Cultivo de protozoários

B2

3

As parasitoses, causadas por protozoários, constitui a etiologia de milhares de óbitos anuais e, em muitos casos, a falta de saneamento, o grau de instrução e a falta de higiene da população podem favorecer a transmissão e a manutenção desses patógenos em uma comunidade. Por causar tantas mortes e problemas na saúde pública meios que facilitem o estudo deste parasito fazem-se importantes.

Entamoeba histolytica

Cultivo Axênico (sem presença de nenhuma bactéria)

MEIO TRYPTICASE-YEAST EXTRACT-IRON-SERUM (TYI-S-33)

O meio de Diamond, Harlow e Cunnick (Trypticase-Yeast Extract-Iron-Serum —TYI-S-33) é provavelmente o mais usado para o crescimento axênico de E. histolytica e de outras espécies de Entamoeba.

A E. histolytica, é o agente da amebíase intestinal e hepática (extra-intestinal)

B2

3

Caldo Nutritivo (TYI)

Trypticase (BBL) 20gExtrato de levedo (BBL) 10gGlicose 10gL-cisteína, cloreto monoidratado 1gÁcido ascórbico 0,2gCloreto de sódio 2gHidrogenofosfato dipotássico anidro 1gDiidrogenofosfato de potássio 0,6gCitrato férrico amoniacal 22,8mgÁgua destilada-deionizada 870mlpH 6,8

Amostras:

-Fezes frescas ou culturas pré-existentes

Inoculação e Cultivo – (culturas pré-existentes)

As culturas selecionadas são mergulhadas em banho de gelo por cinco a 10 minutos e invertidas várias vezes para desalojar e dispersar as amebas da superfície interna do tubo.

Inocular, assepticamente, 0,5 a 1ml da cultura em tubos com meio fresco.

Incubar os tubos a 35°C, na posição inclinada (ângulo de 5° a 10°), com as tampas fortemente fechadas, por 48 horas.

Giardia lamblia

A G. lamblia é um organismo anaeróbio aerotolerante. Os meios de cultura contendo agentes tiorredutores em sua formulação, como a cisteína e a bile de mamíferos, favorecem o crescimento axênico dos trofozoítos desse organismo isolado do homem e de outros animais. A cisteína e os outros agentes tiorredutores protegem os trofozoítos contra os efeitos letais do oxigênio molecular;

Cultivo Axênico (sem presença de nenhuma bactéria)

MEIO TRYPTICASE-YEAST EXTRACT-IRON-SERUM (TYI-S-33)MODIFICADO (BIOSATE-IRON-SERUM) (BI-S-33)

O meio Trypticase-Yeast Extract-Iron-Serum (TYI-S-33) modificado(Biosate-Iron-Serun) (BI-S-33) é indicado para o isolamento e cultivo de trofozoítos de Giardia lamblia.

AmostraFezes frescas

Meio de CulturaBiosate (BBL) 3gGlicose 1gCloreto de sódio 200mgDiidrogenofosfato de potássio 60mgHidrogenofosfato dipotássico anidro 100mgL-cisteína, cloridrato 200mgÁcido ascórbico 20mgCitrato férrico amoniacal 2,28mgBile bovina desidratada 25mgÁgua destilada-deionizada 87ml pH 7,0-7,2

Soro de bovino adulto estéril e inativado (3 min-56°C) 15mlPenicilina G potássica 100.000UISulfato de estreptomicina 100mg

MEIO DE KEISTER (MODIFICAÇÃO DO MEIO TRYPTICASE-YEAST - EXTRACT-IRON-SERUM (TYI-S-33)

O meio de Keister é indicado para o cultivo e o isolamento de trofozoítos de Giardia lamblia.

AmostraAspirado de jejuno.

1. Diidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)2. Hidrogenofosfato dipotássico anidro (K2HPO4)3. Peptona (digerido de caseína) (BBL)4. Extrato de levedo (Difco)5. Glicose6. Cloreto de sódio (NaCl)7. L-cisteína, cloridrato8. Ácido ascórbico9. Citrato férrico amoniacal (pó marrom)10. Bile bovina desidratada (Sigma B-8381)

Meio de Cultura

Isolamento

1. Centrifugar o aspirado do jejuno em frasco estéril, ressuspendendo o sedimento com o meio de cultura.

2. Transferir a suspensão para tubo estéril com tampa de rosca e adicionar suficiente meio para completar 90-95% da capacidade total do tubo.

3. Incubar as culturas à temperatura de 35°C e examinar diariamente até uma semana.

4. Trocar o meio de cultura a cada três a quatro dias pela decantação do meio velho e substituição por meio fresco e completo.

Trypanosoma cruzi e Leishmania spp.

Os tripanossomatídios patogênicos podem ser isolados e cultivados em uma variedade de meios líquidos ou mistos (bifásicos) que contenham hemina ou seus derivados.

Trypanosoma cruzi

Até a década de 1970 uma das grandes dificuldades de realizar trabalhos com o T. cruzi era a falta de um meio de cultura apropriado de fácil preparação, que pudesse ser utilizado por diferentes pesquisadores e laboratórios, permitindo a comparação dos resultados obtidos. Nesse caso, o problema foi objeto da primeira Reunião sobre Pesquisa Básica em Doença de Chagas, realizada em 1974 em Caxambu (MG), onde o meio Liver InfusionTryptose (LIT), idealizado por Yeager e modificado por Camargo, foi escolhido como meio de cultura padrão para o cultivo do parasito.

MEIOS DE CULTURA

Entre os vários meios de cultura atualmente disponíveis, o mais utilizado para o cultivo de T. cruzi é o meio LIT, acrescido de diferentes concentrações de SBF (soro bovino fetal), ou ainda associado a outros meios de cultivo.

Outro meio de cultura muito utilizado, principalmente no isolamento de tripanossomatídios patogênicos, é o meio MacNeal, Novy e Nicolle (NNN). Este meio é extremamente rico em nutrientes, sendo particularmente útil para o isolamento, a manutenção e o crescimento de certas amostras de T. cruzi e de Leishmania spp. de difícil crescimento in vitro. Um meio muito utilizado na manutenção de Leishmania spp. in vitro é o meio Brain Heart Infusion (BHI).

MEIO LIVER INFUSION TRYPTOSE (LIT)

Reagentes

1. Liver Infusion Broth, pó (Difco 0269-17-7)2. Tryptose (Difco)3. Hemina (Sigma H2250)4. Trietanolamina (Sigma T1377)5. Hidrogenofosfato dissódico anidro (Na2HPO4)6. Cloreto de potássio (KCl)7. Cloreto de sódio (NaCl)8. Glicose (C6H12O6)9. Ácido fosfórico (H2PO4)10. Soro bovino fetal estéril inativado (SBF)11. Penicilina G potássica12. Sulfato de estreptomicina

MEIO MACNEAL, NOVY E NICOLLE (NNN)

O meio de MacNeal, Novy e Nicolle (NNN), conhecido como ágar-sangue, é uma das melhores escolhas para o isolamento e manutenção de tripanossomatídeos patogênicos. O meio é bifásico, composto de uma base de ágar sangue e complementado com o meio Liver Infusion Tryptose (LIT).

Reagentes

1. Bacto-Ágar (Difco 1545-01)2. Cloreto de sódio (NaCl)3. Sangue desfibrinado de coelho

MEIO BRAIN HEART INFUSION (BHI)

O meio BHI tem sido intensamente utilizado, com sucesso, no cultivo de diferentes espécies de Leishmania spp. O meio é simples e barato, de fácil preparação.

O meio BHI, assim como os meios anteriormente descritos, deve ser suplementado com soro bovino fetal estéril inativado (SBF) e hemina a fim de sustentar o crescimento das diferentes espécies do gênero Leishmania. O meio pode ainda ser utilizado em conjunto com o meio LIT ou com uma base de ágar como a utilizada no meio NNN.

Reagentes1. Brain Heart Infusion (BHI), pó (Difco 0037-17-8)2. Solução de hemina (2mg/ml) (C34H32ClFeN4O4)3. Água destilada-deionizada

Plasmodium falciparum

As quatro espécies reconhecidas de Plasmodium que causam a malária no homem são: o Plasmodium vivax, o P. malariae, o P. falciparum e o P. ovale.

Dessas quatro espécies de plasmódio causadoras de malária humana, apenas o P. falciparum é passível de ser mantido e reproduzido em cultura in vitro.

A técnica original sofreu modificações no decorrer dos anos. Entretanto, o procedimento é relativamente simples, consistindo em manter eritrócitos humanos infectados com o protozoário em meio de cultura sintético, enriquecido com soro humano (ou de coelho) e mantidos à temperatura de 37°C e em atmosfera de 3% a 4% de dióxido de carbono (CO2) e 16% de oxigênio (O2).

Plasmodium falciparum

Todos os procedimentos relativos à cultura do parasito devem ser realizados, em condições de assepsia total, em capela de segurança biológica, com material esterilizado, a fim de manter as condições de assepsia essenciais para evitar a contaminação por fungos e bactérias. Uma vez que é possível a infecção acidental por plasmódio e que, mesmo em cultivo, os parasitos permanecem infectantes, todas as normas de biossegurança devem ser seguidas e observadas.

Plasmodium falciparum

MEIO DE CULTURA DE TRAGER E JENSEN (RPMI 1640)Reagentes

1. RPMI 1640 (Gibco)2. Tampão HEPES (Calbiochem) 25mM3. Gentamicina4. Hipoxantina 5. L-glutamina 6. Plasma humano dos grupos A ou AB7. Solução de hidrogenocarbonato de sódio 5% (NaHCO3)8. Dimetilsulfóxido (DMSO)9. Glicerol (Glicerina)10. Glicose11. Cloreto de sódio (NaCl)12. Heparina13. Citrato-fosfato-dextrose (CPD)14. Corante de Giemsa

Implantação da Cultura de Plasmodium falciparum

A implantação da cultura é feita a partir de sangue obtido de paciente portador de malária causada pelo P. falciparum. Colher, com tubo a vácuo heparinizado por punção venosa, 10ml de sangue. Centrifugar o sangue total e desprezar o plasma e a camada de leucócitos. Lavar os eritrócitos em dois ciclos de centrifugação, com o meio RPMI. Ressuspender os eritrócitos parasitados com igual volume de RPMI (v/v). Distribuir a suspensão em placas de Petri, novas, estéreis e descartáveis. Incubar à temperatura de 37°C, em atmosfera de aproximadamente 5% de CO2 e baixa oxigenação, a qual é conseguida pela queima de uma vela em dessecador.

Manutenção das Culturas

A manutenção das culturas é feita pela troca diária do meio de cultura RPMI e pelo acompanhamento da parasitemia através de esfregaços sangüíneos delgados (estirados) corados pelo método de Giemsa. As culturas devem ser diluídas com eritrócitos não-infectados quando a parasitemia atingir 10%.

CRIOPRESERVAÇÃO DE CEPAS DE P. falciparum

Quando o sistema de cultura do P. falciparum estiver estabelecido, é recomendada a criopreservação dos organismos em nitrogênio líquido (-196°C).

Esse procedimento permite a manutenção de cepas sabidamente adaptadas em cultura, assim como a manutenção de grande quantidade de antígenos para uso futuro.

Modelos de laudos EPF

Quem trouxe?

EXAME MICROSCÓPICOPesquisa de cistos: ________________________________ _____________________________________________

Pesquisa de ovos: ____________________________________ _____________________________________________

Pesquisa de larvas: ________________________________ _____________________________________________