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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁSINSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA

ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE VARIANTES MOLECULARES DORECEPTOR DE MELANOCORTINA 1 (MC1R)

E O MELANOMA CUTÂNEO

DÉBORA TEIXEIRA DUARTE

ORIENTADORA: PROFª Drª LIDIA ANDREU GUILLO

Dissertação apresentada ao Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia – Área de concentração: Biologia Celular e Molecular.

GOIÂNIA, 2008

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Aos pacientes do Hospital Araújo Jorge

que, gentil e literalmente, deram o sangue para

este trabalho. Em um momento de dor,

colaboraram com algo que não lhes trará

benefício algum. Tal lição de amor ao próximo eu

não poderia ter aprendido em outra ocasião.

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AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Luiz Augusto e Márcia. Por tudo, e especialmente pelo

incentivo e zelo que sempre tiveram com a minha formação acadêmica (o que inclui,

necessariamente, me levar no laboratório em horários inconvenientes, fazer suco de

laranja às quatro da manhã e revisar a dissertação com olhos atentos, dentre outras

habilidades especiais).

Aos meus irmãos Lívia e Rafael, pela companhia desde a mais tenra idade e

por suportarem (quase sempre sem revidar) meus ataques de fúria e desespero,

principalmente nesta reta final.

Às amigas e companheiras de mestrado: Paula, por seu sorriso acolhedor e

por aturar minhas lamentações quase diárias; Lidiane, pela “co-orientação”, broncas,

conselhos e momentos de descontração maravilhosos, sem os quais eu teria

enlouquecido.

À amiga e “super hiper mega” eficiente estagiária Larissa Matuda, com quem

eu dividi de fato todas as alegrias, desilusões e surpresas deste trabalho.

À Erika, pela companhia e conselhos oportunos.

À Zenilda, pelo trabalho silencioso e necessário.

À Profª Drª Lidia, pela orientação, inspiração e paciência.

À Profª Drª Célia, do Laboratório de Biologia Molecular da UFG, pelas

sugestões valiosas e por aceitar o convite para esta parceria.

À Juliana Parente, do Laboratório de Biologia Molecular da UFG, pelas mãos

precisas na hora de sequenciar a minha placa.

À Profª Drª Sueli, do Instituto de Química da Universidade de São Paulo, por

abrir as portas de seu laboratório para um estágio que muito me enriqueceu.

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À Luci, pelo apoio, agasalho, conversas, “tour” na Cidade Universitária e

dicas turísticas sobre São Paulo. E claro, pelo trabalho eficiente e zelo com minhas

amostras.

À equipe do Serviço de Sequenciamento do Cenargen (Embrapa DF).

À equipe do Ambulatório de Pele e Tórax do Hospital Araújo Jorge de

Goiânia: Nermindo, Nildes, Flávio, Saulo, Roberto, Raimundo, Sormany, Odenir,

Verônica e Elenita.

À equipe do Laboratório Hemolabor, pelas amostras cedidas.

À Luciana “prima cunhada”, pela ajuda na formatação.

Aos amigos de todas as horas: Luciana, Patrícia & Leandro Mourão, Anna

Paolla, Vinícius Batista e Paola Bergamini.

A todos da minha família: tios, primos e avós, que torceram por mim.

A todos os voluntários que doaram sangue, sem os quais este trabalho não

existiria.

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“Quem tem consciência para ter coragem

Quem tem a força de saber que existe

E no centro da própria engrenagem

Inventa a contra-mola que resiste

Quem não vacila mesmo derrotado

Quem já perdido não se desespera

E envolto em tempestade, decepado

Entre os dentes segura a primavera.”

(Primavera nos Dentes, João Ricardo & João Apolinário)

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ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE VARIANTES MOLECULARES DO RECEPTOR DE MELANOCORTINA 1 (MC1R) E O MELANOMA CUTÂNEO

O gene do receptor de melanocortina 1 (MC1R) codifica um receptor acoplado à proteína G, o qual exerce um papel central na produção de melanina através de uma via de sinalização mediada por cAMP e ativada pelo hormônio melanócito-estimulante. A região codante do MC1R é altamente polimórfica, e algumas variantes têm sido associadas com um risco elevado de melanoma cutâneo, sugerindo que este seja um gene baixa penetrância na suscetibilidade ao melanoma. Neste estudo nós procuramos determinar a contribuição das variantes do MC1R para o risco de melanoma cutâneo na população brasileira. Este é o primeiro estudo a descrever variantes do MC1R em indivíduos do Brasil. 34 pacientes com melanoma e 71 controles não aparentados e saudáveis foram recrutados consecutivamente entre setembro de 2006 e outubro de 2007. Informações sobre o fototipo cutâneo e características de pigmentação foram coletadas por meio de questionário padronizado. O DNA genômico foi extraído a partir do sangue venoso, e o gene MC1R foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR). A presença de variantes foi investigada por seqüenciamento com o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing. A análise das seqüências foi feita com a plataforma SNPpipeline, mantida pelo Laboratório de Genética de Populações do Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI, NIH, USA). A sequência consenso foi importada do GenBank (AF153431). Não foram detectadas associações de cor de pele, olhos, cabelos e fototipo com o melanoma em níveis significantes, apenas uma tendência de associação entre indivíduos com fototipos I e II e o melanoma (OR=2,03; p=0,1358). Foram encontrados onze diferentes polimorfismos, dos quais sete levam à troca de aminoácido no MC1R (Val60Leu, Val92Met, Arg151Cys, Arg160Trp, Arg163Gln, Asp184His, e Asp294His), incluindo o novo alelo Asp184His; e quatro são mutações silenciosas (Asp42Asp, Thr177Thr, Gln233Gln e Phe300Phe). De todos os indivíduos, 41,90% eram portadores de pelo menos um polimorfismo, incluindo 16 (47,06%) casos e 28 (39,44%) controles. As variantes mais freqüentes foram Val60Leu, que foi encontrada em 13 indivíduos (2 casos e 11 controles) e Arg163Gln, que foi encontrada em 12 indivíduos (6 casos e 6 controles). Nenhuma associação significante com risco de melanoma, subtipo histopatológico de melanoma ou fototipo foi observada para portadores de variantes não sinônimas do MC1R. Não obstante, foram observadas tendências de associação entre as variantes Asp42Asp (OR=6,4; p=0,32), Val92Met (OR=4,6; p=0,08), Arg151Cys (OR=6,8; p=0,10), Arg163Gln (OR=2,3; p=0,20), Asp184His (OR=6,4; p=0,32) e Asp294His (OR=2,1; p=0,54) e o melanoma. Além disso, observamos uma tendência de associação entre a presença de qualquer variante não sinônima e o melanoma de subtipo “não nodular” (lentiginoso acral, extensivo superficial ou lentigo maligna).

PALAVRAS-CHAVE: melanoma, receptor de melanocortina 1, polimorfismo de base única.

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ASSOCIATION STUDY BETWEEN MOLECULAR VARIANTS OF MELANOCORTIN-1 RECEPTOR (MC1R) GENE AND CUTANEOUS MELANOMA

The melanocortin-1 receptor gene (MC1R) encodes a G protein-coupled receptor which plays a central role in melanin production by a cAMP-signaling pathway activated by the melanocyte stimulating hormone. The coding region of MC1R is highly polymorphic and some variants have been associated with an elevated risk for cutaneous melanoma, suggesting that it is a low-penetrance melanoma susceptibility gene. In this study we sought to determine the contribution of MC1R gene variants to the risk of cutaneous melanoma in the Brazilian population. This is the first study to describe MC1R variants among subjects from Brazil. 34 melanoma patients and 71 unrelated healthy controls were consecutively recruited between September 2006 and October 2007. Information about skin phototype and pigmentation characteristics was collected through a standardized questionnaire. Genomic DNA was extracted from venous blood, and the MC1R gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The presence of variants was assessed by sequencing with BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit. Sequence analysis was done with SNP Analysis Server, provided by the Laboratory of Population Genetics (NCI, NIH, USA). Consensus sequence was imported from GenBank (AF153431). We haven’t detected associations of skin color, eye color, hair color or phototype with melanoma in significant levels, but we have detected an association tendency between subjects with phototypes I or II and melanoma (OR=2,03 and p=0,1358). We have found eleven different polymorphisms, of which seven lead to amino acid exchange in MC1R (Val60Leu, Val92Met, Arg151Cys, Arg160Trp, Arg163Gln, Asp184His, and Asp294His), including the novel Asp184His allele; and four are silent mutations (Asp42Asp, Thr177Thr, Gln233Gln and Phe300Phe). From all subjects, 41,90% carried at least one polymorphism, including 16 (47,06%) cases and 28 (39,44%) controls. The most frequent variants were Val60Leu, which was found in 13 subjects (2 cases and 11 controls) and Arg163Gln, which was found in 12 subjects (6 cases and 6 controls). No significant association with melanoma risk, melanoma hystopathological subtype or phototypes was observed for carriers of non-synonymous MC1R variants. However, we did observed association tendencies between the variants Asp42Asp (OR=6,4; p=0,32), Val92Met (OR=4,6; p=0,08), Arg151Cys (OR=6,8; p=0,10), Arg163Gln (OR=2,3; p=0,20), Asp184His (OR=6,4; p=0,32) e Asp294His (OR=2,1; p=0,54) and cutaneous melanoma. Besides that, we have found an association tendency between the existence of any non synonymous variant and non-nodular melanoma (acral lentiginous, superficial spreading or lentigo maligna).

KEY WORDS: melanoma, melanocortin-1 receptor, single nucleotide polymorphisms.

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Lista de FigurasFigura 1. Estrutura da pele humana e seus anexos. (Adaptado de STARR & TAGGART, 1995)........................................................................................14

Figura 2. Camadas da epiderme e suas células características. (Adaptado de GRAY, 1997)..........................................................................................15

Figura 3. Síntese de melaninas. (SLOMINSKI et al., 2004).........................18

Figura 4. Estrutura do MC1R (Adaptado de GARCÍA-BORRÓN et al., 2005)....................................................................................................................22

Figura 5. Mecanismo de ação do MC1R. (CHIN, 2003)...............................25

Figura 6. Aspecto macroscópico do melanoma. (DUVIVIER &MCKEE, 1997)....................................................................................................................30

Figura 7. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma, por cor de pele, segundo sua auto-declaração................................................47

Figura 8. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma por cor dos olhos..............................................................................................48

Figura 9. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma por cor dos cabelos..........................................................................................49

Figura 10. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma por fotótipo.......................................................................................................49

Figura 11. Distribuição dos indivíduos dos grupos controle e melanoma segundo seu hábito de fotoproteção..........................................................51

Figura 12. Distribuição dos casos de melanoma por subtipo histopatológico...........................................................................................52

Figura 13. Eletroforese dos produtos da amplificação por PCR em gel de agarose 1%................................................................................................54

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Figura 14. Trecho de um dos cromatogramas obtidos...............................55

Figura 15. Comparação das seqüências obtidas com a seqüência de referência AF153431 na plataforma SNPpipeline. .....................................56

Figura 16. Detalhe de uma seqüência analisada pelo SNPpipeline, evidenciando mutação na posição 160......................................................57

Figura 17. Página de entrada dos dados e página de resultados do BLAST específico para verificar troca de aminoácidos decorrente de SNPs, o qual é acessado a partir da plataforma SNPpipeline.........................................58

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Lista de TabelasTabela 1. Características epidemiológicas dos grupos melanoma e controle...................................................................................................................47

Tabela 2. Associação entre características de pigmentação e o melanoma cutâneo. ....................................................................................................50

Tabela 3. Distribuição dos casos de melanoma cutâneo com tumor primário por sítio........................................................................................53

Tabela 4. Variantes do MC1R encontradas e sua associação individual com o melanoma...............................................................................................59

Tabela 5. Freqüências alélicas no locus MC1R e sua associação com o melanoma cutâneo....................................................................................61

Tabela 6. Associação entre a presença de variantes não sinônimas e o melanoma cutâneo....................................................................................62

Tabela 7. Associação entre a presença de variantes funcionais do MC1R e o melanoma cutâneo.................................................................................62

Tabela 8. Associação entre a presença de variantes não sinônimas do MC1R e o fototipo no grupo controle.........................................................63

Tabela 9. Associação entre a presença de variantes não sinônimas do MC1R e o fototipo no grupo melanoma......................................................63

Tabela 10. Associação entre a presença de variantes não sinônimas do MC1R e os subtipos histopatológicos de melanoma..................................64

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LISTA DE ABREVIATURAS

AC – adenilato ciclaseACTH – hormônio adrenocorticotróficoAJCC – The American Joint Committee on CancerARF – alternate reading frameASIP – proteína sinalizadora AgouticAMP – adenosina monofosfato cíclicoCD – cisteinildopaCDK4 – cyclin-dependent kinase 4CDKN2A – cyclin-dependent kinase inhibitor 2Acm - centímetrosCREB – elemento de ligação responsivo ao cAMPCRT – sequenciamento por terminação cíclica reversívelDCT – dopacroma tautomerase ou Tyrp2ddNTP – didesoxinucleotídeoDHI - 5,6-diidroxiindolDHICA – 5,6-diidroxiindol-2-ácido carboxílicoDNA – ácido desoxirribonucléicodNTP - desoxinucleotídeoDP – desvio padrãoEDTA – ácido etilenodiamino tetra-acéticoEND1 – endotelina 1GPCR – receptor acoplado à proteína GGRK – GPCR quinaseGSH – glutationaH2O2 – peróxido de hidrogênioIBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e EstatísticaIC – intervalo de confiançaL-DOPA – L-diidroxifenilalaninaLEF-1 – lymphoid enhancer-binding factor 1M – molarm – miliMCR – receptor de melanocortina

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MC1R – receptor de melanocortina 1MDS – melanoma de disseminação superficialMITF – fator de transcrição da microftalmiaMLA – melanoma lentiginoso acralMLM – melanoma lentigo malignaMN – melanoma nodularMSH – hormônio melanócito estimulanteNADP – nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfatoNADPH - nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato-hidrogênionsSNP – SNP não sinônimoOR – Odds RatioPAX3 – paired-box 3PCR – reação em cadeia da polimerasePKA – proteína quinase APOMC – pro-opiomelanocortinaPrASE – microarray-based genotyping technique protease-mediated allele-specific extentionq.s.p. - quantidade suficiente paraRFLP – polimorfismo de comprimento do fragmento de restriçãoRPE – epitélio pigmentar da retinarpm – rotações por minutoSBH – sequenciamento por hibridizaçãoSBS – sequenciamento por sínteseSNA – sequenciamento por adição de único nucleotídeoSNP – polimorfismo de base únicaSOX10 – sex determining region Y box 10SSCP – análise de polimorfismo de conformação de fita simplesSSDNA – Serviço de Seqüenciamento de DNA, Universidade de São PaulosSNP – SNP sinônimoTGFβ – fator de crescimento transformador betaTNFα – fator de necrose tumoral alfaTRP – proteína relacionada à tirosinaseTyrp – proteína relacionada à tirosinaseUV – radiação ou luz ultravioletaµL – microlitros°C – graus celsius

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Sumário1 INTRODUÇÃO..........................................................................................15

1.1 Estrutura da pele humana................................................................151.1.1 Derme........................................................................................151.1.2 Epiderme...................................................................................16

1.2 Melanócito e unidade de pigmentação epidérmica..........................171.3 Melanina e melanogênese................................................................191.4 MC1R ...............................................................................................23

1.4.1 Estrutura do MC1R.....................................................................231.4.2 Mecanismo de ação e regulação do MC1R................................28

1.5 Melanoma........................................................................................311.5.1 Histórico....................................................................................311.5.2 Características Clínicas..............................................................311.5.3 Classificação Histopatológica....................................................311.5.4 Epidemiologia............................................................................341.5.5 Etiologia e fatores de risco........................................................34

1.6 Polimorfismos de base única (SNPs)................................................371.7 Seqüenciamento de DNA..................................................................39

2 JUSTIFICATIVA.........................................................................................40

3 OBJETIVO GERAL.....................................................................................41

3.1 Objetivos Específicos........................................................................41

4 METODOLOGIA........................................................................................42

4.1 Participantes....................................................................................424.2 Aferição de características de pigmentação e histórico de câncer. .424.3 Coleta de sangue.............................................................................434.4 Extração de DNA genômico..............................................................444.5 Quantificação...................................................................................444.6 Reação em cadeia da polimerase....................................................444.7 Eletroforese em agarose..................................................................454.8 Purificação........................................................................................46

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4.9 Quantificação...................................................................................464.10 Seqüenciamento de DNA................................................................46

4.10.1 Preparo das reações de seqüenciamento................................474.10.2 Precipitação.............................................................................47

4.11 Detecção de polimorfismos de base única.....................................484.12 Análise estatística..........................................................................49

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................50

5.1 Características epidemiológicas dos grupos melanoma e controle..505.2 Características de pigmentação e hábito de fotoproteção...............525.3 Características clínicas do grupo melanoma....................................58

5.3.1 Subtipos histopatológicos do grupo melanoma.........................585.3.2 Localização do tumor primário..................................................59

5.4 Análise Molecular.............................................................................605.4.1 Amplificação do gene MC1R por PCR.........................................605.4.2 Seqüenciamento e detecção de SNPs.......................................615.4.3 Distribuição das variantes do MC1R e sua associação com características de pigmentação e risco de melanoma cutâneo..........65

6 CONCLUSÕES..........................................................................................72

7 PERSPECTIVAS........................................................................................73

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................74

9 ANEXOS...................................................................................................82

9.1 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Associação de Combate ao Câncer em Goiás...............................................................................839.2 Comprovante de aprovação do projeto multicêntrico pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP)................................................849.3 Questionário sobre características de pigmentação........................859.4 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – grupo controle.......879.5 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – grupo melanoma....889.6 Planilha dos dados dos indivíduos do grupo controle. .....................909.7 Planilha dos dados dos indivíduos do grupo melanoma. .................91

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1 INTRODUÇÃO

A pele, o maior órgão do corpo humano, consiste de um tecido conjuntivo

(derme) revestido por um epitélio estratificado (epiderme), continuamente renovado

ao longo da vida. Além de revestir e proteger o corpo, a pele apresenta funções

termorregulatória, sensorial, imune e metabólica, dentre outras (FREEDBERG et al.,

2003).

Como todo e qualquer órgão do corpo, a pele está sujeita à distúrbios

proliferativos, resultantes de mutações e outros processos que alterem o ciclo

celular, levando a um crescimento desordenado e à formação de uma massa de

células anormais denominada tumor. Um tumor pode ser benigno ou maligno,

dependendo de sua capacidade de invasão dos tecidos adjacentes; os tumores

malignos também são conhecidos como cânceres (SCHULZ, 2005).

Os cânceres de pele mais comuns são os carcinomas, originados por

queratinócitos da epiderme. Apesar disso, praticamente não ocupam espaço nas

estatísticas de mortes por câncer, porque são pouco invasivos e facilmente curáveis.

Já o câncer originado de melanócitos, o melanoma, é mais raro e costuma ser

bastante agressivo, sendo letal quando descoberto tardiamente (LEBOIT et al.,

2006).

1.1 Estrutura da pele humana

1.1.1 Derme

A derme é um tecido conjuntivo vascularizado, responsável pela nutrição da

pele. Apresenta, além de vasos sanguíneos, vasos linfáticos, fibras nervosas

sensoriais e aferentes, feixes de músculo liso, células imunes e fibroblastos, os

quais produzem uma matriz extracelular rica em colágeno e elastina (ver figura 1).

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Também abriga estruturas de origem epitelial, tais como glândulas sebáceas,

glândulas sudoríparas e folículos pilosos (REES, 2004).

Logo acima da derme, sobre a membrana basal, está a epiderme, um

epitélio estratificado pavimentoso e queratinizado, cujas células dispõe-se em

camadas de acordo com seu estado de maturação.

Figura 1. Estrutura da pele humana e seus anexos. (Adaptado de STARR & TAGGART,

1995).

1.1.2 Epiderme

A epiderme é formada por quatro camadas contíguas (ver figura 2). A

camada mais externa (estrato córneo) é composta de queratinócitos mortos

preenchidos com proteínas filamentosas (queratina). Esta camada forma uma

barreira que protege a pele contra agentes infecciosos, reage com compostos

químicos e absorve radiação. As camadas logo abaixo (estrato granuloso e estrato

espinhoso) são formadas por células vivas, irreversivelmente comprometidas com a

diferenciação terminal. Assim, mudanças genéticas nestas células raramente se

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tornam permanentes, porque elas estão destinadas à se tornarem incapazes de

proliferar, perdendo seu núcleo e sendo eventualmente eliminadas por descamação.

Mesmo a camada basal, à qual a atividade proliferativa é confinada, consiste em

sua maioria de células com um potencial replicativo limitado. Este é um dos motivos

pelos quais os tumores cutâneos originados destas células (carcinomas) são

geralmente pouco agressivos (SCHULZ, 2005).

Além dos queratinócitos, a epiderme apresenta células de Langerhans, que

participam de processos imunes na pele, processando e apresentando antígenos; e

melanócitos, responsáveis pela pigmentação cutânea (REES, 2004).

Figura 2. Camadas da epiderme e suas células características. À direita, melanócito

situado na camada basal, com seus prolongamentos dendríticos em direção aos queratinócitos

adjacentes (Adaptado de GRAY, 1997).

1.2 Melanócito e unidade de pigmentação epidérmica

Os melanócitos situam-se na camada basal da epiderme (ver figura 2), e

pertencem a uma linhagem embrionária diferente dos queratinócitos. Durante o

desenvolvimento embrionário, os precursores dos melanócitos (melanoblastos)

proliferam-se, diferenciam-se e migram da crista neural para seu destino final, que

pode ser a camada basal da pele, as meninges, a mucosa ectodérmica ou o trato

uveal (KUFE et al., 2003).

Os melanócitos adultos são especializados na produção de melanina a partir

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de tirosina, em vesículas denominadas melanossomos (YAAR & GILCHREST,

2004).

Os melanossomos são organelas intracelulares membranosas, originárias do

retículo endoplasmático. Podem ser encontrados em quatro estágios de maturação

morfologicamente distintos: (1) pré-melanossomos ou melanossomos de estágio I,

sem pigmento visível e com estruturas de membrana interna irregulares; (2)

melanossomos de estágio II, caracterizados por vesículas mais alongadas e

membranas internas organizadas em estruturas paralelas; (3) melanossomos de

estágio III, onde a deposição ordenada de melanina nas fibras internas pode gerar

um aspecto de colar de contas; (4) melanossomos de estágio IV ou melanossomos

maduros, completamente preenchidos com melanina e sem estruturas luminais

aparentes (SETALURI, 2003).

Durante o seu desenvolvimento, o melanossomo adquire a tirosinase e as

proteínas relacionadas à tirosinase 1 e 2 (Tyrp1 e Tyrp2), as quais participam da

melanogênese. O tamanho e o número dos melanossomos é importante na

determinação da pigmentação humana, e em geral os melanossomos da pele negra

são maiores do que os encontrados na pele branca (TSATMALI et al., 2002).

Na pele, os melanócitos interagem com queratinócitos adjacentes por meio

de projeções dendríticas (ver figura 2) , transferindo assim seus grânulos de

melanina, que irão se estabelecer de modo a formar um “cap” protetor para o núcleo

do queratinócito. O processo de diferenciação dos queratinócitos transporta a

melanina para as camadas mais externas da pele, onde ela confere pigmentação ao

tecido epidérmico e absorve luz visível e luz ultravioleta (UV), protegendo as células

vivas da pele.

A transferência de melanina para os queratinócitos epidérmicos ou para os

queratinócitos corticais / medulares da haste do pêlo em crescimento provavelmente

envolve um mesmo mecanismo, ainda não elucidado. Diversas teorias têm sido

propostas para explicar este processo de doação de organelas entre células. A

“Teoria Autofágica” propõe que o queratinócito participe ativamente, fagocitando as

extremidades dos dendritos dos melanócitos com melanossomos maduros de

estágio IV. A “Teoria da Descarga” considera que os melanossomos sejam liberados

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no espaço intercelular e então internalizados pelos queratinócitos adjacentes. A

“Teoria da Fusão” propõe, como o nome sugere, que ocorra a fusão das membranas

plasmáticas de melanócitos e queratinócitos, permitindo assim a passagem dos

melanossomos maduros de uma célula para a outra. Por fim, a “Teoria Citócrina”

sugere que os melanócitos injetem a melanina nos queratinócitos destinatários

(SLOMINSKY et al., 2004).

Além da interação óbvia na transferência de melanina, os queratinócitos

atuam regulando o crescimento, a dendricidade, a dispersão, os contatos célula-

célula e a melanização dos melanócitos, por meio de fatores secretados

(SLOMINSKY et al., 2004).

1.3 Melanina e melanogênese

A melanina é um polímero formado a partir da oxidação enzimática de

tirosina, pela tirosinase. Existem dois tipos principais de melanina, que diferem entre

si na composição química, propriedades físicas e estruturais: eumelanina, de cor

acastanhada ou negra, e feomelanina, de cor avermelhada ou amarela (SLOMINSKI

et al., 2004).

A eumelanina é uma macromolécula heterogênea, formada por 5,6-

diidroxiindol (DHI), 5,6-diidroxiindol-2-ácido carboxílico (DHICA) e suas formas

totalmente oxidadas (quinonas) e semi-oxidadas (semiquinonas). A feomelanina,

também uma macromolécula heterogênea, é derivada do composto sulfúrico

cisteinildopa (CD) (MEREDITH & SARNA, 2006).

A biossíntese de melaninas (Ver figura 3) pode ser iniciada a partir da

fenilalanina, que é hidroxilada à L-tirosina pela fenilalanina-hidroxilase; ou a partir da

L-tirosina, que é hidroxilada à L-diidroxifenilalanina (L-DOPA) pela tirosinase. A

tirosinase (EC 1.14.18.1), estruturalmente uma glicoproteína com átomos de cobre

em seu sítio ativo, é a principal enzima da melanogênese, capaz de catalisar dois

tipos de reações diferentes: a hidroxilação de monofenóis a orto-difenóis (atividade

monofenolase) e a oxidação do orto-difenol resultante a orto-quinonas (atividade

difenolase). Por participar da melanogênese em três pontos distintos, é chamada

enzima “rate-limiting”, que determina a velocidade da via. Além de precursora das

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melaninas, a L-DOPA também participa da via de formação das catecolaminas.

Para a formação das melaninas, a L-DOPA é oxidada à dopaquinona pela

tirosinase, e a partir deste ponto, as vias de eumelanogênese e feomelanogênese

divergem. Na via de eumelanogênese, a dopaquinona é convertida em

leucodopacroma e sofre uma série de reações de oxirredução, produzindo os

intermediários DHI e DHICA, que se polimerizam, formando a eumelanina. Na via de

feomelanogênese, a dopaquinona é conjugada com cisteína ou glutationa, formando

cisteinildopa ou glutationildopa, os quais irão sofrer oxidação à cisteinildopaquinona,

e posteriomente, ciclização intramolecular e polimerização, formando assim a

feomelanina (SLOMINSKI et al., 2004).

Figura 3. Síntese de melaninas. GSH, glutationa; Cys, cisteína. 1: Hidroxilação de L-

fenilalanina pela fenilalanina-hidroxilase; 2: hidroxilação de L-tirosina pela tirosinase; 3: oxidação de

L-DOPA pela tirosinase ; 4: tautomerização de dopacroma (pela DCT/Tyrp2 ou cátions metálicos). 5a:

oxidação de DHICA (por Tyrp1 ou peroxidase); 5b: oxidação de DHI (por tirosinase ou peroxidase); a:

hidrólise de glutationildopa (pela γ-glutamiltranspeptidase); b: oxidação de cisteinildopa (por peroxidase); c: ciclização intramolecular de cisteinildopaquinona (pode ser facilitada pela peroxidase)

(SLOMINSKI et al., 2004).

21

Em ambas as vias, o passo obrigatório é a formação de L-DOPA pela

tirosinase. As etapas seguintes podem ocorrer espontaneamente em taxas variáveis,

dependendo da concentração de H+, presença e concentração de cátions metálicos,

agentes redutores, tióis e oxigênio.

A formação de eumelanina ou feomelanina está diretamente relacionada à

presença ou ausência de cisteína e glutationa em seu estado tiolato totalmente

reduzido. Assim, a presença e atividade de enzimas antioxidantes no melanócito,

tais como catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa

redutase podem alterar a via melanogênica quantitativamente ou qualitativamente.

Quando a concentração de compostos sulfídricos é baixa, a dopaquinona é

convertida em dopacroma, iniciando a eumelanogênese. Alternativamente, altas

concentrações de cisteína e glutationa levam à sua conjugação com dopacroma,

formando cisteinildopa e glutationildopa. A transformação da glutationa oxidada em

sua forma reduzida pela glutationa redutase requer NADPH, e é essencial para a

formação de glutationildopa. Assim, o sistema de reciclagem de NADPH/NADP e a

via pentose fosfato estão indiretamente envolvidos na regulação da melanogênese

(SLOMINSKI et al., 2004).

Dentre as propriedades físicas e químicas das melaninas relevantes para a

sua função no organismo estão: habilidades de troca de elétrons (reduzir e oxidar

outras moléculas), baixa fluorescência (mais de 99,9% dos fótons absorvidos estão

sujeitos à dissipação não radioativa, o que é uma característica importante num

fotoprotetor), baixa concentração de radicais livres e a capacidade de se ligar a íons

metálicos (MEREDITH & SARNA, 2006).

As melaninas diferem em suas respostas à luz UV: enquanto a eumelanina

tem efeito fotoprotetor, porque absorve a luz UV e aprisiona os radicais livres

gerados por esta radiação, a feomelanina não só absorve pouca luz UV, como

também gera radicais por fotólise; dentre eles, superóxido, radicais hidroxil e

peróxido de hidrogênio (SLOMINSKI et al., 2004).

A razão entre eumelanina e feomelanina é controlada pelo Receptor de

Melanocortina 1 (MC1R), ao qual se liga o hormônio melanócito estimulante (MSH,

do inglês melanocyte stimulating hormone), determinando assim a pigmentação da

22

pele em seres humanos (REES, 2004). O MSH atua induzindo genes melanócito-

específicos, aumentando a produção de eumelanina e estimulando a proliferação de

melanócitos normais (SLOMINSKI et al., 2004).

23

1.4 MC1R

1.4.1 Estrutura do MC1R

O gene que codifica o MC1R está localizado na região cromossômica

16q24.3 e aparentemente não apresenta íntrons. Este gene tem se mostrado

altamente polimórfico, e algumas variantes tem sido associadas ao fenótipo do

cabelo ruivo e à uma maior susceptibilidade ao melanoma (HARDING et al., 2000).

O MC1R é uma molécula protéica de 317 resíduos de aminoácidos

(MOUNTJOY et al., 1992; CHHAJLANI et al., 1992) que faz parte da subfamília de

receptores de melanocortina (MCR, do inglês melanocortin receptor), um subgrupo

da superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCR, do inglês G protein coupled receptor).

Como sua principal função é o controle da melanogênese, o MC1R é

expresso principalmente em melanócitos, tanto normais como neoplásicos, e

também em queratinócitos, fibroblastos, células dendríticas e células endoteliais,

muito embora nestas últimas, em níveis baixos, incapazes de ativar a sinalização via

adenosina monofosfato cíclico (cAMP) (ROBERTS et al., 2006).

Assim como os demais membros da superfamília GPCR, o MC1R possui sete

hélices transmembrana, um amino-terminal extracelular e uma região carboxi-

terminal intracelular (ver figura 4). O amino-terminal extracelular do MC1R possui

dois sítios de N-glicosilação (sequons), marcados em roxo na figura 4. Embora haja

evidências de glicosilação, não se sabe se ambos os sítios são ocupados (GARCÍA-

BORRÓN et al., 2005).

Ao contrário da maioria das proteínas de membrana, o amino-terminal do

MC1R não contém um peptídeo sinal clivável que o direcione para a membrana do

retículo endoplasmático. Assim, um outro tipo de sinal de direcionamento, não

clivável, deve estar presente, provavelmente no primeiro domínio transmembrana

(GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).

24

Figura 4. Estrutura do MC1R. As posições de mutações não sinônimas são mostradas

em vermelho (alelos fortemente associados a cabelos ruivos e ao melanoma: Asp84His, Arg142His,

Arg151Cys, Arg160Trp e Asp294His) e em laranja (alelos fracamente associados ou não associados

a cabelos ruivos e ao melanoma). Em verde, resíduos de cisteína que podem estar envolvidos em

pontes dissulfeto (adaptado de GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).

25

Os loops extracelulares do MC1R são pequenos, em especial o segundo,

característico dos membros da subfamília MCR e responsável por sua alta atividade

constitutiva. O terceiro loop apresenta resíduos de prolina e cisteína (em verde na

figura 4) altamente conservados entre os MCRs, sugerindo uma função muito

especializada. É provável que as cisteínas 267 e 275 formem uma ponte dissulfeto

intramolecular estruturalmente importante, ligando os domínios transmembrana 6 e

7. Mutantes nestas posições apresentam menor afinidade de ligação por seus

agonistas ou mesmo perda de função, o que indica a importância destes resíduos no

reconhecimento do ligante (GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).

Os loops intracelulares dos GPCRs geralmente contêm interfaces de ligação

para proteínas G heterotriméricas e sítios de fosforilação envolvidos na regulação da

sinalização, internalização e ciclização. No MC1R, o segundo loop intracelular é alvo

de seis mutações que ocorrem naturalmente em populações humanas (Arg142His,

Arg151Cys, Tyr152stop, Ile155Thr, Val156Leu, Arg160Trp), das quais algumas são

mutações de perda de função total ou parcial (Arg142His, Arg151Cys e Arg160Trp)

e já associadas à presença de cabelos ruivos e à maior predisposição ao melanoma,

o que reafirma a importância funcional deste domínio (FLANAGAN et al., 2000;

STURM et al., 2003).

Os fragmentos transmembrana do MC1R estão dispostos aproximadamente

de modo perpendicular ao plano da membrana plasmática, em sentido anti-horário,

formando uma “cavidade” para o ligante, abaixo da interface extracelular da

membrana plasmática. De acordo com modelos tridimensionais do complexo

receptor-agonista, uma região altamente carregada formada pelos resíduos Glu94

(localizado no segundo fragmento transmembrana), Asp117 e Asp121 (localizados

no terceiro fragmento transmembrana) interage com o resíduo de arginina da

sequência His-Phe-Arg-Trp, que é compartilhada pelas melanocortinas naturais

(GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).

Curiosamente, a segunda hélice transmembrana é alvo de 11 mutações

naturais (Phe76Tyr, Ala81Pro, Ser83Leu, Asp84Glu, Ser90Thr, Asn91Asp,

Val92Met, Leu93Arg, Thr95Met, Val97Ile e Leu99Ile; ver figura 4) (GARCÍA-

BORRÓN et al., 2005). Duas delas, Val92Met e Asp84Glu, geram alterações

funcionais relevantes. A primeira leva à uma diminuição da afinidade pelo agonista

26

cerca de 100 vezes, se comparada ao receptor selvagem (RINGHOLM et al., 2004)

e foi associada ao melanoma por Valverde e colaboradores em 1996. A segunda

leva à uma ligeira diminuição da afinidade, e à queda na produção de cAMP via

adenilato ciclase, que é o mecanismo de transdução de sinal do MC1R (RINGHOLM

et al., 2004).

No quarto fragmento transmembrana há um sítio de mutação comum em

populações do extremo oeste da Ásia, Arg163Gln, já associada ao desenvolvimento

de lentigem solar e sardas (MOTOKAWA et al., 2007).

Outras posições de mutação importantes nos segmentos transmembrana

encontram-se na primeira e na sétima hélices: Val60Leu e Asp294His,

respectivamente, ambas em vermelho na figura 4. Val60Leu é uma variante muito

comum em populações caucasianas, parcialmente penetrante para o cabelo ruivo

(FLANAGAN et al., 2000). Asp294His também é associada a cabelos ruivos e ao

melanoma, como já demonstraram Flanagan e cols. (2000) e Sturm e cols. (2003).

Segundo Ringholm e cols. (2004), esta variante apresenta habilidade de se ligar ao

α-MSH ligeiramente menor que o receptor selvagem, e reduzida capacidade de produção de cAMP.

A região carboxi-terminal também é funcionalmente importante, estando

envolvida nos seguintes processos: interação do complexo receptor-ligante com a

proteína G, sinalização para o tráfego intracelular e correta localização do receptor

na membrana plasmática, determinação do número de moléculas do receptor

disponíveis na superfície da membrana e controle da dessensibilização do receptor.

Tais funções são mediadas pela acilação (palmitoilação e miristoilação) de resíduos

de cisteína altamente conservados entre GPCRs (SÁNCHEZ-MÁS et al., 2005).

Assim como outros GPCRs, é provável que o MC1R sofra dimerização

constitutiva, e que isso seja um evento inicial em sua biossíntese, ocorrendo no

retículo endoplasmático. Alguns mutantes naturais podem formar homodímeros e

heterodímeros com a proteína selvagem (não mutada). Embora o MC1R não exiba

cooperatividade na ligação de agonistas, a formação de heterodímeros de mutantes

com selvagem tem consequências funcionais diversas, incluindo efeito dominante

negativo e a modulação de características farmacológicas tais como a afinidade pelo

27

agonista ou a eficácia da ligação do hormônio (GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).

Os principais agonistas do MC1R são peptídeos derivados da clivagem da

proopiomelanocortina (POMC): as melanocortinas α-MSH, β-MSH e γ-MSH, e o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), os quais compartilham o tetrapeptídeo His-

Phe-Arg-Trp (HFRW), essencial para a atividade melanotrópica (GETTING, 2006).

No processo de síntese de melanina, a α-MSH ou hormônio melanócito-estimulante

é o mais importante (SLOMINSKI et al., 2004).

O antagonista endógeno do MC1R é a proteína sinalizadora Agouti (ASIP, do

inglês Agouti Signal Protein). Esta proteína contém 132 aminoácidos, dos quais

aproximadamente 60 formam uma região básica e 40 formam um carboxi-terminal

rico em cisteína, que contém o sítio ativo essencial para sua atividade biológica

(WILSON et al., 1995). A ASIP atua como um antagonista competitivo, que bloqueia

a ativação do MC1R pelo α-MSH (ROUZAUD & HEARING, 2005), estimulando assim a síntese de feomelanina (GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).

Uma forma alternativa do MC1R, gerada por splicing alternativo, foi

primeiramente descrita por TAN e cols. em 1999 e depois caracterizada por

Rouzaud e cols., em 2006. Esta forma, com 350 aminoácidos, parece atuar como

um regulador negativo da melanogênese, com ações opostas às do MC1R clássico.

Dentre seus efeitos está a diminuição da expressão de tirosinase e do fator de

transcrição da microftalmia (MITF), o qual tem um papel importante na ação do

MC1R clássico, conforme veremos mais adiante (ROUZAUD et al., 2006). Cabe

esclarecer que neste estudo estaremos sempre nos referindo à forma clássica do

receptor, com 317 aminoácidos.

28

1.4.2 Mecanismo de ação e regulação do MC1R

Quando o α-MSH se liga ao MC1R, inicia-se uma cadeia de transdução de

sinal que começa com a ativação da adenilato ciclase, responsável pelo aumento

dos níveis intracelulares de cAMP. Tal aumento leva à ativação da proteína quinase

A (PKA) e à conseqüente fosforilação de fatores de transcrição responsivos ao

cAMP (CREB, do inglês cAMP responsive-element-binding protein). Os CREBs, uma

vez fosforilados, ativam a transcrição de vários genes, dentre eles o fator de

transcrição da microftalmia (MITF, do inglês microphthalmia transcription factor),

essencial para a expressão de enzimas da via da melanogênese e fatores de

diferenciação celular (ver figura abaixo) (LIN & FISHER, 2007).

Figura 5. Mecanismo de ação do MC1R. Após a ligação do agonista, a subunidade A da

proteína G trimérica dissocia-se das demais para ativar a adenilato ciclase (AC), que irá produzir o

segundo mensageiro dessa cascata de sinalização (CHIN, 2003).

29

O MITF é um elemento chave na regulação da pigmentação em mamíferos, e

essencial para o desenvolvimento e funcionabilidade de melanócitos, mastócitos,

osteoclastos e epitélio pigmentado da retina. Existem pelo menos seis isoformas de

MITF (nomeadas como MITF-A, MITF-B, MITF-C, MITF-D, MITF-H e MITF-M), as

quais são geradas por diferentes promotores e sítios alternativos de iniciação da

transcrição. A região promotora da isoforma MITF-M, específica de melanócitos,

contém sítios de ligação para CREB, SOX10 (sex determining region Y box 10),

PAX3 (paired-box 3) e LEF-1 (lymphoid enhancer-binding factor 1), os quais irão

estimular a transcrição do gene ao interagir com os fatores regulatórios

correspondentes e com a β-catenina (SLOMINSKI et al., 2004).

Um dos principais efeitos do MITF-M é a regulação positiva da tirosinase,

pelo aumento da transcrição dos genes TyrP1 e TyrP2. Esses genes contêm boxes

M (AGTCATGTGCT) e E (CATGTG) em sua sequência, ao qual o MITF-M se liga. A

acentuação da atividade da tirosinase aumenta a síntese de eumelanina. Por outro

lado, a perda de função do receptor MC1R desativa essa cascata de sinalização, o

que diminui a síntese de eumelanina e causa um aumento na síntese de

feomelanina (SLOMINSKI et al., 2004).

O próprio MC1R possui, em sua região promotora, uma sequência E-box, à

qual o MITF-M se liga, estimulando sua expressão. Outros agentes capazes de

aumentar a expressão do MC1R são a exposição à luz UV, as melanocortinas, a

endotelina 1 (END1) e as interleucinas 1α e 1β. A diminuição da expressão se dá na

presença de TNFα, TGFβ e H2O2 (GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).

A regulação do MC1R se dá também em nível pós-traducional, através da

dessensibilização homóloga, um mecanismo regulatório muito comum nos GPCRs.

Neste tipo de dessensibilização, há uma atenuação da sinalização após minutos de

exposição ao agonista, através da fosforilação do receptor por GRK2 e GRK6,

enzimas da família das GPCR quinases (GRK, do inglês GPCR kinase). O receptor,

fosforilado, torna-se incapaz de se acoplar à sua via de sinalização (SÁNCHEZ-MÁS

et al., 2005).

30

Na maioria dos GPCRs, a fosforilação é seguida da internalização do

complexo receptor-agonista em vesículas endocíticas. A internalização pode ainda

marcar o receptor para degradação nos lisossomos, ou ser seguida pela volta do

receptor à membrana plasmática (reciclagem). É provável que esse mecanismo

também ocorra no MC1R fosforilado, embora não se saiba o destino dos complexos

internalizados (GARCÍA-BORRÓN et al., 2005).

31

1.5 Melanoma

1.5.1 Histórico

A primeira descrição confiável de melanoma em humanos apareceu nos

escritos de Hipócrates (460-375 a.C.), seguida pela do médico grego Rufus de

Ephesus (60-120 a.C.). Ao longo dos séculos, muitos outros médicos relataram

lesões cutâneas pigmentadas com metástases distantes; entretanto, só no século

XIX a descrição e o tratamento do melanoma humano avançaram significativamente.

Num artigo não publicado apresentado à Faculdade de Medicina em Paris, em 1806,

Laennec discutiu “la melanose”, descrevendo sua cor como “melanótica”. A primeira

descrição da base genética do melanoma foi feita por Norris, em 1820. O termo

“melanoma” só apareceu em 1838, quando Carswell usa-o para descrever lesões

cutâneas pigmentadas malignas. Em 1858, Pemberton defendeu e executou uma

excisão de melanoma profunda e radical, que viria a se tornar, um século depois, a

técnica cirúrgica padrão no tratamento de melanoma (KUFE et al., 2003).

1.5.2 Características Clínicas

Os sinais clássicos do melanoma cutâneo são alterações na cor, diâmetro ou

superfície de uma lesão pigmentada prévia, além da presença de bordas irregulares.

Sangramento, formação de nódulos e prurido também podem ocorrer, embora em

lesões mais avançadas. Sintomas sutis, tais como uma ligeira assimetria no formato

da lesão e a presença de mais de uma nuance de cor são frequentes em

melanomas iniciais, embora possam ser imperceptíveis a olho nu. Cerca de 1% dos

melanomas não apresentam pigmentação, e por isso são denominados

“amelanóticos” (KUFE et al., 2003; RAGER et al., 2005).

1.5.3 Classificação Histopatológica

Os melanomas cutâneos podem ser classificados em cinco diferentes grupos,

segundo a AJCC (The American Joint Committee on Cancer): melanoma lentigo

maligna, melanoma de disseminação superficial, melanoma nodular, melanoma

lentiginoso acral e melanoma lentiginoso das mucosas. Estas formas de melanoma

32

representam entidades patológicas distintas, com caraterísticas clínicas e biológicas

diferentes, descritas nos itens a seguir.

a) Melanoma de disseminação superficial (MDS)

O Melanoma de Disseminação Superficial (MDS) é a forma mais comum de

melanoma cutâneo, respondendo aproximadamente por 70% de todos os

melanomas. Geralmente surge de uma lesão preexistente, não raro associada à

Síndrome do Nevo Displásico. Em sua fase inicial, apresenta-se plano e com bordas

irregulares. O festonamento das bordas é um aspecto característico, assim como a

presença de múltiplas tonalidades, variando entre tons castanhos, preto, vermelho e

branco (ver figura 6a). Áreas amelanóticas podem estar presentes, indicando

regressão. À medida que a lesão cresce, sua superfície pode tornar-se irregular

(KUFE et al., 2003).

b) Melanoma Nodular (MN)

O melanoma nodular é o segundo mais comum padrão de crescimento,

abrangendo de 10 a 15% de todos os melanomas cutâneos. Pode aparecer em

qualquer lugar da superfície corporal, mas geralmente é diagnosticado no tronco, em

indivíduos do sexo masculino. Clinicamente, é caracterizado por lesões escuras e de

cor uniforme. Histologicamente, é notável a completa ausência de anormalidades

melanóticas na epiderme adjacente. Pode apresentar-se amelanótico em alguns

casos (ver figura 6b). É biologicamente mais agressivo que o melanoma de

disseminação superficial. Não apresenta a fase radial de crescimento, sendo

associado à rápida evolução para a fase vertical de crescimento e invasão da

derme. Por isso, os melanomas nodulares tendem a ser mais espessos e,

consequentemente, mais perigosos (KUFE et al., 2003).

c) Melanoma Lentigo Maligna (MLM)

O melanoma lentigo maligna surge da lesão melanocítica de mesmo nome

(também conhecida como Sarda Melanótica de Hutchinson ou Melanose pré-

cancerosa de Dubreuilh). É encontrado mais frequentemente em regiões da pele

exposta ao sol, em indivíduos idosos (idade média de 70 anos). Clinicamente, as

lesões apresentam-se grandes (3-4 cm de diâmetro), planas, com bordas irregulares

33

e coloração variando entre tons castanhos (ver figura 6c). Áreas hipopigmentadas

podem estar presentes na lesão, indicando regressão. A lesão precursora, o lentigo

maligna, geralmente está presente há longos períodos (5 a 15 anos) antes do

desenvolvimento do melanoma invasivo (KUFE et al., 2003).

d) Melanoma Lentiginoso Acral (MLA)

O melanoma lentiginoso acral ocorre nas palmas das mãos, solas dos pés e

regiões subungueais. Representa aproximadamente de 3% a 5% de todos os

melanomas cutâneos, sendo mais frequente em indivíduos de pele escura. As

lesões geralmente apresentam-se acastanhadas, com bordas irregulares e pelo

menos 3 cm de diâmetro. Em estágios avançados, pode haver ulceração (ver figura

6d). É bastante agressivo, com rápida evolução para a fase de crescimento vertical

(KUFE et al., 2003).

e) Melanoma Lentiginoso das Mucosas (MLM)

Semelhante ao melanoma lentiginoso acral, o melanoma lentiginoso das

mucosas pode ocorrer em diversos sítios mucosos, tais como cavidade oral,

esôfago, ânus, vagina e conjuntiva (KUFE et al., 2003).

Figura 6. Aspecto macroscópico do melanoma. a: Melanoma de disseminação

superficial; b: Melanoma nodular; c: Melanoma lentigo maligna; d: Melanoma lentiginoso acral

(DUVIVIER &MCKEE, 1997).

a b c da b c d

34

1.5.4 Epidemiologia

O melanoma cutâneo representa cerca de 5% do total de tumores de pele

diagnosticados e 1% de todos os tumores malignos. Sua incidência tem aumentado

significativamente nos últimos 40 anos entre a população de pele clara de países

industrializados (BRESSAC-DE-PAILLERETS et al., 2002).

Segundo a Organização Mundial de Saúde, em 2002 foram diagnosticados

cerca de 160.000 novos casos de melanoma, sendo 79.000 em homens e 81.000

em mulheres. Neste mesmo ano, foram registrados cerca de 31.000 óbitos em

decorrência deste tumor (LEBOIT, 2006).

No Brasil, o melanoma é o menos comum dos tumores de pele, com cerca de

5920 novos casos esperados para o ano de 2008 (2950 em homens e 2970 em

mulheres). Apesar da baixa incidência (3 casos / 100.000 indivíduos), apresenta alta

letalidade se não for diagnosticado em seus estágios iniciais; por isso os

mecanismos de prevenção e diagnóstico precoce são de grande importância (INCA,

2007).

Em Goiânia, o melanoma cutâneo apresenta um padrão semelhante ao

mundial, com incidência crescente para ambos os sexos e mortalidade crescente

para o sexo masculino e tendendo à estabilidade para o sexo feminino (SORTINO-

RACHOU et al., 2006).

1.5.5 Etiologia e fatores de risco

O melanoma é uma doença multifatorial, onde fatores genéticos e ambientais

estão envolvidos. Embora sua etiologia não seja completamente compreendida,

diversos estudos têm identificado fatores presentes em populações com alto risco de

desenvolver melanoma.

Dentre os fatores ambientais, destaca-se a exposição à radiação UV

proveniente da luz solar, particularmente o espectro UVB, que é um reconhecido

carcinógeno cutâneo, implicado tanto no desenvolvimento de melanomas quanto de

carcinomas basocelulares (ALISON, 2004).

35

A exposição à radiação UV é capaz de produzir lesões nas bases

nitrogenadas e quebras no esqueleto de açúcar-fosfato do DNA. As lesões mais

importantes são os dímeros de timina e os fotoprodutos de pirimidina – (6,4) –

pirimidona. Tais lesões, se não reparadas, levam à transições C → T quando o DNA se replica. Além disso, a radiação UV pode induzir alterações na expressão gênica,

como parte da resposta ao stress (ALISON, 2004).

Diferentemente dos carcinomas escamoso e basal, o melanoma não tem

uma relação direta com a exposição cumulativa ao sol, já que os tumores podem

aparecer em áreas relativamente não expostas à luz solar, como palmas das mãos,

sola dos pés e mucosas, embora em taxas consideravelmente menores que nas

áreas expostas. Assim, a relação entre exposição solar e o risco de desenvolver

melanoma é complexa, incluindo também a exposição aguda, intensa, intermitente e

a ocorrência de queimaduras (KUFE et al., 2003).

Dentre os fatores de risco não ambientais estão o histórico familiar, a

presença de pele clara, nevos displásicos (CHAUDRU et al., 2004), cabelos ruivos

ou louros e o desenvolvimento de efélides (ou “sardas”) (HUSSEIN, 2005; RAGER

et al., 2005). Tais fatores estão associados a mutações nos genes CDKN2A (cyclin-

dependent kinase inhibitor 2A, também conhecido como p16), CDK4 (cyclin-

dependent kinase 4) e p14ARF (alternate reading frame), além do MC1R (HARLAND

et al., 2001; RANDERSON-MOOR et al., 2001; BASTIAENS et al., 2001; BISHOP &

BISHOP, 2005; PHO et al., 2006; NAYSMITH et al., 2004; MOTOKAWA et al.,

2007). CDKN2A, CDK4 e p14ARF estão envolvidos no controle do ciclo celular, e são

considerados genes de predisposição ao melanoma com alta penetrância. Mutações

neles, quando em células germinativas, estão associadas ao melanoma familial, e

são herdadas num padrão autossômico dominante, conferindo risco extremamente

alto. O MC1R, por sua vez, é considerado um gene de predisposição ao melanoma

com baixa penetrância. É altamente polimórfico na população em geral (mais de 60

variantes já foram descritas até o momento), e sua associação com o melanoma

ainda não está bem definida (PHO et al., 2006).

Segundo Palmer e cols. (2000), os alelos do MC1R Arg151Cys, Arg160Trp e

Asp294His dobram o risco de melanoma em relação ao alelo selvagem. Estes alelos

já haviam sido associados ao fenótipo de cabelos ruivos e pele clara por Box e cols.

36

em 1997 e depois por Flanagan e cols. em 2000. Em 2003, Sturm e cols.

demonstraram que dois destes alelos (Arg151Cys e Arg160Trp) continham apenas

melanossomos imaturos em seus dendritos, o que justifica o fenótipo de pele e

cabelos claros e o maior risco de câncer de pele, devido à menor fotoproteção.

Matichard e cols., em 2004, também relataram a associação de alguns alelos

(Arg151Cys, Val60Leu e Arg160Trp) com o melanoma na população francesa. Na

população espanhola, foram associadas ao melanoma as variantes Val60Leu,

Val92Met, Ile155Thr, Arg160Trp, Arg163Gln e Asp294His, num estudo que também

encontrou três novas variantes (Ser41Phe, Met128Thr e Asn281Ser) (FERNANDEZ

et al., 2007).

Na população italiana, a variante Arg151Cys é a mais fortemente associada

ao melanoma, segundo Fargnoli e cols. (2006).

Estudos em populações asiáticas descrevem variantes do MC1R com perda

de função (Phe147Δ, Thr157Ile e Pro159Thr) que não haviam sido encontradas nas

populações européias, nas quais a maioria absoluta dos estudos sobre os

polimorfismos do MC1R é conduzida (NAKAYAMA et al., 2006). Isso mostra a

variação do perfil alélico entre as populações, e que a associação de algum alelo

com o melanoma não deve ser extrapolada para outras populações, daí a

importância de estudos que incluam populações não européias para compreensão

do papel do MC1R, tanto na pigmentação quanto na predisposição ao melanoma.

As variantes do MC1R conhecidas até o momento são resultado da alteração

de apenas uma única base na seqüência de nucleotídeos do gene, também

chamado de polimorfismo de base única (SNP, do inglês single nucleotide

polymorphism). Os SNPs são o tipo mais comum de diversidade gênica, e serão

abordados a seguir.

37

1.6 Polimorfismos de base única (SNPs)

Teoricamente o SNP é definido como uma mutação em uma única base que

ocorra em pelo menos 1% da população. Na prática, um locus é um potencial SNP

se ao menos duas seqüências apresentarem o alelo minoritário (BROOKES, 1999).

De acordo com sua localização no genoma, os SNPs podem ser classificados

em: iSNPs, localizados em regiões intrônicas; cSNPs, localizados em regiões

codantes (éxons); rSNPs, localizados em regiões regulatórias e gSNPs, localizados

em regiões intergênicas. Os cSNPs podem ainda ser classificados de acordo com

sua função: sSNPs (SNPs sinônimos), quando a trinca de bases alterada continua

codificando o mesmo aminoácido, e nsSNPs (SNPs não sinônimos), quando a trinca

de bases resultante codifica outro aminoácido ou o término da cadeia. Os rSNPs,

embora não modifiquem nenhuma seqüência de aminoácidos do organismo,

também podem alterar o fenótipo, por meio de mudanças na expressão gênica

(MOONEY, 2005).

Os SNPs são muito freqüentes no genoma humano, ocorrendo ao menos um

a cada 100-1000 pares de bases. Eles respondem por mais de 90% das diferenças

entre indivíduos, e não estão distribuídos aleatoriamente no genoma. As maiores

frequências de SNPs são observadas em íntrons e regiões intergênicas, que

escapam da pressão seletiva à qual as regiões codificantes do genoma estão

sujeitas (COLLINS et al., 1998).

Os SNPs têm se tornado o marcador genético de escolha para estudos de

associação, porque ocorrem numa freqüência maior do que outros marcadores

como microssatélites, e são estáveis e bem distribuídos por todo o genoma. Os

SNPs são marcadores adequados tanto para comparar diferentes indivíduos como

para comparar sequências entre diferentes espécies (BROOKES, 1999).

Os SNPs podem ser identificados através de sequenciamento direto de DNA,

análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP, do inglês

restriction fragment lenght polymorphism), hibridização alelo-específica com sondas

marcadas radioativamente, análise de polimorfismo de conformação de fita simples

(SSCP, do inglês single strand conformation polymorphism), PCR alelo-específica

38

(AS-PCR, do inglês allele-specific PCR) e microarray-based genotyping technique

protease-mediated allele-specific extention (PrASE), dentre outras técnicas (DUFFY

et al., 2004; NAKAYAMA et al., 2006).

Para o estudo de SNPs em uma população sobre a qual não se dispõe de

dados sobre quais alelos estão presentes, ou em que frequência, o método mais

adequado é o sequenciamento direto. Apesar de ser o método mais caro, foi o

método de escolha da nossa equipe para avaliar o polimorfismo do MC1R, já que

não há estudos prévios sobre este gene na população brasileira. Este método será

brevemente descrito no tópico a seguir.

39

1.7 Seqüenciamento de DNA

Atualmente existem diversas técnicas para o seqüenciamento de DNA, que

podem ser classificadas de acordo com seu princípio básico: seqüenciamento por

hibridização (SBH, do inglês sequencing by hybridization), seqüenciamento por

nanoporos e seqüenciamento por síntese (SBS, do inglês sequencing by synthesis),

também conhecido como seqüenciamento DNA polimerase-dependente. Este último

grupo engloba três diferentes estratégias: sequenciamento de Sanger, adição de

único nucleotídeo (SNA, do inglês single nucleotide addition) e terminação cíclica

reversível (CRT, do inglês cyclic reversible termination) (METZKER, 2005).

De todas as técnicas disponíveis, o seqüenciamento de Sanger é a mais

popular, sendo também conhecido como “seqüenciamento didesoxi”. É baseada na

síntese de uma fita de DNA complementar usando 2'-desoxinucleotídeos (dNTPs) e

na terminação da síntese usando 2',3'-didesoxinucleotídeos (ddNTPs). A razão entre

dNTPs e ddNTPs determina a freqüência da terminação da cadeia, e portanto a

distribuição dos comprimentos das cadeias terminadas. Os fragmentos são então

separados por tamanho, por eletroforese em gel de alta resolução, e analisados,

revelando assim a seqüência do DNA (METZKER, 2005).

No seqüenciamento de Sanger automatizado, método empregado por nossa

equipe, os ddNTPs são marcados com corantes fluorescentes e os fragmentos

resultantes são injetados por eletrocinética nos capilares do seqüenciador de DNA,

onde ocorrerá a eletroforese. Quando esses fragmentos marcados passam pela

região de detecção do seqüenciador, os fluoróforos dos ddNTPs são excitados por

um laser, produzindo emissões de fluorescência em quatro cores diferentes, uma

para cada ddNTP. A determinação da cor emitida permite a identificação da base

nitrogenada, e a ordem dos fragmentos fluorescentes revela a seqüência do DNA

(METZKER, 2005).

40

2 JUSTIFICATIVA

Apesar dos constantes avanços na busca de alternativas terapêuticas para o

melanoma cutâneo, a letalidade ainda é muito alta quando o tumor é detectado

tardiamente, por isso é necessário o desenvolvimento de novas ferramentas de

diagnóstico e prevenção.

Por ser um tipo de câncer pouco freqüente no Brasil se comparado aos

cânceres de mama (51 casos / 100.000 mulheres) e pulmão (19 casos / 100.000

homens e 10 casos / 100.000 mulheres) (INCA, 2007), por exemplo, as medidas

preventivas contra o melanoma serão mais eficazes se dirigidas diretamente aos

grupos de maior risco. Assim, faz-se necessário a condução de estudos que possam

identificar tais grupos de alto risco e a partir daí, o estabelecimento de políticas

adequadas para o diagnóstico precoce e prevenção.

Além disso, nenhum estudo sobre a variabilidade da população brasileira no

locus do MC1R foi publicado até o presente momento, o que torna os resultados

deste trabalho bastante relevantes, mesmo que não seja verificada uma associação

das variantes com o melanoma cutâneo.

41

3 OBJETIVO GERAL

O objetivo do trabalho é estudar a associação entre variantes moleculares do

MC1R e a susceptibilidade ao melanoma cutâneo, através de um estudo caso-

controle, de modo a identificar os alelos que caracterizam um grupo de risco e

contribuir para o entendimento da etiologia do melanoma e da melanogênese como

um todo.

3.1 Objetivos Específicos

● Descrever a distribuição das freqüências alélicas do MC1R em uma

amostra de 71 indivíduos saudáveis, recrutados voluntariamente entre

doadores de sangue do Laboratório Hemolabor (Goiânia, Goiás);

● Descrever a distribuição das freqüências alélicas do MC1R em uma

amostra de 34 casos prevalentes de melanoma cutâneo, recrutados

voluntariamente entre os pacientes com melanoma cutâneo em

tratamento no Ambulatório de Pele e Tórax do Hospital Araújo Jorge

(Goiânia, Goiás);

● Verificar a associação das variantes de MC1R com os fototipos

cutâneos;

● Verificar a associação entre variantes do MC1R e a susceptibilidade

ao melanoma cutâneo;

● Verificar a associação entre variantes do MC1R e os subtipos

histopatológicos de melanoma.

42

4 METODOLOGIA

4.1 Participantes

Foram recrutados 34 pacientes com diagnóstico de melanoma cutâneo

confirmado por exame histopatológico, em tratamento no Ambulatório de Pele e

Tórax do Hospital Araújo Jorge (Goiânia, GO), no período de setembro de 2006 a

março de 2007, e 71 voluntários saudáveis, doadores de sangue do Laboratório

Hemolabor (Goiânia, GO), no período de agosto a outubro de 2007.

Os participantes foram incluídos no estudo mediante concordância expressa

em um “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” (ver Anexos 9.4 e 9.5). O

projeto foi previamente encaminhado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa

da Associação de Combate ao Câncer em Goiás (CEP/ACCG) (ver Anexo 9.1) e

pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) (ver Anexo 9.2), como

parte do projeto multicêntrico “Expressão Gênica Diferencial e Caracterização

Funcional de Alvos Moleculares Visando o Desenvolvimento de Terapia Anti-

Tumoral Direcionada e Diagnose do Câncer”, coordenado pela Profª Enilza

Espreáfico (Faculdade de Medicina, USP, Ribeirão Preto, SP).

4.2 Aferição de características de pigmentação e histórico de câncer

A aferição de características de pigmentação e histórico de câncer na família

se deu por meio de entrevista presencial. Inicialmente, a proposta era um

questionário de múltipla escolha auto-aplicável; entretanto, em razão da baixa

escolaridade / analfabetismo, dificuldades na compreensão das questões e idade

avançada de alguns participantes (principalmente no grupo melanoma), o método de

coleta dos dados foi alterado. As informações assim obtidas foram simultaneamente

transcritas para o questionário impresso (Ver anexo 9.3).

43

As categorias de cor de olhos (azul, verde/cinza, castanho/preto), cor de pele

(branca, morena clara, morena, morena escura, negra) e cor de cabelos (ruivo, louro

claro, louro, castanho, preto) foram arbitrariamente definidas por nossa equipe,

visando tão somente facilitar o processo de classificação dos participantes pelos

entrevistadores.

A tradicional classificação em “raças” ou “etnias”, com os termos caucasóide,

negróide e ameríndia não foi utilizada já que, na população brasileira, altamente

miscigenada, a correlação entre cor de pele e origem geográfica dos ancestrais (à

qual os termos se referem) não é confiável e sujeita à imperfeições (PIMENTA et

al., 2006).

A classificação de “cor ou raça” adotada oficialmente pelo IBGE, (branco,

preto, pardo, amarelo e indígena) também foi desprezada por ser pouco informativa,

já que as categorias empregadas carecem de definição precisa. Além disso, os

termos cor de pele e raça não são sinônimos, sendo o conceito de “raça” inexistente

do ponto de vista biológico, e amplamente polêmico do ponto de vista antropológico

(SALZANO, 2007).

Para a aferição de fototipo, utilizou-se a classificação de Fitzpatrick, com as

seguintes categorias: I. sempre se queima e nunca se bronzeia; II. quase sempre se

queima, raramente se bronzeia; III. quase sempre se bronzeia, raramente se

queima; IV. sempre se bronzeia, nunca se queima (FITZPATRICK, 1988).

4.3 Coleta de sangue

Um volume variável de sangue (1-3 mL) foi coletado por punção da veia

mediana do antebraço (preferencialmente), sendo o mesmo armazenado à 8-10°C

em tubos à vácuo contendo EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) até o

momento da extração de DNA, que se deu nas 24 horas seguintes.

44

4.4 Extração de DNA genômico

O DNA genômico foi isolado a partir de 1 mL de sangue periférico, com o kit

GFX Genomic Blood (GE Healthcaare Life Sciences), de acordo com o protocolo do

fabricante. Primeiramente, as hemácias foram lisadas com 3 mL de tampão de lise

(KHCO3 10 mM, NH4Cl 155 mM, EDTA 0,1 mM) e o pellet de leucócitos resultante foi

lavado seguidas vezes com o mesmo tampão, a fim de retirar resíduos de

hemoglobina. Então, os leucócitos foram lisados com a Solução de Extração

(fornecida pelo kit), que é composta de um agente tamponante, um agente

caotrópico e um detergente. O lisado foi transferido para uma coluna contendo uma

matriz de fibra de vidro, à qual o DNA genômico se liga. O DNA permanece ligado à

matriz enquanto os contaminantes foram removidos por lavagens com Tampão TE

(Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH 8,0) e etanol. O DNA purificado foi então eluido em

100uL de tampão TE a 70°C.

4.5 Quantificação

Uma alíquota de 2uL de cada amostra de DNA genômico obtido na etapa

anterior foi empregada para quantificação por fluorimetria. Foi usado o kit Quant-ITTM

dsDNA BR (Invitrogen). Após o preparo das amostras e das soluções-padrão

conforme as instruções do fabricante, as amostras foram gentilmente

homogeneizadas por inversão e depois agitadas no vórtex por 2 segundos.

Procedeu-se então à um spin de centrifugação à 2000 rpm, e à incubação por 3 min

em temperatura ambiente. A leitura das amostras foi feita no fluorímetro QubitTM

(Invitrogen), previamente calibrado com os padrões.

4.6 Reação em cadeia da polimerase

Para a amplificação de toda a região codificante do gene MC1R, utilizou-se a

técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain

reaction). As reações foram, após otimização, padronizadas nas seguintes

condições: 100-300 ng de DNA genômico; 1,3 unidades de enzima Taq Polymerase

45

(Biotools do Brasil); 1X Reaction buffer; 3 mM MgCl2; 0,4 mM de dNTPs; 0,43 mM de

oligonucleotídeo iniciador (primer) e água Milli-Q autoclavada (q.s.p 50uL). Para

cada grupo de reações preparadas no mesmo dia foi feito um controle negativo, nas

mesmas condições acima, sem DNA genômico, para assegurar que os reagentes

estavam livres de contaminação. Os primers utilizados foram os seguintes:

● MC1R - FW: 5’- ACT CCT TCC TGC TTC CTG GAC A -3’ (sense)

● MC1R - RV: 5’- ACA CTT AAA GCG CGT GCA CCG C -3’ (antisense)

As reações foram realizadas em termociclador TC-312 (Techne), seguindo o

programa abaixo:

● desnaturação inicial – 2 min à 95°C

● desnaturação – 1 min à 95°C

● anelamento – 2 min à 68°C 35 ciclos

● extensão – 3 min à 72°C

● extensão final – 10 min à 72°C

4.7 Eletroforese em agarose

O produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose, para fins

de verificação da reação e do controle negativo.

O gel de agarose a 1% foi preparado através da dissolução de 0,4 g de

agarose UltraPureTM (Invitrogen) em 40mL de tampão TBE 5X (Tris, Borato EDTA,

pH 8,4), acrescido de 4uL de brometo de etídio (EtBr) UltraPureTM (Invitrogen). À

uma alíquota de 3uL de cada reação, incluindo o controle negativo, foi acrescido 5uL

de tampão de amostra (Azul de Bromofenol e Glicerol). Após serem agitadas no

vórtex e centrifugadas, as amostras foram aplicadas no gel. Foi usado o marcador

de massa molecular Track-IT 100bp DNA Ladder (Invitrogen). A eletroforese foi

conduzida por 1h e 30 min, à 80V e 300 mA. Todos os géis foram visualizados em

transluminador com luz Ultravioleta (UV) e documentados por fotografia digital.

46

4.8 Purificação

As amostras eficientemente amplificadas foram purificadas com o kit

PureLink™ PCR Purification kit (Invitrogen) segundo as especificações do

fabricante, para a remoção de primers, enzimas e sais. A purificação é baseada na

ligação seletiva do DNA de fita dupla à uma membrana de sílica, na presença de

sais caotrópicos. Os contaminantes são removidos por lavagens etanólicas e

centrifugações. O fragmento de interesse foi eluído em 35 μL de água Milli-Q a 70°C

(pH 8,0).

4.9 Quantificação

Após a purificação, as amostras foram novamente quantificadas por

fluorimetria, seguindo os mesmos procedimentos da quantificação anterior, exceto

pelo kit usado, Quant-ITTM dsDNA HS (Invitrogen), específico para amostras de DNA

menos concentradas.

4.10 Seqüenciamento de DNA

As amostras com rendimento adequado (~20ng/μL) foram seqüenciada em

três laboratórios distintos: Plataforma de Seqüenciamento do Cenargen (EMBRAPA

Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF), Laboratório de Biologia Molecular

(Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO), e

Serviço de Seqüenciamento de DNA (SSDNA) (Instituto de Química, Universidade

de São Paulo, São Paulo, SP).

A região codificante do MC1R foi seqüenciada com os seguintes primers:

● SF1: 5' – AGC AAC GTC CTG GAG AC – 3' (sense)

● SR1: 5' – TGT GGT AGC GCA GTG CGT AGA A – 3' (antisense)

● SR2: 5' – CAG CAT GTG GAC GTA CAG – 3' (antisense)

Todas as amostras foram seqüenciadas com os três primers, para garantir

47

que as variações encontradas representassem de fato mutações no gene e não

artefatos da própria reação.

Para o seqüenciamento no SSDNA, as reações foram preparadas e

precipitadas em nosso laboratório, conforme procedimento descrito a seguir. Para o

seqüenciamento nos demais laboratórios, as amostras de DNA e primers foram

entregues nas concentrações solicitadas, e as reações foram feitas de acordo com o

protocolo local.

4.10.1 Preparo das reações de seqüenciamento

As reações de seqüenciamento foram preparadas utilizando-se o kit

comercial Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Cada reação continha 2uL

do reagente Big Dye, 3uL de Sequencing Buffer 5x, 3uL de primer a 3,2 pmoles/uL,

aproximadamente 100ng de DNA (usualmente, entre 2 e 7uL, dependendo do

rendimento obtido na PCR da etapa anterior) e água “milli-Q” (q.s.p 15uL). As

amostras foram submetidas à desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos, seguido de

30 ciclos com denaturação a 95°C por 45s, anelamento a 50°C por 30s e extensão a

60°C por 4 minutos.

4.10.2 Precipitação

Para a precipitação das reações de seqüenciamento, adicionou-se 25 uL de

“coquetel de precipitação” (25 volumes de etanol 100% gelado; 1 volume de NaOAc

3M pH5,2; 1 volume de glicogênio 1mg/mL) em cada tubo. Após rápida

homogeneização no vórtex, os tubos foram mantidos no gelo e ao abrigo da luz por

15 minutos. Procedeu-se então à centrifugação à 4000 rpm, por 30 minutos à

temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante de cada tubo com uma

inversão vigorosa, os mesmos foram invertidos e submetidos à 2 pulsos de

centrifugação à 1000 rpm. Adicionou-se então 50uL de etanol 70% gelado e

centrifugou-se novamente à 4000 rpm, por 20 minutos. Repetiu-se a drenagem dos

tubos (descarte do sobrenadante e centrifugação com o tubo invertido), e procedeu-

se à secagem das amostras, deixando os tubos abertos, por 1 minuto à 95°C, no

termociclador. Os tubos foram então fechados e guardados à -20°C, envoltos em

papel alumínio, até o momento de serem enviados ao SSDNA.

48

4.11 Detecção de polimorfismos de base única

As seqüências obtidas por este método foram visualizadas no software

Chromas e comparadas com a seqüência consenso do MC1R selvagem depositada

no GenBank (número de acesso: AF153431), possibilitando assim a identificação

das variantes presentes.

Todas as seqüências foram submetidas à análise em duas plataformas

diferentes: SNPpipeline e CLC DNA Workbench.

O SNPpipeline é uma web-plataforma gratuita, mantida pelo Laboratório de

Genética de Populações do Center for Cancer Research (NCI, NIH, USA). É

composta por 3 softwares integrados: PHRED, PHRAP e DEMIGLACE, os quais

fazem o reconhecimento das bases seqüenciadas (base calling) a partir dos

eletroferogramas e estabelecem valores de qualidade para cada base (PHRED),

alinham as seqüências (PHRAP), e identificam os possíveis sítios de SNP

(DEMIGLACE). À cada possível SNP é associado um score numérico, que reflete a

probabilidade de uma posição da seqüência, em um dado alinhamento, apresentar

heterogeneidade em sua composição de nucleotídeos. Regiões cujas diferenças na

seqüência de nucleotídeos sejam devido à baixa qualidade das bases são

automaticamente excluídas, restando apenas os SNPs “legítimos” (BUETOW et al.,

1999).

A CLC DNA Workbench realiza apenas o alinhamento das seqüências,

necessitando que a procura e detecção dos possíveis SNPs seja feita manualmente.

Esta plataforma foi usada para conferência das mutações encontradas com o

SNPpipeline.

49

4.12 Análise estatística

A tabulação dos dados das características de pigmentação e o cálculo de

desvio padrão (DP) foram feitos em planilhas do software OpenOffice Calc

(http://www.openoffice.org).

A determinação de Odds Ratio (OR) e dos intervalos de confiança (IC) foi

feita no software GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA). Para a comparação

das freqüências nos grupos caso e controle foi utilizado o Teste Exato de Fisher

bicaudal. As diferenças foram consideradas significativas para p menor ou igual a

0,05.

50

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Características epidemiológicas dos grupos melanoma e controle

O grupo melanoma foi composto de 34 indivíduos com diagnóstico de

melanoma cutâneo, e o grupo controle foi composto de 71 indivíduos saudáveis,

sem histórico de neoplasias malignas na família, conforme descrito anteriormente.

O grupo melanoma apresentou idade variando de 25 a 92 anos, com média

de 63,26 anos (DP=16,16), e o grupo controle apresentou idade variando de 18 a 57

anos, com média de 33,06 anos (DP=11,93). Pinheiro e colaboradores (2003)

descrevem resultados semelhantes num estudo com pacientes do Hospital

Universitário de Brasília, com 44% dos pacientes com melanoma estando na faixa

etária entre 61 e 80 anos, e outros 34% entre 41 e 60 anos. Um estudo

epidemiológico mais recente (SORTINO-RACHOU et al., 2006), em Goiânia,

apresenta idade mediana de diagnóstico de 54 anos.

A diferença de idade entre os grupos melanoma e controle se deve ao fato de

o melanoma ser uma doença complexa, que expressa um desequilíbrio associado

ao envelhecimento e à presença de mutações genéticas, em parte causadas pela

exposição à radiação UV ao longo da vida, afetando principalmente indivíduos

idosos. O grupo controle, como esperado, apresenta um perfil mais jovem, já que a

doação de sangue não é permitida a indivíduos com mais de 60 anos. Como as

alterações estudadas são mutações herdadas dos pais, presentes em todas as

células do indivíduo (somáticas e germinativas), em qualquer época da vida, a

diferença de idade entre os grup