UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação Mestrado Profissional

Tecnologia em Química e Bioquímica

DANIELA RODRIGUES SILVA

Extratos vegetais na proteção de membranas

contra o dano fotoinduzido

Versão original da dissertação defendida

São Paulo

Data do Depósito na SPG: 20/07/2016

DANIELA RODRIGUES SILVA

Extratos vegetais na proteção de membranas

contra o dano fotoinduzido

Dissertação apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo

para obtenção do Título de Mestre em

Ciências, Área de Concentração

Tecnologia em Química e Bioquímica

Orientador (a): Prof. Dr. Maurício da Silva Baptista

São Paulo

2016

À minha mãe, Sueli...

Por confiar em mim; Me mostrar que é possível;

Me manter firme nos momentos difíceis;

Por todo amor, dedicação e incentivo. Te amo!

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por me amparar nos momentos difíceis, me

dar força interior para superar as dificuldades, mostrar o caminho nas horas

incertas e me suprir em todas as minhas necessidades.

Ao Prof. Dr. Maurício Baptista, pela orientação, oportunidade, auxílio, amizade

e, principalmente, pela paciência até aqui.

A todos dos Laboratórios em estive por esses anos de estudo onde conheci

pessoas admiráveis. Em especial às Prof. Ana Carmona, Iolanda Cuccovia e

Rosangela Itri, obrigada pela assistência em experimentos durante o caminho.

À minha querida amiga, Waleska Kerllen Martins Gardesani, por acreditar em

mim, por não permitir que eu me desviasse do caminho lembrando-me que

Deus tem um propósito que as vezes não entendemos, mas que um dia fará

sentido... Me mostrar o caminho da ciência, fazer parte da minha vida nos

momentos bons e ruins, por ser um exemplo de profissional e de mulher que

estará sempre guardada na minha memória e coração.

Aos colegas do Laboratório de Processos Fotoinduzidos: Alan, Ale, Alessandra,

Cleidi, Patty, Roberta, Vinny, Guilherme, Chris, Divinomar, Helena, Tay, Isabel,

André, Mari, Décio, Orlando, Michelle e Nayra por fazerem parte dessa minha

trajetória aprendi um pouco com cada um de vocês.

Em especial, Ana (“Anitta”), Alice, Raul, “estrelas do meu coração”, obrigada

por todo apoio, incentivo, risadas, descontração, choros e conflitos, aprender

com vocês fez toda a diferença, afinal, a amizade sempre faz!

Aos amigos da Walter Belian que fizeram parte dos momentos, em especial,

Raquel, Leandro, Tainá e Mila vocês não imaginam o quanto foram importantes

para que eu seguisse nas horas difíceis, jamais esquecerei de vocês.

À Raquel Boeira Rizzi, e Patty Munekata, que acompanhou por longos meses,

em nossas viagens diárias na Airton Senna, minhas histórias e o desenrolar até

aqui! Serei eternamente grata pelas risadas, paciência e puxões de orelha que

me deram.

À Mariana Ramos, minha querida amiga de longa data, o meu muito obrigada,

as vezes quase 20 anos de amizade, um ouvido e um chá da tarde repleto de

cumplicidade é tudo que precisamos para manter a sanidade mental.

Aos amigos do Aché, principalmente 2 turno, Bonny, Pri, Fê, Beth, Johnny,

Eglá, Diego, Dani, sem esquecer, claro, Mila e Karen por fazerem meus dias

mais loucos e divertidos.

E, finalmente, ao Nestor (Farma Service), por permitir que seus extratos

fossem utilizados nesse trabalho de pesquisa. Apesar de todo contratempo,

muito obrigada.

“Jamais permita que os impasses da vida o perturbem. Afinal, ninguém pode escapar dos problemas, nem mesmo santos ou

sábios...”

Buda Nitiren Daishoniu

"O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e

vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis."

José de Alencar

RESUMO (Silva, D.R) Extratos vegetais na proteção de membranas contra o dano fotoinduzido. 2016. Número de páginas do trabalho (79p). Dissertação

(Mestrado Profissional) - Programa de Pós-Graduação de Tecnologia em Química e Bioquímica. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

O mercado de produtos cosméticos, especialmente aqueles que têm na

sua composição constituintes naturais, está em franca expansão. Uma das

razões desta expansão é que os extratos vegetais têm eficácia na proteção

contra os efeitos da exposição solar, sendo que o mecanismo de ação envolve

principalmente o efeito antioxidante, diminuindo ou inibindo os danos gerados

pelos radicais livres e/ou por outros compostos oxidantes. Este efeito protetor

dos extratos vegetais tem motivado o interesse das indústrias do ramo,

especialmente no entendimento dos mecanismos de dano e proteção. Além do

efeito antioxidante, demonstrou-se recentemente que compostos vegetais

podem também exercer efeito protetor através da proteção de membranas. No

entanto, a relação entre a capacidade antioxidante desses compostos e a

eficiência de proteção de membranas ainda não foi estabelecida. Neste

trabalho, pretende-se quantificar a eficácia relativa dos extratos vegetais em

termos de proteção de membranas.

Palavras-chave: Membrana lipídica, extratos vegetais, dano fotoinduzido,

antioxidantes.

ABSTRACT

(Silva, D.R) Plant extracts in membrane protection against photoinduced damage. 2016. (79p). Dissertation (Professional Master) - Graduate Program of Technology in Chemistry and Biochemistry . Institute of Chemistry University of São Paulo, São Paulo.

The market of cosmetics, especially those who have in their

composition natural constituents, is booming. One reason for this increase is

that the plant extracts are effective in protecting against the effects of solar

exposure, and the mechanism of action involves mainly the antioxidant effect,

decreasing or inhibiting the damage caused by free radicals and / or other

oxidizing compounds. This protective effect of plant extracts has motivated the

interest of the sector industries, especially in the understanding of the

mechanisms of injury and protection. In addition to the antioxidant effect, it was

demonstrated recently that plant compounds may also exert a protective effect

by the protective membrane. However, the relationship between the antioxidant

capacity of these compounds and membranes protecting efficiency has not

been established. In this work, it is intended to quantify the relative efficacy of

the plant extracts in terms of membrane protection.

Keywords: membrane lipidic, plant extracts, photoinduced damage, antioxidants.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DMMB: Dimetil Azul de Metileno

TEAC: Trolox equivalent antioxidant capacity

AG: Ácido gálico

DPPH: Método anti radicalar (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)

PFT: Polifenol total

FS: Fotossensibilizador

Lista de figuras

Figura 1 – Espectro da radiação solar e perfil de penetração na pele humana;

(KIRCHOFF, 1995).

Figura 2: Esquema representativo das reações de fotossensibilização do tipo I e tipo II de

um fotossensibilizador (FS). [Ochsner, 1997; Viola e Dall'Acqua, 2006].

Figura 3. Distribuição eletrônica dos orbitais moleculares (*) do oxigênio do estado

singlete excitado (1g , destacado em vermelho) e fundamental triplete (3g).

Figura 4. Esquema simplificado de reações "eno" (1) e "dieno"(2) envolvendo o oxigênio

singlete (1g)O2. (Schaich, 1992)

Figura 5. Esquema simplificado das reações envolvidas na peroxidação lipídica e o

envolvimento da adição de oxigênio singlete(1g) O2 por reações "ene" (1) e "dieno" (2).

(Ayala e col, 2014)

Figura 6. Esquema simplificado do mecanismo de ação antioxidante da vitamina E (à

direita) na redução de lipídeos oxidados (à esquerda). (Niki, 2015)

Figura 7. Estrutura molecular do Trolox. (Sigma Aldrich, 2015), acessado em 2015.

Figura 8. Estrutura do Ácido Gálico(Sigma Aldrich, 2015), acessado em 2015

Figura 9. Estrutura genérica da quercetina encontrada no extrato de F. vulgare onde R= (-

H ou -OH) e R1= (galactose ou glicose). (Badgujar e col, 2014; Gowami e Chatterjee,

2014).

Figura 10. Estrutura molecular do polifenol apigenina. (Ranjbar et al, 2014; Singh et

al 2011; Munir et al, 2014).

Figura 11. Estrutura da catequina (Portella et al, 2013; Espinola et al, 1997).

Figura 12. Estrutura do ácido elágico. (Sigma Aldrich, 2015), acessado em 2015

Figura 13. Estrutura da punicalagina. (Sadheguipour et al, 2014)

Figura 14. Estrutura da trealose. (Sigma Aldrich, 2015), acessado em 2015.

Figura 15. Estrutura da ligação 1,3-b,D-galactopiranosídica presente na cadeia de

polissacarídeos da goma arábica (Al-Yahya et al, 2009; Hilmi et al, 2014).

Figura 16. Monômero de hialurano (Rocha de Souza et al, 2007)

Figura 17. Estrutura monomérica básica dos xilo-glicanos (onde G = glicose, X = xilose)

(DENIS U. DE LIMA, 2000)

Figura 18. Modelo de membrana segundo o modelo do Mosaico Fluído: Bicamada

fosfolipídica (A), Colesterol (B), Proteínas intrínsecas (C) e extrínsecas (D),

glicoproteínas (E), Glicolipídos (F) e Glicocálice (G). (Michel, M et al, 2006).

Figura 19. Estrutura molecular da fosfatidilcolina. (Julita, A et al, 2001).

Figura 20. Estrutura química do 1,9-Dimetil-Azul de Metileno (DMMB). (Sigma Aldrich,

2015)

Figura 21. Modelo proposto para avaliação de dano e proteção de membranas.

Figura 22. Espectro de emissão do LED- determinação da banda espectral para

irradiação do fotossensibilizador.

Figura 23. Espectro de absorbância do 1,9 Dimetil Azul de Metileno (DMMB)-

Determinação da banda espectral.

Figura 24: Separação do marcador fluorescente CF livre das vesículas contendo o

marcador encapsulado por coluna de gel filtração sephadex (G-50).

Figura 25 - Redução do Radical DPPH após reação com supressores de radicais livres

(Liang, N.; Kitts, D., 2014)

Figura 26 - Reação do ácido gálico com molibdênio, componente do reagente de Folin-

Ciocaulteau (Huang, D. et al)

Figura 27 – Esquema representativo do procedimento para determinação da

concentração de extratos vegetais após ligação em membranas (Adaptado de Junqueira,

H.C, 2008)

Figura 28- Banda de emissão do irradiador de LEDs vermelho (Página, 38)

Figura 29 - Intensidade de fluorescência da CF em função do tempo de lipossomos

incubados com tampão (esquerda) e na ausência e presença de Triton X (direita).

(lambda de excitação=480nm, lambda de emissão 517nm). (Página, 39)

Figura 30- Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação em

lipossomos de lecitina de soja. (lambda de excitação=480nm, lambda de emissão de

517nm). [DMMB]=15µM, pH=8.0 (Pagina, 41)

Figura 31- Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação, obtido para

vesículas encapsuladas com a sonda carboxifluoresceína com as variadas

concentrações de ácido gálico. (lambda de excitação=480nm, lambda de emissão de

517nm). [DMMB]=15µM, pH=8.0. (Pagina 43)

Figura 32- Porcentagem de proteção de membrana em função da concentração de ácido

gálico. ( Pagina, 44)

Figura 33- Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação em

membranas na presença de extratos vegetais (a) Erva doce; (b) Camomila (c) Guaraná (d)

Nogueira (e) Romã. (lambda de excitação=480nm, lambda de emissão de 517nm).

[DMMB]=15µM, pH=8.0. (Pagina 45)

Figura 33 A- Eficiência de proteção de membrana após irradiação de membranas na

presença compostos fenólicos (a) Erva doce; (b) Camomila (c) Guaraná (d) Nogueira (e)

Romã. (Pagina 45)

Figura 34- Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação, obtido para

vesículas encapsuladas com a sonda carboxifluoresceína com as variadas

concentrações de trealose, padrão sacarídeo utilizado no estudo. (lambda de

excitação=480nm, lambda de emissão de 517nm). [DMMB]=15µM, pH=8.0. (Página, 46)

Figura 34 A- Intensidade proteção após do tempo de irradiação, obtido para vesículas

encapsuladas com a sonda carboxifluoresceína com as variadas concentrações de

trealose, padrão sacarídeo utilizado no estudo. (Página, 47)

Figura 35 - Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação, obtido para

vesículas encapsuladas com a sonda carboxifluoresceína em variadas concentrações de

extratos vegetais sacarídeos (a) Aloe Vera; (b) Plantcol (c) Tamariliz (d) Alga Fucus

Figura 35 A- Eficiência de proteção de membrana após irradiação de membranas na

presença de extratos vegetais sacarídeos (a) Aloe Vera; (b) Plantcol (c) Tamariliz (d) Alga

Fucus.

Figura 36- Raio hidrodinâmico (nm) de lipossomos sem irradiação e após irradiação

(1hora e 2 horas) na ausência e na presença de extratos contendo compostos poli

fenólicos. (Pag, 50)

Figura 37- Raio hidrodinâmico (nm) de lipossomos sem irradiação e após irradiação

(1hora e 2 horas) na ausência e na presença de extratos contendo compostos

sacarídeos. (Pag,50).

Figura 38 - Porcentagem remanescente do radical DPPH• após submissão à soluções

antioxidantes (a) Trolox e (b) Extrato Camomila, determinação do EC50. Todas as análises

de teste foram realizadas em triplicata. (Pag, 52)

Figura 39 – Quantificação do equivalente de Trolox (1,12g) por quilo de extrato

(Camomila), em função do tempo de reação. (Pág, 53)

Figura 40 – Absorbância de soluções com contendo concentrações crescentes de ácido

gálico, submetidas ao reagente de Folin–Ciocalteu. Os resultados de quantificação de

polifenois totais são expressos como equivalentes de ácido gálico (EAG) por Kg de

extrato, através de curva de calibração, obtendo-se a concentrações equivalente de

padrão de ácido gálico que fornece a mesma absorbância do extrato. (pág, 54)

Figura 41. Proteção de membranas de extratos vegetais que tem capacidade antioxidante

e que se ligam bem em membranas (Romã e Camomila) e do extrato de Cereja que tem

valores desprezíveis de atividade antioxidante (GAE=0.1 e TEAC=0.5). (Pág, 59)

Figura 42. Aumento de fluorescência de CF na ausência de trealose (TMP+LIP+FS) e na

presença de concentrações crescentes de trealose. (pág, 60)

Figura 43. ESQUERDA: (A) membrana modelo com moléculas de trealose proximas e (B)

membranas com trealose ligada. Obtida de (Villarreal MA1, Díaz SB, Disalvo EA, Montich

GG. Molecular dynamics simulation study of the interaction of trehalose with lipid

membranes. Langmuir. 2004 Aug 31;20(18):7844-51). DIREITA. Estrutura molecular de

trealose.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO........................................................................................16

1.1 Reações de fotossensibilização, estresse redox e

antioxidantes................................................................................17

1.2 Fotoenvelhecimento da pele e estratégias antioxidantes.............23

1.3 Polifenóis......................................................................................25

1.4 Sacarídeos...................................................................................29

2. MEMBRANAS BIOLÓGICAS..................................................................32

2.1 Lipossomos........................................................................................34

2.2 Fotossensibilização do 1,9-dimetil-azul de metileno como modelo

para estudos de danos às membranas.............................................35

3. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA...........................................................36

4. OBJETIVO..............................................................................................36

5. MATERIAIS E

EQUIPAMENTOS...................................................................................37

6. METODOLOGIA.....................................................................................38

6.1 Fotossensibilizador............................................................................38

6.2 Lipossomos........................................................................................39

6.3 Preparação da solução de carboxifluoresceína................................40

6.4 Preparação da coluna de Sephadex-G50.........................................40

6.5 Preparação do tampão eluente (10mM Tris, 300mM NaCl, pH=8)...40

6.6 Separação de lipossomos encapsulados com carboxifluoresceína..40

6.7 Quantificação de vazamento do lipossomo.......................................41

6.8 Análises complementares................................................................43

6.9 Tratamento de dados........................................................................47

7. RESULTADOS ......................................................................................47

7.1. Caracterização do irradiador ..........................................................47

7.2. O modelo experimental: Estabilidade da suspensão de lipossomos

sem e com irradiação e o cálculo da percentagem de dano..................48

7.3 Eficiência de proteção de membranas.............................................51

7.3.1. Compostos fenólicos..............................................................52

7.3.2. Sacarídeos.............................................................................55

7.4 Estrutura dos lipossomos oxidados e protegidos.............................58

7.5 Ensaios complementares.................................................................60

7.5.1 Atividade antiadicalar..............................................................60

7.5.2 Polifenol total...........................................................................62

7.5.3 Ligação em membranas..........................................................65

8. DISCUSSÃO..........................................................................................67

9. CONCLUSÃO........................................................................................71

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS.....................................................72

1. INTRODUÇÃO

A indústria de cosméticos constitui um dos segmentos mais importantes

da economia mundial e é particularmente forte no Brasil. Atualmente, o Brasil

ocupa a terceira posição no ranking mundial do mercado cosmético, sendo o

primeiro na América Latina. A pesquisa nesse setor acompanhou com rigor o

desenvolvimento do mercado com novas tecnologias [1]. Bioativos naturais,

que atuam diretamente na pele, são cada vez mais frequentes em produtos

cosméticos [2]. Descobertas de mecanismos moleculares destes ativos

levaram ao desenvolvimento de novas tecnologias cosméticas, atuando não

somente na modificação da aparência da pele e do cabelo, mas também

influenciando positivamente na saúde destes tecidos.

No desenvolvimento de novos produtos de origem natural, destaca-se a

farmacognosia, ciência multidisciplinar que estuda compostos naturais com

ação terapêutica analisando suas propriedades físicas, químicas, bioquímicas e

biológicas [3]. Somente para dar um exemplo, segundo Newman e Cragg [4],

nos últimos 70 anos identificaram-se 175 moléculas com capacidade

antitumoral, das quais cerca de 50% correspondiam a produtos naturais ou

compostos derivados diretamente da fonte natural [4].

Um desafio frequente nesta área de pesquisa é identificar novas

plataformas de testes para estes ativos, sem utilizar, se possível, organismos

vivos. Nesse cenário, a pesquisa básica e translacional tem se empenhado na

obtenção de modelos miméticos para o estudo de tais compostos em todos os

níveis, desde membranas e lipossomas até o nível das células em cultura e das

tecnologias in-vitro de reconstrução de pele. Neste trabalho almejamos

principalmente desenvolver uma plataforma que possa quantificar a proteção

de membranas biológicas exercidas por diversos ativos usados na indústria

cosmética. Antes de abordar este objetivo, preparamos a revisão de diversos

temas relevantes neste assunto.

1.1 Reações de fotossensibilização, estresse redox e antioxidantes

A radiação solar, que apresenta um largo espectro frequências, é a

principal fonte de energia no nosso planeta. Essa radiação pode ser dividida

em duas regiões principais de acordo com a capacidade de ionização que

causa na matéria: radiação ionizante e radiação não ionizante. A radiação

ionizante é subdividida em raios-X e raios gama, enquanto a radiação não-

ionizante (Figura 1) subdivide-se em radiação ultravioleta (UV), luz visível e

radiação infravermelha. Felizmente a radiação ionizante, que pode ser

altamente prejudicial aos seres vivos, não penetra na atmosfera terrestre [5].

Figura 1 – Espectro da radiação solar e perfil de penetração na pele humana

O espectro de radiação não ionizante é comumente classificado de

acordo com a faixa de comprimento de onda (λ), em função da faixa espectral

que os seres humanos enxergam. A radiação UV é a parte do espectro

eletromagnético compreendida entre a radiação ionizante e a radiação visível

(100nm < λ < 400nm). Essa radiação é subdividida em UVC (100nm < λ <

280nm), UVB (280nm < λ < 320nm) e UVA (320nm < λ < 400nm) (Baptista,

2011).

A radiação UVC é muito energética e induz processos químicos

degradativos da matéria biológica. UVC é absorvida praticamente na sua

totalidade na estratosfera, sendo que a intensidade de UVC é desprezível no

nível do mar. Já as radiações UVB, UVA, visível e infra-vermelho chegam à

superfície terrestre e têm penetrabilidade considerável na pele, merecendo

atenção e cuidados quanto à exposição exagerada.

É importante mencionar que a interação com a radiação UV não é

somente maléfica para a pele. Esta é de fato fundamental para a manutenção

da homeostase dos seres humanos. A radiação UVB, por exemplo, é

importante para a ativação da vitamina D, necessária para uma eficiente

absorção de cálcio, magnésio, ferro, fosfato e zinco, dentre outros efeitos. Com

efeito, a ausência da radiação UV tem se mostrado um fator crítico para

aparecimento de desordens psicológicas como a depressão sazonal recorrente

na Europa [6].

Em contrapartida, biomoléculas como ácidos nucléicos e proteínas

absorvem diretamente radiação UVB, formando produtos característicos como

dímeros de pirimidina (CPD) e fotoprodutos 6-4 (6-4P), no caso de DNA. Estes

produtos são considerados lesões químicas no DNA e podem ser genotóxicos

[7]. O UVA, não obstante, também é capaz de excitar fotossensibilizadores

endógenos tais como as melaninas e as flavinas, gerando espécies reativas de

oxigênio, levando a quadros de stress oxidativo e de morte celular [8]. Assim, a

exposição excessiva às radiações UV resultam na formação de espécies

reativas em excesso às defesas anti-oxidantes, causando danos celulares e

promovendo o aparecimento de queimaduras e processos inflamatórios,

envelhecimento precoce da pele e o aparecimento de diversas patologias [9].

A interação da radiação com os cromóforos naturais, também

chamados fotossensibilizadores (FS), desencadeia uma série de processos

fotofísicos e fotoquímicos [10]. Dentre esses processos, a formação de estados

excitados de tempo de vida longos (espécies tripletes) facilita a formação de

espécies reativas que promovem stress oxidativo na célula (Figura 2) e estes

processos têm sido separado em mecanismos Tipo I e Tipo II.

No tipo I. o estado triplete transfere energia ou elétron a outras

moléculas do substrato celular formando radicais livres ou outros estados

excitados. Já na fotossensibilização do tipo II, a transferência de energia do

fotossensibilizador no estado triplete se dá ao oxigênio triplete (3O2), excitando

este ao estado singlete (1O2), que pode adicionar a dupla ligação, ao contrário

do oxigênio fundamental (triplete) [11]. As reações de fotossensibilização do

tipo I e tipo II ocorrem em paralelo de acordo com diversos fatores, incluindo,

por exemplo, a concentração de oxigênio do meio. De fato, foi observado que

com o aumento da concentração de oxigênio, há um aumento das reações do

tipo II, onde há a formação de oxigênio singlete e de várias outras espécies

reativas de oxigênio. No entanto, em condições fisiológicas as concentrações

de oxigênio podem ser pequenas, chegando a 7,5 M ou menos, e as reações

do tipo I podem ser preferenciais [12].

Figura 2: Esquema representativo das reações de fotossensibilização do tipo I e tipo II de

um fotossensibilizador (FS). Onde: 1) Absorção de luz 2) Conversão interna 3)

Fluorescência 4) Cruzamento intersistema 5) Fosforecência 6) Transferência de energia

7) Transferência de prótons e eletrôns.

As reações tipo I e II também levam à formação de diferentes espécies

reativas e, possivelmente, diferentes modos e intensidades em que os

processos oxidativos se desencadeiam em um ambiente biológico. O oxigênio

singlete, fruto da reação do tipo II nesse caso, é altamente reativo,

apresentando um curto tempo de vida em água e grande potencial oxidativo

(Figura 3).

Tripletes

Figura 3. Distribuição eletrônica dos orbitais moleculares (*) do oxigênio do estado

singlete excitado (1g , destacado em vermelho) e fundamental triplete (3g).

Essa reatividade aumentada em relação ao oxigênio no estado

fundamental triplete (3g) é explicada pela presença de um orbital * vazio

(Figura 3), possibilitando reações de adição a duplas ligações. Pode-se então

originar hidroperóxidos (reação 1 do tipo "ene") e peróxidos cíclicos (reação 2

do tipo "dieno") em uma única etapa de deslocamento eletrônico conforme

esquematizado nas reações da figura 4 [13].

Figura 4. Esquema simplificado de reações "eno" (1) e "dieno"(2) envolvendo o oxigênio

singlete (1g)O2.

Já o mecanismo de oxidação fotossensibilizada do Tipo I forma

preferencialmente espécies radicalares. As membranas são ricas em ligações

duplas e duplas conjugadas e, portanto, um alvo fácil tanto aos processos de

oxidação tipo I e tipo II. No caso de duplas simples após a adição de 1O2 um

passo adicional de reação é necessário, que é a abstração de hidrogênio ou

formação de radical para que haja a etapa de iniciação da peroxidação lipídica.

Após a etapa de iniciação, a reação de peroxidação lipídica segue de

forma encadeada produzindo peróxidos e cicloperóxidos até que haja uma

reação de terminação radicalar. Em ambiente biológico, reações de

peroxidação lipídica geram pequenos fragmentos de aldeído tais como o 4-

hidróxi-nonenal e o malonodialdeído e esses podem ser quantificados como

marcadores da extensão das reações de peroxidação (Figura 5) [15].

Figura 5. Esquema simplificado das reações envolvidas na peroxidação lipídica e o

envolvimento da adição de oxigênio singlete(1g) O2 por reações "ene" (1) e "dieno" (2).

1.2. Fotoenvelhecimento da pele e estratégias antioxidantes

O fotoenvelhecimento da pele é um processo fisiológico complexo, que

afeta praticamente todas as camadas da pele, sendo que o dano maior é

observado no tecido conectivo da derme [16], atribuindo às pessoas aparência

mais velha, devido a perda de firmeza e tonicidade, bem como, o aparecimento

de rugas [17]. O fotoenvelhecimento da pele está relacionado com o

aparecimento de outras enfermidades mais graves como as lesões

cancerígenas e pré-cancerígenas [18]. Estratégias antioxidantes são

frequentemente utilizadas para evitar o câncer de pele e o envelhecimento

precoce da pele, através da inibição/propagação de reações foto-oxidativas.

Suplementação com compostos de origem vegetal e com moléculas puras com

reconhecido potencial anti-oxidante, são bastante frequentes [19].

A incidência solar por períodos prolongados na superfície cutânea causa

um desequilíbrio entre a atividade de moléculas oxidantes e a atividade das

defesas anti-oxidantes. A radiação solar provoca a geração excessiva de

radicais livres e de outras espécies oxidantes, sendo que os mecanismos

antioxidantes naturais não são suficientes para neutralizá-la, causando

desbalanço redox, morte celular, danos teciduais, processos inflamatórios,

culminando com o envelhecimento precoce da pele [20].

Um dos processos de defesa antioxidante endógeno bastante conhecido

e importante na proteção de membranas celulares, é o da vitamina E [21]. A

vitamina E se intercala na membrana e é oxidada pelo lipídeo radicalar doando

um hidrogênio e interrompendo o processo de peroxidação lipídica. A

renovação da vitamina E oxidada ocorre pela doação de um hidrogênio por

outro oxidante tal como a vitamina C ou pela ação de enzimas redutoras como

a glutationa redutase, fazendo-a ativa novamente (Figura 6).

Figura 6. Esquema simplificado do mecanismo de ação antioxidante da vitamina E (à

direita) na redução de lipídeos oxidados (à esquerda).

No presente estudo, utilizou-se o análogo solúvel da vitamina E, Trolox

(Figura 7) [22], como padrão de comparação no cálculo da atividade

antioxidante dos extratos vegetais. Os extratos vegetais foram subdivididos em

duas classes principais de acordo com seus compostos constituintes, a saber,

polifenóis e sacarídeos.

Figura 7. Estrutura molecular do Trolox.

1.3. Polifenóis

Os polifenóis são por definição compostos que tem mais de um grupo

fenol na sua estrutura [23]. Fenóis tem reconhecida capacidade anti-oxidante

por serem capaz de doar hidrogênio, neutralizando radicais e outros compostos

oxidantes e formando radicais mais estáveis. Nos polifenóis as duplas

conjugadas e os anéis fenólicos agem de maneira sinérgica aumentando a

capacidade de interagir com compostos excitados como oxigênio singlete ou

triplete, inativando-os ao seu estado fundamental num processo chamado de

supressão física [24]. Além disso, o hidrogênio alílico ou fenílico age na

redução de espécies oxidantes, interrompendo processos oxidativos como o de

peroxidação lipídica. Abaixo descrevemos alguns compostos puros, que foram

utilizados como padrões neste trabalho, bem como, alguns extratos vegetais

que foram estudados, além dos principais compostos químicos polifenólicos

presentes nestes.

Ácido Gálico: O ácido gálico (Figura 8) [25], é um poderoso polifenol

encontrado na planta do chá (Camellia sinensis), uvas, berries e vinho. É

comumente utilizado como padrão em análises de polifenóis totais no teste de

Folin-Ciocalteau [26]. Sua atividade protetora em relação às reações de

peroxidação lipídica é bem estabelecida. O ácido gálico mostra-se inclusive

mais eficiente que o TROLOX em ensaios de supressão de radicais hidroxila

(OH.) e peroxila (OOH.) [27]. Tem-se demonstrado também efeitos positivos

através da administração do ácido gálico no tratamento de doenças como o

diabetes e alzheimer [28].

Figura 8. Estrutura do Ácido Gálico

Extrato de Erva Doce: A Erva Doce (Foeniculum vulgare) é uma planta cujas

propriedades farmacológicas são bem conhecidas da medicina popular. Seu

extrato é conhecido pelas propriedades ansiolíticas a anti-inflamatórias.

Entretanto, a literatura científica mostra que os extratos da F. vulgare também

possuem propriedades antimicrobiais, antivirais, antioxidantes e

antienvelhecimento [29]. O extrato é rico no polifenol quercetina, cuja estrutura

pode ser observada na figura 9. A quercetina geralmente é encontrada

conjugada com algum açúcar na posição R1, podendo essa, ser substituída por

galactose ou glicose.

Figura 9. Estrutura genérica da quercetina encontrada no extrato de F. vulgare onde R= (-

H ou -OH) e R1= (galactose ou glicose).

Extrato de Camomila: A camomila (Matricaria chamomilla) também é uma

antiga conhecida da medicina popular por sua atividade sedativa e ansiolítica

em chás da planta. Seu extrato vegetal também foi reportado por sua atividade

antioxidante, antidiabética, anti-inflamatória e antimicrobiana, além de reduzir o

dano causado pela peroxidação lipídica [30][31] O principal ativo dos extratos e

chás de camomila é a apigenina [32] (Figura 10) [33].

Figura 10. Estrutura molecular do polifenol apigenina

Extrato de Guaraná: O extrato do guaraná (Paulinia cupana) é um ótimo

potencializador de habilidades motoras e cognitivas in vivo. Além disso,

estudos clínicos indicam uma menor prevalência de doenças do coração em

pacientes suplementados com extrato de guaraná. Sobretudo, aponta-se o

extrato de guaraná como um protetor eficaz contra a oxidação de lipídeos

[34][35]. Sua composição é rica em catequinas, um importante polifenol (Figura

11) [36].

Figura 11. Estrutura da catequina

Extrato de Nogueira: O extrato da nogueira (Juglans regia) tem sido

associado à proteção de lipídeos em processos oxidativos e à diminuição de

doenças do coração em estudos clínicos [37]. Seu principal componente

polifenólico é o ácido elágico [38] cuja estrutura se observa na figura 12.

Figura 12. Estrutura do ácido elágico.

Extrato de Romã: O extrato da romã (Punica granatum) tem atividade

antioxidante e anti-inflamatória poderosa, além de ser anticancerígeno e

antidiabético [39][40]. Sua composição contém, além de antocianinas e ácido

elágico, isômeros de punicalagina, um polifenol complexo como se pode

observar na figura 13 [41].

Figura 13. Estrutura da punicalagina.

1.4. Sacarídeos

Os sacarídeos, por sua vez, também podem atuar como protetores

celulares, mas através de mecanismos variados. Podem ser redutores, no caso

de açúcares com terminação contendo aldeído livre. Sua força antioxidante

reside na capacidade de doar hidrogênio para interromper processos

oxidativos, oxidando-se no lugar dos lipídeos e terminando o processo

encadeado de peroxidação lipídica. Além disso, alguns sacarídeos têm

demonstrado a capacidade de proteger membranas, não apenas pela ação

antioxidante, mas também por oferecer uma proteção física da integridade das

membranas [42].

Trealose: A trealose [43] (Sigma Aldrich, 2015), (Figura 14) é um dissacarídeo

constituído por 2 unidades de glicose conectadas por uma ligação -1,1. Seu

papel biológico é de grande importância em bactérias, auxiliando na

sustentação da parede celular e termotolerância [44][45][46]. Apresenta

atividade de resistência ao estresse oxidativo pela diminuição da peroxidação

lipídica. Estudos apontam que esse efeito protetor se deve à eficiente ligação

entre a trealose e os lipídeos de membranas [47]. Vale ressaltar que a trealose

não é um açúcar redutor por não ter aldeído livre.

Figura 14. Estrutura da trealose.

Extrato de Aloe Vera: O extrato de Aloe Vera é muito utilizado na medicina

popular como anti-inflamatório em queimaduras e lesões na pele, além ser um

ótimo hidratante natural [48]. Sua composição depende do método de extração

[49]. Extratos aquosos, como é o caso do extrato aqui estudado, é rico

principalmente em polissacarídeos [50][51].

Extrato de goma arábica: O extrato etanólico da Acácia senegal, uma planta

cujo potencial cosmético vem sendo observado pela indústria farmacêutica e

do cabelo, comumente conhecido como "goma arábica" é constituído

quimicamente de polissacarídeos naturais. Após a hidrólise parcial, o extrato

apresenta diversos açúcares, como arabinose, galactose, glucose, ramnose,

xilose e ácidos urônicos, na forma de sais de cálcio, magnésio e outros cátions.

A maioria das gomas são hidrossolúveis e formam soluções mais ou menos

viscosas. Suas principais aplicações são no preparo de emulsões, pastilhas,

como fixador para cabelos, pós compactos, cremes e outros produtos

cosméticos [52]. Sua estrutura principal é composta por polissacarídeos com

ligações 1,3-b,D-galactopiranosil (Figura 15) e sua aplicação farmacêutica tem

relatada a eficácia no tratamento de infecções na mucosa intestinal e seu uso

como calmante tópico [53][54] .

Figura 15. Estrutura da ligação 1,3-b,D-galactopiranosídica presente na cadeia de

polissacarídeos da goma arábica

Extrato de Alga Fucus: A Fucus vesiculosus é uma alga utilizada para

problemas de tireoide, asma, tosse, distúrbios estomacais, doenças urinárias,

diabetes, colesterol alto, desequilíbrio hormonal, dores de cabeça e úlceras. Além

disso, no ramo cosmético vem sendo utilizado como antioxidante e anti-

envelhecimento [55][56][57]. Os polissacarídeos de sua composição contêm

principalmente mucopolissacarídeos (ou glucosaminoglicanos) como o hialurano

(Figura 16), por exemplo.

Figura 16. Monômero de hialurano

Extrato do Tamarindo: O extrato do Tamarindo (Tamarindus indica) também

tem propriedades antioxidantes, que têm se mostrado eficientes na redução de

taxas de peroxidação lipídica [58][59][60]. Além disso, seu efeito inibidor sobre

enzimas como metaloproteinases e hialuronidades têm chamado atenção para

o seu uso cosmético. Os polissacarídeos de sua composição são

principalmente xilo-glicanos (Figura 17) [61].

Figura 17. Estrutura monomérica básica dos xilo-glicanos (onde G = glicose, X = xilose).

2. MEMBRANAS BIOLÓGICAS

As membranas biológicas são formadas por uma dupla camada de

fosfolipídeos contendo também outras classes de lipídeos, proteínas e

açúcares (Figura 18). As proporções molares das moléculas constituintes das

membranas varia de célula para célula e de acordo com as condições em que

as células se encontram [62].

Proteínas podem ser associadas à membrana de duas formas: incluídas

na bicamada lipídica, sendo estas chamadas de proteínas intrínsecas de

membranas; ou apenas aderidas a uma das faces da membrana, sendo estas

chamadas de proteínas extrínsecas de membranas[63]. Já os carboidratos

presentes nas membranas são encontrados como produtos de glicosilação de

proteínas ajudando em suas funções ou ligados a fosfolipídeos na forma de

glicocálice, ajudando na adesão e no reconhecimento célula-célula. A

composição lipídica também pode ser bastante variada com o tipo de

membrana ou com a condição fisiológica das células [63].

Figura 18. Modelo de membrana segundo o modelo do Mosaico Fluído: Bicamada

fosfolipídica (A), Colesterol (B), Proteínas intrínsecas (C) e extrínsecas (D),

glicoproteínas (E), Glicolipídos (F) e Glicocálice (G).

Os fosfolipídios são moléculas anfipáticas, ou seja, são constituídos por

uma parte hidrofílica polar (grupo fosfato) e uma parte hidrofóbica apolar

(cadeia carbônica), unidas por um grupo glicerol (figura 19). O tamanho e a

presença de duplas ligações na cadeia alifática dos fosfolipídeos estão

relacionados com a eficiência do empacotamento desses fosfolipídeos e,

consequentemente, com a fluidez da membrana [64].

Figura 19. Estrutura molecular da fosfatidilcolina.

Além dos fosfolipídeos há diversos outros lipídeos presentes nas

membranas, como esteróis e glicolipídios. Os fosfolipídios mais abundantes

são aqueles ligados à colina (fosfatidilcolina e esfingomielina) e os

aminofosfolipídios (fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina). Destaca-se também

o fosfatidilglicerol, o fosfatidilinositol e a cardiolipina que, embora presentes em

menores quantidades, apresentam funções fundamentais de sinalização e

ancoramento às proteínas da membrana. A distribuição desses lipídeos pelas

duas camadas da bicamada é assimétrica, o que pode refletir em diferentes

estruturas e funções das duas superfícies da membrana [65].

As membranas fornecem barreiras físicas para separar o meio externo do

interno de células e organelas, além de mediar a entrada e a saída das mais

diversas substâncias necessárias para a manutenção da homeostase celular.

Consequentemente, a integridade dos lipídeos das membranas afeta

diretamente o equilíbrio homeostático das células. A oxidação dos lipídeos

altera a conformação destes na membrana, alterando as propriedades das

membranas das células e das organelas, podendo levar ao aumento de

permeabilidade e a alteração na seletividade no fluxo íons e de outras

moléculas e, consequentemente, podendo causar a morte das células [66],[67]

2.1. Lipossomos

Lipossomos, ou vesículas de fosfolipídios, são estruturas esféricas

compostas por bicamadas lipídicas que encapsulam parte do meio em que se

encontram. São formadas predominantemente por moléculas anfifílicas,

insolúveis em água, que quando em ambientes aquosos formam dispersões

coloidais [68]. Formam-se pela auto-organização de fosfolipídeos e têm sido

utilizados há várias décadas como modelos simplificados de membranas e

como carreadoras de fármacos.

Nesse projeto utilizamos lipossomos de leticina de soja como mimético

de membrana para quantificar dano e proteção da membrana. O lipossomo é

preparado contendo uma sonda fluorescente, que fica auto suprimida, no

compartimento interno, a lesão demonstra dano na membrana por aumento de

fluorescência. Lecitina é a designação dada a uma mistura de glicolipídios,

triglicerídios e fosfolipídios, por exemplo: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e

fosfatidilinositol. No entanto, em bioquímica, o termo lecitina é, usualmente,

utilizado como sinônimo de fosfatidilcolina pura, um fosfolipídio que constitui o

principal componente da fração fosfatada que se obtém da gema de ovo ou de

grãos de soja, de onde é extraída por meios mecânicos ou químicos, utilizando

hexano [69].

2.2. Fotossensibilização do 1,9-dimetil-azul de metileno como

modelo para estudos de danos às membranas

Como foi descrito acima, os danos por fotossensibilização contribuem

significativamente para lesões em membranas celulares. Esses danos são

desencadeados por compostos que geram tripletes e que podem induzir tanto

mecanismo Tipo I quanto Tipo II. No presente estudo utilizou-se o

fotossensibilizador sintético 1,9-dimetil-azul de metileno (DMMB - Figura 20)

[70] para causar danos em membranas modelos, ocasionando uma magnitude

mensurável e reprodutível de vazamento. DMMB é relativamente hidrofóbico e

se liga em membranas, gerando tripletes que atuam tanto pelos mecanismos

tipo I quanto pelo tipo II [71].

O DMMB tem demostrado ser um eficiente fotossensibilizador, tendo

sido utilizado em estudos de terapia fotodinâmica, a qual se baseia no princípio

de que a interação entre a luz em comprimento de onda adequado com um

fotossensibilizador e com o oxigênio fundamental (O2) resultando na formação

de diversas espécies reativas (EROs), [72],[73],[74], que são capazes de danos

oxidativos em biomoléculas.

Figura 20. Estrutura química do 1,9-Dimetil-Azul de Metileno (DMMB)

3. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA

As possíveis estratégias de proteção de membranas podem ajudar a

indústria cosmética a desenvolver novos conceitos de proteção da pele e do

cabelo contra danos oxidativos. Pretendemos desenvolver um protocolo

simples para quantificar dano e proteção de membrana.

4. OBJETIVO

Desenvolver um protocolo experimental que possa avaliar dano das

membranas por fotossensibilização e proteção destas por extratos vegetais

(Figura 21).

Figura 21. Modelo proposto para avaliação de dano e proteção de membranas.

EV

A geração de oxigênio singlete (1O2) causa danos em membranas, que são

quantificados usando a emissão da carboxifluoresceína [CF], que está auto-

suprimida no interior do lipossomo, mas cuja fluorescência aumenta

significativamente no meio externo após diluição. A eficácia de extratos

vegetais (EV) na proteção de modelos de membranas pode ser então

quantificada em comparação com padrões anti-oxidantes como ácido gálico.

Além disso, pretende-se usar este método para caracterizar outros

mecanismos de proteção de membranas além do efeito anti-oxidante.

5. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS

Reagentes: O DPPH (1,1’-difenil-2-picril-hidrazil), o Trolox, a

Carboxifluoresceína o ácido gálico foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Tris-

NaCl, Sephadex-G50, Clorofórmio, 1,9- Dimetil Azul de Metileno foram

adquiridos da Merck. O Folin-Ciocalteau foi adquirido da Haloquímica. Os

extratos vegetais e a Lecitina de soja foram fornecidos pela empresa Farma

Service Bioextract. Água utilizada foi bi-destilada e deionizada.

Equipamentos: Os espectros de absorbância foram obtidos em

espectrofotômetro Shimadzu UV-VIS 2400. O espalhamento de luz foi realizada

em equipamento da Malvern e as medidas fluorométricas foram realizados

utilizando-se um leitor de placas Infinite M200-Tecan (RCHISTO). A irradiação

foi realizada utilizando conjuntos de LED vermelhos construídos Novatecnica

Brasil (Figura 22). O comprimento de onda de máximo de emissão era de 639

nm, com 34 W.m2 de irradiância a uma distância de 10 cm, garantindo

efetividade e homogeneidade de irradiação por toda placa.

Figura 22. Espectro de emissão do LED- determinação da banda espectral para

irradiação do fotossensibilizador.

6. METODOLOGIA

6.1. Fotossensibilizador

Para o preparo da solução do DMMB, uma quantidade pequena e

indefinida (alguns miligramas) do corante foi solubilizada em água. Após

completa solubilização, diluiu-se com etanol em torno de 30 vezes. Uma vez

que não há dímeros de DMMB em etanol, pode-se determinar a concentração

da solução baseando-se diretamente no valor de absorbância. A leitura de

absorbância foi realizada no espectrofotômetro Shimadzu UV-VIS 2400. O

fotossensibilizador foi utilizado na concentração final de 15 µM.

Inicialmente caracterizamos as propriedades fotofísicas do DMMB em

etanol (Figura 23). O coeficiente de absortividade molar (ε) foi obtido a partir da

aplicação da Lei de Lambert Beer.

10 cm

Onde, A é a absorbância, ɛ o coeficiente de absorção molar, b a

concentração do composto e c o caminho óptico da cubeta.

Figura 23. Espectro de absorbância do 1,9 Dimetil Azul de Metileno (DMMB)-

Determinação da banda espectral.

6.2. Lipossomos

Preparamos lipossomos multilamelares de lecitina de soja com

carboxifluoresceína encapsulada no compartimento interno. Os lipossomos

foram produzidos adicionando-se clorofórmio a de lecitina de soja em um tubo

de ensaio obtendo-se a concentração final de 30mg/mL. Removia-se o solvente

com fluxo de argônio, enquanto girava-se o tubo de maneira inclinada, até que

fosse obtida a formação de um filme em suas paredes. Hidratava-se o filme

com solução de carboxifluoresceína (vide item 6.3) e agitava-se em um vórtex.

Após 10 minutos de sonicação em sonicador de banho, o sistema era

novamente agitado em um vórtex. Filtrava-se a suspensão obtida em uma

400 500 600 700 800

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Ab

so

rbâ

ncia

(u

.a)

Comprimento de Onda (nm)

DMMB-EtOH

(Equação 1)

coluna de Sephadex G-50 (item 6.4), usando tampão Tris (item 6.5) como

eluente. A fração contendo lipossomos com carboxifluoresceína encapsulada

no compartimento interno era facilmente visualizada na coluna de Sephadex e

era recolhida em um tubo de ensaio.

6.3. Preparação da solução de carboxifluoresceína

Preparou-se a solução de carboxifluoresceína adicionando-se 1,882 g de

carboxifluoresceína sólida a 100 mL de uma solução aquosa contendo 60,57 g

de tampão Tris. Adicionou-se hidróxido de sódio até que pH alcançasse o valor

de 8 e armazenava-se ao abrigo da luz.

6.4. Preparação da coluna de Sephadex-G50

A preparação da coluna de separação consistiu na pesagem de 2g de

Sephadex-G50 e transferência do sólido para um kitassato. Verteu-se 100 mL

de água destilada ao recipiente, que foi mantido em repouso por 30 minutos. O

conteúdo do kitassato foi então transferido para uma coluna de vidro em cuja

extremidade inferior, foi previamente introduzido um pequeno pedaço de

algodão. Simultaneamente à decantação do Sephadex, introduziu-se tampão

na coluna e, assim que a decantação foi concluída, os lipossomos foram

adicionados.

6.5. Preparação do tampão eluente (10mM Tris, 300mM NaCl, pH=8)

A preparação do tampão consistiu na adição de de Tris e NaCl a 1L de

água destilada. Adicionou-se ácido clorídrico até obtenção de pH igual a 8.

6.6 Separação de lipossomos encapsulados com carboxifluoresceína

Separou-se os lipossomos contendo carboxifluoresceína no

compartimento interno da carboxifluoresceína remanescente no exterior dos

lipossomos através do método de filtração e adsorção molecular em coluna de

sephadex (G-50) (Figura 24).

Figura 24: Separação do marcador fluorescente CF livre das vesículas contendo o

marcador encapsulado por coluna de gel filtração sephadex (G-50).

A cromatografia de filtração molecular é um método de cromatografia em

coluna pelo qual as moléculas se separam em solução segundo seu peso

molecular e a velocidade de migração as partículas é tanto menos quanto

menor for seu tamanho, devido a uma maior penetração na rede de poros que

constitui a fase estacionária. As moléculas de maior tamanho que os poros

farão o caminho mais curto, já que nunca entram à malha da fase estacionária.

Já as moléculas pequenas podem difundir dentro da matriz. Quanto menor é

seu tamanho, maior é a probabilidade de que entre em um poro. Assim, a

menor tamanho da molécula, mais longo o caminho que seguirá dentro da

malha da fase estacionária (Figura 23).

6.7. Quantificação de vazamento do lipossomo

Mediu-se a intensidade total de fluorescência da CF liberada pela lise

dos lipossomos com solução de Triton X a 5% (v/v). O conteúdo de CF liberado

dos lipossomos (porcentagem de liberação) foi calculado dividindo-se a

intensidade de fluorescência inicial, pela intensidade total de CF liberada.

% Liberação= [1- ( IFinicial / IFtotal )]

O experimento de quantificação do dano na membrana modelo consistiu

em comparar a ação do fotossensibilizador na permeabilização dos

lipossomos. O estudo foi conduzido em placas de fluorescência de 96 poços,

sendo 8 poços destinados ao branco (apenas tampão, vide item IV.7.3), 8

poços destinados ao controle (apenas lipossomos e tampão) e os restantes a

lipossomos e quantidades variáveis de tampão, fotossensibilizador e

compostos vegetais em estudo. O volume de suspensão de lipossomos

adicionado foi sempre 7 μL e o volume final mantido constante em 300 μL. A

irradiação foi realizada com LED’s λemissão= 639 nm, em arranjo que será

determinado de forma a tornar máxima a dosagem de luz. A determinação da

intensidade de fluorescência foi realizada utilizando-se um leitor de placas

Infinite M200-Tecan (RCHISTO), λexcitação= 480nm / λemissão= 517nm, adequados

às propriedades foto físicas da carboxifluoresceína.

6.8. Análises complementares

Para o melhor entendimento dos resultados obtidos no teste de proteção de

membrana, foi necessário realizar testes complementares com os extratos, tais

como:

i. Método anti radicalar (DPPH);

ii. Medidas de polifenóis (PFT);

iii. Ligação de extratos em membranas;

iv. Espalhamento de luz;

Método anti radicalar (DPPH): O método do DPPH consiste em avaliar a

capacidade antioxidande via atividade sequestradora do radical livre 2,2-difenil-

1-picrilhidrazil (DPPH), que possui coloração púrpura, absorvendo em um

comprimento de onda máximo de aproximadamente 515nm (Figura 25). O

método de DPPH é muito utilizado para se determinar a atividade antioxidante

em extratos e substâncias isoladas como: compostos fenólicos, fenólicos totais,

flavonóis, cumarinas, quitosana com diferentes pesos moleculares,

antocianinas, etc. Os espectros de absorção foram obtidos no leitor Tecan-

Infinite 200M, monitorados na região do visível, utilizando placa de 96 poços

obtendo uma curva de supressão do radical em função da concentração dos

antioxidantes. Por ação de um supressor de radicais livres, o DPPH• é

reduzido, formando difenil-picril-hidrazina, de coloração amarela, com

consequente desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada

pelo decréscimo da absorbância [75]. A partir dos resultados obtidos,

determina-se a porcentagem de atividade antioxidante ou sequestradora de

radicais livres e/ou porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional. A

percentagem de DPPH• remanescente no estado estacionário foi calculada

utilizando a fórmula:

[1 - (controle Abs - Abs amostra) de controle / Abs] x 100

A capacidade de eliminação de radicais foi definida como a quantidade de anti-

oxidante necessário para diminuir o DPPH• inicial concentração de 50%

(concentração eficiente = EC50), que foi estimada utilizando um algoritmo de

regressão linear. Todas as análises de teste foram realizadas em triplicata.

Trolox (ácido 6-hydoxy-2,5,7,8-tetra-metil-chromasn-2carboxilic) foi usada

como um controle positivo e para a calibração de uma curva padrão (0,0125-

0,075 mg mL-1).

Figura 25 - Redução do Radical DPPH após reação com supressores de radicais livres.

Medidas de polifenóis totais (PFT): Compostos polifenólicos são importantes

constituintes dietéticos, em virtude da sua elevada capacidade antioxidante,

atribuída à sua habilidade em complexar íons metálicos, inativar reações

radicalares em sistemas deslipidados, e prevenir conversão de hidroperóxido

em oxirradicais reativos [76]. A quantificação desses compostos fenólicos é

frequentemente realizada por meio do reagente de Folin Ciocalteau é o mais

extensivamente empregado [77]. O método consiste de mistura dos ácidos

fosfomolibídico e fosfotungstico, na qual o molibdênio se encontra no estado de

oxidação (VI) (cor amarela no complexo Na2MoO4 .2H2O); porém, em presença

de certos agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os

chamados complexos molibdênio-tungstênio azuis [(PMoW11O4 )4-] [78], cuja

coloração permite a quantificar a concentração das substâncias redutoras no

comprimento de onda de 780 nm. A Figura 26 mostra a desprotonação dos

compostos fenólicos em meio básico, gerando os ânions fenolatos, na qual,

segundo Singleton, Orthofer e Lamuela-Raventós [79], o molibdênio,

componente do reagente de Folin, sofre redução e o meio reacional muda de

coloração amarela para azul.

Figura 26 - Reação do ácido gálico com molibdênio, componente do reagente de Folin-

Ciocaulteau

Caracterização da ligação de extratos a membranas: O estudo consistiu em

preparar lipossomos, porém utilizando tampão em lugar de solução de

carboxifluoresceína. Preparou-se as soluções dos extratos vegetais de modo

que as concentrações dos mesmos não ultrapassassem 3% do ativo.

Adicionou-se a solução de extratos nas soluções de lipossomos. A suspensão

foi centrifugada, por 10 minutos a 13500 rpm, no qual as vesículas decantaram,

com posterior remoção do sobrenadante. O pellet será ressuspendido com

tampão e novamente centrifugado, até que a fase superior se torne límpida

quando da adição de tampão. Em seguida, o pellet novamente ressuspenso no

mesmo volume, e a partir de então foi possível determinar a concentração de

extrato vegetal através da medida de polifenóis totais restantes na solução

(Figura 27).

Figura 27 – Esquema representativo do procedimento para determinação da

concentração de extratos vegetais após ligação em membranas.

Determinou-se concentração final de extratos vegetais ligados na

membrana através da formula abaixo:

Tamanho dos lipossomos por espalhamento de luz

É conhecido que em solução aquosa contendo partículas com diâmetro

próximo a 200nm ou menores são capazes de se manter em suspensão

coloidal sem precipitar. A fim de obter o tamanho médio das partículas obtidas

em laboratório, utilizou-se da técnica de espalhamento dinâmico de luz

(Dynamic Light Scattering), em que a amostra contendo os lipossomos é sujeito

a medidas de espalhamento de luz resultantes do movimento translacional por

difusão das partículas, ou por tamanho [80].

[PFT]inicial

– [PFT]final

= [PFT]ligado

Para realização da análise dos lipossomos por espalhamento de luz, as

vesículas foram preparadas conforme descrito anteriormente e submetidas à

irradiação por um período de 2 horas. Inicialmente, as soluções foram

analisadas sem irradiação, apenas com seus controles, lipossomos, extratos e

o DMMB. No segundo momento a placa, com as respectivas soluções, foi

submetida a leitura após 1ª hora e 2ª hora de exposição com LEDS vermelhos.

A partir dos dados de espalhamento de luz, foi possível verificar se os

lipossomos sofreram modificação após serem expostos ao estresse oxidativo

por meio da irradiação.

6.9. TRATAMENTO DE DADOS

O software Origin 7.0 (OriginLab Corporation) será utilizado para o

tratamento de dados e obtenção de gráficos.

7. RESULTADOS

7.1. Caracterização do irradiador

As características e propriedades fotofísicas e de interação com

membranas do DMMB já eram conhecidas do grupo [81]. Neste trabalho o

primeiro desafio foi encontrar uma fonte de luz barata e que pudesse irradiar o

DMMB com eficiência. Propusemos então um projeto para a empresa

Novatécnica (Brasil) desenvolver um conjunto de LEDs que pudesse excitar

eficientemente o DMMB e homogeneamente em todos os 96 poços de uma

placa de poliestireno com estas especificações. Note que o irradiador luz (LED)

vermelho emite com máximo em 639nm e com largura de meia altura de

~15nm, o que se adequa muito bem para excitar o DMMB que tem máximo de

absorção em 651nm (Figura 28). Usando esse irradiador e um modelo de

lipossomos com CF internalizado, pudemos testar a cinética de dano em

membranas eficácia fotossensibilizador DMMB.

Figura 28- Banda de emissão do irradiador de LEDs vermelho

7.2. O modelo experimental: Estabilidade da suspensão de lipossomos

sem e com irradiação e o cálculo da percentagem de dano

Antes de proceder aos experimentos de irradiação caracterizamos o

modelo experimental da carboxifluoresceína auto suprimida no interior de

lipossomos e o efeito de danos na membrana deste modelo. A eficiência

fotodinâmica de dano em membrana foi determinada pelo método de liberação

da sonda fluorescente carboxifluoresceína [CF], que inicialmente encontrava-se

auto suprimida no compartimento interno das vesículas íntegras, sendo

progressivamente liberada após geração de espécies reativas com consecutivo

aumento da fluorescência da solução (Figura 21).

Quantificamos a Intensidade de fluorescência em função do tempo, sem

irradiação na ausência e presença de Triton-X (Figura 29). Observa-se que os

lipossomos são significativamente estáveis na ausência de irradiação, pois a

intensidade de emissão da CF é pequena e apresenta um pequeno aumento

em duas horas de observação. Nota-se que na presença de Triton X a 10%

(10uL) ocorre a lise total dos lipossomos, caracterizando o aumento da

intensidade total de fluorescência. Este valor de emissão (~7000) é muito maior

do que o valor inicial (~1000), indicando que o vazamento da CF da vesícula

causa o aumento significativo da sua fluorescência.

Figura 29 - Intensidade de fluorescência da CF em função do tempo de lipossomos

incubados com tampão (esquerda) e na ausência e presença de Triton X (direita).

(lambda de excitação=480nm, lambda de emissão 517nm).

Embora os lipossomos sejam relativamente estáveis o aumento da

emissão de CF no escuro e na ausência de Triton evidencia que uma certa

percentagem de lipossomos acaba vazando sozinho durante o experimente.

Esta variação é praticamente desprezível na ausência de DMMB, mas torna-se

significativa na presença do mesmo. O aumento que se observou na presença

de DMMB (em torno de 300 unidades de emissão de CF), é em torno de 5% do

aumento que ocorre na presença do Triton (~6000 unidades de emissão de

CF) e mantem-se relativamente constante em repetições experimentais. Então

podemos concluir que o vazamento de em torno de 5% dos lipossomos pela

presença do DMMB é um valor de sinal de fundo que precisamos considerar

nas análises de cálculo de valor absoluto de vazamento de lipossomos. No

entanto, neste trabalho as percentagens de vazamentos sempre foram

consideradas em comparação com o valor de vazamento de DMMB com luz, e

na presença de agentes que protegem as membranas. Esse valor de 5%

estará presente tanto no vazamento do lipossomo com DMMB puro quanto no

sistema com lipossomo, DMMB e agente protetor.

O passo seguinte foi caracterizar a cinética de aumento de fluorescência dos

lipossomos com CF internalizada na presença do fotossensibilizador DMMB em

função do tempo de irradicação (Figura 30). É possível notar que os

lipossomos expostos à irradiação apresentam uma curva sigmoide com

progressivo aumento da intensidade de fluorescência, caracterizando o dano

gerado por espécies reativas de oxigênio gerado pelo DMMB. Essas espécies

causam danos oxidativos em lipídeos e permeabilizam as membranas durante

a irradiação. Neste trabalho usamos o valor final de emissão da CF (neste caso

próximo de 5000 unidades de emissão de CF) em lipossomos irradiados como

100% de dano.

Figura 30- Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação em

lipossomos de lecitina de soja. (lambda de excitação=480nm, lambda de emissão de

517nm). [DMMB]=15µM, pH=8.0

7.3. Eficiência de proteção de membranas

Para facilitar a apresentação dos dados dividimos com agentes protetores

em duas grandes famílias: polifenólicos e sacarídeos. Escolhemos como

padrão dos compostos polifenólicos o ácido gálico, que está ele próprio

presente em diversos extratos e que também é comumente usado como

padrão em testes de quantificação de extratos. Como padrão dos sacarídeos,

escolhemos a trealose. Como descrito acima, este dissacarídeo não redutor

protege células de leveduras durante processos de estresse, tais como altas

temperaturas, choque osmótico, efeitos tóxicos do etanol e desidratação [82].

Após a padronização do ensaio de mensuração do dano e proteção de

membranas com compostos padrões, realizamos os testes de proteção de

0 20 40 60 80 100 120

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

nsid

ad

e d

e flu

ore

scê

ncia

Tempo (minutos)

Tampão

Tampão+Lipossomo

Tmp+Lip+FS

membrana com os extratos vegetais propostos, visando relacionar a efetividade

com a composição.

7.3.1 Compostos fenólicos

Na figura 31 está apresentado um dado típico de dano e proteção de

membrana, neste caso realizado com o composto padrão, ácido gálico. Note

que o lipossomo irradiado na presença de DMMB apresenta vazamento

característico, sendo que o nível de emissão de CV alcança o valor típico de

5000 unidades de emissão de CF. Note também que os controles (tampão e

lipossomo com tampão) exibem níveis irrelevantes de emissão de CF.

Interessantemente, na presença de ácido gálico ocorre a diminuição da

emissão de CF e essa diminuição fica mais significativa com o aumento da

concentração de ácido gálico. O ácido gálico, como já era esperado é um

potente agente anti-oxidante, impedimento a progressão das reações

radicalares e impedindo e/ou retardando o processo de foto-oxidação. Note que

ocorre aumento da percentagem de proteção com o aumento da concentração

de ácido gálico. A concentração de 50% de proteção de membranas (7.5 µM de

ácido gálico) será usado como padrão de comparação com os extratos

vegetais. Como já mencionado acima 15 µM oferece nível de proteção próximo

a ~80%.

Note também que na presença de 15µM de ácido gálico ocorre emissão no

nível de 1100 unidades de CF, o que equivale a um dano aproximadamente

21%. Se o dano na ausência de ácido gálico era por definição 100% na

presenta do mesmo o dano foi de 21%, resultando em uma proteção de 79%

das membranas. Para efeito deste trabalho consideraremos estes dois limites

de proteção: ~50% de proteção é equivalente a 7.5µM ácido gálico e ~80% de

proteção é equivalente a 15 µM de ácido gálico (Figura 32).

Figura 31- Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação, obtido para

vesículas encapsuladas com a sonda carboxifluoresceína com as variadas

concentrações de ácido gálico. (lambda de excitação=480nm, lambda de emissão de

517nm). [DMMB]=15µM, pH=8.0.

Figura 32- Porcentagem de proteção de membrana em função da concentração de ácido gálico.

0 20 40 60 80 100 120

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000In

ten

sid

ad

e d

e F

luo

rescê

ncia

(u

.a)

Tempo de irradiação (minutos)

0 3 6 9 12 15 18

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Po

rce

nta

ge

m d

e p

rote

çã

o

Concentração (uM)

Ácido gálico

Linear Fit

Quando se adiciona extratos vegetais ao sistema de lipossomos

contendo DMMB, observa-se que há diferentes níveis de dano na membrana,

dependendo do extrato e concentração (Figura 33). Os extratos de erva doce

e camomila a 0.5% alcançam o nível de 50% de proteção (equivalente 7.5 µM

de ácido gálico), os extratos de guaraná e nogueira alcançam níveis de

proteção acima de 80% a 0.1% e o extrato de romã, que é o mais eficiente

protetor de membranas já testados, alcança um nível de proteção próximo de

100% (97%) de proteção na concentração de 0.01%. Extrapolando o dado de

ácido gálico esse nível de proteção significa um extrato que tem o equivalente

a 100 µM de ácido gálico em termos de proteção de membranas, na

concentração de 0.01%.

Figura 33- Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação em

membranas na presença de extratos vegetais (a) Erva doce; (b) Camomila (c) Guaraná (d)

Nogueira (e) Romã. (lambda de excitação=480nm, lambda de emissão de 517nm).

[DMMB]=15µM, pH=8.0.

Figura 33 A- Eficiência de proteção de membrana após irradiação de membranas na

presença compostos fenólicos (a) Erva doce; (b) Camomila (c) Guaraná (d) Nogueira (e)

Romã.

7.3.2 Sacarídeos

Da mesma forma que foi apresentada para os compostos polifenois, os

lipossomos foram expostos à irradiação na presença de DMMB e na presença

de concentrações crescentes de trealose (Figura 34). Note que o nível de CF

fluorescência relativa a 100% de dano é neste caso 6000 unidades de CF

fluorescência. Com o aumento da concentração de Trealose ocorre uma

diminuição significativa no valor de CF fluorescência, indicando que ocorre

proteção da membrana proporcional a concentração de trealose. Note na figura

35, que a percentagem de proteção aumenta proporcionalmente à

concentração de trealose. O nível de proteção de 50% ocorre na concentração

de 14,61mM e 80% de proteção a 29,21mM de Trealose.

Erv

a D

oce

0,5%

Cam

omila

0,5

%

Gua

raná

0,1

%

Nog

ueira

0,1

%

Rom

ã 0

,01%

0

20

40

60

80

100

Po

rce

nta

ge

m d

e p

rote

çã

o

Compostos fenólicos

Figura 34- Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação, obtido para

vesículas encapsuladas com a sonda carboxifluoresceína com as variadas

concentrações de trealose, padrão sacarídeo utilizado no estudo. (lambda de

excitação=480nm, lambda de emissão de 517nm). [DMMB]=15µM, pH=8.0.

Figura 34 A- Intensidade proteção após do tempo de irradiação, obtido para vesículas

encapsuladas com a sonda carboxifluoresceína com as variadas concentrações de

trealose, padrão sacarídeo utilizado no estudo.

Y= 7,7360 X + 1,9975 R2= 0,9890

0 5 10 15 20 25 30

10

20

30

40

50

60

70

Porc

en

tag

em

de

pro

teçã

o

Concentração (mM)

Trealose

Linear Fit

Os lipossomos também foram expostos à irradiação na presença de extratos

vegetais que sabidamente são ricos em sacarídeos. Note que há um efeito

protetor, pois ocorre diminuição da fluorescência em função do tempo de

irradiação dos lipossomos suspensos. A 0.5% todos esses extratos apresentam

proteção próximo a 50% e o extrato de tamarindo é o que apresenta nível de

proteção próximo a 80%. É interessante notar que extratos que são

constituídos basicamente de sacarídeos, ou seja, não possuem valores

elevados de polifenóis também apresentam níveis consideráveis de proteção

da membrana, sugerindo que o mecanismo de proteção talvez não seja

somente anti-oxidante.

Figura 35 - Intensidade de fluorescência em função do tempo de irradiação, obtido para

vesículas encapsuladas com a sonda carboxifluoresceína em variadas concentrações de

extratos vegetais sacarídeos (a) Aloe Vera; (b) Plantcol (c) Tamariliz (d) Alga Fucus.

Figura 35 A- Eficiência de proteção de membrana após irradiação de membranas na

presença de extratos vegetais sacarídeos (a) Aloe Vera; (b) Plantcol (c) Tamariliz (d) Alga

Fucus

7.4 Estrutura dos lipossomos oxidados e protegidos

Muito embora o dado de vazamento de CF é bem estabelecido para

medir danos em membranas, tornou-se importante caracterizar se o vazamento

que ocorre com a foto-oxidação resulta em alterações na dimensão dos

lipossomos suspensos. Alterações no raio hidrodinâmico dos lipossomos foi

acompanhada por espalhamento de luz. Note que o espalhamento de luz é

estável em lipossomos não irradiados. Na presença de DMMB e irradiação o

raio hidrodinâmico aumenta quase 4 vezes (~150 nm para ~600nm) (Figuras

36 e 37). Essa diferença de raio hidrodinâmico indica que o sistema de

lipossomo é severamente danificado durante a irradiação, desestabilizando as

respectivas estruturas coloidais, que se transforma provavelmente em sistemas

lamelares, que tendem a se organizar em multicamadas para evitar a

exposição de cadeias carbônicas alquímicas à agua. Os extratos vegetais

conseguem evitar esse aumento significativamente. Note que na presença do

Aloe Vera 0,5 % Plantcol 0,5% Tamariliz 0,5% Alga Fucus 0,5%

0

10

20

30

40

50

60

70

80P

orc

en

tag

em

de

pro

teçã

o

Extratos sacarídeos

extrato de romã, lipossomos aumentam de 300nm para 350nm, em torno de

15% de aumento, ao invés de 4 vezes. O mesmo efeito pode ser observado na

presença de extratos ou de sacarose, provando que os carboidratos também

protegem as membranas (Figura 37). É importante enfatizar que os extratos

afetam o tamanho do raio hidrodinâmico mesmo antes de se iniciar as

medidas. Esse efeito deve ser devido a alterações na viscosidade e

concentração iônica do meio pela presença dos extratos. Alteração nestes

parâmetros afetam a difusividade média dos lipossomos em solução, que

resulta em alteração no raio hidrodinâmico. Embora isso possa ser corrigido,

não nos detemos a fazer esse ajuste nesse trabalho, pois somente queríamos

demonstrar que a irradiação causa aumento do raio hidrodinâmico e que esse

aumento pode ser revertido pela presença dos extratos.

Figura 36- Raio hidrodinâmico (nm) de lipossomos sem irradiação e após irradiação

(1hora e 2 horas) na ausência e na presença de extratos contendo compostos poli

fenólicos.

Figura 37- Raio hidrodinâmico (nm) de lipossomos sem irradiação e após irradiação

(1hora e 2 horas) na ausência e na presença de extratos contendo compostos

sacarídeos.

7.5. Ensaios complementares

Com o objetivo de caracterizar os extratos utilizados e para poder correlacionar

a atividade de proteção de membranas com outras propriedades realizamos

diversos outros ensaios, cujos resultados estão descritos abaixo.

7.5.1. Atividade antiradicalar

O radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazila DPPH• é suprimido por agentes

antioxidantes, tais como o ácido gálico e Trolox, e essa supressão é

comumente usada para quantificar a atividade de antioxidantes naturais [83].

Com este intuito, mede-se o percentual de radicais DPPH• que se mantem na

forma radicalar em função do tempo, na ausência e na presença de compostos

antioxidantes. A figura 38 traz dois exemplos destas medidas realizadas em

função da concentração de Trolox e de extrato de camomila, logo após a

mistura e seguindo a absorção de DPPH• em função do tempo. A porcentagem

de DPPH• remanescente no estado estacionário foi calculada utilizando a

fórmula: [1 - (controle Abs - Abs amostra) de controle / Abs] x 100]. A

capacidade de eliminação de radicais é definida como a quantidade de

antioxidante necessário para diminuir a concentração de DPPH• à 50% da

concentração inicial (Eficiente concentração= EC50). Trolox foi usado como

controle positivo e para obtenção da curva padrão de supressão do DPPH•

(0,0125-0,075 mg mL-1).

a) b)

Figura 38 - Porcentagem remanescente do radical DPPH• após submissão à soluções

antioxidantes (a) Trolox e (b) Extrato Camomila, determinação do EC50. Todas as análises

de teste foram realizadas em triplicata.

Após obter-se o EC50 das soluções é possível determinar a quantidade

de equivalentes de Trolox por quilogramas de extrato (g/Kg) (Tabelas 1 e 2),

representado simplificadamente por TEAC (do inglês, Trolox equivalente

antioxidant capacity), através da equação: TEAC(IC50) = Trolox (g) / Extrato

(Kg). Note que o valor de TEAC varia com o tempo de exposição (Figura 39),

uma vez que a quantidade de moléculas de DPPH• suprimidas também

depende do tempo de exposição. Consequentemente, as comparações de

1 2 3 4 5 6 7 8

30

40

50

60

70

80

90

100

% R

em

. D

PP

H

mg/L

Início

1h

2h

3h

4h

1 2 3 4 5 6 7

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100%

Re

ma

ne

sce

nte

DP

PH

[g/L]

Inicio

1h

2h

3h

4h

EC50 EC50

capacidade anti-oxidante devem ser sempre realizadas com o mesmo tempo

de incubação.

Figura 39 – Quantificação do equivalente de Trolox (1,12g) por quilo de extrato

(Camomila), em função do tempo de reação. Obtido a partir das figura 38 A e 38 B.

7.5.2. Polifenol total

Um outro parâmetro importante de comparação de atividade dos

extratos pode ser obtido pela quantificação do total de compostos polifenólicos.

A concentração total de fenóis foi estimada usando o método de Folin-

Ciocalteu com ligeiras modificações [84]. Após diluição (100 vezes) do padrão

estoque inicial [AG] = 5,000 g/L, para adequação da curva de calibração, obteve-

se [AG final] = 0,0500 g/L. Uma alíquota da solução aquosa de extrato vegetal é

misturada com 0,1M do reagente Folin & Ciocalteu (Sigma Aldrich) e 20% (m/v)

de uma solução de carbonato de sódio. Após 2 horas de incubação à

temperatura ambiente, a absorbância a 780 nm é obtida utilizando o leitor de

microplacas. Os resultados são expressos como equivalentes de Ácido Gálico

(g) por quilograma de extrato vegetal (kg)- (Tabelas 1 e 2 ).

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

TE

AC

(g

/Kg

)

Tempo (horas)

Figura 40 – Absorbância de soluções com contendo concentrações crescentes de ácido

gálico, submetidas ao reagente de Folin–Ciocalteu. Os resultados de quantificação de

polifenois totais são expressos como equivalentes de ácido gálico (EAG) por Kg de

extrato, através de curva de calibração, obtendo-se a concentrações equivalente de

padrão de ácido gálico que fornece a mesma absorbância do extrato.

Note na Tabela 1, que existe uma certa correlação entre os valores de

TEAC e de GAE, uma vez que os polifenois estão presentes nestes extratos. A

correlação com os dados de proteção de membranas não é, no entanto, direta.

Note que extrato de romã e de nogueira são os que respondem com valores

maiores de TEAC e PFT e são os que de fato protegem melhor as membranas.

No entanto, estes extratos apresentam praticamente os mesmos valores de

TEAC, mas o extrato de romã é substancialmente superior ao de nogueira em

termos de proteção de membrana. Com relação ao resultado de PFT, o extrato

de romã apresenta maior valor de GAE (~2 vezes) ao de nogueira, mas mesmo

assim, essa superioridade não pode explicar totalmente os dados quantitativos

de proteção de membranas (~10vezes), sugerindo que deve haver outro

parâmetro que interfere na proteção de membranas, além do potencial

antioxidante.

Outro exemplo interessante que merece comentário próprio é o da

trealose e dos extratos que são baseados em sacarídeos (Tabela 2). Note que

a trealose não suprime DPPH• como era esperado, uma vez que é um

dissacarídeo não redutor e, portanto, não se espera que tenha atividade

antiradicalar. Algumas preparações de Aloe Vera (AV) podem ter propriedades

antioxidantes, uma vez que a composição química depende do método de

extração, no entanto, o extrato AV aqui usada não mostrou eficiência na

supressão de espécies de radicais. A falta de efeito antioxidante é

quimicamente compatível com a baixa quantidade de polifenóis totais

detectada nessa classe de extratos vegetais. No entanto, fica a questão, se

estes extratos não têm atividade antioxidante, porque protegem as

membranas?

Tabela 1: Valor de TEAC e GAE para ácido gálico e para extratos contendo polifenóis.

EXTRATOS

DPPH

TEAC (g/Kg)

PFT

GAE (g/Kg)

Ácido Gálico 0,72±0,13 0,55±0,11

Erva Doce 0,58±0,08 0,41±0,09

Camomila 1,12±0,10 0,89±0,17

Guaraná 5,44±0,81 1,54±0,21

Nogueira 9,02±0,74 4,04±0,84

Romã 9,87±0,93 7,34±0,87

Tabela 2: Valor de TEAC e GAE para extratos contendo carboidratos.

Extratos

DPPH

TEAC (g/Kg)

PFT

GAE (g/Kg)

Trealose s/AOX 0,27±0,03

Alga Fucus 0,17±0,04 0,32±0,07

Aloe Vera s/AOX 0,02±0,01

Tamariliz 0,10±0,03 0,17±0,01

7.5.3 Ligação em membranas

Um possível efeito que pode e deve interferir na eficiência de proteção

de membranas é a eficiência de ligação do agente protetor à membrana. Ou

seja, o composto pode ter uma atividade antioxidante proeminente, mas se não

estiver fisicamente presente na membrana, a eficiência de proteção pode ser

menor do que no caso de um agente com menor potencial antioxidante, mas

que esteja em contato íntimo com a membrana. No entanto, a medição de

ligação em membranas não é trivial. De fato, medir a interação de compostos

puros com membranas já é difícil, o que dizer de misturas de centenas de

compostos, presentes nos extratos.

Para superar esta dificuldade, desenvolvemos um ensaio paralelo

adicional ao do PFT, mas que é baseado na mesma plataforma experimental.

O ensaio baseia-se na medição do potencial de PFT de um certo extrato na

presença e na ausência de membranas, para identificar quanto do valor de PFT

deste extrato seria sequestrado pela membrana, ou seja, fornecendo dados de

quanto da reatividade dos extratos perante o reagente de Folin-Ciocalteu é

perdido por ligação e membranas (Tabela 3). Vale ressaltar que todos os

extratos testados são hidro alcoólicos, e consequentemente, tem grande

tendência a ficar solubilizado na parte aquosa. A coluna da direita PFT (ligado)

apresenta a diferença de PFT antes e após a adição de lipossomos e fornece

uma ideia da parte do potencial PFT presente na membrana. Note que os

extratos de guaraná, nogueira e romã são os que mais apresentam ligação em

membranas, o que ajuda a justificar o potencial de proteção de membranas que

estes extratos exercem. Observe também que extratos baseados em

polissacarídeos também apresentaram eficaz ligação nos lipossomos, apesar

de não possuírem em sua composição grupamentos fenólicos para inibir o

processo oxidativo, nos levando a acreditar que seu mecanismo de proteção

seja através de barreira física criada entre o fotossensibilizador e a membrana,

impedindo que haja internalização do mesmo para que ocorra o dano.

Tabela 3: Estimativa da interação de extratos com membranas através da

quantificação do GAE na ausência e presença de lipossomos.

Extratos

PFT (inicial)

GAE (g/Kg)

PFT (final)

GAE (g/Kg)

PFT (ligado)

GAE (g/Kg)

Ácido Gálico 30uM 0,55±0,17 0,27±0,08 0,31

Erva Doce 0,41±0,12 0,31±0,08 0,10

Camomila 0,89±0,21 0,64±0,11 0,25

Guaraná 5,44±0,74 3,25±0,51 3,32

Nogueira 4,04±0,53 2,12±0,33 1,92

Romã 7,34±0,97 6,29±0,83 1,05

Tabela 4: Estimativa da interação de extratos com membranas através da

quantificação do GAE na ausência e presença de lipossomos.

Extratos

PFT (inicial)

GAE (g/Kg)

PFT (final)

GAE (g/Kg)

PFT (ligado)

GAE (g/Kg)

Trealose 2% 0,27±0,08 0,12±0,03 0,15

Alga Fucus 0,32±0,09 0,21±0,08 0,11

Aloe Vera 0,19±0,04 0,10±0,02 0,09

Tamariliz 0,17±0,04 0,11±0,02 0,08

8. DISCUSSÃO

Os dados de quantificação da atividade de proteção de membranas em

função da quantidade de equivalentes de ácido gálico e de trealose parecem

ser maneiras apropriadas para quantificar e comparar a capacidade de extratos

vegetais, que tenham prevalência de polifenois e de sacarídeos

respectivamente. A quantificação da atividade de proteção de membranas pode

ser um novo conceito para o aprimoramento de formulações cosméticos. Para

dar apenas um exemplo próximo a nós, dados recentes mostraram que

proteção de membrana é crítico para explicar o efeito de proteção do extrato de

aloe vera contra luz UVA [84].

Nosso trabalho também trouxe contribuições para o entendimento dos

parâmetros que afetam a proteção de membranas contra reações

fotoinduzidas. Note que na figura 41 a percentagem de proteção de extratos

vária com o tipo de extrato em com a concentração. Note que um extrato que

tem baixa atividade anti-radicalar, sua atividade protetora é mínima. Já extratos

que tenham valores elevados de anti-oxidantes (Tabelas 1 e 2) e que tenham

componentes que se ligam em membranas (Tabela 3), como os extratos de

romã e de camomila, há capacidade significativa de proteção de membrana.

Figura 41. Proteção de membranas de extratos vegetais que tem capacidade

antioxidante e que se ligam bem em membranas (Romã e Camomila) e do extrato

de Cereja que tem valores desprezíveis de atividade antioxidante (GAE=0.1 e

TEAC=0.5).

Além disso, é importante mencionar o caso dos carboidratos que tem

atividade antioxidante insignificante, mas que também protegem as

membranas. Com intuito de propor uma explicação mecanística é interessante

comparar a proteção por aloe vera (Figura 42) com a proteção por trealose

pura. A proteção pelo extrato de aloe vera é proporcional a concentração de

extrato, assim como ocorre com a solução de sacarose. Note que ambas

soluções protegem membranas e nenhuma delas é anti-oxidante, sugerindo

que o mecanismo de ação não é por anti-oxidante. Embora trealose seja um

modelo muito simples para reproduzir a ação do extrato de aloe vera, o fato de

Romã d

iluida 1

00x

Romã d

iluida 5

000x

Camom

ila d

iluida 1

00x

Camom

ila d

iluida 5

000x

Cereja d

iluida 1

00x

0

20

40

60

80

100

120P

orc

en

tag

em

de P

rote

çã

o

B

ambos agirem de maneira semelhante, sugere que o mecanismo de ação seja

equivalente.

Trealose é uma molécula que vem sendo usada por muitos anos como

protetor da estrutura de membranas, agindo principalmente por um efeito físico

de adsorção na parte polar dos lipídeos, protegendo-os por uma barreira física

contra espécies reativas vindas da solução e ao mesmo tempo evitando que

pequenas alterações nos lipídeos afetem a estrutura e a permeabilidade das

membranas. A trealose estabelece ligações de hidrogênio com os grupos

carbonil e de fosfato e substitui as moléculas de água a partir do grupo cabeça

do lipídeo [85]. A interação da trealose foi recentemente modelada

computacionalmente, mostrando a alta afinidade e especificidade da interação

lipídeo/trealose (Figura 43) [86][87]. Desta forma, propomos que a interação

física de carboidratos com membranas é um modo adicional de proteção das

membranas contra danos oxidativos.

Figura 42. Aumento de fluorescência de CF na ausência de AloeVera (TMP+LIP+FS) e na

presença de concentrações crescentes de Aloe Vera.

0 50 100 150 200 250 300 350

0

2000

4000

6000

8000

Inte

nsid

ad

e d

e F

luo

rescê

ncia

Tempo (minutos)

Tmp

Tmp+Lip

Tmp+Lip+FS

0,01%

0,05%

0,1%

0,2%

0,4%

0,6%

0,8%

1%

2%

Aloe Vera

Figura 43. ESQUERDA: (A) membrana modelo com moléculas de trealose proximas e (B)

membranas com trealose ligada. DIREITA. Estrutura molecular de trealose.

9. CONCLUSÃO

As indústrias de cosméticos, perfumes e de higiene pessoal vêm

representando liderança do mercado de produtos naturais. As regras para a

comercialização e aceitação no cenário atual dos produtos com ativos vegetais

são severas e têm promovido um necessário desenvolvimento de

procedimentos técnicos em seus processos produtivos, de controle de

qualidade e de segurança e performance.

Os resultados para os extratos vegetais mostram que aqueles que

possuem elevado teor de polifenóis e expressiva atividade antiradicalar e que

interagem com membranas tem maior eficácia em proteger membranas contra

estresse oxidativo. Por outro lado, observa-se também a eficácia dos extratos

ricos em polissacarídeos, e acredita-se que o mecanismo envolvido seja uma

barreira física em proteger a membrana da ação das espécies reativas geradas

durante a irradiação.

O ensaio de quantificação de proteção de membranas, baseado na

medida de equivalentes de ácido gálico ou de sacarose, foi desenvolvido para

ser um ensaio simples e de custo reduzido, na esperança que esse método

possa ser usado pela indústria cosmética. Sugerimos que estas mensurações

sejam usadas para quantificar a eficiência de proteção de membranas de

extratos que tenham polifenois e sacarídeos, respectivamente. No caso de

extratos que possuem ambos constituintes, ambas mensurações podem ser

realizadas.

10. REFERÊNCIAS

[1] Euromonitor International. GMID (Global market information database): cosmetics

and toiletries global report. 2007. Disponível em

http://www.funcex.org.br/material/redemercosul Acessado em Agosto, 2015.

[2] SOUSA et al. - Constituintes químicos ativos de plantas medicinais brasileiras.

Laboratório de Produtos Naturais, Fortaleza, 1991. pg.: 55-162.

[3] Sociedade Brasileira de Farmacognosia, O que é Farmacognosia?, 2014.

Disponível em: <http://www.sbfgnosia.org.br/farmacognosia.html> Acesso em

Setembro, 2015.

[4] Benson KF1, Newman RA2, Jensen GS1.Antioxidant, anti-inflammatory, anti-

apoptotic, and skin regenerative properties of an Aloe vera-based extract of Nerium

oleander leaves (nae-8(®)).Clin Cosmet Investig Dermatol. 2015 May 6;8:239-48. doi:

10.2147/CCID.S79871. eCollection 2015.

[5] KIRCHHOFF, V. W. J. H. ¾ 1995 - Ozônio e Radiação UV ¾ B, Transtec Editorial,

São José dos Campos, 149p.

[6] Baggerly CA1, Cuomo RE, French CB, Garland CF, Gorham ED, Grant WB, Heaney

RP, Holick MF, Hollis BW, McDonnell SL, Pittaway M, Seaton P, Wagner CL,Wunsch

A. Sunlight and Vitamin D: Necessary for Public Health. JAm Coll Nutr. 2015 Jul-

Aug;34(4):359-65. doi: 10.1080/07315724.2015.1039866. Epub 2015 Jun 22.

[7] Ikehata H1, Ono T. The mechanisms of UV mutagenesis. J Radiat

Res. 2011;52(2):115-25.

[8] Bäumler A.J., Tsolis R.M. & Heffron F. 1996. Contribution of fimbrial operons to

attachment to and invasion of epithelial cell lines by Salmonella Typhimurium. Infect.

Immun. 64(5):1862-1865

[9] Grether-Beck S1, Marini A, Jaenicke T, Krutmann J. Photoprotection of human skin

beyond ultraviolet radiation. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2014 Apr-

Jun;30(2-3):167-74. doi: 10.1111/phpp.12111. Epub 2014 Feb 19.

[10] Williams, G. T.; Smith C. A. “Molecular regulation of apoptosis: genetic controls on

cell death” Cell, 1993, 74, 777-779.

[11] Viola G1, Dall'Acqua F. Photosensitization of biomolecules by phenothiazine

derivatives. Curr Drug Targets. 2006 Sep;7(9):1135-54.

[12] Minami H, Sato K, Maeda T, Taguchi H, Yoshikawa K, Kosaka H, Shiga T, Tsuji T.

Hypoxia potentiates ultraviolet A-induced riboflavin cytotoxicity. J Invest Dermatol.

1999 Jul;113(1):77-81.

[13]. (Alan D. Elbein, Y.T. Pan, Irena Pastuszak, and David Carroll. New insights on

trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology 2003, vol. 13, no. 4 pp. 17R-27R.

[14] Schaich KM1 Metals and lipid oxidation. Contemporary issues. Lipids. 1992

Mar;27(3):209-18.

[15] Ayala A1, Muñoz MF1, Argüelles S1. Lipid peroxidation: production, metabolism,

and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxid Med

Cell Longev. 2014;2014:360438. doi: 10.1155/2014/360438. Epub 2014 May 8.

[16] Wlascheck et al., 2001; M. Wlascheck, I. Tantcheva-Poor, L. Naderi, W. Ma, S.

Alexander, Z. Razi-Wolf, J. Shuller, K. Scharffetter-Kochanek Solar UV irradiation and

dermal photoaging Journal of Photochemistry and Photobiology B, 63 (2001), pp. 41–

51.

.[17] MURPHY, G.M. An update on photoprotection. Photodermatol. Photoimmunol.

Photomed., v.18, p. 1-4, 2002.)

[18] Casagrande R, Georgetti S, Verri Jr W, Dorta D, dos Santos A, Fonseca M.

Protective effect of topical formulations containing quercetin against UVB-induced

oxidative stress in hairless mice. J Photochem Photobiol B Biol2006;84:21–7

[19]. UITTO, J.; BROWN, D.B.; GASPARRO F. et al. Molecular aspects of photoaging.

Eur. J. Dermatol., v. 7, n. 3, p.210-214, 1997

[20] Kim K1, Park H1, Lim KM1. Phototoxicity: Its Mechanism and Animal Alternative

Test Methods. Toxicol Res. 2015 Jun;31(2):97-104. doi: 10.5487/TR.2015.31.2.097.

[21] Niki Evidence for beneficial effects of vitamin E. Korean J Intern Med. 2015

Sep;30(5):571-9. doi: 10.3904/kjim.2015.30.5.571. Epub 2015 Aug 27.

[22] (Sigma Aldrich, Disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/ Acessado em

Outubro,2015.

[23] FRANCIS, F.J. Anthocyanins and betalains: composition and applications. Cereal

Foods World, v. 45, p. 208-213, 2000.

[24] Van Tits LJ, Demacker PN, De Graaf J, Hak-Lemmers HL, Stalenhoef AF. Alpha-

tocopherol supplementation decreases production of superoxide and cytokines by

leukocytes ex vivo in both normolipidemic and hypertriglyceridemic individuals. Am J

Clin Nutr 2000; 71:458-64.

[25] (Sigma Aldrich, Disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/ Acessado em

Outubro, 2015.

[26] Sadeghipour A1, Eidi M2, Ilchizadeh Kavgani A3, Ghahramani R4, Shahabzadeh

S3, Anissian A5. Lipid Lowering Effect of Punica granatum L. Peel in High Lipid Diet

Fed Male Rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:432650. doi:

10.1155/2014/432650. Epub 2014 Sep 10.

[27] Marino T1, Galano A, Russo N. Radical scavenging ability of gallic acid toward OH

and OOH radicals. Reaction mechanism and rate constants from the density functional

theory. J Phys Chem B. 2014 Sep 4;118(35):10380-9. doi: 10.1021/jp505589b. Epub

2014 Aug 21.

[28] Ruitenberg A, van Swieten JC, Witteman JCM, Mehta KM, van Duijn CM, Hofman

A & Breteler MMB (2002) Alcohol consumption and risk of dementia: the Rotterdam

Study. Lancet, 359, p. 281–286.

[29] Badgujar SB1, Patel VV1, Bandivdekar AH1.

Foeniculum vulgare Mill:a review of botany, phytochemistry, pharmacology, contempor

ary application, andtoxicology. Biomed Res Int. 2014;2014:842674. doi:

10.1155/2014/842674. Epub 2014 Aug 3.

[30] Ranjbar A1, Mohsenzadeh F2, Chehregani A2, Khajavi F3, Zijoud SM4, GhasemiH4.

Ameliorative effect of Matricaria chamomilla .L on paraquat: Induced oxidative damage

in lung rats. Pharmacognosy Res. 2014 Jul;6(3):199-203. doi: 10.4103/0974-

8490.132595.

[31] Singh O1, Khanam Z, Misra N, Srivastava MK.

Chamomile (Matricaria chamomilla L.): An overview. Pharmacogn Rev. 2011

Jan;5(9):82-95. doi: 10.4103/0973-7847.79103.

[32] Munir N1, Iqbal AS1, Altaf I2, Bashir R1, Sharif N1, Saleem F1, Naz S1.

Evaluation of antioxidant and antimicrobial potential of two endangered plant species A

tropa belladonna andMatricaria chamomilla. Afr J Tradit Complement Altern Med. 2014

Aug 23;11(5):111-7. eCollection 2014.

[33] (Sigma Aldrich, Disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/ Acessado em

Outubro, 2015. (Sigma Aldrich, 2015)

[34] Portella Rde L1, Barcelos RP, da Rosa EJ, Ribeiro EE, da Cruz IB, Suleiman

L, Soares FA.Guaraná (Paullinia cupana Kunth) effects on LDL oxidation in elderly

people: an in vitro and in vivo study. Lipids Health Dis. 2013 Feb 8;12:12. doi:

10.1186/1476-511X-12-12.

[35] Espinola EB, Dias RF, Mattei R, Carlini EA.

Pharmacological activity of Guarana (Paullinia cupana Mart.) in laboratory animals. J

Ethnopharmacol. 1997 Feb;55(3):223-9 Espinola et al, 1997).

[36] (Sigma Aldrich, Disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/ Acessado em

Outubro, 2015. Sigma Aldrich, 2015).

[37] Anderson KJ1, Teuber SS, Gobeille A, Cremin P, Waterhouse AL, Steinberg FM.

Walnut polyphenolics inhibit in vitro human plasma and LDL oxidation. J Nutr. 2001

Nov;131(11):2837-42.

[38] (Sigma Aldrich, Disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/ Acessado em

Outubro, 2015. (Sigma Aldrich, 2015, acessado em 2015)

[39] Sadeghipour A1, Eidi M2, Ilchizadeh Kavgani A3, Ghahramani R4, Shahabzadeh

S3, Anissian A5. Lipid Lowering Effect of Punica granatum L. Peel in High Lipid Diet

Fed Male Rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:432650. doi:

10.1155/2014/432650. Epub 2014 Sep 10.

[40] Middha SK1, Usha T, Pande V. HPLC Evaluation of Phenolic Profile, Nutritive

Content, and Antioxidant Capacity of Extracts Obtained fromPunica granatum Fruit

Peel. Adv Pharmacol Sci. 2013;2013:296236. doi: 10.1155/2013/296236. Epub 2013

Aug 1.

[41] Modaeinama S1, Abasi M, Abbasi MM, Jahanban-Esfahlan R. Anti Tumoral

Properties of Punica Granatum (Pomegranate) Peel Extract on Different Human

Cancer Cells. Asian Pac J Cancer Prev. 2015;16(14):5697-701.

[42] Connors, K. A.; Binding Constants: The Measurement of Molecular Complex

Stability, Wiley-Interscience: New York, 1987, p. 143-168

[43] (Sigma Aldrich, Disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/ Acessado em

Outubro, 2015. (Sigma Aldrich, 2015),

[44] Echigo R1, Shimohata N, Karatsu K, Yano F, Kayasuga-Kariya Y, Fujisawa

A, Ohto T, Kita Y, Nakamura M, Suzuki S, Mochizuki M, Shimizu T, Chung UI, Sasaki

N. Trehalose treatment suppresses inflammation, oxidative stress, and vasospasm

induced by experimental subarachnoid hemorrhage. J Transl Med. 2012 Apr 30;10:80.

doi: 10.1186/1479-5876-10-80.

[45] Elbein AD1, Pan YT, Pastuszak I, Carroll D. New insights on trehalose: a

multifunctional molecule. Glycobiology. 2003 Apr;13(4):17R-27R. Epub 2003 Jan 22.

[46] Hu JH1, Zan LS, Zhao XL, Li QW, Jiang ZL, Li YK, Li X. Effects

of trehalose supplementation on semen quality and oxidative stress variables in frozen-

thawed bovine semen. J Anim Sci. 2010 May;88(5):1657-62. doi: 10.2527/jas.2009-

2335. Epub 2010 Jan 15.

[47] Hu Y1, Xu J, Hu Q. Evaluation of antioxidant potential of aloe

vera (Aloe barbadensis miller) extracts. J Agric Food Chem. 2003 Dec 17;51(26):7788-

91.

[48] Boudreau MD1, Beland FA. An evaluation of

the biological and toxicological properties of Aloe barbadensis (miller), Aloe vera. J

Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev. 2006 Apr;24(1):103-54.

[49] Rajasekaran S1, Sivagnanam K, Subramanian S. Antioxidant effect of Aloe

vera gel extract in streptozotocin-induced diabetes in rats. Pharmacol Rep. 2005 Jan-

Feb;57(1):90-6.

[50] Benson KF1, Newman RA2, Jensen GS1.Antioxidant, anti-inflammatory, anti-

apoptotic, and skin regenerative properties of an Aloe vera-based extract of Nerium

oleander leaves (nae-8(®)).Clin Cosmet Investig Dermatol. 2015 May 6;8:239-48. doi:

10.2147/CCID.S79871. eCollection 2015.

[51] Hu Y1, Xu J, Hu Q. Evaluation of antioxidant potential of aloe

vera (Aloe barbadensis miller) extracts. J Agric Food Chem. 2003 Dec 17;51(26):7788-

91.Hu et al, 2003

[52] ( Martindale: The Complete Drug Reference. London: Pharmaceutical Press. 36th

edition, Thomson Micromedex, Greenwood Village, Colorado, USA. 2003.

[53] Al-Yahya AA1, Al-Majed AA, Gado AM, Daba MH, Al-Shabanah OA, Abd-Allah AR.

Acacia Senegal gum exudate offers protection against cyclophosphamide-induced

urinary bladder cytotoxicity. Oxid Med Cell Longev. 2009 Sep-Oct;2(4):207-13. doi:

10.4161/oxim.2.4.8878.

[54] Hilmi Y1, Abushama MF, Abdalgadir H, Khalid A, Khalid H. A study of antioxidant

activity, enzymatic inhibition and in vitro toxicity of selected traditional Sudanese plants

with anti-diabetic potential. BMC Complement Altern Med. 2014 May 7;14:149. doi:

10.1186/1472-6882-14-149.

[55] Rocha de Souza MC, Marques CT, Guerra Dore CM, Ferreira da Silva

FR, Oliveira Rocha HA, Leite EL. Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from

brown and red seaweeds. J Appl Phycol. 2007 Apr;19(2):153-160. Epub 2006 Nov 30.

[56] Fujimura T1, Tsukahara K, Moriwaki S, Kitahara T, Sano T, Takema Y. Treatment

of human skin with an extract of Fucus vesiculosus changes its thickness and

mechanical properties. J Cosmet Sci. 2002 Jan-Feb;53(1):1-9.

[57] Lee H1, Kim JS, Kim E. Fucoidan from seaweed Fucus vesiculosus inhibits

migration and invasion of human lung cancer cell via PI3K-Akt-mTOR pathways. PLoS

One. 2012;7(11):e50624. doi: 10.1371/journal.pone.0050624. Epub 2012 Nov 30.

[58] Nakchat O1, Nalinratana N1, Meksuriyen D1, Pongsamart S1. Tamarind seed coat

extract restores reactive oxygen species through attenuation of glutathione level and

antioxidant enzyme expression in human skin fibroblasts in response to oxidative

stress. Asian Pac J Trop Biomed. 2014 May;4(5):379-85. doi:

10.12980/APJTB.4.2014C806.

[59] Nie W1, Deters AM. Tamarind Seed Xyloglucans Promote Proliferation and

Migration of Human Skin Cells through Internalization via Stimulation of Proproliferative

Signal Transduction Pathways. Dermatol Res Pract. 2013;2013:359756. doi:

10.1155/2013/359756. Epub 2013 Sep

[60] Sundaram MS1, Hemshekhar M2, Santhosh MS3, Paul M1, Sunitha K1, Thushara

RM1, NaveenKumar SK1, Naveen S4, Devaraja S5, Rangappa KS6, Kemparaju

K1, Girish KS7. Tamarind Seed (Tamarindus indica) Extract Ameliorates Adjuvant-

Induced Arthritis via Regulating the Mediators of Cartilage/Bone Degeneration,

Inflammation and Oxidative Stress. Sci Rep. 2015 Jun 10;5:11117. doi:

10.1038/srep11117.

[61] Lima, D.U. Polissacarídeos de reserva de parede celular em sementes. Estrutura,

metabolismo, funções e aspectos ecológicos. Revista Brasileira de Fisiologia

VegetalVolume 12, Pág 137, 2000.

[62] MARZZOCO, Anita & TORRES, Bayardo Baptista – Bioquímica Básica.

Guanabara Koogan. Rio de Janeiro, 2007. pp. 87-89.

[63] Polidori, M.C; Schulz, R.J. Nutritional contributions to dementia prevention: main

issues on antioxidant micronutrientes. Genes Nutr. 2014 Mar; 9(2): 382.Published

online 2014 Feb 18. doi: 10.1007/s12263-013-0382-2

[64] Milani M. e Julita, M.F. C. Utilização de Cultura de Anteras no Melhoramento de

Plantas. Campina Grande, 2005 26p. (Embrapa Algodão. Documentos, 145) [65] (Higa

e col, 2000).

[66] VACA, C.E., WILHEM, J., HARMS-RINGDAHL, M. Interaction of lipid peroxidation

products with DNA. Photochemistry and Photobiology. 1987, Vol. 46, pp. 147-160.

[67] BARBER, A.D., HARRIS, S.R., Oxygen free radicals and oxidants: a review. Amer.

Pharm., v.34, n.9, p.26-35, 1994.

[68] LASIC, D. D. Liposomes: from physics to applications. 1ª ed. Amsterdam:

Lipossômicas Compósitas de Fosfatidilcolina de Lecitina de Soja. (LASIC, 1993)

[69] MERTINS, O. Desenvolvimento e Caracterização de Nanovesículas Quitosana.

Dissertação de Mestrado em Química, UFRGS, Porto Alegre, 2004.

[70] (Sigma Aldrich, Disponível em: http://www.sigmaaldrich.com/ Acessado em

Outubro, 2015. Sigma Aldrich, 2015).

[71] Bacellar O.L. Membrane Damage Efficiency of phenothiazinium Photosensitizers.

Photochemical and Photobiological Sciences 2014, 90(4), 801-813)).

[72] EDWARDS, A. M., SILVA, E. Effect of visble light on selected enzymes, vitamins,

and amino acids. Journal of Photochemistry and Photobiology, v. 48, p.36-41, 1999a.

[73] EDWARDS, et al., Photochemical and pharmacokinetic properties of select flavins.

Journal of Photochemistry and Photobiology, v. 63, p.126-131.

[74] CAETANO, W. ET AL.; 2007. Photo-induced destruction of giant vesicles in

methylene blue solutions. Langmuir. 2007, Vol. 23(3), pp. 1307-1314.) Elsevier

Science Publishers B. V., cap.3, p.63-90, 1993.

[75] Liang, N.; Kitts, D. Antioxidant Property of Coffee Components: Assessment of

Methods that Define Mechanisms of Action, Food, Nutrition and Health, November

2014; DOI: 10.3390/molecules191119180 ·

[76] Dimitrios, B.; Trends Food Sci. Technol. 2006, 17, 505. 119.

[77] Abdille, M. D.; Singh, R. P.; Jayaprakasha, G. K.; Jena, B. S.; Food Chem. 2005,

90, 891.

[78] Huang, D.; Ou, B.; Prior, R. L.; J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 1841 (Huang, D. et

al)

[79] Singleton, V. L.; Orthofer, R.; Lamuela-Raventós, R. S.; Methods in Enzymol.

1999, 299, 152.

[80] Chu, B. - " Laser Light Scattering-Basic Principles and Practice" , AP, San Diego

(1991)

[81] Bacellar O.L. Membrane Damage Efficiency of phenothiazinium Photosensitizers.

Photochemical and Photobiological Sciences 2014, 90(4), 801-813)).

[82] ALCARDE, A.R.; BASSO, L.C.. Efeito da trealose na manutenção da viabilidade

de células de leveduras desidratadas por liofilização. Sci. agric., Piracicaba, v.54, n.3,

Sept. 1997. Disponível online em:

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-

90161997000200013&lng=en&nrm=iso . Acessado em 12 de Janeiro de 2016.

[83] VAN DEN BERG, R.; HAENEN, G. R. M. M.; VAN DEN BERG, H.; BAST, A.

Applicability of an improved Trolox equivalent antioxidant 93 capacity (TEAC) assay for

evaluation of antioxidant capacity measurements of mixtures. Food Chemistry, v. 66, p.

511–517, 1999.

[84] Rodrigues, D; Viotto AC, Checchia R, Gomide A, Severino D, Itri R, Baptista

MS, Martins WK. Mechanism of Aloe Vera extract protection against UVA: Shelter of

lysosomal membrane avoids photodamage Photochemical and Photobiological

Sciences 2016, 15(3), 334-350).

[85] Alan D. Elbein, Y.T. Pan, Irena Pastuszak, and David Carroll. New insights on

trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology 2003, vol. 13, no. 4 pp. 17R-27R.

[86] Villarreal MA1, Díaz SB, Disalvo EA, Montich GG. Molecular dynamics simulation

study of the interaction of trehalose with lipid membranes. Langmuir. 2004 Aug

31;20(18):7844-51);

[87] Cristina S. Pereira, Roberto D. Lins, Indira Chandrasekhar, Luiz Carlos G. Freitas,

and Philippe H. Hünenberger. Interaction of the Disaccharide Trehalose with a

Phospholipid Bilayer: A Molecular Dynamics Study. Biophys J. 2004 Apr; 86(4): 2273–

2285.

SÚMULA CURRICULAR

DADOS PESSOAIS

Nome: Daniela Rodrigues Silva Irecê-BA, 23 de Março de 1989.

EDUCAÇÃO

Escola Técnica Walter Belian São Paulo, Dezembro/2006. Universidade Nove de Julho São Paulo, Dezembro/2010. Graduação em Farmácia e Bioquímica

FORMAÇÃO COMPLEMENTAR

Escola Senai Fundação Zerrenner Análises químicas Industriais São Paulo, Julho/2008.

OCUPAÇÃO

Analista de Controle de Qualidade e Desenvolvimento Analítico na empresa Aché-Laboratórios Farmacêuticos, São Paulo, 2014 até o presente.

ATIVIDADES PROFISSIONAIS

Rodrigues, D; Viotto AC, Checchia R, Gomide A, Severino D, Itri R, Baptista MS, Martins WK. Mechanism of Aloe Vera extract protection against UVA: Shelter of lysosomal membrane avoids photodamage Photochemical and Photobiological Sciences 2016, 15(3), 334-350).