CRIOPRESERVAÇÃO DE OÓCITOS

Mestrado em Ensinoda Biologia e Geologia

2010/11

Cecília Antão

BIOLOGIA COMPLEMENTAR

Criopreservação

Um bom protocolo de criopreservação deve evitar:

formação de cristais de gelo efeito de solutos choque osmótico

Conservação de células, tecidos, órgãos ou embriões, por congelamento

Como se formam os cristais de gelo intracelular?

Células estáveis a -196˚C

(N2 líquido)

Água intracelular (temp. ambiente)

Descida da temperatura< 0˚C

GELO

Os cristais de gelo ocupam um volume superior

ao da água líquida

Expansão do gelo pode provocar danos nos organitos celulares ;

evitada por congelação muito rápida

Efeito de solutos

Choque osmótico : quando o reaquecimento é lento, há o risco

da água livre descongelar e recristalizar e, assim, provocar

mais danos à célula

Pressão osmótica

HIPERTÓNICA ISOTÓNICA HIPOTÓNICA

Criopreservação células/oócitos N2

líquido reaquecimento fusão do gelo osmolaridade

ponto de congelação da fase líquida

temperatura

CRIOPRESERVAÇÃO

CONGELAÇÃO VITRIFICAÇÃO(N2 líquido)

RÁPIDA(N2 líquido)

LENTA

SLOW –FREEZE VÁRIOS PROTOCOLOS MAS TODOS INCLUEM:

Exposição a crioprotectores Descida programada da temperatura Limitação da formação de cristaisintracelulares de gelo

CRIOPROTECTORES

PERMEÁVEIS(DMSO,propilenoglicol,glicerol, etilenoglicol)

NÃO PERMEÁVEIS(açúcares, p.ex. sacarose

e trehalose)

CP’s

água

meio extracelular

CÉLULA

meio extracelularCP’s

CRIOPROTECTORES PERMEÁVEIS:Pequenas moléculas que atravessam a membrana celular e formam ligações de hidrogénio com as moléculas de água.Em < concentrações causam descida da temp.

Inibem os cristais de gelo

formam um sólido vitrificado

CRIOPROTECTORES NÃO PERMEÁVEIS:

Permanecem no meio extracelular.Drenam a água do interior da célula, o que leva à desidratação do espaço intracelular.Quando associados a CP’spermeáveis, contribuem para prevenir a formação de cristais.Descongelação: evitam o choque osmótico.

OÓCITO MADURO OU

SECUNDÁRIO

CRIOPRESERVAÇÃO DE OÓCITOS MADUROS

DIFÍCEIS DE CONGELAR: tamanho considerávelcitoplasma complexomembrana especializadaestado transitório

IMPORTANTE!O FUSO ACROMÁTICO DESAPARECE

DURANTE O PROCESSO DE ARREFECIMENTO, DEVIDO À

DESPOLIMERIZAÇÃO DOS MICROTÚBULOS

Os oócitos maduros podem ser utilizados

em 2 fases da meiose:METAFASE II ou PROFASE I

(diplóteno; fase de vesícula germinativa)

Escolhem-se oócitos em MII porque:1. O fuso acromático já está organizado (segregação correcta dos cromossomas; evitar aneuploidia)2. Há bloqueio da meiose II3. Há maior abundância de oócitos nesta fase

Os oócitos em profase I (diplóteno) seriam o ideal porque na fase seguinte – anafase I – existe um risco de não-disjunção

dos cromossomas e , logo, de aneuploidia mas……a prática demonstrou que era mais difícil criopreservar

células nesta fase

CRIOPRESERVAÇÃO DE FOLÍCULOS PRIMORDIAIS

Vantagens < dimensão; > área superficial/ volume pouco diferenciados citoplasma com menosorganitos não existe fuso acromáticonão têm zona pelúcida

Filme educativo sobre medicina reprodutiva“Reproductive Medicine Associates of New York”http://www.youtube.com/watch?v=6tLPv4Z2_NM

REF. BIBLIOGRÁFICASDessolle et .al. (2009) Gynécologie, Obstétrique & Fertilité 37(9):712-719Gosden R.G. & Veeck Gosden L.L. (2005) Cryopreservation of human oocytes and ovarian tissue. In Textbook of in vitro Fertilization and Assisted Reproduction, 3aed. Edit. Peter R. Brinsden, Taylor & Francis, Cambridge, UK, pp.421-430Jain J.K. & Paulson R.J. (2006) Fertility and Sterility 86 (suppl. 3): 1037-46Kuleshova L.L. (2009) Fundamentals and current practice for vitrification. In Preservation of Human Oocytes. Eds. G. Coticchio, A. Borini, InformaHealthcare, London, UK, pp. 36-61.

WEBGRAFIAhttp://www.britannica.com/EBchecked/media/106702/During-ovulation-in-a-healthy-woman-a-dormant-primordial-folliclehttp://artemisacosta.blogspot.com/2008/02/crioconservao-de-gmetas-e-embries.htmlwww.apdpn.org.pt/_scripts/informacao/1843698306.pdf