodução de uma cópia funcional de um dos genes da cápsula mutante restaura

a produção da cápsula e a virulência (CHANG & KWON-CHUNG, 1999).

A cápsula polissacarídica desempenha um importante papel na agressão ao

hospedeiro. Dentro dos macrófagos libera polissacarídeos de sua cápsula dentro de

vesículas ao redor do fagossoma do macrófago tanto in vivo quanto in vitro. As

vesículas com polissacarídeos se acumulam no citoplasma dos macrófagos e podem

causar disfunção e morte celular (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).

38

Especula-se que pode proteger a levedura da dessecação ou reduz sua habilidade

para ser ingerida e destruída por amebas do solo (NEILSON et al., 1978). Existe

uma correlação direta entre a quantidade de polissacarídeos no soro e a severidade

e conseqüência da doença. Tem sido postulado que alto nível de antígeno

polissacarídico de Cryptococcus no fluido cérebro-espinhal contribui para danos no

hospedeiro e manifestações por alteração do metabolismo da água no SNC, levando

ao aumento da pressão intracranial, resultando em cefaléia, alteração visual e

eventualmente à morte (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).

Muitos fatores ambientais influenciam no tamanho da cápsula de C.

neoformans. Fontes de carbono e ausência ou presença de certos aminoácidos e

vitaminas modificam o tamanho da cápsula in vitro. A presença não apenas de

tiamina, L-prolina ou asparagina, mas também baixa concentração de glucose,

manose, xilose ou sucrose induz cápsulas largas. Ao contrário, altas concentrações

de glucose ou de NaCl reprime a biossíntese. Em relação ao estágio de crescimento,

a cápsula é maior na fase estacionária quando comparada à fase exponencial.

Concentrações baixas de Ferro e presença de componentes séricos são fortemente

indutores da biossíntese da cápsula (JANBÓN, 2004).

A cápsula de C. neoformans normalmente não é visível em suspensões

aquosas quando examinadas em microscopia óptica. Porém, pode ser facilmente

visualizada em preparações com tinta da China, onde as partículas da tinta são

excluídas pela cápsula, formando um halo claro ao redor da célula da levedura

(OKABAYASHI et al., 2007)

Lacase e Melanina

Melaninas são polímeros multifuncionais encontrados em representantes de

todos os Reinos biológicos. Tipicamente, são pigmentos escuros, de alto peso

molecular, carregados negativamente e produzidos por uma lacase através da

polimerização oxidativa de compostos fenólicos. A melanina é um radical livre

estável, insolúvel em solventes fisiológicos, e resistentes à degradação ácida.

Também parece que C. neoformans e C. gattii são únicos no gênero a produzir

melanina rotineiramente a partir de compostos difenólicos via uso da enzima

fenoloxidase a 37ºC, embora haja relatos esporádicos de melanização em outras

espécies (HAMILTON & HOLDOM, 1999). Assim, ao contrário de outros fungos, C.

neoformans não possui tirosina, mas sim a enzima fenoloxidase, identificada como

uma lacase, que pode sintetizar melanina a partir de precursores, tais como L-

DOPA, dopamina, epinefrina (HAMILTON & HOLDOM, 1999; WILLIAMSON, 1997

39

apud STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003). Culturas de C. neoformans

crescendo na presença destes precursores apresentam coloração marrom a preta.

O pigmento está localizado na parede celular do fungo e pode contribuir para a

sobrevivência deste e manutenção da integridade da parede (WILLIAMSON, 1997

apud STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).

Existem vários mecanismos pelos quais a melanina contribui para a

virulência. A lacase protege as células de C. neoformans da explosão oxidativa nos

macrófagos alveolares (LIU et al., 1999), sendo proposto que o Fe2+, produto da

redução do ferro pode reduzir H2O2 a radicais hidroxil protegendo assim a célula

fúngica de danos oxidativos. A presença da melanina pode significantemente

proteger C. neoformans de compostos antifúngicos como anfotericina B e

caspofungina através da ligação aos antifúngicos, o que reduz sua disponibilidade e

eficácia (VAN DUIN et al., 2002 apud NOSANCHUCK & CASADEVALL, 2003). A

propriedade da melanina de ligar-se a proteínas confere a C. neoformans a

capacidade de suprimir possíveis efeitos tóxicos causados por peptídeos

(DOERING, 2000; JACOBSON, 2000)

O neurotropismo de C. neoformans pode ser explicado em parte, pela

habilidade do fungo em converter catecolaminas em melanina. Catecolaminas

incluem moléculas como epinefrina, norepinefrina e dopamina que funcionam como

neurotransmissores do SNC (CASADEVALL et al., 2000). Estudos genéticos

suportam a associação de virulência com a produção de fenoloxidase. Polacheck et

al. (1990) mostraram que uma mutante desprovida de fenoloxidase foi morta pelo

sistema oxidativo da epinefrina na presença de um íon de metal e peróxido de

oxigênio, enquanto a cepa selvagem foi resistente, sugerindo que fenoloxidase pode

consumir epinefrina e proteger C. neoformans do sistema oxidativo no SNC.

Como fator de virulência em hospedeiros mamíferos foi provavelmente

cooptada pelo seu uso de C. neoformans em seu ambiente natural, é possível que

em seu nicho ambiental, C. neoformans tem usado melanina para proteger-se dos

danos oxidativos da irradiação ultravioleta do sol ou de extremos de temperatura, ou

ainda mantendo a integridade da parede celular contra alterações osmóticas no

ambiente (WANG & CASADEVALL, 1994; ROSAS & CASADEVALL, 1997;

CASADEVALL & PERFECT, 1998).

A melanina de C. neoformans protege contra os efeitos fungicidas de

peptídeos microbicidas como as defensinas, potegrinas e magaininas, através da

interação e seqüestro destes peptídeos (ROSAS et al., 2000). ROSAS &

40

CASADEVALL (2000) demonstraram in vitro que a melanização diminui a

susceptibilidade de C. neoformans contra enzimas hidrolíticas, sugerindo que a

melanina tem um potencial papel na proteção contra a degradação por

microrganismos antagonistas do ambiente.

Williamson (1994) purificou e identificou esta lacase e descreveu a seqüência

do gene CnLAC1. Posteriormente, foi revelado um segundo gene (ZHU &

WILLIAMSON, 2004). O gene LAC2 é adjacente ao LAC1 e LAC2 também contribui

para a polimerização de moléculas difenólicas para formação da melanina, mas em

menor extensão que o LAC1.

Fosfolipase

As fosfolipases são enzimas capazes de promover a hidrólise de uma ou mais

ligações éster em glicerofosfolipídios e auxiliam na degradação e desestabilização

da membrana da célula hospedeira e lise celular (GHANNOUM, 2000). CHEN et al.

(1997a, 1997b) reportaram atividade de fosolipase B (PLB) lisofosfolipase (LFP) e

lisofosfolipase-transacilase (LPTA) de C. neoformans crescendo em ágar gema de

ovo. De 50 isolados testados, 49 apresentaram atividade devido à fosfolipase B

secretada na cultura. Análise de 4 cepas com diferentes níveis de atividade

fosfolipase indicaram a correlação entre atividade fosfolipase e virulência em

camundongo BALB/c (CHEN et al., 1997a). Os autores sugerem que a atividade

fosfolipase produzida por C. neoformans pode destruir membrana celular de

mamíferos e permitir a penetração da levedura no tecido hospedeiro.

Urease

Urease hidrolisa uréia a amônia e carbamato, resultando em aumento

localizado do pH que pode ser usado na identificação como resultado de alterações

colorimétricas. A grande maioria dos isolados clínicos de C. neoformans é urease

positiva (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003). O gene CnURE1, que codifica a

urease, foi clonado e o produto gênico caracterizado. Estudos de patogenicidade em

coelho infectados com mutante ure1 e cepa selvagem não demonstraram diferenças

significativas na contagem das colônias recuperadas do fluido cefalorraquidiano,

entretanto diferenças significativas foram detectadas em um modelo murino, com

animais inoculados intravenosamente e por inalação com mutante ure1 e linhagem

selvagem. A sobrevida foi maior nos camundongos infectados com o mutante ure1.

A complementação do mutante ure1 com o gene selvagem (URE1) resultou em tipos

transformantes que foram significativamente mais patogênicos do que o mutante

ure1 (COX et al., 2000).

41

Proteinases

Proteinases têm sido demonstradas importantes para a virulência de bactérias

e fungos patogênicos. Isolados clínicos e ambientais de C. neoformans tem atividade

proteinase. Atividade proteinase de C. neoformans degrada proteínas do

hospedeiro, tais como colágeno, elastina, fibrinogênio, imunoglobulinas e fatores de

complemento. Proteinases de C. neoformans podem causar danos no tecido,

provendo nutrientes para o patógeno e proteção do hospedeiro. Esta degradação

dos componentes do hospedeiro pode proteger C. neoformans contra a resposta

imune do hospedeiro, bem como possível auxílio no mecanismo de escape da célula

fúngica dos compartimentos fagossomais (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).

Mating type

Cryptococcus neoformans e C. gattii apresentam um sistema de mating

bipolar com um único locus MAT contendo dois alelos α e a. Há uma diferença

significativa em relação à ocorrência MATα e MATa de isolados clínicos e

ambientais de C. neoformans, uma vez que isolados MATα são 30 a 40 vezes mais

freqüentes que isolados MATa. Kwon Chung et al. (1992) demonstraram que a

progênie do tipo α é mais virulenta que o tipo a, sugerindo que isolados MATα

apresentam vantagem seletiva na sobrevivência ambiental. Em C. neoformans var.

grubii (=C. neoformans sorotipo A) a maioria dos isolados clínicos são MATα.

Nenhuma diferença na virulência foi observada entre cepas α e a congênica a,

entretanto, durante co-infecção cepas MATα e MATa são equivalentes em tecido

periférico, mas as células α têm uma predileção acentuada para penetrar no SNC.

Isto pode explicar a marcante prevalência de MATα em isolados clínicos (NIELSEN

et al., 2005).

Temperatura

Um dos mais importantes fatores de virulência para fungos patogênicos é a

temperatura; C. neoformans e C. gattii podem crescer e se multiplicar à temperatura

corporal dos mamíferos (37-39ºC) e esta característica é essencial para a virulência

destes agentes patogênicos. Raros isolados de outras espécies de Cryptococcus

são capazes de crescer a 37ºC. Mutantes incapazes de crescer a 37ºC não são

virulentos, ainda que tenham capacidade de formar cápsula ou melanina em meios

difenólicos (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). São conhecidos isolados de C.

neoformans particularmente sensíveis a temperaturas acima de 39ºC, que

demonstram um significante decréscimo na taxa de crescimento naquelas

temperaturas, com desenvolvimento de padrões de brotamento incomuns, formação

42

de pseudohifas e proeminente vacuolização no citoplasma. Estas alterações

estruturais demonstram uma grave reação de estresse dentro da levedura e sua

maquinaria de replicação (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

2.5 CRIPTOCOCOSE

Historicamente a criptococose foi descoberta, descrita e estudada através de

sua face oportunística, associada a sarcoma, linfomas, uso de corticóides, uso de

drogas imunossupressoras em hospedeiros transplantados e atualmente é uma das

principais co-morbidades associadas à aids. Epidemiologicamente mostra-se como

um marcador de hospedeiros com imunodeficiência celular (LAZÉRA et al., 2005).

Constitui-se em uma infecção sistêmica, adquirida através da inalação de

propágulos infectantes oriundos de diversas fontes ambientais. Tem sido proposto

que células de leveduras desidratadas e/ou basidiosporos são as unidades

infectantes, uma vez que são suficientemente pequenas (< 3µm de diâmetro)

capazes de se depositarem nos alvéolos pulmonares após inalação (RUIZ &

BULMER, 1981; SORRELL & ELLIS, 1997). Cryptococcus neoformans isolados de

excretas de pombos existem exclusivamente na forma de levedura e são

predominantemente ou exclusivamente MATαααα. Entretanto, células capsuladas

apresentam pouca viabilidade em condições de baixa umidade e escassez de

nutrientes, enquanto basidiosporos são muito pequenos (< dois µm de diâmetro) e

resistentes à dessecação, sendo facilmente dispersados pelo ar. Em meio de cultura

desenvolvem-se como leveduras e são patogênicos para camundongos (RUIZ &

BULMER, 1981; KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). A criptococose não é

contagiosa e a transmissão inter-humana é rara e parece estar relacionada a um

único caso, um evento iatrogênico; transmissão animal-homem, não tem sido

documentada e muito raramente C. neoformans vive como comensal humano; e,

infecção nosocomial não tem sido convincentemente descrita. Os casos

documentados de transmissão homem-homem estão relacionados a transplante de

órgão infectado e acidente com sangue contaminado (CASADEVALL & PERFECT,

1998; BEYT & WALTMAN, 1978 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998; GLASER

& GARDEN, 1985 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998; OOI et al., 1981). Em

relação à transmissão animal-homem, Lagrou et al., (2005) reportaram um caso de

meningite criptocócica em paciente imunocompetente com exposição a pet magpie

com a micose, sugerindo transmissão zoonótica.

43

Lazéra et al. (2005) reconhecem duas entidades clínicas distintas para esta

micose: criptococose oportunista, cosmopolita, associadas a condições de

imunodepressão celular, causada por C. neoformans e criptococose primária,

endêmica em áreas tropicais e subtropicais, ocorre em hospedeiros aparentemente

normais, imunocompetentes, causada por C. gattii. Ambas causam

meningoencefalite, de evolução grave fatal, acompanhada ou não de lesão pulmonar

evidente, fungemia e focos secundários para pele, ossos, rins, supra-renal, entre

outros.

O gênero Cryptococcus compreende várias espécies, mas tradicionalmente

apenas C. neoformans e C. gattii são considerados causadores de criptococose.

Muito raramente algumas outras espécies têm sido relacionadas à infecção.

Espécies diferentes de C. neoformans e C. gattii têm sido isoladas de várias fontes

ambientais e com ampla distribuição geográfica, incluindo Caribe, Antártida e

Himalaia (KHWCHAROENPORN et al., 2007). Em revisão realizada por estes

autores, sobre outras espécies de Cryptococcus envolvidas em infecções são

reportadas as seguintes espécies: C. laurentii, C. albidus, C. adeliensis, C. curvatus,

C. humicolus, C. luteolus, C. macerans e C. unigutullatus, cujos sítios mais comuns

são circulação sanguínea e sistema nervoso central.

2.5.1 Aspectos Clínicos

De acordo com Perfect & Casadevall (2002) existe dois sítios primários da

criptococose: o pulmão e o sistema nervoso central (SNC). Algumas diferenças da

criptococose são observadas em pacientes com ou sem infecção HIV, tais como:

maior envolvimento do SNC e extra-pulmonar; maior taxa de positividade em

exames com tinta da China e hemocultura; e poucas células inflamatórias no fluido

cérebro-espinhal nos pacientes infectados pelo HIV.

As manifestações clínicas da criptococose tendem a se sobrepor entre

pacientes com aids e pacientes gravemente imunocomprometidos por outras causas

(indivíduos transplantados ou em uso de altas doses de corticosteróides), mas sem

aids. Entretanto, alguns achados são mais comuns em hospedeiros com aids que

em não-aids.

O pulmão é a porta de entrada mais comum da infecção. As principais

manifestações clínicas da criptococose são respiratórias e pelo SNC. A doença

pulmonar é mais freqüente em indivíduos imunocompetentes e os sintomas são

muito variáveis, desde oligossintomáticos a pneumonias graves com insuficiência

44

respiratória. Por outro lado, infecção do cérebro e meninges é a mais comum

manifestação clínica da criptococose é também a mais letal (KWON-CHUNG &

BENNETT, 1992). Lazéra et al. (2005) enfatizam sobre a colonização da árvore

traqueobrônquica, evidenciada pelo isolamento repetitivo do fungo de espécimes do

trato respiratório baixo e com ausência de lesão pulmonar, endobrônquica ou de

outros sítios e com base no quadro clínico, apresentam a seguinte classificação para

a criptococose:

Criptococose pulmonar regressiva: a infecção é assintomática e as lesões

pulmonares são primárias ou de reinfecção exógena. O diagnóstico decorre do

encontro casual de exame histopatológico de nódulos residuais pulmonares,

geralmente periféricos e sem calcificação.

Criptococose pulmonar progressiva: com manifestações clínicas e alterações

radiológicas pulmonares diversas. A sintomatologia é inespecífica e escassa, muitas

vezes resultante de um achado casual. Pode ocorrer tosse, escarro mucóide, sendo

pouco freqüente os hemoptóicos. Em pacientes imunocomprometidos a infecção

tende à invasão, fungemia e disseminação para múltiplos órgãos e sistemas

especialmente o SNC.

Criptococose disseminada: São os quadros extrapulmonares. A meningoencefalite

subaguda ou crônica é a mais freqüente manifestação da forma disseminada e

principal causa de óbito. A forma crônica se caracteriza por manifestações que

surgem e desaparecem, intercaladas por períodos totalmente assintomáticos.

Conforme Mitchell & Perfect (1995) a maioria dos pacientes (70 a 90%) apresentam

sinais e sintomas de meningite ou meningoencefalite subaguda tais como cefaléia,

febre, letargia, perda de memória, acima de 2 a 4 semanas. Os sinais e sintomas de

meningite em pacientes com e sem aids são similares. Entretanto, pacientes com

aids podem apresentar alguma diferença entre as quais: (1) a duração de sintomas e

sinais pode ser menor devido à alta carga de microrganismos e pobre resposta

inflamatória, (2) desenvolvem mais comumente um segundo sítio de infecção que é

facilmente detectado e (3) têm maior probabilidade de desenvolver outra infecção

oportunista.

Discute-se se as espécies influenciam na apresentação clínica da micose. De

acordo com Bicanic & Harrison (2005) Cryptococcus neoformans pode afetar

qualquer órgão, mas há uma predileção pelo pulmão por ser a principal porta de

entrada e também pelo SNC, fato este ainda não totalmente esclarecido. No pulmão

os sintomas variam de colonização assintomática a grave pneumonia. Infecção do

45

espaço subaracnóide é acompanhada por envolvimento do parênquima cerebral e,

portanto, meningoencefalite deve ser o termo mais apropriado. Para estes autores a

meningite criptocócica deve estar sempre incluída no diagnóstico diferencial das

meningoencefalites subaguda ou crônica, visto que as características clínicas não

são específicas. Geralmente os pacientes apresentam cefaléia, febre, mal estar e

estado mental alterado após várias semanas. Sinais freqüentemente estão

ausentes, mas podem incluir meningismo, papiloedema, acometimento de pares

cranianos, déficits focais neurológicos e nível de consciência deprimido. As

complicações são comuns, podendo citar: hipertensão intracraniana na ausência de

dilatação ventricular, que pode causar profunda perda da acuidade visual e auditiva.

Menos comumente, pacientes podem sofrer prejuízo cognitivo e ataxia no andar

devido dilatação ventricular com hidrocefalia obstrutiva. Em paciente com aids, a

micose está associada com profunda imunossupressão, geralmente associada com

contagem de células CD4 < 100 cel/µL. Há maior probabilidade de envolvimento

extra-neural e recaída se a terapia antifúngica for descontinuada precedente à

terapia anti-retroviral. Comparada com pacientes HIV-negativos, a apresentação

tende a ser mais aguda e associada com altos títulos de antígenos séricos

criptocócico e pobre resposta inflamatória. Por outro lado, C. gattii causa infecção

em indivíduos aparentemente imunocompetentes, especialmente em áreas tropicais.

Lesões focais pulmonares e de SNC, com formação de “massas” (criptococomas),

são mais comuns, e a duração dos sintomas mais prolongada e a febre é menos

comum nestes grupos.

Além dos pulmões e SNC, a pele é o terceiro sítio anatômico mais prevalente

da infecção criptocócica, caracterizando uma forma de disseminação que ocorre em

cerca 10 % dos casos. Naka et al. (1995, apud CASADEVALL & PERFECT, 1998)

sugeriram que C. neoformans sorotipo D teria mais propensão para infectar a pele,

mas C. gattii também tem sido relatado (HAMANN, et al., 1997 apud CASADEVALL

& PERFECT, 1998; SEVERO et al., 2001; LACAZ et al., 2002b; DORA et al., 2006).

Apresentam-se como lesões acneiformes, púrpura, pápulas, vesículas, nódulos,

tumores abscessos, ulcerações, granulomas, placas, celulite e também lesões que

simulam molusco contagioso (PERFECT & CASADEVALL, 2002; PEMACK et al.,

apud PERFECT & CASADEVALL, 2002; CONCUS et al., 1988 apud PERFECT &

CASADEVALL, 2002). Em geral, as lesões cutâneas são secundárias, em

decorrência da criptococose sistêmica. Entretanto, lesões cutâneas resultantes de

inoculação direta do fungo têm sido reportadas como um evento incomum

46

(CASADEVALL & PERFECT, 1998). Neuville et al. (2003), em revisão de 28 casos

de criptococose cutânea primária (CCP) no French National Register, revelam

evidências de inoculação direta do fungo em qualquer parte do corpo, com injúrias

de pele normal ou em lesões pré-existentes (75% dos pacientes), bem como a

atividades ou hobbies que predispõem a ferimentos (61% dos pacientes). Segundo

estes pesquisadores, lesões de pele associadas com CCP diferem das observadas

em criptococose disseminada. As lesões de CCP eram solitárias e confinadas a

áreas limitadas e localizadas em áreas descobertas. Em pacientes HIV - positivos a

maioria dos pacientes gravemente imunocomprometidos, as lesões cutâneas

indicam uma lesão sentinela da criptococose disseminada (CASADEVALL &

PERFECT, 1998).

Outras localizações mais raras são o globo ocular e a próstata. Na próstata a

infecção geralmente é assintomática, podendo determinar quadros de prostatite e há

indícios de que a próstata possa representar um potencial reservatório para recidiva

da doença em pacientes HIV - positivo (MITCHELL & PERFECT, 1995). A

localização ocular foi de grande importância antes da pandemia da aids, encontrada

em até 45% dos casos de meningite criptocócica. A endoftalmite criptocócica pode

levar à cegueira e a ocorrência de lesão primária é rara (LAZÉRA et al., 2005).

Outros sítios acometidos em decorrência da criptococose sistêmica são seios

paranasais, esôfago, glândulas adrenais, ossos, coração, fígado, linfonodos,

articulações, músculos, rins e placenta (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

A criptcococcemia pode apresentar-se com febre alta, tremores e calafrios,

aparentemente sem sítio secundário. A grande maioria dos pacientes com

criptococcemia tem alta carga de microrganismos no pulmão, SNC ou outros sítios

(LAZÉRA et al., 2005).

Embora C. neoformans seja considerado oportunista, há relatos de infecção

por esta espécie em indivíduos aparentemente hígidos (LUI et al., 2006). Do mesmo

modo, C. gattii considerado patógeno primário também tem sido relatado em

pacientes imunocomprometidos (ROZENBAUM et al., 1990). Entre as doenças de

base relacionadas além da aids estão: linfomas, sarcoidose, hemopatias diversas e

pacientes transplantados (LACAZ et al., 2002a).

2.5.2 Agentes Antifúngicos

As drogas antifúngicas surgiram bem mais tarde que os agentes

antibacterianos, em decorrência dos fungos apresentarem célula eucariótica, similar,

47

portanto, à célula do hospedeiro. Conseqüentemente, muitas substâncias

antifúngicas, causam ações deletérias em células do hospedeiro, podendo acarretar

uma série de efeitos colaterais (ROCHA & SIDRIM, 2004).

Considerado um agente antifúngico potente de amplo espectro de atuação,

porém bastante tóxico, a anfotericina B foi licenciada em 1959 e têm sido bastante

utilizada para infecções fúngicas sistêmicas. Subseqüentemente, outras drogas

foram introduzidas na terapia antifúngica, porém, a anfotericina B tem permanecido

como um tratamento de grande utilidade. Esta droga é um polieno natural obtido da

bactéria Streptomyces nodosus, que se liga ao principal componente da membrana

celular do fungo, o ergosterol, aumentando a permeabilidade celular a prótons e

cátions monovalentes, tais como o potássio (HERREROS & MATÍA, 2006). Os mais

freqüentes efeitos adversos estão relacionados à infusão e nefrotoxicidade. Metade

dos pacientes tratados com anfotericina B sofre reações adversas imediatas

relacionadas à infusão tais como: febre, calafrios, mialgia e/ou náusea. A

nefrotoxicidade, definida com o aumento de duas vezes mais o nível basal de

creatinina sanguínea, ocorre em mais de 30% dos pacientes (BATES et al., 2001).

Induz vasoconstrição na arteríola renal aferente, desequilíbrio e descompensação na

permeabilidade tubular, causando redução da filtração glomerular, acidose tubular e

perda de potássio e magnésio (HERREROS & MATÍA, 2006).

Na década de 90 três formulações lipídicas foram introduzidas no mercado:

anfotericina B complexo lipídico (1995), anfotericina B dispersão coloidal (1996) e

anfotericina B lipossomal (1997), as quais apresentam menor toxicidade para o

paciente, com a vantagem adicional de poderem ser administradas em tempo muito

menor que a anfotericina B convencional (ROCHA & SIDRIM, 2004).

A 5-fluocitosina (5FC) foi introduzida na década de 70, apresentando potente

atividade contra C. neoformans. No entanto, devido à constatação de cerca de 5 %

de isolados serem primariamente resistentes e ao aparecimento de resistência no

decurso do seu uso, esta droga somente pode ser utilizada em associação à

anfotericina B (BLOCK et al., 1973). Esta associação propicia uma ação sinérgica,

permitindo reduzir o tempo de tratamento e melhorando o prognóstico.

Lamentavelmente, esta droga não está mais disponível no mercado brasileiro

(LAZÉRA et al., 2005). Trata-se de uma pirimidina fluorada sintética que age por

inibição da síntese de DNA (ROCHA & SIDRIM, 2004; HERREROS & MATÍA, 2006).

Na década de 1980, surgiram os derivados azólicos, os quais formam um

grupo de compostos sintéticos com amplo espectro de atividade antifúngica e com

48

estrutura química semelhante. São classificados de acordo com o número de átomos

de Nitrogênio no anel azólico em imidazóis, com dois (ex. miconazol e cetoconazol)

e triazóis com três átomos de Nitrogênio (ex. itraconazol, fluconazol e voriconazol)

(MAERTENS, 2004). Interferem na síntese do ergosterol, bloqueando a enzima

lanosterol-14 α-demetilase, interrompendo a conversão do lanosterol em ergosterol.

Esta propriedade dos azóis altera a função da membrana celular aumentando sua

permeabilidade (ROCHA & SIDRIM, 2004; HERREROS & MATÍA, 2006). Em geral,

os triazóis demonstram amplo espectro de atividade antifúngica e reduzida

toxicidade quando comparados com os imidazóis (MAERTENS, 2004). O fluconazol

é altamente solúvel em água e pode ser administrado por via endovenosa em

pacientes gravemente doentes. Após administração oral a absorção é

essencialmente completa (~ 90% de biodisponibilidade) e não influenciado pelo pH

gástrico (BRAMER et al., apud MAERTENS, 2004). Tanto o itraconazol quanto o

flucanazol demonstraram excelente atividade antifúngica no tecido cerebral. O

fluconazol, por atravessar bem a barreira hemato-encefálica e assim atingir uma boa

concentração no sistema nervoso central, particularmente no líquor, o que o tornou

preferido em relação ao itraconazol, além do que este último não está disponível na

formulação para uso venoso (LAZÉRA et al., 2005).

A escolha do esquema terapêutico deve considerar a disponibilidade dos

agentes antifúngicos, o sítio anatômico da infecção e o estado imune do hospedeiro.

Para hospedeiros imunocompetentes com doença pulmonar isolada, observação

cuidadosa deve ser assegurada (GRAYBIL et al., 2000). Segundo Lazéra et al.

(2005) os casos de colonização, onde o fungo é isolado a partir do escarro, porém

sem lesão pulmonar e extra pulmonar devem ter acompanhamento cuidadoso. Nos

casos de pacientes imunodeprimidos é prudente que se faça o tratamento

antifúngico, devido à possibilidade de invasão e disseminação do fungo.

Conforme o Ministério da Saúde, Coordenação Nacional de DST/AIDS o

tratamento recomendado é com a anfotericina B na dose de 0,5 – 1,0 mg/kg/dia,

(IV), geralmente até a negativação das culturas ou até a dose total de 2,5g. Os

imidazóis têm sido substituídos pelos triazóis no tratamento. A associação com

fluocitosina embora apresente melhores resultados em pacientes não infectados

com HIV, aumenta a freqüência de efeitos adversos em hospedeiros com aids.

Visando reduzir os efeitos colaterais da anfotericina B, novas formulações foram

desenvolvidas. Estas formulações são conhecidas como complexos lipídicos da

anfotericina B, sendo divididas em três apresentações. Uma das apresentações não

49

lipossomal e duas liposomais, a saber: anfotericina B em dispersão coloidal (não

lipossomal, ABCD ou Amphocil®), anfotericina B lipossomal com fosfolipídios

unilamelares (lipossomal, LAB ou AmbBisome® e anfotericina B lipossomal também

com fosfolipídios (liposomal, ABLC ou Abelcet®. Todas estas formulações

apresentam um perfil de tolerabilidade muito melhor, com redução importante dos

efeitos adversos agudos e crônicos, entretanto apresentam como fator limitante o

preço elevado. Uma quarta formulação embora não recomendada ou não autorizada

pelos fabricantes é feita em ambiente hospitalar através da manipulação da

anfotericina B convencional e solução lipídica para nutrição parenteral (intralipid®

20%).

Ainda segundo o Ministério da Saúde, o fluconazol pode ser utilizado como

segunda escolha na dose de 400-800 mg/dia, durante seis a dez semanas (VO ou

IV). Para evitar recidivas é imprescindível que a terapia de manutenção seja com

anfotericina B (IV) ou fluconazol (VO) (COORDENAÇÃO NACIONAL DE DST/AIDS,

2008).

Um dos problemas que começa a emergir no debate do tratamento

antifúngico é aumento de dados mostrando a resistência a drogas, principalmente os

azóis. A resistência clínica é definida como a persistência ou progressão de uma

infecção apesar da administração de tratamento apropriado. A susceptibilidade

antifúngica dos fungos isolados é apenas um dos elementos que contribuem para a

resistência; outros fatores incluem a farmacocinética dos antifúngicos, fatores do

hospedeiro, sítios de infecção e o próprio patógeno. Em geral, fungos podem ser

intrinsecamente resistentes a antifúngicos, configurando a resistência primária,

como no caso das equinocandinas, que exibem prévia resistência a C. neoformans

ou desenvolver resistência em resposta a exposição à droga durante o tratamento,

então denominada de resistência secundária, o que é comumente observado com

a 5-fluocitosina (PEREA & PATTERSON, 2002).

Inicialmente, quando 5-fluocitosina foi usada como agente monoterápico para

tratamento de meningite criptocócica, a resistência primária ao tratamento era raro.

Entretanto, o freqüente desenvolvimento de resistência secundária durante o

tratamento indicou que se deva suprimir o uso deste como único antifúngico

(WHELAN, 1987 apud PEREA & PATTERSON, 2002).

A resistência a azóis tem sido documentada devido ao aumento da população

com aids durante o tratamento de candidíase orofaríngea com o uso de azóis tais

como o fluconazol (PERFECT & CASADEVALL, 2002). Entretanto, em relação a

50

isolados de Cryptococcus, os resultados são controversos. Estudos in vitro de C.

neoformans isolados de pacientes com recidivas de meningite criptocócica não

detectaram evidências de resistência a azóis (BRANDT et al., 1996). Por outro lado,

outras investigações têm mostrado o aumento do número de recidivas de meningite

criptocócica em pacientes com aids associados com o aumento de resistência a

drogas (SPITZER et al., 1992 apud CASADEVALL et al., 1993). Resistência

primária a fluconazol em paciente HIV-negativo foi relatada por Assing et al. (2003).

Casadevall et al. (1993) analisando isolados de C. neoformans originados de

pacientes com recidivas detectaram redução na susceptibilidade in vitro, bem como

ampla variação da concentração inibitória mínima (CIM) entre os isolados, porém

atribui a recorrência (recidiva) da meningite ao regime de deterioração do sistema

imune. Outras investigações têm demonstrado tendência oposta. A susceptibilidade

antifúngica de 368 isolados clínicos (1992 a 1994) mais 364 (1996 a 1998) dos

Estados Unidos não mostrou significante alteração nos CIM de anfotericina B e

fluconazol para C. neoformans, não obstante o uso generalizado destes antifúngicos

em pacientes com aids. Os autores atribuíram os baixos níveis de resistência a azóis

ao uso infreqüente destes agentes na população investigada (BRANDT, et al.,

2001). Na Espanha, um estudo de 70 isolados clínicos também não apresentou

alterações significativas entre 1994-1996 e 1997-2005. Os CIMs de fluconazol

permaneceram estáveis e os autores concluíram que a resistência ao fluconazol in

vitro decresceu em 11 anos (TORRES-RODRÍGUEZ et al. 2008).

Pfaller et al. (2005) realizaram estudo de susceptibilidade antifúngica in vitro

de 1811 isolados clínicos, obtidos de 100 laboratórios provenientes de 5 regiões

geográficas. Os resultados mostraram que entre 98 a 100% foram susceptíveis a

anfotericina B (CIM ≤1µ/ml), independente da região. Por outro lado susceptibilidade

a fluocitosina (CIM ≤4µ/ml) variou de 35% na América do Norte a 68% na América

Latina. Em relação ao fluconazol somente 75% dos isolados norte-americanos foram

susceptíveis (CIM ≤8µ/ml), quando comparados com 94% a 100% das outras

regiões, demonstrando assim variação da susceptibilidade destas cepas em relação

à origem geográfica.

A maioria das publicações mostra que a anfotericina B mantém excelente

atividade contra C. neoformans de origem clínica e ambiental (BRANDT et al., 2001;

TAY et al., 2005), entretanto, existe um caso bem documentado de resistência

primária (POWDERLY et al., 1992 apud CASADEVALL, et al., 1993) em paciente

com aids. E de acordo com PEREA & PATTERSON (2002), relatos de resistência

51

secundária têm sido esporádicos (WITT et al., 1996 apud PEREA & PATTERSON,

2002; ALLER , 2000).

No Brasil, alguns estudos demonstram a existência de isolados menos

susceptíveis a itraconazol e fluconazol (PAPPALARDO & MELHEM, 2003;

MONTENEGRO & PAULA, 2000). A maioria dos trabalhos sobre susceptibilidade

antifúngica não discrimina entre espécies e sorotipos de Cryptococcus, mas os

poucos trabalhos têm evidenciado menor susceptibilidade in vitro de C. gattii em

relação a C. neoformans (TRILLES et al., 2004; MORGAN et al. 2006; TORRES-

RODRÍGUEZ, 2008).

Novas drogas estão sendo avaliadas e destas merece destaque o triazol

albaconazol com potencial atividade contra C. neoformans (MILLER et al., 2004).

Um dos obstáculos ao estudo de susceptibilidade antifúngica refere-se à falta

de padronização de testes para tal. Existem ainda sérias limitações que interferem

na credibilidade destes testes, mesmo utilizando métodos recomendados. Até o

presente momento os métodos para testes de susceptibilidade antifúngica para

leveduras são comparáveis aos utilizados para bactérias. Métodos têm sido

desenvolvidos e aprovados pelo Clinical and Laboratory Standarts Isntitute (CLSI,

antigamente National Committee for Clinical Laboratory Standarts) Subcommittee on

Anifungal Susceptibility Testing tais como: teste de diluição em caldo (CLSI aprovou

a norma M27-A2) teste de difusão em disco (CLSI aprovou diretrizes M44-A), os

quais têm sido considerados reprodutíveis, precisos e acessíveis para uso em

laboratórios clínicos (ALEXANDER & PFALLER, 2006; PFALLER et al. 2004;

PFALLER et al., 2005). Outros, entretanto, observam que não há consenso sobre o

ponto de corte para definir sensibilidade e resistência frente aos diferentes

compostos antifúngicos (LAZÉRA et al., 2005; VADENBOSSCHE et al., 2002;

JOHNSON, 2008). VADENBOSSCHE et al. (2002) consideram que o desempenho

dos testes de susceptibilidade antifúngica de acordo com métodos do NCCLS em

larga escala é tecnicamente difícil. O E-test é uma alternativa muito aceitável. O

método da difusão em disco, com valores em diâmetro, proposto por Rosco, produz

muitos erros.

52

3. RELEVÂNCIA

O estado do Pará está situado na região Norte do Brasil, é cortado pela linha

do Equador, localizado entre os paralelos 2 N e 5 S e meridianos 56 e 48 W de

Greenwich, abrangendo uma área de 1.253.164,5 km2 (AMBIENTE BRASIL, [2007]).

Predomina no estado clima equatorial, quente e úmido, e detém grande parte da

floresta Amazônica. A Região Metropolitana de Belém (RMB) está constituída dos

municípios de Belém (capital), Ananindeua, Marituba, Benevides e Santa Bárbara do

Pará. A população estimada da RMB é de 1.795.536 habitantes, sendo que Belém

concentra 68,95% da população da RMB e abrange uma área de 1.827,7 Km2.

(IBGE, [2008]).

A criptococose é uma micose de ocorrência universal, tendo sido registrados

diversos casos no estado do Pará. Considerada como uma importante infecção

oportunista, nos casos de aids é a terceira em freqüência, com elevada letalidade.

No entanto, na sua forma primária, em indivíduos hígidos, imunocompetentes,

apresenta aspectos de ecologia, epidemiologia, patogenia, manifestações clínicas e

de imagem menos conhecidos e pouco relatados. Assim, no estado do Pará, bem

como em outros estados das regiões N e NE (Amazonas, Roraima, Maranhão e

Piauí) a criptococose em crianças, não relacionada à aids, têm sido relatada em

cerca de 1/5 dos casos (CAVALCANTI, 1997, CORRÊA et al., 1999; SANTOS, 2000;

MARTINS, 2003).

Recentemente foi diagnosticada, um caso grave e fatal de meningoencefalite,

em criança HIV-negativa, com hepatite crônica, procedente de e residente em

Itaituba, Pará, causada por ambos os sorotipos A e B de Cryptococcus spp., caso

inédito na literatura (MARTINS et al., 2003). Árvores tropicais colonizadas por

ambos os sorotipos A e B já foram descritas em Roraima e no Piauí, e podem

representar fontes ambientais para infecção humana (FORTES, 2001; LAZÉRA et

al., 1998). No Pará, ainda não há relato de estudos ambientais desta natureza.

Considerando que a Amazônia tem características fisiográficas próprias e eco-

epidemiologia distinta daquela descrita para a criptococose e seu agente em outras

regiões no mundo, como por exemplo, na Austrália, onde tem sido estudada em

profundidade, e onde as características climáticas são propícias ao desenvolvimento

ótimo de fungos, buscou-se esta linha de pesquisa que envolve um fungo

patogênico.

53

Em resumo, muitos aspectos sobre a fonte ambiental e a forma de infecção

deste fungo ainda não estão bem esclarecidos em nossa região. Estudos sobre a

ocorrência de Cryptococcus spp. em diferentes substratos de espécimes vegetais e

outros, descritos ou não na literatura, podem fornecer subsídios para um melhor

entendimento do mecanismo de aquisição desta micose, bem como ampliar a visão

ecológica sobre este agente de grande interesse médico numa região onde as

informações sobre o mesmo são escassas ou inexistentes.

Neste contexto, justifica-se o presente estudo, para fornecer dados inéditos

acerca de fontes ambientais da infecção por Cryptococcus spp. na RMB, bem como

a caracterização molecular dos isolados obtidos nesta região do Brasil.

54

4. OBJETIVOS

Objetivo Geral

Investigar fontes sapróbias de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii na

Região Metropolitana de Belém do Pará, Brasil.

Objetivos Específicos

1. Investigar fontes sapróbias de C. neoformans e C. gattii relacionadas a ocos de

árvores e excretas de aves na área urbana de Belém/PA.

2. Realizar estudo descritivo do ambiente domiciliar e peridomiciliar de pacientes

com criptococose diagnosticados no estado do Pará.

3. Determinar a contaminação domiciliar e peridomiciliar por Cryptococcus spp.

patogênicos.

4. Determinar as espécies, sorotipos e tipo sexuado (mating type) dos isolados de

Cryptococcus spp. patogênicos obtidos.

5. Estimar a quantidade de unidades formadoras de colônias (UFCs) de

Cryptococcus spp. patogênicos presentes nas amostras do ambiente domiciliar e

peridomiciliar.

6. Caracterizar tipos moleculares (VNI-VNIV e VGI-VGIV) dos isolados por técnica

de PCR/RFLP.

55

5. MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE ÁRVORES E

EXCRETAS DE AVES NA ÁREA URBANA DE BELÉM

Antes de iniciar o estudo dos domicílios foi realizada uma investigação em

dois bairros da cidade de Belém, onde foram coletadas onze amostras sendo sete

amostras do oco de árvores aleatoriamente selecionadas nas ruas do bairro do

Umarizal e quatro de excretas secas de aves em cativeiro de lojas de venda de aves

situadas no bairro de São Braz, local este onde é notória a presença de pombos

sobrevoando o local e em grande quantidade. O processamento foi realizado como

descrito no item 5.6.

Colônias fenoloxidase positivas foram isoladas em meio de SC e

caracterizadas quanto à termotolerância a 37ºC e sensibilidade à ciclohexamida. O

meio GCB foi utilizado para determinação das espécies. O estudo bioquímico dos

isolados foi determinado pelo método automatizado Vitek 32-BioMerieux System

(Vitek ICB, bioMeriux, Durham, USA), conduzido no Setor de Fungos de Referência

do Laboratório de Materiais de Referência do departamento de microbiologia do

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS).

A determinação dos sorotipos dos isolados foi realizada, utilizando o teste de

aglutinação em lâmina, com o kit Crypto Check Iatron RM 304-K® (Iatron Labs,

Tokyo, Japão). Para manutenção estes isolados foram transferidos para Skim Milk e

armazenados a -20ºC.

A identificação do tipo sexuado e a tipagem molecular foi realizada conforme

descrito no item 5.6.3.

5.2 ESTUDOS DE FONTES AMBIENTAIS A PARTIR DE DOMICÍLIOS DE

PACIENTES COM CRIPTOCOCOSE.

5.2.1 Seleção dos domicílios

O estudo foi conduzido de acordo com a indicação do endereço de pacientes

diagnosticados com criptococose, no período de 2004 a 2005, registrados no

Hospital Universitário João de Barros Barreto, que é um centro de referência para

Doenças Infecciosas e Parasitárias (DIP) para o estado do Pará, onde os casos

suspeitos de meningite são submetidos a investigação clínica e laboratorial, como

análise bioquímica do líquor e exame direto do sedimento na busca de presença de

56

fungos. Como a demanda do hospital é constituída de pacientes dos diversos

municípios paraenses, além de alguns estados vizinhos, a coleta de material ficou

circunscrita à Região Metropolitana de Belém (RMB).

Um paciente com suspeita de criptococose é normalmente referenciado para

o HUJBB, que é referência em Doenças Infecto-parasitárias. A confirmação dos

casos suspeitos é realizada por equipe médica do Hospital em conjunto com o

Serviço de Apoio ao Diagnóstico, através dos seguintes exames: 1) Exame

microscópico direto de líquor em preparações com tinta Nanquim; 2) Prova de

aglutinação com Látex no líquor; 3) cultivo em meios de Sabouraud com

cloranfenicol. Após consulta aos prontuários, foram selecionados endereços de

pacientes diagnosticados com criptococose, residentes e domiciliados na RMB.

5.2.1.1 Critérios de Inclusão

Foram considerados como alvo do estudo domicílios de pacientes e de

vizinhos circunscritos à RMB (PA).

5.2.1.2 Critérios de exclusão

Não foram consideradas residências de trânsito do paciente quando em

busca do serviço médico.

5.3 ÁREA DE ESTUDO

A RMB inclui os municípios de Belém, Ananindeua, Marituba, Benevides e

Santa Bárbara do Pará (Figura 1). O sítio físico da RMB é caracterizado por porções

continentais e insulares, com um relevo pouco acidentado, é uniforme e com poucas

variações. O Rio Guamá, ramificação do rio Pará e baía do Guajará na altura do

município de Belém conformam a principal formação fluvial, completada por uma

série de pequenos furos, igarapés e paranás, que no interior das áreas urbanas são

transformados em canais de drenagem. O alto índice pluviométrico também contribui

para a alta umidade, notadamente no período de dezembro a março. A temperatura

média é 26ºC. (OBSERVATÓRIO DAS METRÓPOLES, [c2006-2008]).

Embora efetivamente a RMB apresente apenas os municípios de Belém e

Ananindeua conurbados, o processo de periferização nos demais – Marituba,

Benevides e Santa Bárbara do Pará é acompanhado de um processo de

transformação de terra rural em terra urbana, por meio de invasões e loteamentos,

na maioria das vezes clandestinos.

57

A região apresenta uma área de 1.827,7Km2 e concentra 1.795.536 de

habitantes, representando 29% da população do estado, sendo que Belém detém

68,95% da população da RMB. Em 2000, a RMB apresentava 416.176 domicílios

particulares permanentes, situados majoritariamente em Belém (71,17%) e entre os

municípios com níveis de integração na dinâmica metropolitana, Ananindeua, com

integração muito alta com a capital, possui 22,23%, Martituba e Benevides com

baixo índice de integração 4,09 e 1,93%, respectivamente e Santa Bárbara, 0,57%.

(OBSERVATÓRIO DAS METRÓPOLES, [c2006-2008]).

Figura 5.1 - Mapa de localização da Região Metropolitana de Belém. O ecossistema amazônico dota a RMB de áreas de floresta tropical úmida,

embora alterada em função do desmatamento acelerado nos cinco municípios.

Belém possui 39 ilhas, os demais municípios também possuem ilhas, onde ainda

existe uma fauna importante para a preservação. Algumas manchas de vegetação

58

intacta ainda estão presentes em Santa Bárbara do Pará e em algumas ilhas do

município de Belém (OBSERVATÓRIO DAS METRÓPOLES, [c2006-2008]). O

relevo da RMB é bastante uniforme, de plano a suave ondulado. Morfologicamente

pertence a formas erosivas constituídas pelas superfícies pediplanadas e plena

planície fluvial, caracterizado por um emaranhado de canais, furos, igarapés,

paranás e lagos com partes sujeitas a inundações periódicas, quer pelas águas da

chuva quer pelas águas da maré diária ou de equinócio. No município de Belém a

topografia é pouco variável e baixa, atingindo 25 m na ilha de Mosqueiro, ponto de

altitude máxima, com as cotas mais baixas chegando a 4 m. Em Ananindeua

observam-se pouquíssimas oscilações altimétricas, ficando a cota média em torno

de 16 m. Benevides apresenta variações inexpressivas com altitude em torno de

45m e em áreas mais elevadas atinge 57m. (PARÁ, 1997)

Belém, a capital paraense (01°27’20”S e 48°30’15”W), ocupa uma área de

505,8231 Km2. A vegetação dos mangues e sirubais acompanha as porções fluviais

e semi-litorâneas do setor estuarino, enquanto a floresta ombrófila domina as

margens dos cursos d’água e as baixadas, onde prevalecem formações herbáceas,

subarbustivas e arbustivas. A cobertura vegetal com vegetação composta de floresta

secundária ou capoeiras que substituíram a antiga floresta densa, cujos

remanescentes podem ser ainda encontrados em Mosqueiro, Caratateua e áreas

adjacentes. O clima é quente e úmido com precipitação anual média de 2.834 mm e

temperatura média de 25°C em fevereiro e 26°C em novembro, localizando-se em

zona climática Afi (classificação de Köppen), coincidente com clima de floresta

tropical permanentemente úmido, com ausência de estação fria, cuja temperatura do

mês menos quente está acima de 18ºC (PREFEITURA MUNICIPAL DE BELÉM,

2006).

No município de Ananindeua o clima é megatérmico úmido com temperaturas

elevadas em torno de 25ºC com pequena amplitude térmica. O regime pluviométrico

oscila entre 2.250 a 2500 mm com chuvas regulares e a umidade relativa do ar está

em torno de 85% (PREFEITURA MUNICIPAL DE ANANINDEUA, 2007). Em

Benevides o clima também é megatérmico com temperaturas elevadas durante o

ano com média de 25ºC e pequena amplitude térmica. O regime pluviométrico chega

a ultrapassar os 2.500 mm, com período mais chuvoso de janeiro a julho (PARÁ,

1997).

59

5.4 VISITA AO DOMICÍLIO E COLETA DAS AMOSTRAS

No período de março 2004 a abril de 2005 foram realizadas visitas ao

domicílio de 8 pacientes com diagnóstico comprovado de criptococose. As visitas

foram realizadas após contacto prévio com o paciente e/ou seu responsável. Na

residência foi explicado o objetivo da visita e solicitado leitura e assinatura de termo

de consentimento (Anexo 1).

Para controle, de cada domicílio de paciente foram incluídos no estudo três

domicílios próximos, sem ocorrência de caso de criptococose, selecionados de

acordo com a proximidade do domicílio-índice e a acessibilidade.

5.4.1 Entrevista

Uma vez selecionados, os pacientes foram contatados e informados sobre a

pesquisa ambiental. Após esclarecimentos quanto ao objetivo do estudo ao nível

educacional da população, aqueles que aceitaram participar, ou seus representantes

legais, assinaram termo de consentimento. Com relação aos domicílios-controle, foi

utilizado o mesmo método de abordagem.

Também foi utilizado um questionário em aberto, visando obter informações

sobre os hábitos do paciente.

5.4.2 Ficha Ambiental

Características do domicílio e peridomicílio foram registradas em formulário

específico (Anexo 2), incluindo os seguintes parâmetros: tipo de construção,

presença e tipo de animais domésticos, de criação e silvestres, presença e tipo de

vegetação no domicílio e peri-domicílio. Após, foram realizadas coletas de material

nos ambientes pré-definidos, a saber: a) Intradomicílio: poeira do assoalho e outras

amostras de matéria orgânica observada nas visitas. b) Peridomicílio (ambiente no

entorno da casa, jardim ou equivalente): coleta também dirigida pela inspeção,

direcionada a ocos de árvores, criadouros de pássaros, habitats de morcegos e

locais de acúmulo de matéria orgânica diversa. c) Coletas em domicílios controle

(casa ao lado) usando idêntica metodologia.

Seguindo estes parâmetros foram realizadas coletas em quantidade variável,

de acordo com as características encontradas e possibilidade de acesso.

5.4.3 Coleta das Amostras

A coleta de poeira do ambiente intradomiciliar foi realizada utilizando-se a

vassoura da própria casa. Amostras do ambiente peridomiciliar incluíram materiais

60

diversos entre os quais: madeira em decomposição, ocos de árvores vivas ou

mortas, insetos e artrópodes que foram coletados diretamente em frascos estéreis.

Todas as amostras foram acondicionadas em frascos coletores estéreis, os quais

foram identificados, com o tipo de material, local procedência e data e armazenadas

sob refrigeração no Laboratório de Micologia da UFPA até o processamento,

realizado no Laboratório de Micologia do IPEC/FIOCRUZ.

5.5 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

O processamento das amostras foi realizado seguindo metodologia descrita

por Lazéra et al. (1996), com algumas variações, no Laboratório de Micologia

Ambiental, do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC/FIOCRUZ), Rio

de Janeiro/RJ.

5.5.1 Isolamento das colônias

O material coletado foi homogeneizado em gral e pistilo de porcelana estéreis

e diluído (1:50 P/V) em solução salina fisiológica a 0,9%, acrescida de 0,2 mg/l de

cloranfenicol. O material foi submetido à agitação vigorosa durante 5 minutos, e em

seguida, colocado em repouso durante 30 minutos.

Com auxílio de uma seringa de insulina descartável, alíquota de 0,1 ml do

sobrenadante foi semeada em cada placa de Petri contendo meio de cultura com

sementes de níger (niger seed agar-NSA), num total de 10 (dez) placas por amostra

ambiental. As placas semeadas foram incubadas à temperatura ambiente (± 25ºC) e

observadas diariamente por um período de cinco a sete dias. Colônias de coloração

marron escura observadas em meio NSA, fenol-oxidade positivas, foram isoladas em

meio de agar-Sabouraud com cloranfenicol (SC). Os isolados foram preservados em

skim milk a -20ºC ou em glicerol a -70ºC e depositadas na coleção de Culturas do

Laboratório de Micologia do IPEC/FIOCRUZ.

A densidade de colônias fenoloxidase positivas foi estimada através da

quantificação do número de unidades formadoras de colônias (UFC) em 1:50 (P/V)

da suspensão inoculada em meio NSA e expressa em UFC/g.

Para o processamento de amostras de tatuzinhos foi realizada desinfecção

superficial com álcool a 70% durante 5 minutos. A seguir os mesmos foram

macerados em 2 ml de solução fisiológica com cloranfenicol e 0,1 ml foi transferido

para as placas de Petri estéreis até esgotamento da suspensão.

5.5.2 Identificação fenotípica

61

5.5.2.1 Síntese de melanina (atividade fenoloxidase)

Para revelar a capacidade de produção de melanina foi utilizado o cultivo em

meio NSA. O microrganismo foi semeado por estrias na superfície do meio em uma

placa de Petri, incubada à temperatura ambiente (± 25ºC) durante 5 dias, para a

observação do pigmento.

5.5.2.2 Termotolerância

Para teste de termotolerância todos os isolados foram repicados em meio SC

e incubados a 25ºC e 37ºC, por um período de 48-72 horas, e realizadas

observações diárias. Ambas as espécies, C. neoformans e C. gattii crescem a 37ºC.

5.5.2.3 Sensibilidade à cicloheximida

Para realização do teste de sensibilidade à cicloheximida os isolados foram

inoculados em Agar Sabouraud suplementado com cloranfenicol e cicloheximida

(Mycosel) e incubados à temperatura ambiente (± 25ºC) por 48 horas. A maioria dos

isolados de C. neoformans e C. gattii são sensíveis à ≤ 12 µg/ml de cicloheximida

(KWON-CHUNG, 1998).

5.5.2.4 Sorotipagem

A determinação dos sorotipos foi realizada, utilizando o teste de aglutinação

em lâmina, com o kit Crypto Check Iatron RM 304-K® (Iatron Labs, Tokyo, Japão)

que identifica 5 sorotipos: A, D e AD para C. neoformans e B e C para C. gattii. Este

kit é constituído de anticorpos policlonais, monoespecíficos o que garante a

especificidade e sensibilidade da reação. O kit utiliza 5 fatores antigênicos,

discriminados como fatores 1, 5, 6, 7 e 8. O fator 1 confirma o gênero Cryptococcus,

o fator 5 indica o sorotipo B, o fator 6 o sorotipo C, o fator 7 o sorotipo A o fator 8 o

sorotipo D e os fatores 7 e 8 associados identificam o sorotipo AD.

Para o teste foi utilizado colônias com 48 horas de crescimento em meio SC

incubadas à temperatura ambiente (± 25ºC). Em lâmina própria para aglutinação que

acompanha o kit, foi colocado uma gota de cada fator sérico nos cículos

correspondentes (F1, 5, 6, 7 e 8) e a seguir com auxílio de uma alça microbiológica

foi transferida uma pequena quantidade de massa fúngica sobre cada fator sérico.

As lâminas foram homogeneizadas manualmente e feito a leitura após observação

direta de pequenos grumos formados frente a cada fator e os sorotipos identificados

conforme explicitado no parágrafo acima.

62

5.5.2.5 Assimilação de compostos de Carbono e Nitrogênio

O estudo bioquímico dos isolados foi determinado pelo método automatizado

Vitek 32-BioMerieux System (Vitek ICB, bioMeriux, Durham, USA), conduzido no

Setor de Fungos de Referência do Laboratório de Materiais de Referência do

departamento de microbiologia do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em

Saúde (INCQS).

Uma suspensão de leveduras (crescimento de 48 h), padronizado no tubo 2

da escala de McFarland foi transferida para cartelas VITEK, utilizando-se o aparelho

VITEK. Após sucção retirou-se as cartelas e incubou-se a 30°C, durante 48h ou até

72 horas, quando necessário.

Após período de incubação, foi realizada a leitura no aparelho VITEK,

acoplado a um computador, o qual possui programa específico para leitura,

permitindo a emissão dos resultados com a identificação específica em valores

percentuais.

Os reagentes utilizados foram: glicose, galactose, lactose, sacarose, maltose,

celobiose, α-metil-D-glicosídeo, xilose, arabinose, trealose, melizitose, rafinose, N-

acetil-D-glicosamina, xilitol, dulcitol, adonitol, ciclo-heximida, sorbitol, melibiose,

inositol, nitrato de potássio, 2-keto-D-gluco, uréia, eritol.

5.5.2.6 Meio CGB

Cryptococcus neoformans pode ser diferenciado de C. gattii utilizando-se o

meio de canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) proposto por Kwon-Chung et

al., (1982b). Os isolados foram semeados em meio de CGB e incubados à

temperatura ambiente (± 25ºC), durante 5 dias, realizando-se observações com

48h, 72h e 5 dias. Cryptococcus gattii hidrolisa a glicina, assimilando-a como fonte

de carbono e nitrogênio e é resistente a L-canavanina. O meio CGB tem pH 5,8 e

apresenta uma coloração amarelo-esverdeada. Com o crescimento do fungo o pH

do meio aumenta, o que é revelado pelo azul de bromotimol que altera a coloração

do meio de amarelo esverdeado para azul cobalto. Alguns isolados de C.

neoformans são capazes de assimilar a glicina, mas são sensíveis à L-canavanina,

não havendo, portanto crescimento e nem alteração da coloração do meio.

5.5.3 Identificação Molecular

5.5.3.1 Extração de DNA

63

O DNA genômico foi extraído por dois métodos mecânicos: 1) protocolo

modificado de Ferrer et al. (2001), e 2) método CETAB, utilizando pérolas de vidro,

conforme O´Donnel et al. (1997).

Seguindo o protocolo modificado de Ferrer et al., 2001, colônias dos isolados

foram cultivados em meio de SC durante 48 horas à temperatura ambiente. A

massa fúngica foi removida com o auxílio de alça microbiológica e transferida para

um tubo tipo Eppendorf e armazenado a -20ºC, durante a noite. Após

armazenamento foi adicionado 500 µl de solução de lise (Tris-HCl 1M, EDTA, NaCl,

SDS) e 5 µl de 2-mercaptoetanol. A suspensão foi homogeneizada por agitação

vigorosa em agitador tipo vortex e incubada a 65ºC durante 1 h, com duas agitações

durante este período, de 30 em 30 min. A seguir adicionou-se 500 µl de

fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (v:v:v 25:24:1) e misturado em agitador durante

2min para obter uma suspensão homogênea. Após homogeneização centrifugou-se

a 14000 rpm por 15 min. A fase aquosa foi removida e misturada com igual volume

de isopropanol para precipitação dos ácidos nucléicos. O DNA foi precipitado a –

20ºC durante uma noite. Após centrifugação a 14000 rpm por 15 min a 4ºC o

sobrenadante foi eliminado e o sedimento lavado com etanol 70%. Após uma leve

mistura manual e centrifugação a 14000 rpm por 15 min, removeu-se o etanol e o

sedimento foi seco à temperatura ambiente (± 25) . O sedimento seco foi

ressuspenso em 100 µl de água bi-destilada estéril e conservado em geladeira. A

integridade do DNA extraído foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1%

corado com brometo de etídio. O DNA foi quantificado em espectrofotômetro, depois

diluído a uma concentração de 10 ng/µl e armazenado em alíquotas a -20ºC, os

quais foram utilizados para análises. O processo de extração foi realizado em capela

de fluxo laminar vertical (Veco), após irradiação prévia com U.V., utilizando-se

materiais de consumo novos e estéreis.

Seguindo o método CETAB (O’DONNEL et al, 1997) foi realizada conforme

descrição a seguir. Após ruptura das leveduras com pérolas de vidro, uma colônia de

C. neoformans foi inoculada em meio de SC por esgotamento e incubada à

temperatura ambiente por 48 horas. A massa fúngica foi transferida para um tubo

tipo eppendorf de 1,5 ml, armazenado a -70ºC, para posterior liofilização.

Aproximadamente 150 µl do liófilo foram transferidos para um tubo de 1,5 ml onde

se adicionou 50 µl de pérolas de vidro de 0,1 mm. Após pulverização manual com

pistilo, adicionou-se 800 µl de tampão CTAB (Solução CETAB:

hexadecyltrimethylammonium bromide, NaCl, pH 8,0 + Solução TE: TrisHCl 1M,

64

EDTA 0,5M) e pulverizou-se novamente e agitou-se em vortex por 20 segundos,

incubando-se durante 15 minutos a 65ºC. Este passo foi repetido mais duas vezes

seguida de outra agitação. A suspensão foi centrifugada a 14000 rpm, por 30

minutos a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para um tubo de 1,5 µl, onde se

adicionou tampão CTAB até um total de cerca de 700 µl. A seguir, acrescentou-se

700 µl de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1 v/v). A suspensão foi misturada por

cerca de 20 segundos e centrifugada a 14000 rpm por 20 min a 4ºC cuja fase

aquosa foi transferida para outro eppendorf acrescentado de 500 µl de clorofórmio-

álcool isoamílico. A suspensão foi misturada por cerca de 20 segundos e

centrifugada a 14000 rpm, por 10 minutos a 4ºC, e a fase aquosa foi transferida para

tubo de 1,5 ml com adição de 150 µl de tampão CTAB. E mais 300 µl (0,6 v) de

isopropanol a -20ºC. Esta suspensão foi misturada manualmente por inversão e

centrifugada a 14000 rpm, por 10 minutos a 4ºC, para obtenção do precipitado de

DNA. A seguir o sobrenadante foi removido com pipetas de 1 ml e 100 µl de etanol a

70% a -20ºC, misturando-se brevemente e centrifugado a 14000 rpm por 5 minutos a

4ºC. O sobrenadante foi removido com pipeta de 100 µl e seco ao ar por cerca de 10

minutos. Ao sedimento seco foi adicionado 100 µl de tampão TE (Tris.HCl 1M, EDTA

0,5M) estéril pH 7,6 mais 4 µl de RNAse na concentração de 10mg/ml, incubando-se

em seguida a 37ºC por até 20 minutos e estocado e conservado em geladeira. A

integridade do DNA extraído foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1%

corado com brometo de etídio. O DNA foi quantificado em espectrofotômetro, depois

diluído a uma concentração de 10 ng/µl e armazenado em alíquotas a -20ºC, os

quais foram utilizados para análises. O processo de extração foi realizado em cabine

de segurança biológica, classe II (Veco), após irradiação prévia com U.V., utilizando-

se materiais de consumo novos e estéreis.

5.5.3.2 Determinação do mating type

Seqüências específicas, codificadoras do gene do feromônio de cada tipo

sexuado (MAT α, e MAT a) foram detectadas através de técnica de PCR, de acordo

com Chaturvedi et al., (2000). Para determinação do mating type, foram utilizados

os pares de primers α1 (MAT αααα: 5’-CTTCACTGCCATCTTCACCA-3) e α2 (5’-

GACACAAAGGGTCATGCCA-3’), específicos para o mating type α e a1 (5’-

CGCCTTCACTGCTACCTTCT-3’) e a2 (5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’),

específicos para mating type a que originam produtos de amplificação de 101 pb e

117 pb, respectivamente. As reações de amplificação foram realizadas a um volume

65

final de 25 µl contendo 5 µl do DNA (10ng/µl) extraído, suspenso numa mistura de

9,5 µl de água MilliQ, 6,25 µl de DNTP (diluição a 8 mM em tampão Taq 10X e

água), 1,5 de MgCl2 (2,5mM de cloreto de Magnésio), 1,25 µl de cada primer (10

pmol/µl) e 0,25ml da enzima Taq Polimerase (Invitrogen). A reação de polimerase

em cadeia (PCR) foi realizada por um aquecimento inicial das amostras seguindo a

seguinte programação: 1 ciclo de 95ºC por 3 minutos; 30 ciclos de 94ºC por 1

minuto, 57,5ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto; seguido de 1 ciclo a 72ºC por 7

minutos em um termociclador (Eppendorf e/ou MiniCycler, MJ Research). Os

produtos da amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2%

corado com brometo de etídio. Foram utilizados controles negativos (sem DNA) e

cepas padrão (ATCC 28957 e ATCC 28958) como controle positivo.

5.5.3.3 Tipagem Molecular

Os isolados foram caracterizados através da análise do gene URA-5,

utilizando-se a técnica de Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP).

A PCR do gene URA-5 foi realizada conforme descrito por Meyer et al. 2003 a

um volume final de 25 µl. Cada reação contendo 50 ng de DNA genômico , tampão

PCR 1X ( 200mM Tris p\h 8,4, 500 mM KCl), 0.2 mM de dATP, dCTP, dGTP e dNTP

(Biotools, Espanha) ), 2 mM MgCl,, 2,5 U Taq DNA polymerase (Invitrogen, São

Paulo, Brasil), e 25 ng de cada primer URA5

(5'ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG3') e SJ01

(5’'TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC 3'). As reações foram realizadas em 35

ciclos na seguinte programação: 35 ciclos de 94ºC por 5’ de desnaturação inicial, de

94ºC por 45” de desnaturação, de 63ºC por 1’ de anelamento, de 72ºC por 2’ de

extensão e um ciclo final de 72ºC por 10’ de extensão final; em termociclador

(Eppendorf e/ou MiniCycler, MJ Research). Os produtos de PCR foram separados

por eletroforese em gel de agarose a 3% corado com brometo de etídio. Foram

utilizados controles negativos (sem DNA) e padrões (LMN 794 – VNI, LMM 795-

VNII, LMM 796 – VNIII, LMM 797 – VNIV, LMM 798 – VGI, LMM 799 - VGII, LMM

800 - VGIII, LMM 801 - VGIV) como controle positivo. Amplificação dos produtos de

PCR foi verificado por eletroforese em gel de agarose a 1% e em dupla digestão

com enzimas, Sau96I (10 U/µl) and HhaI (20 U/µ l) durante 3h no mínimo e

separados por eletroforese em gel de agarose a 3%, a 100 V. O resultado de RFLP

foi fotografado e comparado com os padrões (VNI - VNIV e VGI - VGIV).

66

6. RESULTADOS

6.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE ÁRVORES E

EXCRETAS DE AVES EM DOIS BAIRROS DE BELÉM/PA.

A partir de onze amostras ambientais processadas, duas foram positivas para

Cryptococcus spp (Tabela 6.1). De uma amostra constituída de excretas de

periquitos foram isoladas cinco colônias de C. neoformans e de uma amostra de oco

de árvore viva (Senna siamea) foram isoladas duas colônias, sendo uma C.

neoformans e outra C. gattii, perfazendo um total de sete isolados. Quanto a tipo

sexuado os sete isolados foram caracterizados como MATα e em relação à tipagem

molecular todos os isolados C. neoformans apresentaram genótipo VNI enquanto C.

gattii foi caracterizado como VGII.

Tabela 6.1 - Número e caracterização de isolados oriundos de fontes ambientais da

cidade de Belém/PA.

ISOLADO SUBSTRATO ESPÉCIE SOROTIPO

TIPO SEXUADO

GENÒTIPO

LMM 1082 Poeira com excretas de pássaros.

C. neoformans A α VNI









LMM 1089 Oco profundo de Senna siamea


LMM 1090 Oco profundo de Senna siamea

C. gattii B α VGII

A Tabela 6.2 apresenta dados meteorológicos observados no período das

coletas, demonstrando elevada temperatura e umidade.

67

Tabela 6.2 - Dados meteorológicos de Belém/PA, referentes ao período de coleta.

Ano Mês

Temp.

máxima

Temp.

mínima

Temp.

média

Umidade

Relativa

Umidade

relativa

Brilho

solar

2002 Mai 32,4 23,8 26,7 85 197,4 206

Média/ano 32,3 23,4 26,6 84 2798,5 2410,5

2003 Mar 30,7 23,7 26,1 89 494,9 104,2

Média/ano 32,2 23,6 26,6 84,2 2749 2424,9

Fonte: EMBRAPA/Amazônia Oriental

Na figura 6.1 está demonstrado o perfil eletroforético dos isolados ambientais

Mat α obtidos de amostras ambientais de uma área urbana de Belém/PA.

Figura 6.1- Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo sexuado com

primers MATα1- MATα2 e MAT a1- MAT a2 dos isolados ambientais de C. neoformans e C.

gattii de uma área da cidade de Belém/Pará, por PCR. Linhas – 1 e 11: Peso molecular

100pb; 2: LMM 1082; 3: LMM 1083; 4: LMM 1084; 5: LMM1088; 6: LMM 1089; 7: LMM

1090; 8: ATCC 28957 padrão MATα ; 9: ATCC 28958 padrão MATa; 10: Controle negativo.

O perfil eletroforético obtido por PCR/RFL dos isolados de C. neoformans e C.

gattii das amostras coletadas aleatoriamente em dois bairros de Belém está

representado na Figura 6.2.

68

Figura 6.2 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo molecular (VNI

e VGII) dos isolados ambientais de uma área da cidade de Belém. Linhas – 1: LMM 1082; 2:

LMM 1083, 3: LMM 1084, 4: LMM 1087, 5: LMM 1088, 6: LMM 1089, 7: LMM 1090.

Isolados padrões, de 8 a 11 (VNI-VNIV) de 12 a 15 (VGI-VGIV); 16: controle negativo; M:

peso molecular 100pb. Isolados 1 a 6 correspondem a C. neoformans VNI e o isolado 7

corresponde a C. gattii VGII.

6.2 ESTUDO DE FONTES SPRÓBIAS RELACIONADAS AOS CASOS-INDICE

SELECIONADOS.

Trata-se de um estudo seccional, descritivo, aprovado pelo Comitê de Ética

do Hospital João de Barros Barreto (HUJBB) pertencente à Universidade Federal do

Pará (UFPA) (Anexo 3).

A partir de consulta realizada no Departamento de Arquivo Médico e

Estatística (DAME) do HUJBB, foi fornecida uma lista de pacientes diagnosticados

com criptococose, da qual selecionamos oito casos, denominados de casos-índices.

Após contato com paciente ou responsável foi realizada coleta em domicílio e

peridomicílio. Na tabela 6.3 estão registrados os casos com domicílio-índice,

informando idade, gênero, sorologia HIV, procedência, agentes e evolução clínica.

69

Tab

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6.3

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70

6.3 ANÁLISE DAS AMOSTRAS COLETADAS

Conforme a tabela 6.4, cento e três amostras foram coletadas em domicílio e

entorno do paciente, e oitenta e três em domicílios controle, cuja maior positividade

foi detectada em amostras provenientes do caso-índice 3, com 42,11%. A média de

amostras por domicílio-índice foi de 12,88, enquanto do domicílio-controle foi 4,

considerando um total de 21 domicílios controle. Vale ressaltar que em relação aos

domicílios 1, 2, 3 e 5, foram realizadas duas visitas. No domicílio 8, a casa do

pacinete estava fechada e não se teve acesso ao interior do mesmo, embora se

tenha coletado duas amostras no seu entorno. No total foram processadas cento e

oitenta e seis (186) amostras. O número de amostras por residência variou conforme

o tamanho da edificação e a quantidade de material suspeito disponível, com uma

média de 6,41 amostras por domicílio.

Os agentes da criptococose foram encontrados em três dos oito domicílios de

pacientes. Em relação aos domicílios-controle no caso-índice 7 não se obteve

amostras; e positividade para colônias fenoloxidase foi detectada em quatro

domicílios-controles relativos ao caso índice 3 e em um de paciente cujo domicílio

não foi investigado, mas duas amostras do entorno foram negativas.

Considerando os domicílios positivos, a característica marcante foi o

predomínio de casas de poucos cômodos, às vezes com dois pavimentos e

edificadas em madeira. Os casos em sua maioria, mesmo os que não foram

selecionados situam-se em áreas de invasão em precárias condições de

saneamento.

71

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72

O quadro 6.1 destaca os domicílios positivos dos quais se isolou o fungo,

discriminando as suas características gerais, e descreve o tipo de amostras

positivas, onde se observa que poeira intradomiciliar, madeira em decomposição e

artrópodes foram os materiais com positividade. As características comuns são a

predominância das casas em madeira, muitas com aparente deterioração das

paredes.

73

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74

6.4 DESCRIÇÃO DOS CASOS-ÍNDICE DE CRIPTOCOCOSE, SEUS DOMICÍLIOS

E RESULTADOS DA INVESTIGAÇÃO DOMICILIAR POR C. neoformans E OU C.

gattii.

6.4.1 – Caso índice 1

Caso 1. Paciente do sexo feminino, 13 anos, residente em Mosqueiro, acometida de

meningite criptococócica, em 2003 cuja pesquisa para fungos foi realizada através

de exame do LCR com diagnóstico positivo para Cryptococcus. Após tratamento

recebeu alta. Casa de alvenaria “crua” constituída de dois cômodos, piso

acimentado, telhado de barro sem forro. No entorno muitas árvores frutíferas e/ou de

porte alto, domicílios vizinhos espaçados, sem cercado, maioria de madeira,

próximos a área de mata e um campo em frente. Presença de basidiomas em

abundância no entorno. A paciente se recuperou sem seqüela aparente. Foram

processadas 41 amostras, a maioria constituída de raspados de madeira

constituintes de uma casa destruída pertencente à família e de raspados de ocos de

vegetais diversos. Domicílio e peridomicílio negativos para Cryptococcus. Domicílios

controle igualmente negativos para Cryptococcus.

6.4.2 – Caso-índice 2

Caso 2. Paciente do sexo masculino, 11 anos, acometido por meningite por C. gattii,

em fevereiro de 2004. Após tratamento recuperou-se com alta em março/2004.

Residente no bairro do Icuí-Guajará, no município de Ananindeua. Área de invasão.

O paciente é proveniente de Santa Isabel do Pará. Mora no local estudado

aproximadamente há dois anos. O diagnóstico apontou meningite fúngica por C.

gattii, tendo se recuperado aparentemente sem seqüelas. A casa atual, com três

cômodos para 5 pessoas, constituída na parte da frente em tijolo e o restante em

madeira. Piso cimentado, telhado de barro, sem forro, boa ventilação e iluminação,

úmida situada em rua sem asfaltamento ao lado de uma padaria. No momento da

coleta, foi observado muita madeira empilhada no fundo do quintal e junto à padaria

mais madeira para uso na fabricação do pão. No quintal tanto do domicílio do

paciente quanto dos vizinhos, havia árvores frutíferas e/ou ornamentais, algumas

destas foram derrubadas. Presença de insetos e animais domésticos, gato e

cachorro; relatado a presença de morcegos à noite. A coleta em sua maioria

consistiu de materiais oriundos de troncos vegetais em decomposição raspados ou

pedaços de madeira, onde normalmente se encontravam formigas, aranhas,

75

tatuzinhos de jardim, entre outros artrópodes. Das 32 amostras coletadas, 2

amostras constituídas de tatuzinhos (Tabela 6.5 e Figura 6.3), positivas para C.

neoformans e mais uma amostra do raspado de uma das tábuas onde andavam

vários tatuzinhos e aranhas, igualmente positiva para C. neoformans. Estas

amostras surpreenderam pela enorme quantidade de colônias formadas (Figura 6.4)

bem como pelo fato de que nas primeiras 48 horas não se observava outros agentes

contaminantes nas placas, parecendo culturas puras.

Figura 6.3 - Tatuzinhos de jardins (Arthropoda), coletados em peridomicílio

relativo ao caso-índice 2.

Figura 6.4 - A e B: Aspecto de colônias de C. neofromans isoladas em placas de

Petri após processamento dos tatuzinhos.

Devido o processamento ter sido modificado para estas amostras, não foi

possível o cálculo de UFCs/g. Entretanto o processamento de 2 animais (tatuzinhos

A B

76

A) em 2 ml de solução fisiológica resultou na contagem de 3.099 UFCs com média

de 238,38 UFCs por placa. O processamento de 3 animais (tatuzinhos B) em 2 ml de

solução fisiológica resultou na contagem de 3.215 UFCs com média de 247,31 por

placa. Na Tabela 6.5 evidencia-se o substrato e densidade de colônias estimadas

neste caso índice. Os tatuzinhos foram identificados como Cubaris murina Brandt,

1833, pertencente ao Filo Arthropoda, classe Crustacea, Ordem Isopoda, família

Armadillidae.

Tabela 6.5 - Distribuição de Cryptococcus neoformans de acordo com o tipo de

substrato, e UFC/g relativos ao caso-índice 2.

TIPO DE AMOSTRAS Nº DE ANIMAIS Nº DE COLÔNIAS

ISOLADAS

DENSIDADE

UFC/G

Tatuzinho A 2 6 238,38*

Tatuzinho B 3 31 247,31*

Raspado de madeira - 9 2,74 x 104

*Média UFC/placa

6.4.3 Caso índice 3

Caso 3: Paciente do sexo feminino, 33 anos, militar, com criptococose por C. gattii,

proveniente do bairro do Jurunas em Belém, morando no local há 25 anos. A

paciente era portadora de lúpus eritematoso sistêmico (LES), diagnosticado em

2003, em tratamento com altas doses de corticosteróides. Esteve internada em

vários períodos a partir de novembro de 1985. A identificação do fungo C. gattii foi

obtida em janeiro/2004. Relatou que participava de missões em áreas de mata

invadida, no sul do Estado do Pará. O local de seu domicílio impressionava pelo

aglomerado de casas de poucos cômodos, predominantemente de madeira,

contíguas e muito próximas (Figuras 6.5 a 6.8) em ambiente extremamente úmido.

Na realidade a sua residência está inserida em uma comunidade que pode ser

caracterizada como uma favela na proximidade de portos e muitas madeireiras.

Tratada com antifúngicos no HUJBB a paciente recuperou-se com seqüelas graves,

para continuar o tratamento do LES em regime ambulatorial. Algum tempo após as

nossas visitas ao domicílio veio a falecer.

77

Figura 6. 5 - Aspecto externo do peridomicílio relativo ao caso-índice 3.

Figura 6.6 - Aspecto externo de casa da mãe e vizinha à casa da paciente (caso-

índice 3) com positividade para C. neoformans e C. gattii.

78

Figura 6.7 - Detalhe da porta de entrada do domicílio da paciente (caso-índice 3),

presença de basidioma.

Figura 6.8 - Entrada da vila onde foram obtidos isolados ambientais de C.

neoformans e C. gattii relativos ao caso-índice 3.

79

Dezesseis das 37 amostras ambientais processadas (43%) foram positivas.

Entretanto, devido ao elevado nível de contaminação por fungos filamentosos, em

apenas 11 foi conseguido isolamento de colônias puras (Tabela 6.6). Foi obtido o

isolamento de C. neoformans de alguns ambientes a partir de madeira em

decomposição e poeira de mais dois domicílios próximos (controle). Ambas as

espécies, C. neoformans e C. gattii, foram isoladas do mesmo ambiente, em poeira

intradomiciliar de dois domicílios vizinhos (controle), sendo um destes da mãe da

paciente. Cryptococcus gattii também foi encontrado isoladamente em poeira

intradomiciliar coletada no primeiro andar do domicilio da mãe da paciente (domicílio

controle).

80

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81


Caso 4: Paciente do sexo masculino, 47 anos, eletricista, residente no bairro de

Coqueiro, município de Ananindeua, há três anos. Apresentou qudro de meningite

em dezembro de 2002 sendo diagnosticado através de pesquisa de fungos em LCR

e látex. Após tratamento recebeu alta em 2003. Residência em alvenaria com piso

em cerâmica, sem forro, seis cômodos. Condomínio fechado, de classe média. O

paciente fazia vistoria técnica da companhia de eletricidade em vários bairros, e

relatou a presença de pombos próximos ao local de trabalho no centro da cidade de

Belém e no domicílio chegou a criar pombos por aproximadamente 15 anos na

antiga residência. Recuperou-se com seqüelas (perda de visão e audição). Tem sítio

com muitas árvores em balneário próximo a Belém. Domicílio bem cuidado, limpo,

boa ventilação e iluminação. Domicílios vizinhos consistiram de um terreno com

mato, casa e obra em alvenaria. Domicílios e peridomicílios (caso e controles)

negativos para Cryptococcus.


Caso 5: Paciente do sexo feminino, 59 anos, residente no bairro do Coqueiro,

município de Ananindeua. Originária de Quatipuru reside em Ananindeua há mais de

13 anos. A paciente é diabética, hipertensa e portadora de LES e adoeceu de

meningite em 2003, cujo fungo foi isolado e identificado como C. gattii. Após várias

internações, evoluiu para óbito. Casa de alvenaria, quatro cômodos, piso em

cerâmica com cozinha cimentada, localizada em rua asfaltada. Ventilação e

iluminação ruim, sem janelas laterais. Presença de árvores frutíferas no quintal,

caixa d’água e cercado de madeira. Domicílios vizinhos em madeira. Domicílios e

peridomicílios (caso e controles) negativos para Cryptococcus.


Caso 6: Paciente do sexo feminino, 28 anos, HIV+, bairro Montese, em Belém. Deu

entrada no HUJBB em maio/2004 evoluindo para óbito e o diagnóstico foi realizado

através de pesquisa de fungos em LCR com teste do látex no LCR também foi

positivo. Pesquisa paralela permitiu o isolamento do fungo que foi identificado como

C. neoformans. A paciente morava com mãe na época da doença. Casa em

madeira 2 pavimentos com 8 cômodos,uma parte de piso em cerâmica e outra em

terra., Telhado de amianto, sem forro, localizado em área de invasão, ruas sem

asfaltamento, condições de saneamento inadequadas. A mãe acha que ela contraiu

82

meningite no hospital. Presença de galinha, cachorro e coelho. Domicílios e

peridomicílios (caso e controles) negativos para Cryptococcus.


Caso 7: Paciente do sexo masculino, 65 anos, marceneiro, com meningite por C.

neoformans, residente no bairro Batista Campos, em Belém. Deu entrada no HUJBB

em feveriro/2004 evoluindo para óbito. Diagnóstico foi realizado através de pesquisa

de fungos em LCR. Casa de dois pavimentos, com cinco cômodos, construída em

madeira, algumas paredes externas com deterioração (Figuras 6.9 e 6.10). Piso de

tábua, sem forro e telhado de barro, aparentemente limpa, porém com ventilação e

iluminação razoáveis. A filha relatou que o mesmo tinha uma marcenaria, onde vivia

em permanente contato com poeira constituída principalmente de raspas de madeira

e pó de serra. Foram coletadas no local 13 amostras, constituídas de restos de

madeira, e tatuzinhos que estavam junto à madeira empilhada. Duas amostras

sendo uma de madeira em decomposição e outra de poeira intradomiciliar

mostraram colônias fenoloxidades positivas, porém só de uma amostra de poeira

intradomiciliar foi obtido isolamento de C. neoformans e C. gattii (Tabela 6.7).

Figura 6.9 - Aspecto externo junto ao domicílio do paciente (caso-índice 7), observar

presença de basidiomicetos.

83

Figura 6.10 - Aspecto externo de domicílio de paciente (caso-índice 7) com

criptococose neoformans, ao fundo, cuja poeira foi positiva para C.

neoformans e C. gattii.

Tabela 6.7 - Número de isolados e densidade de colônias fenoloxidase positivas, de

acordo com o tipo de substrato, relativos ao caso-índice 7.

FONTE DE ISOLAMENTO COLÔNIAS

ISOLADAS

DENSIDADE

UFC/g

Madeira em decomposição 0 5,0 x 10

Poeira intradomiciliar 16 5,25 x 103

84


Caso 8: Paciente do sexo masculino, 31 anos, HIV+, com meningite por C.

neoformans, diagnosticado por pesquisa de fungos positiva em LCR. Foi internado

em outubro/2003 evoluindo para óbito, residente no bairro da Pedreira em Belém. O

domicílio estava fechado desde o falecimento do paciente. Casa de madeira, piso de

tábua, telha de barro. Não foi possível o acesso ao interior da casa. Domicílios

vizinhos compartilhando o mesmo terreno, e pelo menos dois deles pertencentes a

familiares do paciente. Uma casa na frente de alvenaria e as outras de madeira.

Foram coletadas duas amostras da parte externa do domicílio do paciente e o

restante dos domicílios vizinhos, constituídas de poeira e madeira. A partir de uma

amostra de poeira intradomiciliar da casa de um primo (domicílio controle) foi isolado

C. neoformans (Tabela 6.8). Os demais domicílios-controle foram negativos para

Cryptococcus.

Tabela 6.8 - Distribuição de Cryptococcus spp. de acordo com o tipo de substrato,

espécie isolada e UFC/g relativos ao caso-índice 8.

FONTE DE ISOLAMENTO ESPÉCIE

ISOLADA

COLÔNIAS

ISOLADAS

DENSIDADE

UFC/g

Poeira intradomiciliar de

domicílio controle

C. neoformans 10 6,0 x 103

6.5 ANÁLISE DOS ISOLADOS QUANTO À FONTE DE ISOLAMENTO,

DISTRIBUIÇÃO

A freqüência de contaminação domiciliar e/ou peridomiciliar dos substratos

ambientais dos quais foi isolado o fungo, estão representados na Tabela 6.9.

Cryptococcus neoformans foi isolado de: i) quatro amostras de poeira intradomiciliar;

ii) duas amostras de artrópodes (Cubaris murina), denominados vulgarmente como

tatuzinhos de jardins; e iii) três amostras de madeira em decomposição, perfazendo

um total de 9 amostras ambientais, correspondente a 4,84 % do total de amostras

processadas. Cryptococcus gattii foi isolado de uma amostra de poeira

intradomiciliar, representando 1,89 % de positividade de amostras desta natureza e

0,54 % do total de amostras processadas. Por outro lado, ambas as espécies, C.

neoformans e C. gattii, compartilhando um mesmo substrato, foram isoladas de: i)

cinco amostras de poeira intradomiciliar, correspondendo a 9,43 % das amostras

85

deste material; e ii) uma amostra de madeira em decomposição, correspondente a

1,03% de amostras desta natureza. Amostras de cascas, ocos e troncos de árvores

em decomposição, fragmentos vegetais e algumas amostras de excretas animais

não apresentaram positividade.

86

Tab

ela

6.9

- F

reqüê

ncia

de

Isola

ment

o de Cryptococcus neoform

ans e

C. gattii

de

aco

rdo

com

o m

ate

rial

analis

ado.

AM

OS

TR

AS

PO

SIT

IVA

S

AM

OS

TR

AS

AM

BIE

NT

AIS

Nº

DE

AM

OS

TR

AS

C. neoform

ans

C. gattii

C. neoform

ans e C. gattii

TO

TA

L

N

%

N

%

N

%

N

%

Poei

ra in

trad

om

icili

ar

* 53

4

7,5

5 1

1,8

9 5

9,4

3

10

18,

87

Art

róp

odes

9 2

22,2

2

0 0,0

0 0

0,0

0

2

22,

22

Ma

deir

a em

deco

mpo

siçã

o

97

3

3,0

9 0

0,0

0 1

1,0

3

4

4,1

2

Árv

ore

s (c

asca

, tr

onc

o)

17

0

0,0

0 0

0,0

0 0

0,0

0

0

0,0

0

Oco

de á

rvor

e

9 0

0,0

0 0

0,0

0 0

0,0

0

0

0,0

0

Exc

reta

s d

e galin

ha

1 0

0,0

0 0

0,0

0 0

0,0

0

0

0,0

0

TO

TA

L 18

6 9

4,8

4 1

0,5

4 6

3,2

3

16

8,6

0

* In

clui

subst

rato

s div

ers

os

N=

núm

ero

de a

mos

tras

posi

tivas

87

6.6 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS

Embora 22 (11,8%) das 186 amostras ambientais coletadas nos domicílios

produzissem colônias fenoloxidase positivas (Figura 6.11), suspeitas de C.

neoformans ou C. gattii, conseguiu-se o isolamento de colônias puras, de apenas 16

(8,6%) das amostras. Algumas foram processadas 2 vezes, mas a presença de

outros fungos contaminantes, notadamente Zygomycetes, não permitiram o

isolamento.

Figura 6.11 - Aspecto de colônias fenoloxidase positivas (marrons), sugestivas

de C. neoformans ou C. gattii.

Na figura 6.12 observa-se que das 16 amostras positivas com isolamento, a

fonte ambiental com maior positividade foi poeira intradomiciliar, com 62% (n=10) do

total de amostras positivas, seguido de madeira em decomposição, 25% (n=4).

88

4; 25%

10; 62%2; 13%

Poeira intradomiciliar Artrópodes Madeira em decomp.

Figura 6.12- Percentual de amostras positivas com isolamento de C. neoformans

e/ou C. gattii.

No total foram isoladas 220 colônias, positivas para síntese de melanina,

sensíveis a cicloheximida e termotolerantes a 37ºC. Todos os isolados foram

submetidos ao teste de CGB, cujos resultados estão demonstrados na Tabela 6.10 e

Figura 6.13, onde se destaca o predomínio de C. neoformans com 169 isolados

sobre C. gattii com 51 isolados. Maior número de isolados tanto de C. neoformans

quanto de C. gattii foram recuperadas de amostras ambientais oriundas do caso

índice 3.

Tabela 6.10 - Freqüência de C. neoformans e C. gattii identificados pelo teste de

CGB de acordo com os casos-indice.

CASO-

ÍNDICE

C. neoformans C. gattii TOTAL DE

ISOLADOS

%

2 46 0 46 20,91

3 105 43 148 67,27

7 8 8 16 7,27

8 10 0 10 4,55

TOTAL 169 51 220 100

89

Figura 6.13 - Freqüência de C. neoformans e C. gattii, de acordo com o caso-índice identificados pelo teste de CGB.

6.7 ANÁLISE MOLECULAR

6.7.1 Tipo sexuado

Todos os isolados foram estudados quanto ao tipo sexuado, cujos resultados

são apresentados na Tabela 6.11 e Figura 6.14. De um total de 169 isolados de C.

neoformans 99 pertencem ao tipo sexuado MAT α, e 70 são MAT a, enquanto dos

isolados de C. gattii 1 foi MAT αa e o restante foram MAT α (n=50). Observa-se

ainda que C. neoformans MAT α foi isolado de amostras ambientais referentes aos

casos-índice 3, 7 e 8; C. neoformans MAT a de amostras referentes aos casos-

índice relativos 2 e 3 e C. gattii MAT α referentes aos casos-índices 3 e 7 e MAT αa

do caso-indice 3. Em percentuais foram 45% de C. neoformans MAT α, seguido de

C. neoformans MAT a com 31,8%%, C. gattii MAT α com 22,7% e C. gattii MAT αa

com 0,5% do total de isolados (Figura 6.15).

Tabela 6.11 - Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii quanto ao tipo sexuado e caso-índice.

C. neoformans C. gattii TOTAL CASO ÍNDICE MAT α MAT a MAT α MAT αa

2 0 46 0 0 46

3 81 24 42 1 148

7 8 0 8 0 16

8 10 0 0 0 10

TOTAL 99 70 50 1 220

46

0

105

43

8 8 10 0

0

20

40

60

80

100

120

2 3 7 8

C neoformans

C gattii

90

Figura 6.14 - Distribuição do tipo sexuado dos isolados de acordo com o caso-

índice.

Figura 6.15 - Percentual de C. neoformans e C. gattii de acordo com o tipo sexuado

Em relação à fonte de isolamento, a Tabela 6.12, mostra que C. neoformans

MAT α foi isolado de poeira domiciliar (n=98) e madeira em decomposição (n=1), C.

neoformans MAT a de artrópodes (n=37) e raspado de madeira ou madeira em

decomposição (n=33) e C. gattii MAT α de poeira intradomiciliar (n= 41) e madeira

em decomposição (n=9) e um isolado MAT αa de poeira intradomiciliar. Na figura

6.16 está demonstrado o perfil eletroforético de alguns isolados ambientais MAT α e

MAT a.

0

46

0 0

81

24

42

1

8

0

8

0

10 0 0

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

2 3 7 8

C neoformans Matα

C neoformans Mat a

C gattii Matα

C. gattii Matαa

45,0%

31,8%

22,7%

0,5%

C neoformans Matα

C neoformans Mat a

C gattii Matα

C. gattii Matαa

91

Tabela 6.12 - Distribuição do tipo sexuado de acordo com a fonte de isolamento. TIPO SEXUADO N (%) FONTE DE

ISOLAMENTO C. neoformans

MAT α

C. neoformans

MAT a

C. gattii

MAT α

C. gattii

MAT αa

TOTAL

Poeira

intradomiciliar*

98 (45,55) 0 41(18,64) 1 (0,45) 140

Artrópodes 0 37 (16,82) 0 0 37

Madeira em

decomposição

1 (0,45) 33 (15) 9 (4,09) 0 43

TOTAL 99 70 50 1 220

*Inclui diversos substratos

N= número de isolados

Figura 6.16 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo sexuado

com primers MATα1- MATα2 e MAT a1- MAT a2 de seis isolados ambientais de C.

neoformans da região metropolitana de Belém/Pará, por PCR. Linhas – 1 e 11: Peso

molecular; 2: PA11; 3: PA6; 4: PA36; 5: ATCC 28957 padrão MATα; 6: ATCC 28958 padrão

MATa; 7: PA 134; 8: PA 102; 9: PA 158; 10: Controle negativo.

6.7.2 Análise da tipagem molecular

Os isolados foram analisados por PCR-RFLP, para determinação do tipo

molecular. A Tabela 6.13 apresenta os dados resultantes da análise, onde se verifica

que 3 tipos moleculares foram determinados VNI, VNIV e VGII.

92

Tabela 6.13 – Perfil dos isolados ambientais após caracterização dos tipos

moleculares analisados por PCR-RFLP.

CASO-ÍNDICE E

AGENTE ETIOLÓGICO

C. neoformans C. gatti Tipagem molecular

2 (C. gattii) 46 0 VNIV

3 (C. gattii) 105 43 VNI, VNIV e VGII

7 (C.neoformans) 8 8 VNI e VGII

8 (C.neoformans) 10 0 VNI

Os genótipos determinados em 220 isolados corresponderam a 99 (45%) de

VNI, 70 (32%) de VNIV e 51 (23%) de VGII, conforme Tabela 6.14 e Figura 6.17.

Tabela 6.14 - Distribuição dos genótipos identificados por caso-índice.

GENÓTIPO CASO-

ÍNDICE VNI VNIV VGII

TOTAL

2 0 46 0 46

3 81 24 43 148

7 8 0 8 16

8 10 0 0 10

TOTAL 99 70 51 220

Figura 6.17 - Percentual dos isolados analisados conforme tipo molecular.

Em relação à fonte de isolamento o genótipo VNI foi recuperado de poeira

intradomiciliar e madeira em decomposição, VNIV foi isolado de madeira em

45%

32%

23%

VNI

VNIV

VGII

93

decomposição e tatuzinhos, e VGII de poeira intradomiciliar e madeira em

decomposição (Figura 6.18).

Figura 6.18 - Distribuição dos genótipos de acordo com a fonte de isolamento.

O perfil eletroforético obtido por PCR/RFLP de alguns isolados de C.

neoformans e C. gattii são representados na Figura 6.19.

Figura 6.19 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo molecular

(VNIV, VGII e VNI) de alguns isolados ambientais (PA 16 a PA 214) de C. neoformans e C.

gattii da região metropolitana de Belém/Pará, obtidos por PCR/RFLP. Padrões (VNI-VNIV e

VGI-VGIV) estão representados pelos isolados LMM 794 a LMM 801.

98

0

42

0

37

0 1

33

9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Poeira intradomiciliar Artrópodes Madeira em decomp.

VNI

VNIV

VGII

94

No apêndice 1 são apresentados dados referentes ao substrato, tipo sexuado

e tipo molecular de cada isolado, identificados por códigos utilizados nas figuras 6.16

e 6.19.

95

7. DISCUSSÃO

A criptococose e seus agentes têm sido bastante estudados no decorrer das

últimas décadas em virtude do advento da aids o que provocou um aumento drástico

das infecções oportunísticas entre as quais a criptococose, notadamente a causada

pela espécie C. neoformans. Diversas investigações têm sido reportadas

contribuindo para uma melhor compreensão do comportamento eco-epidemiológico

de ambas as espécies: C. neoformans e C. gattii, mas muitos aspectos de sua

ecologia, mecanismo de infecção, fatores de virulência, sexualidade e estrutura

populacional ainda permanecem obscuros.

Em relação às amostras ambientais coletadas aleatoriamente em lojas de

venda de pássaros e algumas árvores ornamentais de ruas da cidade de Belém,

alguns aspectos merecem destaque.

Não obstante a investigação ter sido realizada com um número pequeno de

amostras, os resultados obtidos foram relevantes devido à escassez de informações

referentes a estes importantes agentes na região Norte do Brasil. Os resultados

registraram pela primeira vez a ocorrência de C. neoformans sorotipo A, MATα,

genótipo VNI em excretas de aves, bem como C. neoformans sorotipo A, MATα,

genótipo VNI e C. gattii sorotipo B, MATα, VGII compartilhando o mesmo oco de

Senna siamea na cidade de Belém.

A ubiqüidade de C. neoformans sorotipo A é bem documentada e tem sido

isolado da maioria dos casos de aids no Brasil (ROZENBAUM et al., 1992, CASALI

et al., 2003) e no mundo (MITCHELL & PERFECT, 1995; BICANIC & HARRISON,

2005). Todos os isolados deste trabalho foram MATα e mostram concordância com

literatura mundial que relata a ocorrência de isolados MATα com marcante

predomínio sobre os isolados MATa, clínicos ou ambientais (KWON-CHUNG &

BENNETT, 1978).

Estudo global com cepas de diversos países mostrou que os tipos

moleculares VNI e VGI são os genótipos mundialmente predominantes (MEYER et

al., 1999; BOEKHOUT et al., 2001), embora a América Latina apresente perfil

diferente para C. gattii (MEYER et al., 2003; ESCANDÓN et al., 2006). No Brasil,

Lugarine et al. (2008) identificaram predominância de VNI em excretas de aves

(Passerine e Psittacine) no Paraná. No Rio Grande do Sul, Casali et al. (2003)

registraram VNI em excretas de pombos e VNIV em amostras de Eucaliptus spp.

96

O primeiro registro de C. gattii de origem ambiental na região Norte foi

documentado por Fortes et al. (2001), isolado a partir de Guetarda acreana, em uma

área de mata virgem no estado de Roraima. O isolamento de C. neoformans e C.

gattii compartilhando o mesmo oco foi registrado pela primeira vez em Teresina/PI

em Cassia grandis, sugerindo um possível elo entre seus ciclos biológicos na

natureza (LAZÉRA et al., 2000). Também Fortes (2001) relata o isolamento de

ambas as espécies a partir de oco de Adenanthera pavonina, em Boa Vista/RR. Este

evento não tem sido comumente registrado na literatura e, portanto, chama a

atenção que estes relatos tenham sido observados nas regiões Norte e Nordeste do

Brasil, as quais têm demonstrado diferenças epidemiológicas reveladas pela elevada

prevalência de C. gattii, em pacientes destas regiões (CORRÊA et al., 1999;

CAVALCANTI, 1997; MARTINS, 2003, NISHIKAWA et al. 2003), em contraste com

os relatos das regiões Sul e Sudeste, onde predomina C. neoformans.

O papel das árvores no ciclo biológico de C. neoformans ou C. gattii não está

devidamente esclarecido, mas a consistente associação de C. gattii com madeira em

decomposição tem sido demonstrada o que levou a sugestão de uma existência

endofítica em comum com outros Basidiomycetes degradadores da madeira (Sorrell,

2001). Entendemos que a presença de C. gattii e C. neoformans em oco de árvore

viva demonstra uma relação saprobiótica e conforme postula Lazéra (2000) C.

neoformans ou C. gattii e seus teleomorfos estão possivelmente associados com

madeira em decomposição e participando na sucessão ecológica dos agentes

decompositores de substratos lignificados. Esta interpretação é consistente com a

classificação do fungo na ordem Tremellales e a presença da enzima lacase

produzida por estas espécies. Segundo Sorrell, (2001) a lacase dos Basidiomycetes

degrada e mineraliza a lignina dentro da superfície interna da madeira em

decomposição que se comunica com o cerne rígido da árvore viva.

É interessante observar que as nossas amostras ambientais do oco de árvore

foram coletadas no mês de maio/2002, cujas médias de temperatura e umidade

corresponderam a 26,7ºC e 85%, respectivamente, e as amostras de habitats de

pássaros foram coletadas no mês de março/2003, com médias de 26,1ºC e 89%,

respectivamente. Estes resultados não permitem sugestões conclusivas sobre a

influência das condições climáticas, mas sugerem que ambas as espécies estão

bem adaptadas às condições de temperatura e umidade altas. Estudos realizados

em várias regiões da Colômbia sugerem que fatores climáticos, principalmente

umidade, temperatura, evaporação e radiação solar podem afetar a ocorrência dos

97

diferentes sorotipos de Cryptococcus spp. em diferentes espécies de árvores

(GRANADOS & CASTAÑEDA, 2006).

As excretas de aves são consideradas o substrato natural mais comumente

associado a C. neoformans, mas o papel das aves na disseminação do fungo no

ambiente ainda não está bem esclarecido, mesmo com um número considerável de

investigações sobre o tema. Pombos e outras aves podem transportar C.

neoformans em seus bicos, garras, pernas e penas (KOWN-CHUNG & BENNETT,

1992). Swinne-Desgain, 1994 apud Casadevall & Perfect, (1998) estudando pombos

na Bélgica isolaram C. neoformans de papos de 50% destas aves e concluíram que

os mesmos são reservatórios do fungo. Os pombos são resistentes à infecção por

inoculação via gastrintestinal e intramuscular, mas a infecção pode ser induzida por

via intracerebral ou ocular. Esta resistência pode ser em função da alta temperatura

corporal, inibidora de C. neoformans (41 a 43ºC) e a presença da microbiota

bacteriana intestinal (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Por outro lado, Sorrell &

Ellis (1997) consideraram improvável que os pombos sejam a principal fonte de C.

neoformans na natureza, pois são encontrados em baixa concentração em vários

sítios anatômicos pesquisados. As informações disponíveis sugerem que, embora

infectados em seus papos, os pombos sejam resistentes à infecção disseminada. No

entanto, podem contribuir para a propagação do fungo por possibilitarem ao mesmo

um meio rico e propício ao seu desenvolvimento na forma de excretas e podem

transportá-los em seus bicos e pés (CASADEVALL & PERFECT, 1998).

A presença de C. neoformans e C. gattii nos habitats apresentados pode

indicar uma contaminação externa e transitória, entretanto, conforme ressaltam

Lazéra et al. (1993), estes microambientes não representam apenas uma proteção

contra a luz solar, mas também são fontes de matéria orgânica, constituindo um

habitat adequado para a sobrevivência e colonização destes fungos.

No presente estudo foram analisadas amostras ambientais de domicílios e

peridomicílios relacionadas à pacientes com criptococose e residentes na região

metropolitana de Belém. A partir da análise de 186 amostras ambientais, sendo 103

coletadas em domicílio de pacientes e 83 em domicílios vizinhos (controle), 22

apresentaram positividade para C. neoformans e/ou C. gattii, com isolamento de 220

colônias. Considerando a relação casos-índice versus positividade observou-se que

dos oito casos-índice selecionados, (em um destes só se efetivou coletas no entorno

e domicílios controles), obteve-se positividade em 4 (50%) dos casos-índices

estudados. Este percentual relativamente alto é relevante considerando-se que o

98

número de domicílios estudados foi pequeno; além disso, é superior ao encontrado

por outros autores, inclusive em número de isolados. Assim, em estudo de 824

amostras ambientais coletadas em 154 domicílios de pacientes residentes na região

metropolitana do Rio de Janeiro/RJ, Passoni et al. (1998) isolaram 37 colônias de C.

neoformans em 20 (13%) domicílios. Em outro estudo similar Cavalcanti (1997)

estudou 39 domicílios, encontrando positividade em 8 (21%), para C. neoformans e

C. gattii, sendo 4 domicílios em Teresina (PI), 1 em Açailândia (MA), 1 em Barra da

Corda (MA) e 1 em Coroatá (MA). Machado et al. (1993), após inquérito com

pacientes sobre possível contato com pombos, analisaram 59 amostras de solo

misturadas com excretas de pombos, penas e material orgânico proveniente de 16

sítios apontados pelos pacientes e detectaram positividade em 5 (8,5%). Em um dos

casos, o sorotipo A de C. neoformans isolado de LCR foi coincidente com o sorotipo

das amostras isoladas do centro de Porto Alegre, local apontado pelo paciente como

possível fonte de infecção.

A relação entre domicílio contaminado por C. neoformans e pacientes com

aids e criptococose foi mencionada por Passoni et al. (1998), que detectaram maior

positividade em domicílios de pacientes com criptococose associado a aids (15,6%),

ao passo que nos domicílios de pacientes sem criptococose e com aids detectou

8,9% e nos domicílios de pacientes sem criptococose e sem aids a positividade foi

14,3%. No presente estudo, dois domicílios de pacientes com aids não

apresentaram positividade, mas o fungo foi detectado em amostras provenientes de

domicílios vizinhos de um destes casos. Na África Central, onde a prevalência da

criptococose associada a aids é elevada (BICANIC & HARRISON, 2005; MITCHELL

& PERFECT, 1995) C. neoformans foi isolado de 7 domicílios de 20 pacientes com

criptococose associada a aids (SWINNE et al., 1989), sugerindo a importância do

acompanhamento do paciente “curado”, que facilmente pode ser re-infectado após a

alta hospitalar e seu retorno a casa.

O principal fator associado com contaminação domiciliar por C. neoformans

apontado por Passoni et al. (1998) foi a presença de criação de aves no ambiente

domiciliar. O papel das aves na ecologia de C. neoformans tem sido bastante

discutido em várias investigações, embora muitos aspectos ainda permaneçam

obscuros. Muitos estudos mostram a associação direta do fungo com as excretas de

aves, predominantemente de pombos. A elevada concentração de C. neoformans

em excretas de pombos (RUIZ et al., 1981) e a alta prevalência de pombos em

grandes centros urbanos demonstram consistentemente a possibilidade de

99

continuada exposição humana ao fungo. Entretanto, apesar de todas as evidências

disponíveis, faltam provas definitivas quanto à aquisição da infecção a partir deste

substrato.

Na tentativa de correlacionar os isolados ambientais com isolados obtidos de

pacientes têm sido utilizadas diversas técnicas de tipagem molecular. O primeiro

estudo foi desenvolvido por Currie et al. (1994) que, através da técnica de RFLP,

analisaram isolados clínicos e ambientais de Nova York e identificaram duas

linhagens de origem clínica e ambiental com relação genética. Yamamoto et al.

(1995) utilizando o método de RAPD, detectaram em duas localidades de Nagasaki

dois isolados ambientais fortemente relacionados com dois isolados clínicos,

sugerindo que a mesma linhagem pode ser encontrada em amostras clínicas e

ambientais em determinada área geográfica. Franzot et al., (1997) utilizaram RFLP

com elementos repetitivos CNRE-1 e outros métodos de tipagem molecular que

demonstraram evidências de ligação entre alguns isolados brasileiros obtidos de

excreta de pombos e de pacientes. Contrastante com estes dados, Varma et al.

(1995), através da técnica de RFLP com sonda UT-4p, não detectaram nenhuma

correlação entre cepas de pacientes com aids e sem aids e ambientais. Nos

domicílios analisados em nosso estudo não foi registrada a presença de pombos,

nem foi evidenciada a presença de excretas destas aves, ainda que na região

metropolitana de Belém e em outros centros urbanos (MONTENEGRO & PAULA,

2000; REOLON et al., 2004), principalmente nas áreas mais antigas, apresentem

grandes conglomerações destas e outras aves. Casadevall & Spitzer (1995)

sustentam que a utilização de técnicas moleculares como RFLP com elementos

repetitivos CNRE-1 e sonda UT-4p bem como cariotipagem eletroforética são

altamente discriminatória para métodos de tipagem molecular e seu uso por diversos

autores tem sugerido que a recorrência da criptococose nos casos estudados foi

devido à persistência do isolado inicial, ou seja, uma reativação.

O presente estudo mostra que, embora o substrato predominantemente

coletado tenha sido madeira em decomposição (n=97), foi da poeira intradomiciliar

(n=53) que se obteve maior positividade para Cryptococcus spp., com 10 amostras

positivas. É preciso considerar que esta positividade é subestimada, visto que mais

quatro amostras de poeira intradomiciliar apresentaram colônias fenoloxidase

positivas, entretanto, o alto grau de contaminação não permitiu o seu isolamento e

subseqüente perfeita caracterização fenotípica e genotípica. Muitas das amostras

apresentavam grande contaminação por espécies de Mucorales e Trichoderma spp.

100

O isolamento de C. neoformans de poeira domiciliar associada ou não à

presença de aves domésticas tem sido reportado por muitos autores. Além de

Passoni et al. (1998), um estudo epidemiológico registrou o isolamento de C.

neoformans a partir de poeira doméstica em 54% de domicílios de pacientes com

aids e 20% de domicílios aleatoriamente selecionados em Bumjumbura, Burundi

(SWINNE et al., 1991). Cavalcanti (1997) isolou C. neoformans de 5 amostras

constituída de poeira + solo intradomiciliar. Os dados aqui apresentados mostram

que a partir de 53 amostras de poeira intradomiciliar C. neoformans foi isolado de 4

amostras, C. gattii de uma amostra e ambas as espécies foram isoladas de outras 5

amostras. De acordo com o que foi encontrado na literatura, este parece ser o

primeiro registro de C. gattii neste tipo de substrato, bem como o primeiro relato de

compartilhamento de ambas as espécies em poeira intradomiciliar. De uma maneira

geral, as amostras de poeira consistiam de vários substratos, uma vez que foram

obtidas da varrição do domicílio no momento da visita. Em geral, estes substratos

consistiam de areia, às vezes pêlos de animais, cabelo, cupins, formigas e outros

detritos. Cabe ressaltar que todas estas amostras foram coletadas em residências

de madeira, muitas vezes com partes da edificação em decomposição. Estes

achados representam um novo aspecto no estudo da ecologia de C. gattii e

evidenciam que indivíduos podem estar em exposição contínua com o agente no

próprio ambiente domiciliar, o que impõe uma maior preocupação pela presença do

fungo em material facilmente aerossolizável e ao alcance de hospedeiros

suscetíveis.

O segundo tipo de substrato com maior positividade era constituído de restos

de madeira em decomposição, coletados em alguns casos do próprio domicílio do

paciente e/ou de domicílio controle. Diferente do esperado nas amostras de madeira

observou-se predominância de C. neoformans. Apenas uma amostra continha as

duas espécies neste substrato. Por outro lado, estes resultados reforçam a hipótese

de Lazéra et al. (2000) de que o nicho primário, tanto de C. neoformans quanto de

C. gattii, é de origem vegetal em decomposição.

A maioria dos estudos descreve C. gattii associado a vegetais e, embora

tenha habilidade para utilizar creatinina como fonte de Nitrogênio, esta levedura não

tem sido isolada de excretas de aves. Em nosso estudo C. gattii foi isolado de 6

amostras de poeira intradomiciliar, sendo 5 referentes ao caso índice 3 e uma

referente ao caso índice 7. Esperava-se a ocorrência de C. gattii em detritos de

madeira, no entanto, foi mais freqüentemente isolado de amostras de poeira

101

intradomiciliar. Por outro lado, como já foi ressaltado, as residências com poeira

positiva eram todas construídas em madeira.

Há um consenso geral de que a maioria das infecções por Cyptococcus spp.

são adquiridas por inalação de propágulos infectivos. Células da levedura

capsuladas do tipo encontrada em culturas laboratoriais são consideradas

excessivamente grandes para uma eficiente inalação (PERFECT & CASADEVALL,

2002). Porém, leveduras desidratadas e acapsuladas e/ou basidiosporos

apresentam diâmetro suficientemente pequeno para inalação e deposição alveolar.

Em estudo conduzido por Ruiz & Bulmer (1981) C. neoformans foi isolado a

partir do ar em um edifício (torre) desocupado e contaminado com excretas de

pombos em Oklahoma/EUA, através da exposição de placas de Petri com meios de

cultura específicos, durante 15 min, bem como de detritos do chão e excretas de

pombo. O número e tamanho das células de C. neoformans contidas no ar foram

analisados com coletor de ar da marca Anderson. O ar continha uma média de 45

UFC em 100 l de ar e 60% das células com menos de 4,7 µm de diâmetro. Amostras

do chão foram coletadas antes e após varrição. A varrição resultou na

aerossolização de um grande número de células de 4,7 a 11 µm em diâmetro. Um

minuto após a varrição 4,4% de células viáveis de C. neoformans eram menores que

1,1 µm (0,65 – 4,7 µm), um tamanho compatível com a deposição alveolar

(NEILSON et al. 1977). Baseado nestes achados foi estimado que a exposição

humana a esta atmosfera durante uma hora poderia resultar na deposição de 41

células de C. neoformans nos pulmões. Aproximadamente 106cél/ g de C.

neoformans foi cultivado de excretas de pombos (RUIZ & BULMER, 1981). Em outra

investigação em ambiente similar ao anterior Ruiz et al., (1981), avaliaram a

distribuição e o tamanho das células de C. neoformans em amostras de excretas de

pombos acumuladas e, portanto, mais compactadas e com amostras compostas de

material particulado relativamente finos e dispersadas pelo chão, revelando que

excretas envelhecidas compactadas continham menos células viáveis de C.

neoformans que aquelas com material seco livremente espalhado pelo chão. O

material fino espalhado pelo chão continha 300 vezes mais células viáveis que as

excretas acumuladas e mais compactas.

No presente estudo, a contagem de colônias de Cryptococcus spp. em

amostras de poeira intradomiciliar variou entre 1,5 x 102 até 75 x 102 UFC/g.

Em relação ao número de colônias produzidas, chamou atenção substrato

coletado no domicílio do caso índice 2, situado na cidade de Ananindeua na RMB,

102

considerada a segunda maior cidade do estado. Artrópodes conhecidos

popularmente como “tatuzinhos de jardins” apresentaram elevadíssimos índices de

UFC, com média de 238,38 e 247,31 UFC por placa. Nas primeiras 48 horas a

maioria das placas apresentava-se como colônias marrom escuras puras, fenol

oxidase positivas. Todos os isolados foram C. neoformans e os tatuzinhos foram

identificados como Cubaris murina. Embora o paciente deste domicílio tivesse sido

acometido por C. gattii, este resultado demonstrou que tais artrópodes podem

também transportar estas leveduras e, possivelmente, dispersá-las no ambiente,

uma vez que material raspado da madeira onde os tatuzinhos andavam também

estavam contaminados com C. neoformans. Estes dados estão de acordo com Ruiz

et al. (1982), que em seus experimentos detectaram C. neoformans em tatuzinhos

de jardins identificados como Methoponorthus pruinosus. Os autores recuperaram o

fungo também de placas com meio de cultura onde os tatuzinhos foram colocados

para andarem. Através de cortes histológicos observaram a presença de leveduras

não capsuladas que foram sugeridas como sendo C. neoformans. É importante

ressaltar que em nosso estudo o procedimento utilizado para análise destes

artrópodes foi diferente dos demais substratos, o que pode ter influenciado na

enorme quantidade de colônias produzidas, pois os mesmos foram macerados em 2

ml de solução salina. As duas amostras foram coletadas no mesmo ambiente, mas

em recipientes separados, por isto foram processadas separadamente.

A associação de C. neoformans com invertebrados foi estudada em vários

aspectos por Ruiz et al. (1982), demonstrando que fatores bióticos influenciam na

sobrevivência de C. neoformans, incluindo bactérias, amebas, ácaros e tatuzinhos

de jardins. Algumas bactérias, entre quais Pseudomonas aeruginosa e Bacillus

subtilis, apresentaram propriedade anti-C. neoformans e ácaros que foram

observados em placas contendo ágar azul tripano (TBA) apresentavam células de

leveduras azuis (células de C. neoformans apresentam-se azuis sobre TBA) dentro

do trato digestivo dos ácaros. O experimento com amebas (Achantamoeba

palestinensis) isoladas de excretas de pombos demonstrou que estas, na forma de

trofozoítas, podem ingerir e matar as 99, 9% de células de C. neoformans após sete

dias de incubação. A formação de pseudohifas, observadas em outro estudo, parece

ser uma forma de resistência ao ataque (massacre) das amebas, sugerindo que esta

forma fúngica possa persistir em locais habitados por amebas (NEILSON et al.,

1978). Recentemente Kidd et al., (2003) relataram o primeiro isolamento de C. gattii

de insect frass (produto resultante de uma colônia de insetos, vivos e/ou mortos,

103

sobre substrato vegetal, igualmente vivo ou morto) coletado de uma cavidade

sombreada na casca de uma árvore viva (Eucalyptus tereticornis) na Austrália. Estes

detritos permitiram identificar o inseto como pertencente à ordem Lepidoptera.

Análise com PCR fingerprinting identificou os tipos moleculares VGI e VGII de C.

gattii.

A potencial associação entre Cryptococcus spp. e hospedeiros diversos são

consistentes com a classificação do fungo na ordem Tremellales, a qual inclui fungos

micoparasitas (KWON-CHUNG et al., 1995), sugerindo uma possível relação de

parasitismo na natureza (LIN & HEITMAN, 2006). Pelo exposto, deve-se considerar

outras relações ecológicas, como comensalismo e predação, uma vez que no

experimento com ameba, C. neoformans mostrou-se fonte de alimentação. Na

realidade, evidencia-se um complexo ciclo de interação onde várias funções

ecológicas podem ser relacionadas.

Outro aspecto que vem sendo abordado é a possibilidade do fungo adquirir

virulência no ambiente em decorrência da interação com hospedeiros não

mamíferos. Os registros de associação de Cryptococcus spp. com grande variedade

de hospedeiros sustenta a hipótese de que a virulência do fungo pode estar

relacionada e mantida por via de seleção imposta pela exposição a predadores

naturais. Amebas como Achantamoeba castelannii (STEENBERGEN et al., 2001),

nematóides (MYLONAKIS et al., 2002) e o fungo mucilaginoso Dictyostelium

discoideum, entre outros, têm sido utilizados em modelos de estudo de virulência.

Em um destes estudos, Steenbergen et al. (2001) relataram que linhagens

acapsuladas de C. neoformans não sobrevivem quando incubadas com amebas,

porém, a melaninização protege a levedura contra o ataque (killing) da ameba,

sugerindo que a virulência de C. neoformans é conseqüência de adaptações que

desenvolveram para proteção contra predadores no ambiente. Observaram ainda

que todas as leveduras testadas foram ingeridas pela ameba, no entanto, linhagens

acapsuladas e linhagens com pseudohifas foram ingeridas mais rapidamente que as

formas capsuladas, mostrando que a cápsula tem papel anti-fagocítico. Após

ingestão, as células resistem e replicam-se dentro de vacúolos fagocíticos. Vacúolos

contendo polissacarídeos são deletérios para a célula (FELDMESSER et al., 2000).

Por fim, o estudo demonstrou que muitas linhagens virulentas de C. neoformans

podem causar a lise da ameba.

No presente estudo, a determinação do tipo sexuado por PCR com primers

específicos e do tipo molecular através da técnica de PCR/RFLP do gene URA5,

104

revelou que todos os 37 isolados dos tatuzinhos e de uma amostra de raspas de

madeira onde os tatuzinhos foram encontrados pertencem ao tipo sexuado MATa,

tipo molecular VNIV. Provavelmente todos estes isolados resultaram de uma

expansão clonal, indicando possível associação comensal entre os fungos e os

tatuzinhos, provavelmente transitória. Para melhor compreensão destes achados

são necessárias novas buscas em diversos ambientes para verificar se este é um

evento ocasional ou freqüente. Estudos histológicos podem comprovar a presença

interna da levedura. E estudos controlados em laboratórios poderão melhor definir o

tipo de associação ecológica entre os fungos e tatuzinhos de jardim.

Em relação ao tipo de domicílio positivo para Cryptococcus spp. deve ser

ressaltado o fato de a maioria dos casos selecionados e mesmo os não

selecionados situarem-se em áreas de invasão, com precárias condições de

saneamento e cujas edificações são construídas de forma desordenada e

predominantemente em madeira. Muitos dos domicílios visitados encontravam-se

em aparente decomposição. Em alguns destes foi registrada a presença de

basidiomas de Basidiomycetes, denotando a participação deste grupo na

degradação da madeira.

Dos oito domicílios de casos-índice estudados destacam-se dois: i) O caso-

índice 3, de uma paciente portadora de LES e residente em área de invasão próximo

a portos e madeireiras. Cryptococcus neoformans foi isolado do domicílio da

paciente, do domicílio da mãe da paciente e de dois domicílios vizinhos.

Cryptococcus gattii foi isolado da poeira intradomiciliar após varrição no andar de

baixo da residência da mãe. As duas espécies foram encontradas em poeira

intradomiciliar de dois domicílios vizinhos, bem como do andar de cima da residência

da mãe da paciente e ainda da cozinha da paciente. Estas residências foram

construídas de forma contígua, ou seja, uma parede separa duas casas. As casas

em frente mantêm diminuta distância, podendo-se considerar como se fosse um

único ambiente. Durante a coleta não foi observada a presença de pombos, mas sim

muitas madeireiras próximas, sugerindo que material proveniente do manejo da

madeira seja disperso pelo ambiente; ii) O caso-índice 7, de um paciente do sexo

masculino, HIV negativo, de 65 anos de idade e que foi a óbito devido criptococose

por C. neoformans. O paciente era marceneiro e, portanto, em freqüente exposição a

detritos de madeira. A sua residência era em madeira, mas localizada no limite, em

área mais bem estruturada do que no caso-índice 3. Também se observou pelo lado

externo da casa uma parede em decomposição, mas as amostras coletadas não

105

foram positivas. No domicílio foram detectadas duas amostras positivas das 11

coletadas. Uma das amostras apresentou baixa densidade de colônias e rápida

contaminação, não se conseguindo seu isolamento para identificação e

caracterização precisa. Somente de uma amostra de poeira intradomiciliar coletada

no andar de cima do domicílio foram recuperados 16 isolados, identificados como C.

neoformans e C. gattii na proporção de 1:1.

O caso índice 8 refere-se a um paciente HIV positivo. Por questões familiares,

não permitiram nossa entrada no domicílio do paciente, fechado desde a sua morte.

Embora o domicílio seja em madeira, situa-se em um bairro mais estruturado, com

ruas largas e residências próximas construídas em alvenaria. Uma amostra de

poeira intradomiciliar coletada em domicílio-controle, pertencente a um parente do

paciente, foi positiva para C. neoformans. Todos os isolados foram VNI, MATα,

compatíveis com os isolados da maioria dos casos de aids.

É interessante ressaltar que na maioria das amostras ambientais, C.

neoformans sempre esteve presente em maior proporção ou pelo menos foi isolado

em maior proporção, o que pode representar maior poder de competitividade e/ou

capacidade de rápida reprodução.

Se a criptococose é causada por uma infecção aguda ou reativação de uma

infecção latente é um tema ainda em discussão. Evidências sugerem que a

reativação de infecção latente seria mais comum (LIN & HEITMAN, 2006). É

provável que as manifestações da criptococose sejam devidas à reativação mais do

que uma re-infecção (BRANDT et al., 1996). Garcia-Hermoso et al., (1999)

analisaram 9 pacientes que moraram na África durante 110 meses antes de se

mudarem para a Europa. Perfis de RAPD mostraram que os isolados clínicos dos

pacientes africanos diagnosticados na França eram significativamente diferentes dos

isolados clínicos europeus, sugerindo que a infecção por C. neoformans havia sido

adquirida na África, suportando a idéia de uma fase dormente seguida da reativação

do fungo. Através da avaliação de um grupo de viajantes que estiveram em

Vancouver foi sugerido para C. gattii um período de incubação de 2 a 11 meses,

indicando que a infecção por C. gattii é mais consistente com infecção primária

(MacDOUGALL & FYFE, 2006).

No Brasil, estudos clínico-epidemiológicos mostram a importância da

criptococose gattii de SNC em adultos jovens de ambos os sexos e crianças nas

regiões N e NE, com letalidade de 35% a 40% (CAVALCANTI 1997, CORRÊA et al.

1999, SANTOS 2000, DARZÉ et al. 2000, NISHIKAWA et al. 2003, MARTINS 2003,

106

LAZÉRA et al. 2005). É notório que a maioria é diagnosticada quando há

manifestações do SNC, não se diagnosticando formas pulmonares mais leves, o que

parece indicar um importante fator de sub-diagnóstico da doença nestas regiões.

No estado do Pará os registros hospitalares mostram alta incidência de

criptococose, embora pouco documentada na literatura. Há registro de um caso de

criptococose cutânea de paciente masculino de 29 meses, residente em casa tipo

palafita, ocorrido em 1981, cujo diagnóstico foi obtido por exame histopatológico e

seu tratamento realizado pela remoção da lesão, não ocorrendo recidiva (AUAD,

1993). Em estudo mais recente, Corrêa et al., (1999) registram criptococose gattii em

crianças e jovens no Pará e Santos et al. (2005) apresentaram em congresso um

estudo que mostra o predomínio da criptococose gattii sobre a criptococose

neoformans em centro de referência em Belém do Pará onde a maioria absoluta

apresenta lesão de SNC.

A percepção da importância da criptococose gattii é crescente; se antes era

vista como problema restrito a grupos populacionais rurais ou nativos, atualmente

identifica-se sua ocorrência em diversas regiões onde surjam condições laboratoriais

para o diagnóstico e discriminação das espécies de Cryptococcus (LAZÉRA et al.,

2007).

Tais achados sugerem a possibilidade de infecção humana indoor, isto é, a

infecção seria adquirida dentro das residências. É, portanto, de fundamental

importância ampliar este estudo para verificar se o próprio ambiente domiciliar em

Belém do Pará e outros domicílios em condições similares podem representar fontes

cotidianas para a infecção humana, o que traz um novo conceito de risco na

criptococose, particularmente aquela causada por C. gattii que atinge crianças e

jovens aparentemente normais em Belém do Pará, bem como nas regiões Norte e

Nordeste do Brasil em geral.

É reconhecida a predominância do tipo sexuado MATα sobre MATa em

isolados de C. neoformans e C. gattii independente da origem clínica ou ambiental.

Kwon-Chung & Bennett (1978) encontraram uma proporção de 30:1 entre os

isolados clínicos e 40:1 entre os isolados ambientais de C. neoformans. Todos os

isolados C. gattii sorotipo B de Vancouver foram MATα e a grande maioria fértil

(FRASER et al., 2003). Não está claro o porquê deste predomínio, embora o tipo

sexuado MATα seja referido como mais virulento (KWON-CHUNG et al., 1992b), o

que lhe conferiria maior competitividade. Wickes et al. (1996), ao demonstrar in vitro

que isolados do tipo sexuado MATα são capazes de produzir hifas e basidiosporos

107

na ausência de mating, sob determinadas condições (limitação de nitrogênio e

água), sugere que esta associação possa explicar a preponderância deste mating

type na natureza. O dimorfismo refere-se à capacidade de algumas espécies se

apresentarem ora na fase micelial ora na fase leveduriforme, dependente de

determinados fatores como temperatura, nutrientes e tensão de CO2, observados em

várias espécies de fungos patogênicos, notadamente os causadores de infecções

sistêmicas. Embora a presença de hifas seja descrita em C. neoformans e C. gattii,

estes não têm sido referidos como dimórficos, porque a fase micelial é transitória e

observada durante a fase sexual (WICKES et al. 1996)

A determinação do mating type em 220 isolados analisados neste estudo

mostrou concordância com a literatura em relação a maior freqüência de isolados

MATα. Entretanto diferentemente do estudo de Kwon-Chung & Bennett (1978) os

isolados obtidos neste trabalho revelaram predomínio de MATα, na proporção ~2:1.

Halliday et al., (1999) analisando isolados clínicos e ambientais da Austrália também

detectaram a maioria de isolados MATα, porém em isolados de uma determinada

área geográfica a proporção de MATα foi de 27:2 enquanto que numa segunda área

esta proporção foi de 50:50, o esperado para uma recombinação sexual. Nosso

estudo revelou que o tipo sexuado MATa só foi detectado em isolados de C.

neoformans. Mas, o que chamou mais atenção foi a ocorrência de ambos os tipos

sexuados em um mesmo ambiente em domicílios diferentes. C. neoformans MATa

foi recuperado de duas amostras de restos de madeira em decomposição retirada da

própria parede do domicílio de uma paciente (caso índice 3) enquanto de amostras

de poeira doméstica isolou-se C. neoformans MATα e C. gattii MATα de um

domicílio situado em frente. Um segunda coleta, realizada 4 meses depois, revelou a

presença de C. neoformans e C. gattii MATα do domicílio desta paciente. A

presença de isolados de MATα e MATa no mesmo espaço geográfico reforça

evidências de ocorrência do ciclo sexuado na natureza, possivelmente ligado a

ambientes com a presença de substratos de origem vegetal em decomposição,

como já foi sugerido por Lazéra et al. (2000). Cruzamento entre isolados ambientais

coletados em Roraima demonstraram fertilidade in vitro, entretanto mostraram

ausência de autofertilidade (FORTES, 2001).

Considerando que os primers utilizados para este estudo foram originalmente

construídos com base no feromônio de isolados C. neoformans sorotipo D, chamou

atenção uma amostra de C. gattii em que o marcador molecular revelou bandas

compatíveis com MATαa. A PCR foi repetida mais de uma vez com o mesmo

108

resultado. Sendo assim este isolado merece ser mais bem estudado quanto à sua

ploidia e seqüenciamento genético para confirmação do tipo sexuado e verificação

se trata de isolado recombinante ou híbrido, uma vez que há possibilidade de

híbridos inter-espécies e estes são extremamente raros na natureza. Isolados αa

são característicos do ciclo sexual clássico destas leveduras. Embora apenas um

isolado αa, tenha sido detectado é possível especular que há uma grande

possibilidade da existência do ciclo sexuado nestes habitats, visto que isolados

MATα e MATa foram recuperados de um mesmo ambiente. Além disto, cepas

haplóides foram demonstradas, capazes de desenvolver um ciclo monocariótico

(WICKES et al., 1996) indicando a necessidade de continuar esta linha de pesquisa

que poderá resultar no encontro de híbridos ou recombinantes.

O estudo do ciclo sexuado não foi objeto deste estudo, porém resultou no

isolamento de colônias que devem ser testadas para verificar sua fertilidade e

possível recombinação ou hibridização gênica entre C. neoformans e C.gattii.

Em estudo de plantas e animais os termos hibridização e híbrido são

utilizados para descrever o processo ou produto do processo no qual uma progênie

é gerada a partir do cruzamento de duas linhagens parentais geneticamente

divergentes, como por exemplo, linhagens de diferentes raças, variedades,

subespécies espécies ou gêneros (Xu et al., 2002). Linhagens de sorotipo A e D são

referidas como variedades por alguns autores, devido às diferenças sorotípicas entre

estas. Por isto, mating type entre linhagens sorotipo A e D tem sido referidos como

híbridos (XU et al., 2002). A recombinação refere-se à formação de uma nova

combinação de genes observada na progênie e não nos parentais resultante de

crossing over e segregação, independente ou durante a meiose. Não foi possível

obter a sorotipagem de todos os isolados devido a indisponibilidade comercial do kit

Crypto Iatron. Entretanto estes isolados MATa foram caracterizados como VNIV, e

este genótipo mostra correspondência com sorotipo D. A maioria dos isolados

híbridos relatados na literatura são AD, compatíveis com a distribuição cosmopolita

destes sorotipos. Híbridos BD, oriundos do cruzamento entre as espécies são raros.

A sua ocorrência natural foi registrada por Bovers et al. (2006).

Outros isolados MATa foram obtidos das amostras de tatuzinhos coletados

em quintal do domicílio do paciente caso índice-2. Estes achados foram discutidos

acima.

109

No Brasil, o tipo sexuado MATa foi registrado por Trilles et al. (2003) em

alguns isolados do Piauí, do Rio de Janeiro e do Amazonas. Raros isolados αa

foram registrados por Casali et al. (2003) e Barreto de Oliveira et al. (2004).

A distribuição dos tipos moleculares pelo método de PCR/RFLP do gene

URA5, evidenciou a ocorrência de três tipos moleculares em isolados ambientais na

RMB. O genótipo mais freqüente foi VNI (45 %), seguido pelo genótipo VNIV (32 %)

e VGII (23 %). Estes resultados estão em concordância com estudos prévios que

estabeleceram o genótipo VNI como o mais freqüente entre os isolados de C.

neoformans (MEYER et al., 1999; MEYER et al., 2003). Os genótipos VNI e VGI

foram considerados os tipos moleculares mundialmente predominantes (MEYER et

al., 1999, BOEKHOUT, et al., 2001), sendo que a maioria dos isolados clínicos de

pacientes com aids são VNI (ELLIS et al., 2000). Por outro lado, estudos posteriores

mostraram perfil diferente para isolados da América Latina. Isolados de origem

clínica, veterinária e ambiental provenientes de 9 países iberoamericanos foram

estudados por Meyer et al. (2003) e revelaram o predomínio do genótipo VNI

(68,2%) e, em menor proporção, VNII (5,6%), VNIII (4,1%), VNIV (1,8%), VGI (3,5%),

VGII (6,2%), VGIII (9,1%) e VGIV (1,5%). Notou-se a ocorrência de todos os

genótipos e, entre os isolados de C. gattii, prevaleceu o genótipo VGIII; porém, entre

os isolados brasileiros somente o genótipo VGII foi registrado. Estudo de 247

isolados ambientais de várias regiões da Colômbia agrupou a maioria no genótipo

VNI (98,1%) e VGII (100%) (ESCANDÓN et al., 2006).

Em nossa investigação ambiental não foi detectado o genótipo VGIII,

prevalente nas cepas ibero-americanas; porém, quando se avaliam somente as

cepas brasileiras, estes resultados coincidem com o estudo de Meyer et al. (2003).

No Rio Grande do Sul o estudo de cepas clínicas e ambientais (CASALI et al., 2003)

mostrou VNI (83,9%) de C. neoformans como o mais freqüente tipo molecular, de

origem clínica e ambiental. Entre os isolados C. gattii (8,9 %) todos foram VGIII

embora de origem clínica, mostram divergência em relação aos observados neste

estudo onde todos os isolados foram VGII. Estes achados estão de acordo com o

observado em outra análise de sorotipos, que também revelou marcante diferença

em relação a C. gattii quando se comparam a sua ocorrência nas regiões

Norte/Nordeste e Sul/Sudeste (NISHIKAWA et al., 2003).

Neste trabalho o genótipo VNIV foi isolado de tatuzinhos de jardins e raspado

de madeira relacionado, bem como de raspados de madeira em decomposição de

110

um domicílio, revelando-se todos do tipo sexuado MATa . Todos os isolados

oriundos de Eucaliptus spp. analisados por Casali et al., (2003) apresentaram este

genótipo, mas diferentemente, todos foram MATα . É interessante este achado uma

vez que também foram isolados em madeira em decomposição e pode-se afirmar

que não era de Eucaliptus spp. Embora não possamos afirmar, nosso achado

sugere que o fungo estivesse presente na madeira e que, ao serem ingeridos pelos

tatuzinhos, de alguma forma conseguem sobreviver por algum mecanismo de

escape e multiplicar-se em seu interior. Estes achados necessitam de novas buscas

e novas abordagens para um melhor entendimento desta relação.

Trilles et al. (2003) pelo método de AFLP identificaram 3 isolados do Piauí

como AFLP2, correspondente ao genótipo VNIV. Destes, dois foram isolados de solo

de toca de tatu e um de oco de árvore, e todos eram MATa. Analisando estes dados

em conjunto, observa-se que todos os genótipos VNIV das regiões N e NE eram

MATa, o tipo sexuado menos freqüente no mundo, enquanto que na região Sul

prevaleceram isolados MATα. Todos estes achados parecem mostrar uma relação

entre C. neoformans VNIV com vegetais e animais, uma vez que tatus têm sido

considerados possíveis reservatórios de vários patógenos (WANKE et al., 2007).

A ocorrência do genótipo VNIV no norte do Brasil adiciona um novo dado à

literatura, uma vez que até recentemente era considerado restrito a Índia e África do

Sul (ELLIS et al., 2000).

A ocorrência de isolados VGII neste estudo representa um achado importante,

uma vez que este genótipo foi o responsável pelo surto iniciado em 1999 na ilha de

Vancouver, Canadá, onde foi demonstrado que a concentração de propágulos foi

significantemente maior nos meses mais quentes e secos do ano (KIDD et al., 2007)

e alta fertilidade (FRASER et al., 2003). Dois subtipos foram identificados por Kidd et

al., (2004) nomeados VGIIa e VGIIb. A maioria destes isolados é considerada hiper-

virulenta e tem um idêntico genótipo, compatível com o único genótipo do Pacífico

Nordeste. A minoria é significantemente menos virulenta e compartilha genótipo

idêntico aos isolados férteis da população recombinante da Austrália (FRASER et

al., 2005). Considerando que C. gattii acomete principalmente hospedeiros

imunocompetentes, com elevada prevalência em crianças e jovens, tanto no estado

Pará (CORRÊA et al., 1999) quanto no Piauí (CAVALCANTI, 1997; MARTINS, 2003)

e Amazonas (SANTOS, 2000), este estudo confirma a presença de C. gattii VGII em

111

fontes ambientais da RMB e se revela preocupante, dado a elevada presença de

construções em madeira. As sobras das madeireiras constituem um material

abundante, barato e acessível para construção de habitações rústicas em áreas

alagadas na maior parte do ano e sem saneamento.

Estes achados mostram um ciclo biológico complexo dos agentes da

criptococose, adaptados a ambiente domiciliar localizado em área onde a pobreza

impera, cuja população usa madeira de refugo para a maioria de suas construções,

sob regime de alta pluviosidade e elevada umidade relativa do ar, em alguns casos

situadas próximas a rios ou igarapés muitas vezes sofrendo inundações provocadas

pelo regime de marés muito fortes nesta região do Brasil. Nestas condições,

observa-se acelerado processo de decomposição de substratos de madeira não

tratada, propiciando íntimo contato homem-fungo e atingindo todas as faixas etárias,

incluindo as crianças. Portanto, é bem provável que propágulos de leveduras

dessecadas e até mesmos basidiosporos possam ser produzidos por C. neoformans

e/ou C. gattii e sejam inalados no cotidiano destes domicílios, causando infecção

pulmonar assintomática, pneumonia ou disseminando para o sistema nervoso

central e outros órgãos. É importante ampliar os estudos sobre a criptococose e

seus agentes no Norte e Nordeste do Brasil, bem como identificar tipos moleculares

predominantes em infecções humanas, em animais e no meio ambiente, para um

melhor entendimento da estrutura populacional e diferenças geográficas destes

importantes agentes e identificar possíveis mecanismos de infecção nesta região.

A falta de condições de planejamento das construções e saneamento

contribui para um ambiente de pouca luminosidade e ventilação, menos limpo,

propiciando o desenvolvimento e multiplicação destes patógenos.

O presente estudo contribui pioneiramente para o conhecimento de fontes

ambientais e caracterização molecular de C. neoformans e C. gattii, oriundas da

região Norte do Brasil, adicionando novos genótipos e aspectos ecológicos

concernentes a estes dois agentes de relevante importância médica para a região,

bem como poderá servir de subsídio para novas pesquisas que visem identificar

possível elo genético entre isolados clínicos e ambientais.

112

8 – CONCLUSÕES Os resultados aqui apresentados permitem as seguintes conclusões:

1. Em relação às amostras coletadas em ocos de árvores ornamentais em área

urbana de Belém, registrou-se pela primeira vez a ocorrência de C. neoformans

sorotipo A, MATα, genótipo VNI e C. gattii sorotipo B, MAT α, genótipo VGII

compartilhando o mesmo oco de Senna siamea na cidade de Belém/PA, sugerindo

provável interação entre estas.

2. Metade dos domicílios dos casos-índice pesquisados (3/8 mais 1 domicílio

controle) apresentou contaminação por Cryptococcus neoformans e/ou

Cryptococcus gattii, demonstrando a ocorrência dos agentes da criptococose dentro

de e/ou no entorno de domicílios de pacientes da região.

3. A identificação dos isolados ambientais revelou o predomínio de C. neoformans

sobre C. gattii.

4. Em relação ao substrato investigado, detectou-se maior contaminação em poeira

intradomiciliar, demonstrando a ocorrência do fungo em material facilmente

aerossolizável.

5. Pela primeira vez foi demonstrada a ocorrência de C. gattii em ambiente

intradomiciliar, bem como a ocorrência de ambas as espécies compartilhando o

mesmo ambiente domiciliar, acrescentando mais um dado ecológico sobre

comportamento destes agentes.

6. Nos substratos constituídos de madeira em decomposição, Cryptococcus

neoformans foi isolado de 3 amostras e C. gattii, em conjunto com C. neoformans, foi

isolado de uma, sustentando a hipótese de que substrato de origem vegetal em

decomposição é habitat primário de ambas as espécies.

7. Cryptococcus neoformans foi isolado de tatuzinhos de jardins (Cubaris murina),

achado inédito.

113

8. A ocorrência de C. neoformans em amostra de raspado de madeira onde os

artrópodes C. murina foram coletados sugere que os mesmos possam ser

dispersores do fungo no ambiente.

9. Em função do elevado índice de UFC de C. neoformans detectado nos

artrópodes, bem como o baixo índice de contaminação por outros fungos, sugere

que o fungo estava colonizando internamente estes artrópodes e que,

possivelmente, conseguem sobreviver e se multiplicar em seu interior.

10. A caracterização molecular mostrou que todos os isolados dos tatuzinhos de

jardins eram do tipo sexuado MATa, tipo molecular VNIV, indicando possível

estrutura populacional clonal.

11. Globalmente, a determinação do mating type mostrou predominância de isolados

MATα, sendo 45% C. neoformans MATα, 32% C. neoformans MATa e 23% C. gattii

MATα. Um isolado C. gattii MATαa foi demonstrado. A ocorrência de isolados MATα

e isolados MATa em um mesmo ambiente sugere a possibilidade de cruzamento

entre isolados ambientais, o que poderia resultar em progênie de recombinantes ou

híbridos.

12. A ocorrência de C. gattii MATαa, indica possibilidade de híbridos inter-espécies.

Todavia merece estudos mais aprofundados para comprovação do achado que é

raro na natureza.

13. A utilização de PCR/RFLP do gene URA5 revelou o predomínio do tipo molecular

VNI, seguido de VNIV e VGII. Os genótipos VNIV e VGII constituem-se em novos

registros de isolados ambientais para a região norte do Brasil. Embora registrado em

menor número, a ocorrência de VGII é marcante quando comparada com as das

regiões Sul e Sudeste do Brasil.

14. A ocorrência isolada ou combinada de C. neoformans e C. gattii em habitações

precárias, construídas predominantemente em madeira, em uma região quente e

úmida, com alta pluviosidade, favorece a possibilidade de infecção indoor.

114

15. A elevada ocorrência dos agentes da criptococose na RMB indica que este

modelo de estudo deve ser aumentado para avaliação mais abrangente da relação

entre fontes de infecção e pacientes.

115

9 - PERSPECTIVAS

O Hospital Universitário João de Barros Barreto tem registrado um índice

relativamente alto de meningite por Cryptococcus spp., inclusive recente caso

(junho/2008) de óbito de um menino em local similar em bairro próximo ao registrado

neste estudo, o que deixou a população em pânico. A ocorrência de meningite

criptoccócica por C. gattii tem sido registrada nas regiões Norte e Nordeste

notadamente em crianças e jovens aparentemente hígidos têm evidenciado elevada

morbidade e mortalidade sugerindo áreas endêmicas na região. Os resultados

obtidos no presente estudo permitem sugerir algumas linhas de pesquisa e

divulgação, a saber:

• Realizar estudos moleculares buscando caracterizar os genótipos da região e

subsidiar as equipes de saúde locais no conhecimento das possíveis fontes

ambientais da região.

• Identificar a freqüência de ocorrência de ambas as espécies (C. neoformans e

C. gattii) num mesmo biótopo na região urbana de Belém

• Estudo comparativo da presença destes agentes em áreas de florestas com

mínima ação antrópica e em áreas degradadas pela atividade humana.

• Investigar a relação entre C. neoformans e C. gattii com a biota local, como

insetos, isópodas, e amebas e outros animais.

• Utilizar estas linhas de pesquisa para treinamento de alunos de graduação e

pós-graduação visando a formação de grupo de pesquisa que possa gerar

informações da região.

• Elaborar material informativo para divulgar junto à população de áreas com

registro da infecção e outros, visando auxiliar na prevenção desta micose.

• Realizar palestras comunitárias e para a comunidade acadêmica e

profissionais da saúde visando a divulgação de informações que possam ajudar para

uma melhor diagnóstico e prevenção.

• Estes resultados iniciais indicam a importância de se ampliar os estudos para

outras regiões da Amazônia, onde a criptococose gattii é endêmica, atingindo um

grande contingente de crianças e adolescentes imunocompetentes.

Pelo exposto pretende-se dar continuidade a esta linha de pesquisa e

expandir para cidades do interior do estado onde haja registro da infecção.

116

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143

APÊNDICE

144

APÊNDICE 1 - Dados Complementares

TABELA 1. Caracterização dos isolados ambientais da Região Metropolitana de Belém.

ISOLADOS SUBSTRATO ESPÉCIE SOROTIPO MAT URA-5 PA1 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA2 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA3 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA4 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA5 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA6 Tatuzinho de jardim C. neoformans D Mat a VNIV PA7 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA8 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA9 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA10 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA11 Raspado de madeira C. neoformans D Mat a VNIV PA12 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA13 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA14 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA15 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA16 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA17 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA18 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA19 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA20 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA21 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA22 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA23 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA24 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA25 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA26 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA27 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA28 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA29 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA30 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA31 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA32 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA33 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA34 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA35 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA36 Tatuzinho de jardim C. neoformans D Mat a VNIV PA37 Tatuzinho de jardim C . neoformans Mat a VNIV PA38 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA39 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA40 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA41 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA42 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA43 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA44 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA45 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA46 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA47 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA48 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA49 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV

145

PA50 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA51 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA52 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA53 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA54 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA55 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA56 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA57 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA58 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA59 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA60 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA61 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA62 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA63 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA64 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA65 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA66 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA67 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA68 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA69 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA70 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA71 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA72 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA73 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA74 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA75 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA76 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA77 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA78 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA79 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA80 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA81 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA82 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA83 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA84 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA85 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA86 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA87 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA88 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA89 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA90 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA91 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA92 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA93 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA94 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA95 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat αa VGII PA96 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA97 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA98 Poeira intradomicliar – parede C. neoformans Mat alfa VNI PA99 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA100 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA101 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA102 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA103 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI

146

PA104 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA105 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA106 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA107 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA108 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA109 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA110 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA111 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA112 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA113 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA114 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA115 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA116 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA117 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA118 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA119 Poeira intradomiciliar C. neoformans B Mat alfa VNI PA120 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA121 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA122 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA123 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA124 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA125 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA126 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA127 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA128 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA129 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA130 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA131 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA132 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA133 Poeira intradomiciliar C gattii B Mat alfa VGII PA134 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA135 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA136 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA137 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA138 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA139 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA140 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA141 Poeira intradomiciliar C. neoformans A Mat alfa VNI PA142 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA143 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA144 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA145 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA146 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA147 Poeira intradomiciliar C gattii Mat alfa VGII PA148 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA149 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA150 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA151 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA152 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA153 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA154 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA155 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA156 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA157 Poeira intradomiciliar C gattii Mat alfa VGII

147

PA158 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA159 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA160 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA161 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA162 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA163 Poeira intradomiciliar C.gattii Mat alfa VGII PA164 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA165 Madeira em decomposição C. gattii Mat alfa VGII PA166 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA167 Madeira em decomposição C. gattii Mat alfa VGII PA168 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA169 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA170 Madeira em decomposição C. gattii Mat alfa VGII PA171 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA172 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA173 Madeira em decomposição C. neoformans Mat alfa VNI PA174 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA175 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA176 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA177 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA178 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA179 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA180 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA181 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA182 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA183 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA184 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA185 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA186 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA187 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA188 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA189 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA190 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA191 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA192 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA193 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA194 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA195 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA196 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA197 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA198 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA199 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA200 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA201 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA202 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA203 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA204 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA205 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA206 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA207 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA208 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA209 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA210 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA211 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI

148

PA212 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA213 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA214 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA215 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA216 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA217 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA218 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA219 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA220 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI

149

APÊNDICE 2

First isolation of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii

from environmental sources in the city of Belém, Pará, Brasil.

Solange do PSE Costa11, Márcia dos S Lazéra2, Wallace RA Santos3; Bernardina

P Morales2, Cláudia CF Bezerra2, Marília M Nishikawa4, Gláucia G Barbosa2,

Luciana Trilles2, José L do Nascimento1, Bodo Wanke2.

Instituto de Ciências Biológicas/UFPA, Rua Augusto Corrêa, 01, Guamá, 66075-110, Belém, PA,

Brasil1; Laboratório de Micologia/IPEC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil2, Instituto de

Ciências da Saúde/UFPA, Belém, PA, Brasil3, INCQS/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil4. E-

mail: [email protected]

Cryptococcus neoformans and C. gattii are important agents of

meningoencephalitis in humans. In the present study we report the occurrence of

both of these pathogenic yeasts in the city Belém, Pará, Brazil. The determination of

species, serotypes, mating type and molecular type were performed. In the 11

samples analyzed, 2 were positives, and 7 isolates were obtained, being 6 of C.

neoformans and 1 C. gattii. All C. neoformans isolates were serotype A and the only

C. gattii was serotype B. This is the first report of genotypes VNI and VGII isolated

from natural sources in the north of Brazil.

Keywords: Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Belém/Pará

___________________________________________________________________

Introduction

Cryptococcosis is an important life-threatening endemic systemic mycosis of

people and animals, caused by two species of Cryptococcus: C. neoformans and C.

gattii, and attains healthy and immunocompromised hosts. The infection is usually

acquired through the inhalation of viable propagules from the environment where

they grow in natural habitats. Although the lungs are the primary site of the infection,

the central nervous system is the most frequent and severe clinical manifestation in

humans. The species differ in genotype, phenotype, epidemiology, as well as in their

geographic distribution and natural habitat (Perfect & Casadevall, 2002; Kwon Chung

1 Financial support: CAPES, Fiocruz/Ipec

Corresponding author: [email protected]

150

& Varma, 2006). While C. neoformans has a worldwide distribution and is classically

found in avian guano and some tree hollows, C. gattii has a more restricted

distribution, prevailing in tropical and sub-tropical regions, associated with

decomposing wood in hollows of tropical trees (Lazéra et al., 2005).

Cryptococcus neoformans is cosmopolitan, most frequently associated with

pigeon and other avian droppings and affects mainly immunocompromised hosts. On

the contrary, C. gattii is predominantly associated with woody debris of different tree

species (Lazéra et al., 2005), occurs mostly in immunocompetent hosts and is

usually restricted to tropical and subtropical areas. Only recently an outbreak of

cryptococcosis gattii on the Vancouver Island, Canada, changed this distribution

pattern (Kidd et al., 2004).

The isolation of virulent strains of C. neoformans from decomposing manure,

old nests and roosting sites of pigeons was described in 1955 (Kwon-Chung &

Bennett 1992) and since then, several additional studies on environmental sources of

this yeast have been reported. In Brazil, C. neoformans was isolated from decaying

wood within a hollow of Sygygium jambolana tree (Lazera et al., 1993) and from

hollows of Cassia grandis, Senna multijuga and Ficus microcarpa (Lazera et al.,

1996). The association of C. gattii with Eucalyptus camaldulensis was initially related

in Australia (Ellis & Pfeiffer, 1990) and later in California (USA) (Pfeiffer & Ellis, 1991)

and Mexico (Licea et al., 1996). In Brazil, was isolated from bat guano contaminated

with animal and plant material (Lazera et el., 1993) and decaying wood of Moquilea

tomentosa (pink shower tree) (Lazéra et al., 2000), Guettarda acreana, (in the

Amazonian rainforest) (Fortes et al., 2001).

In 1999 Corrêa et al. reported on 19 cases of cryptococcosis in children in the

state of Pará, out of them 9 were caused by C. gattii. Based on this observation, the

authors considered the existence of a highly endemic area of infection by C. gattii in

Pará. Considering the relevance of this infection in the state of Pará, we investigated

the occurrence of these yeasts in environmental samples in the city of Belém, Pará,

Brazil.

Materials and Methods

The city of Belém (01°27’20”S e 48°30’15”W) is the capital of the state of Pará

and has about 1,280,614 inhabitants. Located at the mouth of the Amazonas river,

15 m above the sea level, in the North region of Brazil, near the equator line, it has a

tropical and humid climate, characterized by a rainy season from December to May

151

and a dryer season from June to November, with an annual average precipitation of

2,834 mm and average temperature of 25°C in February and 26 °C in November

(Prefeitura Municipal de Belém, 2006). Besides, it has constant high relative humidity

about 85%.

Four samples of caged psittacine dried bird excreta were collected in three

avian stores located downtown and seven wood samples of different trees were

collected by scraping the inner decomposing wood of the hollow of each tree and

packed in sterile collector flask.

Processing was done according to Lazera et al. (1996). After homogenization,

1 g of each sample was suspended in 50 ml of sterile physiological saline solution

with chloramphenicol. The suspension was shaken for 5 min and allowed to settle for

30 min. Aliquots 0,1ml of the supernatant were streaked onto 10 plates of niger seed

agar (NSA).

Positive phenoloxidase isolated colonies were tested for in thermotolerance at

37ºC and cyclohexamide sensitivy. The canavanine-glycine-bromothymol blue (CGB)

medium was used to determine the species. Carbon and nitrogen compounds

assimilation was perform by employing the Vitek 32-BioMerieux System (Vitek ICB,

bioMeriux, Durham, USA). Serotyping was performed using of the Crypto check kit

(Iatron Laboratories, Tokyo, Japan). After identification the isolates were stored in

Skim Milk medium (DIFCO) at -20ºC.

DNA was extracted as modified protocol described from Ferrer et al. (2001).

Half an inoculation loop of culture was frozen at -20°C for 1 h and incubated at 65°C

for 1 h in 0.5 ml of extraction buffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 3% sodium

dodecyl sulfate, 1% 2-mercaptoethanol). The lysate was extracted with phenol-

chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1, v:v:v). DNA was recovered by isopropanol

precipitation, washed with 70% (v:v) ethanol and diluted in sterile water.

The mating type was determined using specific PCR primer pairs for mating

type α and a, according to Chaturvedi et al (2002). The α-mating-type-specific 5’

oligonucleotide primer was 5’-CTTCACTGCCATCTTCACCA-3’ and the 3’

oligonucleotide primer was 5’-GACACAAAGGGTCATGCCA-3’. The a-mating-type-

specific 5’ oligonucleotide primer was 5’-CGCCTTCACTGCTACCTTCT-3’ and the 3’

oligonucleotide primer was 5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’. Amplification

reactions were performed in a volume of 25 µl. The PCR amplicons were

electrophoresed in 2 % agarose gels in 1 x Tris-borate-EDTA (TBE) buffer at 100 V

152

for 60 min, and stained with ethidium bromide. Two type strains, ATCC 28957 (Mat

α) and ATCC 28958 (Mat a) were used as positive control.

URA5-RFLP analysis was performed as described by Meyer et al (2003). PCR

of the URA5 gene was conducted in a final volume of 25 µL. Each reaction contained

50 ng of DNA, 1X PCR buffer, (200 mM Tris pH 8.4, 500 mM KCl), 0.2 mM of each

dATP, dCTP, dGTP, and dTTP (Biotools, Spain), 2 mM magnesium chloride, 2.5 U

Taq DNA polymerase (Invitrogen, São Paulo, Brazil), and 25 ng of each primer URA5

(5'ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG3') and SJ01

(5'TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC 3'). PCR was performed for 35 cycles at

94°C for 2-min initial denaturation, 45 s of denaturation at 94°C, 1 minannealing at

61°C, and 2-min extension at 72°C, followed by a final extension cycle for 10 min at

72°C. PCR products were double digested with Sau96I (10 U/µL) and HhaI (20 U/µl)

for 3 h, and the fragments were separated by 3% agarose gel electrophoresis at 100

V. RFLP patterns were assigned visually by comparing them with the patterns

obtained from the standard strains (VNI-VNIV and VGI-VGIV).

Results

Out of the eleven environmental samples collected (droppings, 3, dust, 1 and

hollow trees, 7) two showed Cryptococcus spp. growth, 5 isolates from one sample of

budgerigar droppings and 2 from a hollow of a Senna siamea (Kassod tree). All C.

neoformans isolates were serotype A and one C. gattii isolate was serotype B. In the

Kassod tree hollow both C. neoformans and C. gattii were isolated, sharing the same

habitat. Mating type analysis (Figure 1) showed 100% MAT α. The RFLP profiles

showed 7 of the molecular type VNI and one VGII (Figure 2).

Figure 1. PCR amplification of environmental isolates with primers MATα1, MATα2 and MATa1, MATa2. Lanes: M Molecular weight marker: 100 bp DNA ladder; 1, LMM 1082; 2, LMM 1083; 3, LMM 1084; 4, LMM 1088; 5, LMM 1088; 6, LMM 1089; 7, LMM 1090; 8, ATCC 28957; 9, ATCC 28958; 10, negative control.

153

Figure 2. Molecular typing profiles generated via RFLP analysis of URA5 from environmental isolates. Lanes: M, Molecular weight marker: 100 bp DNA ladder; 1, LMM 1082; 2, LMM 1083; 3, LMM 1084; 4, LMM 1087; 5, LMM 1088; 6, LMM 1089; 7, LMM 1090; 8, LMM 794; 9, LMM 795; 10, LMM 796; 11, LMM 797; 12, LMM 798; 13, LMM 799; 14, LMM 800, 15, LMM, 801; 16, negative control. All samples are molecular types VNI, except lane 7 which is VGII. Lanes 8 to 15 are molecular type standard strains (VNI-VNIV and VGI –VGIV).

Discussion

The eco-epidemiology of C. neoformans and C. gattii has been extensively

studied in many regions of the world, including in Brazil. However, in the north of

Brazil only a few studies have been performed. Fortes, et al. (2001) demonstrated

the occurrence of C. gattii in Guettarda acreana in wild area from Amazon rainforest.

In the present study we report for the first time the isolation of C. neoformans and C.

gattii from enviromental sources in the city of Belém, Pará. The isolation of C.

neoformans and C. gattii sharing the same hollow in a Senna siamea tree is

important for the understanding of their life cycle in nature. Lazera et al. (2000)

reported for the first time the presence of both species in the hollow of a pink shower

tree in Teresina, (PI), northeast of Brazil, suggesting a possible link to their natural

life cycle.

The fact that all C. neoformans isolates in this study were mating type α

agrees with worldwide literature that indicates the predominance of Mat α in

environment and clinical isolates.

Recently Kidd et al. (2004) reported C. gattii molecular type VGII as the

causative agent of the cryptococcosis outbreak at the Vancouver Island (British

Columbia, Canada), characterized by temperate climate. In our study the detection of

the molecular type VGII reinforces that this genotype deserves more investigations in

other parts of the Brazilian Amazonia and other South American countries.

This study indicates that C. neoformans molecular type VNI and C. gattii

molecular type VGII, both presenting as mating type α, are present in the urban

environment of the city of Belém, Amazon region, adding new genotype and serotype

information about the molecular types in the north of Brazil.

154

ACKNOWLEDGEMENTS

We thank to Antonio Sérgio Lima (MPEG) for in the identification of botanic specimen

and to Roseane Norat for her technical assistance.

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Lazéra MS, Pires FDA, Camillo-Coura L, Nishikawa MM, Bezera CCF, Trilles L,

Wanke B 1996. Natural habitat of Cryptococcus neoformans var. neoformans in

decaying wood forming hollows in living trees. J Med Vet Mycol 34: 127-131.

Lazéra MS, Cavalcanti MAS, Londero AT, Trilles L, Nishikawa MM, Wanke B 2000.

Possible primary ecological niche of Cryptococcus neoformans. Med Mycol 38: 379-

383.

Lazéra MS, Gutierrez-Galhardo MC, Cavalcanti MAS, Wanke B 2005. Criptococose.

In: JR Coura, Dinâmica das Doenças Infecciosas e Parasitárias, V. II, Guanabara

Koogan SA, Rio de Janeiro, p. 1223-1235.

Licea BA, Garza DG, Zúñiga MT 1996. Aislamento de Cryptococcus neoformans var.

gattii de Eucalyptus tereticornis. Rev Iberoam Micol 13: 27-28.

Meyer W, Castañeda A, Jackson S, Huynh M, Castañeda E, 2003. Molecular typing

of IberoAmerican Cryptococcus neoformans isolates. Emerg Infect Dis 9:189-195.

Prefeitura Municipal de Belém 2006. Indicadores da Cidade de Belém. SEGEP.

Departamento de Pesquisa e Informação, Belém, p. 1-60.

Perfect JR, Casadevall A 2002 . Cryptococcosis. Infect Dis Clin N Am 16:837-874.

Pfeiffer TJ, Ellis DH 1991. Environmental isolation of Cryptococcus neoformans var.

gattii from California. J Infect Dis 163: 929-930.

156

ANEXOS

157

ANEXO 1

SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

LABORATÓRIO DE MICOLOGIA

TERMO DE CONSENTIMENTO

Projeto de pesquisa: FONTES AMBIENTAIS DE Cryptococcus neoformans NA

REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM-PARÁ

Eu,......................................................................................................................

com ........... anos de idade fui procurado(a) pela Profª. Solange do Perpétuo Socorro

Evangelista Costa (CRBM Nº 232), biomédica, professora e pesquisadora do

Laboratório de Micologia da Universidade Federal do Pará, oportunidade em que fui

informado sobre os objetivos da pesquisa, dentro do projeto acima citado, sob sua

coordenação. Compreendi que o objetivo principal desta pesquisa é investigar a

presença do fungo Cryptococcus neoformans, causador de micose denominada

criptococose, no ambiente domiciliar.

A Profª. Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa ou outro membro de

sua equipe justificou o objetivo da pesquisa porque deseja saber se paciente com

criptococose esteve exposto ao fungo causador da micose em ambiente domiciliar

e/ou áreas vizinhas. Ela explicou a mim e a meus familiares, que este estudo irá

contribuir para a entender se a presença deste fungo nos domicílios e/ou áreas

vizinhas está relacionada aos casos de criptococose ocorridos em Belém.

Também me esclareceram que, serei informado sobre o resultado da

pesquisa efetuada em minha residência. Segundo as informações prestadas, a

pesquisa consta de levantamento de dados pessoais, relacionados ao hábito do

paciente, bem como de informações acerca do domicílio e área vizinha, que serão

anotados em uma ficha própria.

Está claro que eu posso não querer participar desta pesquisa, e isso não

causará mal, nem a mim nem a minha família. Mas também foi dito e repetido que

não receberei nenhum pagamento por participar. Compreendido tudo isso, eu

autorizo que minha residência seja visitada e estudada, através da coleta de

materiais no interior e área externa de meu domicílio, inclusive permito fotografar

locais da residência, relacionados à pesquisa.

158

Foi garantido também que as informações dadas ao projeto são

secretas, e que a ninguém será informado sobre meu nome, ou de meus familiares,

como participantes da pesquisa.

Também fiquei ciente que caso tenha alguma reclamação a fazer deverei

procurar a Profª. Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa ou outro membro

de sua equipe (telefones: (091) 211-1549, e fax (091) 221-1602 ou a direção do

Centro de Ciências Biológicas da UFPA, cito a Rua Augusto Corrêa, 01, Bairro do

Guamá em Belém.

Por fim declaro que além de ler esse documento, recebi as explicações que

desejei da equipe do projeto, e por não ter mais dúvidas, concordo em participar

como voluntário do projeto e estudo agora proposto, o que fica confirmado pela

minha assinatura abaixo. Como Tenho Dificuldade (SIM � NÃO �), de entender o

escrito acima, atesto também que a profª Solange Do Perpétuo Socorro E. Costa (ou

um membro da sua equipe) leu pausadamente este documento e esclareceu as

minhas dúvidas, e como tem a minha concordância para participar do estudo,

coloquei abaixo a minha assinatura (ou impressão digital).

(Local) ..........................., ......... de ........................ de 2003

PESQUISADO NOME: ................................................................................................ Assinatura:___________________________________ IMPRESSÃO DATILOSCÓPICA (quando se aplicar)

TESTEMUNHAS: 1. NOME:.................................................................................................. Assinatura:________________________________________________ 2. NOME:.................................................................................................. Assinatura:________________________________________________

__________________________________ Profª. Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa

(DOCUMENTO EM DUAS VIAS, uma para ser entregue ao pesquisado)

159

ANEXO 2

Fontes ambientais de Cryptococcus neoformans na Região metropolitana de Belém/PA

ESTUDO AMBIENTAL

ESTADO DO PARÁ Município de Nº: ____________

Data: _____/_____/_______

Nome do Paciente: _____________________________________________________________

Endereço: ____________________________________________________________________

Número de residentes_______________________

Posição do Paciente na Família: [ ] Pai [ ] Mãe [ ] Filho [ ] Outro

Número de Cômodos : ______ Especificar : ________________________________________

Paredes: [ ] Alvenaria [ ] Madeira [ ] Taipa [ ] Outro

Piso:[ ] Cerâmica [ ] Cimento [ ] Carpete [ ] Tábua [ ] Terra [ ] Outro

Cobertura: [ ] Laje [ ] Telha de barro [ ] Telha de amianto [ ] Palha [ ] Outro

Presença de forro: [ ] Sim [ ] Não

AMBIENTE DOMICILIAR Acúmulo de Poeira: [ ] Sim [ ] Não Data da última limpeza: ____/____/______ Ventilação: [ ] Boa [ ] Ruim Umidade: [ ] Sim [ ] Não Iluminação Natural: [ ] Boa [ ] Ruim Condições de Higiene: [ ] Boa [ ] Ruim

Outras informações relevantes : _______________________________________________________

Presença de árvores: [ ] Mangueira [ ] Cajueiro [ ] Fícus [ ] Cássia [ ] Oitii [ ] Tento [ ] Mulungú [ ] Outras _______________________

Presença de aves: [ ] Pombo [ ] Galinha [ ] Arara [ ] Periquito [ ] Outras _________

Presença de animais: [ ] Morcego [ ] Gato [ ] Cachorro [ ] Outros _____________

Presença de insetos: [ ] Cupim [ ] Formiga [ ] Barata [ ] Outros _____________

Presença de outros animais: _________________________________________________________

PERIDOMICÍLIO:___________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________

Coleta de Material: [ ] Sim [ ] Não Número de amostras : _________________________

Descrição das amostras: _____________________________________________________________

_________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________

Investigador: __________________________________________

ESTUDO DE VARIEDADE [sim] [não] ESTUDO DE SOROTIPO [sim] [não] [ ] neoformans [ ] gattii [ A ] [ B ] [ C ] [ D ]

160

ANEXO 3. Documento de comprovação do Comitê de Ética e Pesquisa do HUJBB

161

ANEXO 4

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










http://www.livrosgratis.com.br/cat_1/administracao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_2/agronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_3/arquitetura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_4/artes/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_5/astronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_6/biologia_geral/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_11/comunicacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_47/turismo/1







de fontes ambientais na regiÃo metropolitana de …livros01.livrosgratis.com.br/cp112859.pdf ·...

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