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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE

PLANTAS MEDICINAIS DA CAATINGA UTILIZADAS COMO

ANTIINFLAMATÓRIAS

DANIELLE DA CUNHA AMARAL LIMA

RECIFE/2011


CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE

PLANTAS MEDICINAIS DA CAATINGA UTILIZADAS COMO

ANTIINFLAMATÓRIAS

DANIELLE DA CUNHA AMARAL LIMA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco

Profa. Dra. Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim (Orientadora)

Prof. Dr. Ulysses Paulino de Albuquerque (Co-orientador)

RECIFE/2011

Lima, Danielle da Cunha Amaral

Estudo comparativo da atividade antioxidante de plantas medicinais da caatinga utilizadas como antiinflamatórias / Danielle da Cunha Amaral Lima. – Recife: O Autor, 2011.

86 folhas: il., fig., gráf.; 30 cm.

Orientador: Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal

de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2011.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Método. 2. FIC. 3. FRAP. 4.DPPH. I. Amorim, Elba Lúcia Cavalcanti de. II.Título.

UFPE 615.32 CDD (20.ed.) CCS2011-159


Reitor

Amaro Henrique Pessoa

Vice- Reitor

Gilson Edmar Gonçalves e Silva

Diretor de Ciências da Saúde – CCS

José Thadeu Pinheiro

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde – CCS

Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros

Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Dalci José Brondani

Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Antônio Rodolfo de Faria

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêutica

Nereide Stela Santos Guimarães

Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Ana Cristina Lima Leite

Dedico este trabalho aos meus pais

Juarez e Silvia, minha irmã

Margarida e ao meu noivo Walter que

me apoiaram em todos os momentos,

sempre com muito carinho, e

compreenderam a minha ausência

nesse período.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pelas oportunidades e pela força nos momentos mais difíceis.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêutica da Universidade Federal de

Pernambuco e ao corpo Docente pelo acesso à educação e informação, importantes para meu

crescimento profissional e pessoal.

À Profa. Elba Lúcia, Coordenadora do Laboratório de Produtos Naturais (LAPRONAT),

pela orientação sempre com paciência, carinho e amizade.

Ao Prof. Ulysses Paulino, Coordenador do Laboratório de Etnobiologia Aplicada (LEA),

pela co-orientação na construção deste trabalho.

À comunidade do Carão pelo acolhimento da população e informações concedidas.

Aos pesquisadores e amigos do LAPRONAT sempre dispostos a ajudar: Ariane, Clarissa,

Daniela Cabral, Daniela Sena, Elvis, Jenifer, Joabe, Tadeu, Thiago e Valérium.

Ao meu noivo, Walter, pela paciência nos momentos de angústia, pelo seu carinho e apoio.

À minha avó Terezinha Amaral, presente na fase final do mestrado, sempre descontraindo e

alegrando o ambiente.

Aos meus pais, Juarez e Silvia, e à minha irmã, Margarida, pela dedicação, amor e incentivo

em todos os momentos.

Muito obrigada!

“Comece fazendo o que é necessário,

depois o que é possível e de repente

você estará fazendo o impossível”

(São Francisco de Assis)

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO 11

2. REVISÃO DA LITERATURA 14

2.1 Aspectos Gerais da Pesquisa com Plantas Medicinais 15

2.2 Radicais Livres e Estresse Oxidativo 17

2.3 Radicais Livres e Processo Inflamatório 19

2.4 Metodologias Para Avaliação da Atividade Antioxidante 20

3. OBJETIVOS 22

3.1 Objetivo Geral 23

3.2 Objetivos Específicos 23

4. ARTIGO I: Estudo comparativo de três métodos usados para avaliar a

atividade antioxidante em plantas medicinais 24

5. ARTIGO II: Avaliação de atividade antioxidante de plantas medicinais da

Caatinga utilizadas como antiinflamatórias 45

6. CONCLUSÃO 70

REFERÊNCIAS 72

ANEXOS 83

Anexo 1: Estruturas químicas 84

Anexo 2: Gráficos 85

LISTA DE ABREVIATURAS

CE50 – Concentração 50% Efetiva

DPPH – 1,1-difenil-2-picrilhidrazina

EAA – Equivalente de Ácido Ascórbico

EDTA – Ácido Etilenodiaminotetracético

EROS – Espécies Reativas de Oxigênio

FIC – Quelante do Íon Ferro II

FRAP – Poder Antioxidante Redutor Ferro III

TPTZ – Tripiridiltriazina

RESUMO

Plantas com atividade antioxidante podem estar envolvidas no tratamento e/ou prevenção de diversas enfermidades, em especial as que envolvem processos inflamatórios. Foram selecionadas vinte espécies de plantas utilizadas para tratar inflamação pela comunidade de Carão, localizada em Altinho-PE, e dezenove espécies de forma aleatória. A coleta foi realizada na referida região no mês de setembro de 2009, de no mínimo 3 indivíduos de cada espécies, submetidas a extração por maceração com metanol 80% durante 6 dias e evaporado o solvente sob pressão reduzida. Buscando avaliar a correlação entre métodos utilizados para determinar a atividade antioxidante foram aplicados três: atividade sequestrante de radical livre DPPH (DPPH), ensaio da atividade quelante do íon ferroso (FIC) e poder antioxidante redutor férrico (FRAP). Avaliou-se também o poder antioxidante de espécies utilizadas para tratamento de inflamações comparadas às espécies selecionadas de forma aleatória. Observou-se que não houve correlação entre os métodos FIC e DPPH (rs = -0,3008 e p = 0,1975) e entre FIC e FRAP (rs = 0,3042 e p = 0,1921). Entretanto, foi possível observar correlação significativa entre FRAP e DPPH (rs = -0,9563 e p = < 0,0001). Através da análise de variância de Kruskal-Wallis os dois grupos de espécies estudadas foram estatisticamente iguais através dos métodos DPPH e FRAP e que as espécies aleatórias foram estatisticamente mais efetivas quando avaliado o poder quelante do íon ferroso. Contudo, quando utilizada a classificação de Melo et al (2010), observa-se que 45% das espécies antiinflamatórias apresentaram boa atividade seqüestradora de radicais livres comparadas às 36,84% das aleatórias. Conclui-se que os métodos utilizados avaliam a atividade antioxidante por meio de mecanismos distintos, não sendo recomendável o emprego de um único método para determinação da atividade antioxidante. Sendo o método DPPH mais indicado para avaliar a atividade antioxidante de espécies utilizadas para tratar inflamação. Dados sugerem que as espécies anttinflamatórias não agem quelando o íon ferroso, não sendo este método mais indicado para avaliação da atividade antioxidante de espécies antiinflamatórias, visto a quelação de metais de transição tem um papel secundário no mecanismo de inibição dos radicais livres.

Palavras chave: Métodos, FIC, FRAP, DPPH

ABSTRACT

Plants with antioxidant activity may be involved in the treatment or prevention of various diseases, especially those involving inflammation. It was selected twenty species of plants of the Carão community, located in Altinho-PE, used to treat inflammation and nineteen species randomly. The collection was done in that region in September 2009, from, at least, three individuals of each species, subjected to extraction by maceration with 80% methanol for 6 days and the solvent evaporated under reduced pressure. Trying to evaluate the correlation between the methods used to determine the antioxidant activity were applied three: DPPH free radical scavenging activity (DPPH) assay the ferrous ion chelating activity (FIC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP). We also compared the antioxidant power of species used for treatment of inflammation to randomly selected species. It was observed that there was no correlation between FIC and DPPH methods (rs = -0,3008; p = 0,1975) and between FIC and FRAP (rs = 0,3042; p = 0,1921). However, we observed a significant correlation between FRAP and DPPH (rs = -0,9563; p = <0,0001). Through the analysis of variance Kruskal-Wallis the two groups of species were statistically indistinguishable by the methods DPPH and FRAP and that the random species were statistically more effective when used the ferrous ion chelating power. However, when used the classification of Melo et al (2010), notes that 45% of anti-inflammatory species showed good free radical scavenging activity compared to 36,84% of random. We conclude that the methods used to evaluate antioxidant activity through distinct mechanisms and is not recommended to use a single method for determination of antioxidant activity. Being the DPPH method the best to evaluate the antioxidant activity of species used to treat inflammation. Data suggest that the species do not act as anti-inflammatory chelating the ferrous ion, which is not the best method to evaluate the antioxidant activity of anti-inflammatory species, since the chelation of transition metals have a secondary role in the mechanism of inhibition of free radicals. Key words: Methods, FIC, FRAP, DPPH

LIMA, D. C. A. Estudo comparativo da atividade antioxidante de plantas medicinais da Caatinga utilizadas como antiinflamatórias

11

1. Introdução


12

1. INTRODUÇÃO

A natureza, de modo geral, é a responsável pela produção da maioria das substâncias

orgânicas conhecidas, e o reino vegetal, pela maior parcela de diversidade química

registrada na literatura científica (Montanari & Bolzani, 2001). A utilização de plantas

como fonte de medicamentos para o tratamento das enfermidades que acometem a

espécie humana, remota à idade antiga. Além disso, devido ao elevado custo de muitos

medicamentos, a população de muitos países pobres e em desenvolvimento, que não

tem acesso á medicina moderna, tem se utilizado dos produtos naturais para o

tratamento de suas enfermidades. De acordo com dados da Organização Mundial de

Saúde (OMS), cerca de 70 a 95% da população dos países em desenvolvimento

recorrem à medicina tradicional para cuidados primários de saúde (Robinson & Zhang,

2011).

Muitas estratégias podem ser consideradas para investigação das atividades

biológicas das plantas medicinais. Entre elas, a abordagem etnodirigida que consiste em

combinar informações adquiridas junto às comunidades locais, ou pessoas experientes,

que fazem uso da flora medicinal com estudos realizados em laboratórios especializados

(Elisabetsky, 1987).

Durante a atividade metabólica, normalmente ocorre produção de radicais livres

que quando reagem com DNA, RNA, proteínas e outras substâncias oxidáveis

promovem danos que podem contribuir para o envelhecimento e o desenvolvimento de

doenças inflamatórias e degenerativas, como câncer, aterosclerose, artrite reumatóide,

entre outras. (Melo et al., 2006). Para prevenir tais danos, existem endogenamente

mecanismos antioxidantes (Kviecinski, 2007). Entretanto, algumas vezes, os

mecanismos endógenos não são suficientes para prevenir a instalação de algumas


13

enfermidades, sendo necessária a intervenção, com o uso, por exemplo, de plantas com

atividade antioxidante, geralmente, ricas em compostos fenólicos (Ammar et al., 2009).

Uma vez que o processo inflamatório está intimamente relacionado com a

presença e geração de radicais livres, se torna necessária a avaliação de atividade

antioxidante de produtos naturais utilizados com fins antiinflamatórios. Entretanto, a

atividade antioxidante pode ocorrer através de diferentes mecanismos. Devido a este

fato, não existe uma metodologia padrão para avaliação de tal atividade, sendo

necessária a análise por diferentes métodos que envolvem fundamentos distintos

(Kviecinski, 2007). Além disso, torna-se interessante, também, avaliar atividade

antioxidante de espécies sem indicação antiinflamatória para evitar interpretações

equivocadas e generalizações.


14

2. Revisão da Literatura


15

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Aspectos Gerais da Pesquisa com Plantas Medicinais

A utilização de plantas no tratamento de diversas enfermidades é uma prática

que foi bastante usada no passado, principalmente em épocas de inexistência de

produtos farmacêuticos avançados. O uso de produtos naturais com propriedades

terapêuticas é tão antigo quanto a civilização humana e, por um longo tempo, produtos

minerais, de plantas e animais foram as principais fontes de drogas (Rates, 2001).

Durante um período, os produtos ditos de origem sintética passaram a assumir o

mercado dos medicamentos, entretanto, atualmente, os medicamentos de origem

naturais voltaram a ter seu espaço no mercado, o que pode ser observado com a nova lei

que regulamenta a comercialização de tais medicamentos, assim como a disponibilidade

dos mesmos no Sistema Único de Saúde (SUS) (Brasil, 2006).

No Brasil, estima-se que 25% dos US$ 8 bilhões do faturamento da indústria

farmacêutica, no ano de 1996, foram originados de medicamentos derivados de espécies

vegetais. Considera-se também que as vendas neste setor crescem 10% ao ano, com

estimativa de terem alcançado a cifra de US$ 550 milhões no ano de 2001. Estados

Unidos e Alemanha estão entre os maiores consumidores dos produtos naturais

brasileiros. Entre 1994 e 1998, importaram, respectivamente, 1.521 e 1.466 toneladas de

plantas que seguem para esses países sob o rótulo genérico de “material vegetal do

Brasil”, de acordo com o IBAMA (Brasil, 2006). Embora possua a maior diversidade

vegetal do mundo, com cerca de 60.000 espécies vegetais superiores catalogadas, no

Brasil, apenas 8% foram estudadas para pesquisas de compostos bioativos e 1.100

espécies foram avaliadas em suas propriedades medicinais (Brasil, 2006). Portanto, o

Brasil é detentor de um alto potencial econômico pouco utilizado. Mais especificamente


16

no nordeste, é possível observar a presença de várias comunidades étnicas, possuindo

cada uma delas características e cultura próprias. Devido a isto, etnobotânicos têm

trabalhado com esses grupos, assim como, com comunidades rurais que também fazem

uso de tais recursos naturais. Nesse contexto, é extremamente importante conhecer

como tal recurso é utilizado pela população local (Albuquerque et al., 2007).

Durante muito tempo, a região do nordeste brasileiro, por apresentar grande

parte de sua extensão formada por vegetação seca, Caatinga, foi pouco estudada.

Entretanto, atualmente a situação modificou, tornando-se um alvo de pesquisas com

intuito de avaliar os usos terapêuticos das plantas utilizadas por comunidades locais.

(Desmarchelier et al., 1999; Desmarclekier & Barros, 2003; Viana et al., 2003; Araújo

et al., 2008). Tais pesquisas têm desmistificado a idéia de improdutividade deste

domínio, revelando uma imensa variedade de plantas usadas com finalidade medicinal e

também mágico-religiosa (Albuquerque & Andrade, 2002; Silva & Andrade, 2005;

Almeida et al., 2006; Albuquerque & Oliveira, 2007; Agra et al., 2007; Albuquerque et

al., 2007; Alviano et al., 2008). Contudo, as mesmas ainda são escassas, se comparadas

à grande diversidade cultural e biológica desta região (Albuquerque et al., 2007).

Atualmente, desde a publicação de trabalhos a partir de 1990, vem sendo

constatado o valor de estudos etnodirigidos na investigação de compostos químicos de

plantas com potencial atividade farmacológica, baseado no conhecimento acumulado de

uma determinada cultura para cura de suas doenças (Albuquerque & Hanazaki, 2006). A

partir de então, a principal estratégia das grandes companhias farmacêuticas é incentivar

pesquisas com o intuito de descobrir novas drogas a partir de produtos naturais

utilizados em comunidades tradicionais, estratégia que no Brasil, ainda é relativamente

recente (Reis et al., 2004; Seidl, 2001). Tais estudos têm crescido na área relativa à


17

descoberta de plantas com atividade antioxidante, uma vez que tal processo está

intimamente relacionado com diversas enfermidades (Kviecinski, 2007).

2.2 Radicais Livres e Estresse Oxidativo

O oxigênio molecular é essencial à vida dos organismos aeróbios, sendo que sua

função predominante nos eucariontes é de servir como último aceptor de elétrons na

respiração mitocondrial, quando é finalmente reduzido à água durante o complexo

processo de fosforilação oxidativa. A redução completa do oxigênio à água requer

quatro elétrons, e esta redução produz sequencialmente três produtos de redução: o

ânion superóxido (O2·-), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (HO·), os

quais conjuntamente são denominados de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs).

Sendo o radical hidroxila um dos mais reativos e que, juntamente com o ânion

superóxido, são caracterizados como os radicais livres de oxigênio (Kviecinski, 2007).

Embora o H2O2 não seja um radical livre, o mesmo também é um produto reativo e, via

reação de Haber-Weiss (equação 1) ou reação de Fenton (equação 2), pode servir como

um importante precursor de HO· (Kviecinski, 2007).

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO· + HO- (1)

O2·- + H2O2 O2 + HO· + HO- (2)

As EROs podem reagir com biomoléculas tais como proteínas, lipídeos, ácidos

nucléicos e carboidratos, sendo capazes de provocar danos oxidativos nestas estruturas.

Portanto, os antioxidantes são definidos como qualquer substância que, presente em

baixas concentrações, atrasa ou inibe a oxidação do substrato oxidável (Al-mamary et

al., 2002; Moreira et al., 2002; Chanwitheesuk et al., 2005; Wu et al., 2005), além de


18

prevenirem ou repararem danos ocasionados às células pelas espécies reativas de

oxigênio (Chanwitheesuk et al., 2005).

Por este motivo, nos sistemas vivos existe uma variedade de defesas

antioxidantes, enzimáticas e não enzimáticas, que controlam a formação excessiva das

Espécies Reativas. Dentre as defesas enzimáticas, encontram-se as enzimas superóxido

dismutase (SOD) e catalase (CAT), enquanto que compostos como glutationa reduzida

(GSH) e ascorbato (ASC), fazem parte do sistema de defesa não enzimático celular

(Kviecinski, 2007).

Contudo, quando há uma produção excessiva de EROs e/ou uma diminuição das

defesas antioxidantes, pode ocorrer comprometimento do balanço redox, e assim, o

organismo pode estar submetido a um processo denominado de estresse oxidativo com

consequente dano tecidual (Kviecinski, 2007). Estudos mostraram que as EROs podem

estar intimamente envolvidas na patogênese de processos inflamatórios e de

envelhecimento e muitos outros processos degenerativos como o câncer, aterosclerose,

doenças neurodegenerativas, cataratas, entre outros (Kviecinski, 2007).

Como já citado anteriormente, os organismos possuem um sistema antioxidante

de proteção contra as EROs. Produtos naturais com atividade antioxidante são também

importantes para atenuar o dano oxidativo, desta maneira complementando tais defesas

naturais. Portanto, há um interesse crescente pelos efeitos antioxidantes de produtos de

origem natural e do seu papel na saúde e na enfermidade. Neste contexto, as

propriedades antioxidantes dos compostos polifenólicos das plantas foram sugeridas

como efetoras de um papel importante na manutenção da saúde humana e na prevenção

de várias doenças (Kviecinski, 2007).

Recentes pesquisas revelam que vários taninos atuam como captadores de

radicais, os quais interceptam o oxigênio ativo formando radicais estáveis. Alem disso,


19

estudos sugerem que os taninos parecem ter duplo efeito, por um lado, são benéficos a

saúde devido a seu efeito quimiopreventivo contra carcinogênese ou atividades

antimicrobianas, por outro lado, estão envolvidos possivelmente na formação de

cânceres, hepatotoxicidade ou efeitos antinutricionais. Outras pesquisas sugerem que

alguns flavonóides são responsáveis por ação antitumoral considerável, podendo agir

como antivirais, anti-hemorrágicos, hormonais, antiinflamatórios, antimicrobianos e

antioxidantes (Mello & Santos, 2001).

2.3 Radicais Livres e Processo Inflamatório

A presença de radicais livres tem sido correlacionada com diversas

enfermidades, indicando que estas espécies não têm papel etiológico na maioria dos

estados patológicos, mas que participam diretamente dos mecanismos fisiopatológicos

que determinam a continuidade e as complicações presentes nestes processos

(Gutteridge, 1993). O aumento na produção de radicais livres pode ocorrer devido à

hiperóxia e à exposição à certos componentes químicos, à radiação ou à inflamação

tecidual local, resultando em estresse oxidativo, caracterizado por um desequilíbrio

entre oxidantes e antioxidantes, no qual ocorre predominância de radicais livres (El-

habit et al., 2000).

Os maiores produtores de Espécies Reativas de Oxigênio no tecido inflamatório

são os leucócitos, os quais tornam-se ativados e aderem-se à superfície das células

endoteliais. A NAPH oxidase de leucócitos polimorfonucleares, contém citocromo b245

que catalisa a redução monovalente de O2 para formar O2·-. Outras células inflamatórias,

como linfócitos e macrófagos, também possuem NADPH oxidase na membrana,

portanto a cascata do ácido araquidônico que gera prostaglandinas e leucotrienos,


20

também favorece a geração de EROs no processo de síntese de eicosanóides

(Kviecinski, 2007).

O íon ferro II geralmente não está presente em condições fisiológicas (in vivo) e

não se acreditava que esse íon pudesse ser disponibilizado em concentrações suficientes

para catalisar a formação de O2·- em condições normais. Entretanto, com medidas

químicas sensíveis, foi possível detectar concentrações importantes de ferro reduzido no

líquido sinovial de animais com processos inflamatórios induzidos o que poderia

catalisar a reação de Fenton e gerar grandes quantidade de EROs (Kviecinski, 2007).

Vários fármacos antiinflamatórios têm mostrado um mecanismo antioxidante

como parte de sua atividade biológica, tais como nimesulida, aminosalicilatos, entre

outros. Então, o estudo da atividade e do mecanismo antioxidante dos extratos naturais

utilizados na medicina tradicional com finalidade antiinflamatória se tornou igualmente

interessante (Kviecinski, 2007).

2.4 Metodologias para Avaliação da Atividade Antioxidante

Devido à enorme diversidade química existente, vários ensaios vêm sendo

desenvolvidos para avaliar a capacidade antioxidante de diferentes amostras (Melo et

al., 2006). Entretanto, apesar da diversidade de métodos para avaliar a atividade

antioxidante, ainda não existe um procedimento metodológico universal (Duarte-

Almeida et al., 2006; Pratt & Birac, 1979). Este fato impõe a necessidade de avaliar a

capacidade antioxidante por diferentes ensaios, com mecanismo de ação diferente. A

diferença de tais atividades antioxidantes pode ser observada quando comparado o

fundamento da metodologia do DPPH com o ensaio da atividade quelante do íon ferro

II (FIC) e FRAP.


21

O radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazina (DPPH) (Anexo 1) é um cromóforo

muito estável, com um pico de absorção no comprimento de onda de 517 nm, em meio

metanólico, apresentando solução de coloração violeta intensa (Blois, 1958; Arnao et

al., 2000). Ao passo que o DPPH sofre redução pelos componentes existentes na

solução teste, observa-se mudança da coloração da solução original de violeta intensa

para amarela, e o grau deste descoramento indica a habilidade do antioxidante em

seqüestrar o radical livre (Soler-Rivas et al., 2000; Blois, 1958).

Na atividade quelante do íon ferro II, a ferrozina (Anexo 1), um reagente

cromogênico, torna a solução rósea de acordo com a quantidade de ferro disponível em

solução. Assim, quanto maior a quelação de íon na amostra, menor o número de íons

disponíveis para a reação com a ferrozina e menor será a absorbância. Portanto, os

antioxidantes contribuem para a quelação de metais de transição, que em excesso

podem levar a peroxidação lipídica, com conseqüente lesão às membranas plasmáticas e

à oxidação do DNA. O ferro II em solução, mesmo em concentração muito baixa, induz

a geração de radicais hidroxilas, através da reação de Fenton, causando injúria ou morte

celular (Santos et al., 2007).

O método FRAP (poder antioxidante redutor do íon Fe3+) é baseado na habilidade

dos antioxidantes em reduzir o íon ferro III a ferro II na presença de tripiridiltriazina

(TPTZ) (Anexo 1) formando complexo azul ferro II - TPTZ com uma absorção máxima

a 593 nm. O aumento na absorbância é proporcional ao conteúdo antioxidante,

provocando uma mudança na coloração de verde para azul escuro. Neste método é

avaliada a capacidade da amostra em agir como redutor, antioxidante (Stratil et al.,

2006).


22

3. Objetivos


23

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar a atividade antioxidante, por diferentes métodos, de plantas da caatinga

utilizadas como antiinflamatórias na medicina popular.

3.2 Objetivos Específicos

3.2.1 Verificar a existência de correlação entre os métodos utilizados para análise

da atividade antioxidante: sequestrante de radical livre DPPH, quelante do íon

Fe2+ e poder redutor do íon Fe3+;

3.2.2 Verificar a correlação entre as atividades antioxidante e antiinflamatória de

plantas da caatinga.


24

4. Artigo I:

Estudo comparativo de três métodos

usados para avaliar a atividade

antioxidante em plantas medicinais


25

4. ARTIGO I:

Artigo I submetido a:

Revista: Revista Brasileira de Farmacognosia

Autores: Lima, D.C.A.; Sena, D.D.S.; Araújo, T. A. S.; Albuquerque, U. P.; Amorim,

E. L.

Título: Estudo comparativo de três métodos usados para avaliar a atividade



26

Estudo comparativo de três métodos usados para avaliar a atividade


Danielle C. A. Lima 1*, Daniela Dayne S. Sena 1, Thiago Antônio S. Araújo 2, Ulysses

Paulino de Albuquerque 2, Elba Lúcia C. Amorim 1

1 Laboratório de Produtos Naturais (LAPRONAT), Departamento de Ciências

Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Pernambuco,

Recife, Brasil.

2 Laboratório de Etnobotânica Aplicada (LEA), Área de Botânica, Departamento de

Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, Brasil.

* Avenida Arthur Sá, s/n, Recife, Pernambuco, Brasil.

RESUMO

Plantas com atividade antioxidante podem estar envolvidas no tratamento e/ou

prevenção de diversas enfermidades, em especial as que envolvem processos

inflamatórios. Como o estresse oxidativo envolve vários mecanismos de ação, os

métodos para avaliação da atividade antioxidante são bastante variados. Buscando

avaliar a correlação entre métodos, foram analisadas as atividades antioxidantes de

plantas reportadas como medicinais por meio de três métodos: atividade sequestrante de

radical livre DPPH (DPPH), ensaio da atividade quelante do íon ferro II (FIC) e poder

antioxidante redutor íon ferro III (FRAP).


27

Não houve correlação entre os métodos FIC e DPPH (rs = -0,3008 e p = 0,1975) e entre

FIC e FRAP (rs = 0,3042 e p = 0,1921). Entretanto, foi possível observar correlação

significativa entre FRAP e DPPH (rs = -0,9563 e p = < 0,0001). Conclui-se que os

métodos utilizados avaliam a atividade antioxidante por meio de mecanismos distintos,

não sendo recomendável o emprego de um único método para determinação da desta

antioxidante.

Palavras-chave: DPPH, FIC, FRAP, Plantas caatinga.

ABSTRACT

Plants with antioxidant activity may be involved in the treatment or prevention of

various diseases, especially those involving inflammation. As oxidative stress involves

multiple mechanisms of action, methods for evaluation of antioxidant activity are quite

varied. It was analyzed the antioxidant activity of plants reported as medicinal by three

methods: scavenging activity of DPPH free radical (DPPH) assay the activity of ferrous

ion chelating (FIC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP ). There was no

correlation between FIC and DPPH methods (rs = -0.3008 and p = 0.1975) and between

FIC and FRAP (rs = 0.3042 and p = 0.1921). However, it was observed a significant

correlation between FRAP and DPPH (rs = -0.9563, p = <0.0001). It concludes that the

methods used evaluate the antioxidant activity through distinct mechanisms and is not

recommended the use of a single method in these types of study.

Keywords: DPPH, FIC, FRAP, Caatinga plants


28

1. Introdução

Um dos principais produtores de agentes oxidantes é o processo de respiração

celular, o qual produz normalmente três produtos: o ânion superóxido (O2·-), o peróxido

de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (HO·), os quais conjuntamente são

denominados de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs), sendo o radical hidroxila um

dos mais reativos e que, juntamente com o ânion superóxido, são caracterizados como

os radicais livres de oxigênio (Kviecinski, 2007). Embora o H2O2 não seja um radical

livre, o mesmo também é um produto reativo e, via reação de Haber-Weiss (equação 1)

ou reação de Fenton (equação 2), pode servir como um importante precursor de HO·

(Kviecinski, 2007).

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO· + HO- (1)

O2·- + H2O2 O2 + HO· + HO- (2)

As EROs podem reagir com biomoléculas tais como proteínas, lipídeos, ácidos

nucléicos e carboidratos, sendo capazes de provocar danos oxidativos nestas estruturas.

Portanto, os antioxidantes podem ser definidos como qualquer substância que, presente

em baixas concentrações, quando comparada a um substrato oxidável, atrasa ou inibe a

oxidação desse substrato de maneira eficaz, ou seja, retardam ou previnem

significativamente a oxidação de moléculas ao inibirem a iniciação ou a propagação da

reação de oxidação em cadeia (Al-mamary et al., 2002; Moreira et al., 2002;

Chanwitheesuk et al., 2005; Wu et al., 2005), além de prevenirem ou repararem danos

ocasionados às células pelas espécies reativas de oxigênio (Chanwitheesuk et al., 2005).

Nos sistemas vivos existe uma variedade de defesas antioxidantes, enzimáticas

e não enzimáticas, que controlam a formação excessiva das Espécies Reativas (Alscher

et al., 2002). Contudo, quando há uma produção excessiva de EROs e/ou uma


29

diminuição das defesas antioxidantes, pode ocorrer comprometimento do balanço redox,

e assim, o organismo pode estar submetido a um processo denominado de estresse

oxidativo com conseqüente dano tecidual (Kviecinski, 2007). Estudos mostraram que as

EROs podem estar intimamente envolvidas na patogênese de processos inflamatórios,

como na artrite crônica, assim como podem desempenhar um importante papel de

sinalização celular em baixas concentrações, no processo de envelhecimento e muitos

outros processos degenerativos como o câncer, aterosclerose, doenças

neurodegenerativas, catarata, entre outros (Kviecinski, 2007).

Devido à enorme diversidade química existente, particularmente, entre os

compostos fenólicos, vários ensaios vêm sendo desenvolvidos para avaliar a capacidade

antioxidante de diferentes amostras vegetais (Melo et al., 2006), ainda não existe um

procedimento universal (Duarte-Almeida et al., 2006; Pratt & Birac, 1979), sendo

necessária a aplicação de métodos que se baseiam em diferentes mecanismos. Neste

contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar, por meio de três métodos distintos, a

atividade antioxidante de plantas medicinais da caatinga e verificar a correlação entre

esses métodos.

2. Materiais e métodos

2.1 Seleções das plantas, coleta e extração

A seleção foi baseada em levantamento Etnobotânico realizado pelo Laboratório

de Etnobotânica Aplicada na comunidade de Carão, município de Altinho/PE, nordeste

do Brasil (Araújo et al., 2008; Alencar et al., 2009; 2010). Selecionou-se de forma

aleatória vinte plantas, tanto nativas quanto exóticas, com uso popular para tratamento

de inflamação, devido à relação cientificamente conhecida entre atividade

antiinflamatória e antioxidante (Kviecinski, 2007; Gutteridge, 1993) (Tabela 1).


30

TABELA 1 - Plantas utilizadas popularmente como antiinflamatórias no município de

Altinho/PE, Nordeste do Brasil.

Nome científico Família Nome popular Parte usada

Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan Fabaceae Angico Casca

Boerhavia diffusa L. Nyctaginaceae Pega-pinto Raiz

Aspidosperma dispermum Müll.Arg. Apocynaceae Catingueira Casca

Caesalpinia ferrea Mart. ex Tul. Fabaceae Jucá Casca

Cedrela odorata L. Meliaceae Cedro Casca

Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B.

Gillett

Burseraceae Imburana Casca

Crateva tapia L. Capparaceae Trapiá Casca

Croton blanchetianus Baill. Euphorbiaceae Marmeleiro Casca

Erythrina velutina Willd . Fabaceae Mulungu Casca

Guapira laxa (Netto) Furlan. Nyctaginaceae Piranha Casca

Hyptis suaveolens Poit. Lamiaceae Alfazema Folha

Leonotis nepetifolia (L.) R.Br. Lamiaceae Cordão-de-frade Folha

Maranta divaricata Roscoe Marantaceae Cana-de-macaco Caule

Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir. Fabaceae Jurema-preta-lisa Casca

Momordica charantia L. Cucurbitaceae Melão-de-são-

caetano

Rama

Myracrodruon urundeuva Allemão Anacardiaceae Aroeira Casca

Rhamnidium molle Reissek Rhamnaceae Sassafráz Casca


31

Schinopsis brasiliensis Engl. Anacardiaceae Baraúna Casca

Senna occidentalis (L.) Link Fabaceae Manjiroba Casca

Tabebuia aurea (Silva Manso) Benth. &

Hook.f. ex S.Moore

Bignoniaceae Caibeira Casca

As partes das plantas selecionadas foram as que obtiveram maior porcentagem

de citação entre os moradores da região, para tratar doenças e sintomas relacionados a

processos inflamatórios.

As coletas foram realizadas em setembro de 2009 de, no mínimo, três

indivíduos, com base nas partes indicadas popularmente (Araújo et al., 2008), secas a

temperatura ambiente, trituradas, submetidas à extração por maceração com metanol a

80% (v/v) durante seis dias ao abrigo da luz e então, evaporado o solvente sob pressão

reduzida para ser obtido o extrato seco.

2.2 Atividade sequestrante de radicais livres (DDPH)

Os métodos mais comumente utilizados para se determinar a atividade

antioxidante de modo prático, rápido e sensível são as que envolvem um radical

cromóforo, simulando as espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo o radical livre

DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina) um dos mais utilizados (Melo et al., 2006; Arnao

et al., 2000).

A atividade antioxidante foi analisada pela capacidade das substâncias presentes

nas amostras captarem o radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil). Para a

avaliação da atividade captadora do radical livre DPPH, alíquotas dos extratos das

amostras vegetais foram diluídas em metanol PA, obtendo-se as concentrações de 25.0,

50.0, 100.0, 150.0, 200.0 e 250.0 µg/mL. A 0,5 mL de cada amostra foi acrescentado 3


32

mL de solução metanólica do radical livre DPPH 40 µM/mL. Após 30 minutos de

incubação à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, foi realizada a leitura da

absorbância a 517 nm. O mesmo procedimento foi realizado para determinação da CE50

do padrão, ácido ascórbico, nas concentrações 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 40.0 e 50

µg/mL (Sousa et al., 2004).

Construiu-se uma curva de calibração do DPPH para calcular a porcentagem de

DPPH remanescente e a CE50, concentração da amostra ou padrão que causa 50% de

inibição da concentração inicial de DPPH (Sousa et al., 2004).

Para construção da curva de calibração do DPPH foram preparadas soluções

metanólicas com 9 pontos de concentrações entre 1 a 40 µg/mL. A absorbância foi

medida a 517 nm, em cubetas de vidro, tendo como branco metanol. A partir da equação

da curva de calibração e dos valores de absorbância após 30 min para cada concentração

testada, foram determinados os percentuais de DPPH remanescentes (% DPPHREM),

conforme a equação 3:

% DPPHREM = [DPPH] T=t /[DPPH] T=0 x100 (3)

Onde: [DPPH]T=t corresponde à concentração de DPPH no meio após a reação com o

extrato ou controle e [DPPH]T=0 é a concentração inicial de DPPH (40 µg/mL).

Para determinação da concentração eficiente, CE50, foi utilizado o programa

Excel for Windows 2003 e construída uma curva exponencial da concentração do

padrão ou das amostras versus porcentagem de DPPH remanescente.

2.3 Atividade quelante do íon ferro II (FIC)

A presença de metais de transição no sistema biológico pode catalisar reações de

Haber-Weiss e de Fenton, resultando na geração de radicais hidroxilas. Entretanto, os


33

antioxidantes podem quelar com esses metais de transição, resultando na supressão da

geração de HO-, e inibição do processo de peroxidação de moléculas biológicas. Íon

ferro II é aplicado como íon metálico de transição no ensaio de FIC (Chew et al., 2009).

A metodologia utilizada foi adaptada de Chew (2009) e Santos (2007).

Inicialmente, pesou-se, em triplicata, 250 mg da amostra e diluiu-se para um volume

final de 50 mL, com metanol 75% (v/v), formando uma solução de 5 mg/mL. A partir

desta solução, prepararam-se soluções nas seguintes concentrações, em duplicata: 0,25,

0,5, 1, 2, 3, 4 e 5 mg/mL. Adicionou-se 1 mL de sulfato ferroso (FeSO4) a 0,1 mM a

várias diluições dos extratos (1mL; 0,25-5.0 mg/mL), seguida de ferrozina (1 mL) a

0,25 mM. A mistura reacional foi deixada na bancada por 10 min antes da absorbância

ser mensurada a 562 nm. Para cada ponto foi realizado o branco com 1 mL de cada

concentração e 2 mL de metanol 75% (v/v).

O mesmo procedimento foi realizado para o EDTA (padrão) nas concentrações

de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 e 50 µg/mL. O controle, formado por 1 mL de cada reagente

(metanol 75% (v/v), sulfato ferroso e ferrozina), também foi realizado em triplicata.

Para cada concentração foi calculada a porcentagem da amostra capaz de quelar

o íon ferro II, conforme a equação 4:

% Atividade Quelante: Acontrole – (A - Ab) / Acontrole x 100 (4)

Onde Acontrole corresponde à média das absorbâncias do controle, A é a absorbância da

amostra em análise e Ab, a absorbância apenas da solução na referida concentração

(branco).

Com a concentração no eixo das abscissas e a porcentagem da atividade quelante

nas coordenadas, elaborou-se um gráfico, com auxílio do programa Microsoft Excel


34

2003, obtendo uma curva de característica logarítmica. A partir da equação gerada,

determinou-se a CE50.

2.3 Poder antioxidante redutor do íon ferro III (FRAP)

Este método avalia a capacidade da amostra em reduzir o íon Fe3+ a íon Fe2+

(Stratil et al., 2006).

O método foi adaptado de Stratil (2006) e Vazquez (2008). As amostras foram

pesadas em triplicata e diluídas em água destilada para uma concentração final de 0,5

mg/mL. No momento da análise, preparou-se a solução reagente FRAP, formado pela

adição de solução de TPTZ 10 mmol/L em HCl 40 mmol/L com FeCl3 · 6H2O 20

mmol/L e tampão acetato 300 mmol/L, para manter o pH em 3,6, na proporção 1:1:10.

Adicionou-se 3 mL do reagente FRAP, recém-preparado, a 0,1 mL da triplicata

de cada espécie, observando uma mudança de coloração imediata de verde para azul,

dependendo da atividade. Quanto mais escuro o azul maior será a absorbância e a

atividade antioxidante. Após 5 minutos a leitura foi realizada no espectrofotômetro no

comprimento de onda de 593 nm.

O padrão utilizado foi o ácido gálico na concentração 0,55 mM. O branco de

cada espécie foi realizado adicionando-se 0,1 mL de água destilada mais 3mL do

reagente FRAP.

A partir das leituras de absorbância do ácido ascórbico nas concentrações de 0,1

a 0,6 mM, construiu-se um gráfico concentração (mM) x absorbância, com auxílio do

Microsoft Excel 2003, originando uma equação da reta a qual foi utilizada para

determinar a concentração equivalente em ácido ascórbico de cada espécie e

consequentemente a atividade em equivalente de ácido ascórbico (EAA) em mmol/g.


35

2.4 Análise estatística

A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de D’ Agostino-Pearson e a

relação entre os três métodos foi avaliada pela análise de correlação de Spearman com

auxílio do programa BioStat 5.0.

3. Resultados

Observou-se uma relação concentração dependente entre os métodos que

avaliam o potencial sequestrante de radicais livres e a atividade quelante (Tabela 2). Os

padrões ácido ascórbico (DPPH) e EDTA (FIC) apresentaram, respectivamente, CE50 de

21,074 µg/mL ± 2,72 e 9,776 µg/mL ± 0,24. Já o padrão ácido gálico para o método

FRAP apresentou atividade equivalente em ácido ascórbico de 5,6, isto é: 1 g do ácido

gálico equivale a 5,6 mmol de ácido ascórbico. Algumas plantas, como Aspidosperma

dispermum, Myracrodruon urundeuva, Schnopsis brasiliensis apresentaram melhor

atividade seqüestradora do radical livre DPPH do que o padrão utilizado. Entretanto,

para os métodos FIC e FRAP, os padrões utilizados tiveram resultados mais expressivos

do que todos os extratos metanólicos testados, sendo, então, o EDTA melhor quelante e

o ácido gálico melhor redutor do íon Fe2+ quando comparados às espécies analisadas.


36

TABELA 2 – Atividade antioxidante de plantas da caatinga usadas popularmente como

antiinflamatórias

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

PLANTAS DPPH (CE50 em

µg/mL)

FIC (CE50 em

mg/mL)

FRAP (EAA

em mmol/g)

Anadenanthera colubrina (Vell.)

Brenan 23,72 ± 0,63 2,03 ± 0,14 1,14 ± 0,007

Boerhavia diffusa L. 418,20 ± 10,01 0,30 ± 0,030 0,15 ± 0,09

Aspidosperma dispermum Müll.Arg. 15,12 ± 2,30 3,42 ± 0,36 1,12 ± 0,006

Caesalpinia férrea Mart. Ex Tul. 34,81 ± 1,19 5,62 ± 0,68 1,08 ± 0,03

Cedrela odorata L. 36,54 ± 1,72 0,18 ± 0,03 0,82 ± 0,02

Commiphora leptophloeos (Mart.)

J.B. Gillett 25,48 ± 0,76 4,43 ± 0,77 1,10 ± 0,01

Crateva tapia L. 2168,72 ±

185,75 1,95 ± 0,13 0,12 ± 0,04

Croton blanchetianus Baill. 68,05 ± 1,80 5,01 ± 1,67 0,69 ± 0,004

Erythrina velutina Willd . 1166,91 ± 92,96 0,38 ± 0,03 0,17 ± 0,08

Guapira laxa (Netto) Furlan. 493,41 ± 51,18 1,45 ± 0,26 0,31 ± 0,09

Hyptis suaveolens Poit. 72,72 ± 4,45 2,77 ± 0,44 0,72 ± 0,05

Leonotis nepetifolia (L.) R.Br. 769,72 ± 104,98 0,54 ± 0,10 0,24 ± 0,04

Maranta divaricata Roscoe 3887,80 ±

754,49 2,16 ± 0,3 0,15 ± 0,01

Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir. 22,23 ± 0,56 2,56 ± 0,33 1,10 ± 0,01


37

Momordica charantia L. 4461,17 ±

516,59 0,68 ± 0,07 0,12 ± 0,08

Myracrodruon urundeuva Allemão 17,61 ± 0,56 0,96 ± 0,16 1,18 ± 0,0

Rhamnidium molle Reissek 31,46 ± 0,73 2,63 ± 0,25 0,98 ± 0,02

Schinopsis brasiliensis Engl. 17,15 ± 1,26 1,19 ± 0,16 1,18 ± 0,0

Senna occidentalis (L.) Link 1492,03 ±

257,04 0,93 ± 0,16 0,13 ± 0,08

Tabebuia aurea (Silva Manso)

Benth. & Hook.f. ex S.Moore 706,15 ± 74,84 22,47 ± 4,66 0,21 ± 0,05

Não foi observada correlação significativa entre os métodos DPPH e FIC (rs =

-0,3008 e p = 0,1975) e FIC e FRAP (rs = 0,3042 e p = 0,1921), diferentemente da

inversa e significativa correlação encontrada entre os métodos DPPH e FRAP (rs = -

0,9563 e p = < 0,0001), como previsto. A correlação inversa entre DPPH e FRAP

ocorre devido ao emprego de diferentes unidades: para valores de CE50 quanto menor

for o resultado melhor será a atividade da espécie, diferentemente do método FRAP, no

qual quanto maior for o resultado melhor será a atividade antioxidante. Espécies com

este perfil podem ser utilizadas com finalidade antiinflamatória, anticancerígena e no

auxílio do tratamento de doenças neurodegenerativas, por exemplo.

Cedrela odorata, Myracrodruon urundeuva, Schnopsis brasiliensis e Tabebuia

aurea não apresentaram variação da atividade antioxidante quando comparados os

resultados dos três métodos, mostrando atividade seqüestradora de radicais livres,

quelante e redutora equivalentes.


38

4. Discussão

O mecanismo de reação do método DPPH depende da conformação estrutural

do antioxidante. Observa-se na prática que alguns compostos reagem muito

rapidamente com o DPPH, reduzindo o número de moléculas destes proporcionalmente

ao número de grupos hidroxila (Ammar et al., 2009; Brand-Williams et al., 1995). O

DPPH é um composto que apresenta um radical livre de nitrogênio, o qual é eliminado

por agentes sequestrantes destes radicais livres. Portanto, este método avalia a

habilidade de compostos antioxidantes em seqüestrar radical ou doar hidrogênio (Chew

et al., 2008). O FRAP analisa a capacidade da amostra em doar elétron (Chan et al.,

2007a). Como essas duas atividades estão relacionadas com a presença de compostos

fenólicos (Chan et al., 2007b), os métodos DPPH e FRAP apresentaram correlação.

Entretanto, não foi observada correlação do DPPH e do FRAP com o método FIC, uma

vez que neste último os compostos responsáveis por esta atividade são os que contem

nitrogênio na sua estrutura (Chan et al., 2007b). Esse método avalia a capacidade de

agentes antioxidantes em quelar íon ferro II e consequentemente prevenirem ou

inibirem a reação de Fenton, a qual gera radicais hidroxilas livres. Portanto, o uso de

um único método é insuficiente para identificar atividade antioxidante (Wang et al.,

2009; Lima et al., 2010).

Espécies como Boerhavia diffusa, Erythrina velutina e Momordica charantia

demonstram a necessidade da realização de testes que avaliem através de mecanismos

distintos, visto que apresentaram baixa atividade antioxidante quando aplicados os

métodos DPPH e FRAP, divergindo da atividade quelante. A correlação encontrada

entre os métodos DPPH e FRAP corrobora com os estudos de Wijngaard (2009), o qual

também observou correlação significativa entre esses dois métodos com r = 0,95, e de

Stratil (2006).


39

Os testes mostraram simplicidade, rapidez e reprodutibilidade, sendo o FIC e

FRAP mais práticos quando comparados ao método DPPH. Entretanto, este último é o

mais comumente utilizado para avaliação da atividade antioxidante em produtos de

origem natural, uma vez que agentes quelantes são efetivos apenas como antioxidantes

secundários (Kim et al., 2010) e o método FRAP avalia de forma indireta, comparando-

a com a atividade do ácido ascórbico.

Os métodos de avaliação de atividade antioxidante estão sendo extensamente

caracterizados, comparados e revistos. Eles variam muito em princípio de detecção,

sensibilidade, pH da reação e fonte de oxidantes. Apesar destas especificidades, todos

estes métodos são específicos (Lolito & Frei, 2006).

Outros modelos de estudos, além do FIC, FRAP e DPPH, como peroxidação

lipídica e ensaios in vivo estão disponíveis para caracterizar os produtos naturais como

antioxidantes biológicos (Mensur et al., 2001). Porém, nem sempre é simples

determinar o método mais apropriado para avaliar a capacidade antioxidante da

amostra. O método DPPH, por exemplo, deve ser utilizado rotineiramente com extratos

hidro-orgânicos contendo compostos hidrofílicos e lipofílicos, enquanto que o FRAP é

indicado para compostos hidrofílicos (Rufino et al., 2010). Entretanto, ainda não existe

um consenso para o emprego do FIC. Portanto, tornam-se muito importante a utilização

dos três métodos para evitar conclusões equivocadas, corroborando com estudo anterior

que afirma a necessidade de aplicação de métodos que avaliam diversos parâmetros

(Rufino et al., 2010).


40

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45

5. Artigo II:

Avaliação de atividade antioxidante de

plantas medicinais da Caatinga

utilizadas como antiinflamatórias


46

5. ARTIGO II:

Artigo II a ser submetido a:

Revista: Revista Brasileira de Farmacognosia

Autores: Lima, D.C.A.; Sena, D.D.S.; Araújo, T. A. S.; Albuquerque, U. P.; Amorim,

E. L.

Título: Avaliação de atividade antioxidante de plantas medicinais da Caatinga



47

Avaliação de atividade antioxidante de plantas medicinais da Caatinga


Danielle C. A. Lima 1*, Daniela Dayne S. Sena 1, Thiago Antônio S. Araújo 2, Ulysses

Paulino de Albuquerque 2, Elba Lúcia C. Amorim 1

1 Laboratório de Produtos Naturais (LAPRONAT), Departamento de Ciências

Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Pernambuco,

Recife, Brasil.

2 Laboratório de Etnobotânica Aplicada (LEA), Área de Botânica, Departamento de

Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, Brasil.

* Avenida Arthur Sá, s/n, Recife, Pernambuco, Brasil.

RESUMO

Plantas que possuam propriedades antioxidantes podem ser úteis no tratamento e/ou

prevenção de diversas enfermidades, como nos processos inflamatórios. Este trabalho

baseou-se em estudo etnobotânico previamente realizado e teve como objetivo avaliar a

capacidade antioxidante de vinte espécies de plantas da caatinga utilizadas para tratar

inflamação e dezenove espécies selecionadas de forma aleatória. Foram aplicados três

métodos: atividades sequestrante de radical livre (DPPH), redutora do íon ferro III

(FRAP) e quelante do íon ferro II (FIC). Foram aplicados os testes de variância de

Kruskal-Wallis e ANOVA. Os métodos DPPH e FRAP foram estatisticamente iguais

para os dois grupos (aleatórias e antiinflamatórias). Entretanto, quando avaliadas através

da classificação de Melo et al. (2010) 45% das espécies antiinflamatórias apresentaram


48

boa atividade seqüestradora de radicais livres, enquanto que o grupo das plantas

aleatórias, apenas 31,57%. Devido à correlação existente entre os métodos DPPH e

FRAP com o conteúdo fenólico total, atribui-se a atividade antiinflamatória e

antioxidante destas espécies aos compostos fenólicos. Devido a relação encontrada entre

a atividade quelante e as espécies aleatória, conclui-se que o método FIC não é o mais

indicado para avaliar a atividade antioxidante de espécies com propriedade

antiinflamatórias.

Palavras-chave: DPPH, FIC, FRAP, Conteúdo Fenólico.

ABSTRACT

Plants that have antioxidant properties may be useful in the treatment or prevention of

various diseases such as inflammatory processes. This work was based on

ethnobotanical study previously made and it aim was to evaluate the antioxidant

capacity of twenty species of caatinga plants used to treat inflammation and nineteen

species selected at random. We applied three methods: free radical scavenging activities

(DPPH), ferric reducing antioxidant power (FRAP) and ferrous ion chelating (FIC). We

applied the Kruskal-Wallis and ANOVA variance test. DPPH and FRAP methods were

statistically identical for both groups (random and anti-inflammatory). However, when

evaluated by classifying Melo et al. (2010) 45% of species showed good anti-

inflammatory free radical scavenging activity, while the group of random plants, only

31,57%. Due to the correlation between DPPH and FRAP methods with the total

phenolic content, is attributed to the antiinflammatory and antioxidant activity of these

species to phenolic compounds. Because of the relationship found between the chelating


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activity and randomly species, we conclude that the FIC method it isn’t most suitable

for evaluating the antioxidant activity of species with anti-inflammatory property.

Keywords: DPPH, FIC, FRAP, Phenolic Content.

1. Introdução

A presença de radicais livres tem sido correlacionada com um grande número de

doenças, indicando que estas espécies não têm papel etiológico na grande maioria dos

estados patológicos, mas que participam diretamente dos mecanismos fisiopatológicos

que determinam a continuidade e as complicações presentes nestes processos

(Gutterigde, 1993). O aumento na produção de radicais livres pode ocorrer devido à

hiperóxia (aumento na quantidade de oxigênio em tecidos e órgãos) e à exposição das

células ou indivíduos a certos componentes químicos, à radiação ou a inflamação

tecidual local, resultando em estresse oxidativo, caracterizado por um desequilíbrio

entre oxidantes e antioxidantes (El-Habit, 2000).

As espécies reativas de oxigênio (EROs) podem reagir com proteínas, lipídeos,

ácidos nucléicos e carboidratos, podendo provocar danos oxidativos. Portanto, os

antioxidantes podem ser definidos como qualquer substância que, presente em baixas

concentrações, quando comparada a um substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação

desse substrato de maneira eficaz, ou seja, retardam ou previnem significativamente a

oxidação de moléculas ao inibirem a iniciação ou a propagação da reação de oxidação

em cadeia (Al-mamary et al., 2002; Moreira et al., 2002; Chanwitheesuk et al., 2005;

Wu et al., 2005), além de prevenirem ou repararem danos ocasionados às células pelas

espécies reativas de oxigênio (Chanwitheesuk et al., 2005).


50

Os maiores produtores de EROs no tecido inflamatório são os leucócitos

sanguíneos, os quais tornam-se ativados e aderem-se à superfície das células endoteliais.

A NAPH oxidase de leucócitos polimorfonucleares, contém citocromo b245 que

catalisa a redução monovalente de O2 para formar O2·-. Linfócitos e macrófagos,

também possuem NADPH oxidase na membrana, portanto a cascata do ácido

araquidônico que gera prostaglandinas e leucotrienos, também favorece a geração de

EROs no processo de síntese de eicosanóides (Kviecinski, 2007).

Vários fármacos antiinflamatórios têm mostrado um mecanismo antioxidante

como parte de sua atividade biológica, tais como nimesulida, aminosalicilatos, entre

outros (Kviecinski, 2007). Entretanto, o uso de antioxidantes sintéticos tem diminuído

devido à suspeita de sua atividade como estimulantes de carcinogênese (Lima et al.,

2010). Então, o estudo da atividade e do mecanismo antioxidante dos extratos naturais

utilizados na medicina tradicional com finalidade antiinflamatória se tornou igualmente

interessante. Neste contexto, as propriedades antioxidantes dos compostos polifenólicos

das plantas foram sugeridas como efetoras de um papel importante na manutenção da

saúde humana e na prevenção de várias doenças (Kviecinski, 2007). Tais substâncias

com núcleo fenólico, como flavonóides e taninos, apresentam destaque especial como

antioxidantes, por atuarem como eficientes captadores das espécies reativas de oxigênio,

além de reduzirem e quelarem íons Fe3+ que catalisam a peroxidação lipídica (Al-

mamary et al., 2002; Nahar & Sarker, 2005; Delazar et al., 2006).

Este estudo teve o objetivo de avaliar a possível correlação existente entre

atividade antioxidante e antiinflamatória de plantas da caatinga através da aplicação de

três métodos: atividade sequestrante de radicais livres, atividade quelante do íon ferro II

e poder antioxidante redutor do íon ferro III.


51

2. Materiais e métodos

2.1 Seleções das plantas, coleta e extração

A seleção foi baseada em levantamento Etnobotânico realizado pelo Laboratório

de Entobotânica Aplicada na comunidade de Carão, município de Altinho/PE, nordeste

do Brasil (Araújo et al., 2008; Alencar et al., 2009; 2010). Selecionou-se de forma

aleatória vinte plantas, tanto nativas quanto exóticas, com uso popular para tratamento

de inflamação (Tabela 1) e dezenove plantas sem esta indicação (Tabela 2), com auxílio

do Software BioEstat 5.0.

TABELA 1 - Plantas utilizadas popularmente como antiinflamatórias no município de


Nome científico Família Nome popular Parte usada

Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan Fabaceae Angico Casca

Boerhavia diffusa L. Nyctaginaceae Pega-pinto Raiz

Aspidosperma dispermum Müll.Arg. Apocynaceae Catingueira Casca

Caesalpinia ferrea Mart. ex Tul. Fabaceae Jucá Casca

Cedrela odorata L. Meliaceae Cedro Casca

Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B.

Gillett

Burseraceae Imburana Casca

Crateva tapia L. Capparaceae Trapiá Casca

Croton blanchetianus Baill. Euphorbiaceae Marmeleiro Casca

Erythrina velutina Willd . Fabaceae Mulungu Casca

Guapira laxa (Netto) Furlan. Nyctaginaceae Piranha Casca


52

Hyptis suaveolens Poit. Lamiaceae Alfazema Folha

Leonotis nepetifolia (L.) R.Br. Lamiaceae Cordão-de-frade Folha

Maranta divaricata Roscoe Marantaceae Cana-de-macaco Caule

Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir. Fabaceae Jurema-preta-lisa Casca

Momordica charantia L. Cucurbitaceae Melão-de-são-

caetano

Rama

Myracrodruon urundeuva Allemão Anacardiaceae Aroeira Casca

Rhamnidium molle Reissek Rhamnaceae Sassafráz Casca

Schinopsis brasiliensis Engl. Anacardiaceae Baraúna Casca

Senna occidentalis (L.) Link Fabaceae Manjiroba Casca

Tabebuia aurea (Silva Manso) Benth. &

Hook.f. ex S.Moore

Bignoniaceae Caibeira Casca

TABELA 2 - Plantas sem indicação de uso antiinflamatório no município de


Nome científico Família Nome popular Parte

usada

Alpinia speciosa (Blume) D.

Dietr. Zingiberaceae Colônia Folha

Bauhinia cheilantha (Bong.)

Steud. Fabaceae Mororó-branco Folha

Catharanthus roseus (L.) G. Don Apocynaceae Bom-dia Flor

Eucalyptus globulus Labill. Myrtaceae Eucalipto Folha


53

Eugenia uvalha Cambess. Myrtaceae Ubaia Casca

Gossypium hirsutum L. Malvaceae Algodão-crioulo Folha

Helianthus annuus L. Asteraceae Girassol Semente

Hymenaea courbaril L. Fabaceae Jatobá Casca

Lantana camara L. Verbenaceae Chumbinho Folha

Leucaena leucocephala (Lam.) de

Wit Fabaceae Espinheiro Flor

Mangifera indica L. Anacardiaceae Manga Flor

Myrciaria cauliflora (Mart.) O.

Berg Myrtaceae Jabuticaba Casca

Ocimum americanum L. Lamiaceae Manjerona Folha

Ocimum gratissimum L. Lamiaceae Louro Folha

Plectranthus amboinicus (Lour.)

Spreng. Lamiaceae Hortelã-grande Folha

Plectranthus barbatus Andrews Lamiaceae Hortelã-miúda Folha

Solanum aculeatissimum Jacq. Solanaceae Gogóia Planta toda

Tillandsia usneoides (L.) L. Bromeliaceae Salambaia-

comprida Planta toda

Ziziphus joazeiro Mart. Rhamnaceae Juazeiro Casca

Das espécies com indicação para tratamento de inflamação pela população local,

65% tiveram a atividade antiinflamatória comprovada através de estudos científicos e

20% em estudos com plantas do mesmo gênero. Apenas 15% das plantas não tinham

atividade comprovada através de estudos científicos.


54

As partes das plantas selecionadas foram as que obtiveram maior porcentagem

de citação entre os moradores da região, para tratar doenças e sintomas relacionados a

processos inflamatórios.

O material vegetal foi coletado nos arredores da comunidade do Carão, que é

caracterizado por ser uma área de Caatinga hipoxerófila, com clima Bsh (semi-árido

quente) (IBGE, 2000).

As coletas foram realizadas em setembro de 2009 e foram coletadas amostras de,

no mínimo, três indivíduos, com base nas partes indicadas popularmente (Araújo et al.,

2008), secas a temperatura ambiente, trituradas, submetidas à extração por maceração

com metanol a 80% (v/v) durante seis dias ao abrigo da luz e então, evaporado o

solvente sob pressão reduzida para ser obtido o extrato seco.

2.2 Atividade sequestrante de radicais livres (DDPH)

Os métodos mais comumente utilizados para se determinar a atividade

antioxidante de modo prático, rápido e sensível são as que envolvem um radical

cromóforo, simulando as espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo o radical livre

DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina) um dos mais utilizados (Melo et al., 2006; Arnao

et al., 2000).

A atividade antioxidante foi analisada pela capacidade das substâncias presentes

nas amostras captarem o radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil). Para a

avaliação da atividade captadora do radical livre DPPH, alíquotas dos extratos das

amostras vegetais foram diluídas em metanol PA, obtendo-se as concentrações de 25.0,

50.0, 100.0, 150.0, 200.0 e 250.0 µg/mL. A 0,5 mL de cada amostra foi acrescentado 3

mL de solução metanólica do radical livre DPPH 40 µM/mL. Após 30 minutos de

incubação à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, foi realizada a leitura da


55

absorbância a 517 nm. O mesmo procedimento foi realizado para determinação da CE50

do padrão, ácido ascórbico, nas concentrações 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 40.0 e 50

µg/mL (Sousa et al., 2004).

Construiu-se uma curva de calibração do DPPH para calcular a porcentagem de

DPPH remanescente e a CE50, concentração da amostra ou padrão que causa 50% de

inibição da concentração inicial de DPPH (Sousa et al., 2004).

Para construção da curva de calibração do DPPH foram preparadas soluções

metanólicas com 9 pontos de concentrações entre 1 a 40 µg/mL. A absorbância foi

medida a 517 nm, em cubetas de vidro, tendo como branco metanol. A partir da equação

da curva de calibração e dos valores de absorbância após 30 min para cada concentração

testada, foram determinados os percentuais de DPPH remanescentes (% DPPHREM),

conforme a equação 1:

% DPPHREM = [DPPH] T=t /[DPPH] T=0 x100 (1)

Onde: [DPPH]T=t corresponde à concentração de DPPH no meio após a reação com o

extrato ou controle e [DPPH]T=0 é a concentração inicial de DPPH (40 µg/mL).

Para determinação da concentração eficiente, CE50, foi utilizado o programa

Excel for Windows 2003 e construída uma curva exponencial da concentração do

padrão ou das amostras versus porcentagem de DPPH remanescente.

2.3 Atividade quelante do íon ferro II (FIC)

A presença de metais de transição no sistema biológico pode catalisar reações de

Haber-Weiss e de Fenton, resultando na geração de radicais hidroxilas. Entretanto, os

antioxidantes podem quelar com esses metais de transição, resultando na supressão da


56

geração de HO-, e inibição do processo de peroxidação de moléculas biológicas. Íon

ferro II é aplicado como íon metálico de transição no ensaio de FIC (Chew et al., 2009).

A metodologia utilizada foi adaptada de Chew (2009) e Santos (2007).

Inicialmente, pesou-se, em triplicata, 250 mg da amostra e diluiu-se para um volume

final de 50 mL, com metanol 75% (v/v), formando uma solução de 5 mg/mL. A partir

desta solução, prepararam-se soluções nas seguintes concentrações, em duplicata: 0,25,

0,5, 1, 2, 3, 4 e 5 mg/mL. Adicionou-se 1 mL de sulfato ferroso (FeSO4) a 0,1 mM a

várias diluições dos extratos (1mL; 0,25-5.0 mg/mL), seguida de ferrozina (1 mL) a

0,25 mM. A mistura reacional foi deixada na bancada por 10 min antes da absorbância

ser mensurada a 562 nm. Para cada ponto foi realizado o branco com 1 mL de cada

concentração e 2 mL de metanol 75% (v/v).

O mesmo procedimento foi realizado para o EDTA (padrão) nas concentrações

de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 e 50 µg/mL. O controle, formado por 1 mL de cada reagente

(metanol 75% (v/v), sulfato ferroso e ferrozina), também foi realizado em triplicata.

Para cada concentração foi calculada a porcentagem da amostra capaz de quelar

o íon ferro II, conforme a equação 2:

% Atividade Quelante: Acontrole – (A - Ab) / Acontrole x 100 (2)

Onde Acontrole corresponde à média das absorbâncias do controle, A é a absorbância da

amostra em análise e Ab, a absorbância apenas da solução na referida concentração

(branco).

Com a concentração no eixo das abscissas e a porcentagem da atividade quelante

nas coordenadas, elaborou-se um gráfico, com auxílio do programa Microsoft Excel

2003, obtendo uma curva de característica logarítmica. A partir da equação gerada,

determinou-se a CE50.


57

2.3 Poder antioxidante redutor do íon ferro III (FRAP)

Este método avalia a capacidade da amostra em reduzir o íon Fe3+ a íon Fe2+

(Stratil et al., 2006).

O método foi adaptado de Stratil (2006) e Vazquez (2008). As amostras foram

pesadas em triplicata e diluídas em água destilada para uma concentração final de 0,5

mg/mL. No momento da análise, preparou-se a solução reagente FRAP, formado pela

adição de solução de TPTZ 10 mmol/L em HCl 40 mmol/L com FeCl3 · 6H2O 20

mmol/L e tampão acetato 300 mmol/L, para manter o pH em 3,6, na proporção 1:1:10.

Adicionou-se 3 mL do reagente FRAP, recém-preparado, a 0,1 mL da triplicata

de cada espécie, observando uma mudança de coloração imediata de verde para azul,

dependendo da atividade. Quanto mais escuro o azul maior será a absorbância e a

atividade antioxidante. Após 5 minutos a leitura foi realizada no espectrofotômetro no

comprimento de onda de 593 nm.

O padrão utilizado foi o ácido gálico na concentração 0,55 mM. O branco de

cada espécie foi realizado adicionando-se 0,1 mL de água destilada mais 3mL do

reagente FRAP.

A partir das leituras de absorbância do ácido ascórbico nas concentrações de 0,1

a 0,6 mM, construiu-se um gráfico concentração (mM) x absorbância, com auxílio do

Microsoft Excel 2003, originando uma equação da reta a qual foi utilizada para

determinar a concentração equivalente em ácido ascórbico de cada espécie e

consequentemente a atividade em equivalente de ácido ascórbico (EAA) em mmol/g.

2.4 Análise estatística

A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de D’Agostino, com nível de

significância de 0,01, com auxílio do programa BioStat 5.0. A correlação entre atividade


58

antioxidante e antiinflamatória foi analisada pelo teste de variância de Kruskal-Wallis

ou ANOVA (um critério) e conforme classificação de atividade sequestrante de DPPH

(Melo et al., 2010) e quelante do íon ferro II (Chew et al., 2009).

3. Resultados

Observou-se uma relação concentração dependente entre os métodos que

avaliam o potencial sequestrante de radicais livres e a atividade quelante (Tabela 3). Os

padrões ácido ascórbico (DPPH) e EDTA (FIC) apresentaram, respectivamente, CE50 de

21,074 µg/mL ± 2,72 e 9,776 µg/mL ± 0,24. Já o padrão ácido gálico para o método

FRAP apresentou atividade equivalente em ácido ascórbico de 5,6, isto é: 1 g do ácido

gálico equivale a 5,6 mmol de ácido ascórbico.

Os resultados da atividade antioxidante através da aplicação dos três métodos

das espécies usadas popularmente como antiinflamatórias estão descritos em Lima et al.

(2011) e das espécies sem indicação de uso como antiinflamatórias na Tabela 3.

TABELA 3 – Atividade antioxidante de plantas da caatinga sem indicação de uso como

antiinflamatórias

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

ESPÉCIES DPPH (CE50 em

µg/mL)

FIC (CE50

em mg/mL)

FRAP (EAA

em mmol/g)

Alpinia speciosa (Blume) D.

Dietr. 101,38 ± 3,10 0,13 ± 0,02 0,31 ± 0,02

Bauhinia cheilantha (Bong.)

Steud. 30,52 ± 2,48 0,78 ± 0,07 0,63 ± 0,01

Catharanthus roseus (L.) G. Don 1425,08 ± 112,10 3,63 ± 0,29 0,15 ± 0,02


59

Eucalyptus globulus Labill. 39,21 ± 2,55 1,12 ± 0,07 0,80 ± 0,02

Eugenia uvalha Cambess. 45,18 ± 4,06 1,08 ± 0,16 0,98 ± 0,08

Gossypium hirsutum L. 64,91 ± 3,42 1,41 ± 0,17 0,20 ± 0,003

Helianthus annuus L. 331,48 ± 18,91 0,47 ± 0,18 0,18 ± 0,006

Hymenaea courbaril L. 39,88 ± 3,13 1,08 ± 0,42 0,88 ± 0,04

Lantana camara L. 73,25 ± 2,53 1,05 ± 0,09 0,38 ± 0,01

Leucaena leucocephala (Lam.)

de Wit 741,37 ± 89,50 0,56 ± 0,09 0,20 ± 0,02

Mangifera indica L. 18,13 ± 0,66 0,55 ± 0,06 1,14 ± 0,00

Myrciaria cauliflora (Mart.) O.

Berg 47,40 ± 0,66 0,23 ± 0,04 1,04 ± 0,02

Ocimum americanum L. 366,10 ± 69,39 2,67 ± 0,19 0,54 ± 0,09

Ocimum gratissimum L. 152,01 ± 8,67 1,03 ± 0,09 0,41 ± 0,0

Plectranthus amboinicus (Lour.)

Spreng. 242,56 ± 18,13 0,29 ± 0,07 0,50 ± 0,05

Plectranthus barbatus Andrews 99,74 ± 3,62 2,09 ± 0,38 0,66 ± 0,04

Solanum aculeatissimum Jacq. 1058,63 ± 93,81 0,42 ± 0,06 0,16 ± 0,02

Tillandsia usneoides (L.) L. 162,73 ± 25,14 1,01 ± 0,02 0,38 ± 0,07

Ziziphus joazeiro Mart. 1636,19 ± 171,01 1,06 ± 0,14 0,13 ± 0,008

Os valores da CE50 para atividade seqüestradora de radicais livres (DDPH) para

os dois grupos (aleatórias e antiinflamatórias) deram estatisticamente iguais (H =

0,1547; p = 0,6940), assim como o poder antioxidante redutor do íon ferro III (F =

1,0074; p = 0,3234). Diferentemente do método que avalia o poder quelante do íon

ferro II: as espécies selecionadas de modo aleatório foram estatisticamente melhores


60

correlacionadas com esta atividade (H = 3,9801; p = 0,0460; média da CE50 para o

grupo aleatório de 1,09 ± 0,88 e para as antiinflamatórias, 3,08 ± 4,83).

Os resultados para o extrato bruto através do método DPPH podem ser

classificados em: I – boa atividade (CE50 < 63 µg); II - moderada atividade (63 µg <

CE50 < 147 µg); III - baixa atividade (CE50 > 147 µg) (Melo et al., 2010). Apesar de não

haver diferença estatística entre os dois grupos para o método DPPH, observa-se que

45% das espécies antiinflamatórias apresentaram boa atividade seqüestradora de

radicais livres, enquanto que o grupo das espécies aleatórias, apenas 31,57% foram

classificadas como boa atividade.

A atividade quelante também foi avaliada comparando a porcentagem de

atividade quelante de todas as espécies entre os dois grupos na concentração de 4

mg/mL (Tabela 4). Os resultados foram classificados em: alta atividade (FIC ≥ 80 %),

média (40% < FIC < 80%) e baixa atividade (FIC ≤ 40%) (Chew et al., 2009). 35% das

espécies utilizadas para tratar inflamação na comunidade pesquisada apresentaram alta

atividade quelante, comparadas a 47,37% das espécies selecionadas de modo aleatório

(Gráfico 1). O padrão utilizado (EDTA) na concentração de 50 µg/mL obteve 99,08% ±

0,18 de atividade quelante do íon ferro II.

TABELA 4: Porcentagem de atividade quelante (FIC)

ESPÉCIES ANTIINFLAMATÓRIAS FIC (%)

Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan 67,35 ± 3,55

Boerhavia diffusa L. 93,14 ± 0,51

Aspidosperma dispermum Müll.Arg. 52,72 ± 2,23

Caesalpinia férrea Mart. ex Tul. 47,27 ± 2,84


61

Cedrela odorata L. 88,45 ± 5,52

Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett 49,94 ± 5,33

Crateva tapia L. 67,79 ± 3,64

Croton blanchetianus Baill. 48,32 ± 5,37

Erythrina velutina Willd. 93,04 ± 0,18

Guapira laxa (Netto) Furlan. 72,24 ± 4,42

Hyptis suaveolens Poit. 60,13 ± 2,05

Leonotis nepetifolia (L.) R.Br. 90,12 ± 1,98

Maranta divaricata Roscoe 78,35 ±

15,06

Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir. 68,83 ± 4,83

Momordica charantia L. 90,12 ± 1,98

Myracrodruon urundeuva Allemão 80,34 ± 3,63

Rhamnidium molle Reissek 66,54 ± 2,33

Schinopsis brasiliensis Engl. 71,24 ± 3,31

Senna occidentalis (L.) Link 85,76 ± 3,20

Tabebuia aurea (Silva Manso) Benth. & Hook.f. ex

S.Moore

23,88 ± 4,09

ESPÉCIES ALEATÓRIAS FIC (%)

Alpinia speciosa (Blume) D. Dietr. 94,19 ± 0,59

Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud. 82,19 ± 0,77

Catharanthus roseus (L.) G. Don 59,51 ± 2,34


62

Eucalyptus globulus Labill. 54,57 ± 6,25

Eugenia uvalha Cambess. 70,68 ± 0,95

Gossypium hirsutum L. 62,94 ± 0,65

Helianthus annuus L. 84,78 ± 8,74

Hymenaea courbaril L. 73,08 ± 1,77

Lantana camara L. 77,51 ± 0,94

Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit 86,24 ± 1,19

Mangifera indica L. 72,77 ± 0,74

Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg 75,40 ± 0,58

Ocimum americanum L. 61,94 ± 2,91

Ocimum gratissimum L. 83,96 ± 4,44

Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng. 87,23 ± 4,31

Plectranthus barbatus Andrews 65,96 ± 4,78

Solanum aculeatissimum Jacq. 92,83 ± 1,02

Tillandsia usneoides (L.) L. 82,78 ± 3,31

Ziziphus joazeiro Mart. 94,61 ± 0,26

Gráfico 1: Classificação da atividade quelante das espécies


63

Do total de 46 indicações das espécies aleatórias com alta atividade quelante

(FIC ≥ 80 %), 46% estavam relacionadas com afecções do sistema respiratório,

incluindo principalmente, congestão, gripe e tosse. As outras indicações (54%) foram

das mais variadas, sendo a indicação mais comum o tratamento de verminoses.

Por não existirem dados na literatura classificando os resultados do método

FRAP através dos valores EAA, não foi possível fazer a mesma comparação realizada

com os valores de DPPH e FIC. Entretanto, uma vez que os métodos DPPH e FRAP

possuem correlação significativa e inversa (Lima et al., 2011), torna-se desnecessário

este tipo de classificação através dos dois métodos.

4. Discussão

Devido a correlação entre os métodos DPPH e FRAP (Lima et al., 2011), deduz-

se que espécies com boa atividade sequestrante de radicais livres possuem ação redutora

do íon ferro III equivalente. O maior índice de espécies com indicação antiinflamatória

com boa atividade seqüestradora de radicais livres e boa atividade redutora do íon ferro

III indica que as espécies com esta indicação podem agir através da inibição da geração

de radicais livres e da redução de agentes oxidantes. De acordo com estudos

anteriormente publicados, estes métodos apresentam correlação positiva com o

conteúdo fenólico total das espécies (Chan et al., 2007; Chew et al., 2009; Wang et al.,

2009; Chew et al., 2008; Verma et al., 2009; Czinner et al., 2000), sugerindo serem

estes metabólitos secundários responsáveis pela ação antioxidante e antiinflamatória.

O método FIC foi aplicado com o objetivo de identificar a relação entre a

atividade quelante do íon ferro II e a provável ação antiinflamatória, de acordo com a

indicação popular das espécies com esta atividade. Observou-se que não houve


64

correlação positiva entre as espécies com indicação antiinflamatória e a atividade

quelante, pois as espécies aleatórias apresentaram melhor atividade quando comparadas

através da análise estatística de variância e a classificação de Chew et al., 2009. Como

os agentes quelantes não agem inibindo diretamente os radicais livres, os mesmos são

considerados antioxidantes secundários (Gülçin et al., 2005), não sendo portanto, o

melhor método para a pesquisa de espécies com propriedade antiinflamatória.

A ausência de correlação entre o método FIC com DPPH e FRAP (Lima et al.,

2011) pode significar que compostos fenólicos responsáveis pela atividade antioxidante,

seqüestrando radicais livres e reduzindo íons ferro III provavelmente, não estão

diretamente envolvidos na quelação de íons ferro II. Os compostos responsáveis por tal

atividade podem ser os que contêm nitrogênio na sua estrutura, os quais são geralmente

melhores quelantes do que os fenóis (Chan et al., 2007).

Observou-se que as espécies aleatórias tiveram bastantes indicações de uso

relacionado às afecções do sistema respiratório, principalmente tosse, gripe e congestão.

Devido à relação existente entre atividade antioxidante e antimicrobiana

(Bandyopadhyay et al., 2007), sugerimos estudos que avaliem a correlação entre

atividade quelante e antimicrobiana.

5. Referências





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69



240-248.



5921.


70

6. Conclusão


71

6. CONCLUSÃO

Uma vez que não se conhece, até o momento, um método que avalie a

capacidade antioxidante através de todos os mecanismos envolvidos, torna-se

extremamente necessária a aplicação de diferentes métodos, para evitar resultados

equivocados. Portanto, fica evidente a importância da associação, para avaliação da

atividade antioxidante, de no mínimo dois métodos: DPPH e FIC ou FRAP e FIC.

Como o resultado do método FRAP é expresso em equivalente de ácido ascórbico e o

DPPH em CE50, assim como o FIC, torna-se mais interessante a aplicação dos dois

últimos, para assim, facilitar a comparação dos dados.

Conclui-se que o método mais indicado para avaliar a atividade antioxidante de

espécies utilizadas com finalidade antiinflamatória é o DPPH e/ou FRAP e que os

compostos responsáveis por esta atividade são os fenóis. Sugerindo então, que estes

compostos não possuem atividade quelante.


72

Referências


73

REFERÊNCIAS

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5921.


83

Anexos


84

Anexo 1: Estruturas químicas

1,1-difenil-2-picrilhidrazina (DPPH)

Ferrozina

Tripiridiltriazina (TPTZ)


85

y = 0.02517x + 0.00359

R2 = 0.99950

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 10 20 30 40 50 60

[ ] (ug/mL)

A

y = 105.01284e-0.02783x

R2 = 0.99420

0102030405060708090

100

0 10 20 30 40 50 60

[ ] (ug/mL)

% D

PP

Hre

m

Anexo 2: Gráficos

Gráfico 2: Curva de calibração do DPPH (DPPH)

Gráfico 3: Atividade antioxidante do padrão ácido ascórbico frente o radical livre

DPPH (DPPH)

Gráfico 4: Atividade quelante do padrão EDTA (FIC)

y = 42.66884Ln(x) - 47.20839

R2 = 0.99573

0.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

0 5 10 15 20 25 30 35

[ ] (ug/mL)

% A

TIV

ID. Q

UE

LAN

TE


86

y = 3.83771x - 0.21353

R2 = 0.94971

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

C (mM)

A

Gráfico 4: Curva do ácido ascórbido (FRAP)

danielle da cunha amaral lima · danielle da cunha amaral lima ... daniela cabral, daniela sena,...

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