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Trabalhos Originais23 (9): 589-595, 2001RBGO

RESUMOObjetivos: comparar o desenvolvimento embrionário com o uso de dois métodos diferentesde cultura (meio seqüencial ou co-cultura em células Vero).Métodos: foram incluídas 110 pacientes que tiveram ovócitos aspirados e submetidos àfertilização in vitro. Metade das pacientes teve seus embriões cultivados juntamente comcélulas Vero e a outra metade em meio seqüencial G1:2/G2:2. Os embriões foram transferidosno dia 5 pós-fertilização, após avaliação morfológica, verificando-se a taxa de blastulação. Agravidez foi definida por meio de ultra-sonografia, verificando-se batimento cardíaco após a13a semana pós-transferência.Resultados: a taxa de blastocistos expandidos encontrada em nosso estudo foi de 15,9% e14% com células Vero e G1:2/G2:2, respectivamente. Com células Vero 36,0% das pacientesengravidaram com taxa de implantação de 18,9%. Quando se utilizou G1:2/G2:2 as taxas degravidez e implantação foram 28,9% e 14,9%, respectivamente. Em apenas 17 casos obtiveram-se blastocistos após co-cultivo em células Vero, apresentando 76,5% de taxa de gravidez e63,0% de implantação. Quando o cultivo foi em G1/G2 21 pacientes apresentaram blastocistose as taxas de gravidez e implantação foram de 57,1 e 76,0%, respectivamente.Conclusão: não houve diferença significativa entre as taxas de gravidez ou implantação nos2 tipos de cultivo. Nos casos em que blastocistos expandidos foram transferidos, as taxas deimplantação e gravidez aumentaram com ambos os tipos de cultivo. Nestas pacientes,independente do tipo de cultivo utilizado, um número maior de ovócitos foi obtido, o que nosleva a pensar que não apenas as condições de cultura influenciam as taxas de implantaçãoe gravidez, mas a qualidade dos óvulos também é importante, pois as “boas respondedoras”tiveram melhores resultados.

PALAVRAS-CHAVE: Fertilização in vitro. Infertilidade. Cultura de embriões.

Cultura de Embriões até o Estágio de Blastocisto: Comparaçãoentre o Uso de Meios Seqüenciais e de Co-Cultura

Embryo Culture to Blastocyst Stage:Comparison Using Sequential Medium and Coculture

Carlos Gilberto Almodin, Vania Cibele Minguetti-Câmara, Lis Andréa Cardoso Pereira

Materbaby – Reprodução Humana e Genética, Maringá, PRCorrespondência:Carlos Gilberto AlmodinAv. XV de Novembro, 123287013-230 – Maringá – PR

IntroduçãoAs condições de cultura de embriões huma-

nos têm sido responsabilizadas como principal fa-tor pelas baixas taxas de implantação e gravidez1.É difícil avaliar morfologicamente os efeitos dele-térios que os meios de cultura exercem sobre osembriões. Na tentativa de avaliar a viabilidade dos

embriões, muitos autores têm realizado a trans-ferência para o útero no dia 5 pós-fertilização emestágio de blastocisto, sendo sugerido por algunsque isto só é válido nos casos em que se tem gran-de número de embriões, ao passo que outros apói-am a idéia de que a sincronização do embrião como trato feminino é importante2,3. O principal pro-blema relacionado à transferência de blastocistosé conseguir condições de cultura adequadas parasuportar o desenvolvimento dos embriões até o dia5 ou 6 após a fertilização.

Há poucos anos foi focada atenção nos bene-fícios que a co-cultura, principalmente nos casosde falhas sucessivas de implantação, pudesse ofe-

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recer. Guerin e Nicolet4 relataram os resultadosde 11 grupos franceses, que após realizarem 1603culturas de embriões com outras células conse-guiram taxa de blastulação de 41,8% e taxas degravidez e implantação de 32,9 e 24,8%, respecti-vamente. Estes grupos utilizaram as células Vero,mas outros tipos celulares como células epiteliaisde oviduto bovino e humano5,6 ou fibroblastosuterinos bovinos7 parecem ter o mesmo efeitoquanto a melhorar o desenvolvimento do embrião.

Outros autores renovaram as esperanças demelhores taxas de gravidez com o advento dos meiode cultura seqüenciais livres de soro, formuladospara cultura do zigoto até a fase de blastocisto. Re-centemente, estudos sobre a fisiologia e metabo-lismo do embrião levaram ao uso de meios maispróximos às necessidades dos embriões. As mu-danças na composição dos meios incluem modifi-cações no conteúdo de carboidratos e aminoácidos,entre outras. Estes meios elevaram as taxas deformação de blastocisto a níveis superiores a 50%no dia 5 de desenvolvimento, e taxas de gravidez eimplantação superiores a 60 e 40%, respectiva-mente3.

Ainda existe muita controvérsia entre osautores quanto às melhores condições de cultura.Este estudo tem o intuito de comparar os resulta-dos da utilização de células Vero e meiosseqüencias no cultivo de embriões in vitro.

Pacientes e MétodosEste estudo envolveu 110 pacientes com ida-

de entre 23 a 45 anos, que durante o período defevereiro de 1999 a julho de 2000 procuraram aClínica Materbaby com infertilidade e foramindicadas para fertilização in vitro. Foram realiza-dos 110 ciclos, sendo subdivididos aleatoriamenteem dois grupos de 55 ciclos cada. A inclusão daspacientes no estudo ocorreu após consentimentoinformado prévio. Estas pacientes tiveram seusembriões co-cultivados em células Vero, célulasde cápsula renal de macacos Rhesus (Grupo 1) oumantidos em meio seqüencial (Grupo 2), sendo osgrupos determinados por sorteio aleatório, inde-pendente de idade ou causa da infertilidade. Acausa da infertilidade em 53 casos foi o fator mas-culino. Nos casos restantes, as causas de inferti-lidade feminina incluíram endometriose (12), fa-tor tubário (14), esterilidade sem causa aparente(29 casos) e 4 casos de falência ovariana, que uti-lizaram doação de óvulos.

A estimulação ovariana foi iniciada após blo-queio hipofisário com acetato de leuprolida(Lupron, TAP Pharmaceutical, Abbott Laboratories,

Chicago, IL, USA), 0,15 mL/dia, iniciado entre ovigésimo primeiro e o vigésimo terceiro dia do ci-clo menstrual e mantido até o início da menstrua-ção seguinte. No terceiro dia de sangramento erainiciada a indução, com redução do Lupron para0,05 mL/dia, e a estimulação ovariana era inicia-da com hormônio folículo-estimulante (Metrodin,Serono, São Paulo, SP, Brasil) na dose de 150-225UI/dia ou gonadotrofina menopausal humana(Menogon, Ferring, São Paulo, SP, Brasil), 75-225UI/dia. O crescimento folicular foi monitorado so-mente por ultra-sonografia endovaginal. Foi admi-nistrada gonadotrofina coriônica humana (HCG,10.000 UI, Profasi, Serono) quando pelo menos 3folículos com 20 mm de diâmetro foram observa-dos. Os ovócitos foram aspirados 34-36 horas apósa injeção de HCG usando punção ovarianatransvaginal guiada pelo ultra-som.

Os ovócitos colhidos foram lavados em D-PBS(Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA), trans-feridos para placas contendo meio de culturaMénézo B2 (Laboratorie CCD, Paris, França) emantidos em incubadora (Forma, modelo 3159) a37°C, com atmosfera contendo 5% de CO2 e umi-dade de 97%. O sêmen foi preparado por meio degradiente descontínuo de Percoll (55/90%,Pharmacia, Uppsala, Sweden). Nos casos de infer-tilidade por fator masculino os ovócitos foram sub-metidos à injeção intracitoplasmática. Tal proce-dimento era realizado 3 a 6 horas após a coletados ovócitos, quando estes eram desnudados como auxílio de hialuronidase (H-3757, Sigma, St.Louis, MO, USA). Nos casos nos quais os parâme-tros do sêmen eram adequados foi realizada ainseminação dos ovócitos com 100.000espermatozóides/mL.

Quando era realizada a micromanipulação,utilizava-se microscópio invertido Diaphot 300(Nikon, Japão) com contraste de fase Hoffman, sobaumento de 400X. O microscópio era equipado commicromanipuladores hidráulicos MMO-204D einjetores IM6 (Narishige, Tokyo, Japan). Duranteo procedimento um único espermatozóide era iden-tificado, imobilizado e aspirado a partir de uma gotade meio de cultura tamponado HTF (IrvineScientific, Santa Ana, CA, USA) contendopolivinilpirrolidona (Irvine Scientific). Os ovócitosforam mantidos por uma pipeta de sustentação,enquanto o espermatozóide era injetado.

A confirmação da fecundação era verificada15 a 18 horas após a fertilização e os embriõescom 2 pró-núcleos (PN) eram depositados sobre amonocamada de células Vero cultivadas em meiode cultura Ménézo B2 com 10% de soro sintético(Irvine) ou em meio G1:2 com soro albumina hu-mana a 5% (Irvine). O congelamento dos embri-ões em pró-núcleo foi realizado segundo protoco-

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lo proposto por Check et al.8, não obedecendo aum padrão, sendo realizado segundo o históricode cada paciente.

As placas contendo células Vero eram pre-paradas previamente, sendo descongeladas ourepicadas a partir de outros frascos mantidos emestufa. Quando descongeladas, as células eramlavadas e diluídas de modo a obter-se concentra-ção de 200.000 a 400.000/mL. O repique era rea-lizado com o auxílio de tripsina (T-8642, Sigma)que descolava as células do fundo do frasco, sendoposteriormente lavadas e diluídas adequadamen-te. Eram mantidas a 37°C e 5% de CO2, alcançan-do a confluência de células dentro de 48 horas.

Os embriões eram mantidos em co-cultivoaté o dia 3 pós-fertilização, quando sofriam trocade cerca de 70% de seu meio de cultura por meionovo, sendo então mantidos até o dia 5. A transfe-rência uterina somente era realizada neste dia,quando pelo menos um dos embriões tivesse atin-gido o estágio de blastocisto. Caso contrário, eleseram mantidos por mais um dia em cultura.

Os embriões colocados em meios seqüên-cias permaneciam em placas contendo 50 µL demeio G1:2 cobertas com óleo mineral até o dia 3,quando eram transferidos para 50 µL de meio G2:2com soro albumina humana 5%, permanecendoaté o dia 5. Quando não havia a presença deblastocisto, trocava-se o meio G2:2 e a transferên-cia era realizada no dia 6.

Nos 2 grupos eram selecionados para atransferência apenas os embriões que não apre-sentassem sinal de bloqueio do desenvolvimento.Quando havia mais de 3 blastocistos para a trans-ferência, o restante era congelado, segundo proto-colo proposto por Ménézo et al.9.

A fase lútea foi suplementada com 50 mg/IM/dia de progesterona, 16 mg/dia demetilprednisolona e 80 mg/dia de ácido

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acetilsalicílico. A gravidez foi definida pela presen-ça de gestação viável e batimento cardíaco pre-sentes após a 13a semana pós-tranferência.

As variáveis qualitativas foram representa-das por freqüência absoluta (n) e relativa (%) e adiferença entre os dois grupos foi verificada peloteste do χ2. As variáveis quantitativas foram re-presentadas por média e desvio padrão (DP) e osdois grupos foram comparados em relação a essasvariáveis pelo teste t de Student para amostrasindependentes. Adotou-se o nível de significânciade 0,05 (α = 5%). Níveis descritivos (p) inferiores aesse valor foram considerados significantes emarcadas com *.

ResultadosDas 55 pacientes incluídas no Grupo 1, fo-

ram colhidos 435 ovócitos e destes, 362 (83,2%)foram inseminados e/ou fertilizados. Os restan-tes não estavam em metáfase II (MII) ou apre-sentavam alterações morfológicas. Após 18 h dafertilização foram observados 259 embriões(71,5%), sendo 182 (70,3%) mantidos em co-cul-tivo por 5 a 6 dias e 77 (29,7%) congelados quandoapresentavam 2 PN. Foram obtidos 50blastocistos/zigoto, atingindo uma taxa deblastulação de 27,5%, sendo que 29 destes (15,9%)eram blastocistos expandidos (BE). Apenas 148embriões foram transferidos após o término daco-cultura, para 50 pacientes, das quais 18engravidaram (36,0%). Em 3 casos não houveembriões viáveis para transferência e em 2 ca-sos não houve recuperação dos ovócitos. A taxade implantação foi de 18,9%, pois 28 sacosgestacionais com batimento cardíaco foram ob-servados à ultra-sonografia (Tabela 1).

Tabela 1 - Comparação entre o uso de G1/G2 e células Vero no cultivo dos embriões.

Número de pacientesMédia ± DP da idade em anosMédia ± DP do n° de ovócitos colhidosMédia ± DP do n° de embriões com 2 PNMédia ± DP do n° de embriões cultivados até D5 ou D6Média ± DP do n° de embriões transferidosTaxa de fertilização (% embriões com 2PN/ovócito em MII)Taxa de blastocistos desenvolvidos de 2PN (%)Taxa de BE desenvolvidos de 2 PN (%)Taxa de gravidez clínica/transferência (%)Taxa de implantação (% por saco gestacional)

Células Vero

5533,2 ± 4,9 7,9 ± 6,2 4,7 ± 4,3 3,3 ± 2,0 3,0 ± 1,6

71,527,515,936,018,9

G1/G2

5532,5 ± 5,2 6,7 ± 5,0 3,9 ± 3,3 3,8 ± 3,1 2,8 ± 1,8

70,237,714,028,914,8

PN = pró-núcleos; BE = blastocistos expandidos; MII = metáfase II.

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Em 17 pacientes obtiveram-se embriões noestágio de BE após co-cultivo (Grupo 1). Nestas pa-cientes foram colhidos 220 ovócitos, sendo 191(86,8%) em MII, e fertilizados 128 (67,0%). Os 79embriões co-cultivados desenvolveram 29blastocistos expandidos, sendo transferidos 27, pois

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2 foram congelados. Treze destas pacientesengravidaram (76,5%) e foram observados 17 sa-cos gestacionais com batimento cardíaco, sendo ataxa de implantação 63,0% se considerarmos ape-nas os BE transferidos (Tabela 2).

Tabela 2 - Comparação entre G1/G2 e células Vero nas pacientes que tiveram desenvolvimento a blastocisto expandido.

Número de pacientes (%)Média ± DP da idade em anosMédia ± DP do n° de ovócitos colhidosMédia ± DP do n° de embriões com 2 PNMédia ± DP do n° de embriões cultivados até D5 ou D6Média ± DP do n° de BE desenvolvidos de 2 PNTaxa de fertilização (% embriões com 2 PN/ovócitos MII)Taxa de gravidez clínica/transferência (%)Taxa de implantação/BE transferido (% por saco gestacional)

Células Vero

17 (30,9%)30,6 ± 4,712,1 ± 5,7 7,6 ± 4,5 4,6 ± 1,4* 1,7 ± 1,0

67,076,563,0

G1/G2

21 (38,2%)31,6 ± 4,910,2 ± 5,26,5 ± 2,86,3 ± 2,7*1,4 ± 0,8

75,157,176,0

* p < 0,05PN = pró-núcleos; BE = blastocistos expandidos; MII = metáfase II.

No Grupo 2 foram incluídas também 55 pa-cientes, obtendo-se 305 ovócitos em MII (82,2%),que foram inseminados ou submetidos a injeçãointracitoplasmática de espermatozóide (ICSI), e os66 ovócitos restantes (17,8%) foram descartados.Foram obtidos 214 embriões (70,2%) e apenas 7foram congelados em 2 PN. Dos 207 embriões cul-tivados, 78 chegaram ao estágio de blastocisto(37,7%), sendo 29 destes blastocistos expandidos(14,0%). Foram transferidos 128 embriões, sendoestes transferidos para 45 pacientes. Destas, 13engravidaram (28,9%). Em 6 casos houve falha decoleta de ovócitos, em 2 casos falha de fertilizaçãoe em 2 casos os embriões pararam o desenvolvi-mento muito precocemente. Foram observados 19sacos gestacionais com batimento cardíaco à ultra-sonografia, sendo a taxa de implantação de 14,8%.

Nas 21 pacientes que tiveram BE após culti-vo em G1:2/G2:2, foi obtido um total de 214 ovócitos,com 181 (84,6%) em MII. A taxa de fertilização foide 75,1% (136/181). Dos 132 embriões que perma-neceram em cultivo, 29 desenvolveram-se até oestágio de BE, sendo 25 destes transferidos e o res-tante congelado. A taxa de gravidez foi de 57,1%,pois 12 pacientes engravidaram. A taxa de implan-tação por BE transferido foi de 76,0%, com 19 sacosgestacionais com batimento cardíaco.

DiscussãoNa tentativa de obter embriões com maior

chance de implantação, muitos autores têm utili-zado meios seqüênciais no cultivo destes. A idéiado meio seqüencial baseia-se na divisão do perío-do pré-implantacional em 2 fases. A primeiracorresponde ao estágio de clivagem do embrião,caracterizado por níveis baixos de biossíntese, bai-xa capacidade respiratória e limitada capacidadede utilizar glicose como fonte de energia, pois afunção mitocondrial está diminuída. Já no perío-do pós-compactação aumentam as taxas debiossíntese, assim como a capacidade respirató-ria e a habilidade para utilizar glicose1. De acordocom as mudanças fisiológicas é importante con-siderar mudanças nas formulações dos meios.

A ocorrência do bloqueio de desenvolvimen-to em várias espécies coincide com a transição doestágio do oviduto para o útero. Embriões dehamster entram no útero com 4-8 células, cor-respondendo esta fase ao bloqueio de desenvolvi-mento in vitro. Embriões de coelho permanecemno oviduto até tornarem-se mórulas, a mesmaetapa na qual o bloqueio de desenvolvimento podeser induzido in vitro. O bloqueio de desenvolvimentotambém ocorre em mórula, em embriões de gato,o mesmo estágio no qual eles entram no útero10.Análises do fluido do oviduto e do útero ao longo dociclo hormonal revelam mudanças na concentra-ção de carboidratos tanto dentro do ciclo como en-tre o oviduto e o útero. Gardner e Lane2 verifica-ram que os níveis de glicose no oviduto são maisbaixos quando o ovócito/pré-embrião estão presen-tes (0,5 mM), ao passo que o piruvato está aumen-

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tado (0,32 mM) e no útero a glicose alcança umpico de 3,15 mM e o piruvato está bem diminuído(0,1 mM). Entretanto, deve-se levar em conside-ração que o ovócito e o pré-embrião são circunda-dos por células do cumullus que são muito ativasmetabolicamente e consomem glicose liberandopiruvato e lactato. Além disso, é importante con-siderar que o embrião de 2 células possui umtransportador específico para a glicose, indicandoalguma função fisiológica para esta hexose, tal-vez outra que não como fonte de energia. O desvioda utilização da glicose para outras vias pode le-var à biossíntese de importantes anabólitos parao embrião, e o caminho metabólico e nutrientespreferidos podem levar a vantagens no suporte dodesenvolvimento do embrião in vitro. Importantesreguladores do metabolismo energético são osaminoácidos. Os aminoácidos essenciais não pa-recem conferir nenhum benefício ao embrião atéo estágio de 8 células, e até podem resultar emperda de viabilidade2. Todos estes dados demons-trados a respeito do metabolismo do embrião jus-tificam a utilização dos meios seqüenciais.

Schoolcraft et al.11 mostraram recentemen-te taxas de gravidez e implantação, com o uso demeios seqüenciais, superiores às obtidas com ouso de co-cultivo por outros autores. Nosso traba-lho não mostrou diferença entre as taxas obtidasentre os dois tipos de cultivo. Há diferenças im-portantes entre o estudo de Schoolcraft et al.11 e onosso. A primeira é que nós usamos o G1:2/G2:2“comercial” no cultivo dos embriões, meio este quepassou por transporte e provavelmente oscilaçõesde temperatura que podem alterar a sua composi-ção e causar danos aos embriões. Outra diferençarelevante é que a média do número de zigotos/paciente foi menor e menos constante (4,0 ± 3,3 x12,9 ± 0,5) em nosso estudo. Isto ocorreu devido adiferenças no critério de inclusão e seleção depacientes. Apenas as pacientes “boas responde-doras”, com pelo menos 10 folículos ≥12 mm emdiâmetro no dia da injeção do HCG, foram incluí-das no estudo de Schoolcraft et al.11. Foram man-tidas no estudo, também, somente as pacientescom 4 ou mais ovócitos fertilizados, pois as pacien-tes com 3 ou menos zigotos tiveram seus embri-ões transferidos no dia 3 de desenvolvimento, di-ferente de nosso estudo, em que todas as pacien-tes, mesmo com menos de 3 pré-embriões, tive-ram a transferência no dia 5 pós-fertilização.

Pode-se verificar em nosso estudo que naspacientes que tiveram blastocistos expandidos ataxa de gravidez e implantação foi superior (Tabe-la 2) à estatística geral. Deve-se observar no en-tanto que estas pacientes tiveram número maiorde ovócitos colhidos, e portanto de embriões emPN, tanto com células Vero como com G1:2/G2:2

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(Tabela 2). Se considerarmos apenas as pacien-tes nas quais se obtiveram mais que 7 ovócitosem MII, observamos que 65% das pacientes comG1:2/G2:2 tiveram blastocistos expandidos e ape-nas 39% tiveram este êxito quando consideramostodas as pacientes. A taxa de pacientes que tive-ram blastocisto expandido com o uso de célulasVero também variou de 33 para 54% nas pacien-tes com mais de 7 ovócitos em MII (dados nãomostrados). Quando utilizamos células Vero, dei-xamos um número menor de embriões em cultivo(o restante foi congelado em PN), mas mesmo as-sim não houve diferença significativa no númerode blastocistos expandidos obtidos entre os dois gru-pos. Isto nos leva a acreditar que a qualidade dosovócitos, e não apenas o número, interfere com aobtenção de blastocistos expandidos. Pode-se veri-ficar então que quando incluímos pacientes “boasrespondedoras” nossa taxa de gravidez e implan-tação sofre um incremento significativo, indepen-dente do procedimento de cultivo utilizado.

Acredita-se que as células somáticas modifi-quem o meio de cultura de uma maneira consis-tente com a fisiologia do embrião. Os sistemas deco-cultura alteram o meio, seja pela secreção desubstâncias importantes ao desenvolvimento doembrião, como pela extração de impurezas ou re-dução de níveis de nutrientes do meio12. Esta redu-ção pode ser inclusive nos níveis de glicose, o queé consistente com a teoria do uso dos meiosseqüenciais. Mas um detalhe importante é queestas células têm sido utilizadas mesmo durante operíodo pós-compactação, quando a necessidade deglicose parece ser maior. Nas pacientes que tive-ram transferência em estágio de blastocisto expan-dido, foi observada tendência a uma maior taxa deimplantação quando o meio G1:2/G2:2 foi utilizado(Tabela 2), sugerindo melhor qualidade destesblastocistos, mesmo não bem evidenciada morfolo-gicamente, em relação ao co-cultivo. Além disso,comparando-se o resultado entre transferência nodia 3 ou dia 5 pós-fertilização após o uso de célulasVero se não encontraram diferenças significativasnas taxas de gravidez ou implantação13. O mesmotem sido evidenciado quando se utilizam meiosseqüenciais, tendo muitos autores optado por cul-tura de longa duração apenas nos casos em que setem um número grande de embriões para selecio-nar aqueles a serem transferidos.

Grande importância tem sido dada ao co-cultivo devido à secreção de fatores de crescimentopelas células. Kurachi et al.14 determinaram quea presença de EGF e TGF-α são importantes parao desenvolvimento de embriões de camundongo.A adição de anticorpos monoclonais para os re-ceptores dos mencionados fatores de crescimentoreduziram o desenvolvimento a blastocistos, en-

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tão indiretamente sugerindo que estes fatores sãonecessários. Sargent et al.15 sugerem a produçãode meios de cultura definidos, sem soro esuplementados com fatores de crescimento. A adi-ção de fatores ao meio de cultura promove o de-senvolvimento de blastocistos in vitro de um gran-de número de espécies16-18. Dunglison et al.19 au-mentaram a formação de blastocistos humanos de18,4 para 43,6% após a adição de LIF ao meio (1000UI/mL). Este incremento às taxas de formação deblastocistos utilizando o LIF também foi observadopor outros autores20,21, mas existem controvérsi-as quanto à melhoria no desenvolvimento embrio-nário22. Martin et al.23 cultivaram embriões hu-manos em um meio modificado, com níveis redu-zidos de glicose e lactato e adição de aminoácidosessenciais, aumentando a taxa de formação deblastocistos de 40,7 para 45,5%, mas na presençade 1 nM de “heparin-binding epidermal growthfactor” (HB-EGF) a taxa foi aumentada para 65,4%e com 100 nM de HB-EGF foi para 71,0%, sendoque 81% destes embriões alcançaram o “hatching”.Não houve diferença na qualidade dos blastocistos,entretanto são necessárias mais investigaçõesquanto à normalidade destes embriões antes douso clínico23. Além dos fatores de crescimento e/ou citocinas, uma variedade de lipídeos, incluin-do ácidos graxos livres, triglicerídeos efosfolipídeos, têm sido sintetizados e liberados nomeio de cultura pela co-cultura, além de enzimasantioxidantes que podem aumentar o desenvolvi-mento embrionário pela metabolização de radicaislivres12.

Apesar dos grandes avanços nas técnicas dereprodução humana nos últimos anos, as taxasde gravidez ainda são insatisfatórias e estudosainda serão necessários para elucidar melhor osaspectos fisiológicos e metabólicos dos embriões.Dividir as exigências metabólicas do embrião ape-nas em 2 fases, pré- e pós-compactação, talvez sejainsuficiente. Quanto aos fatores de crescimento,talvez eles sejam necessários apenas em deter-minados estágios de desenvolvimento do embrião,e talvez possam causar efeitos deletérios se usa-dos inapropriadamente. Um ponto parece ser deconsenso entre os autores: a necessidade da trans-ferência de embriões morfologicamente saudáveis,independentemente do estágio em que for feita atransferência. Pode-se comprovar pela Tabela 2que quando as pacientes tiveram bons embriõespara a transferência, ou seja, blastocistos expan-didos, tiveram taxas de gravidez aumentadas, sejacom o uso de células Vero ou G1:2/G2:2. As taxasde implantação também aumentam, principal-mente porque apenas embriões morfologicamen-te ideais foram transferidos.

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SUMMARYPurpose: to compare the embryonic development obtainedwith two different culture methods (sequential medium orcoculture in Vero cells).Methods: oocytes were recovered from 110 patients andsubmitted to in vitro fertilization. The embryos of half of thepatients were co-cultured with Vero cells and the embryos ofthe other half were cultured in sequential G1:2/G2:2 mediumfor five days. The embryos were transferred on the 5th dayafter fertilization after morphological evaluation for thedetermination of blastula formation rate. Pregnancy wasdefined by ultrasonography and a fetal heartbeat wasdetermined 13 weeks after transfer.Results: the expanded blastocyst rate found in our study was15.9 and 14% with Vero cells and G1:2/G2:2, respectively.With Vero cells 36.0% of patients became pregnant and theimplantation rate was 18.9%. When G1:2/G2:2 was used,the pregnancy and implantation rates were 28.9 and 14.9%,respectively. Only 17 patients had blastocysts after coculturein Vero cells, with a 76.5% pregnancy rate and a 63.5%implantation rate. When embryos were cultured in G1/G2,21 patients presented blastocysts and the pregnancy andimplantation rates were 57.1 and 76.0%, respectively.Conclusion: there was no significant difference in pregnancyor implantation rates between the 2 types of culture. Whenexpanded blastocysts were transferred, the implantation andpregnancy rats increased with both culture types. In thesepatients, regardless of the type of culture used, a largernumber of oocytes was obtained, suggesting that theimplantation and pregnancy rates are affected not only bythe culture conditions but also by the quality of the eggs,since “good responders” had better results.

KEY WORDS: In vitro fertilization. Infertility. Embryo culture.

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