CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

( CCD)

Bruno Henrique Ferreira

José Roberto Ambrósio Jr.

CROMATOGRAFIA

• Método usado para separar, identificar e quantificar componentes de uma mistura;

• Método físico-químico que utiliza distribuição dos componemtes em duas fases em contato íntimo:– fase estacionária: sólido, líquido ou gel; pode

ser: introduzida numa coluna ou espalhada como um filme (suporte cromatográfico);

– fase móvel: líquido ou gás;

Tipos de Cromatografia

• Em Papel;• Em Camada Delgada;• Por Adsorção;• Por Troca Iônica;• Por Exclusão;• Gasosa;• Líquida de Alta Eficiência.

Cromatografia em Papel

• Utiliza pequena quantidade de amostra;• Aplicada na separação e identificação de

compostos polares;– antibióticos hidrossolúveis;– ácidos orgânicos;– íons metálicos.

• Classifica-se como: por partição ou planar líquido-líquido.

Cromatografia por Adsorção

• Método cromatográfico líquido-sólido;• Utiliza-se uma coluna recheada com um

sólido (fase estacionária) e uma fase líquida, onde a sorção isotérmica refere-se a um aumento da concentração do material (que está em excesso na fase móvel) entre as superfícies das fases móvel e estacionária.

Cromatografia Por Troca Iônica• Cromatografia em coluna recheada;• Utilizada para suavizar a dureza da água;

Cromatografia Por Exclusão• Distribuição seletiva e dinâmica das moléculas do soluto entre duas fases líquidas separadas, dependentes de uma estrutura estacionária contendo poros de tamanho controlado;

•o recheio é constituído por macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes

Cromatografia Gasosa

• Separação de Gases ou substâncias volatilizáveis;

• Baseia-se na diferente distribuição das substâncias da amostra entre as fases.

• A amostra é introduzida por injeção na coluna contendo a fase estacionária.

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ( HPLC)

• Cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, cheias de material especiais e fase móvel que é eluida sob altas pressões.

• Realiza separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos .

• Alta resolução, eficiência e sensibilidade.

ADSORVENTES

• Importância na sua eficiência: tamanho e área superficial das partículas, sendo estes fatores determinantes na fixação doadsorvente na placa cromatográfica.

• Tipos: sílica, alumina, pó de celulose, pó de poliamida, etc.

SÍLICA GEL• adsorvente mais utilizado;• preparada pela polimerização de sílica

desidratada;• poros de 10-1500 ângstrons de diâmetro;• área superficial de 200-1000 m2/g;• temperatura de ativação de 150-200ºC;• usado para separar aminoácidos, alcalóides,

açúcares, ácidos graxos, lipídeos, óleos essenciais, cátions e ânions inorgânicos, esteróides

ALUMINA• apresenta-se em várias formas que diferem

entre si pela área superficial, energia da superfície, tamanho dos poros e, conseqüentemente, em suas propriedades cromatográficas;

• área superficial: 50-250 m2/g;• usado para separar: alcalóides, fenóis,

esteróides, vitaminas, carotenos e aminoácidos.

VANTAGENS CCD

• insuperável flexibilidade dos sistemas cromatográficos: irrestritas mudanças de solventes, otimizando a seletividade;

• as análises de várias amostras podem ser feitas simultaneamente;

• pode-se especiar a análise para um determinado componente de interesse;

VANTAGENS CCD

• a análise pode ser feita sob diferentes condições;

• baixo custo: pequena quantidade de amostra;

• rápido: análises simultâneas.

DESVANTAGENS CCD

• poder de resolução limitado;• por constituir um sistema aberto, depende

de fatores ambientais: influência da umidade relativa na camada hidrofílica, podendo haver contaminação por impurezas do ar, volatilização, oxidação e fotossensibilidade.

PREPARAÇÃO DAS CROMATOPLACAS

• limpeza: água e detergente;• secagem: em estufa;• aplicação do adsorvente: em suspensão do

adsorvente com solvente volátil:– espalhamento da suspensão com bastão de

vidro (camada não uniforme);– uso de espalhadores (camada uniforme)

PREPARAÇÃO DAS CROMATOPLACAS

– por imersão na suspensão (camada uniforme)– placas pré-fabricadas: custo elevado;Obs: camada uniforme: menoresquantidades de amostra e maior rapidez no

desenvolvimento dos cromatogramas.

ATIVAÇÃO DAS PLACAS

• temperaturas e tempos elevados tornamadsorventes mais ativos.

• sílica, alumina: 105-110ºC por 30-60min.• Este processo promove a remoção de vapor

d’água e outros resíduos possivelmente adsorvidos na placa.

SELEÇÃO DA FASE MÓVEL

O solvente ou mistura de solventes:• não deve reagir com o adsorvente;• deve interagir de forma diferente com cada

componente da mistura (diferente força de eluição), levando-se em conta sua polaridade, dentre outras propriedades.

APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS

• amostras na forma de soluções em solventes bastante voláteis;

• utilizando-se uma micropipeta, aplica-se 1 gota de amostra a 1,5-2cm acima do nível inicial do solvente.

• distância entre as amostras: 1-1,5cm• faz-se uma marca a 1-1,5 cm da borda

superior da cromatoplaca.

PREPARAÇÃO DA CUBA

• introduz-se solvente até altura de 0,5-1cm:– colocar papel de filtro nas paredes e tampar a

cuba para haver mais eficiente saturação da cuba com os vapores do solvente.

DESENVOLVIMENTO • introduz-se a cromatoplaca levemente

inclinada, com as amostras aplicadas, jásecas, na cuba saturada de vapor de solvente, tampando-a em seguida;

• observa-se o deslocamento do solvente, o qual elui as amostras, finalizando-se o processo quando o solvente atingir a marca estabelecida próxima à borda superior da cromatoplaca, retirando-a da cuba rapidamente e secando-a.

REVELAÇÃO

Tornar visíveis as substâncias incolores presentes nas amostras:

• luz UV, tornando as manchas fluorescentes;• adsorventes impregnados com reagentes

fluorescentes;• borrifação com H2SO4 ou H2SO4/KMnO4 e

aquecimento a 100-120ºC;• exposição a vapores de I2 em recipiente

fechado.

FATOR DE CAPACIDADE OU RETENÇÃO (k´)

• Razão da distância percorrida pelo analitoentre FE/FM.

• Quanto maior seu valor, maior afinidade do analito pela FE em relação à FM.

FATOR DE SELETIVIDADE (ALFA)

• é a razão entre o fator de retenção de 2 analitos.

• quanto maior seu valor, mais fácil a separação.

• alfa=1, não há separação

FATOR DE EFICIÊNCIA (N)

• relação entre o tempo de permanência do analito no sistema e o alargamento da banda cromatográfica.

• quanto mais difícil a separação (alfa pequeno), maior o N necessário para realizar a separação.

Características da mancha

• A mancha deve ser: Compacta, redonda ou oval.

• As causas das manchas assimétricas (caudas) são: – Insolubilidade na Fase Móvel. – Adsorção forte na Fase Estacionária.– Aplicação de quantidade muito grande da

amostra.– Dissociação.

Para Aumentar a Reprodutibilidade

• Saturação da cuba cromatográfica;• Qualidade e quantidade da Fase Móvel;• Atividade da Fase Estacionária;• Qualidade da Fase Estacionária;• Espessura da camada delgada;• Técnica e condição da Fase móvel

(desenvolvimento, temperatura, distância percorrida pela Fase Móvel, quantidade da amostra).

DOCUMENTAÇÃO

• Fotografia;• Scaneamento;• Xerox;• Determinação dos valores de Rs e Rf.