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2 - Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento ano IX - nº 36 - janeiro/junho 2006 - 3

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ENTREVISTAENTREVISTAENTREVISTAENTREVISTAENTREVISTA

Células-tronco


A pesquisa de células-tronco no Brasil

“Nós ainda não conhecemosnem a pequena parte da biologia decélulas-tronco e as suas capacida-des são provavelmente muito mai-ores do que atualmente estimadas.”Esta constatação, praticamente umadécada depois de os primeiros estu-dos sobre o assunto serem publica-dos na prestigiosa revista Science, éfeita pelo cientista RadovanBorojevic, professor Titular da UFRJ(Universidade Federal do Rio de

Janeiro) e Chefe do Laboratório deBiologia Celular e Molecular do De-par tamento de His tologia eEmbriologia do ICB (Instituto de Ci-ências Biomédicas) da UFRJ.

Integrante do primeiro grupo depesquisadores, em todo o mundo, ecom sucesso, em 2001, a utilizar célu-las-tronco para tratamento de pacien-tes brasileiros portadores de insufici-ência cardíaca em estado avançado,Borojevic prevê nesta entrevista para

a Biotecnologia, Ciência & De-senvolvimento , que a MedicinaRegenerativa significará uma redu-ção nos gastos com a Medicina tradi-cional, com ganhos para os pacien-tes do Sistema Único de Saúde (SUS),e também para os usuários dos pla-nos de saúde, uma vez que estestambém vão aderir às terapias celu-lares.

Contrário à utilização de células-tronco embrionárias, Borojevic co-

Radovan BorojevicUniversidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ

Entrevista concedida aEdmilson Silva


Radovan Borojevic – A MedicinaRegenerativa está ainda no seu co-meço. Utilizam-se geralmente pro-genitores derivados de medula ós-sea, não purificados, mal caracteriza-dos nem expandidos. Os fatores decrescimento envolvidos e as matri-zes tridimensionais necessárias para

a organização espacial dos implantessão pouco conhecidos. Embora asinjeções de células da medula ósseatêm sido feitas em fígado de pacien-tes com doença hepática, nenhumbenefício para o paciente foi relata-do; o termo e o conceito de “terapia”não pode ser aplicado neste caso.Por isso, os melhores avanços foramobtidos em lesões que envolvemdefeitos vasculares, tais como infarto,obstrução e degeneração vascular, já

que naturalmente as células da me-dula óssea participam na neo-angiogênese, sempre quando existeuma deficiência de oxigenaçãotecidual. Avanços de conhecimentosbásicos e tecnológicos são necessári-os, e felizmente, numerosos gruposno mundo trabalham atualmente

memora sucessos como o de umgrupo de cientistas coordenados porNico Ferraz e Colin McGuckin, daUniversidade de Newscastle, da In-glaterra, que acabam de conseguircriar, em laboratório, células do fíga-do e lista as doenças contra as quaisa Medicina Regenerativa vem ob-tendo êxito, tais como na área dareparação de danos estéticos.

Este pesquisador, entretanto, écategórico quanto à expectativa deque a terapia celular possa evitar oenvelhecimento, sonho de muitosnessa época de culto desmedido aocorpo. Para ele, a MedicinaRegenerativa é capaz de aliviar osefeitos da degeneração tecidual, ga-rantindo a qualidade de vida, dimi-nuindo o sofrimento, ao dar qualida-de funcional e estética do corpo,gerando tranqüilidade e felicidade àspessoas que já conheceram a vida edevem aproveitar da sabedoria acu-mulada ao longo dos anos.

Borojevic descarta a possibilida-de de, dentro de meio século, ascélulas-tronco venham a estar dispo-níveis em farmácias, visto que estassão sempre retiradas da medula dopróprio paciente – não custa reiterarque ele é contrário à utilização dascélulas de embriões – e defende anecessidade de avanço dos conheci-mentos básicos e tecnológicos paramelhor conhecimento desse novomanancial terapêutico.

De nacionalidade francesa, masnaturalizado brasileiro, Borojevic ébiólogo pela Faculdade de Ciênciasde Zagreb, Croácia, com mestradona Faculté de Sciences, Universitéde Strasbourg, França, e doutoradoem Ciências na Universidade de Pa-ris, França. O pesquisador tem maisde 200 publicações entre livros erevistas científicas nacionais e es-trangeiros.

BC&D - As células-tronco já são usa-das com sucesso, ainda que experi-mentalmente, para o tratamento dealgumas doenças, principalmente ascardíacas e ortopédicas. Também seemprega para a regeneração do fíga-do de portadores de cirrose. Emtermos de Terapia Celular, quantoainda podemos avançar?

nessa área.

BC&D – O que era tido como pro-missor com a utilização das células-tronco se confirmou na prática? Oque se pode esperar do empregodelas no futuro?

Radovan Borojevic – Sim. As pos-sibilidades de terapias celulares con-tinuam crescendo, tanto em mode-los relativamente simples de injeçãodireta de células-tronco em tecidosdegenerados ou lesados, quanto embioengenharia de tecidos e órgãos invitro . Um bom exemplo nesta áreaé o sucesso recente de grupos decientistas britânicos na construçãode tecido hepático em laboratório.

BC&D – Uma das áreas cuja deman-da não pára de crescer é a de esté-tica. Quais são as perspectivas queas células-tronco proporcionam parao setor de embelezamento?

Radovan Borojevic – As terapiascelulares podem vir a ter uma amplaárea de atuação em cirurgia repara-dora. Inclui-se aqui o reparo de de-feitos estéticos (cicatrizes de acne,c icat r izes solares , r í t ides(enrugamento), envelhecimentocutâneo etc.). As possibilidades deatuação nessa área são muito am-plas.

BC& D – As células-tronco poderãoacabar com o envelhecimento?

Radovan Borojevic – Não. O en-velhecimento é um processo naturalda vida. Entretanto, as terapias celu-lares podem aliviar os efeitos dadegeneração tecidual, garantindo aqualidade de vida, diminuição desofrimento, qualidade funcional eestética do corpo, tranqüilidade efelicidade das pessoas que já conhe-ceram a vida e devem poder apro-veitar da sabedoria acumulada aolongo dos anos.

BC&D – Além do diabetes, qual é opotencial das células-tronco contraas doenças auto-imunes? Já se podepensar ou tem algum grupo de pes-quisa tentanto usar as células-tronco

“Cálculos realizados recente-mente no nosso grupomostram que o maior

beneficiário de terapiascelulares será o SUS

(Sistema Único de Saúde)”

"A pesquisa justifica qualquerprotocolo experimental, namedida que não causa mal

desnecessário a um dosenvolvidos. Sou contra o usoem terapia de humanos de

construções celulares, para asquais a previsibilidade dedestino a longo prazo é

praticamente nula"



para tratar ou repor o sistemaimunológico?

Radovan Borojevic – Várias doen-ças auto-imunes já podem receberterapia celular. Destacam-se resulta-dos clínicos relevantes em esclerosemúltipla, doença reumatóide juve-nil, Doença de Crohn etc. Para algu-mas doenças auto-imunes, a terapiacelular pode ser a primeira opçãoterapêutica.

BC&D – Um dos grandes temoresrelacionados ao uso das células-tron-co é o do desenvolvimento dos tu-mores, os teratomas. O estado-da-arte nesta área possibilita prever essetipo de problema, à medida que aMedicina Regenerativa tende a sepopularizar?

Radovan Borojevic – O apareci-mento de teratomas acompanha asterapias experimentais usando as cé-lulas-tronco embrionárias. A meu co-nhecimento, não há relatos do apa-recimento de teratomas consecutivoao uso de células-tronco autólogasde pacientes adultos, e esse perigo éatualmente considerado muito re-moto.

BC&D – Até quando as células-tron-co serão utilizadas como curingashisto e fisiológicamente?

Radovan Borojevic – Nós aindanão conhecemos nem a pequenaparte da biologia de células-tronco eas suas capacidades são provavel-mente muito maiores do que atual-mente estimadas.

BC&D – Como anda a utlização decélulas-tronco para regeneração ós-sea? E na regeneração do tecidocerebral?

Radovan Borojevic – Para a rege-neração óssea, os ensaios clínicos jáestão sendo realizados no caso denecrose avascular da cabeça defêmur, pela equipe de ortopedia daUniversidade Federal da Bahia(UFBA), em Salvador, sob a direçãodo professor doutor, Gildásio C.Daltro, com resultados extremamen-

te promissores. A traumato-ortope-dia é um dos campos em que amedicina regenerativa está fazendoavanços rápidos, e várias aplicaçõesclínicas já estão sendo planejadas.Em patologia do cérebro, avançospromissores foram obtidos no casode acidente vascular cerebral (AVC),embora nesse caso a lesão primáriaseja vascular e não do tecido nervo-so. Resultados também promissores

estão sendo obtidos em modelosexperimentais de várias doençasdegenerativas do tecido cerebral, epodemos prever avanços clínicospara os próximos anos.

BC&D – Atualmente, há cientistasfalando em transdiferenciação celu-lar. Em que aspectos se diferenciada chamada “ diferenciação celular”?

Radovan Borojevic – Trata-se deuma questão semântica. Rigorosa-mente falando, a transdiferenciaçãoé a transformação estrutural e funci-onal de uma célula diferenciada emoutra. O termo diferenciação se apli-ca em geral à aquisição de estruturase funções específicas em uma célulaprogenitora, pouco diferenciada. Atransdiferenciação envolve geralmen-te a perda de um conjunto de carac-terísticas específicas, adquirindo amorfologia ou mesmo a função deuma célula progenitora.

BC&D – Além dos aspectos técni-cos, é forçoso abordar a questãoética quando se trata da utilizaçãodas células-tronco. Em outros países,à propostas de fusão de células hu-manas com óvulos de animais, paraque, do híbrido gerado, se possautilizar as células embrionárias em

estudos. Como avalia essa questão?

Radovan Borojevic – A pesquisajustifica qualquer protocolo experi-mental, na medida que não causamal desnecessário a um dos envolvi-dos. Sou contra o uso em terapia dehumanos de construções celulares,para as quais a previsibilidade dedestino a longo prazo é praticamen-te nula.

BC&D - Também em outros paíseshá cientistas que pretendem usar osembriões para criar células-troncocom defeitos genéticos responsá-veis por doenças neurológicas, vi-sando a reprogramação dos tecidosadultos e o conseqüente tratamentode doenças degenerativas. Esse tipode proposta é viável, é promissora?

Radovan Borojevic – O estadoatual de conhecimentos não justificaeste tipo de propostas

BC&D – Pode-se aventar que, futu-ramente, daqui a 50 anos por exem-plo, será possível comprar células-tronco nas farmácias?

Radovan Borojevic – Não. As célu-las-tronco são normalmente deriva-das do próprio paciente e devem seradaptadas às necessidades específi-cas de cada um dos pacientes.

BC&D – E do ponto de vista econô-mico, corre-se o risco de diferencia-ção de qualidade na MedicinaRegenerativa, ou seja, ter uma “me-dicina” para os mais ricos e outraomenos requintada para as classesmenos favorecidas?

Radovan Borojevic – Cálculos reali-zados recentemente no nosso grupomostram que o maior beneficiário deterapias celulares será o SUS (SistemaÚnico de Saúde), pela diminuição detempo de internação de pacientes,redução de pagamento de pensões ede indenizações por invalidez, e de-créscimo global do custo social daMedicina. Em breve, tanto o SUSquanto os planos de saúde optarãopelas terapias celulares, semprequando clinicamente possível.

“Nós ainda não conhecemosnem a pequena parte da

biologia de células-tronco eas suas capacidades sãoprovavelmente muito

maiores do que atualmenteestimadas”



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Colaboraram nesta edição

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FundadorDr. Henrique da Silva Castro

Direção Geral e EdiçãoAna Lúcia de Almeida

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Os artigos assinados são deinteira responsabilidade

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ISSN 1414-6347

NOTA: Todas as edições da Revista BiotecnologiaCiência & Desenvolvimento estão sendo indexadaspara o AGRIS (International Information System forthe Agricultural Sciences and Technology) da FAOe para a AGROBASE (Base de Dados da AgriculturaBrasileira).

Portal Biotecnologia - www.biotecnologia.com.br

Alexander de AndradeAna Paula Schneider LucionAndreas K. GombertAntonio FigueiraCarlos Alberto LabateCatarina Paula da Silva RamosDieter Rugard SiedembergerEdmilson SilvaElisângela Nedel MarascaFrancisco Harrison de Brito PereiraFrederico Augusto Ribeiro de BarrosJanaína de Cássia AlbinoJoão Batista de Almeida e SilvaLarissa CanilhaLidia Mariana FiuzaLuciana Harumi Morimoto FigueiredoMaria Isabel de Oliveira PenteadoMariana Brayner CavalcantiMariana de Souza CastroNeiva KnaakPaola A. F. CeledónPatrícia Teles MedeirosPaulo César StringhetaRadovan BorojevicRaul Antônio Morais MeloRicardo Bastos CunhaSilas Granato Villas-BôasSilvana CresteThiago Martins Sampaio de LacerdaUbirajara Machado TeixeiraWagner FontesWalter de CarvalhoWashington Batista das Neves

ENTREVISTENTREVISTENTREVISTENTREVISTENTREVISTAAAAACélulas-tronco no Brasil - Radovan Borojevic pág. 04

MEIO AMBIENTEMEIO AMBIENTEMEIO AMBIENTEMEIO AMBIENTEMEIO AMBIENTEDesenvolvimento sustentável pág. 70

PPPPPAAAAATENTETENTETENTETENTETENTEPatentes em Biotecnologia pág. 32

PESQUISAPESQUISAPESQUISAPESQUISAPESQUISAO proteoma da madeira pág. 10

Microencapsulamento de antocianinas pág. 18

Genes cry1Ab e cry1Ac de Bacillus thuringiensis pág. 26

Espectrometria de massa de proteínas pág. 40

Biocatalizadores imobilizados pág. 48

Análise do metaboloma pág. 58

Mapa de risco em laboratório clínico pág. 78

Mapeamento genético da cana-de-açúcar pág. 82

Conselho CientíficoDr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento VegetalDr. Henrique da Silva Castro - Saúde;Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia;Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;Dr. Naftale Katz - Saúde;Dr. Pedro Jurberg - Ciências;Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.

Conselho Brasileiro de Fitossanidade - CobrafiDr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia

Fundação Dalmo Catauli GiacomettiDr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos

Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPENDr. José Roberto Rogero

Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotecDr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPADr. Diógenes Santiago Santos - UFRGSDr. José Luiz Lima Filho - UFPEDra. Elba P. S. Bon - UFRJ


O Proteoma daMADEIRA

Introdução

O setor florestal contribui deforma relevante para o desenvolvi-mento de vários países, em termosde geração de renda, tributos, em-pregos, divisas e na promoção dodesenvolvimento regional. No Brasilo setor de base florestal oferececerca de 3 milhões de empregosdiretos e indiretos, participando com4% do PIB nacional e 7,3% do totalexportado (LEITE, 2005).

A madeira é o quinto mais im-portante produto do comércio mun-dial (PLOMION et al., 2001). Além

de ser uma formidável fonte naturale renovável de energia e fibras (pa-pel e celulose), durante a sua forma-ção ocorre uma grande incorporaçãode CO

2, contribuindo com a redução

do aquecimento global (PLOMIONet al., 2001). A expectativa de cres-cimento do consumo da madeira paraa próxima década é de 20%, enquan-to que a cobertura florestal naturalmundial declina a uma média anualde 9,4 mi lhões de hectares(BOERJAN, 2005). Para atender aesta demanda e reduzir a pressãosobre as florestas nativas é necessá-ria a obtenção de árvores mais pro-dutivas, resistentes a fatores bióticose abióticos e com madeira de altaqualidade, conforme a finalidade deseu uso. Dentro deste contexto, di-ferentes programas de pesquisa es-tão sendo desenvolvidos por insti-tuições públicas e privadas, utilizan-do técnicas como o mapeamentogenético, transgenia, genômica,transcrissoma e proteômica, aliadasao melhoramento convencional, bus-cando compreender os mecanismosenvolvidos com o desenvolvimentoda madeira.

A formação da madeira é umprocesso complexo que envolve mui-tos eventos biológicos os quais sãocoordenados por uma ampla variedadede fatores endógenos (fitohormônios),exógenos (fotoperíodo e temperatura) epela interação entre ambos. O pro-cesso é dirigido pela expressão or-denada de numerosos genes estru-turais e regulatórios (muitos dos quaisainda não conhecidos) envolvidosnos diferentes estádios de sua for-mação. A expressão destes genes éresponsável pela formação dos dife-

PESQUISA

O uso da proteômica no estudo da formação da madeira

Alexander de AndradeEngenheiro AgrônomoDoutor em Genética e Melhoramento de PlantasPesquisador, ESALQ, [email protected]

Paola A. F. CeledónBióloga, Doutora em Genética e Melhoramento dePlantas, Pesquisadora, ESALQ , USP

Carlos Alberto LabateEngenheiro AgrônomoProfessor Dr. Departamento de GenéticaESALQ, USP.

Imagens cedidas pelos autores

Figura 1 – Tecidos que compõem a madeira. (A) Corte transversal do caule deEucalyptus grandis; (B) Esquema dos tecidos que formam a madeira


rentes tecidos que compõem as ár-vores. Apesar de sua importância oconhecimento das principais etapasenvolvidas com a formação da ma-deira ainda está distante de ser com-pleto. Com raras exceções, muitopouco é conhecido sobre os proces-sos celulares, moleculares ebioquímicos responsáveis pelo seudesenvolvimento (PLOMION, 2001;CHAFFEY, 2002).

A Biotecnologia e odesenvolvimento da madeira

A análise molecular de espéciesflorestais apresenta dificuldades de-vido a aspectos de sua biologia comoo longo ciclo de vida, falta demutantes e de linhagens puras (DUet al., 2006). Mesmo assim grupos depesquisa nacionais e internacionaistêm dedicado esforços à compreen-são dos mecanismos genéticos emoleculares envolvidos na formaçãoda madeira em árvores. Por sua im-portância, principalmente para a in-dústria de papel e celulose, umagrande atenção vem sendo destina-da à compreensão das vias metabó-licas envolvidas na síntese da celulo-se e lignina (POKE et al., 2005), e naidentificação dos vários genes en-volvidos nesses processos. A desco-berta de genes relacionados princi-palmente com a síntese destes doispolímeros abre novas perspectivas

para a manipulação genética com afinalidade de alterar suas concentra-ções na madeira, tornado-a mais pro-dutiva e atrativa para a indústria.Estudos com árvores transgênicas deálamo têm demonstrado que a alte-ração da expressão de genes relaci-onados com a rota metabólica dalignina pode alterar a sua composi-ção e quantidade na madeira. A prin-cipal conseqüência da redução daquantidade e composição da ligninana madeira é a diminuição do uso deprodutos químicos empregados du-rante o processo de sua extração naprodução de papel e celulose, redu-zindo custos e minimizando os im-pactos ambientais (BAUCHER et al.,2003).

Dentre as tecnologias mais utili-zadas no estudo do desenvolvimen-to da madeira estão os microarranjosde cDNAs ou oligonucleotídeos, osquais têm identificado genes prefe-rencialmente expressos em tecidoscomo xilema (HERTZBERG et al.,2001). Normalmente estes estudostêm utilizado como sistema modeloà comparação entre madeiras juvenile adulta (EGERTSDOTTER et al.,2004) e submetidas a diferentes con-dições como a madeira normal e detensão (PLOMION et al., 2003).

Uma região considerada comouma importante fonte de informa-ções é a zona cambial, formada porum tecido meristemático localizado

no caule que por diferenciação celu-lar forma as células especializadasque compõem os tecidos vasculares(Figura 1) do xilema e do floema. Ocâmbio é uma excelente fonte decélulas para estudos, pois o tecido érico em proteínas e ácidos nucléicose ainda não é lignificado. A zonacambial já foi utilizada para identifi-car genes (SCHARADER et al., 2004)e mais recentemente proteínas con-sideradas importantes para a forma-ção da madeira de Populus(VANDER-MIJNSBRUGGE et al.,2000), Pinus (GION et al., 2005) eEucalyptus (ANDRADE, 2006;CELEDÓN, 2006; MEIRELES, 2006).

A era “Pós-Genômica”

Os dados gerados pelosequenciamento do genoma, embo-ra relevantes, são limitados, tornan-do necessária a integração com ou-tras técnicas que permitam estudartanto os processos de transcrição dasinformações contidas nos genesquanto os seus produtos; as proteí-nas. Esta constatação deu início auma nova etapa na pesquisa biológi-ca conhecida como “Era Pós-Genômica”, promovendo o desen-volvimento e o aperfeiçoamento detécnicas utilizadas no estudo de trans-critos (transcrissoma), proteínas(proteômica) e metaból i tos(metabolômica), todas integradaspela bioinformática (PALSSON, 2002;WECKWERTH et al., 2004). Aproteômica tem ganhado destaquepor complementar e sercomplementada pelos dados gera-dos pela genômica e pelatranscrissoma, representando umaponte de ligação entre os genes e osseus produtos, as proteínas. Os re-centes avanços na proteômica, comoa introdução da espectrometria demassas para a anál ise demacromoléculas, unidos a técnicasanalíticas bem conhecidas como aelet roforese bidimensional ,eletroforese capilar e a cromatografialíquida e a gasosa, possibilitaram oestudo de processos fisiológicos com-plexos e dinâmicos (PATTERSON eAEBERSOLD, 2003), como a forma-ção da madeira em árvores. Atual-

Figura 2 – Fluxo experimental usado pela proteômica na identificação deproteínas e genes envolvidos na formação da madeiras


mente a eletroforese bidimensionalcombinada com a espectrometria demassas (Figura 2) são as técnicasmais usadas na análise do proteomade árvores.

A proteômica permite conhecero produto final de um gene, suaspropriedades químicas e locais deatuação na célula, o que é impossí-vel prever a partir de seqüências deDNA devido às etapas deprocessamento pós-transcricional epós-traducional (gl icosi lação,fosforilação, acetilação, etc.) quemodulam a atividade de uma prote-ína. Por outro lado, um produto gênicomuitas vezes não atua isoladamente,estando com freqüência envolvidoem interações com o produto deoutros genes para a formação decomplexos moleculares funcionais.Desta maneira, para os estudos deexpressão gênica fazem-se necessá-rias estratégias que desvendem aregulação da funcionalidade das pro-teínas e sua influência no metabolis-mo da planta, permitindo esclarecerse a regulação de um determinadogene ocorre durante as etapas detranscrição ou tradução (VAN WIJK,2001). O conhecimento do controleda expressão gênica está sendocomplementado pela proteômica eabre a possibilidade de identificarnovos genes alvos, os quais podemser usados na manipulação genéticade plantas (PANDEY e MANN, 2000;PIMENTA, 2003).

Extração deproteínas da madeira

A chave do sucesso na análisede qualquer proteoma está relacio-nada primeiramente com uma boaetapa de extração e purificação dasproteínas do material analisado. Amelhor preparação da amostra éaquela que utiliza um menor númeropossível de reagentes com a mínimamanipulação. Além disso, deve ex-trair o maior número de proteínascom a mínima perda e modificaçãodas moléculas durante o preparo daamostra, para evitar interferênciasnas etapas de separação e identifica-ção (DUNN, 1993; GÖRG et al.,2004). Normalmente tecidos de plan-tas apresentam baixas concentrações

de proteínas e são ricos em compos-tos que interagem com as proteínasdurante a extração (como proteases,compostos fenólicos, pigmentos ecarboidratos), interferindo e redu-zindo a reprodutibilidade durante aanálise (CARPENTIER et al., 2005).Em plantas lenhosas, estes compos-tos são ainda mais abundantes, espe-cialmente em tecidos lignificadoscomo a madeira (VÂLCU e SCHLINK2006). Os compostos que interfe-rem na extração e purificação dasproteínas são específicos para cadaespécie, tecido ou ainda o estádio dedesenvolvimento, por isso existe anecessidade de otimizar o processode acordo com a amostra analisada(GÖRG et al 2004). Além disso, fato-res ambientais, como a seca, podemalterar as características de um teci-do, necessitando de preparos adicio-nais durante a extração.

Dentre os diferentes métodosde extração utilizados na análise doproteoma de plantas, a extração comTCA e acetona (DAMERVAL et al.,1986) é a mais difundida. O métodopossibilitou a obtenção de bons re-sultados na extração de proteínas damadeira em desenvolvimento e detensão de Pinus pinaster (GION etal., 2005). Uma vantagem do méto-do é a imediata precipitação dasproteínas com simultânea inativaçãode compostos envolvidos em suadegradação, como as proteases(VÂLCU e SCHLINK, 2006).

Outro método envolve asolubilização das proteínas com fenolmisturado a uma fase aquosa e sub-seqüente precipitação com metanole acetato de amônio (HURKMAN eTANAKA, 1986). Neste método deextração, os ácidos nucléicos ecarboidratos solubilizam-se preferen-cialmente na fase aquosa, enquantoas proteínas permanecem no fenol,com a vantagem da proteólise serminimizada na presença do solvente.Este método já foi utilizado para aextração de proteínas da casca e damadeira de álamo (VANDER-MIJNSBRUGGE et al., 2000), e detecidos da madeira de Eucalyptusgrandis em diferentes estádios dodesenvolvimento (ANDRADE, 2006;CELEDÓN, 2006; MEIRELES, 2006).É uma estratégia bastante eficiente,

porém deve ser usada com precau-ção devido à toxidez do fenol.

O uso de detergentes como oSDS (sodium dodecyl sulfate) podeser uma estratégia alternativa quan-do deseja-se favorecer o enriqueci-mento de proteínas citosólicas e demembrana. A comparação entre ostrês métodos de extração (Figura 3),com tecidos da zona cambial de ár-vores de 3 anos de eucalipto, de-monstrou que diferentes grupos deproteínas foram favorecidos confor-me a estratégia adotada.

Separação das proteínas

A principal estratégia usada pelaproteômica durante a etapa de sepa-ração de proteínas é a eletroforesebidimensional (2D-PAGE). A técnicapermite a separação, detecção equantificação de milhares de proteí-nas simultaneamente presentes emuma amostra complexa, através dacombinação da focalização isoelétricae da eletroforese em gel depoliacrilamida desnaturante. Aeletroforese bidimensional separa asproteínas pela sua carga (focalizaçãoisoelétrica ou IEF) na primeira di-mensão e pelo seu peso molecular(SDS-PAGE) na segunda dimensão(Figura 4). Quando realizadas isola-damente, as técnicas de IEF e deSDS-PAGE permitem a separação deaproximadamente 100 proteínas deuma amostra heterogênea, porém,quando combinadas permitem a se-paração teórica de cerca de 10000spots individuais. Na prática um gelde 2D-PAGE com alta resolução per-mite a visualização de aproximada-mente 3000 proteínas dependendoda amostra e da sensibilidade datécnica de revelação, embora já te-nham sido descritos géis com 10000spots (KLOSE e KOBALZ, 1995).

Nos últimos anos com o desen-volvimento de novas técnicas analí-ticas e com o aperfeiçoamento dapreparação das amostras, a técnica2D-PAGE sofreu uma evolução sur-preendente, aumentando a sua reso-lução, sensibilidade e repetibilidade,tornando-se amplamente usada naseparação e identificação de proteí-nas. Entretanto, existem ainda difi-culdades associadas a esta técnica


como baixa resolução dos spots emalgumas faixas de PM e pI, poucasensibilidade para detecção de pro-teínas de baixa concentração e pe-quena representação de proteínashidrofóbicas. Estas dificuldades téc-nicas vêm sendo superadas, com ummaior número de repetições por tra-tamento (RUBINFELD et al., 2003),uso de sofisticados programas deimagem de géis (ROGER et al.,2003), seleção de faixas de pH es-treitas as quais aumentam a resolu-ção da amostra (GÖRG et al., 1999),enriquecimento de frações de prote-ínas baseado em características quí-micas (CORTHALS et al ., 2000) eaplicação de protocolos específicospara recuperação de proteínas debaixa solubilidade (MÉCHIN et al.,2003).

A eletroforese bidimensional éutilizada preferencialmente na com-paração de proteomas em diferen-tes estádios fisiológicos ou de desen-volvimento, onde a observação deproteínas diferencialmente expres-sas, permite inferir o envolvimentodos genes correspondentes a cadaestádio em questão. O uso da técnicana separação de proteínas da madei-ra de diferentes espécies como pinus,álamo e o eucalipto, tem revelado apresença de múltiplos spots de umamesma proteína em géisbidimensionais (Figura 5). A presen-ça de diferentes spots de uma mes-ma proteína pode indicar e auxiliarna compreensão de eventos como:

• Modificações pós-traducionais;• Variações alélicas de um mes-

mo gene (isoformas);

• Produtos de genes parálogos;• Eventos provenientes do splicing

alternativo.Em árvores de interesse flores-

tal, a separação de proteínas por 2D-PAGE tem sido utilizada na compara-ção entre: proteínas da madeira e detecidos fotossintetizantes em pinus(COSTA et al.,1999), na sazonalidadede proteínas durante o ano em dife-rentes tecidos de álamo (VANDERMIJNSBRUGGE et al., 2000), no es-tudo de madeira normal e de tensão(PLOMION et al , 2003), no estudodas proteínas da madeira de Pinuspinaster (GION et al., 2005) e deEucalyptus grandis (Figura 6) emdiferentes estádios do desenvolvi-mento (ANDRADE, 2006; CELEDON,2006; MEIRELES, 2006).

Identificação esequenciamento de

proteínas

As principais técnicas usadas naidentificação e sequenciamento depeptídeos e proteínas são a degrada-ção de Edman e a espectrometria demassas (MS). Embora a degradaçãode Edman seja amplamente usada,tem como limitações: baixa sensibi-lidade e consome muito tempo (emmédia uma hora por aminoácido),sendo incompatível com proteínasque apresentam a região N-terminalbloqueada (PENG e GYGI, 2001).Atualmente a ultra-sensibilidade eresolução dos espectrômetros demassas têm desempenhado um im-portante papel na identificação deproteínas (Figura7), permitindo quemesmo aquelas presentes embaixíssimas concentrações possamser analisadas e identificadas, comrapidez e robustez nas análises.

O uso da espectrometria de mas-sas por muito tempo ficou restrito aum pequeno número de moléculascapazes de resistir ao método deionização e ao processo de análiseque envolve a sua transferência paraum sistema de alto vácuo e altastemperaturas, sendo um obstáculono estudo de biomoléculas como asproteínas. No final dos anos 80, como desenvolvimento de dois novosmétodos de ionização branda (Figu-ra 8) o MALDI (Matrix-Assisted Laser

Figura 3 – Avaliação dos métodos de extração por eletroforese bidimensionaldas proteínas do caule de Eucalyptus grandis com 3 anos. Em (a) foi realizadaextração com fenol, (b) extração com TCA e na (c) com SDS. A focalização foirealizada em um gradiente de pH linear de 4-7. Coloração com coomassiebrilhante blue G250

Figura 4 Etapas usadas na separação de proteínas por eletroforese bidimensional.(A) retirada do tecido, (B) extração e purificação das proteínas, (C) obtenção de umextrato livre de impurezas, (D) aplicação da amostra e da fita de acrilamida comgradiente de pH, (E) focalização isoelétrica, separação conforme seu pontoisoelétrico, (F) SDS-PAGE, separação pelo peso molecular, (G) gel 2D-PAGE damadeira de Eucalyptus grandis corado com coomassie brilhante blue


Desorption Ionization) e o ESI(Electrospray Ionization), ocorreuuma revolução na análise debiomoléculas. Estas novas técnicasforam tão importantes que seus cri-

adores, Koishi Tanaka (MALDI) eJohn Fenn (ESI) ganharam o PrêmioNobel de Química em 2002.

No início dos anos 90 as novastécnicas de ionização branda, associ-

adas com o desenvolvimento denovos algoritmos computacionais,permitiram correlacionar dados obti-dos de um espectro de massas debiomoléculas com seqüências exis-tentes em bancos de dados. Esteevento marcou a transformação daMS no estudo em larga escala e dastécnicas usadas na genômica funcio-nal (MANN e WILM, 1995; MANN etal., 2001).

O sucesso dos métodos deionização MALDI e ESI e o desenvol-vimento de analisadores de massaem seqüência (tandem), levaram aum grande aumento na resolução esensibilidade do método, tornando-ouma ferramenta obrigatória nas aná-lises estruturais e químicas depept ídeos e prote ínas . Osespectrômetros de massa atuais per-mitem selecionar uma só moléculaionizada, fragmentá-la (colisão comum gás inerte) e através da análisedas massas dos fragmentos conhecera estrutura da molécula original, per-mitindo determinar, por exemplo, aseqüência de aminoácidos de umpeptídeo ou uma alteração químicaespecífica em algum resíduo deaminoácido (PIMENTA, 2003;PATTERSON e AEBERSOLD, 2003;STEEN e MANN, 2004).

Diversos laboratórios têm ado-tado o uso do MALDI e do ESI emsuas estratégias de identificação esequenciamento de proteínas. Porusarem diferentes princípios deionização e distintas limitações, ouso dos dois métodos tem levado aum maior número de moléculasidentificadas, além de aumentar arapidez e a confiabilidade das análi-ses. Normalmente o MALDI-TOF-MSé usado primeiramente para deter-minar a massa da proteína e após asua digestão com tripsina, seuspeptídeos são separados, normal-mente por cromatografia líquidaacoplada diretamente noespectrômetro de massas (ESI-TOF-MS/MS) e seqüenciados(GIORGIANNI, 2003).

Situação atuale perspectivas do

proteoma da madeira

Os trabalhos de proteoma en-

Figura 6 – Padrão da expressão de proteínas do caule Eucalyptus grandis emdiferentes idades, separadas por eletroforese bidimensional, (figura do gel de árvoresde 6 anos retirado e modificado de MEIRELES, 2006)

Figura 5 – Exemplos de proteínas do caule de eucalipto encontradas em diferentesspots; (a) isoflavona redutase, (b) tubulina e (c) 14-3-3

Figura 7 – Etapas usadas na identificação e sequenciamento de proteínas. (A) O gel2D-PAGE é escaneado, (B) análise do gel por programas de imagem, (C) proteínasde interesse são retiradas do gel, digeridas com tripsina e seqüenciadas porespectrometria de massas, (D) obtenção dos espectros de massa (E) através da análisee interpretação dos espectros de massas é encontrado a seqüência dos aminoácidosque compõem os peptídeos, (F) com a seqüência dos diferentes peptídeos éidentificada a proteína


Tabela 1. Proteínas mais abundantes em ordem decrescente encontradas no proteoma do Eucaliptus grandis e Pinus pinaster

Eucalyptus grandis Pinus pinaster

Proteína Função Proteína Função

S adenosylmethionine Metabolismo de aminoácidos Actin Citoesqueleto

Isoflavone reductase Metabolismo secundário Tubulin beta Citoesqueleto

Actin Citoesqueleto S adenosylmethionine synthase Metabolismo de aminoácidos

HSP 70 KDa Resposta a estresse Tubulin alpha Citoesqueleto

CAffeic acid 3-O-methyltransferase Síntese de lignina HSP 70 KDa Respostas a estresse

Enolase Energia Isoflavone reductase Metabolismo secundário

ATP synthase beta chain Energia ATP synthase beta chain Energia

Tubulin alpha Citoesqueleto Caffeic acid 3-O-methyltransferase Síntese de lignina

Tubulin beta Citoesqueleto L-ascorbate peroxidase Energia

Fructokinase Energia 14-3-3 Regulação intracelular

14-3-3 Regulação intracelular Triosephosphate isomerase Energia

Glutamine synthase Metabolismo de nitrogênio Enolase Energia

Phosphoglycerate kinase Energia UDP-glucose protein transglucosylase Energia

UDP-glucose pyrophosphorilase Energia S-Adenosyl-L-homocysteine hidrolase Metabolismo de aminoácidos

volvendo a formação da madeira sãorecentes, porém têm demonstradoque entre diferentes espécies comoo pinus e o eucalipto (Tabela 1) asproteínas mais expressas estão en-volvidas no metabolismo de energiae em mecanismos de defesa. Alémde mecanismos responsáveis pelasíntese de celulose, hemicelulose elignina, os compostos mais abundan-tes da madeira. O proteoma da ma-

deira tem demonstrado também queexiste uma grande similaridade en-tre as proteínas de angiospermas egimnospermas (COSTA et al., 1999).

A similaridade entre a abundân-cia e homologia de proteínas dediferentes espécies indica a existên-cia de metabolismos conservados re-lacionados direta ou indiretamentecom a formação da madeira em dis-tintos grupos taxonômicos. Possivel-

mente diferenças significativas po-derão ser encontradas através daanálise de proteínas de menor abun-dância, que devem incluir fatores detranscrição, envolvidos com o con-trole da expressão gênica. A mudan-ça na expressão destes genes deveser a grande responsável pela dife-rença observada entre as caracterís-ticas da madeira de diferentes espé-cies.

Figura 8 – Fontes de ionizaçãobranda usada na proteômica. (A)Esquema do MALDI-MS. A matrize a amostra são aplicadas em umaplaca de metal (B) e, apüs aevaporação do solvente, asmoléculas da amostra cristalizamcom a matriz. Esses cristais sãoentão bombardeados com umfeixe de raio laser, ionizando asmoléculas para serem detectadaspelo espectrômetro de massas. (C)Esquema do ESI-MS. A amostra édissolvida em um solvente volátile injetada por um tubo capilarmetálico sobre o qual é aplicadauma voltagem (D); o resultado éum aerossol de analíto e solvente.A alta temperatura da fonte provocaa evaporação do solvente,produzindo íons protonados paraa análise.

Espectrômetrode massas

Feixede

laser

Detector

Filtro de massa

Aceleração porpotencial elétrico

Placa com a amostra e a matrizsubmetida a alta voltagem

Matriz

Analito

Misturade

peptídeosColuna Descarga

elétrica

Capilar

Formação deum spray

MS


A técnica de separação empre-gada nestes trabalhos envolve aeletroforese bidimensional, a qualpossui como limitação a separaçãode proteínas hidrofóbicas de mem-brana (RABILOUD et al., 1997), debaixa abundância, com pesomolecular muito baixo (< 10KDa),bem como as de maior peso molecular(> 200 KDa) e as extremamenteácidas ou básicas (HARDER et al.,1999). A combinação de diferentesestratégias de separação no estudodo desenvolvimento e formação damadeira como a cromatografia líqui-da multidimensional e a eletroforesecapilar, poderá isolar grupos de pro-teínas com menor representatividadenos géis bidimensionais, como fato-res de regulação, e que podem serresponsáveis por controlar caracte-rísticas de importância para o setorflorestal.

A disponibilidade dos dados ge-rados pelo sequenciamento dogenoma de espécies com importân-cia florestal como o eucalipto, pinuse o álamo irão aumentar a taxa deidentificação de proteínas porespectrometria de massas. Além deesclarecer questões sobre as rotasmetabólicas envolvidas em sua for-mação e as enzimas que atuam noprocesso, auxiliando no isolamentode genes estruturais e que regulam aformação da madeira (ZHONG et al .,2005) disponibilizando novas possi-bilidades para o melhoramento ge-nético de árvores de interesse flores-tal.

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Microencapsulamento deANTOCIANINAS

Uma alternativa para o aumento de sua aplicabilidade como ingrediente alimentício

1. Introdução

É fato conhecido que a cor é umatributo que influencia de forma de-cisiva na preferência do consumidorao adquirir determinado alimento.Geralmente, afeta o julgamento, sen-do utilizada como forte indicador dequalidade. Assim, o desenvolvimen-to de produtos de aparência atrativaé importante para a indústria dealimentos.

Considerando que a manuten-ção da cor original no produto pro-cessado e armazenado é um fator dequalidade, a adição de corantes arti-ficiais tornou-se prática usual e ne-cessária, devido a sua maior estabili-dade. Para os vários tipos de pig-mentos naturais esta manutenção é,muitas vezes, difícil pelas possibili-dades de transformação que estespodem sofrer. A utilização doscorantes naturais requer o conheci-mento químico de suas moléculaspara adaptá-las às condições de usoem processos, embalagens e distri-buição (ARAÚJO, 1999).

Recentemente, os corantes arti-ficiais têm sido questionados por cer-tos segmentos da população, e estatendência, aliada à publicidade con-tínua e adversa, tem aumentado ointeresse pelos corantes de origemnatural. Assim, o uso de corantesnaturais em produtos alimentícios éuma tendência atual, principalmen-te pelo seu forte apelo de marketing,em razão dos consumidores deman-darem cada vez mais produtos natu-rais e que tragam benefícios para asaúde.

As antocianinas são pigmentos

naturais, hidrossolúveis, bastante co-nhecidos, pois determinam a colora-ção característica de uma grande va-riedade de vegetais, incluindo aque-les usados na alimentação humana.Estes pigmentos têm sido, portanto,consumidos pelo homem porincontáveis gerações sem causaraparentemente qualquer efeito so-bre a saúde. Apesar disso, seu usocomo aditivo natural está ainda bas-tante restrito em função de limita-ções, como a disponibilidade dematéria-prima produtora de pigmen-tos na quantidade e na qualidaderequerida, a dificuldade na sua puri-ficação, o poder corante reduzidoquando comparado aos produtos sin-téticos e, principalmente, a baixaestabilidade apresentada pelasantocianinas (STRINGHETA, 1991).

O corante antocianina é encon-trado em diversas fontes vegetais,sendo as principais: morango, uva,jabuticaba, cereja, berinjela e repo-lho roxo. As antocianinas são comer-cialmente usadas em soluções ácidascomo em refrigerantes (pH entre2,5 e 3,8, em que se apresentam nacor vermelha). São ainda usadas emdoces, produtos de confeitaria, re-frescos, pós para refrescos, cobertu-ras de bolo, gelatinas e geléias. Paraaplicação geral, o pH entre 1,0 e 3,5confere maior estabilidade ao pig-mento.

Existem evidências indicandoque as antocianinas, além de nãoserem tóxicas nem mutagênicas,apresentam propriedades terapêuti-cas benéficas, particularmente na of-talmologia e no tratamento de váriosproblemas de circulação sanguínea

Frederico Augusto Ribeiro de BarrosMestrando em Food Engineering,Biological & Agricultural Engineering departmentTexas A&M University - [email protected]

Paulo César StringhetaProfessor doutor,Titular do Depto de Tecnologia de AlimentosUniversidade Federal de Viç[email protected]


PESQUISA


(TIMBERLAKE, 1988).Microencapsulamento é um pro-

cesso pelo qual minúsculas partícu-las de ingredientes ativos de gás,líquidos ou sólidos são empacotadosdentro de um segundo material(RISCH & REINECCIUS, 1995).

De modo geral, pode-se classifi-car o processo como: macro (> 5000µm), micro (0.2 – 5000 µm) e nano(< 0.2 µm). Quanto à forma, as cáp-sulas são idealmente esféricas, em-bora seu formato seja influenciadopela estrutura original do ingredien-te encapsulado (RISCH &REINECCIUS, 1995).

Quanto à estrutura física, asmicropartículas podem ser classifi-cadas como microcápsulas oumicroesferas. As microcápsulas con-sistem em micropartículas onde onúcleo está envolvido por uma ca-mada ou filme polimérico formando

um sistema do tipo reservatório. Omaterial microencapsulado é cha-mado de núcleo ou fase interna,enquanto a fase externa é chamadade parede, revestimento ou mem-brana (JÚNIOR, 2005).

As microesferas diferem dasmicrocápsulas pelo fato de constitu-írem um sistema matricial, no qual opol ímero forma uma redetridimensional onde o material a sermicroencapsulado pode estaradsorvido, incorporado ou ligadocovalentemente à matriz polimérica,formando sistemas de dissolução,dispersão ou sistemas porosos(JÚNIOR, 2005).

O material polimérico é selecio-nado de acordo com as propriedadesfísico-químicas do compostos a sermicroencapsulado, processo de pro-dução, aplicação e via de administra-ção (FINCH, 1990).

A f inal idade básica damicroencapsulação na indústria dealimentos é proteger os ingredientesencapsulados contra oxidação quí-mica ou de fatores do ambiente comono caso de algumas vitaminas,polipeptídeos, pigmentos e com-postos bioativos como a luteína e olicopeno. Também tem como obje-tivo o retardamento da evaporaçãode núcleos voláteis como alguns óle-os essenciais. Em algumas técnicas,a cápsula pode ser também projeta-da para liberar lentamente o produtocom o passar do tempo ou até quedeterminada condição físico-quími-ca seja alcançada (THIES, 1994).

Os métodos demicroencapsulamento podem serclassificados em métodos físico-quí-micos como coacervação e técnicasenvolvendo emulsificação; métodosquímicos como a polimerizaçãointerfacial e gelificação; e métodosmecânicos como revestimento emturbinas, suspensão no ar ou leitof luidizado, centr i fugação emmult ior i f íc io e secagem poratomização “spray drying” (OLIVEI-RA et al, 1992).

Tradicionalmente, o métodomais comum de encapsulação deingredientes alimentícios é o “spraydrying”. “Spray drying” é ainda atécnica de encapsulamento mais eco-nômica e tem vasto uso na indústria

Figura 1 Esquema das microcápsulas e microesferas respectivamente (JÚNIOR, 2005)

Figura 2 Molécula de β-ciclodextrina (DZIEZAK, 1988)


de aromas. Existe a disponibilidadede equipamentos e seu custo deprodução é baixo quando compara-do com a maioria dos outros méto-dos (CONSTANT, 1999).

O primeiro passo para efetuartal processo é selecionar o agenteencapsulante adequado. Oencapsulante ideal deve ter proprie-dades emulsificantes, ser capaz deformar filmes, ser biodegradável, re-sistente ao trato gastrintestinal, terbaixa viscosidade a altos níveis desólidos, exibir baixa higroscopicidadee ser de baixo custo. Goma arábica,amidos modificados e amidoshidrol isados são os agentesencapsulantes mais freqüentementeusados no “Spray drying”(CONSTANT, 1999).

Uma vez escolhido o agenteencapsulante, este deve ser hidratado.A encapsulação conduzida em um“Spray drying” envolve três etapasbásicas: a primeira, relativa à prepa-ração da dispersão ou emulsão a serprocessada; a segunda,homogeneização da dispersão; e, fi-nalmente, a atomização da massadentro da câmara de secagem (RISCH& REINECCIUS, 1995).

Como exemplo, a β-ciclodextrinaé um polímero cíclico de glicose,obtido pela degradação controladado amido por enzimas específicas econtém 7 unidades de glicose unidasem α-1,4. Essa molécula apresenta aparticularidade de possuir uma es-trutura fracamente polar no interiordo anel e polar no lado externo,conseqüentemente em solução aquo-sa, as moléculas de água no interiordo anel são facilmente substituídaspor moléculas apolares, ou de pola-ridade menor que a da água, forman-do est ruturas que sãoenergeticamente mais estáveis, po-dendo ser isoladas por cristalizaçãoou secagem (BOBBIO, 1995).

Dif ic i lmente um agenteencapsulante apresenta isoladamen-te todas as propriedades citadas, as-sim, na prática, é comum empregarmisturas de dois ou mais components(CONSTANT, 1999).

Ao contrário de outros métodosde microencapsulamento, a técnicade secagem por atomização é rápidae de única etapa, conveniente, pos-

sui flexibilidade de uso em alta esca-la, envolve condições brandas e épouco influenciada pelos parâmetrosde solubilidade da fase interna e dopolímero (JÚNIOR, 2005).

2. Metodologia

As antocianinas foram extraídascom etanol a partir de inflorescênciasde capim gordura (Melinisminutiflora) colhidos em Viçosa, MG.O pH foi corrigido para 2,0 comsolução de HCl. O extrato foi filtradoem papel Whatman nº 1, em funil deBuchner e a remoção da clorofila foirealizada mediante solução de éteretílico:éter de petróleo na propor-ção de 1:1, utilizando um funil deseparação. O extrato assim obtidofoi concentrado sob vácuo na tem-peratura de 45 ºC, até a soluçãoapresentar-se viscosa. Posteriormen-te, o extrato foi armazenado sobatmosfera de nitrogênio ao abrigo daluz à temperatura de 4 ºC.

Utilizou-se polissacarídeos comoagentes encapsulantes . Osencapsulantes testados foram solu-ções de maltodextrina e goma-arábi-ca em uma concentração de 30%;solução de β-ciclodextrina com umaconcentração de 10%. E as soluçõesde capsul® e flomax® foram testadasem concentrações de 20%. Misturadestes encapsulantes também foramtestadas.

As formulações empregadas es-tão descritas no quadro 1. Na maiorparte das formulações foi usado umteor de sólidos de 30%, de acordo

com sugestão de literatura (RISCH &REINECCIUS, 1995).

As amostras foram levadas aosecador tipo “spray dryer” (modeloBUCHI mini spray dryer B-191) ondese procedeu a atomização. As condi-ções de secagem foram: vácuo(30mbar); temperatura do ar de en-trada (180 ºC); temperatura do ar desaída (65 ± 5)ºC; e pressãomanométrica positiva. A quantidadede solução atomizada para cadaamostra foi em média de 120 mL, eo tempo de secagem variou de 15 a20 minutos.

Após a etapa anterior, o produtorecolhido na forma de pó foi acondi-cionado em embalagens de vidroâmbar e armazenado sob refrigera-ção em torno de 0ºC.

A figura 3 mostra o fluxogramado processo de obtenção dasmicroesferas utilizadas no presentetrabalho.

Estudo da Estabilidade:Uma fração do pó foi diluída em

tampão HCl/KCl para os testes empH 2,0 e citrato/fosfato para pH 3,0e 4,0. O extrato líquido foi utilizadocomo controle nos testes de estabi-lidade. Em cada pH foram diluídasquantidades de corante suficientespara a obtenção de absorbância inici-al entre 0,6 e 0,8 no comprimento demáxima absorção.

No teste de estabilidade à luz, assoluções de antocianinas a pH 2, 3 e4 foram acondicionadas em frascosde vidros hermeticamente fechados.Uma parte das amostras foi colocadaem um suporte em fila dupla,

Quadro 1. Formulações utili zadas

FORMULAÇÕES

Designação Concentração dosencapsulantes

Relaçãocorante/encapsulante

(m/m)

MD 30% Maltodextrina 1:4

GMD 25% Maltodextrina, 5%Goma-arábica

1:4

Beta 10% de -ciclodextrina 1:4

floMD 25% Maltodextrina, 5%Flomax®

1:4

β


posicionados entre duas lâmpadasfluorescentes de 40 W, 2.500 lux,correspondente à luz do dia, guar-dando distância de 5 cm entre si emambiente com temperatura contro-lada de (25 ± 1)ºC. A parte restantedos frascos permaneceu na mesmatemperatura em ausência de luz.

Para o teste a diferentes tem-peraturas, as soluções de antocianinasa pH 2, 3 e 4 foram colocadas emfrascos de vidros hermeticamentefechados. Em seguida, foram acondi-cionadas em banho maria até atingi-rem a temperatura desejada (70ºC e90ºC) e então foram colocados emuma estufa nesta temperatura para acoleta de dados.

As medidas de absorbância dossistemas de soluções tamponadasforam usadas para construir gráficosdo logaritmo neperiano da razãoabsorbância/absorbância inicial (LnA/Ao) versus o tempo, obtendo-seatravés da inclinação da reta o valorda constante de velocidade dedegradação(kd). A partir dos valoresobtidos de kd foram calculados osvalores do tempo de meia-vida (t1/2)pela relação t1/2 = ln 2/ kd, sendousados como parâmetros para esti-mar a estabilidade ante a ação da luze calor.

A estrutura e o tamanho dasmicroparticulas das formulações fo-ram observados por meio de ummicroscópico eletrônico de varredu-ra (MEV) do tipo JEOL JSM5510 comsistema de EDS acoplado THERMOe evaporador JEOL JEE4C da UFOPconforme as seguintes etapas: asamostras permaneceram emdessecadores durante vários dias e aseguir foram metalizadas com carbo-no em alto vácuo; no MEV, (acelera-ção de 10 kvolt), foram observadas efotografadas sob ampliações de 1000,2000, 3000,5000 e 10000 vezes

3. Resultados

Os valores encontrados para t1/2

mostram claramente a influênciamarcante da luz na constante develocidade da reação, quando com-parados àqueles colocados ao abrigoda luz, mesmo em diferentes pHs.

No quadro 3 encontram-se osresultados da umidade do produto

Figura 3 Fluxograma do processo de obtenção das microesferas (CONSTANT, 1999)

Quadro 2 - Valores t1/2 (dias) para as formulações em pH 2, 3 e 4 na presençae ausência de luz

pH controle MD GMD beta floMD

t1/2 das formulações na presença de luz

2 24,3 30,7 25,1 22,4 32,4

3 18,05 15,5 16,3 21,3 23,9

4 17,1 20,6 18,2 25,3 21,5

t1/2 das formulações na ausência de luz

2 135 141,5 182,4 154 177,7

3 105 116,3 132 124,7 100,2

4 75,4 86,4 102 95,6 90,9

Quadro 3 - Umidade dos produtos microencapsulados

Produto MD GMD beta floMD

Umidade(%) 4,04 4,60 4,12 4,89


em pó de cada formulação selecio-nada.

A adição de encapsulantes aoextrato em pH 2,0 mostrou umatendência em melhorar a estabilida-de das antocianinas, sendo evidenci-ada através dos valores obtidos det1/2. A formulação com a β-ciclo-dextrina não demonstrou qualquerefeito protetor no comportamentocinético das antocianinas em pH 2,0.As outras formulações quando com-paradas com o controle foram efeti-vas neste pH, principalmente a for-mulação floMD. Portanto, em pH 2,0a formulação que melhor protegeu ocorante foi a mistura de maltodextrinae flomax® com o corante na propor-ção de 4:1 (floMD).

Em pH 3,0 nota-se que somenteas formulações beta e floMD prote-geram o pigmento, sendo que aformulação floMD obteve melhorresultado. Neste pH, as formulações

MD e a GMD não foram eficientes naproteção do pigmento contra a luz.

Já em pH 4,0, a formulação betafoi a que mais protegeu o pigmento.Dessa forma, para se obter bonsresultados com a β-ciclodextrina sen-do usada como agente encapsulantede antocianinas o meio não podeestar sob condições drásticas de aci-dez, possivelmente, por ocorrerhidrólise da estrutura da molécula,diminuindo sua eficiência comoencapsulante.

Ao abrigo da luz, todos osencapsulantes foram eficientes naproteção do pigmento contra degra-dação, como é mostrado no quadro2, verificando os valores de tempode meia vida (t1/2 ) das formulações.

Ficou claro que a formulaçãofloMD, que se usa o flomax®, amidomodificado produzido pela NationalStarch, foi a mais eficiente na prote-ção do extrato de antocianinas con-

tra a luz. Verifica-se também, umaqueda do valor de t1/2 à medida queaumenta o pH, característica dasantocianinas, que possuem umamaior estabilidade em pHs baixos.Na ausência de luz, notou-se que amelhor proteção ocorreu em pH 4,0,mas que no geral , todospolissacarídeos protegeram bem opigmento.

Os valores encontrados para(t1/2 ), quadro 4, mostram claramentea influência marcante da temperatu-ra na constante de velocidade dareação, ou seja, quanto maior a tem-peratura menor é o valor de t 1/2.

Esses resultados indicam que, àmedida que se submete o extrato napresença ou não de encapsulantes atemperaturas mais elevadas, a suadegradação é maior, podendo-se ve-rificar esse efeito pelo decréscimono valor de t 1/2, quando se aquecemas amostras a 70 ºC e 90ºC.

Figura 4 - Curvas de degradação da antocianina em pH 3,0 sob efeito da luz

Quadro 4 - Valores t1/2 (horas) para as formulações em pH 2, 3 e 4 em temperaturas de 25ºC, 70ºC e 90ºC

pH Controle beta GMD

25ºC 70ºC 90ºC 25ºC 70ºC 90ºC 25ºC 70ºC 90ºC

2 3960 6,4 2,6 3696 5,8 1,43 4377,6 8,1 2,3

3 2520 25,4 9,2 2992,8 23,3 13,1 3168 29,9 12

4 1809,6 35,2 14,6 2294,4 39,9 12,2 2448 40,7 15,5


Os tempos de meia vida maio-res encontrados em pH 4,0 e tempe-raturas de 70ºC e 90ºC devem-se,provavelmente, ao fenômeno dehidrólise dos pigmentos, que é de-pendente da temperatura e pH. As-sim, temperaturas elevadas associa-

das com pH ácido tendem a aceleraro processo de decomposição pelahidrólise dos açúcares ligados àantocianidina.

A 70 ºC a formulação beta só semostrou eficiente em pH 4,0. Comojá discutido anteriormente, a molé-

cula de β-ciclodextrina é muito sensí-vel a pHs muito ácidos, ocorrendohidrólise de sua estrutura. Já a formu-lação GMD mostrou bons resultadosquando comparados com o controletanto em pH 2, 3 e 4.

A 90ºC a formulação GMD sónão foi eficiente na proteção ao pig-mento em pH 2,0. E a formulaçãobeta apresentou bons resultados empH 3,0. Mas, nesta temperatura no-tou-se uma menor diferença nos va-lores de t 1/2 do controle e formula-ções, mostrando que em temperatu-ras muito elevadas a tendência édiminuir o efeito protetor dosencapsulantes, devido, principalmen-te, à hidrólise destes.

Assim, a formulação GMD mos-trou-se relativamente mais eficaz naproteção contra a degradação dasantocianinas presente no extrato.

Segundo JUNIOR , 2005 quandohá formação de sistemas de dissolu-ção entre o núcleo e o agenteencapsulante significa formação demicroesferas, ou seja, um sistemamatricial, no qual o polímero formauma rede tridimensional onde o ma-terial a ser microencapsulado podeestar adsorvido, incorporado ou liga-do covalentemente à matr izpolimérica. Desta forma concluiu-seque houve formação de microesferasentre antocianinas e ospolissacarídeos, pois houve forma-ção de uma solução após mistura.

O quadro 5 mostra o diâmetrodas microesferas com tamanhos ex-tremos encontrados nas amostras ava-liadas. De forma geral, as partículasapresentavam o tamanho intermedi-ário aos valores representados.

As figuras de 5 a 7 representamas fotografias de algumas amostrasde microesferas obt idas pormicroscopia eletrônica de varredura(MEV) das partículas de antocianinasmicroencapsuladas.

De modo geral, o processo deencapsulação é classificado comomicro quando o diâmetro das partícu-las varia de 0,2 a 5000 µm (RISCH &REINECCIUS, 1995). Através dos re-sultados apresentados no quadro 5 edas micrografias acima pode-se afir-mar que houve umamicroencapsulação das antocianinasquando se utilizou polissacarídeos

Figura 5 - Micrografias da formulação Beta. Ampliação de 2000 vezes (esquerda)e 10000 vezes (direita)

Figura 6 - Micrografias da formulação floMD. Ampliação de 5000 vezes (esquerda)e 3000 vezes (direita)

Figura 7 - Micrografias da formulação GMD. Ampliação de 1000 vezes

Quadro 5 - Diâmetro das microesferas

Formulação Diâmetro

MD 5,3 - 14,3

GMD 5,3 - 15,6

GMD2 5,95 - 12,7

beta 6,1 - 17

FloMD 6,0 - 16,9


como agentes encapsulantes.As amostras apresentaram em

comum a tendência de formação demicroesferas com diâmetros varia-dos. Segundo CONSTANT (1999), ofato de o processo não ter sido ho-mogêneo, devido a problemas como equipamento, pode ter favorecidoa var iação no tamanho dasmicroesferas. Embora no geral asamostras tenham apresentado asmesmas características, algumas di-ferenças foram verificadas em razãodo encapsulante utilizado.

Provou-se que ocorre algum tipode interação físico-química entre aestrutura dos polissacarídeos em suaforma granular com o pigmento na-tural antocianina. A goma arábicaalém de possuir cadeias de glicosepossui uma fração protéica, o quetambém pode ter facilitado aencapsulação do pigmento.

Quanto mais intacta for a pare-de das microesferas mais perfeito foio processo de microencapsulação.Isto foi observado na formulaçãofloMD (figura 6) e parcialmente naformulação beta (figura 5). Destaforma, ocorre uma maiorencapsulação do pigmento quandose utiliza b-ciclodextrina e principal-mente uma mistura de maltodextrinacom Flomax® (amido modificadoquimicamente com característicashidrof í l icas) como agentesencapsulantes.

As outras formulações apresen-taram algumas perfurações em suaestrutura. Isto pode sugerir que paraestes encapsulantes a micro-encapsulação das antocianinas nãofoi tão perfeita devido, por exem-plo, a uma menor afinidade

molecular. Porém, observou-se queem todas formulações utilizadasocorreu a microencapsulação dasantocianinas.

Para o cálculo dos diâmetrosdas microcápsulas utilizou-se umprograma chamado QUANTIKOV,um quantificador de micropartículas,d isponível no s i te http: / /www.geocities.com/quantikov. A fi-gura 8 mostra a determinação dodiâmetro de uma microesfera obti-da por este programa.

Conclusão

O corante microencapsuladomostrou maior estabilidade diantedos fatores luz, pH e calor do que ocorante não microencapsulado usa-do como controle neste trabalho.

As formulações que continhamuma mistura de encapsulantes obti-veram melhores resultados no efei-to protetor das antocianinas do queas formulações nas quais osencapsulantes eram utilizados se-paradamente.

Através da técnica demicroscopia eletrônica de varredu-ra (MEV) observou-se a formaçãode microesferas , entre asantocianinas e polissacarídeos utili-zados como agentes encapsulantes.

O processo de micro-encapsulação é uma técnica que,uma vez usada em pigmentos natu-rais, pode oferecer proteção e torná-los mais estáveis melhorando destaforma sua utilização como ingredi-ente alimentício.

Agradecimentos

Ao professor Paulo CésarStringheta pela oportunidade e pelaorientação. Ao CNPq pela bolsa deiniciação cientifica PIBIC.

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Figura 8 - Microesfera com seu diâmetrocalculado pelo programa quantikov

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Genes cry1Ab e cry1Ac deBacillus thuringiensis

Genes cry1Ab e cry1Ac de Bacillus thuringiensis e proteínas com potencial na agrobiotecnologia

busca por métodos al-ternativos de controlede insetos-praga temsido realizada intensa-mente por diversos gru-

pos de pesquisa no mundo todo,devido à necessidade de uma agri-cultura mais sustentável e mais com-prometida com a preservação domeio ambiente (Bobrowski et al.,2003).

Os inseticidas biológicos, utili-zados há mais de 50 anos no Brasil,são uma alternativa para o controlemais seletivo de insetos nocivos(Hilder e Boulter, 1999; Betz et al.,2000). Dentre os agentes de contro-le biológico destaca-se o B.thuringiensis, que é uma bactériaGram-positiva, a qual sintetiza inclu-sões cristalinas durante a esporulação,denominadas proteínas Cry, que sãocodificadas por genes cry. As prote-ínas do cristal bacteriano apresen-tam ação tóxica a insetos de diversasordens, pr incipalmente aoslepidópteros, dípteros, coleópteros(Höfte e Whiteley, 1989; Schnepf etal., 1998).

As proteínas da classe Cry1 deB. thuringiensis têm um pesomolecular em torno de 130-140 kDa(Höfte e Whiteley, 1989). Após adigestão por tripsinas, no intestinomédio de insetos suscetíveis (Tojo eAizawa, 1983), o fragmento tóxicocorresponde a 60-70 kDa (Aronsonet al., 1986; Höfte e Whiteley, 1989).Esses peptídeos tóxicos se ligam areceptores específicos nas membra-nas, onde se formam canais iônicos,aumentando o volume e lise celular,devido à pressão osmótica internaaumentada (Schnepf et al., 1998;

Neiva KnaakMestre em BiologiaLaboratório de Microbiologia ePPG-Biologia - UNISINOS

Lidia Mariana FiuzaDoutora em Ciências AgronômicasLaboratório de Microbiologia ePPG-Biologia - UNISINOSFitotecnia/EEA-IRGA, [email protected]

Fiuza, 2004). Por outro lado,Polanczyk et al. (2003) comentamque a morte do inseto, no caso deprodutos à base de B. thuringiensis,representa a interação da atividadetóxica da proteína e dos esporos; eno caso de plantas-Bt, a causa damorte é somente a proteína.

Atualmente mais de 300 genesde B. thuringiensis foram clonadose seqüenciados ( http: / /epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index), resultan-do em proteínas sintetizadas pelasplantas ou utilizadas em produtospara aplicações foliares. Em 1995,havia 182 produtos à base de B.thuringiensis registrados, porém até1999 o total de vendas destes produ-tos era inferior a 2% do valor total detodos os inseticidas comercializados(Frutos et al., 1999).

Em 1981, o primeiro gene cryfo i c lonado e expresso emEscherichia coli (Schnepf e Whitley,1981). Em 1987, foram produzidasas primeiras plantas-Bt modificadasgeneticamente, as quais sintetizamas proteínas Cry, onde se destaca otomate (Fischhoff, 1987) e o tabaco(Vaeck et al., 1987). Naquela oca-sião, os genes cry1Ab e cry1Ac de B.thuringiensis foram utilizados emplantas para protegê-las contra inse-tos da ordem Lepidoptera (Vaeck etal., 1987).

Nesse contexto, o presentetrabalho aborda tópicos relacio-na-dos as plantas transgênicas que ex-pressam as proteínas Cry1Ab eCry1Ac de B. thuringiensis e osprodutos comerciais ativos contralepidópteros.

PESQUISA


Plantas Transgênicascom genes cry de Bt

Atualmente, o milho-Bt é a plan-ta transgênica mais cultivada no mun-do, seguido pelo algodão-Bt (James,2005). Além desses, a batata e otomate destacam-se entre outrasplantas cultivadas que expressamuma ou várias proteínas Cry paracontrole de insetos-praga (Oecd,2001).

Na tabela 1, adaptado de Fonteset al. (2002), estão relacionadas àsplantas cultivadas que foram trans-formadas com os genes cry1Ab ecry1Ac, visando à resistência a inse-tos-praga de importância econômi-ca.

De acordo com Betz et al. (2000),as plantas transgênicas utilizandogenes cry de B. thuringiensis nãoafetam insetos não-alvo ou vertebra-

dos. Glare e O´Callagham (2000)relatam estudos realizados sobre oefeito de várias subespécies e pro-dutos à base de B. thuringiensissobre 9 ordens de predadores, distri-buídos em 25 famílias. Em relaçãoaos parasitóides, os mesmos autoresenumeram uma série de trabalhosrealizados com as ordens Diptera eHymenoptera, onde a segunda estarepresentada por 10 famílias. Emambos os casos, embora os estudostenham mostrado algumas variaçõesnos resultados, os produtos formula-dos com B. thuringiensis e suassubespécies apresentam pouco ounenhum efeito sobre estes inimigosnaturais, sendo assim consideradosseletivos.

Nesse sentido, Shelton et al.(2002) relatam que as toxinas de B.thuringiensis podem se acumularno solo durante o crescimento daplanta, mas Saxena e Stotzsky (2000)

avaliaram o efeito de Cry1Ab libera-das pela raiz e a biomassa de organis-mos do solo. Esses autores introduzi-ram minhocas em solos com presen-ça e ausência de B. thuringiensis, osquais concluíram que apesar da pro-teína Cry1Ab estar presente no in-testino das minhocas, o números to-tais de nematóides, culturas deprotozoários e bactérias não foramafetados pela referida toxina.

“Milho-Bt”

O Milho é cultivado em cerca de17,8 milhões de hectares, sendo 11,3de milho-Bt e 6,5 milhões de hecta-res de milho-Bt mais herbicidas(James, 2005). Diversos estudos têmmostrado que a resistência do milho-Bt às larvas de S. frugiperda(Lepidoptera, Noctuidae) têm sidosuperior às linhagens não transgências(Williams et al., 1999; Lynch et al.,

Tabela 1.Plantas transgênicas resistentes aos lepidópteros através da expressão das proteínas Cry1Ab e Cry1Acde B. thuring iensis

Toxinas Plantas Insetos-alvo Referências

Cry1Ab

Repolho Plutella xylostella L. Bhattacharya et al. (2002)

Algodão Heliothis virescens Fabr. Perlak et al. (1990)

Berinjela Leucinodes orbonalis Guenée Kumar et al. (1998)

MilhoPlodia interpunctella

HübnerOstrinia nubilalis Hübner

Giles et al. (2000)

Koziel et al.(1993)

BatataPhthorimaea operculella

ZellerHeliothis arm igera Hübner

Perforoen et a l. (1992)

Chakrabarti et al. (2000)

ArrozChilo supressalis Walker

Cnaphalocrocis m edinalis Guenée

Fujimoto et al. (1993)

Ye et al. (2003)

Fumo M anduca Sexta L. Williams et al. (1993)

Tomate Heliothis virescens Fabr. Fischolff et al. (1987)

Cry1Ac

CanolaTrichoplusia ni Hübner, Spodopteraexigua Hübner, Heliothis virescens

Fabr., Helicoverpa zea BoddieStewart et al. (1996)

Arroz Plutella xylostella L. Ramachandran et al. (1998)

Feijão Chilo supressalis Walker Cheng et al. 1998

Fumo

Heliothis virescens Fabr., Heliothiszea Boddie, Pseudoplusia includens

Walker Heliothis virescens Fabr.,

Heliothis zea Boddie, Spodopteralitoralis Boiusduval

Stewart et al. (1996)

Mcbride et al. (1995)

Tomate Heliothis armigera Hübner Mandaokar et al. (2000)

Algodão Pseudoplusia includens Walker Beach and Todd (1986)


1999). Plodia interpunctel la(Lepidoptera, Pyralidae) tambémteve seu desenvolvimento e a so-brevivência reduzidos quando ali-mentada com grãos de milho-Bt, ex-pressando a toxina Cry1Ab, quandocomparados com os insetos criadoscom o milho convencional (Giles etal., 2000). Ainda potencializado esseefeito, Singer et al. (2000) confirmaque as plantas transgênicas produ-zem de 7 a 19% a mais que ascorrespondentes não transgênicas.

O uso dessa tecnologia resultana diminuição do uso de inseticidas eaumento no rendimento de grãos,como ocorre com o milho e algodãocomercializados por fazendeiros naÍndia que tiveram uma redução de70% na aplicação de inseticida re-presentando uma economia de US$30 por hectare, aumentando assim orendimento em 80,87% (Qaim eZilberman, 2003). As variedades demilho transformadas com B.thuringiensis também poderão re-duzir a propagação de fungos noarmazenamento de grãos, reduzindoos níveis de micotoxinas, além deaumentar a resistência a lepidópteros,como Sitotroga cerealella e Corcyracephalonica (Uscha et al., 1993).

Além da eficiência no controlede pragas, as plantas transgênicastêm sido consideradas como segu-ras, pois Pilcher et al. (1997) avalian-do o efeito da ingestão de pólen demilho-Bt que expressa a toxinaCry1Ab sobre três predadores:Coleomegilla maculata (Coleoptera,Coccinellidae), Orius insidiosus(Hemiptera, Anthocoridae) eChrysoperla carnea (Neuroptera,Chrysopidae), não encontraram di-ferença significativa no efeito tóxi-co, para nenhum dos três insetos,quando comparados com a ingestãodo milho não transgênico.

“Algodão-Bt”

O algodão é cultivado em 8,5milhões de hectares, sendo 4,9 mi-lhões de hectares com algodão-Bt e3,6 mlhões de hectares com algo-dão-Bt mais herbicidas (James, 2005).Stewart et al. (2001) realizaram umasérie de ensaios de laboratório paracomparar o impacto relativo do cul-

tivar algodão, Gossypium hirsutumL., expressando zero, uma, ou duasproteínas inset ic idas de B.thuringiensis a vários lepidópteros.Nesses ensaios, os autores constata-ram que as larvas alimentadas com otecido da planta que expressa Cry1Ace Cry2Ab de B. thuringiensis forammais tóxico a Helicoverpa zea(Boddie), S. frugiperda, e S. exiguaque cultivares que expressam umaúnica proteína (Cry1Ac).

Algodão expressando Cry1Ac deB. thuringiensis, comercializado paracontrolar H. virescens no campo,mostrou ser uma tecnologia eficien-te e com segurança ambiental (Betzet al., 2000). O uso de algodão-Btresultou em diminuições significati-vas no uso de inseticidas em paísesem desenvolvimento, e em algunscasos, também em aumento na ren-tabilidade (Qaim e Zilberman, 2003).

“Arroz-Bt”

O Irã é o primeiro país acomercializar arroz modificado ge-neticamente com B. thuringiensis,este foi testado em laboratórios ondeo arroz-Bt era crescido em estufa eem experimentos de campo de 99 a10/2004, num total de 6 gerações,matando de 12 a 100% das quatroespécies de insetos que se alimenta-ram do arroz-Bt. Além disso, o arroz-Bt não mostrou padrão anormal decrescimento e valor nutricional com-parada ao arroz não-Bt (www.genet-i n f o . o r g / g e n e t / 2 0 0 5 / M a y /msg00078.html).

Algumas variedades japônicasde arroz foram transformadas com osgenes que codificam as proteínasCry (Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ba eCry2A) que podem ser tóxicas avários lepidópteros, entre elesC. suppressalis , Scirpophagaincertulas, Marasmia spp. e C.medinalis (Pathak e Khan, 1994).No campo, os ensaios com cultivaresde arroz transgênico começaram naChina em 1998 (Shu et al., 2000; Tuet al., 2000) e na Índia em 2001.

Os genes sintéticos crvlAb ecrylAc de B. thuringiensis foraminseridos em cultivares de arroz e aslinhas transformadas expressaram

resistência contra S. incertulas, C.supressalis e C. medinalis, no labo-ratório, em casa de vegetação(Fujimoto et al., 1993; Cheng et al.,1998) e também em condições decampo (Tu et al., 2000).

Produtos Comerciais à basede Bt para Lepidópteros

A utilização de agentes de con-trole biológico é uma alternativa vi-ável, e bioinseticidas formulados àbase de B. thuringiensis vêm apre-sentando resultados satisfatórios nocontrole de lepidópteros. Na tabela2 estão relacionados os produtoscomerciais de B. thuringiensis quecontém as proteínas Cry1Ab eCry1Ac, conforme dados publicadospor Navon (2000) e Capalbo et al.(2005).

O emprego de B. thuringiensisé altamente desejável em progra-mas de controle de insetos que ata-cam diversas culturas, devido a suaalta especificidade e a rápida degra-dação no ambiente (Polanczyk et al.,2003). Entre as vantagens da utiliza-ção das proteínas Cry destacam-sesua especificidade aos insetos sensí-veis, seu efeito não poluente aomeio ambiente, sua inocuidade aosmamíferos e vertebrados, além daausência de toxicidade às plantas(Whiteley e Schnepf, 1986). Apesardo sucesso das formulações comer-ciais de B. thuringiensis, essas têmvárias desvantagens quando aplica-das em condições de campo (Cohen,1991), pois podem sofrer com afotoinativatição através de luzultravioleta, da temperatura, do or-valho ou da chuva (Dunkle e Shasha,1988; McGuire e Shasha, 1990).

As possibilidades de utilizaçãodo B. thuringiensis no controle bio-lógico foram reconhecidas em 1938,na França, a partir da formulação da“Sporeína” (Weiser, 1986). Desde osanos 50, diversos países como aRússia, a França, a Alemanha e osEstados Unidos começaram a produ-zir inseticidas biológicos à base doreferido entomopatógeno (Weiser,1986). Nos anos 60 foi isolada umacepa de B. thuringiensis kurstakiHD-1, a qual apresentou umatoxicidade de 2 a 200 vezes superior


àquelas normalmente utilizadas nosprodutos comerciais na época(Dulmage, 1970). A partir desseperíodo, a procura por outras cepasfoi estimulada e atualmente diversoslaboratórios continuam trabalhandonas coleções de novos isoladosbacterianos. Entre esses Crickmoreet al. (1998) relatam à eficácia de B.thuringiensis contra diversas ordensde insetos (lepidópteros, dípteros ecoleópteros) e outros grupos deinvertebrados (nematóides, ácaros eprotozoários).

Conforme mostra a Tabela 2,os produtos comerciais contendotoxinas específicas para lepidópterossão os mais importantes, pois a mai-oria dos biopesticidas à base de B.thuringiensis usados para controlarpragas agrícolas são formulações deB. thuringiensis kurstaki HD-1, de-vido à alta toxicidade e amplo es-pectro de ação dessa cepa às lagar-tas (Navon et al., 1993). Produtos àbase desta bactéria para o controlede pragas agr ícolas sãocomercializados há mais de cinqüen-ta anos, sendo o seu mercado anualestimado em 100 milhões de dóla-res. Sendo assim há uma previsão deaumento na uti l ização dessebiopesticida bacteriano à medida queas legislações de proteção ambientalmais rigorosas forem adotadas e os

produtos mais eficientes e baratosforem lançados no mercado (Schnepfet al., 1998).

Considerações

Como parte de uma propostade manejo integrado, a utilização debioinseticidas, infere a aplicação deprodutos sintéticos menos tóxicos epoluentes de forma integrada às plan-tas transgênicas. Ainda há a possibi-lidade de numa mesma planta, se-rem transferidos dois genes diferen-tes, expressando duas toxinas de B.thuringiensis que apresentem dife-rentes mecanismos de ação. Estasações poderão prorrogar o surgimentode populações de insetos resistentesàs proteínas Cry. Além disso, reco-menda-se a utilização de métodosde controle biológico à base deentomopatógenos, que representamum baixo impacto ao ambiente euma melhor relação custo - benefícioao produtor.

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Tabela 2. - Biopesticidas à base de cepas de B. thuringiensis que sintetizam proteínas Cry1Ab e Cry1Ac ativascontra lepidópteros

Ingredientes ativos Empresas produtoras Nomes comerciais

Bt kurstaki HD-1 Sumitomo (Abbott) Biobit, Dipel, Foray

Bt kurstaki HD-1 Thermo Trilogy Corp Javelin, Steward, Thuricide, Vault

Bt kurstaki HD-1 Iharabras/ Novartis S.A. Thuricide

Bt kurstaki Iharabras/ Novartis S.A. Thuricide PM

Bt kurstaki Sumitomo (Abbott) Bactospeine, Futura

Bt kurstaki Thermo Trilogy Corp Able, Costar, Florbac

Bt kurstaki BioDalia, Dalia Bio-Ti

Bt galleriae Tuticorin Alkali Chemicals & Fertilizers Spicturin

YB-1520 Huazhong Agric. University Mainfeng pesticide

CT-43 Huazhong Agric. University Shuangdu

Bt aizawai, GC 91 Novartis S.A. Agree

Bt kurstaki , 3a, 3b Agri-control Bac-control PM


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PATENTESem Biotecnologia

RESUMO

O presente artigo destaca naprimeira parte o cenário mundialcom relação às proteçõesbiotecnológicas, enfatizando as prin-cipais tendências de proteção dastecnologias em diferentes partes domundo. Em seguida, o artigo apre-senta os principais resultados obti-dos com a análise dos documentosde patente depositados no Brasil naárea biotecnológica entre váriasempresas de biotecnologia e univer-sidades. O trabalho discute ainda,subáreas nas quais há maior númerode pedidos de proteção na área dabiotecnologia agropecuária, bemcomo faz uma análise comparativadas proteções da Embrapa em com-paração com as outras empresas euniversidades. Observou-se maiortendência de proteção no Brasil naárea de biotecnologia farmacológicae em termos de biotecnologia agrí-cola, a maior concentração é na áreade controle biológico. A Embrapasegue a tendência de mercado, ten-do 56% de suas patentes emagrobiotecnologia na área de contro-le biológico.

INTRODUÇÃO

BiotecnologiaTradicional e Moderna

A Biotecnologia pode ser defini-da como sendo a manipulação deseres vivos ou parte destes paraproduzir bens e serviços, engloban-do tecnologias de diversos níveis,desde a fermentação, utilizada naprodução de alimentos e bebidas até

PATENTE

Luciana Harumi Morimoto FigueiredoMestre, Analista especialista em [email protected]

Maria Isabel de Oliveira PenteadoDoutora, Pesquisadora e especialista em [email protected]

Patrícia Teles MedeirosMestre, Bolsista do Projeto SAPE/CNPqFortalecimento do Sistema de Apoio aoPatenteamento - Embrapa,[email protected]

a manipulação genética,que resultoudos recentes avanços científicos nocampo da biologia molecular. Existe,portanto, uma clara distinção entreatividades que envolvem antigas emodernas biotecnologias.

A área da biotecnologia se ca-racteriza por ser multidisciplinar,possuir diferentes níveis tecnológicose ter aplicações comerciais em di-versos setores da economia (Carva-lho, 1996; Silveira, 2002). Produtosoriundos dessa área podem ser utili-zados em várias indústrias. Assim, abiotecnologia não é definida pelosseus produtos, mas pelas tecnologiasutilizadas para se produzir tais pro-dutos (Paugh e Lafrance, 1997).

A biotecnologia Tradicional ouClássica é constituída por um con-junto de técnicas amplamente difun-didas, que utilizam seres vivos en-contrados na natureza e/ou aquelesmelhorados pelo homem para exer-cer determinada função produtiva.Dentre tais técnicas destacam-se: oisolamento, a seleção e os cruza-mentos genéticos naturais entre es-pécies sexualmente compatíveis(Carvalho, 1996; Silveira, 2002).

A biotecnologia moderna surgiuno início dos anos setenta comoresultado de descobertas científicasno campo da engenharia genética.Segundo Carvalho (1996), “abiotecnologia moderna inicia o seutrabalho com seres vivos naturaispara obter outros seres vivos nãoencontráveis na natureza, obtidospela aplicação de técnicas não natu-rais de seleção, transformação gené-tica e otimização fisiológica”.

Os principais campos que en-volvem a biotecnologia moderna são

Patenteamento em biotecnologia agropecuária: cenário brasileiro



a engenharia genética e a fusão ce-lular.

O objetivo das técnicas que com-põem a engenharia genética é trans-ferir genes de um organismo paraoutro. A introdução de segmentos deDNA de um organismo A em umorganismo B é chamado de transfor-mação gênica, desse modo o indiví-duo B passa a ser chamado detransgênico ou organismo genetica-mente modificado (OGM), que apre-senta novos atributos biológicos.

A segunda tecnologia utilizadapela biotecnologia moderna é a fu-são celular, que consiste na “forma-ção de uma única célula por fusão deduas diferentes. Na célula híbrida, osnúcleos dos doadores podem per-manecer separados ou se fundir; nadivisão celular subseqüente, um fusose forma e cada célula-filha tem umúnico núcleo contendo a soma doscromossomos das células originais. Omesmo que hibridação somática”(Borém e Vieira, 2005).

Agricultura e Biotecnologia

Com o surgimento dabiotecnologia, as pesquisas na áreaagropecuária aumentaram seu po-tencial de captação de recursos deempresas privadas, em algumas áre-as, tais como: controle de ervas dani-nhas, pragas e doenças; aumento daprodutividade vegetal e animal; qua-lidade nutricional; facilidade deprocessamento de produtos alimen-tícios; dentre outros. Descobertas denovos genes e a construção da arqui-tetura básica de cultivares vegetais,por exemplo, representam hoje umcampo de grande potencial econô-mico (Machado et al, 2004).

A biotecnologia é uma ciênciaem constante evolução, que estásempre oferecendo produtos novose mais eficientes, em diversas áreas.Embora seus avanços tenham im-pactos muito amplos, beneficiandoum leque de atividades industriais,os setores que mais se beneficiam dodesenvolvimento desta tecnologiasão a agricultura e a área da saúde. Amaior parte das oportunidades deapl icações comercia is dabiotecnologia moderna se concentranessas áreas. Os principais agentes

deste processo são a indústria farma-cêutica e a indústria de sementes,que necessitam de inovações paramanter a competitividade no merca-do além de que as trajetóriastecnológicas de expansão das indús-trias que atuam nesses setores mos-traram progressivamente sinais deesgotamento, revelado na elevaçãodos custos de descobertas de produ-tos novos (Silveira et al, 2002).

As biotecnologias tradicionaiscom maiores aplicações na agricultu-ra estão nas áreas de cultura detecidos, controle biológico de pragase fixação biológica de nitrogênio. Acultura de tecidos in vitro “compre-ende a cultura de células, tecidos ouórgãos, em condições de assepsia emeios de cultura artificiais” (Olivei-ra, 2000). Esse tipo de cultura permi-te a criação de uma nova planta apartir de uma parte diminuta de umaplanta adulta. Esta parte é cultivadaem tubo de ensaio e induzida a seregenerar num vegetal completo,idêntico à planta original (clone). Éde grande importância econômicaporque permite, entre outras aplica-ções, a propagação em grande esca-la de plantas de qualidade superior,sem destruir a planta mãe e obterplantas fáceis de transportar paradiversas regiões e recuperar plantasem vias de extinção (Oliveira, 2000).

A fixação biológica de nitrogê-nio é muito utilizada atualmente naagricultura e de grande importânciaeconômica na produção de diversoscultivos, além de ser importante paraa melhoria da qualidade ambiental,já que redução do uso de fertilizantesindustriais diminui a quantidade denitratos escoados para águas superfi-ciais e subterrâneas. Uma quantida-de adequada de nitrogênio é funda-mental para o crescimento das plan-tas e uma das vantagens da fixaçãobiológica é o seu baixo custo emcomparação com as tecnologias subs-titutas.

No Brasil, a Embrapa foi respon-sável pelo desenvolvimento detecnologias de identificação no soloe seleção das estirpes de bactériasmais eficazes, tornando possível tra-tar as sementes com as linhagenscorretas para cada tipo de solo. Usan-do a semente inoculada, a economia

com adubação química é cerca de460 reais por hectare, o que resultanuma economia de R$ 5 bilhões porano (Oliveira, 2003).

O controle biológico de pragasé uma aplicação da biotecnologia naagricultura que vem ganhando im-portância nos últimos anos. Os de-sastres ambientais, a demanda cres-cente de alimentos e produtos deprimeira necessidade em função docrescimento populacional, a expan-são dos mercados consumidores nospaíses desenvolvidos e o aumentode pragas foram os fatores que con-tribuíram para valorizar o uso debioinseticidas nas atividades agríco-las. Para reduzir a contaminação porprodutos ou inseticidas químicos, ocombate às pragas utilizandoentomopatógenos tornou-se a alter-nativa mais viável frente a necessi-dade de desenvolvimento de umaagricultura sustentável.

As pesquisas na área genômicatêm fornecido ferramentas impor-tantes para o controle biológico. Oestudo do código genético dos inse-tos ajuda a desvendar os mecanis-mos de resistências destes animais aseus inimigos naturais. Os avançosda engenharia genética e daimunologia têm resultado em maiorcompreensão do funcionamento dosistema imunológico dos insetos, oque tende a favorecer a utilização deentomopatógenos para combatê-los(Silva, 2002).

Com relação às técnicas con-vencionais de melhoramento gené-tico, estas passaram por um proces-so de evolução que foi desde (1) autilização da seleção pelo homemdas plantas reproduzidas naturalmen-te; passando pela (2) utilização cons-ciente da reprodução sexual combi-nada com a seleção através da mani-pulação da reprodução sexual; echegando até (3) a eliminação dabarreira sexual, primeiro com amutagênese e poliploidia, e, a partirda década de 70, com a utilização damutação dirigida através dabiotecnologia moderna.

O surgimento da biotecnologiamoderna marca a entrada de umanova era para a agricultura, com umpapel de destaque para a genéticamolecular. A tendência é que a revo-


lução agrícola atual possa dependermenos de inovações mecânicas equímicas baseando-se mais no usointensivo do conhecimento cientificoe de técnicas moleculares e celula-res. Essas técnicas podem aumentara produtividade e reduzir custos, alémde melhorar a qualidade dos alimen-tos e permitir práticas agrícolas maisecológicas. A manipulação genéticadas plantas já tem mostrado impac-tos em outros setores produtivos,como na indústria química e farma-cêutica, com a possibilidade, a partirde plantas geneticamente modifica-das, de produzir fitoterápicos ou ain-da desenvolver vegetais biorreatores.

A primeira variedade de umaespécie vegetal produzida pela en-genharia genética a atingir o merca-do consumidor foi o tomate FlavrSavr,desenvolvido pela empresa ameri-cana Calgene e comercializada apar t i r de 1994 (ht tp://en.wikipedia.org/wiki/FlavrSavr). Asplantas geneticamente modificadaspodem ser classificadas em três fa-ses, de acordo com a natureza desuas modificações (Aragão 2003):

primeira fase - proprieda-des agronômicas : plantas geneti-camente modificadas com caracte-rísticas agronômicas de tolerância aherbicida e resistência a pragas (in-setos, fungos e vírus);

segunda fase - nutricional:são plantas modificadas com o obje-tivo de melhorar quantitativa e qua-litativamente suas qualidadesnutricionais;

terceira fase - biofábricas:plantas modificadas para sintetizarprodutos especiais, como fármacos,plásticos e outras especialidadesquímicas.

Um exemplo de planta de pri-meira fase é a soja resistente aoglifosato e uma planta de segundafase tem como exemplo o “arrozdourado” (alto valor de vitamina A).A maioria das plantas geneticamentemodificadas produzidas e liberadas paracomercialização pertence à primeirafase: soja, milho, canola, algodão,batata, abóbora, tomate e mamão.

O sistema agroalimentar brasi-leiro teve crescimento entre 1990-1993 devido à melhoria de sua pro-dutividade (Associação Brasileira de

Agribusiness 1993; citado por Cribb2004). Essa melhoria na produtivida-de ocorreu devido às várias inova-ções surgidas nesse período, princi-palmente nos segmentos de conser-vas, massas, laticínios, carne, moa-gem, biscoitos, sucos naturais, refri-gerantes e cervejas (Ribeiro 1994;citado por Cribb 2004). Com o ad-vento da biotecnologia moderna osetor agroalimentar mostrou um au-mento significativo na produção,principalmente devido às plantaçõesde cultivares transgênicas. Estudosmostram que de 1996 a 2005 oaumento de áreas plantadas comsementes de organismos genetica-mente modificados (OGMs) foi enor-me, passando de zero hectares paracerca de 90 milhões de hectaresplantados com organismos genetica-mente modificados nos 21 paísesque atualmente plantam OGMs(James, 2005).

Atualmente, as principais carac-terísticas das plantas que estão sen-do cultivadas nesses 21 países sãorelacionadas à tolerância a herbicida eresistência a insetos, que estão pre-sentes nas principais cultivaresplantasdas, como soja, algodão, canolae milho (James, 2005). Tillman et al(2001) descrevem em seu trabalhoque no ano 2000 o uso de pesticidasno mundo todo foi de 4.106 milhõesde toneladas (cobrindo uma área de1,5. 109 hectare) e que esse númeropoderá aumentar para 7. 106 milhõesde toneladas em 2020 (cobrindo umaárea de 1,7. 109 hectare) e 10.106

milhões de toneladas em 2050 (co-brindo uma área de 1,9. 109 hectare),enfatizando que poderemos estarcontaminando enormemente o am-biente além de danos à saúde (DiCiero, 2006). Em 2002, o InstitutoBrasileiro de Geografia e Estatísticarevelou que o uso de agrotóxicospor hectare no Brasil aumentou21,6%, colocando o país como umdos maiores usuários de tais insumos(Agência Brasil, 2002). Além disso,inúmeros estudos mostram que apopulação poderá chegar a até 10bilhões de habitantes em 2025, oque indica que não teremos áreascultiváveis compatíveis com o tama-nho populacional. Todos esses fatosapontam e justificam um crescente

desenvolvimento de tecnologias li-gadas à biotecnologia agropecuáriamoderna.

Belém et al (2000) indicam queas principais linhas de pesquisa naárea biotecnológica agropecuária são:(1) transformação de plantas porengenhar ia genét ica , (2)biotransformação de resíduos indus-triais altamente poluentes em ali-mentos nutracêuticos, (3) estudosenvolvendo as proteínas tóxicas deBacillus thuringiensis e (4) estudosenvolvendo a bactéria Rhizobiumpara transformar o nitrogênio atmos-férico N2 em fonte de aminoácidos.

Biotecnologia, Agricultura ePropriedade Intelectual

As patentes em biotecnologiasão aquelas que contemplam pro-cessos de produção e produtos base-ados em materiais biológicos, taiscomo processos biotecnológicos(pex: método para produção de plan-tas transgênicas), produtos resultan-tes de processos biológicos(pex: composição contendomicroorganismos para controle bio-lógico), e podendo incluir os própriosorganismos resultantes dos processosbiotecnológicos (pex: plantastransgênicas). No Brasil, o todo ouparte de seres vivos naturais e mate-riais biológicos encontrados na natu-reza, ou ainda que dela isolados nãopodem ser protegidos por patentes(Art.10, inciso IX da Lei 9279/96).Dentre os seres vivos, apenas osmicroorganismos transgênicos sãoconsiderados patenteáveis no Brasil,conforme explicitado no Art. 18, incisoIII e seu parágrafo único da Lei 9279/96 (LPI). Portanto, no Brasil, os pro-dutos e processos biotecnológicossão protegidos por patentes atravésde construções gênicas, proteínasrecombinantes, processos de isola-mento ou purificação de produtos,processos relacionados a alteraçõesde plantas, processos de obtençãoou síntese de moléculas, moléculassintéticas, entre outros.

Há diferenças no escopo de pro-teção entre países, sendo os EstadosUnidos mais condescendentes comrespeito a produtos e processosbiotecnológicos. No entendimento


americano são passíveis de prote-ção, por exemplo, as moléculas deDNA e proteínas como encontradasna natureza, desde que tenham pas-sado por algum processo de interfe-rência humana e preencham os re-quisitos de patenteabilidade (novi-dade, atividade inventiva e aplica-ção industrial). Para os americanos,um material biológico isolado e puri-ficado da natureza envolve um tra-balho intelectual humano e, dessaforma, os materiais biológicos dessanatureza se tornam inventivos. Por-tanto, nos EUA, seqüências de DNAe aminoácidos são passíveis de pro-teção, assim como os organismosgeneticamente modificados já quesão derivados de processos envol-vendo manipulação humana para suaobtenção. A primeira patente ameri-cana para um animal foi concedidaem 12 de abril de 1988 para o RatoHarvard, um animal geneticamentemodificado de forma a se tornar sus-cetível a contrair câncer de mama(Assumpção, 2001).

A diretiva européia para a pro-teção legal das invençõesbiotecnológicas também defendeque o material biológico que é isola-do de seu ambiente natural ou pro-duzido por meio de processo técni-co, pode ser objeto de uma invençãomesmo que este ocorra previamen-te na natureza. Em outras palavrastambém oferece abertura para a pro-teção de materiais biológicos natu-rais.

Os conceitos que norteiam apatenteabilidade de um produto/pro-cesso biotecnológico são basicamen-te os mesmos já estabelecidos paraas outras áreas tecnológicas acresci-dos de alguns procedimentos dife-renciados necessários ao preenchi-mento dos critérios de repetibilidadee suficiência descritiva da invenção,como é o caso do depósito de mate-rial biológico em Instituições Depo-sitárias. Esse tipo de depósito é ne-cessário para as tecnologias inventi-vas que envolvam material biológicoque não possam ter suas característi-cas totalmente descritas no pedidode patente, como é o caso dosmicroorganismos.

Outro aspecto interessante a serressaltado é a necessidade de serem

fornecidos, no relatório descritivo dosdocumentos de patente nessa área,uma cuidadosa e detalhada descri-ção do material biológico, dosparâmetros técnicos envolvidos noprocessamento de obtenção destematerial visando a obtenção de umproduto efet ivamentebiotecnológico. Um exemplo dematerial biológico amplamente pro-tegido nas patentes biotecnológicasé a construção gênica que envolve,muitas vezes, a ligação de uma mo-lécula de DNA de interesse a umvetor comercial. Nesse caso, é im-portante que o pedido de patentetenha toda seqüência da moléculade DNA de interesse bem comotodas as informações relevantes comrelação ao vetor comercial como onome do fabricante e, se possível, omapa de restrição do vetor. É muitoimportante a descrição detalhada detodas as metodologias utilizadas paraa realização da construção gênicapara que um especialista no assuntopossa reproduzir a invenção.

O cenário de patenteamentomostra que as empresas vêm inves-tindo na proteção de seus desenvol-vimentos tecnológicos na área dabiotecnologia, não só pelo grandeimpacto científico e tecnológico, mastambém pelo potencial econômico.Uma das invenções revolucionáriasno campo da biotecnologia foi in-ventada pelos pesquisadores StanleyCohen (Universidade de Stanford) eHerbert Boyer (Universidade daCalifórnia). A invenção diz respeitoao corte e inserção de seqüênciasgenéticas, onde um DNA provenien-te de um organismo heterólogo pôdeser inserido em um plasmídeobacteriano, que por sua vez foi inse-rido em um organismo vivo para setornar uma “fábrica” capaz de produ-zir o produto do DNA inserido emquantidades ilimitadas. O pedidoenvolvendo essa invenção tramitoudurante sete anos no escritório depatentes americano (USPTO) e foiconcedido em dezembro de 1980sob o número US4237224. As inven-ções englobando a tecnologia deno-minada Cohen-Boyer geraram, até1999, cerca de US$ 251 milhões emroyalties para ambas as universida-des e foram licenciadas para 467

diferentes companhias (Assumpção,2001).

Diversos produtos e processoscom potencial mercadológico foramdesenvolvidos no campo dabiotecnologia e os países aumenta-ram a proteção dessas tecnologiasvisando principalmente garantir umlugar de destaque no mercado mun-dial através do monopólio decomercialização das mesmas. Osdepósi tos de patentes embiotecnologia têm crescido mais ra-pidamente do que o total de depósi-tos feitos no escritório europeu depatentes (EPO). Entre 1991 e 2002,os depósitos de patente embiotecnologia cresceram 8,3% ao anoenquanto que o total de depósitoscresceram 5,7% (Beuzekon eArundel, 2006).

Um dos campos mais atrativospara depósitos em biotecnologia é odos fármacos ou produtos relaciona-dos à saúde humana ou animal e énesse campo onde também se temmaiores investimentos em pesquisae desenvolvimento. De acordo comBeuzekon e Arundel (2006), os de-pósitos na área de saúde são predo-minantes na biotecnologia, repre-sentando 87% em 12 dos 14 paísesestudados ( Nova Zelândia, Dina-marca, Austrália, Finlândia, Itália, Bél-gica, Estados Unidos, Japão, Canadá,Turquia, Luxemburgo, Israel, China eÍndia), excetuando-se apenas Suéciae Bélgica.

Os depósitos de patentes embiotecnologia agropecuária tambémcresceram mais em número que aque-les sobre outras tecnologias agríco-las. Nos Estados Unidos, os pedidosde patente depositados no escritórioamericano (USPTO) também mos-tram um aumento no crescimentodos depósitos de patente na áreaagrobiotecnológica (Figura 1).

No que diz respeito à participa-ção das patentes em biotecnologiacom relação ao total de patentesdepositadas no Brasil, de acordo comFortes e Lage (2006), a participaçãonacional no número de depósitos nasubárea C12N entre 1998 e 2000 foide 2,6%. Esse índice foi observadona Índia em 1990 para os pedidosem biotecnologia, conforme Gupta& Subbaram (1992).


Em relação aos paísesdepositantes na área biotecnológica,a análise apresentada por Beuzekone Arundel (2006) também mostradiferenças ao longo do período estu-dado (1991-2002). Em 2002, cercade 39,9% das patentes depositadasno escritório europeu de patentes(European Patent Office - EPO) naárea biotecnológica foram oriundasdos EUA, 34,5% da União Européia ecerca de 14% do Japão. A partir de1997, observou-se uma redução nodepósito de patentes americanas noescritório europeu, enquanto que onúmero de depósitos japoneses au-mentaram. Os autores explicaramessas alterações como uma possívelresposta à política mais restritiva ado-tada pela Europa na análise de pa-tentes em biotecnologia nos últimosanos (Beuzekon e Arundel, 2006).

Metodologia

No intuito de conhecer o cená-rio das proteções biotecnológicasagropecuárias no Brasil e de situar aspatentes da Embrapa nessa área,foram analisados os documentos depatente depositados, no Brasil, orempresas e instituições públicas brasi-leiras especializadas em biotecnologia.

Os dados referentes aos depósi-tos brasileiros foram obtidos através

da análise do banco de dados depatentes do Instituto Nacional daPropriedade Industrial – INPI-(www.inpi.gov.br), considerando-setodas as informações disponíveis nointervalo de tempo de 1982 a 2006.

Inicialmente foi feito um levan-tamento de todas as patentes detitularidade da Embrapa e, em segui-da, as mesmas foram analisadas porárea de classificação internacional depatentes. As áreas selecionadas parao estudo foram aquelas onde aEmbrapa apresentou maior númerode depósitos, que correspondem àssubclasses A01N, A61K e C12N daclassificação internacional.

Considerando que, no Brasil, apesquisa se concentra basicamenteem instituições publicas, também seefetuou um levantamento das em-presas e instituições públicas de gran-de impacto na área de biotecnologiacom relação ao número total de de-pósitos e aos depósitos nas subáreasC12N, A61K e A01N.

O perfil dos depositantes brasi-leiros também foi analisado para asubclasse A01N, que dentre as trêssubclasses analisadas é a que maisabrange os produtos e processosagronômicos (tais como defensivosagrícolas e reguladores de cresci-mento vegetais). Esse perfil foi sub-dividido nos seguintes grupos: em-

presas públicas, órgãos públicos/uni-versidades, empresas privadas edepósitos individuais.

Resultados e Discussão

As instituições e empresas pú-blicas brasileiras analisadas para opresente trabalho foram: Universida-de de Campinas (Unicamp), Univer-sidade de São Paulo (USP), EmpresaBrasileira de Pesquisa Agropecuária(Embrapa), Universidade Federal deMinas Gerais (UFMG), Universidadedo Rio de Janeiro (UFRJ), FundaçãoOswaldo Cruz (FIOCRUZ), Universi-dade Federal do Rio Grande do Sul(UFRGS), Universidade Federal deViçosa (UFV), Universidade deBrasília (UnB), Universidade Estadu-al de São Paulo (UNESP) e Universi-dade Federal de Lavras (UFLA).

Dentre as empresas públicas einstituições brasileiras pesquisadas, amaioria dos depósitos entre 1982 e2006 foi feita pela Universidade Es-tadual de Campinas (Unicamp) se-guida pela Universidade de São Pau-lo (USP) e Embrapa (Figura 2).

É importante ressaltar que entreas empresas e instituições estuda-das, a Embrapa é a única que sededica exclusivamente à pesquisaagropecuária e a maioria de suastecnologias protegidas são voltadas

Figura 1 - Número de depósitos americanos (escala logarítimica) total e na área agrobiotecnológica. Adaptado do site doescritório americano de patentes (www.uspto.gov)


para essa aplicação. Com sua amplaprogramação de pesquisa, a Embrapapossui pedidos em diversas áreas,que estão concentradas em 3subclasses da classificação internaci-onal de patentes (Tabela 1).

Na tabela 1 observa-se que astrês subclasses onde a Embrapa pos-sui a maioria dos seus pedidos depo-sitados são C12N, A61K e A01N,indicando que grande parte das in-venções estão concentradas no cam-po biotecnológico agropecuário. Es-sas áreas correspondem aosmicroorganismos ou enzimas e com-posições contendo os mesmos(C12N); preservação de animais ouplantas e parte dos mesmos (A01N)e preparações medicinais (A61K). Asubclasse C12N contempla grandeparte das invenções biotecnológicase, principalmente, o que diz respei-to à biotecnologia moderna pois é

nela que se concentra a engenhariagenética e a os processos e produtosenvolvendo mutações. Já a subclasseA01N abrange os biocidas, repelen-tes ou atraentes de pestes e regula-dores de crescimento de plantas. Nasuclasse A61K os pedidos da Embrapatem utilização preferencial nas pre-parações relacionadas à agronomiaou veterinária.

A análise detalhada destassubclasses para as mesmas empre-sas e instituições públicas considera-das no estudo indicou que a Univer-sidade Federal de Minas Gerais(UFMG) supera as demais institui-ções e empresas nas subclasses A61Ke C12N, enquanto que a Embrapa sedestaca na subclasse A01N com mai-or número de depósitos (Figura 3).Isso demonstra claramente a impor-tância e coerência dessas institui-ções com seus objetivos.

A análise dos depositantes brasi-leiros na subclasse A01N revelouque a maioria dos depositantes bra-sileiros em 2000 eram empresas pri-vadas, enquanto que em 2001 osdepósitos passaram a pertencer gran-de parte aos órgãos públicos/univer-sidades e, a partir de 2002 os depó-sitos passaram a se concentrar emdepositantes individuais (Figura 4).Provavelmente a grande parte dos

Tabela 1 - Distribuição dos pedidos daEmpresa Brasi le i ra de Pes quisaAgropecuária (Embrapa) por subclassesda clas si ficaç ão internac ional depatentes. A Classificação Internacional dePatentes pode ser obtida no site do INPI(www.inpi.gov.br) ou da World InformationPatente Office (www.wipo.int)

Classificaçãointernacional

Número dedepósitos

A01C 1

A01G 2

A01H 5

A01N 17

A23B 1

A23D 1

A23F 1

A23G 2

A23L 13

A61K 19

A61P 1

C07C 1

C09B 4

C10G 1

C10L 1

C11B 3

C11C 1

C12N 20

C12P 3

C12Q 2

C12R 6

C13D 1

G01N 6

Figura 2 - Número de depósitos realizados por instituições e empresas públicasbrasileiras no Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI)

Instituições e empresas

Unicamp

UFRJ

UFMGEmbrapa

Usp

UFVUFRGS

Fiocruz

Unb

UnespUflaN

.de d

epós

itos

500

400

300

200

100

0

Figura 3 - Número de depósitos das empresas e instituições públicas brasileiras nassubclasses A01N, A61K e C12N

N.d

e dep

ósito

s

60

50

30

40

20

10

0

UFMG

USP

Unicam

p

Fiocruz

Embrapa

UFRJUnB UFV

Unesp

UFRGS

A01N

A61K

C12N


depósitos individuais teve a inven-ção desenvolvida com base no co-nhecimento adquirido em institui-ções de pesquisa. O resultado daanálise dos depositantes brasileiroscontrasta com os dados obtidos paraos países desenvolvidos, como é ocaso dos Estados Unidos, onde osprincipais depositantes são as em-presas privadas. No período entre1998 e 1999 os depositantes ameri-canos foram divididos em três gran-des grupos: 1) novas empresas de

faturamento relativamente reduzidosubsidiárias ou atuando em estreitaassociação com empresas gigantesdo setor químico e farmacêutico; 2)empresas tradicionais de grandeporte e 3) instituições vinculadas apesquisa e ensino (Assumpção,2001).

Considerando apenas os docu-mentos de patente na áreaagropecuária (ou seja, cujos produ-tos e processos são utilizados nessaárea tecnológica), observa-se que a

Embrapa destaca-se com maior nú-mero de depósitos nas três subclassesquando comparada às demais insti-tuições (Figura 5). Esses depósitosrealizados pela Embrapa se concen-tram principalmente na área de con-trole biológico de pragas gerandotecnologias como feromônios ebioinseticidas. As outras instituiçõescomo UFMG, Fiocruz, USP, Unicamp,se destacam na área farmacológica.Os depósitos de patentes dessas Ins-tituições, cujos os documentos depatente envolvem as subclassesA61K e C12N, correspondem emsua maioria na área de fármacos

Vários estudos têm mostrado aimportância da biotecnologia e a ten-dência mundial de um aumento nonúmero de patentes na áreabiotecnológica (Beuzekon e Arundel,2006). Mais de seis mil patentesforam concedidas no escritório ame-ricano de patentes (USPTO) entre1998 e 1999 dentro da classe 435 naclassificação americana de patentes,que representa as áreas da “BiologiaMolecular” e “Microbiologia”(Assumpção, 2001). No Brasil foiobservada uma tendência de aumen-to no número de depósitos na áreabiotecnológica agrícola (Figura 6).Para o ano de 2005, embora se espe-

Figura 5 - Número de depósitos das Instituições e empresas públicas na áreaAgropecuária realizados no Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI)

Embrapa

UFRJ

UFMG

Unicamp

UFV

UFRGS

Fiocruz

UnB

Unesp

USP

N.d

e dep

ósito

s

18

2

14

16

8

10

12

6

4

0

A01N A61K C12N

Figura 4 - Perfil de depositantes brasileiros no Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI) dentro da subclasse A01N

N.d

e dep

ósito

s(%

)

70

60

50

40

30

20

10

0

2000 2001 2002 2003 2004

Empresas públicas Empresas privadas

Órgãos públicos/Universidades Depósitos individuais


re um aumento, o valor não foi com-putado, devido ao fato de muitosdepósitos ainda estarem em períodode sigilo. Esse fato mostra que aEmbrapa está protegendo suastecnologias seguindo a mesma ten-dência dos principais depositantesnesta área.

Considerações Finais

O presente estudo mostrou queo Brasil segue as tendências mundi-ais e vem aumentando as patentesem biotecnologia e também embiotecnologia agrícola.

A Embrapa, embora investindoem subáreas um pouco diferencia-das, também vem atuando conformeas tendências do mercado, aumen-tando seus depósi tos embiotecnologia e, principalmente,desenvolvendo a maioria desuas pesquisas inovat ivasagrobiotecnológicas na área de con-trole biológico.

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Figura 6 - Evolução nos Números de depósitos de pedido de patente brasileiros nasubárea A01N

N.d

e dep

ósito

s

2000 2001 2002 2003 2004

40

30

2010

0

Anos


química de proteínas tempassado por um novo pe-ríodo de grandes avançostecnológicos e científicos.Com a conclusão do

seqüenciamento dos genomas devários organismos, inclusive o da es-pécie humana, a pesquisa envolven-do proteínas ganhou novo fôlego eentramos em uma nova fase conheci-da como pós-genômica, em virtudeda sua estreita relação com os dadosproduzidos pelas pesquisasgenômicas. Essa fase tem-se caracte-rizado pelo domínio de um novométodo analítico empregado no estu-do de proteínas: a espectrometria demassa, simbolizada por MS — do nomeem inglês mass spectrometry.

Princípios daespectrometria de massa

A espectrometria de massa é ummétodo de determinação precisa demassas molares. Há várias décadas,esse método vem-se consolidandocomo ferramenta insubstituível paraa determinação de estruturas quími-cas, principalmente de compostosorgânicos pequenos e voláteis. Du-rante a década de 1980, foram desen-volvidos novos mecanismos deionização em espectrômetros de mas-sa para moléculas grandes e polarescomo peptídios e proteínas, até en-tão impossíveis de serem analisadospor essa técnica, o que permitiu quevários problemas bioquímicos pudes-sem ser resolvidos.

Um espectrômetro de massa éformado basicamente de duas partes:o sistema de ionização das moléculas,responsável por vaporizá-las e carregá-

ESPECTROMETRIAde massa de proteínasPESQUISA

O papel-chave da espectrometria de massa na era pós-genômica

las eletricamente, e o analisador demassa — o espectrômetro de massapropriamente dito — que separa osíons resultantes de acordo com a mas-sa. Atualmente, duas técnicas deionização (Figura 1), que secomplementam e se sobrepõem, do-minam a análise de proteínas: adessorção a laser e a eletropulveri-zação.

Dessorção a laser

A palavra dessorção (desorption,em inglês) refere-se ao fenômeno deretirada de substâncias adsorvidas ouabsorvidas por outras. No caso daespectrometria de massa, a proteína— ou a mistura protéica ou peptídica— em estudo é misturada a umamatriz ácida e irradiada com um feixede laser , cuja energia causa adessorção da molécula. A matriz ácidatransfere prótons para as moléculasde proteína, fazendo que fiquemionizadas positivamente. A dessorçãodas moléculas de matriz e de proteínafaz que elas passem para o estadogasoso. Estar na forma ionizada e noestado gasoso é condição para queuma molécula possa ser analisada porespectrometria de massa. A principaltécnica empregada na análise de pro-teínas baseada no fenômeno dadessorção a laser é conhecida comoMALDI — sigla em inglês para matrix-assisted laser desorption ionization.

Eletropulverização

Na ionização por eletropulveri-zação, a proteína é dissolvida em umasolução acidificada a qual é pulveriza-da em uma agulha metálica — ou um

Ricardo Bastos CunhaProf. Dr., Núcleo de Proteômica,Centro Brasileiro de Serviços e Pesquisasem Proteínas; Divisão de Química AnalíticaInstituto de QuímicaUniversidade de BrasíliaBrasília/[email protected]

Mariana de Souza CastroProfa. Dra., Núcleo de Proteômica,Centro Brasileiro de Serviços ePesquisas em ProteínasUniversidade de BrasíliaBrasília/[email protected]

Wagner FontesProf. Dr., Núcleo de Proteômica,Centro Brasileiro de Serviços ePesquisas em ProteínasUniversidade de BrasíliaBrasília/[email protected]


capilar de vidro revestido de metal— submetida a intenso campo elétri-co, o que causa sua ionização. Umacorrente de gás inerte flui no sentidocontrário ao da pulverização, o quecausa sua dessolvatação. A proteína,já ionizada e no estado gasoso, éatraída para dentro do espectrômetrode massa, onde é analisada. O termoESI — sigla em inglês paraelectrospray ionization — écomumente empregado para desig-nar tal técnica.

Analisadores de massa

Os principais analisadores demassa (Figura1) que acompanhamos sistemas de ionização descritossão:

• tempo de vôo — abrevia-secomo TOF, sigla em inglês para time-of-flight — sistema em que molécu-

las ionizadas e aceleradas são lançadasem um tubo sob vácuo e sem campoelétrico para medida do seu tempode vôo até um detector. Esse tempode vôo é proporcional à massa molarda molécula. Este analisador é usual-mente associado à dessorção a laser;mas pode também ser utilizado comeletropulverização;

• quadripolo, que utiliza a con-dução de moléculas ionizadas entrequatro cilindros metálicos conectadosa fontes de radiofreqüência para fa-zer que determinados grupos de íonscheguem ao detector. Esse analisadorgeralmente é usado comeletropulverização, mas pode estarassociado também à dessorção a laser.

• aprisionamento de íons —abrevia-se como IT, sigla em inglêspara ion trap — em que as molécu-las também são conduzidas para den-tro de um compartimento onde exis-

te um forte campo eletromagnético.Diferentemente do quadripolo, nes-se sistema os íons não são perdidosem sua trajetória rumo ao detector.Ao contrário, eles são aprisionadosno compartimento onde existe cam-po eletromagnético e liberados um aum. Esse analisador associa-se tantoà eletropulverização quanto àdessorção a laser .

APLICAÇÕES

A espectrometria de massa éuma técnica capaz de determinarmassas molares de forma muito pre-cisa em experimentos rápidos (pou-cos minutos). Essas informações pos-sibilitam a resolução de diversos pro-blemas em química de proteínas, taiscomo: checagem da correção de umaseqüência de aminoácidos, identifi-cação de proteínas, determinação da

Figura 1 - Técnicas de ionização e tipos de analisadores de massa: A) eletropulverização (ESI), mostrando a agulha depulverização, os filtros iniciais que impedem a progressão de partículas não-ionizadas e o início de um sistema de quadripolos;B) quadripolos em um sistema de triplo quadripolo, esquematizando partículas conduzidas ao detector à esquerda; C) dessorçãoa laser (MALDI) ilustrando um pulso de laser incidindo sobre a amostra aplicada na placa retangular e gerando partículasionizadas. À esquerda das partículas são mostrados filtros eletrônicos que impedem a passagem de partículas não-ionizadaspara o analisador TOF; D, E e F) analisador tipo TOF no modo refletor (reflectron), apresentando todo o tubo de vácuo comos íons no início da trajetória (D), a mudança de trajetória no refletor (E) e a chegada ao detector após o refletor – acima, notubo estreito (F)


fidelidade e homogeneidade de pro-teínas recombinantes, identificaçãode complexos protéicos não-covalentes, detecção de doençasgenéticas, identificação de modifica-ções químicas em proteínas, deter-minação de glicosilações — adiçãode açúcares à molécula de proteína— e fosforilações — adição defosfatos à molécula de proteína —,seqüenciamento de proteínas epeptídios etc. As possibilidades deaplicação da espectrometria de mas-sa não se esgotam aqui. Existemvários outros usos dessa novatecnologia re lac ionados àbiotecnologia e a áreas correlatas.Aplicações que envolvem análise decarboidratos, lipídios e ácidosnucléicos estão se tornando rotinatambém. A seguir são relacionadasalgumas apl icações daespectrometria de massa em quími-ca de proteínas.

Determinação precisa damassa molar de proteínas

A espectrometria de massa éuma das técnicas analíticas mais pre-cisas existentes. Consegue-se facil-mente 5 ou 6 algarismos significati-vos nas medidas de massa molar,com erros que podem chegar a ape-nas 0,001 % em equipamentos dealta resolução. A título de compara-

ção, na eletroforese em gel, técnicaainda muito utilizada para separaçãode misturas protéicas e medidas demassas molares de proteínas, conse-guem-se erros de no mínimo 5 %. Aprecisão dos espectrômetros demassa é tanta que é possível distin-guir duas moléculas de 10.000 uque diferem entre si pela presençade apenas 1 carbono-13 (13C) namolécula — o carbono-12 (12C) é oisótopo mais abundante na natureza.A espectrometria de massa é, por-tanto, entre todas as técnicas exis-tentes, a que possibilita a determina-ção mais precisa da massa molar deproteínas e peptídios.

Checagem da pureza deproteínas e peptídios

O estado de pureza de proteí-nas e de peptídios é um aspectoextremamente importante em quí-mica de proteínas. A checagem des-sa pureza pode ser feita utilizando-se a espectrometria de massa. Demaneira geral, a existência de umpico único em espectros de MALDIou no espectro reconstruído de ESIindica a presença de apenas umaforma molecular. A presença de doisou mais picos demonstra a existên-cia de isoformas ou de contaminantes.

A checagem de pureza porespectrometria de massa é um mé-

todo consideravelmente maissensível e, devido a sua gran-de precisão, bem mais fide-digno que outros méto-dos existentes, como acromatografia líquida — HPLC,s ig la em inglês parahigh performance liquidchromatography — e aeletroforese.

Identificação deisoformas protéicas

Isoformas protéicas sãoproteínas que têm a mesmafunção, mas são codificadaspor genes distintos e apre-sentam pequenas diferençasem sua seqüência. Por exem-plo, o fator de transformaçãobeta (TGF-B) existe em três

versões ou isoformas (TGF-B1, TGF-B2, e TGF-B3), cada uma delas écapaz de disparar uma cascata desinal ização que começa nocitoplasma e termina no núcleo dacélula. Essas isoformas são bastantedifíceis de separar pelos métodosusuais utilizados na purificação deproteínas. Sua presença pode serdemonstrada por meio daespectrometria de massa, desde quesuas massas molares sejam distintas.A ocorrência de um pico únicocromatográfico que produza doispicos distintos e próximos em umespectro de massa sugere a presen-ça de isoformas protéicas, que podeser confirmada por meio de técnicasde identificação de proteínas (veradiante).

Confirmação da seqüênciacompleta de aminoácidos

Se a massa molar calculada apart i r de uma seqüência deaminoácidos de uma proteína oupeptídio, determinada experimen-talmente, for igual àquela determi-nada por espectrometria de massa,pode-se concluir que a seqüênciaem questão está correta. Cabe res-saltar que a existência de aminoácidosisobáricos, ou seja, aminoácidos quepossuem a mesma massa molar oumassas molares muito próximas —

Figura 2 - Seqüenciamento por espectrometria de massa (CID-MS/MS). O espectro deMS/MS é rico em informações de seqüência. A diferença de massa entre os diversos picos podeauxiliar na dedução da seqüência do peptídio, uma vez que as ligações preferencialmenteclivadas pelo processo CID são as peptídicas. Espera-se obter, em um espectro de MS/MS, picoscorrespondentes às fragmentações da cadeia peptídica em diferentes posições, determinandoas séries A, B, C, X, Y e Z, cujas massas auxiliam na dedução da seqüência do peptídio. Nafigura, foram ilustradas as séries B e Y, correspondentes aos fragmentos provenientes dafragmentação apenas das ligações peptídicas

SIETDVSFDK

y3

y6

b2y

1 y7

y2

y4

y5 y8

y10

b1 b b4

B 6b

b8

b9

b10

496.4

628.4

300 600 900 1200

m/z, amu

1000

2000

3000

1285.4

595.2

886.8147.0

409.4710.2

811.2 1140.888.1

200.8

3331.0 431.2

7739.0

879.6

994.4

1122.4

262.2

496.4

628.4940.4

,

1000

2000

3000

Inte

nsid

ade,

cps SIETDVSFDKSIETDVSFDK

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cuja diferença é inferior ao erro damedida —, deixa certa dúvida a res-peito da seqüência correta. Porém, acomparação com seqüências simila-res ou mesmo com a seqüência dogene pode minimizar essas dúvidas.

Confirmação da correção daexpressão de proteínas

recombinantes

A tecnologia de DNArecombinante é hoje muito utilizadana indústria da biotecnologia. Trata-se de uma série de procedimentosusados para juntar-se (recombinar)segmentos de DNA com determina-do objetivo biotecnológico. A corre-ção da expressão de proteínasrecombinantes pode ser avaliada pormeio da determinação exata de suasmassas molares uti l izando-seespectrometria de massa. Essa técni-ca pode ser utilizada no controle dequalidade da fidelidade da expres-são gênica e pureza do material ob-tido, uma aplicação particularmenteútil para a indústria da biotecnologia.

Determinação de modificaçõespós-traducionais

A maioria das proteínas, apósser sintetizada — ou seja, traduzida—, sofre modif icações pós-traducionais. Uma das maneiras maiscomuns em que uma proteína émodificada é pelo processo deglicosilação, no qual oligossacarídeossão ligados a sítios específicos dacadeia polipeptídica. Mais de 60 %das proteínas naturais são glicosiladas.Açúcares ligados à estrutura de pro-te ínas podem auxi l iar noenovelamento correto da proteína,servir de epitopos de reconhecimen-to de anticorpos, servir como umacapa de proteção contra a ação deproteases ou exercer um papel nalocalização e na orientação de prote-ínas da membrana celular, apenaspara citar alguns exemplos. Aespectrometria de massa tem sidoextensivamente utilizada para de-terminação do conteúdo decarboidratos em glicoproteínas, paralocalização de sítios de glicosilação eaté para determinação de estruturas

glicídicas.A fosforilação de uma proteína é

uma das mais importantes modifica-ções pós-traducionais com efeito di-reto na atividade celular. A maioriados processos metabólicos em umacélula eucariótica são regulados emcertos pontos pela fosforilação deuma ou mais proteínas-chave. Aregulação da transcrição genética, aprogressão do ciclo celular, a prolife-ração, a divisão e a diferenciaçãocelular, a dinâmica citoesquelética ea estocagem e recuperação de ener-gia são todos processos dependen-tes de fosforilação. A identificaçãode sítios específicos de fosforilação éuma etapa importante em direçãoao entendimento das vias de sinali-zação intracelulares. Cada vez maisesse trabalho tem sido conduzidopor meio da espectrometria de mas-sa.

Os aminoácidos que são normal-mente fosforilados são a serina, atreonina e a tirosina, emborafosforilações em resíduos de histidinae ácido aspártico também sejam des-critas. Se a seqüência completa deaminoácidos da proteína fosforiladafor conhecida, os sítios de fosforilaçãopodem ser determinados simples-mente analisando-se a misturapeptídica obtida de um digestoenzimático por espectrometria demassa. Os peptídios com massa de98 u — resultante da adição deH3PO4 — acima do esperado pelaseqüência estão fosforilados.

Seqüenciamento de proteínaspor MS/MS

Trabalhos de seqüenciamentopor espectrometria de massa sãoconduzidos normalmente em equi-pamentos conjugados, ou seja, quepossuem pelo menos doisanalisadores de massa. Tais equipa-mentos associam dois analisadoresde massa em série e, por isso, atécnica é conhecida como MS/MS —por alusão à espectrometria de mas-sa (MS, sigla em inglês para massspectrometry) seguida de outraespectrometria de massa. Equipa-mentos típicos de MS/MS incluemespectrômetros de eletropulve-

rização com triplo quadripolo ou comum quadripolo e um analisador TOF(Q-TOF), equipamentos do tipo apri-sionamento de íons (ion trap) eequipamentos com ionização do tipoMALDI com dois analisadores TOF(MALDI-TOF-TOF).

Nesse tipo de análise, uma amos-tra de peptídio puro ou mesmo umamistura de peptídios obtidos por di-gestão enzimática é injetada noespectrômetro de massa. No casomais complexo de mistura depeptídios, um peptídio de interesseé selecionado no 1º filtro de massa,introduzido e acelerado em uma câ-mara de colisão, onde existe umacorrente gasosa de um gás inerte,como nitrogênio ultrapuro. As coli-sões entre as moléculas do íonpeptídico e do gás inerte provocama fragmentação da cadeiapolipeptídica. Esse fenômeno é cha-mado de dissociação induzida porcolisão — CID, sigla em inglês paracollision induced dissociation. Asligações mais lábeis são justamenteas ligações peptídicas, seguidas pe-las demais ligações da cadeia princi-pal. Assim, um espectro dessa frag-mentação é rico em informações deseqüência (Figura 2). Existe umanomenclatura para descrever os di-versos fragmentos peptídicos passí-veis de serem obtidos por CID-MS/MS (Figura 3), que auxilia na inter-pretação dos espectros de MS/MS.

As vantagens do seqüencia-mento por MS/MS em relação aosmétodos químicos incluem a granderapidez — um experimento de MS/MS pode ser feito em menos de 5min, o mesmo trabalho em umseqüenciador automático pode de-morar até dois dias —, o baixíssimocusto — enquanto o seqüenciamentoquímico utiliza diversos reagentesde alto custo, a técnica de MS/MSgasta praticamente somente nitro-gênio — e a grande sensibilidade —seqüenciamento químico na ordemde picomol; MS/MS na ordem defemtomol. As desvantagens são adifícil interpretação dos espectros —os resultados não costumam ser tãoclaros como no seqüenciamento quí-mico — e a grande dificuldade parase distinguir os aminoácidos isobáricos


leucina e isoleucina. Aminoácidos quepossuem massas molares muito pró-ximas, tais como glutamina e lisina,fenilalanina e sulfóxido de metionina,bem como alguns aminoácidos edipept ídios , ou mesmo doisdipeptídios, podem ser distinguidosem espectrômetros de massa maisprecisos.

Atualmente, existem programasque selecionam automaticamente ospeptídios de interesse para fragmen-tação, técnica chamada de CID de-pendente de dados (data-dependentCID), ou mesmo que permitem quetodos os peptídios que entram noespectrômetro de massa sejam frag-mentados ao mesmo tempo, méto-do conhecido como multiplexação.Esses programas tornam oseqüenciamento por MS/MS com-pletamente automatizável.

Seqüenciamento de proteínaspor espectrometria de massa

usando o fenômeno do

decaimento pós-fonte — post-source decay (PSD)

Na espectrometria de massacom ionização por dessorção a lasere análise por tempo de vôo (MALDI-TOF), uma fração grande de íons doanalito sofre deterioração durante ovôo — post-source decay (PSD) —dentro do espectrômetro de massa,após o desligamento da fonte delaser . Dessa forma, o espectro obti-do de peptídios de tamanho médio(até 2.800 u) é rico em informaçõesde seqüência, apesar de o padrão declivagem ser diferente daquele obti-do por dissociação induzida por coli-são. O mecanismo de ativação pare-ce ser determinado por eventos decolisão entre os íons e as moléculasneutras, no campo de aceleração.Essa técnica de seqüenciamento fi-cou conhecida como PSD e só podeser usada em equipamentos do tipoMALDI.

Seqüenciamento escada

Uma estratégia alternativa deseqüenciamento é o chamadoseqüenciamento escada ( laddersequencing), que consiste na forma-ção de uma família de polipeptídiosparcialmente fragmentados, cada umdiferindo do próximo pela perda deum aminoácido. Esses peptídios-es-cada podem ser gerados por meiode métodos enzimáticos, como ouso de carboxipeptidases, ou quími-cos, como ácido clorídrico (HCl) di-luído, ácido pentafluoropropiônico,ácido heptafluorobutírico ou mesmoa degradação de Edman, que utilizaa reação seletiva N-terminal comisotiocianato de fenila. A segundaetapa consiste na determinação pre-c isa das massas dos vár iospolipeptídios degradados, por meioda espectrometria de massa. Essamistura de peptídios pode ser anali-sada em conjunto, em uma únicaetapa, não necessitando ser separa-

Figura 3 - Nomenclatura para descrever os diversos fragmentos peptídicos obtidos por CID. A figura mostra um tetrapeptídioque pode ser clivado em 9 posições principais, podendo gerar 18 fragmentos diferentes, dependendo de que lado fica a cargapositiva, uma vez que somente o fragmento carregado é detectado por espectrometria de massa. Quando, na fragmentaçãoda cadeia polipeptídica, a carga positiva permanece no lado N-terminal da molécula, os íons são nomeados A

n, B

n e C

n,

dependendo se a quebra aconteceu nas ligações CH–CO, CO–NH ou NH–CH da cadeia principal, respectivamente, em quen é o número de cadeias laterais existentes no fragmento. De forma análoga, se a carga positiva permanecer na porção C-terminal da molécula os íons produzidos são designados por X

n, Y

n e Z

n


da previamente. Os aminoácidos emseqüência são identificados levando-se em conta a diferença de massaentre os sucessivos picos. As vanta-gens do seqüenciamento escada so-bre os métodos químicos usuais sãoa rapidez — porque economiza umacorrida cromatográfica em cada ciclo— e o baixo custo por ciclo. Asvantagens em relação a outros méto-

dos que utilizam espectrometria demassa incluem a maior facilidade nainterpretação dos espectros e a ex-tensão da seqüência, normalmentebastante superior no seqüenciamentoescada. Essa técnica fornece melho-res resultados em equipamentos dotipo MALDI, devendo-se evitarutilizá-la em equipamentos do tipoESI, pois este produz uma família de

envelopes de carga, o que dificultamuito a interpretação dos resulta-dos.

Identificação de proteínas

A identificação de proteínas éum procedimento de capital impor-tância na abordagem proteômica. Umdos procedimentos utilizados paraidentificar proteínas em bancos deseqüências sem a necessidade deseqüenciar a proteína em estudo é achamada “impressão digital do mapapeptídico” (peptide massfingerprint). Nesse método, é feitauma digestão enzimática ou químicada proteína, in vitro , seguida de umaanál ise espectrométr ica dospeptídios obtidos. As massas mola-res desses fragmentos peptídicos sãoentão comparadas com massas depeptídios provenientes de digestõesteóricas, in silico, de proteínas de-positadas em bancos de seqüências.A identificação é probabilística e aporcentagem de cobertura dospeptídios da amostra com relação àproteína pareada é um dos principaisparâmetros de identificação (Figura 4).

Geralmente, o equipamento deescolha nesse caso é o MALDI-TOF.O método da impressão digital domapa peptídico é praticamente infa-lível — e particularmente útil — naidentificação de proteínas de espé-cies com genomas pequenos e com-pletamente seqüenciados. Entretan-to, o índice de insucesso na identifi-cação aumenta à medida que seaumenta o número de registros con-frontados no banco de dados utiliza-do na busca. Para proteínas isoladasde espécies cujo genoma não estáseqüenciado, é necessário usar ban-cos de dados ampliados (sem restri-ção taxonômica). Nesse caso, é im-perativo utilizar fragmentos de se-qüência (sequence tags) para umaidentificação mais confiável, geral-mente obtidos em equipamentos dotipo MALDI-TOF-TOF.

Mapeamento de interaçõesmoleculares

A palavra proteoma está nor-malmente associada ao conjunto de

Figura 4 - Esquema geral para identificação de proteínas por espectrometriade massa. A partir de proteínas separadas por 2D-PAGE (eletroforesebidimensional) selecionam-se as manchas eletroforéticas de interesse e realizam-se a clivagem enzimática de tais proteínas (1). O digesto é submetido à análisepor MALDI-TOF (2) para caracterização das massas dos peptídeos (4) e eventualfragmentação de algum peptídeo por PSD (5) ou análise por TOF-TOF paraobtenção de fragmentos de seqüência (sequence tags). Outra alíquota do digestopode ser submetida à cromatografia em fase reversa associada à espectrometriade massa por ESI (3), obtendo-se espectros com envelopes de cargas parapeptídeos maiores (6), que podem ter a sua massa calculada por algoritmos dereconstrução (8), ou para peptídeos menores (7), que podem ser fragmentadospor CID e ter sua seqüência determinada (9).


proteínas expressas por um deter-minado tipo de célula em um deter-minado momento. Entretanto, esseconceito fornece apenas uma visãoestática do processo biológico. Defato, as proteínas exercem suas fun-ções como resultado de interaçõesaltamente dinâmicas com outras pro-teínas. A célula pode ser vista comouma série de “máquinas moleculares”interagindo umas com as outras. Es-sas máquinas moleculares são, naverdade, formadas por grandes com-plexos de proteínas. A modulaçãoespacial e temporal dessas interaçõesé o que efetivamente define as fun-ções celulares , em termosmoleculares. O número total degenes humanos não difere substan-cialmente do verme nematódeoCaenorhabditis elegans, o que suge-re que a complexidade fenotípicapode ser atribuída parcialmente àcombinação contextual dos produ-tos genéticos e suas interações. Aespectrometria de massa está sendoagora utilizada como uma ferramen-ta para explorar a dinâmica dasinterações entre proteínas.

Um método direto para estudara interação proteína-proteína consis-te na observação direta do comple-xo protéico por microscopia de forçaatômica e na determinação da cons-tante de afinidade. Um métodoespectrométrico que vem ganhandoprestígio nos últimos tempos é ochamado SELDI (sigla em inglês parasurface-enhanced laser desorptionionization). Nele, a placa de MALDIé quimicamente modificada de for-ma a permitir a ligação de uma “mo-lécula isca”, que agrupa em torno desi as proteínas que por ela têm afini-dade, imobilizando-as também naplaca. As proteínas não-ligantes sãoretiradas por lavagem da placa. Aplaca é então montada na fonteionizadora de MALDI e as proteínasque interagiram com a “moléculaisca” são analisadas por SELDI-TOF.Essa técnica tem sido sugerida paramapear epitopos de anticorpos, imo-bilizando-se o antígeno na placa deSELDI usando o anticorpo como“isca”. A proteína-alvo é entãodigerida e os peptídios que não es-tão ligados ao anticorpo são lavados.Os peptídios que formam o epitopo

podem então ser determinados porSELDI-TOF.

Um método alternativo para de-terminar interações protéicas é cha-mado espectrometria de massa debioafinidade e consiste na análisedireta do complexo em umespectrômetro de massa. Essa técni-ca parece estar ganhando espaço ese tornando uma ferramenta-padrãona determinação de interações pro-teína-proteína. Estudos recentes su-gerem uma estratégia geral para aanálise em larga escala de interaçõesproteína-proteína usando a aborda-gem de co-precipi tação/espectrometria de massa. Uma “eti-queta” de afinidade é expressa liga-da diretamente a uma proteína-alvo.As proteínas-alvo são sistematica-mente depositadas, juntamente comoutras proteínas participantes docomplexo protéico, em uma colunade afinidade. O complexo é desfeitoe as proteínas participantes do com-plexo são separadas por eletroforeseem poliacrilamida — sodium dodecylsulfate polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE) — deuma dimensão. As proteínas são en-tão extraídas do gel, digeridas comtripsina e identificadas por impres-são digital do mapa peptídico(peptide mass fingerprint). A orga-nização funcional do proteoma deuma levedura foi caracterizada usan-do tal método e 232 complexosmultiprotéicos foram determinados,sugerindo novos papéis celularespara 344 proteínas.

CONCLUSÕES

Enfim torna-se cada vez maisevidente a importância daespectrometria de massa em pes-quisas envolvendo proteínas. NoBrasil, apesar da existência de pou-cos pesquisadores que dominam atécnica, vários projetos encontram-se em desenvolvimento, permitindoum aprofundamento significativo emquestões de interesse regionais enacionais, como doença de Chagas,utilização de enzimas em processosindustriais, peptídios biologicamen-te ativos, reprodução animal, pragasde lavouras, imunologia do traumaetc. A recém instalada Rede

Proteômica Nacional, que associa la-boratórios em todo o País que traba-lham com a abordagem proteômica,demandará de forma sistemática ecrescente a ut i l ização deespectrômetros de massa, cada vezmais precisos e versáteis. O parqueinstalado de equipamentos no Brasiljá não pode ser considerado peque-no. Porém, o número de pesquisado-res que utilizam, em algum momen-to de sua pesquisa, a espectrometriade massa de proteínas cresce deforma exponencial e, portanto, aoferta de equipamentos deve acom-panhar essa demanda. De acordocom o estabelecido para a RedeProteômica Nacional, laboratórioscentrais, que já possuem equipa-mentos, pessoal treinado, programasde manutenção e experiência naárea, fornecerão a infra-estruturabásica de equipamentos para os la-boratórios-satélite, de forma que to-dos possam se beneficiar dos recur-sos existentes com o mínimo dedesperdícios de insumos para o País.

BIBLIOGRAFIARECOMENDADA

Westermeier, R. & Naven, T. (2002)Proteomics in Practice: ALaboratory Manual of ProteomeAnalysis, Ed. Wiley-VCH Verlag,Germany.

Wilkins, M.R., Williams, K.L., Appel,R.D. & Hochstrasser, D.F. (1997)Proteome Research: NewFrontiers in FunctionalGenomics, Ed. Springer-Verlag,Germany.

Simpson, R. J. (2003) Proteinsand Proteomics, a LaboratoryManual , Ed.Cold Spring HarborLaboratory Press, New York, USA.

Siuzdak, G. (1996) MassSpectrometry for Biotechnology ,Ed. Academic Press, San Diego,USA.

Sousa, M.V., Torres, F.A.G., Ricart,C.A.O., Fontes, W. & Silva, M.A.S.(2001) Gestão da Vida? Genomae Pós-Genoma, Ed. Ao Livro Téc-nico, Rio de Janeiro, Brasil.


BIOCATALIZADORESIMOBILIZADOS

1 RESUMO

A imobilização de células ouenzimas representa uma alternativapara a condução de bioprocessosuma vez que, teoricamente, osbiocatalisadores imobilizados ficamretidos para serem utilizados por tem-po indefinido.

É difícil definir quais os melho-res suportes e técnica de imobiliza-ção a serem utilizados na imobiliza-ção de células ou enzimas específi-cas, pois há uma ampla variação nãosó nas características dos materiais aserem imobilizados, mas também nascondições prevalecentes durante oprocesso.

A presente revisão busca deta-lhar alguns dos principais suportesutilizados para a imobilização de cé-lulas ou enzimas, visando à produçãode insumos de interesse industrial apartir de diferentes matérias-primas.

2 INTRODUÇÃO

2.1 O que é imobilização?A imobilização pode ser defini-

da como o movimento não indepen-dente das células ou enzimas naparte aquosa do sistema, por esta-rem alojadas dentro ou na superfíciedo agente imobilizador (TAMPION eTAMPION, 1988). A imobilização tam-bém é definida como a fixação deenzimas ou células vivas em umambiente, de maneira que sua ativi-dade catalítica não seja afetada ne-gativamente (CANTARELLI, 1989).O uso em processo contínuo, o au-mento da estabi l idade e oreaproveitamento do material bioló-gico são considerados como as prin-

cipais vantagens propiciadas pelaimobilização (VITOLO, 1988; CAR-VALHO, CANILHA e SILVA, 2006).

Existem dois tipos de leito paraa imobilização de células, os que asaprisionam fisicamente e os que asaderem à superfície. No primeirocaso, são encapsuladas em glóbulosou fibras feitas de polissacarídeos, deproteínas ou de polímeros sintéti-cos. No segundo, as células são fixa-das ao suporte de imobilização dire-tamente por ligações químicas(iônicas ou covalentes) (MEERSMAN,1992). Como exemplo de um mate-rial para adesão superficial de célulasdestaca-se DEAE celulose (dietilamino etil celulose), material durá-vel, inerte e não poroso, além defraco trocador iônico. Suas partículastêm superfície suficientemente irre-gular para formar um traçado perme-ável de alta resistência ao entupi-mento. Este material tem mais afini-dade com leveduras do que combactérias. As leveduras imobilizadasem DEAE celulose são aplicadas namaturação contínua de cerveja e naprodução de cerveja livre de álcoolou de baixo teor a lcoól ico(MEERSMAN, 1992; Van IERSEL etal ., 2000). Como exemplos de mate-rial usado para o aprisionamento físi-co de células, destacam-se as mem-branas de alumina, que promovem oalojamento das células no interior deseus poros irregulares, formando umatrama permeável de alta resistênciaao entupimento e reduzindo ao mí-nimo as contaminações(BORENSTEIN, 2003).

2.2 Imobilização versuscélulas livres

O uso de sistemas com células

PESQUISA

Uso de células e enzimas imobilizadas em processos biotecnológicos

Larissa CanilhaEngenheira Química, Mestre e Doutora emBiotecnologia IndustrialDepartamento de BiotecnologiaEscola de Engenharia de Lorena (EEL)Universidade de São Paulo (USP)[email protected]

Walter de CarvalhoFarmacêutico, Mestre e Doutor em BiotecnologiaIndustrial - Professor e pesquisadorDepartamento de BiotecnologiaEscola de Engenharia de Lorena (EEL)Universidade de São Paulo (USP)[email protected]

João Batista de Almeida e SilvaEngenheiro Químico, Mestre em Ciência eTecnologia de Alimentos , Doutor em TecnologiaBioquímico-FarmacêuticaProfessor e pesquisadorDepartamento de BiotecnologiaEscola de Engenharia de Lorena (EEL)Universidade de São Paulo (USP)[email protected]



imobilizadas tem sido consideradocomo uma alternativa viável para seaumentar a produtividade em razãodas elevadas densidades celularesnormalmente obtidas (RAMA-KRISHNA e PRAKASHAM, 1999).

A imobilização eleva a atividadefermentativa da levedura, promo-vendo a adaptação das células aomeio e eliminando a fase lag embateladas sucessivas de fermentação(DURAN e BAILEY, 1986). Em siste-mas contínuos, há uma diminuiçãodo risco de contaminação em opera-ções com altas taxas de diluição ealta concentração de células, haven-do também redução da formação desubprodutos por células residuais eeliminando a necessidade de remo-ção das células ou de reciclo, tornan-do a extração do produto mais efici-ente (WILLIAMS e MUNNECKE,1981). Em sistemas com células imo-bilizadas consegue-se maior massade células por unidade de volume detrabalho do que em sistemasdescontínuos, contínuos e de recu-peração de células trabalhando comcélulas l ivres (WILLIAMS eMUNNECKE, 1981; PILKINGTON,MARGARITIS e MENSOUR, 1998).Outras vantagens do uso de célulasimobilizadas em relação ao uso decélulas em suspensão no meio defermentação são: a facilidade dereutilização dos biocatalisadores, oaumento da estabilidade destesbiocatalisadores e a redução de cus-tos operacionais (PILKINGTON,MARGARITIS e MENSOUR, 1998;RAMAKRISHNA e PRAKASHAM,1999; CARVALHO, CANILHA e SIL-VA, 2006). O sistema que usa célulaslivres de leveduras em modo contí-nuo de fermentação é limitado, umavez que podem ocorrer perdas decélulas no fermentador. Além disso,as células imobilizadas são mais re-sistentes a condições adversas, umavez que a matriz de imobilizaçãogeralmente resulta em maior prote-ção a estas células. Por este motivo,procura-se produzir etanol com cé-lulas imobilizadas (LEE, AHN e RYU,1983).

Os reatores com células imobili-zadas permitem alto desempenhoporque trabalham com altas densida-des de células fixadas nos suportes.

Uma desvantagem é que o estadofisiológico dos organismos não podeser controlado (BORENSTEIN, 2003).Isto é particularmente prejudicial nossistemas em que o metabólito se-cundário é o produto principal, poisé produzido na fase estacionária oude decréscimo de at iv idade(HAMDY, KIM e RUDTKE, 1990).

Resumidamente, há três moti-vos básicos para aceitar a imobiliza-ção de células: 1-reutilizar obiocatalisador por mais de um ciclofermentativo; 2- usar um processocontínuo sem reciclo celular; 3- au-mentar a es tabi l idade dobiocatalisador em relação às varia-ções de pH, temperatura, concen-tração de nutrientes ou do meio defermentação (HAMDY, KIM eRUDTKE, 1990).

Atualmente, a importância e ointeresse desta tecnologia são ilus-trados pelo grande número de publi-cações observadas nos últimos anose também pela estabilização de al-guns processos em escala industrial(FREEMAN e LILLY, 1998;RAMAKRISHNA e PRAKASHAM,1999; Van IERSEL et al ., 2000; CAR-VALHO et al., 2005).

2.3 Células imobilizadasversus enzimas imobilizadas

A dificuldade em se recuperar aenzima do meio reacional ao final dacatálise, aliada à instabilidade e fre-qüente inadequabilidade para usoem determinados solventes e/ou con-dições de pH, temperatura e expo-sição a agentes desnaturantes, po-dem ser superadas por meio da imo-bilização. A enzima imobilizada podeser reutilizada e é normalmente maisestável em relação à enzima livre,com a vantagem adicional de possi-bilitar a utilização de um processocontínuo (CARVALHO, CANILHA eSILVA, 2006). Porém, à medida queos estudos com células imobilizadasavançaram, observou-se que a imo-bilização de células é mais vantajosaem relação à imobilização deenzimas, pois evita o trabalho deextraí-las dos microorganismos parafixá-las, em seguida, a um suporte(CHIBATA, TOSA e SATO, 1983).Nos processos onde há imobilizaçãode células, a fermentação é acelera-

da por causa do aumento da densida-de celular. Assim é possível conduzira operação contínua com alta taxa dediluição, atingir rendimento especí-fico mais alto, eliminar fermentadoresmais caros e exercer controle fácil emais ef ic iente do processofermentativo (KOLOT, 1980).

Quando os cofatores são neces-sários no processo biotecnológico, ouso de células é preferível ao deenzimas imobilizadas, pois as célulaspossuem a capacidade de regeneraros cofatores naturalmente, além denão requerer etapas de extração epurificação, apresentar menor custoe maior resistência a perturbaçõesambientais. As células podem serimobilizadas sem perda significativade sua atividade catalítica e, portan-to, são mais eficazes quando se tratade catalisar uma série de reaçõessubseqüentes, além de apresenta-rem alta estabilidade operacional ede armazenamento (CORCORAN,1985).

3 MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃOE TIPOS DE SUPORTE

O método e o tipo de suporte aserem empregados em um determi-nado processo devem ser estabele-cidos empiricamente, recaindo a es-colha do binômio suporte-métodosobre aquele que apresentar maiorretenção da atividade. A escolha dométodo de imobilização e do tipo desuporte dependerá basicamente dedois fatores: 1- das característicaspeculiares do material biológico; 2-das condições de uso do sistemaimobilizado. Face à variabilidadedestes fatores, pode-se afirmar quenão existe um método geral de imo-bilização e nem um suporte univer-sal, adequados para qualquer pro-cesso (CORCORAN, 1985; VITOLO,1988).

3.1 Métodos de imobilizaçãoExistem vários métodos para a

imobilização de biocatalisadores. Es-tes métodos podem ser divididosem quatro grandes grupos, confor-me ilustrado na Figura 1.

O método de imobilização pormeio de auto-agregação envolve aagregação ou a floculação das célu-


las de maneira natural ou artificial-mente induzida. Desta forma, osbiocatalisadores são ligados entre sisem a necessidade de uso de umsuporte de imobilização. A floculaçãonatural é uma propriedade de relati-vamente poucas células. Além disso,agregados celulares naturais são ge-ralmente instáveis e sensíveis a ten-sões de cisalhamento, sendo neces-sária a adição de agentes químicosque formam ligações cruzadas entrecélulas, como glutaraldeído, durantea imobilização (GROBOILLOT et al. ,1994).

O método de imobilização pormeio de ligação a superfícies podeser realizado por meio de interaçõesiônicas ou adsortivas, ou através deligações covalentes entre gruposreat ivos do suporte e dobiocatalisador. A ligação por meio deadsorção e/ou interações iônicas éum método simples e barato, exis-tindo a possibilidade de regenerar amatriz utilizada, porém apresentacomo desvantagem a vulnerabilidadede perda dos biocatalisadores imobi-lizados para o meio reacional impe-dindo o trabalho em condições mui-to severas. Para aumentar a massa debiocatalisadores imobilizados, supor-tes porosos têm sido geralmente

utilizados, permitindo a ligação dobiocatalisador também à estruturasuperficial interna. Por outro lado, aimobilização por meio de ligaçõescovalentes resulta em uma interaçãobiocatalisador-suporte mais forte,sendo a principal desvantagem orisco de danos à membrana celular,no caso de imobilização de células(GROBOILLOT et al . , 1994 ;PRADELLA, 2001).

A imobilização por meio de apri-sionamento em matrizes porosas,como o alginato e a carragena, nor-malmente envolve a sintetização insitu da matriz porosa em torno dosbiocatalisadores a serem imobiliza-dos. Os poros da matriz formada sãomenores que as células contidas nointerior (PRADELLA, 2001). Estemétodo tem sido extensivamenteestudado para a imobilização de cé-lulas viáveis, devido à possibilidadede uso de polímeros hidrofílicosbiocompatíveis como suportes deimobilização (GROBOILLOT et al. ,1994). Além disso, as células imobi-lizadas em uma matriz hidrofílicapodem ser protegidas de condiçõesnão adequadas de pH, temperatura,solventes orgânicos e/ou compostosinibidores presentes no meio de fer-mentação (PARK e CHANG, 2000).

Como principais desvantagens sãocitadas: o pequeno volume disponí-vel para a contenção das célulasimobilizadas, a perda de células parao meio de fermentação e a instabili-dade dos suportes normalmente uti-lizados, que limita a utilização dosagregados por longos períodos (PARKe CHANG, 2000; PRADELLA, 2001).

O método de imobilização pormeio de contenção por barreiras en-volve a utilização de membranaspré-formadas (reatores do tipohollow fiber) ou a formação in situda membrana em torno das células aserem imobilizadas (KAREL, LIBICKIe ROBERTSON, 1985). Este método,também conhecido comoencapsulamento, tem sido utilizadocomo uma tecnologia alternativa aoaprisionamento em matrizes poro-sas, uma vez que oferece vantagenscomo maior capacidade de conten-ção de células e prevenção da perdade células para o meio de fermenta-ção. Devido à ausência de núcleogelificado, as limitações à transferên-cia de massa também são reduzidas(PARK e CHANG, 2000).

Face ao exposto, todos os mé-todos de imobilização apresentamvantagens e desvantagens. Emboraa estabilidade das células não possa

Figura 1 - Métodos de imobilização de enzimas e células


ser garantida em todos os casos, asseguintes vantagens são citadas:inóculo retido no suporte, possibili-dade de melhor controle das propri-edades reológicas do meio, maiorpureza e rendimento de produtos,não há necessidade de extração epurificação das enzimas e podem seresperados resultados econômicosmais favoráveis (GROBOILLOT etal., 1994; PRADELLA, 2001).

3.2 Tipos de suporteNa literatura são citados inúme-

ros materiais inertes que podem serusados como suportes. A naturezafísica destes suportes varia desdemateriais geliformes (alginato, álco-ol polivinílico, carragena, etc) atésuperfícies sólidas (vidro poroso,Eupergit C, alumina, etc). Os supor-tes podem ser classificados em cincotipos fundamentais: 1. microporososou não porosos (vidro, sílica, nylon);2. microencapsulados (nitrocelulose,triacetato de celulose); 3. polímeroscom moderado grau de ligações cru-zadas (poliacrilamida); 4. polímeroscom baixo grau de ligações cruzadas(sephadex, DEAE celulose); 5.macroporosos (sílica, alumina)(VITOLO, 1988; GERBSCH eBUCHHOLZ, 1995).

Os materiais utilizados como su-portes deveriam idealmente ser en-contrados com facilidade e abundân-cia, ter baixo custo, resultar em baixo

custo de imobilização, facilidade deoperação em grande escala, não apre-sentar toxidez as células, apresentaralta capacidade de retenção e terresistência mecânica para uma longavida operacional (NAGASHIMA,1984; PRADELLA, 2001). Os supor-tes inorgânicos são mais vantajososque os orgânicos pela durabilidade,densidade, estabilidade e controlede porosidade (NAGASHIMA, 1984).Segundo MOUEDDEB et al. (1996),os materiais inorgânicos tambémapresentam como vantagem a facili-dade de esterilização e limpeza.

3.3 Tipos de reatoresutilizados com células

imobilizadasOs reatores para trabalhos com

células imobilizadas podem ser divi-didos em três categorias, de acordocom o padrão de fluxo: reatores demistura, reatores de leito empacota-do e reatores de leito fluidizado (Fi-gura 2). Estes reatores podem tam-bém ser modificados para melhoraras características de transferência demassa e a capacidade de controledas condições de cultivo ou paraminimizar o estresse imposto ao su-porte de imobilização (FUKUDA,1994; BARON, WILLAERT e BACKER,1996).

Os fatores que devem ser leva-dos em consideração quando da es-colha de um determinado tipo de

reator para o cultivo de células imo-bilizadas são: 1- requerimentos detransferência de massa (principal-mente suprimento de oxigênio eremoção de gases), 2- método deimobilização empregado, 3- caracte-rísticas da matriz de imobilizaçãoutilizada, 4- natureza do substrato, 5-requerimentos para o cultivo domicroorganismo utilizado (FUKUDA,1994; PILKINGTON, MARGARITIS eMENSOUR, 1998). A escolha inade-quada do reator pode provocar rom-pimento do suporte de imobilização.Desta forma, é importante escolherum reator que permita uma adequa-da mistura do meio sem provocardanos a matriz de imobilização(PILKINGTON, MARGARITIS eMENSOUR, 1998).

Os reatores de mistura repre-sentam o tipo de reator mais ampla-mente utilizado para o cultivo decélulas em suspensão, seja em esca-la laboratorial, seja em escala indus-trial (BARON, WILLAERT, BACKER,1996). Embora vários tipos de turbi-nas possam ser utilizados, a principaldesvantagem relativa ao uso destetipo de reator para o cultivo decélulas imobilizadas refere-se à ten-são de cisalhamento imposta a matri-zes sensíveis (GROBOILLOT et al.,1994). Este reator apresenta vanta-gens como fácil controle de tempe-ratura e pH, e a sua operação emmodo contínuo é adequada em casos

Figura 2 - Tipos de reatores para trabalhos com células imobilizadas:(a) reator de mistura; (b) reator de leito empacotado; (c) reator de leito fluidizado


de inibição pelo substrato (FUKUDA,1994). Além disso, oferece as me-lhores características de mistura etransferência de oxigênio(GROBOILLOT et al., 1994).

Nos reatores de leito empacota-do, os agregados imobilizados sãoempacotados em uma coluna, atra-vés da qual o meio de fermentação épassado. Apesar da simplicidade dedesign e baixo custo, este tipo dereator é mais utilizado em fermenta-ções anaeróbicas. Para cultivosaeróbios, entretanto, a aeração domeio de fermentação geralmente nãoé suficiente para oxigenar todo oreator devido à depleção rápida dooxigênio no início da coluna(GROBOILLOT et al., 1994). Alémdisso, desvios do comportamentoideal de fluxo, do tipo plug flow, sãoconstantemente observados duranteas fermentações por motivos diver-sos (acúmulo de gases como de CO2,compactação do leito, acúmulo debiomassa suspensa), levando à for-mação de caminhos preferenciais, oque prejudica as taxas de produçãoatravés de limitações à transferênciade massa (FUKUDA, 1994).

Os reatores de leito fluidizadorepresentam um compromisso entreos reatores de mistura e os reatoresde leito empacotado, aliando as boascondições de mistura (característicados reatores de mistura) às baixastensões de cisalhamento (caracterís-tica dos reatores de leito empacota-do). Em contraste com os reatores deleito empacotado, os reatores deleito fluidizado facilitam a misturaentre as fases líquida e sólida, facili-tam a remoção de gases e minimizama pressão sobre o leito de agregadosimobilizados. Para a obtenção de boascaracterísticas de fluidização, a dife-rença de densidade entre os agrega-dos celulares e o meio de fermenta-ção deve ser a maior possível. Destaforma, géis de hidrocolóideshidratados, como alginato de cálcio,não são recomendados devido à se-melhança de densidades entre opolímero e o meio de fermentaçãoaquoso. Dependendo do tamanho edensidade do suporte, das taxas defluxos de gases e líquidos e da geo-metria do leito, diversos padrões demistura podem ser obtidos nos quais

as fases líquidas e sólidas podemestar sendo adequadamente mistu-radas ou não. Desta forma, depen-dendo das condições hidrodinâmicasdo sistema, os agregados celularespodem sofrer limitações de transfe-rência de massa, o que irá prejudicaras taxas de produção (GROBOILLOTet al. , 1994).

3.4 Suportes utilizados para aimobilização de enzimasExistem diversos materiais que

podem ser utilizados como suportepara a imobilização de enzimas. En-tre eles, Eupergit C, alumina e sílica(Tabela 1) têm sido bastante repor-tados na literatura.

3.4.1 Eupergit CEupergit C é um suporte que

consis te em microesferasmacroporosas, desenvolvido atravésda copolimerização de N,N’-metileno-bis-metacrilamida, glicidil-metacrilato, alil-glicidil-éter emetacrilamida. Este suporte é quimi-camente estável em qualquer valorde pH, ou seja, pode imobilizar umaenzima em qualquer faixa de pHentre 0 e 14, na qual ela é estável enão perde a sua atividade catalítica.Eupergit C também é mecanicamen-te estável, uma vez que não apre-sentou nenhum desgaste após 650ciclos de operação em reatores demistura com volumes de substratode até 1000L (KATCHALSKI-KATZIRe KRAEMER, 2000). Este suporte jáfoi avaliado para a imobilização devárias enzimas: β-galactosidase deBacillus circulans, α-galactosidasede Aspergillus oryzae, para transfor-mar lactose em glicose e galactose,ou produzir galacto-oligossacarídeos(HERNAIZ e CROUT, 2000) ;ciclodextrina glicosiltransferase(CGTase) de Thermoanaerobactersp., para a formação de ciclodextrina(MARTÍN et al., 2003); β-glicosidasede Aspergillus niger (Novozyme188), para produção de etanol apartir de hidrolisados lignocelulósicos(TU et al. , 2006); lipase de Candidarugosa , para produção de glicerol(KNEZEVIC et al., 2006). A revisãoelaborada por KATCHALSKI-KATZIRe KRAEMER (2000) apresenta umavisão detalhada do assunto e tam-

bém referencia outros trabalhos queusaram este suporte para a imobili-zação de enzimas.

3.4.2 AluminaA alumina é um material

inorgânico, inerte, poroso, transpa-rente, estável e não tóxico além deapresentar boa durabi l idade(ALBRAS, 2003). Em ensaios quefizeram uso da alumina para a imobi-lização de enzimas, foi constatadoque este suporte é um material bas-tante resistente a altas temperaturase pHs (COSTA et al., 2001). Confor-me descrito por IDA, MATSUYAMAe YAMAMOTO (2000), a membranade alumina pode ser usada comosuporte para a imobilização deenzimas, pois ela é mecanicamenteforte e quimicamente estável. Porestas e outras características aalumina vem sendo utilizada na imo-bilização de diversas enzimas:catalase de Bacillus sp., para otratamento de efluentes têxteis (COS-TA et al., 2001); glicoamilase de A.niger ( IDA, MATSUYAMA eYAMAMOTO, 2000); lipase deCandida antarctica , para síntese debutil butirato (LOZANO et al., 2002);amilase de Bacillus subtilis, utiliza-da nas indústrias alimentícias efermentativas (RESHMI, SANJAY eSUGUNAN, 2006).

A alumina, a quitosana e a celu-lose também foram utilizadas comosuportes na imobilização da enzimacatalase de A. niger, para a decom-posição de peróxido. O sistema queresultou em maior atividade foi aimobilização em glutaraldeído-celu-lose. A atividade da catalase emglutaraldeído-celulose foi aumentan-do após alguns meses de estocagem,provavelmente devido à formaçãode ligações covalentes entre aenzima e o suporte, desenvolvidoscom o tempo. Já a enzima imobiliza-da na alumina ficou inativa e a estru-tura da enzima imobilizada naquitosana foi destruída (EBERHARDTet al. , 2004).

3.4.3 SílicaSílica é um produto sintético,

produzido pela reação de silicato desódio e ácido sulfúrico. Ao seremmisturados, forma-se um hidrosol que


lentamente se contrai para formaruma estrutura sólida de sílica gel,também chamada hidrogel. A sílicagel é bastante utilizada como supor-te para a imobilização de enzimaspor apresentar as seguintes vanta-gens: possui alta resistência mecâni-ca, estabilidade térmica e química;possui alta resistência à contamina-ção e à degradação microbiana; apre-senta elevada área superficial poro-sa (PEREIRA e KUBOTA, 2004;DAVID et al., 2006). Conforme des-crito na Tabela 1, sílica gel foi utili-zada como suporte na imobilizaçãodas seguintes enzimas: lipase deCandida cylindracea, que catalisa ahidrólise de triacilglicerol em ácidosgraxos livres e glicerol (MORENO eSINISTERRA, 1994; CARVALHO etal., 2003); cloroperoxidase deCaldariomyces fumago, que podemser usadas na degradação oxidativade clorofenóis e compostos fenólicospresentes em águas residuais derefinaria (PETRI, GAMBICORTI eSALVADORI, 2004; HERNANDEZ,2005); invertase de S. cerevisiae,utilizada em indústrias alimentíciaspara produção de adoçantes (DAVIDet al., 2006).

3.5 Suportes utilizados para aimobilização de célulasExistem diversos materiais que

podem ser utilizados como suportepara a imobilização de células. Géisde alg inato, carragena epoliacrilamida, alumina, terra deKanuma, caule de cana e sílica sãoalguns exemplos de suportes des-critos na literatura (Tabela 2).

3.5.1 Alginato de cálcioO método de aprisionamento

em gel de alginato de cálcio é umatécnica extensivamente utilizadapara a imobilização de células viá-veis (RAMAKRISHNA ePRAKASHAM, 1999). Como a for-mação do gel ocorre rapidamentena presença de íons cálcio, semalterações drásticas de temperatura,pH e pressão osmótica, a atividadee a viabilidade dos microorganismosimobilizados são conservadas(CORCORAN, 1985). Vantagenscomo baixo custo, grande disponibi-lidade no mercado, possibilidade de

Tabela 2 - Exemplos de suportes utilizados na imobilização de células.

Suporte Microorganismo Referência

Alginato de cálcio

Candida tropicalis eSaccharomyces cerevisiae Jamai et al. (2001)

Kluyveromyces lactis Becerra et al. (2001)

Candida guilliermondii Carvalho et al. (2005)

Carragena

- López, Lázaro e Marques (1997)

S. cerevisiae Nigam (2000)

Pseudomonas dacunhae Çahk et al. (1999)

Escherichia coli Leng, Zheng e Sun (2006)

Poliacrilamida

S. cerevisiae Siess e Divies (1981)

S. uvarumPundle, Prabhume e Sivaraman(1988)

S. cerevisiae Norouzian et al. (2003)

Alumina

S. cerevisiae

Hamdy, Kim e Rudtke (1990)

Santos et al. (1998)

Borenstein (2003)

Zymomonas mobilis Bekers et al. (2001)

Lactobacillus rham nosus Moueddeb et al. (1996)

Bactérias redutoras de sulfato eBactérias metanogênicas

Silva et al. (2006)

Levedura/fabricação de vinhos Kourkoutas et al. (2006)

Terra de Kanuma, Carvãoativado, Celulose em pó

Levedura/produção de etanol Kumakura, Yoshida e Asano (1992)

Tabela 1 - Exemplos de suportes utilizados para a imobilização de enzimas

Suporte Microorganismo Enz ima Referência

Eupergit C

Bacillus circulans ß-galactosidase Hernaiz e Crout (2000)

Aspergillus oryzae -galactosidase Hernaiz e Crout (2000)

Thermoanaerobacter sp.Ciclodextrinaglicosiltransferase Martín et al. (2003)

Aspergillus niger ß-glicosidase Tu et al. (2006)

Candida rugosa Lipase Knezevic et al. (2006)

Alumina

Bacillus sp. Catalase Costa et al. (2001)

A. niger Glucoamilase Ida, Matsuyama eYamamoto (2000)

Candida antarctica Lipase Lozano et al. (2002)

Bacillus subtil is AmilaseReshmi, Sanjay eSugunan (2006)

Alumina, Quitosanae Celulose A. niger Catalase Eberhardt et al. (2004)

Sílica gel

Saccharomyces cerevisiae Invertase David et al. (2006)

Caldariomyces fumago Cloroperoxidase Petr i, Gambicorti eSalvadori (2004)

Sílica gel eAlumina Candida cylindracea Lipase Moreno e Sinister ra(1994)

α


ampliação de escala de produção e aaceitação das substâncias utilizadaspara a imobilização (alginato e cloretode cálcio) como aditivos na produ-ção de alimentos têm sido citadas nali teratura (CORCORAN, 1985;CHAMPAGNE, BLAHUTA eGAGNON, 2000). Entre as desvanta-gens do uso deste polímero comosuporte destacam-se a instabilidadequímica na presença de agentesquelantes do íon cálcio (como fosfato,lactato e citrato), a tendência dasesferas em sofrer dilatação na pre-sença de cátions monovalentes e aslimitações impostas à transferênciade substratos e produtos (FREEMANe LILLY, 1998). Este suporte já foiutilizado para a imobilização de célu-las de Candida tropicalis eSaccharomyces cerevisiae, na pro-dução de etanol (JAMAI et al., 2001);Kluyveromyces lactis, na produçãode lactose (BECERRA et al ., 2001);Candida guilliermondii, na produ-ção de xilitol (CARVALHO et al.,2005).

3.5.2 CarragenaA carragena é um polímero na-

tural presente na estrutura celular dealgas do tipo Rodophyceae. Estepolissacarídeo tem a particularidadede formar colóides e géis em meiosaquosos a concentrações muito bai-xas (CREDIDIO, 2006). O sistemade imobilização de células emcarragena é promissor para a produ-ção industrial de etanol. Quando foiutilizado gel de alginato de cálciopara a imobilização de células, osuporte não apresentou boa estabili-dade operacional quando compara-do ao uso de células imobilizadas emcarragena (CHIBATA, TOSA e SATO,1986). Este suporte já foi então uti-lizado para a imobilização de célulasde S. cerevisiae, visando à produçãode etanol (LÓPEZ, LÁZARO e MAR-QUES, 1997; NIGAM, 2000) ;Pseudomonas dacunhae , visando àprodução de L-alanina (ÇAHK et al.,1999); Escherichia coli , visando àprodução de L-fenilalanina (LENG,ZHENG e SUN, 2006).

3.5.3 PoliacrilamidaUm outro tipo de suporte utili-

zado em fermentação alcoólica é a

poliacrilamida. A poliacrilamida é umpolímero formado pela mistura dedois monômeros, acrilamida ebisacrilamida, formando uma espé-c ie de rede. Células deSaccharomyces cerevisiae foramimobilizadas em gel de poliacrilamidae foi verificado que dentro das partí-culas do gel a viabilidade celular secomportou de forma heterogênea,com um elevado número de célulasnão-viáveis. Por outro lado, as célu-las que se encontravam na superfíciedo gel mantiveram a capacidade deformar colônias com boa atividadefermentativa (SIESS e DIVIES, 1981).Também foi avaliada a estabilidadedesse suporte para imobilização decélulas de Saccharomyces uvarumna produção de etanol. A estabilida-de das células imobilizadas em gelde poliacrilamida foi maior que asdas células imobilizadas em alginatode cálcio (PUNDLE, PRABHUME eSIVARAMAN, 1988). A poliacrilamidatambém foi utilizada na imobilizaçãode S. cerevisiae, para a bioconversãode etanol e butanol em aldeídos(NOROUZIAN et al., 2003).

3.5.4 AluminaConforme visto anteriormen-

te, a alumina é um material inorgânicoque apresenta diversas vantagenspara ser utilizada como suporte deimobilização. Sua vida útil, se nãoilimitada, é mais longa do que a dossuportes orgânicos mais comumenteusados em testes com fermentaçãoalcoólica (SANTOS et al ., 1998;BEKERS et al., 2001; RESHMI, SANJAIe SUGUNAN, 2006). NAVARRO,LUCCA e ALLIERI (1982) tambémassinalaram que o baixo custo daalumina torna-a mais atrativa paraimobilizar células de leveduras.MOUEDDEB et al . (1996) ressalta-ram que a alumina apresenta algu-mas vantagens sobre os materiaisorgânicos, destacando-se a facilida-de de esterilização e limpeza. Porestas características, este materialvem sendo utilizado na imobilizaçãode células de S. cerevisiae, para aprodução de etanol (HAMDY, KIM eRUDTKE, 1990; SANTOS et al., 1998;BORENSTEIN, 2003); Zymomonasmobilis , para produção de levânio eetanol (BEKERS et al ., 2001);

Lactobacillus rhamnosus, para a pro-dução de ácido lático (MOUEDDEBet al ., 1996). Segundo BEKERS et al .(2001), desde 1982 a alumina vemsendo amplamente utilizada comosuporte para a imobilização deenzimas e microorganismos. A revi-são elaborada por estes autoresreferencia diversos trabalhos que uti-lizaram este suporte para imobiliza-ção de biocatalisadores.

SILVA et al. (2006) avaliaramvários tipos de suportes, inclusive aalumina, na imobilização de bactéri-as redutoras de sulfato e bactériasmetanogênicas . Espuma depoliuretano e carbono vegetal foramos suportes mais indicados para aimobilização das bactérias redutorasde sulfato enquanto que a cerâmicade alumina apresentou-se como osuporte mais indicado para asarchaea metanogênicas. Estes auto-res afirmam que o sucesso de umreator anaeróbico está diretamenteassociado com o material usado comosuporte da imobil ização. Já,KOURKOUTAS et al. (2006) avalia-ram o efeito de armazenamento ereuso das células imobilizadas delevedura em alumina, “kissiris” epedaços de maçã, durante a fabrica-ção do vinho. As células imobilizadasapresentaram maior estabilidade queas células livres quanto ao períodode estocagem e atividade, indepen-dentemente do suporte utilizado. Osresultados também mostraram queas células imobilizadas não apresen-taram efeito negativo na composi-ção dos produtos responsáveis peloaroma dos vinhos, durante aestocagem. Estes autores tambémdestacam outros trabalhos da litera-tura que utilizam alumina, “kissiris” epedaços de maçã como suporte paraa imobilização na produção de vi-nhos.

3.5.5 Outros tipos de suportesCélulas de levedura também fo-

ram imobilizadas em suportes poro-sos de terra de Kanuma (solo prove-niente do Japão), carvão ativado ecelulose em pó, por polimerização epor irradiação a baixa temperatura.As fermentações alcoólicas foramrealizadas em reatores com célulasimobilizadas ou com recuperação de


células. Os reatores com células imo-bilizadas se apresentaram como amelhor alternativa nesse bioprocessoquanto ao custo e complexidade,além de terem produzido mais etanol.A terra de Kanuma foi mais efetivaque a celulose em pó, pois a ativida-de das suas células imobilizadas per-maneceu constante por longos perí-odos. Ao final, células imobilizadasobtidas por copolimerização de doismonômeros (10% de metoxinonaetilenoglicol metacrilato e 10%de hidroxietil metacrilato) usando30% de terra de Kanuma apresenta-ram a mais alta produtividade emetanol (KUMAKURA, YOSHIDA eASANO, 1992).

4 CONCLUSÕES

O uso de biocatalisadores imo-bilizados (enzimas e células) é umaestratégia a ser utilizada para a con-dução de bioprocessos em váriassituações. Aliada à engenharia, bio-química, microbiologia e genética,esta tecnologia pode ser utilizadacomo uma ferramenta para aumen-tar a eficiência de processosbiotecnológicos e,consequentemente, reduzir custosde produção. Para aproveitar o enor-me potencial desta metodologia, osdesafios a superar passam pela pro-dução de suportes e coadjuvanteseficientes e de baixo custo, assimcomo pela harmonização dos com-ponentes do trinômio suporte - mé-todo de imobilização - uso do siste-ma imobilizado.

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GenômicaFuncional

MecanismosBiológicos

Genoma

Análise doMETABOLOMA

Introdução

Durante as décadas de 80 e90, foi investido muito tempo e es-forço no sequenciamento do códigogenético de diversos organismos,com o intuito de se elucidar comple-tamente o mecanismo de funciona-mento celular em nível molecular.No entanto, após todo este esforço,ficou evidente que o conhecimentodas sequências de todos os genes deum organismo não é suficiente parase entender todos os mecanismosmoleculares de uma célula. Por estarazão, na era pós-genômica, ou era

pós-sequenciamento, os cientístasestão recorrendo (novamente) à bi-oquímica clássica para buscar ferra-mentas que auxiliem na elucidaçãoda função dos milhares de genes queforam sequenciados, mas que per-manecem com função desconheci-da.

Como consequência, surgiuuma nova área nas ciências biológi-cas, conhecida como Genômica Fun-cional (Figura 1), que tem comoobjetivo primordial determinar fun-ção para os diversos genessequenciados. Basicamente, a fun-ção de um gene é determinada quan-do são identificados os seus respec-tivos produtos gênicos, ou seja,RNAm, proteína e metabólitos. Se-melhante à nomenclatura utilizadapara a palavra genoma, que designao conjunto de todos os genes de umorganismo, os conjuntos dos respec-tivos produtos gênicos também re-ceberam a terminação (ou sufixo)“oma” (Villas-Bôas et al., 2005a).Assim, o conjunto de todos os RNAmtranscritos por um organismo passoua ser chamado de transcriptoma e oconjunto de todas as proteínas deproteoma. O metaboloma, o maisrecente dos “omas”, é usado para sereferir ao conjunto de todos osmetabólitos que são produzidos e/ou modificados por um organismo.

A análise dos produtos gênicosem sistemas vivos requer o uso detécnicas analíticas bastante sofistica-das, que gerem dados suficientespara serem combinados às informa-ções já obt idas com osequenciamento dos genomas. Mé-todos rápidos e práticos foram de-senvolvidos, os quais são capazes de

PESQUISA

Silas Granato Villas-BôasPhD em Biotecnologia, Pesquisador, AgResearchLimited, Grasslands Research CentreNova Zelâ[email protected]

Andreas K. GombertDoutor em Engenharia QuímicaProfessor Doutor Escola PolitécnicaUSP - São [email protected]


Uma ferramenta biotecnológica emergente na era pós-genômica

Figura 1- Genômica FuncionalGenômica funcional promete preencher rapidamente o “espaço” entre seqüência efunção gênica, aumentando o conhecimento sobre os mecanismos de funcionamentodos sistemas biológicos


(virtualmente) determinar os níveisde todos os genes transcritos(transcriptoma) e de todas as prote-ínas traduzidas (proteoma) numacélula (Godovac-Zimmermann &Brown, 2001; Baldi & Hatfield, 2002;Cristoni & Bernardi, 2003). Contudo,métodos modernos para a análise dometaboloma ainda estão em desen-volvimento (Villas-Bôas et al.; 2005b).

A área metabolômica surgiumuito recentemente, devido ao fatode que as alterações nos níveis deRNAm nem sempre resultavam emalterações nos níveis de proteínas(Gygi et al., 1999), e uma veztraduzida, uma proteína podia estarou não enzimaticamente ativa(Sumner et al., 2003). Assim, as alte-rações observadas no transcriptomae no proteoma nem semprecorrespondiam a a l teraçõesfenotípicas. A Figura 2 ilustra, deforma muito simplificada, os possí-veis pontos de regulação em nívelmolecular do funcionamento celular.Os metabólitos, como substratos, pro-dutos ou cofatores nas reações bio-químicas, desempenham um papelmuito importante na conexão dasdiferentes vias metabólicas que ope-ram dentro de uma célula viva. Onível dos metabólitos de uma célulaou tecido é determinado pela con-centração e propriedades dasenzimas, sendo portanto, função de

um complexo sistema regulatóriooperante dentro das células (ex.;regulação da transcrição e da tradu-ção, regulação das interações prote-ína-proteína, e regulação alostéricadas enzimas através das suasinterações com os metabólitos). Por-tanto, o nível dos metabólitos repre-senta uma informação integrativa dafunção celular em nível molecular,definindo assim o fenótipo de umacélula ou tecido em resposta a alte-rações ambientais ou genéticas. Aidentificação do nível dos metabóli-cos é, desse modo, um complemen-to fundamental na determinação dafunção gênica.

Muitos metabólitos participamde diversas reações bioquímicas di-ferentes, amarrando as diferentespartes do metabolismo celular à umarede metabólica altamente controla-da (Nielsen, 2003). Deste modo, aalteração do nível de um únicometabólito numa célula resulta naalteração do nível de diversos outrosmetabólitos que estão direta e indi-retamente conectados ao primeiro,demonstrando ass im que ometaboloma de uma célula ou teci-do tem a capacidade de responderrapidamente a qualquer alteraçãoambiental e/ou genética, sendo in-clusive capaz de caracterizar muta-ções ditas silenciosas.

Neste artigo, serão apresenta-

dos alguns aspectos sobre a áreapós-genômica mais emergente, achamada metabolômica. Serão abor-dadas as novas tecnologias analíticasdisponíveis para a análise dosmetabólitos celulares e será apre-sentada uma breve discussão sobreas diversas aplicações das análisesmetabolômicas.

Características e desafíos daárea metabolômica

Como o transcriptoma e oproteoma, o metaboloma é depen-dente do contexto, ou seja, o nívelde cada metabólito depende do es-tado fisiológico, de desenvolvimen-to, e/ou patológico de uma célula,tecido ou organismo (Villas-Bôas etal., 2005b). No entanto, uma impor-tante diferença é que, diferentemen-te dos RNAm e das proteínas, édifícil, ou praticamente impossível,estabelecer uma ligação direta entregenes e metabólitos. A naturezainterconectada do metabolismo ce-lular, no qual um mesmo metabólitopode participar de diversas viasmetabólicas, dificulta extremamentea interpretação dos dadosmetabolômicos. Além disso, acredi-ta-se que, os organimos complexosou pluricelulares, tais como nos ve-getais e animais, produzam muitomais metabólitos do que genes, pois

Genoma

Genes

Transcriptoma

RNAm

Proteoma

Proteínas

Metaboloma

Metabólitos

Figura 2 - O funcionamento celular em nível molecularA informação codificada no DNA é transcrita em uma molécula de RNA mensageiro que é traduzida em uma molécula de proteínaque, quando não exercendo um papel extrutural, irá catalizar uma ou mais reações químicas dentro e/ou fora da célula, sendoportanto responsável pela transformação de pequenas moléculas químicas chamadas de metabólitos. Os metabólitos, por suavez, regulam a atividade das proteínas, o processo de transcrição e tradução, além de servirem de substratos para modificaçãoe síntese das proteínas e lipídeos, e síntese de DNA e RNA. Portanto os metabólitos são os produtos finais do metabolismo celular.


múltiplos RNAm podem ser forma-dos a partir de um único gene, múl-tiplas proteínas a partir de um únicoRNAm, e múltiplos metabólitos apartir de uma única enzima, porquemuitas enzimas aceitam mais de umsubstrato, apesar de sua altaseletividade (Schwab, 2003). Noentanto, para os organismosunicelulares têm-se detectado muitomenos metabólitos do que genes.Como exemplo, para a leveduraSaccharomyces cerevisiae foramidentificados pouco mais que 700metabólitos, para um genoma deapproximadamente 6 mil genes(Famili et al.; 2003). Para a bactériaEscherichia coli, que possui cerca de4400 genes, foram identificados pou-co mais de 400 metabólitos (Edwards& Palsson, 2000). Todavia, é impor-tante lembrar que muitos intermedi-ários metabólicos possuem um tem-po de vida muito curto dentro dascélulas o que dificulta sua detecção.

Outro grande desafio na áreametabolômica é a análise dosmetabólitos, que é muito mais com-plexa do que as análises dos RNAme mesmo das proteínas, pois a análi-se do genoma (DNA) e dotranscriptoma (RNAm) se baseia naanálise química de biopolímeros com-postos por apenas 4 nucleotídeosdiferentes, e no caso do proteoma,

que é consideravelmente mais com-plexo, de biopolímeros formados porbasicamente 22 aminoácidos dife-rentes. Esses biopolímeros são qui-micamente muito similares, o quefacilita o desenvolvimento de técni-cas analíticas de grande escopo. Ometaboloma, entretanto, é compos-to por uma grande variedade decompostos químicos de baixa massamolar (< 1000 Da), os quais possu-em propriedades químicas diversas.O metaboloma compreende desdeespécies iônicas a carboidratoshidrofílicos, álcoois e cetonas volá-teis, aminoácidos e ácidos orgânicos,lipídeos hidrofóbicos e produtos na-turais complexos. Essa complexida-de química, adicionada à enormevariação de concentrações (variandode pmoles a mmoles), torna a análisesimultânea de todo o metabolomade uma célula uma tarefa pratica-mente impossível. Portanto, ometaboloma vem sendo estudadoatravés da aplicação de métodos efi-cientes de preparação de amostrasacoplados a uma combinação de di-ferentes técnicas analíticas moder-nas, de modo a se obter a maiorquantidade de informação possível.

A análise do metaboloma

A análise do metaboloma en-

volve a determinação dos níveis (ouconcentrações) de compostos quí-micos de baixa massa molar (menorque 1000 Da), que estejam presen-tes dentro e fora das células. OliverFiehn (2002) foi o primeiro a proporuma classificação das diversas abor-dagens analíticas disponíveis para aanálise de metabólitos, dividindo-asem quatro grupos principais: (i) aná-lise direcionada; (ii) perfil metabóli-co; (iii) metabolômica e (iv)“fingerprinting” metabólico (Esque-ma 2). No entanto, hoje em dia estáevidente que essa classificação ébastante confusa e subjetiva, princi-palmente a abordagem denominadametabolômica, que se refere a umaanálise química na qual todos osmetabólitos de um organismo seri-am supostamente identificados equantificados, o que ainda é umatarefa impossível devido à grandecomplexidade e dinamismo dometaboloma. Portanto, foi sugeridoque a palavra metabolômica fosseusada para descrever a nova área daciência responsável pela análise dometaboloma, ao invés de se referirsomente a uma abordagem analíticaespecífica (Villas-Bôas et al. 2005a)(veja os atuais conceitos no Esque-ma 1). Assim, do ponto de vistaanalítico há basicamente duas abor-dagens principais para se analisar o

Esquema 1 - Nova classificação das abordagens analíticas para a área metabolômica de acordo com oproposto por Villas-Bôas et al. (2005a).

MetabolômicaMetabolomaConjunto de

metabólitos {Oliveret al. 1988}

Área da ciência responsávelpela caracterização de

fenótipos metabólicos{ometaboloma} em determinadas

condições{e.g. diferentesestágios de desenvolvimento,

diferentes condiçõesambientais, diferentes modifi-cações genotípicas} e a liga-

ção destes fenótipos com seusgenótipos correspondentes

Fingerprintingmetabólico

Footprintingmetabólico

Metabólitos intracelularesidentificados ou não

Metabólitos extracelularesidentificados ou não


metaboloma: (a) análise direcionadae (b) perfil metabólico, sendo queeste último pode ser ainda sub-divi-dido em (i) “fingerprinting” metabó-lico, quando se refere a perfil demetabólitos intracelulares, e (ii)“footprinting” metabólico, quando serefere a perfil de metabólitosextracelulares.

A diferença entre análisedirecionada e perfil metabólico éque a primeira refere-se à determi-nação de um grupo de metabólitospré-definidos, ignorando outrosmetabólitos que porventura sejamdetectados ou detectáveis durante aanálise. Por outro lado, o perfil meta-bólico pode ser definido como oconjunto de todos os metabólitos ouprodutos derivados dos mesmos(identificáveis ou não) e que sejamdetectados em uma amostra usandouma técnica analítica particular, acom-panhado por uma estimativa de quan-tidade (absoluta ou relativa). Nor-malmente, no perfil metabólico, faz-se uso de separações cromatográficasbastante eficientes, mas, muitas ve-zes, uma boa resolução pode serobtida usando-se simplesmente po-derosos detectores químicos, como

a ressonância magnética nuclear(NMR), a espectroscopia deinfravermelho usando transformaçãode Four ier (FT-IR) ou aespectrometria de massa de ionização“electrospray” (ESI-MS). Essesdetectores são normalmente empre-gados para classificar rapidamenteas amostras por análise de dadosmultivariados ou quimiometria (Villas-Bôas et al. 2005b).a) A preparação das amostras

A preparação das amostras éuma das etapas cruciais na análise dometaboloma porque é nessa etapaque se introduz a maior parte dosartefatos analíticos. A Figura 3 resu-me os principais passos na prepara-ção das amostras. O primeiro passo éa interrupção rápida do metabolismocelular, o que no inglês é chamadode “quenching” celular. A interrup-ção instantânea do metabolismo énecessária pois os níveis metabóli-cos variam muito rapidamente emfunção de quaisquer alterações noambiente da célula (ex. decréscimoou aumento do nível de oxigêniodissolvido; variação na luminosidade,no caso de organismosfotossintetizantes, entre outros). A

meia-vida típica de metabólitos pri-mários intracelulares está na ordemde um segundo ou menos. Por exem-plo, em Saccharomyces cerevisiae,a glicose citossólica é convertida auma velocidade de aproximadamen-te 1 mmol/s e o ATP a aproximada-mente 1.5 mmol/s (de Koning e VanDam, 1992). Embora a meia-vidados metabólitos extracelulares sejamaior que dos intracelulares, ainda éimportante interromper qualquer ati-vidade bioquímica nas amostrasextracelulares, para se evitar qual-quer variação nos níveis dosmetabólitos. O “quenching” meta-bólico é obtido através de uma alte-ração drástica de temperatura ou depH. Existe uma grande variedade demetodologias descritas na literatura,sendo que a amostragem em nitro-gênio líquido ou em solução demetanol frio (< -40 oC) são as técni-cas mais empregadas (Villas-Bôas etal. 2005b, c).

Depois do “quenching” meta-bólico, é necessário separar abiomassa celular do meio de culturaextracelular (isso no caso de culturade células ou microrganismos) e se oobjetivo é analisar os metabólitos

Esquema 2 - Classificação das abordagens analíticas para a área metabolômica deacordo com o proposto por Fiehn (2002).

MetabolomaConjunto de

metabólitos {Oliveret al. 1988}

Análises alvoAnálise de um peque-no grupo específico

de metabólitos

Perfil metabólicoAnálise de um grupopré-selecionado de

metabólitosMetabolômica

Análise quantitativa equalitativa de todos os

metabólitos sintetizadospor um organismo

FingerprintingmetabólicoRápida classificação de

amostras contendometabólitos sem a identifica-

ção dos compostos

Para o estudo do efeitoprimário de uma altera-

ção genética

Para o estudo da alteraçãode uma via metabólica por

intersecção de viasmetabólicas

Para estudar efeitospleiotrópicos de uma

alteração genética

Para rápida caracterizaçãofenotípica


intracelulares, esses deverão ser ex-traídos do meio intracelular, evitan-do-se ao máximo as perdas por de-gradação e/ou reação bioquímica. Oobjetivo da extração dos metabólitosintracelulares é torná-los acessíveisàs diferentes técnicas analíticas. Amaioria dos procedimentos de extra-ção de metabólitos é laborioso einevitavelmente ocorrem perdas de-vido a diferentes fatores, sendo queo principal é a grande diversidadequímica que caracter iza ometaboloma (Villas-Bôas et al.2005b,c) . Os metaból i tosintracelulares são geralmente extra-ídos com solventes orgânicos. Nor-malmente, usa-se mais de umsolvente para a extração das diferen-tes classes de metabólitos. Por exem-plo, solventes polares, como metanol,mistura de metanol e água, ou etanolpara se extrair metabólitos polares, esolventes apolares, como clorofór-mio, acetato de etila ou hexano parase extrair os compostos lipofílicos(Villas-Bôas et al. 2005b,c).

Depois da extração, as amostrascontendo os metaból i tosintracelulares são geralmente muitodiluídas devido à grande razão entrebiomassa e volume dos solventes

usados na extração. Essa diluição tam-bém pode ser observada em algu-mas amostras de metabólitosextracelulares. A última etapa napreparação das amostras é, portanto,a sua concentração, que normalmen-te é obtida através da liofilização,evaporação à vácuo dos solventesou por técnicas de extração seletivacomo a extração e a micro-extraçãoem estado sólido (Villas-Bôas et al.2005b, c).

b) A análise dos metabólitosA espectrometria de massa

(MS) e a ressonância magnética nu-clear (RMN) são os métodos maisusados na detecção e análise demetabólitos celulares. RMN é muitoútil na caracterização estrutural decompostos desconhecidos, e tem sidobastante empregada na análise dometaboloma. No entanto, em certascircunstâncias, o espectro de RMNde 1H não fornece informações sufi-cientes para se caracterizar comple-tamente um metabólito, principal-mente quando o composto é defici-ente em prótons ou quando osprótons podem ser quimicamenteintercambiados com o solvente. Poroutro lado, a RMN de 13C é poucosensível e portanto pode-se levar

horas para a análise de uma únicaamostra, além de que os equipa-mentos para RMN são muito caros,se comparados às tecnologias quefazem uso da espectrometria demassa.

A espectrometria de massaapresenta várias vantagens em rela-ção a outros métodos de análisequímica, entre elas estão principal-mente a sua alta sensibilidade epraticidade, combinadas à possibili-dade de se confirmar a identidadedos componentes presentes emamostras biológicas complexas e tam-bém à possibilidade de detecção e,na maioria das vezes, de identifica-ção de compostos desconhecidos oucuja presença na amostra seria ines-perada. Além disso, a combinação daespectrometria de massa com técni-cas de separação (cromatografia,electroforese) ampliou enormemen-te a capacidade de análise químicade amostras biológicas complexas. ATabela 1 resume as potencialidadese l imi tações das di ferentestecnologias analíticas que fazem usoda espectrometria de massa. A infor-mação básica contida num espectrode massa é muito simples. O espec-tro exibe a massa de moléculas

Concentraçãoda amostra

AMOSTRAEXTRAÇÃO

Separandomoléculas pequenas

AMOSTRAGEMQuenching dometabolismo

Separação dabiomassa do

meioextracelular

AMOSTRAEXTRACELULAR

Figura 3 - Principais etapas na preparação das amostras para análise do metabolomaA primeira etapa é a amostragem que deve ser realizada simultaneamente ao interrompimento do metabolismo celular(quenching), seguido da separação da biomassa do meio extracellular (quando possível). A segunda etapa é a extração dosmetabólitos intracelulares que poderá passar por uma etapa de concentração da amostra antes da análise (uma metodologiadetalhada sobre a análise do metaboloma de diversos organimos se encontra em Villas-Bôas et al. 2006b).


ionizadas e seus fragmentos corres-pondentes, e os valores das massassão simplesmente a soma das mas-sas dos átomos que compõe cadafragmento ou melécula. Um espec-tro de massa contém uma enormequantidade de informações estrutu-rais e sua interpretação requer umconhecimento abrangente e profun-do da técnica, porém quase sempreesse conhecimento não é necessáriona análise de metabólitos, pois jáexistem vários softwares disponíveisno mercado, que facilitam enorme-mente a interpretação dos dadosobtidos por espectrometria de mas-sa.

c) O tratamento dos dados

Após a análise das amostras,os dados obtidos precisam ser aindatratados de forma que sejam conver-tidos em algum tipo de informaçãoútil e interpretável. Há basicamenteduas maneiras para se tratar os dadosmetabolômicos: (i) fazer uma rápidaclassificação das amostras sem iden-tificação dos metabótidos ou (ii) iden-tificar o máximo número possível demetabólitos detectados. Na primeiraabordagem usa-se uma quantificaçãorelativa dos diferentes components(ex.; intensidade dos picos) e osdiversos componentes analisados sãoclassificados empregando-se uma no-menclatura aleatória, que não seja aidentidade do composto, como porexemplo o tempo de retenção ou

massa molar dos picos, ou compo-nentes A, B ...N. Essa abordagem égeralmente usada quando não seconsegue identificar facilmente oscompostos detectados e que geral-mente são obtidos através da injeçãodireta no espectrômetro de massaou RMN, sem separação prévia doscomponentes da amostra através decromatografia ou eletroforese. Essaabordagem é empregada quando sequer classificar rapidamente diferen-tes mutantes em relação aos tiposselvagens, ou diferentes estágios dedesenvolvimento de uma célula ouorganismo, ou mesmo diferenciarcélulas sadias de células enfermas;sem identificar, necessariamente, oque as diferenciam.

Técnicas de análise de dadosmultivariados como a “Associaçãopor Culpa” (do inglês ‘Guilty-by-Association’; Oliver, 2000) permi-tem indicar áreas do metabolismoque foram alteradas através da com-paração dos dados obtidos a partir deamostras conhecidas. Por exemplo,se um mutante na via glicolítica écomparado a um mutante desconhe-cido e este último apresenta umperfil metabólico semelhante ao pri-meiro, isso será uma forte indicaçãode que o mutante desconhecidopossui também uma alteração queafeta a via glicolítica, pois seus dadosse associam com os dados da linha-gem mutante que é conhecida porpossuir mutação na via glicolítica.Embora essa seja uma abordagemrápida e prática, ela é bastante limi-tada em informações, principalmen-te por não fornecer a identidade dosdiversos metabólitos detectados, oque dificulta a caracterização do es-tado das diferentes vias metabólicasativas nas células, impedindo, assim,uma direta integração dos dadosmetabolômicos com os dados dasoutras áreas da Genômica Funcional.

Por outro lado, hoje está evi-dente que o maior potencial da aná-lise do metaboloma depende da iden-tificação e quantificação (relativa ouabsoluta) dos diferentes metabólitosdetectados nas amostras (Bino et al.2004; Nielsen and Oliver, 2005; Villas-Bôas et al. 2005d). Alterações obser-vadas nos níveis de metabólitos es-pecíficos permitem identificar vias

Tabela 1 - Potencialidades e limitações das diferentes técnicas analíticas que fazem usoda espectrometria de massa

TécnicaAnalítica

Aplicações Gerais Vantagens Desvantagens

GC-MS(croma tografiade gases -espectrometriade massa)

Separação, identifica çãoe quantificaçãosimultânea de dife rentesclasses de metabólitos(voláteis e não voláte is)numa única anál ise.Basicamente, o tipo daanálise (direcionada ouperfil metaból ico) édefinida pelo modo dedetecção empregado(S IM 1 ou SCAN2).

Alta resoluçãocromatográfica, queé ideal pa ra resolveramostras biológicascomplexa s; Análi sesimultânea dedferentes classes dematabólitos.

Difícil aná lise decompostos termo-sensíveis;Metaból itos nãovolátei s devem serderivat izados antesda análise; Difícilidentificação decompostosdesconhecidos apósderivat iza çãoquímica

LC-MS(croma tografialíquida -espectrometriade massa)

Separação, identifica çãoe quantificação dediferentes grupos demetabólitos

Alta sensibilidade;Média a altaresoluçãocromatográfica;Análise decompostos nãovoláteis semderivatizaçãoFácila náli se decompostos te rmo-sensíveis.

Os e luentes devemser volátei s;Muita svezes as amostrasdevem serdesalinizadas apósseparaçãocromatográfica ; Opotencial deidentificação élimitado sem o usode MS em série(MS /MS)

CE-MS(eletroforese decapila r -espectrometriade massa)

Principalmente usadona sepa ração,identificação equanti ficação decompostos pola resusando pequenovolume de amostra

Útil na separação deisômerosmolecula res; Volumepequeno deamostra;Altaresolução.

Metodologiacomplexa;Difícilquantifica ção;Difilcudade deinterface CE comMS.

MS(espectrometriade massa)

A aplicação va ria deacordo com o métodode ionização.Geralmente empregadana dete rminação demetabólitos através dasua massa molar e perfilde fragmentação. Muitousada na obtenção deperfís metaból icos semidentificação doscompostos.

Análise rápida demetabólitos; Passossimples naprepa ração dasamostras; Altasensibil idade;Recomendado nacaracterização decompostosdesconhecidos.

Idetificação ecaracterização demetabólitos dependede MS/MS ; Gradeinterferência damatrix da amostra;Incompa tibilidadecom solventesfortemente iônicos etampões.

1SIM= Análise restrita de moléculas contendo fragmentos pré-selecionados. 2SCAN= Análiseindiscriminada da amostra ( todos os fragmentos)


metabólicas específicas que foramalteradas, facilitando enomermentea integração efetiva dos dados obti-dos nas diferentes áreas da GenômicaFuncional, além de possibilitar a iden-tificação e caracterização de novasvias metabólicas, a caracterização demutações/genes silenciosos e mes-mo a elucidação dos mecanismosregulatórios do metabolismo celular.Para esse tipo de análise, o primeiropasso é a análise estatística dos da-dos, ou seja, determinar se a variaçãoobservada nos níveis de cadametabólito é significativa. Normal-mente, usa-se o teste ‘t” ou a análisede variância (MANOVA). Natural-mente, os requisitos básicos paraesse tipo de análise são a replicaçãodas amostras (mínimo três, normal-mente de cinco a seis); a reproduçãodos cultivos (mínimo três, normal-mente de três a seis); o uso decontroles, que dependerão do estu-do em questão (ex.: linhagemparental das linhagens mutantes); apadronização interna (compostosexógenos adicionados às amostraspara avaliar as perdas durante a aná-lise); além da normalização dos da-dos obtidos usando-se a quantidadede biomassa coletada em cada amos-tra e/ou o padrão interno.

O ponto chave no tratamento

dos dados, no entanto, é avisualização/apresentação dos resul-tados. Os dados das “ômicas” sãomultivariados e portanto difíceis deserem visualizados. O objetivo prin-cipal neste tipo de análise é ilustrarcom a maior clareza possível as prin-cipais diferenças observadas nos ní-veis dos metabólitos presentes nasamostras a serem comparadas entresi. Com frequência, os resultados deníveis ou perfís metabólicos são apre-sentados em gráficos de barras, oque muitas vezes é bastante confu-so, tornando-se inviável à medidaem que o número de metabólitosdetectados e o número de variáveisa serem comparadas (ex. número demutantes ou linhagens) aumentam.Dessa forma, diversos softwares es-tão disponíveis no mercado e nainternet, muitos deles gratuitos, quepermitem realizar tratamentos dedados multivariados, ou seja, dadosgerados a par t i r de umamultiplicidade de amostras que re-presentam uma multiplicidade devariáveis. Não há um único ou me-lhor método para se tratar dadosmultivariados. A dica é escolher ummétodo versátil, aprendê-lo e saberusá-lo bem. Os principais métodossão a “Análise do Componente Prin-c ipal” (do inglês Principal

Component Analysis or PCA), a “Aná-lise de Discriminantes Múltiplos” (doinglês Fischer Discriminant Analysisor FDA) e as técnicas de agrupamen-to ou “clustering” (para maiores de-talhes consultar Villas-Bôas et al.2005b). Exemplos ilustrativos demodelos gráficos para cada métodousado no tratamento de dadosmultivariados estão apresentados naFigura 4.

Outras alternativas estão tam-bém sendo exploradas para a apre-sentação dos dados metabolômicos,as quais podem melhorar ainda maissua interpretação e integração comos dados da proteômica etranscriptômica. Particularmente,duas alternativas que fazem uso darazão diferencial da concentração decada metabólito nas diferentes vari-áveis testadas, merecem ser menci-onadas: (i) visualização em redemetabólica, na qual os metabólitoscom níveis aumentados ou diminuí-dos são apontados diretamente narede metabólica usando-se uma es-cala de cores (Figura 5), como ex-plorado por Villas-Bôas et al. (2005d),e (ii) Modelo de chips de DNA (ouDNA microarrays), nos quais os no-mes dos metabólitos tomam o lugardos nomes dos genes e cada colunarepresenta duas variáveis que estãosendo comparadas (Figura 6). Ascores indicam se o nível daquelemetabólito aumentou ou diminuiuna amostra analisada, em relação auma amostra padrão. Esse tipo detratamento de dados pode ser en-contrado em Villas-Bôas et al. (2005d,2006a).

Algumas aplicações dasanálises metabolômicas

a) Determinação dafunção gênica

A metabolômica foi criada eidealizada especificamente para serusada como ferramenta na determi-nação da função gênica (Villas-Bôaset al. 2005a). Como já foi discutidona introdução desse artigo, o níveldos metabólitos representa uma in-formação integrativa da função celu-lar em nível molecular, definindoassim o fenótipo de uma célula ou

Figura 4: Exemplos de gráficos usados na análise de dados multivariadosA: Análise do component principal; B: Análise de discriminantes múltiplos; C: Análisede agrupamentos não-hierárquico; D: Análise de agrupamentos hierárquico(dendogramas)


tecido em resposta a alteraçõesambientais ou genéticas. A avaliaçãodos níveis de metabólitos é um com-plemento fundamental na determi-nação da função gênica em célulasou tecidos. Porém, o metabolomatem se destacado principalmente nacaracterização fenotípica de muta-ções silenciosas. Mutações silencio-sas são modificações genéticas quenão resultam em nenhuma alteraçãoóbvia de morfologia, rendimento, ve-locidade de crescimento, ou de qual-quer outro parâmetro observável,em relação ao fenótipo de linhagensparentais sob uma dada condiçãofisiológica (Thorneycroft et al. 2001).Esse fenômeno é ainda mais surpre-

endente quando se altera genes co-nhecidos por desempenhar um pa-pel fundamental no funcionamentocelular. Acredita-se que o organismoalterado tem a capacidade de con-tornar os efeitos deletérios do genemutado através da ativação de genessilenciosos ou através da redundân-cia na família do gene mutato(Weckwerth et al. 2004). A formamais comum de redundância gênicaé a frequente expressão de enzimascom diversas isoformas e que estãoenvolvidas em várias vias metabóli-cas (Weckwerth et al. 2004). Namaioria das vezes, as isoformas dasenzimas não podem ser diferencia-das com base na sua atividade

enzimática. É nesse ponto que ametabolômica entra como ferramen-ta fundamental na caracterização fun-cional de genes redundantes e/ougenes silenciosos que são ativadossomente quando outros são deletadosou mutados. Como os metabólitosestão inseridos dentro de uma redemetabólica muito rígida, qualquer pe-quena alteração no nível de um úni-co metabólito irá refletir na alteraçãodos níveis de diversos outrosmetabólitos, como uma reação emcadeia que resultará numa amplifica-ção da alteração genética ocorrida. Oconhecimento das redes metabóli-cas é essencial na interpretação dosdados metabolômicos, que quando

Figura 5 - Visualização em rede metabólicaEsta figura aparece em Villas-Bôas et al. (2005c) e ilustra as diferenças nos níveis dos metabólitos do metabolismo central ebiosíntese de aminoácidos da levedura Saccharomyces cerevisiae , comparando uma linhagem mutante com o tipo selvagemcorrespondente. Os nomes dos metabólitos estão abreviados. Os que aparecem dentro de um círculo negro tiveram seus níveisaumentados no mutante em comparação ao tipo selvagem. Os em cinza tiveram seus nívels diminuídos. Os que não aparecemdentro de um círculo não foram detectados. Os números indicam o número de passos na via metabólica. Interessantemente, nesseestudo particular, a maioria dos metabólitos com seus níveis aumentados no mutante envolvem uma reação de transaminaçãoentre o glutamato e o 2-oxoglutarato (como indicado na figura). Reproduzido com permissão de Villas-Bôas et al. (2005).Biochemical Journal 388: 669 – 677. Ó Biochemical Society.

acoplados aos dados das outras“ômicas” (pr incipalmente aproteômica) constitui uma excelen-te ferramenta na determinação dafunção gênica e ainda permite adescoberta de novas vias metabóli-cas, como exemplificado em Villas-Bôas et al. (2005e).b) Melhoramento de linhagens

por Engenharia Metabólica(EM)

A EM é hoje uma área consagra-da dentro da Biotecnologia. Apesarde já ter sido praticada anteriormen-te, foi somente em 1991 que o ter-mo apareceu oficialmente (Bailey,1991). Algumas definições de EMexistem na literatura, mas esta ativi-dade pode ser definida de uma for-ma bastante simples: a EM é o me-lhoramento dirigido das proprieda-des de um organismo através da

aplicação da tecnologia do DNArecombinante.

A EM é uma área de trabalhoclaramente multidisciplinar, envol-vendo diversas áreas do conheci-mento e diferentes atividades, asquais podem ser apresentadas naforma de um ciclo, conforme ilustra-do na Figura 7. Partindo-se de umdeterminado organismo / linhagem,as atividades têm início na etapa deanálise, na qual deve ser levantada amaior quantidade de informaçãopossível sobre o metabolismo doorganismo em estudo. Com estasinformações, na etapa seguinte, serápossível identificar os melhores al-vos para modificações genéticas (asquais serão introduzidas na etapa desíntese), com o objetivo de melhoraras propriedades ou, em outras pala-vras, o fenótipo deste organismo.

Nota-se, portanto, que as atividadesdentro do ciclo da EM dependemestritamente dos objetivos do traba-lho, ou seja, das características quese deseja modificar no organismoem estudo, dada uma aplicaçãotecnológica específica.

A informação a ser obtida naetapa de análise do ciclo de EM éobtida fazendo-se uso de um conjun-to de ferramentas analíticas e mate-máticas, as quais são em grande par-te comuns àquelas empregadas emestudos de Genômica Funcional. Tra-ta-se das análises do genoma, dotranscriptoma, do proteoma e dometaboloma, entre outras, dando-sehoje preferência às ferramentas dealto processamento, ou highthroughput , como referido em in-glês . Anál ises enzimát icasselecionadas e Análise de Redes Me-tabólicas (ARM) (Christensen &Nielsen, 2000), que têm como obje-tivo identificar a rede metabólicaativa do organismo em estudo, assimcomo quantificar as velocidades dasreações do metabolismo (tambémdenominados fluxos metabólicos),complementam o espectro analíti-co-matemático da etapa de análise.

É importante ressaltar que osobjetivos da EM raramente são atin-gidos após somente um ciclo deatividades (Figura 7). Ainda que seobtenha uma linhagem melhoradaapós o primeiro ciclo, não há porquenão continuar as atividades, de for-ma a se obter linhagens com caracte-rísticas ainda melhores. Portanto, tãoimportante quanto a primeira etapade análise, a qual se refere ao orga-nismo inicialmente escolhido para osestudos, são as etapas de análise dosciclos posteriores, ou seja, após uma,duas, ou mais etapas de modifica-ções genéticas. Assim, o uso dasferramentas analítico-matemáticasindicadas acima, para analisar as li-nhagens geradas após cada etapa demodificações genéticas, é fundamen-tal não somente para verificar se asmesmas resultaram nas alteraçõesfenotípicas esperadas, mas tambémpara permitir o projeto de novasmodificações, que possam melhorarainda mais o metabolismo do orga-nismo em questão.

Figura 6: Visualização baseada no modelo de chip de DNA-arrayEsta figura aparece em Villas-Bôas et al. (2005c) e representa um modelo de chip deDNA-arrays, onde os nomes dos metabólitos (abreviados na figura) tomam o lugardos nomes dos genes e cada coluna representa duas variáveis que estão sendocomparadas (wt = tipo selvagem; mt = mutante; aer = cultivo aeróbico, ana = cultivoanaeróbico). As cores indicam se o nível daquele metabólito aumentou ou diminuiuna situação que está sendo comparada e a espessura do círculo em vermelho indicao nível de confiança estatística. Reproduzido com permissão de Villas-Bôas et al.(2005). Biochemical Journal 388: 669 – 677. Ó Biochemical Society.

Após pouco mais de uma déca-da de existência oficial, contandoinclusive, desde 1999, com umapublicação específica, a revistaMetabolic Engineering (Elsevier), aEM provavelmente não causou oimpacto imaginado por seus pionei-ros. Isto se deve principalmente aofato de não conhecermos ainda to-dos os detalhes do metabolismo dosprincipais organismos de interesseindustrial, em particular os aspectosde regulação metabólica. Como jámencionado neste artigo, a partir doconhecimento do genoma, não épossível prever o funcionamento deum organismo. Em outras palavras,uma simples modificação genéticamuito raramente produz um únicoefeito fenotípico.

No caso de microrganismos,tem-se adotado nos anos recentesuma estratégia diferente e comple-mentar ao uso da tecnologia do DNArecombinante, para introduzir modi-ficações genéticas em um organis-mo com o objetivo de melhorar suaspropriedades metabólicas. Trata-se,

resumidamente, em exercer umapressão seletiva sobre o organismoem estudo, de forma a provocar nomesmo a expressão de um fenótipodesejado. Nesta abordagem, as mu-tações espontâneas e a sobrevivên-cia dos indivíduos mais bem adapta-dos ao ambiente imposto são oselementos responsáveis por intro-duzir as alterações no genoma. Esteprocesso tem sido denominadoEvolutionary Engineering e resulta-dos muito interessantes têm sidoobtidos, como demonstram algumaspublicações recentes (Overkamp etal., 2002; Kuyper et al., 2005). Alémdisto, este processo de seleção for-çada de um determinado fenótipopermite que as modificações genéti-cas e fisiológicas, direta ou indireta-mente ligadas a este fenótipo, sejammapeadas a posteriori pelas técni-cas “ômicas” de alto processamento.Isto, por sua vez, permite que novosalvos de EM sejam identificados eque as linhagens possam ser melho-radas ainda mais. Este processo comoum todo tem sido denominado na

literatura como Engenharia Metabó-lica Inversa, ou seja, em vez de serealizar uma (ou mais) modificaçõesgenéticas, em busca de um fenótipo,provoca-se um fenótipo desejado,para depois mapear as alteraçõesresponsáveis por este fenótipo, deforma a se poder melhorá-lo aindamais (Bro & Nielsen, 2004).

Combinando-se a EM direta coma EM inversa (envolvendo experi-mentos de EvolutionaryEngineering), pode-se imaginar umciclo de atividades ligeiramente di-ferente para o melhoramento de or-ganismos de interesse econômico,em relação àquele apresentado naFigura 7. Neste novo ciclo, na etapade síntese, opta-se por introduzir asmodificações genéticas projetadas oupela tecnologia do DNArecombinante, ou através de experi-mentos de seleção dirigida, confor-me indicado acima. Em seguida, pas-sa-se a uma nova etapa de análise eassim por diante.

Em ambos os casos (aplicando-se EM inversa ou não), pode-se ob-

Figura 7: Ciclo de atividades característico da Engenharia Metabólica (adaptado de Nielsen, J. Appl. Microbiol. Biotechnol.55:263-283, 2001)


servar que a análise do metaboloma,ou o conhecimento dos níveis (ouconcentrações) dos metabólitos intra-e extracelulares do organismo emestudo, é parte fundamental da ca-racterização do metabolismo ou fisi-ologia, dento da etapa de análise dociclo de atividades.

c) Controle de qualidade eavaliação de equivalência

entre OGM’sA metabolômica de plantas é

a área que está mais avançada até opresente. A análise dos metabólitosde vegetais permite realizar um mi-nucioso controle de qualidade dosalimentos que consumimos diaria-mente. Por exemplo, há muito tem-po se detecta adulteração em óleode oliva através da análise da com-posição de ácidos graxos que é es-pecífica para cada óleo. Porém, omais difícil é determinar se um dadoóleo de oliva, sendo vendido comoprocedendo de uma certa origemgeográfica que lhe confere maiorprestígio e, consequentemente mai-or valor, corresponde realmente àqualidade dos óleos produzidos comazeitonas daquela região. Todavia,com a anál ise dos diversosmetabólitos que estão presentes noóleo e que lhe conferem sabor earoma característicos (o que depen-de da variedade das azeitonas usadasna produção do óleo, do solo e domicroclima local), é possível deter-minar a procedência precisa do pro-duto.

Outro exemplo de aplicaçãoestá relacionado aos produtos con-tendo organismos geneticamentemodificados (OGM’s). Desde abrilde 2004, dentro da União Européia,todos os alimentos contendo mais de0,9% de ingredientes obtidos a partirde OGM’s devem ser rotulados comocontendo material modificado gene-ticamente (Anonymous, 2003). Istosignifica que produtos como fari-nhas, óleos e xarope de glicose pro-duzidos a partir de OGM’s, que jáforam considerados anteriormentecomo ‘substancialmente equivalen-tes’ aos materiais originados de fon-tes tradicionais (desde que não con-tivessem na sua composição DNAmodificado), desde 2004 tiveram queser rotulados como produtos conten-

do material geneticamente modifi-cado. Isto aumentou a preocupaçãopública sobre a qualidade e seguran-ça dos alimentos contendo compo-nentes originados de OGM’s. Dessaforma, a análise do perfil metabólicotem permitido a determinação pre-cisa da equivalência entre o produtoproduzido a partir de OGM’s e o deorigem tradicional. A análise demetabólitos determina se existemdiferenças significativas com relaçãoaos metabólitos “traço” que foramdesconsiderados até o momento,podendo, portanto, fornecer evidên-cias importantes em relação à segu-rança e a qualidade dos produtosgeneticamente modificados.

Conclusões econsiderações finais

Em 1999, o físico FreemanDyson disse que “as surpresas naciência acontecem geralmente apartir do desenvolvimento de novasferramentas e novas tecnologias enão a partir de novos conceitos”(Madou, 2002). Além disto, todos osprojetos de sequenciamentogenômico em andamento, tanto deprocariotos como de eucariotos, con-tinuam a nos lembrar que o nossoconhecimento sobre o funcionamen-to de um organismo ou célula, emnível molecular, é realmente muitolimitado. Tipicamente, 20 a 40 % dasfases abertas de leitura (ou OpenReading Frames, ORF’s) encontra-das nos genomas sequenciados per-manecem com função desconheci-da. Esses “genes órfãos”, como sãonormalmente denominados, devemter algum papel no funcionamentocelular, pois, do contrário, teriamsido perdidos durante a evolução.Portanto, o grande momentum dasCiências Biológicas atualmente é abusca da função destes genes desco-nhecidos, e para atingir esse objeti-vo serão necessários tanto o desen-volvimento de novas técnicas comoo estabelecimento de novos concei-tos.

A metabolômica é uma áreavibrante e diversa, que está em suafase exponencial de crescimento.Hoje já existem diversos gruposdedicados ao desenvolvimento e

apl icação das técnicasmetabolômicas, concentrando-seprincipalmente na Europa, EstadosUnidos, Japão e Oceania. Uma soci-edade internacional foi formada re-centemente - The MetabolomicsSociety (metabolomicssociety.org) -cuja missão é promover o cresci-mento e o desenvolvimento da áreametabolômica internacionalmente eessa mesma sociedade possui umarevista periódica trimestral chamadaMetabolomics, que é publicada pelaSpringer e já está no seu quintofascículo. A Springer tambem publi-cou um livro com diversos artigos derevisão especialmente dedicados àanál ise do metaboloma(Vaidyanathan et al. 2005), e a Wiley& Sons publicará em 2006 o primeirolivro texto sobre metaboloma (Villas-Bôas et al. 2006b).

Com este artigo introdutório,os autores esperam poder motivargrupos brasileiros a estabelecer no-vas plataformas para o estudo dometaboloma, com o objetivo de pro-mover as áreas de Genômica Funci-onal, Engenharia Metabólica, dentreoutras, no nosso país.

“O progresso da ciência de-pende do desenvolvimento de novastécnicas, de novas descobertas e denovas idéias, provavelmente nestaordem” (traduzido a partir de Syd-ney Brenner, Nature, 5 June 1980).

Agradecimentos

Agradecemos à Dr. KátiaNones (AgResearch Limited/ NovaZelândia) por suas construtivas su-gestões.

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DesenvolvimentoSustentável

1 - Introdução

Durante séculos a natureza foiconsiderada pelo homem como umadespensa – onde este retirava o máxi-mo dos recursos naturais e como umdepósito de lixo – onde podia jogartodos os resíduos do processo produ-tivo. Este valor equivocado dado anatureza pelo homem, visando ape-nas o interesse econômico, fez comque este durante toda a sua históriabuscasse o desenvolvimento a qual-quer custo, esquecendo-se de que aqualidade de vida está intimamenteligada a preservação dos recursos na-turais.

Hoje podemos perceber que exis-te no mundo todo, uma grande preo-cupação com a defesa do meio ambi-ente, pois se destruirmos os recursosque são indispensáveis a sobrevivên-cia das espécies, estaremos colocan-do em risco o futuro de toda a huma-nidade.

A partir desta constatação o pre-sente trabalho tem por objetivo estu-dar o desafio enfrentado nos diasatuais para garantir as futuras gera-ções um ambiente saudável e equili-brado, por meio do desenvolvimentosustentável – que busca uma harmo-nia entre crescimento econômico epreservação do meio ambiente.

Para tanto dividimos o artigo emquatro partes básicas além da presen-te: na primeira procuramos estudar arelação existente entre meio ambien-te e desenvolvimento econômico, quevem ocasionando uma grave criseambiental; na segunda quais são osprincipais problemas dessa relação;na terceira as estratégias para se al-

MEIO AMBIENTE

cançar o desenvolvimento sustentá-vel e; na quarta é dado um enfoqueespecífico a uma dessas estratégiasque é a questão da escassez e polui-ção das águas doces.

2. Meio ambiente xprocesso de desenvolvimento

econômico

O processo de desenvolvimen-to adotado, em especial pela culturaocidental, encontra-se alicerçado nocrescimento econômico e têm produ-zido infinitas alterações na natureza,muitas delas praticamente irreversíveis.Configura-se assim, uma criseambiental transfronteiriça de propor-ções gigantescas.

A degradação do ambiente vis-lumbrada atualmente, originou-se apartir das mudanças ocorridas nosmeios de produção e geração de ri-quezas, até então baseadas na coope-ração individual. Com o advento daRevolução Industrial, ocorreram pro-fundas transformações sociais e eco-nômicas em todo planeta. A partir daí,o homem estabelece com a naturezauma nova relação de dominação, ba-seada na satisfação de suas ambiçõese na simples absorção das riquezasnaturais.

A prática passou a ser a explo-ração irracional dos recursos naturaise de energia, subjugados à atividadeeconômica. Estabeleceu-se assim umaproposta de desenvolvimento econô-mico ilimitado baseado em recursosfinitos. Os problemas de ordemambiental que surgem a partir deentão, mostram-se cada vez mais com-plexos e evidentes, capazes de modi-

Ana Paula Schneider LucionBacharel em DireitoUniversidade Regional do Noroeste – RS / UNIJUIAluna do mestrado em DesenvolvimentoUniversidade Regional do Noroeste - RS - UNIJUIBolsista da [email protected]

Dieter Rugard SiedembergerProfessor do mestrado em DesenvolvimentoUniversidade Regional Integrada do NoroesteUNIJUI / RSDoutor em Desenvolvimento RegionalUniversitat Tuebingen - AlemanhaMestre em Planejamento RegionalUniversitat Karlsruhe - AlemanhaGraduação em Administração de EmpresasUniversidade Regional do Noroeste - UNIJUI / RSGraduação em Ciências ContábeisUniversidade Regional do Noroeste - UNIJUI/[email protected]

Elisângela Nedel MarascaBacharel em DireitoUniversidade Regional do Noroeste - UNIJUI / RSPós-graduação em nível de especialização emDireito Privado pela Universidade Regional doNoroeste - UNIJUI / RSPós-graduação em nível de especialização emDireito Civil e Direito Processual CivilUniversidade Regional Integrada do Alto Uruguai edas Missões - URIAluna do mestrado em DesenvolvimentoUniversidade Regional do Noroeste – UNIJUI / [email protected]

Ubirajara Machado TeixeiraBacharel em DireitoUniversidade Regional do Noroeste – UNIJUI / RSPós-graduação em nível de especialização emDireito Público MunicipalUniversidade Regional do Noroeste – UNIJUI / RSAluno do mestrado em Desenvolvimento daUniversidade Regional do Noroeste – UNIJUI / [email protected]

O desafio da sociedade contemporânea


ficar a qualidade de vida de milhõesde pessoas.

O desrespeito ao meio ambien-te é facilmente identificado, seja emgrandes centros urbanos ou mesmonos lugares mais periféricos. Em nomedo desenvolvimento econômico, mui-tos países, de forma predatória, utili-zaram-se e continuam a utilizar-se dasriquezas naturais sem a preocupaçãode sua conservação. Essa ideologiadesenvolveu-se com base na grandeabundância de recursos naturais exis-tentes e na falsa idéia de serem elesilimitados. Em virtude disso, apesardas mudanças causadoras dedesequilíbrios no meio ambiente, “ospreços de mercado, no entanto, nãoconsideram tais perturbações, deixan-do-as de lado no cálculo econômico,dessa forma reforçando osdesequilíbrios” (CAVALCANTI, 2002,p.27). Essa visão antiquada de que osbens ambientais seriam gratuitos nãopode mais justificar-se diante da criseambiental configurada.

A problemática que envolve aquestão da economia e do meio ambi-ente está alicerçada em dois eixosconflitantes. De um lado, parte-se doprincípio de que as técnicas de produ-ção que permitem o crescimento eco-nômico e um modo de consumo pre-datório produzem graves conseqüên-cias ao meio ambiente verificado atra-vés de um desequilíbrio dosecossistemas. Por outro, depara-se comuma visão segundo a qual os efeitosgerados pela proteção ambiental im-põem limitações ao desenvolvimentodos países através de elementos ex-ternos ao processo auto-regulador domercado.

Diante dessa dualidade, vemsendo solidificada uma visão concili-adora, que propõe um desenvolvi-mento sustentado de forma acompatibilizar o crescimento econô-mico com uma política de preserva-ção ambiental, a fim de buscar arealização de um objetivo maior, quevem a ser o bem estar e a felicidadedos homens. Essa alternativa de de-senvolvimento tem por pressupostouma sociedade sustentável, onde o“progresso deve ser apreendido pelaqualidade de vida e não pelo puroconsumo material.” (CAVALCANTI,2002, p.28).

“Para ser sustentável, com efeito,o sistema econômico deve possuiruma base estável de apoio. Isto requerque as capacidades e taxas de regene-ração e absorção sejam respeitadas.Se não for assim, o processo econômi-co vai se tornar irremediavelmenteinsustentável.” (CAVALCANTI, 2002,p.38). Sendo assim, a natureza deveser encarada como um fator restritivoao crescimento econômico sempreque este representar uma diminuiçãona qualidade de vida das pessoas, erisco à disponibilidade de bens natu-rais às futuras gerações.

Optar pelo desenvolvimentosustentável representa aceitar que ocrescimento econômico infinito e semlimitações ecológicas conduz a umagrande crise ambiental que apresentamuitas vezes conseqüênciasirreversíveis. Dessa forma, todos so-mos levados a pensar sistematicamen-te, tanto prós, quanto contras de umaabordagem alternativa ao desenvolvi-mento, ou simplesmente deixar queas coisas aconteçam como sempreaconteceram.

Diante da configuração de umacrise ambiental e de um aparenteantagonismo entre crescimento eco-nômico e preservação ambiental, pen-sar em desenvolvimento sustentávelsignifica pensar em alternativas con-ciliatórias de forma a garantir o equi-líbrio da exploração ambiental e suapreservação, com o crescimento eco-nômico. A grande questão então será,harmonizar riqueza coletiva existentee finita (riquezas naturais), com ri-queza individual e criável (riquezaseconômicas).

3. Principais problemas quesurgiram da relação entre meio

ambiente e desenvolvimentoeconômico.

Desde o seu surgimento naface da terra, o homem tem provoca-do modificações no espaço geográfi-co, decorrentes de sua interação coma natureza. Por muitos séculos, osimpactos causados no ambiente fo-ram limitados a pequenas proporções,em virtude da baixa concentraçãopopulacional e, sobretudo pela poucacapacidade técnica, que restringia aspossibilidades de transformação no

meio ambiente.Com o crescimento

populacional e o avanço técnico, ainterferência humana na natureza foise intensificando e provocando gra-ves impactos ambientais. A poluiçãodo solo, do ar, das águas, odesmatamento, o agravamento do efei-to estufa e a destruição da camada deozônio, são apenas alguns exemplosdos problemas que assolam a socieda-de contemporânea.

Durante muito tempo, os im-pactos ambientais restringiam-se aoâmbito local, tendo suas causas facil-mente identificadas: poluição do ardevido à queimada de florestas,desmatamento para a agricultura, etc.Com a evolução técnica e a crescentedemanda por consumo, as formas deexploração foram se aprimorando emintensidade e abrangência, provocan-do efeitos globais.

As conseqüências da forma pre-datória de exploração do ambientesão das mais variadas: destruição dacamada de ozônio, alterações climáti-cas, desmatamento, efeito estufa,extinção de espécies, escassez dosrecursos hídricos, bem como, polui-ção das águas, ar e do solo. A compre-ensão de cada uma delas é importantepara que se possa entender as suascausas e buscar alternativas de desen-volvimento, sem que para isso interfi-ra no equilíbrio da natureza.

Um fator que desencadeia gran-de preocupação no mundo todo é aalteração climática, que tem no ho-mem o seu maior responsável. Segun-do a grande maioria dos especialistas,sua principal causa é a queima demateriais fósseis (petróleo, carvão mi-neral e gás natural) muito utilizadosdesde o início da Revolução Industri-al. Com o aumento da temperaturamédia, o gelo existente nas zonaspolares poderá derreter-se, total ouparcialmente, o que inundaria cida-des e plantações, provocando o êxodode milhões de pessoas.

Intrinsecamente ligado ao au-mento da temperatura terrestre, está adestruição da camada de ozônio. Suaformação há 400 milhões de anos foifundamental para o desenvolvimentoda vida na Terra e indispensável parasua continuidade. Esse gás tem afunção de filtrar os raios ultravioletas


emitidos pelo sol. Sem essa proteçãohaveria uma diminuição da capacida-de de fotossíntese das plantas e de-sencadearia um número ainda maiorde doenças como o câncer de pele,alterações no sistema imunológico eperturbações da visão.

As alterações do clima e a des-truição da camada de ozônio sãosentidas juntamente com o efeito es-tufa, que retém o calor provenientedas irradiações solares, como se fos-sem o vidro de uma estufa de plantas.Ainda não se pode prever a forma comque esse fenômeno se manifestará nofuturo No entanto, estima-se que osuperaquecimento poderá causar ca-lamidades relacionadas a variaçõesclimáticas, tais como, inundações (de-corrente do derretimento das geleirase chuvas torrenciais), furacões (pro-vocados pela elevação atmosférica porcausa da temperatura). A partir daídesencadeará uma série de conseqü-ências danosas aos ecossistemas, atin-gindo a fauna e a flora que nãoconseguirem se adaptar às novasmudanças.

Muito freqüentes ainda, têmsido os problemas ambientaisadvindos com o gerenciamento dolixo, em especial o urbano. Geradopela intensa produção do sistema ca-pitalista, o lixo acumula-se nas gran-des cidades, como resultado do cará-ter descartável do consumo. Estima-se que “em todo mundo, as pessoasque residem nas cidades produzemcerca de 0,5 a 2 kg de lixo sólido, porpessoa, por dia.” (CORSON, 1996,p.5). A essa grande quantidade dedetritos, tem-se dado o destino maiscômodo, ou seja, os aterros sanitários.A precariedade na armazenagem doslixões tem poluído gravemente aságuas de superfície e subterrâneas.Além disso, a decomposição do lixoorgânico produz metano, um gás quepode causar explosões.

As conseqüências da explora-ção predatória do homem não parampor aí. Outras modificações podemser facilmente identificadas a nívelglobal. A cada ano a ocorrência defenômenos como chuvas ácidas, au-mento das áreas de desertificação,extinção de espécies, poluição dosmais variados tipos, desmatamentossão mais freqüentes, representando

uma séria ameaça à sobrevivênciahumana.

Nem sempre as origens dosdesequilíbrios ambientais são facil-mente identificadas. Como a atmosfe-ra é uma só e as águas se interligam,as conseqüências dos problemas eco-lógicos atingem facilmente propor-ções planetárias. Baseado nisso, denada adianta transferir uma indústriaaltamente poluidora, de uma regiãopara outra, porque seus efeitos adqui-rem repercussão global.

Tudo que ocorre em um deter-minado local acaba de uma forma oude outra afetando os demais. Nummundo globalizado a falsa idéia deque cada país tem o direito de fazer oque melhor lhe convir com o seuterritório e com suas paisagens natu-rais, sede lugar a uma compreensãocada vez mais clara da existência deuma interdependência entre as na-ções. De forma ilustrativa pode-sedizer que

[...] as enormes queimadas deflorestas na África ou na América doSul não dizem respeito unicamenteaos países que as praticam; elas fazemdiminuir a massa vegetal sobre o pla-neta (e as plantas, pela fotossíntese,contribuem para a renovação do oxi-gênio do ar) e, o que é mais importan-te, liberam enormes quantidades degás carbônico na atmosfera, fato queacaba por atingir os seres humanos.(VISENTINI, 2000, p.317).

Inúmeros outros problemasadvindos da exploração desregradada natureza pelo homem poderiamser citados. Todos eles convergem nosentido de que os problemas quedizem respeito aos organismos vivosatravessam as fronteiras formais dosEstados e, portanto necessitam sertratados de forma sistêmica eglobalizada, sem descuidar-se do as-pecto local.

4. Estratégias para se alcançaro Desenvolvimento Sustentável

A variedade de problemas glo-bais existentes representa hoje umgrande desafio para toda a sociedade(poder público, iniciativa privada eorganizações não–governamentais)

no sentido de tentar elaborar estraté-gias para se alcançar o desenvolvi-mento sustentável. Essas estratégiasvariam de acordo com as necessida-des e oportunidades de cada região.Entretanto, existem algumas estraté-gias que são consideradas importan-tes a nível mundial.

Conforme Myers citado porCorson (1996) existem algumas áreasnas quais métodos inovadores podemajudar a melhorar a gestão dos pro-blemas globais e assim conseguir atin-gir um progresso rumo ao desenvolvi-mento econômico e social sustentá-vel. Entre essas se incluem: ciência,tecnologia e educação; valores e pa-drões éticos; contabilidade dos recur-sos naturais; governos nacionais; in-centivos econômicos; capacidades degerenciamento; organizações interna-cionais; negócios e indústria e organi-zações não-governamentais.

Em relação a ciência, tecnologiae educação, o grande desafio científi-co que toda a humanidade terá queenfrentar nas próximas décadas é ode melhorar a sua compreensão sobreo que é a biosfera, pois é neste com-plexo sistema que se apóiam todas asformas de vida na terra. ConformeCorson (1996) precisamos desenvol-ver com urgência uma ciência dabiosfera, onde se possa reconhecer ecompreender os impactos da ativida-de humana sobre os sistemas quemantêm a vida na terra. Para tentar-mos desenvolver essa ciência, deve-mos utilizar o campo da ecologiaglobal, estabelecendo programasinterdisciplinares em colégios e uni-versidades para treinar os cientistasnesse campo e estimular os estudan-tes a explorá-lo.

A maioria das informações decomo funciona a biosfera e de comoa atividade humana afeta o sistemaglobal surge de programas destinadosa monitorar as mudanças globais edesenvolver modeloscomputadorizados para analisar taisprocessos. Como exemplo podemoscitar o Sistema de Monitoração doMeio Ambiente Global (GEMS) e oBanco de Informações dos RecursosGlobais (GRID), sendo os dois pro-gramas coordenados pelo Programade Meio Ambiente das Nações Uni-das. Contudo, grande parte desses


programas dependem da compreen-são de fenômenos globais remotosque geralmente é obtida através desatélites em órbita.

Atualmente, a capacidade dastecnologias de percepção remota sãosuperiores as habilidades dos cientis-tas ecológicos. Portanto é precisomelhorar a comunicação entre os quedesenvolvem a tecnologia e sistemasde percepção remota e os que aplicamesses métodos aos problemas globais.Nesse sentido, é importante obtermoscada vez mais informações a respeitode como funciona os sistemas ecoló-gicos da terra, para podermos usareste da melhor maneira possível embenefício da humanidade e protegen-do-o da ocorrência de danos.

Para Corson (1996) a tecnologiadeveria ser utilizada em benefício domeio ambiente, onde fossem desen-volvidos programas com tecnologiainovadora, adaptando as tecnologiasimportadas e aperfeiçoando as tradi-cionais para tentar diminuir os impac-tos ambientais.

Já a estratégia, ética e valoresenfatizam que a deterioração dos re-cursos naturais que mantém a vida naterra ocorre em grande parte pelacompreensão inadequada que as pes-soas possuem da nossa dependênciaem relação ao meio ambiente e pelofato de não aceitar a responsabilidadeque tem pelas conseqüências futurasdessa deterioração, ou seja, a humani-dade atribui um valor muito insignifi-cante a natureza, aos recursos natu-rais e ao futuro.

As pessoas não percebem o gran-de valor que a natureza possui. É elaquem nos fornece os materiais quesão essenciais para nossa sobrevivên-cia na terra. Um fator importante paramudar essa mentalidade, está na edu-cação, pois é esta que vai ajudar oscidadãos a perceber que as ações eescolhas que fizerem hoje afetarão aqualidade das futuras gerações. Exis-te “uma necessidade crítica de educarmais pessoas, e especialmente maislíderes, que vejam o mundo como umtodo, que estejam preocupados com aproteção da biosfera que herdaram, eque estejam comprometidos em aju-dar a assegurar uma qualidade de vidaaceitável às gerações futuras”(PETERSON apud CORSON, 1996, p.

317).Por sua vez a estratégia referente

a contabilidade dos recursos naturaismenciona que estes (ar, água, solo),possuem valor econômico e são es-senciais para a sobrevivência huma-na. No entanto, os orçamentos nacio-nais em seus procedimentos contábeisraramente avaliam os recursos natu-rais como bens produtivos e que po-dem sofrer depreciação com o passardo tempo, ou seja, não são considera-dos nesses orçamentos a diminuiçãodos recursos naturais.

Essa divergência entre como ava-liamos a atividade econômica e comoapreciamos o uso dos recursos natu-rais acaba gerando uma visãodistorcida da saúde econômica, dan-do sinais de mau governo dos políti-cos. A falta de uma contabilidade dosrecursos naturais gera resultados ilu-sórios na renda atual, ao custo deperdas permanentes dos recursos na-turais do país.

O problema da degradação dosrecursos naturais gerado pela má ad-ministração da contabilidade econô-mica é generalizado e está presentenos diversos sistemas econômicos tan-to nos países desenvolvidos como nosem desenvolvimento. Segundo Corson(1996) a primeira ação no sentido depromover uma inclusão dos recursosnaturais no cálculo da renda nacionalé estimar os valores desses recursos edos serviços que eles provêem. Oobjetivo conforme Myers, citado porCorson (1996), é desenvolver um “in-dicador líquido de bem–estar nacio-nal”.

Assim, uma meta fundamentalpara melhorar a capacidade dos go-vernos nacionais é a inclusão da con-tabilidade dos recursos naturais nosprocessos de governo, pois esta aju-dará a conservar os recursos naturais,proteger a qualidade de vida paracaminharmos rumo ao desenvolvimen-to sustentável. A partir do momentoem que a contabilidade dos recursosnaturais se torna parte dos processosde governo seus órgãos poderão de-senvolver idéias mais claras sobre ocusto dos danos com a poluição ecom a degradação dos recursos natu-rais e a economia que obterão aoprevenir tais danos. Essas estimativaspoderiam ajudar a desenvolver modos

de tornar comum a várias nações osaltos custos de reparação dos danosatuais e futuros “pagamento dospoluidores”, como o baixo custo desua prevenção “pagamento da pre-venção da poluição”.

É importante também que a con-tabilidade dos recursos naturais sejaajustada com a melhoria da capacida-de de previsão dos governos, permi-tindo a determinação de custos ebenefícios a longo prazo nos setoreseconômicos e sociais e em programasde proteção dos recursos naturais eda qualidade ambiental. Enfim, asmetas ambientais deveriam fazer par-te do programa de impostos, projetosde investimento em pesquisa e incen-tivo ao comércio exterior, ou seja, serparte da política econômica.

No tocante aos incentivos eco-nômicos, as práticas modernas de-monstram que os preços estabeleci-dos para bens que resultam da trans-formação de recursos esgotáveis nãoimpedem a sobre-utilização dos últi-mos, ou seja, os preços não refletemcorretamente os custos ambientais queincidem sobre a base de recursos.Assim, somente quando os preçosforem tabelados de forma a incluir oscustos com a preservação do meioambiente através da produção eprocessamento, a despesa com a pro-teção ambiental pode ser recuperadae a administração ambiental melhora-da.

Nessa perspectiva, para que seconsolide um desenvolvimento de ba-ses sustentáveis, é essencial que hajauma integração entre incentivos eco-nômicos e programas ambientais, poisestes contribuem para promover ocrescimento econômico, melhorar aqualidade de vida da população, mo-tivar a reciclagem e reduzir o custocom o controle da poluição.

Outro aspecto a ser consideradopara que se possa obter ganhos con-sideráveis, em relação a proteção domeio ambiente, principalmente nospaíses em desenvolvimento por dete-rem as maiores reservas naturais, é aforma com que vem ocorrendo a ges-tão do uso dos recursos naturais. Naquase totalidade dos casos, a exem-plo da poluição das águas, tem ocor-rido uma sobreposição do econômicosobre o ambiental, de forma a ocasio-


nar um dano, na maioria das vezesirreversível. Assim, é indispensável queocorra uma melhoria nogerenciamento dos recursos naturais.Essa melhoria conforme Corson (1996)inclui emprego de recursos humanosespecializados, sistemas de informa-ção e meios administrativos e legaispara gerenciamento do uso dos recur-sos.

Portanto, para que se tenha umaadministração de recursos e proteçãoambiental bem sucedida é necessárioconsiderar, tanto no planejamentocomo na implementação, as necessi-dades, preferências e oportunidadesdos indivíduos e grupos que estãodiretamente afetados, ou seja, exami-nar detalhadamente as práticas locaisexistentes antes de recomendar qual-quer mudança. As práticas locais evo-luem lentamente em resposta as ne-cessidades locais e são na maioria dasvezes sustentáveis em termos ecoló-gicos, econômicos e sociais.

Fruto da ação efetiva de institui-ções internacionais, algumas melhoriaspodem ser percebidas em prol dapreservação da natureza. Entretanto,apesar dos efeitos desastrosos da des-truição do meio ambiente, os exem-plos de instituições credoras multila-terais de desenvolvimento que nãointegraram a proteção ambiental emseus programas continuam a figurarna maioria dos casos.

Para que se possa resolver osproblemas globais, alguns observado-res têm salientado a importância de semodificar os padrões tradicionais denegociação e acordos internacionais,pois estes levam muitos anos paraserem efetivados e implementados. Épreciso que se crie um modelo maisflexível que:

[...] permita um processo de acor-dos intermediários ou auto-ajustáveisque sejam capazes de responder aosrecentes conhecimentos científicos;utilizem novos métodos econômicospara determinação dos riscos; e quepermitam um papel mais ativo porparte dos cientistas, políticos comcompetência técnica e setor privado(MATHEWS apud CORSON, 1996, p.321).

No que tange ao meio ambiente,o Estado nação tem se reveladoineficiente para lidar com as ameaçasao ecossistema global. Dessa forma,os bens globais somente poderão serprotegidos de ameaças ambientais sehouver um esforço conjunto do Esta-do, das organizações internacionais,da iniciativa privada e das organiza-ções não governamentais

A iniciativa privada, principal-mente as multinacionais, ocupam umpapel importante no sentido de aju-dar a preservar o meio ambiente eassim poder alcançar o desenvolvi-mento sustentável. Tanto os negócioscomo a indústria podem exercer umpapel efetivo no sentido daimplementação de novas técnicas quesejam adequadas ambientalmente.Essas técnicas, conforme Corson(1996), podem ser implementadas naagricultura, reflorestamento, pescaoceânica, processamento industrial,produção de energia e gerenciamentodo lixo.

Na agricultura os produtores po-dem proteger suas áreas de cultivoprocurando alternativas para a substi-tuição dos produtos químicos usadospor outros menos nocivos à natureza.No reflorestamento poder-se-ia pro-curar inst i tuir programas degerenciamento sustentável de flores-tas e reflorestamento. No setor deprodução de energia vários progres-sos já foram conquistados, como quei-ma de lixo para alimentar operaçõesindustriais, desenvolvimento de veí-culos automotores mais limpos e efi-cientes, reciclagem de alumínio e ain-da existem várias outras metas queprecisam ser atingidas.

Contribuições positivas têm sidopropostas por movimentos sociais,constituídos principalmente por gru-pos ambientalistas, centros de estu-dos políticos e organizações não-go-vernamentais que vêm desempenhan-do um papel fundamental naconscientização pública na busca pormelhores condições de vida associa-das à preservação do meio ambiente ea condução da economia adequada atais exigências. Devido a sua flexibi-lidade e por ter redes de trabalhoespalhadas por vários países, as ONGSevitam a inércia burocrática, adap-

tam-se mais facilmente as oportuni-dades, promovendo um intercâmbioalém das fronteiras nacionais.

Conforme Barbieri (1997) as or-ganizações não-governamentais temdesempenhado um papel mais impor-tante que as próprias organizaçõesgovernamentais eintergovernamentais, pois estas geral-mente não estão compromissadas cominteresses de curto prazo, decorrentesde questões eleitoreiras e partidárias.

As organizações não-governa-mentais enfatizam a idéia de que nãodevemos implementar estratégias dedesenvolvimento sustentável de umasó vez, como se fosse uma revolução,mas sim lentamente, de forma gradu-al, num processo em constante evolu-ção. Também é necessário que hajauma integração entre indústria, co-mércio e comunidade, para que osprogramas de melhoria sócio-ambiental aconteçam de forma con-junta e harmoniosa.

Enfim, para que se consiga alcan-çar o desenvolvimento sustentável épreciso conjugar esforços de toda asociedade, sem exclusão de qualquerde seus segmentos (governo, iniciati-va privada e comunidade). O desen-volvimento sustentável precisa ser en-tendido com um objetivo planetário,onde os povos se unam por esta causae em parceria tentem combater osproblemas ambientais com soluçõeseficientes. É de suma importância de-senvolver em todos os cidadãos umaconsciência ecológica, alicerçada naética ambiental, não deixando queessas estratégias fiquem a mercê dolivre mercado, baseado num modelode capitalismo selvagem que visa olucro a qualquer custo.

5 – Recursos naturais:a água em questão

Com a evolução dos tempos ahumanidade passou a perceber a ne-cessidade, como vimos, de debater osdiversos caminhos do desenvolvimen-to e não simplesmente voltado a óticado crescimento, da aplicação detecnologias, do avanço industrial, docrescimento da rentabilidade das ope-rações, entre outras. Vê a necessidadede construir uma compreensão que


leve a um desenvolvimento sustentá-vel, onde os avanços sejam conjuga-dos de forma harmônica com os re-cursos naturais indispensáveis para asobrevivência humana e das espéciesvivas, existentes. Assim, para falar emdesenvolvimento é indispensável queo façamos sob a ótica de suasustentabilidade, visando a defesa epreservação dos recursos naturais.

Os recursos naturais podem serestudados em seu conjunto, compre-endendo todos àqueles necessários,como dito, à sobrevivência humana edas espécies vivas. Tal estudo deman-daria um debruçar-se investigativo deproporções amplificadas o qual não éa proposta deste texto. Desta forma,preferimos apresentar neste debatesobre desenvolvimento sustentávelcom preservação aos recursos natu-rais, o exemplo da água.

Falar sobre a água nos remetea discorrer sobre um recurso naturalque possui pública relação com apreservação da vida, e que tambémdemonstra importância à agricultura,aqüicultura, navegação e harmoniapaisagística. (FREITAS – 2002). Pode-mos destacar ainda a utilização deágua para a produção de energia eprodução industrial. Mesmo com suasólida importância, este recurso natu-ral sofre reveses em duas frentes debatalha, uma resultante de sua escas-sez natural e outra relacionada aoprocesso de poluição existente. As-sim, debater desenvolvimento susten-tável significa, neste aspecto, saberconstruir caminhos, como vimos an-ter iormente, os quais se jamconciliáveis com os interesses natu-rais, preservando e recuperando oecossistema.

Este bem vital para a humani-dade e seu desenvolvimento, está dis-tribuído, conforme vários estudos re-alizados, em 97,2% nos mares, ocea-nos e lagos salgados, enquanto aágua doce representa apenas 2,8% dototal de água existente no planeta.Deste percentual de água doce, 76,7%encontram-se em geleiras e lençóisglaciais, 22,3% em lençóis subterrâne-os e apenas 1% é água encontrada nasuperfície. (SANDERSON LEITÃO -2002) Soma-se a isso a explosãodemográfica em curso, e podemos

visualizar a dimensão da escassez desterecurso natural. Somente paraexemplificar, segundo MárciaRodrigues Bertoldi, hoje cerca de 1bilhão de pessoas não possuem aces-so a água potável, podendo este nú-mero chegar a 2.500 bilhões até o anode 2050.

A escassez da água doce éacentuada pela forma de sua utiliza-ção, vejamos que 73% do consumo deágua é destinado aos processos deirrigação para a agricultura, 21% édestinado à indústria e apenas 6%está para o consumo doméstico. Den-tre estes números, destacamos que detoda a água utilizada para a irrigaçãosomente 40% são absorvidos pela plan-ta, sendo que, o restante, ou seja, 60%de toda água utilizada nos processosde irrigação são perdidas. (CORSON -1996). Os processos de irrigação sãoineficientes, gerando o desperdícioanunciado, soma-se a isso o fato deque também na indústria e no consu-mo doméstico, a humanidade nãoestá preparada para compreender oproblema da escassez do recurso, tudoisto nos remete para uma situaçãointensamente critica deixando um le-gado de incertezas para os que virão.È indispensável a aplicação detecnologias que otimizem a utilizaçãoda água na agricultura e no setorindustrial, não sendo possível que emnome dos rendimentos financeiros emmaior escala, se utilize a água comorecurso natural inesgotável.

O processo de poluição exis-tente atua de forma decisiva parapiorar ainda mais está situação. Aindustrialização trouxe consigo evi-dentes contra-indicações que resul-tam na poluição crescente dos ma-nanciais de água doce. Segundo,WALTER CORSON, “as atividades in-dustriais e de mineração são as prin-cipais fontes de poluentes das águasnos países industrializados.” Ao ladodisso o autor acrescenta que também“a agricultura é uma fonte principalde poluentes orgânicos e inorgânicosatravés dos fertilizantes, pesticidas,herbicidas e restos de animais.”(CORSON, 1996, p. 163)

Fator decisivo para o processode poluição em curso, tem como exem-plo, a situação da destinação do lixo.

No Brasil, existem 12 mil lixões, sendoque, 63% destes estão instalados nabeiras de rios e mananciais. Segundopesquisa realizada pelo IBGE – Insti-tuto Brasileiro de Geografia e Estatís-tica, entre 1989 e 1990 em 4425 cida-des o precário saneamento básico éresponsável por 80% das doenças queafetam a população e 65% dasinternações hospitalares de crianças.Outros dados da pesquisa apontamque 30 milhões de habitantes do Bra-sil não recebem água tratada; 92% doesgoto produzido no país é lançadonos rios e no mar sem qualquer trata-mento; os rios são responsáveis por51% do consumo de água no país; noBrasil todos os dias são lançados 10bilhões de litros de esgoto nos rios eno mar.

Assim é possível visualizar quea depredação do meio ambiente écausa de preocupação à sobrevivên-cia da espécie humana e de tantasoutras espécies de vida. O desenvolvi-mento desenfreado, a qualquer custo,baseando simplesmente na otimizaçãodos lucros deve ser substituído porum desenvolvimento sustentável, ca-paz de otimizar a vida com qualidade.

O breve quadro da situação daágua, apontado acima, faz refletir queé urgente gerar desenvolvimento sus-tentável, capaz de atender as expec-tativas socioeconômicas, bem como,as expectativas ambientais, onde to-dos os setores envolvidos no proces-so possam coexistir, desde às indús-trias até a vida silvestre. Tal idéia estáfocada no fato de que, mesmo exis-tindo interesses variados, não signifi-ca que sejam conflitantes. Neste sen-tido, nada impede que, se utilize águano processo de irrigação agrícola,mas que o faça adaptando tecnologiacapaz de diminuir o desperdíciod’água. Que se aplique a legislaçãoexistente, eliminando-se a existênciade lixões em locais inadequados eque se agregue mecanismos dereciclagem eficientes.

Pensar desenvolvimento sus-tentável significa repensar os proces-sos de produção e industrializaçãoexistentes, adequando todos os me-canismos as necessidades ambientais,já resultantes de legislações específi-


cas. Significa construir e consolidaruma conscientização universal deinterpretação da realidade menciona-da supra, e da necessidade detransformá-la para salvar os recursosnaturais existentes e conseqüentemen-te a espécie humana e outras formasde vida existentes.

Várias mobilizações em defesad’água, como fonte de desenvolvi-mento sustentável, ganham espaço nocenário nacional e internacional, exem-plo disso foi o Fórum Brasileiro deONGS e Movimentos Sociais para oMeio Ambiente e o Desenvolvimentoque em agosto de 2002 debateu “Bra-sil 2002: a sustentabilidade que quere-mos” tal discussão é um exemplo doprocesso de mobilização existente eque tende e deve crescer em defesa depolíticas de desenvolvimento susten-tável.

O referido fórum debateu pro-postas para a sustentabilidade, defen-dendo uma série de agendas onde sepode destacar, entre outras, as pro-postas de:

adoção de políticas de gestão deresíduos sólidos, prevenindo ou im-pedindo o alojamento de resíduosem corpos hídricos, a assimilaçãode técnicas e boas práticas na ges-tão dos recursos hídricos comoconstrução de cisternas e outrosmecanismos conhecidos e susten-táveis, de capitação de água, areformulação de processostecnológicos de controle de en-chentes, bem como a restauraçãodas margens naturais dos cursosd’água com matas ciliares, promo-vendo a sua re-naturalização. De-senvolvimento sustentáveis que im-peçam ou reduzam o desperdício,tanto como estender essastecnologias e boas práticas paraagricultura, energia e saneamento,adequadas as necessidades das co-munidades, respeitando-se os valo-res culturais e a capacidade econô-mico-financeira. (Fórum Brasileirode ONGs – Documento GT Água –2002)

O processo de defesa d’águadeve ser palco para o conjunto dapopulação, com sua própriaconscientização, mas também deve

ser pauta dos governos e dos capita-listas que operam os meios de produ-ção. Ou seja, sabe-se que a água érecurso natural escasso, que há muitodesperdício em sua utilização, bemcomo, que existe um processo depoluição crescente que ataca a quali-dade d’água. Isto significa que deveexistir medidas que enfrentem taisproblemas e que busquem soluções.A conscientização da população émedida necessária, seja para colabo-rar com sua parte na preservação e naeconomia d’água, mas principalmen-te para pressionar os governos à ado-ção de medidas e fiscalizando oscapitalistas na realização de suasações.

Nesse sentido, os governospossuem mecanismos de controle asua disposição, devendo lançar mãodos mesmos nesta cruzada em defesada água, em defesa da vida. Falamosda legislação existente, que se cons-titui em instrumento necessário naregulação do setor, devendo a legisla-ção ser colocada em prática com afinalidade de coibir o avanço do pro-cesso de poluição em curso, bemcomo, fazendo retroceder os níveisde poluição existentes. O fato é quea legislação existente, ou suaaprimoração representa papel funda-mental na defesa dos recursos hídricos,tão caros a sobrevivência da espéciehumana e das demais formas de vidasexistentes. Somente conjunto todosestes fatores e que poderemos evitaro caos da falta d’água, aliando osinteresses dos processos de produçãocom os processos de preservaçãoambiental, resultando para o bem dahumanidade em um processo de de-senvolvimento sustentável eficaz.

6 – Conclusão

O debate acerca do desenvol-vimento sustentável ganha incrívelforça nos dias atuais, tendo em vistaa situação visualizada a olhos nus,em caráter global, da realidade e futu-ro que nos espera. O meio ambientevem sendo gradativamente destruído,e inverter e modificar os processos dedesenvolvimento até ontem existen-tes é condição indispensável para quepossamos salvar as espécies vivas, econseqüentemente os próprios algozes

da vida natural: o homem.O processo de destruição do

ambiente natural está diretamente li-gada às alterações ocorridas nos mei-os de produção, processos de indus-trialização e geração de riquezas co-locadas em prática a partir da revolu-ção industrial. Nesse momento o ho-mem age na natureza, com o únicoobjetivo de satisfazer suas ambiçõesde acumulação, sem preocupar-seefetivamente se os recursos explora-dos seriam finitos ou não.

Esta nova realidade colocadaem curso, aliando crescimentopopulacional e avanço técnico, pas-sou a gerar e multiplicar graves im-pactos ambientais, conforme pode-mos verificar no debate realizado nodecorrer do texto. No início tais im-pactos eram percebidos somente emâmbito local, facilmente percebidos eidentificados, mas com o passar dostempos e “aprimoramento” das técni-cas os efeitos nefastos passara a serpercebidos e gerar implicações emescala global, afetando a sobrevivên-cia do planeta.

Está situação, onde sua gravi-dade foi exemplificada com o caso daágua doce, que além de escassa rece-be negativamente a interferência defatores resultantes da atuação do ho-mem na natureza, precisa ser decidi-damente enfrentada. Se tais condi-ções ambientais foram geradas porum novo modelo de produção colo-cado em curso a partir da revoluçãoindustrial, é de fácil compreensão queprecisamos adotar um outro modelo oqual seja capaz de conviverharmonicamente com a natureza, co-locando em curso além desta harmo-nia um processo de recuperação doambiente natural. Este novo modelo éo que chamamos de desenvolvimentosustentável, urgente para a nossa so-brevivência.

Este novo processo, de desen-volvimento sustentável, precisa serpraticado em nível global, pelo poderpúblico, iniciativa privada, principal-mente as grandes empresasmultinacionais, organizações não-go-vernamentais, criando alternativas vi-áveis para a mútua convivência, ouseja, cabe ao próprio homem atravésde suas várias manifestações de poderorganizar uma nova consciência uni-


versal em defesa da preservação dosrecursos naturais, que tenha comoeixo central a busca do desenvolvi-mento sustentável.

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Washington Batista das NevesQuímico, Laboratório de Biologia MolecularFundação de Hematologia e Hemoterapia dePernambucoEspecialista em Tecnologia Ambiental UniversidadeCatólica de PernambucoRecife-PE – [email protected]

Raul Antônio Morais Melo, PhDMédico HematologistaFundação de Hematologia e Hemoterapia dePernambucoProfessor Adjunto da Faculdade de Ciências MédicasUniversidade de Pernambuco Mestre em Medicina Tropical e Doutor em ClínicaMédica – Recife-PE – [email protected]

Catarina Paula da Silva RamosBióloga, Laboratório de Biologia MolecularFundação de Hematologia e Hemoterapiade PernambucoEspecialista em Análises ClínicasMestranda em GenéticaUniversidade Federal de PernambucoRecife-PE – [email protected]

Mariana Brayner CavalcantiBiomédica, Departamento de Energia Nuclear daUniversidade Federal de PernambucoMestra em Tecnologias Energéticas e NuclearesDepartamento de Energia NuclearDoutoranda em Tecnologias Enérgicas e NuclearesUniversidade Federal de PernambucoRecife-PE – [email protected]

Francisco Harrison de Brito PereiraGraduando em Medicina pela Faculdade de CiênciasMédicas - Universidade de PernambucoRecife-PE – [email protected]

Thiago Martins Sampaio de LacerdaGraduando em Medicina pela Faculdade de CiênciasMédicas - Universidade de PernambucoRecife-PE – [email protected]


MAPA DE RISCO EMLABORATÓRIO CLÍNICO

Introdução

O Mapa de Risco é fruto daatividade do Movimento Sindical Ita-liano ocorrido no final da década de60, que pela falta de condições detrabalho, criou um modelo de avali-ação com o objetivo de transformaro local de trabalho em um ambienteseguro e democrático (Matos &Simoni, 1993). No Brasil, a elabora-ção obrigatória do Mapa de Risco foies tabelecida pela NormaRegulamentadora nº 5 (NR-5) paratodas as empresas do país que te-nham Comissão Interna de Preven-ção de Acidentes – CIPA e devecontar com a participação do maiornúmero possível de profissionais.

O Mapa de Risco é a represen-tação gráfica do local de trabalhoonde são registrados os riscosambientais, suas naturezas e intensi-dades, estando estes vinculados, di-reta ou indiretamente ao processo,organização e às condições de traba-lho capazes de acarretar prejuízos àsaúde dos trabalhadores (Teixeira &Valle, 1996). Ele deve ser de fácilvisualização e estar afixado em lo-cais acessíveis no ambiente de traba-lho para informação e orientaçãoquanto as principais áreas de riscopara todos que atuem ou transitempelo local. Estes riscos têm origemnos diversos elementos do processode trabalho (materiais, equipamen-tos, instalações, suprimentos e espa-ços de trabalho) e na forma de orga-nização do trabalho (arranjos físicos,treinamento, ritmo, método, postu-ra, jornada e turnos de trabalho).

No Mapa de Risco, círculos de

PESQUISA

tamanhos e cores diferentes identifi-cam os locais e os fatores que podemgerar situações de perigo pela pre-sença de agentes físicos, químicos,biológicos, ergonômicos e de aci-dentes. Dentro dos círculos devemser especificados os grupos a quepertence o risco, segundo cor padro-nizada e também a intensidade dosriscos, representada por tamanhosproporcionalmente diferentes de cír-culos, de acordo com a percepçãodos trabalhadores. Como não há fór-mula definida para calcular aproporcionalidade proposta, elapode ser es t ipulada peloselaboradores do mapa. A NR-5 suge-re que as dimensões dos círculospossuam as proporções 1, 2 e 4,respectivamente, para as intensida-des pequena, média e grande.

O importante é que as informa-ções sejam verdadeiras, tornando oMapa de Risco um retrato da situaçãode segurança e higiene no ambientede trabalho. Como não há um mode-lo que possa servir para todos oscasos, a forma operacional e os me-canismos para a elaboração do mapa,devem ser decididos pela equipe. Omapeamento deve ser sempre atua-lizado de modo que cada vez mais osprofissionais aprendam a identificare a registrar graficamente os focosde acidentes contribuindo para o seucontrole ou eliminação. O conheci-mento e a percepção que os traba-lhadores têm do processo de traba-lho e dos riscos ambientais presen-tes, incluindo os dados consignadosno Mapa de Risco, devem ser consi-derados para fins de planejamento eexecução do Programa de Preven-

Avaliação de Riscos Ambientais em Laboratório de Biologia Molecular


ção de Riscos Ambientais (PPRA).Apenas recentemente, a área da

biologia molecular passou a integraro laboratório clínico de modo queestudos são necessários para a análi-se dos riscos ambientais provocadospela introdução de novos equipa-mentos, insumos e métodos de tra-balho. A elaboração do mapa de riscovisa reunir as informações necessári-as para estabelecer o diagnóstico dasituação de segurança e saúde dotrabalho no laboratório, possibilitar atroca e divulgação de informações e

Tabela 1. Padronização dos tipos de risco ambientais quanto a sua natureza

Físicos Químicos Biológicos Ergonômicos Acidentes

Ruídos Poeiras Vírus Esforço físico intenso Sinalização

Vibrações Fumos Bactérias Levantamento e transportemanual de peso Arranjo físico inadequado

Radiações ionizantes Névoas Protozoários Exigência de posturainadequada

Máquinas e equipamentossem proteção

Radiações nãoionizantes Neblinas Fungos Controle rígido de

produtividadeFerramentas inadequadas

ou defeituosas

Frio Gases Parasitas Ritmo de trabalhoexcessivo ou repetitivo Iluminação inadequada

Calor Vapores Bacilos Trabalho em turno noturno Eletricidade

Pressões anormais Substâncias,compostos ou produtos

químicos em geral- Jornada de trabalho

inadequadaProbabilidade de incêndio

ou explosão

Umidade - - - Armazenamentoinadequado

- - - - Animais peçonhentos

Fonte: Manual de Segurança no Ambiente Hospitalar, 1995

estimular a participação em ativida-des de prevenção (Mastroeni, 2004).

O objetivo deste trabalho foiidentificar e caracterizar do ponto devista qualitativo e quantitativo osriscos ambientais a que está expostaa equipe de um laboratório clínicode biologia molecular.

Material e métodos

O estudo contou com a partici-pação da equipe do Laboratório de

Biologia Molecular da Fundação deHematologia e Hemoterapia dePernambuco – Hemope, compostade cinco profissionais e seis bolsistasexpostos aos riscos. O laboratório,onde se realiza a técnica da Reaçãoem Cadeia da Polimerase – PCR, estádividido em três diferentes áreas fun-cionais: PRÉ-PCR, PCR e PÓS-PCR.

Para a identificação dos riscosambientais foi elaborado um fluxo-grama da rotina laboratorial e umadescrição das instalações, equipa-mentos, materiais e equipes de tra-balho. O instrumento utilizado paracaracterização dos riscos foi distribu-ído com a equipe e consistiu de umaficha para registro de riscosambientais para anotações sobre asseguintes variáveis: ambiente, tipo,localização, natureza e intensidadedos riscos.

Os riscos ambientais foram clas-sificados em físicos, químicos, bioló-gicos, ergonômicos e de acidentes,conforme a NR-5 e representadospelas cores azul, vermelho, marrom,amarelo e verde, respectivamente(Tabela 1).

A intensidade dos tipos de riscofoi considerada como inexistente (0),pequena (1), média (2) e grande (3)e representada por círculo de tama-nho proporcionalmente diferente ouFigura 1 - Layout do Laboratório de Biologia Molecular do Hemope

14

15

13 12

16 11

7

89

6 6

1010

10

5

2

3

1

4


Tabela 2. - Descrição da área física e natureza dos riscos encontrados no Laboratório de Biologia Molecular do Hemope

Nº Áreas / Riscos

01Bancada de extração de ácidos nucléicos e prateleira com reagentes e tubos.Uso de substâncias químicas; recepção de material biológico; postura corporal, movimentos repetiti vos; arranjo doambiente, trabalho repetitivo, ausência de sinalização, locomoção de materiais.

02 Bancada com espectrofotômetro, homogeinizador e agitador.Ruído, vibração; manipulação de material biológico.

03 Bancada com centrífugas.Ruído, vibração; manipulação de material biológico.

04 Geladei ra.Frio; armazenamento de material biológico.

05Bancada com computadores e prateleiras com li vros, catálogos e pastas.Postura corporal, movimentos repetitivos; arranjo do ambiente, eletricidade, ausência de sinali zação.

06 Pia.Descarte de material biológico.

07 Cabina de Segurança Biológica.Ruído, vibração; manipulação de material biológico.

08Bancada com centrífuga, agi tador e prateleira com substâncias químicas.Ruído, vibração; uso de substâncias químicas; manipulação de material biológico; arranjo do ambiente, falta desinalização, locomoção de materiais.

09 Bancada com computador e prateleira com livros/pastas.Arranjo do ambiente, falta de sinalização.

10Geladei ra e freezers.Frio; armazenamento de material biológico.

11Bancada termocicladores, cuba de eletroforese, microondas e prateleira com equipamentos.Calor, radiação não ionizante; uso de substâncias químicas; manipulação de material biológico; postura corporal,movimentos repetiti vos; eletricidade, arranjo do ambiente, falta de sinalização, locomoção de materiais.

12 Lixeira.Descarte de material biológico.

13Geladei ra.Frio; armazenamento de material biológico.

14 Bancada com transi luminador e equipamentos de fotografia.Radiação não ionizante; uso de sustâncias químicas e material fotográfico; manipulação de material biológico.

15 Pia com recipiente para descarte de substância tóxica e contaminada.Uso de substâncias químicas; descarte de material biológico; falta de sinalização, arranjo do ambiente.

16Luz UV.Radiação não ionizante.

Fonte: Laboratório de Biologia Molecular do Hemope

pela ausência do mesmo quando deintensidade inexistente, baseada noscritérios adotados no Manual de Se-gurança no Ambiente Hospitalar(1995).

A análise dos dados foi realizadaatravés do cálculo da mediana dosresultados obtidos na avaliação reali-zada por cada membro da equipe.

Resultados

Com os dados obtidos através

das fichas de registro de riscosambientais baseado no layout des-crito na Figura 1 e nas áreas/riscosrepresentados na Tabela 2, foi ela-borado o mapa de risco do Laborató-rio de Biologia Molecular do Hemope(Figura 2).

Um total de 37 riscos ambientaisforam identificados, sendo doze físi-cos, onze biológicos, cinco químicos,cinco de acidentes e quatroergonômicos (Gráfico 1).

Os cinco tipos de risco analisa-

dos apresentaram diferentes intensi-dades no Laboratório (Gráfico 2).

Conclusões

Todos os tipos e graus de inten-sidade de fatores de risco ambientaisforam encontrados no estudo. Osriscos físicos foram os mais freqüen-tes e os biológicos de maior intensi-dade.

A construção do mapa de riscoreuniu e organizou as informações


Figura 2 - Mapa de Risco do Laboratório de Biologia Molecular do Hemope

necessárias para traçar o perfil diag-nóstico da biossegurança de um la-boratório clínico de biologiamolecular.

A pesquisa estimulou a partici-pação em atividades relativas abiossegurança e a busca de soluçõescom medidas atenuantes e educativaspara os riscos ambientais identifica-dos. O estudo possibilitou à equiperefletir sobre os problemas das con-dições de trabalho, tendo efeito pe-dagógico inclusive para outros labo-ratórios da Instituição.

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Gráfico 1 Distribuição dos 37 riscos ambientais no Laboratório de Biologia Moleculardo Hemope

Gráfico 2. Tipos e medianas de intensidades de riscos ambientais no Laboratóriode Biologia Molecular do Hemope


Mapeamento genético daCANA-DE-AÇÚCAR

Introdução

A cana-de-açúcar (Saccharumspp.) é uma das principais culturasdo Brasil, sendo o agronegócio sucro-alcooleiro responsável por 2,4% doPIB nacional (www.jornalcana.com.br ).Este setor é também um dos quemais empregam no país, com a gera-ção de 3,6 milhões de empregosdiretos e indiretos, além de congre-gar mais de 72.000 agricultores e334 usinas (www.jornalcana.com.br).O Brasil é o maior produtor mundialde açúcar, obtendo 24 milhões detoneladas ano-1, das quais cerca de60% são exportadas. Há perspecti-vas para aumento das exportaçõesdo açúcar brasileiro, motivado prin-cipalmente pela redução aos subsí-dios praticados pela União Européiaà produção de açúcar de beterraba, epelo aumento do consumo de pro-dutos industrializados que utilizam oaçúcar como matéria-prima. A pro-dução brasileira de etanol também éa maior do mundo, com 14 bilhõesde litros de álcool ano-1, devido autilização em larga escala no Brasildo etanol como combustívelrenovável e alternativo ao petróleo.Hoje o álcool é reconhecido mundi-almente pelas suas vantagensambientais, sociais e econômicas ediversos países têm demonstradointeresse crescente na tecnologiabrasileira. Estima-se que com oscarros bi-combustíveis, a demandainterna de etanol combustível seráde 22,1 bilhões de litros anuais até oano de 2010, enquanto que no mer-cado externo, a demanda projetadaseja de 5,2 bilhões de litros. Paraatender ao incremento na demanda,o setor sucro-alcooleiro deverá ex-

PESQUISA

Uso de marcadores moleculares no mapeamento genético visando o melhoramento da cana-de-açúcar

Janaína de Cássia AlbinoMSc, estudante de pós-graduaçãoCentro de Energia Nuclear na AgriculturaUniversidade de São Paulo

Silvana CresteDSc., Pesquisadora, Centro de CanaInstituto Agronômico de Campinas

Antonio FigueiraPhD, Professor AssociadoCentro de Energia Nuclear na AgriculturaUniversidade de São [email protected]


pandir a área plantada com cana-de-açúcar dos atuais seis milhões dehectares para 9,1 milhões de ha nospróximos oito anos. Essa expansãodeve ocorrer principalmente em áre-as tradicionalmente ocupadas pelapecuária extensiva (oeste de SãoPaulo, Goiás, Triângulo Mineiro,Paraná e Mato Grosso do Sul).

Apesar da importância da cultu-ra de cana-de-açúcar para o Brasil, orendimento nacional é baixo, commédia de 75 ton/ha (www.fnp.com.br),sendo que a principal estratégia paraaumento de produtividade é o de-senvolvimento de cultivares melho-radas. Em todo o mundo, os progra-mas de melhoramento genético bus-cam obter cultivares mais produti-vas, exibindo tolerância a fatoresbióticos e abióticos, de modo a seextrair o potencial máximo da cultu-ra sob condições ambientais especí-ficas. As cultivares comerciais emuso foram originalmente derivadasde hibridações interespecíficas, en-tre a espécie produtora de açúcar, S.officinarum (‘cana nobre’), e as es-pécies selvagens S. spontaneum, S.edule , S. barbieri e S. sinense , se-guidas de uma sér ie deret rocruzamentos com S.officinarum.

Nos programas de melhoramen-to do Instituto Agronômico de Cam-pinas (IAC) e do Centro de TecnologiaCanavieira (CTC) são realizados pre-ferencia lmente cruzamentosbiparentais entre cultivares de elite.As sementes dos cruzamentos sãogerminadas, e as plântulas obtidassão cultivadas em diversas estaçõesexperimentais, sendo submetidas àseleção em fase de soca,quant i f icando-se parâmetros


tecnológicos e biométricos relacio-nados à produção (Figura 1). Osclones resultantes das diversas fasesde seleção são enviados para as usi-nas cooperadas e avaliados quantoao seu desempenho sob diversascondições edafoclimáticas. Anual-mente, cerca de 2.000 cruzamentossão realizados pelos programas demelhoramento do IAC e CTC, geran-do uma população de 3.500.000seedlings para seleção. Nos doisúltimos anos, nove novas cultivaresforam lançadas pelos dois programasde melhoramento. Portanto, o de-senvolvimento de uma cultivar decana-de-açúcar é um processo quedemanda muito tempo (em média12 anos), trabalho e recursos.

O elevado nível de ploidia (2n =100-130) , a ocorrência deaneuploidia e a complexidadeci togenét ica dos híbr idosinterespecíficos, combinado com adificuldade de se obter total controlena hibridação, tem limitado os estu-dos genéticos em cana-de-açúcar(Grivet & Arruda, 2001), fazendo domelhoramento genético uma ativi-dade extremamente desafiadora. Amaioria das características-alvo daseleção no melhoramento apresentaherança complexa, sendo que emcana-de-açúcar, essa complexidadeé intensificada em decorrência daexis tência da pol iploidia e

aneuploidia. Portanto, a cana-de-açúcar é considerada, dentre as plan-tas cultivadas, como aquela que apre-senta a genética mais complexa.

O mapeamento genético apre-senta grande potencial para a análisedo genoma, pois permite dissecargeneticamente os caracteres de he-rança complexa em caracteres deherança simples, fornecendo infor-mações importantes para o auxíliodo melhoramento (Ferreira &Grattapaglia, 1998). Tendo em vistaque o genoma de cada indivíduopossui características (seqüências denucleotídeos) que o diferencia dosdemais, a análise molecular permitedetectar variabilidade genética comotambém determinar pontos de refe-rência nos cromossomos, possibili-tando assim, um aumento da eficiên-cia da seleção precoce e/ou indiretaem cana-de-açúcar. O uso demarcadores moleculares possibilitaotimizar a prática de seleção no me-lhoramento, uma vez que são capa-zes de revelar a variabilidade gené-tica existente no DNA e não estaremsujeitos às influências de efeitosambientais.

Diversos tipos de marcadoresmoleculares estão disponíveis paraanálise do genoma da cana-de-açú-car, sendo que sua utilização no me-lhoramento poderá permitir a sele-ção de um clone a partir da informa-

ção de seu genótipo e não de seufenótipo, num processo denomina-do de seleção ass is t ida pormarcadores . Dessa forma,marcadores moleculares associadosa características de interesse, sejamelas qualitativas ou quantitativas,poderão auxiliar o melhorista a sele-cionar, de forma mais eficiente, osclones com as características deseja-das, ainda na fase juvenil (seedlings),reduzindo-se o tempo e o espaçonecessários para se praticar a sele-ção, possibilitando ainda, a seleçãosimultânea para mais de uma carac-terística. O pré-requisito básico paraa aplicação da seleção assistida pormarcadores no melhoramento dacana-de-açúcar é a construção demapas genéticos de ligação e a iden-tificação de marcadores fortementeligados a gene(s) associados à carac-terística de interesse.

Detecção de polimorfismoe nível de ploidia em

cana-de-açúcar

Por se tratar de uma plantapoliplóide, o mapeamento commarcadores moleculares tal como éfeito em plantas diplóides não podeser diretamente aplicado em cana-de-açúcar, dado à impossibilidade dese identificar o genótipo de um indi-víduo a partir do padrão de bandasobtido (da Silva et al., 1995). Emindivíduos poliplóides, há inúmerosalelos de um mesmo loco segregan-do, os quais podem ser desde nuliplex(i.e. aaaaaaaa, se x = 8), a simplex( i .e Aaaaaaaa) , duplex ( i .e .AAaaaaaa), triplex (i.e. AAAaaaaa),ou multiplex, com número irregularde cromossomos em muitas classeshomólogas em decorrência deaneuploidia em cana-de-açúcar(Hoarau et al., 2001; Grivet & Arruda,2001). Somado a esses fatores, com-plicações relacionadas a possíveisduplicações no genoma e confusõesentre alelos e locos parálogos (i.e.derivados destas duplicações) sãomuito difíceis de se esclarecer (Grivetet al., 1996).

Um método para mapeamentogenético em poliplóides compareamento bivalente na meiose,

Figura 1. Vista aérea de experimentos contrastando diversas cultivaresde cana-de-açúcar


e a segregação deles na progênieobedece à proporção 3:1 (da Silva etal., 1993; Grivet et al., 1996). Outrostipos de segregação são possíveis deserem observados em poliplóides,no entanto, não existem programascomputacionais capazes de analisarestes dados e a análise deve serconduzida diretamente.

Espécies consideradasalopol iplóides possuem umpareamento cromossômico preferen-cial na meiose, com formação debivalentes, devido ao seu genomaser uma combinação de espéciesdistintas, reunidas por hibridaçõesinterespecíficas. Já as espécies con-sideradas autopoliplóides, por pos-suírem um genoma derivado da com-binação de mais de dois genomasgeneticamente muito similares(homólogos), o pareamento doscromossomos na meiose ocorrem deforma aleatória ou não preferencial(herança polissômica). Em uma es-pécie alopoliplóide que possua trêsconjuntos cromossômicos genetica-mente distintos (homeólogos), opareamento na meiose se daria compreferência de pareamentocromossômico de cada um dos trêsconjuntos distintos homeólogos. Nomapeamento genético desta espé-cie (trigo, por exemplo), cada grupode ligação seria a representação dosdois cromossomos homólogos decada um destes conjuntos. Com issoseria esperado que metade das liga-ções formadas entre locos estivesseem fase de associação (locos nomesmo cromossomo) e a outra me-tade em repulsão (um loco em cadacromossomo homólogo), como emum organismo diplóide. Emautopoliplóides, onde os conjuntosde genomas são geneticamente idên-ticos (homólogos), e o pareamentona meiose se dá de forma aleatória,a probabilidade de haver a segrega-ção de cromossomos homólogos paraum mesmo gameta é, dependendodo número de ploidia, muito baixa.As cultivares modernas de cana-de-açúcar apresentam formaçõesbivalentes (preferencial) na meiose,com algumas formações bivalentesou até multivalentes (Price, 1963).

Os mapas desenvolvidos para

Figura 2. Esquema ilustrando a segregação de marcadores em dose única nadescendência do cruzamento

Figura 3. Esquema ilustrando os inúmeros alelos de um mesmo loco segregando.Em destaque os alelos em dose única utilizados para o mapeamento genético

baseado na segregação demarcadores de dose única (MDU) foiproposto por Wu et al. (1992). Essemétodo é uma alternativa para sim-plificar o estudo das segregações demúltiplos alelos em diferentes dosa-gens. No mapeamento de poliplóidesempregando-se marcadores em doseúnica, as bandas são interpretadascomo marcadores dominantes, compresença ou ausência do fragmento,desprezando-se o caráter co-domi-nante dos marcadores RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism) e microssatélites(Figura 2 e 3). Os MDUs são detec-

tados pela segregação de fragmen-tos na proporção de 1:1, onde meta-de dos gametas contém o DNA deum fragmento e a outra metade não(como por exemplo Aaaaaaaa xaaaaaaaa; Figura 2). Estes tipos degametas podem ser visualizados naprogênie de um determinado cruza-mento, onde um fragmento(marcador) está presente em umgenitor e ausente no outro (Wu etal., 1992). Outra maneira de detecçãode marcadores em dose única é quan-do um mesmo alelo está presentenos dois genitores em dosagem úni-ca (simplex; Aaaaaaaaa x Aaaaaaaa),


cana-de-açúcar mostraram variaçõesno comportamento doscromossomos na meiose, dependen-do da população ou família estuda-da. Os níveis de ploidia foram esti-mados pela determinação da fase deligação entre os marcadores nos gru-pos de ligação e pela proporção demarcadores em dose única nogenoma (Wu et al., 1992; da Silva etal., 1993). Como um mapa genéticoé baseado na segregação de locosdetectados, esta baixa probabilidadede segregação conjunta decromossomos faria com que grandeporcentagem das ligações formadasentre locos representasse a ligaçãodeles no mesmo cromossomo (asso-ciação). Para se detectar ligaçõesentre locos em fase de repulsão emum organismo autopoliplóide serianecessária uma população demapeamento com cerca de 750 indi-víduos (Wu et al., 1992). Em mapasgenéticos, onde o mapeamento temsido geralmente feito com 100 indi-víduos, a proporção de fases de liga-ção em associação ou repulsão seria1:1 em alopoliplóides, e 1: <0,25 emautopoliplóides (Wu et al., 1992; daSilva et al., 1993).

A detecção de fragmentos emdose única no genoma também éafetada pela variação de comporta-mento dos cromossomos na meiose(Wu et al., 1992; da Silva et al.,1993). Da Silva et al. (1993) estabe-leceram uma relação teórica entreporcentagens de MDU com o tipo deploidia baseando-se nas freqüênciasesperadas para duas, três e quatrodoses, sendo 1/4, 1/8 e 1/16, paraalopoliplóides e 3/14, 1/14 e 1/70em autopoliplóides, respectivamen-te. Assim, a proporção esperada defragmentos em múltiplas doses é de0,44 (44%) para alopoliplóides e de0,30 (30%) para autopoliplóides. Por-tanto, em uma população formadapor 100 indivíduos, um organismopoliplóide seria considerado comcomportamento de alopoliplóide senos resultados de mapeamento fos-se detectada metade das ligaçõesem fase de repulsão e uma propor-ção praticamente igual de marcadoresem dose única e doses múltiplas. Jápara ser considerado autopoliplóide

nenhuma fase de repulsão deveriaser detectada nos resultados demapeamento, sendo confirmado pelaconstatação de que cerca de 70%dos fragmentos estariam em doseúnica no genoma.

Mapeamento genéticoem cana-de-açúcar

Os genótipos cultivados de cana-de-açúcar, bem como as espéciesselvagens de Saccharum, sãopresumivelmente a l tamenteheterozigóticos, não havendo linhaspuras melhoradas devido a dificulda-des de autofecundação e aopareamento ao acaso de múltiploscromossomos homólogos. Por estesmotivos, as populações segregantesusadas para mapeamento são geral-mente progênies de primeira gera-ção, derivadas principalmente do cru-zamento entre cultivares e espéciesselvagens (Guimarães et al., 1997;Ming et al., 2001). A estratégia demapeamento de marcadores em doseúnica (MDU) já permitiu a constru-ção de diversos mapas para cana-de-açúcar, provenientes de populaçõesoriundas de cruzamentos entre es-pécies selvagens e cultivadas, ou decruzamentos entre cultivares e/ouclones-elite.

O primeiro mapa desenvolvidopara cana-de-açúcar baseou-se emuma progênie de 88 indivíduos F1,obtidos do cruzamento de S.spontaneum ‘SES208’ (2n = 64) eseu duplo-haplóide ‘ADP068’, em-pregando marcadores RAPD ouRandom Amplified PolymorphicDNA (Al-Janabi et al., 1993). DaSilva et al. (1993) obtiveram outromapa para o mesmo cruzamentoempregando marcadores RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism) em dose única. Aintegração dos dados, com base em71 plantas em comum, resultou em64 grupos de ligação e 8 grupos dehomologia , i .e . conjunto decromossomos homólogos, agrupadospela presença de marcadores co-muns derivados de uma mesma son-da RFLP ou de loco de microssatélite(da Silva et al., 1995).

Um segundo mapa foi desen-

volvido no Centre de CoopérationInternationale en RechercheAgronomique pour le Développment(CIRAD, França) a partir de 77 indi-víduos obtidos pela autofecundaçãoda cultivar ‘R570’ (2n = 107 – 115),e integrou 408 locos RFLPs dispostosem 96 grupos de co-segregação e 10grupos homologia. (Grivet et al.,1996). Nesta mesma população,Asnaghi et al. (2000) adicionaram217 marcadores RFLPs, derivados desondas heterólogas de sorgo, milho earroz, sendo 66% mapeadas no gru-po de ligação VII de sorgo, próximasao gene de resistência à ferrugem.Outra progênie de autofecundaçãodo mesmo cultivar, com 295 plantaspermitiram detectar, a partir demarcadores AFLP (AmplifiedFragment Length Polymorphism),887 polimorfismos em dose únicaque compuseram 120 grupos de co-segregação, totalizando 5.849 cM (1/3 do genoma previsto) (Hoarau etal., 2001). Recentemente, 148marcadores derivados de “GenesAnálogos de Resistência” (RGA)advindos de etiquetas de seqüênciasexpressas (ESTs) seqüenciadas peloprojeto SUCEST e 134 marcadoresmicrossatélites, foram adicionados aeste mapa, formando 128 grupos deco-segregação e 8 grupos dehomologia (Rossi et al., 2003).

Um terceiro mapa, desenvolvi-do a partir de 100 indivíduos F1 docruzamento entre S. officinarum‘Louisiana Purple’ (2n = 80) e S.robustum ‘Mol 5829’ (2n = 80) con-sistiu de 160 marcadores RAPD e ummarcador morfológico dispostos em51 grupos de ligação (Mudje et al.,1996). A partir deste cruzamento,Guimarães et al. (1999) construírammapas dos genitores com marcadoresRAPD, RFLP e AFLP. O mapa de‘Louisiana Purple’ consiste de 341marcadores em dose única dispostosem 74 grupos de ligação, num totalde 1.881 cM, enquanto que o mapade ‘Mol 5829’ consiste de 301marcadores dose única, em 65 gru-pos de ligação e 1.189 cM (Guima-rães et al., 1999).

A partir de uma progênie F1 com85 indivíduos, Ming et al. (1998,2002a), utilizando-se marcadores


RFLP, obtiveram quatro mapas adici-onais, sendo um para cada genitorenvolvido no cruzamento entre S.officinarum ‘Green German’ (GG,2n = 97 – 117) x S. spontaneum‘IND 81-146’ (IND, 2n = 52 - 56) eS. officinarum ‘Muntok Java’ (MJ,2n = 140) x S. spontaneum ‘PIN 84-1’ (PIN, 2n = 96). Um total de 72grupos de ligação foram formadospara S. officinarum GG e MJ e 69para S. spontaneum IND e PIN e otamanho de cada mapa foi 2.305 cMpara GG; 1.443 cM para MJ; 2.063 cMpara IND; e 1.303 cM para PIN.

Aitken et al. (2005), a partir deuma progênie F1 de 277 indivíduos,construíram um mapa para o cruza-mento entre o S. officinarum (clone‘IJ76-514’) e a cultivar australiana‘Q165’, constituído por 1.074 mar-cas, derivadas de marcadores AFLP,Randomly Amplif ied DNAFingerprint (RAF) e microssatélites,distribuídas em 136 grupos de liga-ção reunidos em 8 grupos dehomologia. A densidade do mapa foide 9.058,3 cM, com distância entrelocos de 9.9 cM. Também na Austrá-lia, dois mapas genéticos foramconstruídos a partir de uma popula-ção de 232 indivíduos do cruzamen-

to entre as cultivares ‘Q117’ e ‘MQ77-340’, utilizando marcadores AFLP emicrossatélites (Reffay et al., 2005).O mapa de ‘MQ77-340’ foi formadocom 101 grupos de ligação com 342marcas ligadas e uma cobertura de3.582 cM. Para ‘Q117’, um mapasimilar foi construído, com 270 mar-cas ligadas em 93 grupos de ligaçãoe uma cobertura de 3.167 cM.

Mais recentemente, mais doismapas foram construídos para clonesaustralianos. Uma progênie de 192indivíduos, obtida do cruzamento en-tre a cultivar ‘Q117’ e o clone deelite ‘74C42’, foi mapeada utilizan-do-se mais de 1000 marcadores SSR,AFLP e RFLP derivados de ‘GenesAnálogos de Resistência’ (RGA). Omapa de ‘Q117’ contém 407marcadores em única distribuídos em75 grupos de ligação, e o mapa de‘74C42’ contém 445 MDU distribuí-dos em 84 grupos de ligação. Ambosos mapas formaram 8 grupos dehomologia (McIntyre et al., 2005a;2005b).

No Brasil, um mapa genético deligação vem sendo construído a par-tir do cruzamento entre clones deelite de cana-de-açúcar, de um es-forço conjunto do laboratório de

Genética e Evolução do Centro deBiologia Molecular e EngenhariaGenética (CEBMEG/UNICAMP), doCentro de Tecnologia Canavieira(CTC), Departamento de Genéticada Escola Superior de Agricultura“Luiz de Queiroz” (ESALQ/USP), edo laboratório de Melhoramento dePlantas do Centro de Energia Nuclearna Agricultura (CENA/USP). A pro-gênie é composta por 498 indivídu-os F1, dos quais 100 foram escolhidosaleatoriamente para genotipagem,obtidos a partir do cruzamento dosclones de elite ‘SP80-180’ e ‘SP80-4966’, pertencentes ao programa demelhoramento do Centro deTecnologia Canavieira (CTC). Osresultados obtidos entre os diversoslaboratórios envolvidos a partir demarcadores RFLPs, AFLPs e SSRs,foram recentemente integrados porGarcia et al (2006), e resultou em1.118 marcas em dose única, sendoque 357 marcas foram incorporadasem 131 grupos de co-segregação,totalizando 2.602,4 cM, com distân-cia média entre marcas de 7,3 cM.Recentemente, Albino (2006) utili-zando marcadores RFLP derivadosde sorgo e de genes análogos deresistência (RGA) identificados em

Figura 4. Grupo de Ligação VI (GHIV) do mapa genético gerado por Albino (2006), que ancora no grupo de ligação J de sorgopela sonda pSB204 (Ming et al., 1998)


cana-de-açúcar, acrescentou mais176 MDU nesta população,totalizando 1.294 marcas (Figura 4).Marcadores microssatélites selecio-nados a partir de ESTs de cana, iden-tificados pelo projeto SUCEST tam-bém estão sendo empregados nomapeamento desta progênie, o quepermitirá uma maior saturação destemapa.

Mapeamento comparativo emcana-de-açúcar

A detecção de alto grau de con-servação do conjunto gênico(sintenia), assim como na ordem dosgenes nos cromossomos entre espé-cies de Gramíneas (co-linearidade),sugeriu que características precisa-mente mapeadas em espécies comgenomas grandes e complexos(como cana-de-açúcar), poderiam serdissecadas pelo isolamento dos mes-mos genes em espécies relaciona-das com genoma pequeno.

A colinearidade e sintenia ob-servadas em espécies relacionadaslevaram a Bennetzen & Freeling(1993) a sugerirem que as Gramíneasfossem tratadas como um sistemagenético único, permitindo, numfuturo, a elaboração de estratégiasglobais de melhoramento degramíneas (Glazmann et al., 1997).O genoma do arroz já foi completa-mente seqüenciado (Yu et al., 2002;Goff et al., 2002; IRGSP, 2005), pos-sui mapas físicos e genéticos alta-mente saturados, exibindo alto graude sintenia com muitos cereais, oque faz desta espécie o organismoideal para estudos de genética eevolução de plantas. Como espécie-modelo de Gramíneas, o pequenogenoma do sorgo (Sorghum bicolorL., 760 Mpb) é o complemento lógi-co mais próximo do genoma total-mente seqüenciado de arroz (Oryzasativa, 440 Mpb), e encontra-se sen-do tota lmente seqüenciado(Kresovich et al., 2005).

Com respei to à t r iboAndropogoneae, os primeiros estu-dos comparativos eram focados en-tre sorgo e milho (Hulbert et al.,1990; Binelli et al., 1992; Whitkus etal., 1992; Melake-Berhan et al., 1993;

Pereira et al., 1994), demonstrandoque as duas espécies dividiam inú-meros locos or tólogos ( i .e .homólogos por descendência) agru-pados em regiões colineares. D’Hontet al. (1994) comparando os genomasde milho e cana-de-açúcar, foram osprimeiros a demonstrar que o genomada cana-de-açúcar poderia ser bene-ficiado pela análise comparativa deespécies relacionadas. Glaszmannet al. (1997) realizaram análise com-parativa entre diversas gramíneas everificaram estreita relação entremilho, arroz e o grupo de ligação Bde sorgo.

Dufour et al. (1997) realizaramanálise comparativa entre osgenomas de sorgo e cana-de-açúcarutilizando 84 sondas heterólogas pre-viamente empregadas nomapeamento de cana-de-açúcar emilho. A forte co-linearidade esintenia observadas entre sorgo ecana-de-açúcar levaram a sugerir ogenoma diplóide de sorgo como oelo central no mapeamento compa-rativo de espécies pertencentes àtribo Andropogoneae (milho, sorgoe cana-de-açúcar). A maioria dosgrupos de sintenia sorgo/cana-de-açúcar mostrou homologia a duasregiões distintas duplicadas nogenoma de milho, sendo consistentecom a origem tetraplóide deste últi-mo. Milho, sorgo e cana-de-açúcarexibem alto grau de co-linearidadegenômica, porém, os genomas desorgo e cana-de-açúcar exibem or-ganização cromossômica mais simi-lar (Dufour et al., 1997; Ming et al.,1998).

Guimarães et al. (1997) realiza-ram análise comparativa entreSaccharum, sorgo e milho e tambémverificaram uma relação quase per-feita entre Sacharum e sorgo. Ape-nas duas inversões na ordem dosmarcadores foram observadas entreS. robustum e sorgo enquanto queentre S. officinarum e sorgo a co-linearidade foi perfeita. Asnaghi etal. (2000) empregaram sondasheterólogas de arroz, milho e sorgopara saturar a região próxima à mar-ca CDSR0029, relacionada à resis-tência a ferrugem, no mapa de ‘R570’de cana-de-açúcar. Estas compara-

ções permitiram a identificação desegmentos de cromossomoshomeólogos entre a extremidade dogrupo de ligação D de sorgo, grupode ligação 2 de arroz e aos grupos deligação 4 e 5 de milho. Ming et al.(1998) compilaram dados de seismapas de Saccharum (GG, IND, MJ,PIN, S. officinarum ‘LouisianaPurple’, S. robustum ‘MOL’) e ali-nharam o mapa obtido com o mapade sorgo. Aproximadamente 84%dos locos mapeados por 242 sondascomuns foram homólogos entreSaccharum e sorgo, e apenas doisarranjos intercromossômicos e doisintracromossômicos diferem osgenomas de S. officinarum e S.spontaneum de sorgo. Pelo menoscinco grupos homólogos emSaccharum assemelham quase quetotalmente a um único cromossomode sorgo (Figura 4). Posteriormente,Ming et al. (2002a) obtiveram ummapa consenso para GG, IND, MJ ePIN composto de 289 grupos deligação em 13 grupos de homologia,e o alinharam com o genoma desorgo. Dos 982 locos mapeados nomapa consenso, 845 (86%) apresen-taram homologia ao mapa de sorgo,indicando uma estrutura genômicaaltamente conservada entre os doisgêneros.

Jordan et al. (2004) empregan-do marcadores RFLP, encontraramsete marcas associadas aoperfilhamento e outras seis associa-das à capacidade de rebrota em cana-de-açúcar. Estas marcas derivaramde oito sondas RFLP previamentemapeadas em cana-de-açúcar e/ousorgo, as quais estão localizadas emou próximas a QTLs relacionados àbrotação e capacidade de formaçãode rizomas em sorgo. Estas observa-ções reforçam o uso do sorgo comoreferência para simplif icar omapeamento de cana-de-açúcar. Re-centemente, McIntyre et al. (2005a)isolaram 54 “Genes Análogos de Re-sistência” (RGA) na biblioteca deEST do clone australiano ‘Q117’ decana-de-açúcar. Estas marcas foramutilizadas para mapear uma progê-nie composta por 192 indivíduosderivados do cruzamento entre‘Q117’ e ‘74C42’, denominada po-


pulação Q1, e 120 indivíduos deriva-dos do cruzamento entre o cultivarde sorgo ‘31945-2’ e a espécie sel-vagem Sorghum arundinaceus, de-nominada população S3. Vinte e trêsmarcadores RGA foram comuns en-tre as duas espécies, o que revelou aexistência de uma sintenia de clustersde RGA. Rossi et al. (2003) já haviarelatado a organização de RGAs emclusters em cana-de-açúcar.

O mapeamento comparativopor meio de mapas de RFLPs possi-bilita um melhor conhecimento daorganização do genoma e do proces-so evolutivo entre espécies relacio-nadas, assim como permitem o de-senvolvimento de estudos genéti-cos sobre caracteres agronômicos,por meio da localização de genesmaiores e QTLs (locos de caracterís-ticas quantitativas). Os estudos com-parativos têm revelado uma grandeco-linearidade entre genomas, de-monstrando que um número surpre-endentemente reduzido derearranjos cromossômicos distingueespécies e gêneros correlacionados(Bennetzen & Ma, 2003). Tal conhe-cimento sugere que diversos genesde interesse agronômico são com-partilhados por diversos genomas, oque possibilita a troca de informa-ções relevantes sobre suas funções elocalizações, aumentando a eficiên-cia e o aproveitamento dos recursosinvestidos em análises genômicas.

Mapeamento de locos decaracteres quantitativos - QTLs

Uma importante aplicação dosmapas genéticos é o estudo de locosque contribuem para a variação decaracterísticas de interesse agronô-mico. A maioria das características deimportância econômica resulta daação conjunta de vários genes, sen-do denominadas poligênicas, quanti-tativas ou de herança complexa, sen-do muito afetadas pelo ambiente.Para a grande parte destas caracterís-ticas, poucas informações existemsobre número, posiçãocromossômica, magnitude do efeitoe interações dos locos que controlamsua expressão. Estes locos são deno-minados QTL (Quantitative Trait

loci), ou seja, locos controladores decaracterística quantitativa (Ferreira& Grattapaglia, 1998). QTL tambémpode ser definido como um segmen-to de cromossomo que afeta umdeterminado caráter, não sendo ne-cessariamente um único gene(Falconer & Mackay, 1996). Omapeamento de QTL é baseado emtestes de associação entremarcadores moleculares e dadosfenotípicos, por meio de váriasmetodologias estatísticas, que per-mitem estimar o número e a localiza-ção dos genes que controlam a vari-ação fenotípica de um caráter, bemcomo a magnitude dos seus efeitos eas interações com outros QTLs.

Em cana-de-açúcar, Sills et al.(1995) realizaram uma primeira ten-tativa de analisar QTLs utilizando 83MDU derivados de RAPD em umaprogênie de apenas 44 indivíduos, eidentificaram associações significati-vas (P < 0,05) por análise de variânciasimples entre marcas individuais e ascaracterísticas número de perfilhos;conteúdo de sacarose e fibra; pesofresco; diâmetro médio de colmo; eperfilhos com flor ou com ferrugem.Dois outros estudos preliminares re-lataram a associação de marcadoresmoleculares com resistência a doen-ças e florescimento. Daugrois et al.(1996) identificaram, no mapa docultivar ‘R570’ de cana-de-açúcar,um possível gene principal para re-sistência a ferrugem (agente causal:Puccinia melanocephala) localiza-dos a cerca de 10 cM do marcadorRFLP CDSR0029. Foi o primeirorelato de herança monogênica pararesistência a doença em cana-de-açúcar. A sintenia de cana-de-açúcarcom sorgo, milho e arroz foi usadapara posicionar este gene (Asnaghiet al., 2000). Guimarães et al. (1997)encontrou um marcador RFLP(umc114e.2490) associado comflorescimento induzido por dias cur-tos. No entanto, as populações demapeamento usadas nos dois estu-dos foram muito pequenas para umaanálise completa de QTLs.

Guimarães (1999) identificoupor anál ise de regressão emapeamento por intervalos regiõesgenômicas associadas à QTLs refe-

rentes a número, diâmetro e peso decolmos; porcentagem de colmos cominflorescência; porcentagem decolmos infectados com carvão (agen-te causal: Ustilago scitaminea); por-centagem de fibra e teor de sacarose,em uma progênie do cruzamentoentre S. officinarum x S. robustum.Foram detectadas associações signi-ficativas (P < 0,05) para todos oscaracteres avaliados, sendo identifi-cados QTLs com contribuições com-plementares provenientes de am-bos os genitores para vários deles. Ogrupo de co-segregação 7 de S.officinarum foi particularmente in-teressante, uma vez que ancorouQTLs para três dos sete caracteresfenotípicos avaliados, dentre eles oflorescimento, sendo que o locoumc114e.2490 mapeado nesta re-gião genômica já tinha sido associa-do com florescimento em milho,sorgo e arroz por vários outros auto-res. Assim, além da grande co-linearidade dos marcadores, podehaver também a conservação deQTLs controlando fenótipos de inte-resse agronômico entre Sorghum eSaccharum.

Duas populações segregantesderivadas de cruzamentos entre S.officinarum e S. spontaneum, com-postas por mais de 200 indivíduos,foram mapeadas com 1.255marcadores em dose única; avaliadaspara detecção de QTLs associadoscom caracteres como produção deaçúcar e de seus componentes deprodução (peso e número de colmoe brix) ; a l tura de planta; eflorescimento, e comparadas aosmapas genéticos de milho e sorgo(Ming et al., 2001; 2002b; 2002c).Foram encontradas associações sig-nificativas para todos os caracteresavaliados. Quatro QTLs controlandoaltura de planta e um QTL controlan-do florescimento em cana-de-açú-car, correspondem a quatro (de seis)e a um (de três) QTLs em sorgo,respectivamente. Utilizando umaprogênie de 295 indivíduos deriva-dos da cultivar ‘R570’, Hoarau et al.(2002) encontraram 40 QTAs(Quantitative Trait Al leles)presumíveis (P < 0,05) relacionadosa quatro componentes de produção


para cana-de-açúcar (altura de plan-ta, número e diâmetro de colmos ebrix).

Os clones de elite australianos‘Q117’ e ‘74C42’, híbridos deSaccharum spp. foram avaliados paralocalização de QTLs associados aperfilhamento, capacidade de rebrotae resistência a doenças. Utilizandoanálises de marcas simples, Jordan eta l . (2004) encontraram 16marcadores associados aperfilhamento e outros 14 associa-dos a rebrota, todos com associaçõesaltamente significativas (P < 0,01).Estas marcas derivam de oito sondasRFLP previamente mapeadas emcana-de-açúcar e/ou sorgo, as quaisestão localizadas em ou próximas aQTLs relacionados à brotação e ca-pacidade de formação de rizomasem sorgo. McIntyre et al. (2005b)mapearam três sondas RGA signifi-cativamente associadas à resistênciaà ferrugem, que correspondem a umQTL associado ao mesmo caráterlocalizado no grupo de ligação E (LGE) de sorgo. Outro acesso, ‘MQ77-340’, descendente de ‘Mandalay’, umimportante clone de S. spontaneumusado em programas de melhora-mento na Austrália, foi avaliado paracaracteres relacionados a açúcar (POL,brix, CCS – açúcar comercial);percentual de fibra; peso de colmo;toneladas de cana por hectare (TCH);e toneladas de açúcar por hectare(TSH), sendo mapeados váriosmarcadores, com efeitos positivos enegativos, para todos os caracteresanalisados (Reffay et al., 2005).

Na população de ‘SP80-180’ x‘SP80-4966’, foram detectados, atra-vés de análises de marcas individuais(ANAVA e regressão linear) e inter-valo composto, associações signifi-cativas (P < 0,005) de marcadoresAFLP com altura e diâmetro de col-mo; número de perfilhos; brix (% nocaldo); percentual de fibra; % POL nacana (PCC); e tonelagem de canapor hectare (TCH) (Kido, 2003). Amesma população foi avaliada porda Silva & Bressiani (2005), utilizan-do marcadores RFLP derivados deEST associados ao metabolismo desacarose. Por meio de análise devariância, um marcador em dose única

(pA35) foi associado significativa-mente (P < 0,01) ao conteúdo deaçúcar.

No entanto, os QTLs identifica-dos até o momento, têm se mostradosuficientes para explicar uma baixaporcentagem da variação observadapara as características quantitativas,possivelmente refletindo seu con-trole poligênico complexo e a re-dundância genética existente emcana-de-açúcar, onde qualquer locogênico e seu complemento alélicopodem estar representado váriasvezes em cromossomos homólogosde cada um dos dois genomas pre-sentes nas variedades modernas decana-de-açúcar (Casu et al., 2005).

A construção de mapas genéti-cos saturados, baseados em progêni-es de materiais elite, representativosde programas de melhoramento, quesegregam para características de im-portância agroindustriais, poderáviabilizar a seleção assistida pormarcadores, permitindo o planeja-mento de cruzamentos e a aplicaçãode seleção indireta ou precoce.Apesar dos avanços que se têm sidoobtidos com o auxílio dos marcadoresmoleculares em cana-de-açúcar, énecessário que as informações gera-das possam ser traduzidas num pro-cedimento prático e de rotina aomelhorista, de modo a acelerar odesenvolvimento de novas varieda-des. Os marcadores e QTLs forte-mente ligados aos componentes deprodução e outros caracteres de in-teresse agronômicos identificadospor mapeamento em cana-de-açú-car, necessitam ser disponibilizadosde uma forma mais simples e rápidapara os programas de seleção, per-mitindo que efetivamente, a pro-messa de seleção assistida pormarcadores seja implantada em cana-de-açúcar. Diversas tecnologias degenotipagem de alta eficiência estãoà disposição, mas seu custo para usoem larga escala ainda é um fatorlimitante. Portanto, o uso de seleçãoassitida por marcadores no melhora-mento da cana-de-açúcar, requer odesenvolvimento de estratégias quesuperem os gargalos impostos pelasmetodologias atuais. Explorar a in-formação derivada da seqüência do

genoma ou transcriptoma (banco deESTs), e/ou mapas genéticos com-parativos de outras gramíneas mo-delo, poderá ser uma estratégia bas-tante interessante, visto que a vastainformação existente poderá ser com-partilhada com cana-de-açúcar, per-mitindo a localização de genes deimportância econômica. Acomplementaridade de metodologiasconvencionais e moleculares deveráresultar num futuro próximo, numprocedimento mais eficiente e rápi-do no melhoramento da cana-de-açúcar.

Agradecimentos

Os autores expressam seus agra-decimentos a FAPESP, CNPq ePADCT-MCT pelo auxílio financeiro,e ao Centro de Tecnologia deCanavieira.

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