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CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
1
Faculdade de Medicina
Universidade de Lisboa
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA
ATOPIA E NA ASMA
Tese de Mestrado em
Epidemiologia
MARGARIDA CORTEZ
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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ORIENTADOR
Prof. Doutor Manuel Bicho
Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina de Lisboa
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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Esta Tese de Mestrado foi escrita de acordo com o antigo acordo ortográfico.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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ÍNDICE
1. NOTAS BREVES ……………….………………………………………………………………………………………………..….6
2. GLOSSÁRIO …………………….…..………………………………………………………………………………….………..….7
3.RESUMO….………………………………………………….…………………………………………………………………..…..13
4. ABSTRACT………….…………………………….……………………………………………………………………………..…..15
5. INTRODUÇÃO . ............................................................................. ........................................... ..17
6. REVISÃO DA LITERATURA………....................................................................................................27
6.1 DESCRIÇÃO DA HAPTOGLOBINA ,DA HEMOGLOBINA E DO METABOLISMO DO FERRO
DERIVADO DA HEMOGLOBINA………………………………………………………………………..………….27
6.2 SÍNTESE DA HAPTOGLOBINA………………………………………………………………………….……..28
6.3 HP COMO PROTEÍNA DE FASE AGUDA…..………………………………………………………………30
6.4 ASPECTOS ESTRUTURAIS E FENÓTIPOS………..………………………………………………….….…31
6.5 O COMPLEXO Hp-Hb…………………….……………………………………………………………….…….…32
6.6 FUNÇÕES FISIOLÓGICAS DA Hp EM GERAL ………………………..………………………………….33
6.7 Hp COMO INIBIDORA DA LIPOXIGENASE E CICLOXIGENASE …………………………..…….34
6.8 Hp COMO ADIPOCINA NA INFLAMAÇÃO NA OBESIDADE ……..………………………………35
6.9 Hp COMO LIGANDO DO CD11/CD18 ………………………………………………………………….…37
6.10 Hp COMO LIGANDO DO CD22 ……………………………………………………………………………..37
6.11 POLARIZAÇÃO DOS MACRÓFAGOS ASSOCIADO À HIPÓXIA ,SINTASE DO ÓXIDO
NÍTRICO (NOS),ARGINASE E POLIMORFISMO DA HP …………….…………………………………….…37
6.12 HAPTOGLOBINA, IMUNIDADE INATA E ATOPIA …….…………………………………………….39
6.13 CD163 E VIAS METABOLIZADORAS DA Hp …….…………………………………………..…………44
6.14 TOLERÂNCIA, DOENÇA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA Hp ……………..…………………52
6.15 PAPEL DAS DCs NA ORIGEM DAS iTregs …………………………….……………………………..…54
6.16 POLUIÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE INDIVIDUAL ASSOCIADA AO POLIMORFISMO DA
Hp …………………………………………………………………………………………………………………………….57
6.17 STRESS OXIDATIVO E POLARIZAÇÃO MACROFÁGICA ……..…………………..…….………57
6.18 PAPEL DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS NA RESPOSTA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA
Hp ……………………………………………………………………………………………………………………………58
6.19 IgE , RECEPTOR DA IgE , RESPOSTA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA Hp ……..…….59
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6.20 Hp NA NEO-ANGIOGÉNESE , NA MIGRAÇÃO CELULAR E REMODELAÇÃO …….…60
6.21 A HAPTOGLOBINA E A ASMA ALÉRGICA -DOENÇA Th2 ……………………..………..…63
7. OBJECTIVOS DO ESTUDO ……………………………………………………………………………………67
8. MATERIAL E MÉTODOS ………………………………………………………………………………….……68
9. RESULTADOS ………………………………………………………………………………………………..……73
10.DISCUSSÃO E CONCLUSÃO …….…..……………………………………………………………..……. 102
11. BIBLIOGRAFIA …………………………….…………………………………………………………………..108
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1.NOTAS BREVES A Genética, a Imunologia e a doença alérgica sempre reuniram ente si características científicas
únicas que fizeram despertar cedo em mim o gosto por estas matérias.
Todo o trabalho de investigação sobre a Haptoglobina e sua associação com a doença alérgica só
foi possível graças ao empenho de uma equipa pluridisciplinar do Laboratório de Genética da
Faculdade de Medicina de Lisboa, pelo que os meus agradecimentos vão para : o Prof. Doutor
Manuel Bicho, que tem sido um grande impulsionador da Genética Médica; Prof. Cláudia Marinho
que soube incutir desde o início o gosto pela investigação científica translacional; ao Prof. Doutor
José Augusto Gamito Melo Cristino, Director do Serviço de Patologia Clínica do CHLN, e Dra Helena
Proença pelo apoio dado na central de colheitas do CHLN e nos doseamentos das concentrações
séricas de Haptoglobina. À Dra. Joana Freitas pela disponibilidade para o estudo dos polimorfismos
genéticos , análise e compilação de dados, e à Sra. D. Conceição Gonçalves que se responsabilizou
por organizar a colheita de plasmas de doentes e executar os polimorfismos genéticos da
haptoglobina.
À minha família
O meu muito Obrigado
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2.GLOSSÁRIO
aa- Aminoácidos
AA-Ácido araquidónico
ACQ7- Questionário de controlo da asma 7
APCs- Células apresentadoras de Antigénio
Apo A1- Apolipoproteína A1
APRE- Elementos de resposta de fase aguda
Asp- Aspergilus
BCR- Receptor do antigénio das células B
BR- Biliverdina redutase
CCL20- quimiocina C-C motivo ligando 20
CCL22- quimiocina C-C motivo ligando 22
CCR6- Receptor de quimiocina tipo 6
CD4- Células Thelper
CD4+CD25+Treg- Células Treguladoras
CD5- Receptor de IgM das células B
CD6- Cluster de diferenciação pertencente à família de receptores capturadores ricos em cisteína
CD8-Células T citotóxicas
CD11/CD18- família de β-integrinas
CD22- Cluster de diferenciação 22 receptor multifuncional transmembranar das células B
CD23- Receptor de baixa afinidade para a IgE
CD40- proteina co-estimuladora das APCs
CD54- Proteina co-estimuladora das células apresentdoras de antigénio
CD86- Proteina co-estimuladora das células apresentdoras de antigénio
CD163- Receptor do complexo Hp-Hb
CD206-Receptor da manose
CIC -Complexos imunes
CO-Monóxido de carbono
COX- Cicloxigenase
CXCL10- quimiocina CXC motivo ligando 10
DAMPs- Padrões moleculares associados a lesão
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Dcs- Células dendríticas
Dc1- Células dendríticas tipo1
Dc2- Células dendríticas tipo2
DCV-Doença cardio-vascular
DEP- Partículas da exaustão do diesel
Derp1-Alergénio molecular 1 do dematofagoides pteronyssinus
Derp2- Alergénio molecular 2 do dematofagoides pteronyssinus
DNA- Ácido desoxiribonucleico
ECP- Proteína catiónica dos eosinófilos
ECM -Matriz extracelular
Eos-Eosinófilos
FOXP3- Forkhead box p3:marcador das Tregs
Fe2+-Ferro ferroso
Fe3+-Ferro Férrico
FcεRII- Receptor de baixa afinidade para a IgE
FeNO- Òxido nítrico exalado
FEV1- Volume expiratório forçado em 1 segundo
GATA3-Factor de transcrição trans-actuante específico das células T h2
GINA- Linhas de orientação da iniciativa global da asma
GM-CSF- factor estimulante de colónias dos granulócitos-macrófagos
GREs- Glucorticoide e elementos de resposta
Hb- Hemoglobina
HbSR- Receptor capturador da Hb
HDL-Lipoproteína de alta densidade
12-HETE- 12- Hidroxieicosatetraenóicos
HIF1α -factores de transcrição indútiveis pela hipoxia 1α
HIF-2 α -factores de transcrição indútiveis pela hipoxia 2α
HIV-1-Vírus da Imunodeficiência humana tipo 1
HO- Heme-oxigenase
Hp- Haptoglobina
Hp*1 –Alelo 1 da Haptoglobina
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Hp*2- Alelo 2 da Haptoglobina
Hp1 -1- Homozigóticos para o Alelo 1 da Haptoglobina
Hp2-1- Heterozigóticos para o Alelo1 e 2 da Haptogloina
Hp2-2 - Homozigóticos para o Alelo 2 da Haptoglobina
Hp-Hb- complexo Hp-Hb
ICAM-1- Molécula de adesão intercelular 1
IFNγ- Interferão gama
IgE- Imunoglobulina E
IL-1RI- Receptor da IL-1 tipo1
IL-1-RII- Receptor da IL-1 tipo2
IL-1RA- Antagonista do Receptor da IL-1 tipo1
IL-2- Interleucina 2
IL-4-- Interleucina 4
IL-5-- Interleucina 5
IL-6-- Interleucina 6
IL-10- Interleucina 10
IL-12-Interleucina 12
IL-13- Interleucina 13
IL-17- Interleucina 17
IL-18- Interleucina 18
IL-21- Interleucina 21
IL-23- Interleucina 23
IL-27- Interleucina 27
iNOS- Sintase do óxido nítrico indutível
ISAC- Immuno Solid-phase Allergen Chip
iTreg- Células T reguladoras induzidas
LBA -Lavado bronco-alveolar
LO- Lipoxigenase
LPS- Lipopolissacárido
M1- Macrófagos activados pela via clássica, tipo1
M2- Macrófagos activados pela via alterna, tipo2
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M2a- Macrófagos activados pela via alterna ,tipo 2a
M2b- Macrófagos activados pela via alterna, tipo 2b
M2c- Macrófagos activados pela via alterna ,tipo 2c
M4-Macrófagos indutíveis pelas quimocinas plaquetárias
M-DC: macrófagos que originam células dendríticas
Mb-Macrófago indutível pelos complexos Hp-Hb
Mc-Mastócitos
M-CSF- factor estimulante de colónias dos macrófagos
MCP1-Proteína quimioatractiva de monócitos
MDDCs- células dendríticas derivadas dos monócitos
MD2- factor de diferenciação mielóide 2
M-HA: Macrófagos associados à hemorragia
MHC-Sistema major de histocompatibilidade
Mo-Monócitos
M-ox: Células esponjosas
MPO- Mieloperoxidase
mRNA- RNA mensageiro
NADPH oxidase –Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidase
NF-E2- Factor 2 relacionado com o factor nuclear eritróide2
NF-kB- factor nuclear Kβ
NGF- factor de crescimento neuronal
NK-Células natural killer
NLRs- Nod-Like-Receptors
NO- Óxido Nítrico
NO2- Díóxido de azoto
NOS- Sintase do óxido nítrico
NTBI- ferro lábil plasmático não ligado à transferrina
nTreg- Células T reguladoras naturais
NU-Neutófilos
O3-Ozono
24p3- Proteína de fase aguda
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PAF- factor activador de plaquetas
PAGE -electroforese em gel de poliacrilamida
PAI-1- Inibidor 1 do activador do plasminogénio
PALMs- mediadores lípidicos associados aos pólens
PAMPs- Padrões moleculares associados a patogénios
PAQLQ- Questionário da qualidade de vida do asmático em Pediatria
PAR-2-Receptor activado pela protease
PCR- proteína C reactiva
PD20- Dose de teste de provocação que diminui os débitos respiratórios de 20%
pDc2-Células dendríticas plasmocitóides
PGE2- Prostaglandina E2
PGF2α- Prostaglandina F2α
PKC - proteína quinase C
PPRs- Receptores de reconhecimento de patogénios
PST- Prolina Serina Treonina
RAST- Radioallergosorbent test
RORγT- Factor de transcrição relacionado com o receptor orfão do ácido retinóico- t
RNI- Espécies reactivas de azoto
ROI- Intermediários reactivos de Oxigénio
ROS –Espécies reactivas de Oxigénio
sCD163-Receptor solúvel para o complexo Hp-Hb
SCRC- Receptores capturadores ricos em cisteína
SP-A- Proteina de surfactante A
SP-D- Proteina de surfactante D
STAT3- Transdutor de sinal e activador de transcrição 3
Syk- tirosina cinase
TAM-Macrófagos associados a tumores
Tbet- Factor de transcrição das células Th1
Tconv- Células T convencionais
TCR- Receptor das células T
TGFβ- Factor transformador de crescimento β
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Th0- Células T naive
Th1- Células Thelper tipo 1
Th2-Células Thelper tipo 2
Th3- Células reguladoras T helper 3
Th17- Células Thelper tipo 17
TLRs-Toll-Like-Receptors
TNFα- Factor de necrose tumoral α
Tr1- Células reguladoras tipo1
Treg- Células T reguladoras
TSLP-linfopietina do estroma tímico
TWEAK -receptor do factor-like de necrose tumoral fraco indutor de apoptose
TxA2-Tromboxano A2
VOC- Compostos orgãnicos voláteis
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3.RESUMO
Fundamentos: A haptoglobina (Hp), uma alfa2-sialoglicoproteina liga-se à hemoglobina livre (Hb)
e tem sido implicada na modulação da resposta Th1/Th2 interferindo na resposta imune inata e
adaptativa.O locus da Hp localiza-se no cromossoma 16q22, sendo nos humanos, polimórfico
para a cadeia α. A cadeia α da Hp tem 2 alelos major co-dominantes, Hp*1 e Hp*2, com 3
variantes genotípicas, Hp1-1, Hp2-1, Hp2-2.
OBJECTIVOS: Doentes asmáticos (controlados e não controlados) foram comparados com um
grupo controlo para :1) Avaliar as frequências alélicas e genotípicas da Hp no grupo controlo e no
grupo de doentes asmáticos e dentro dos asmáticos entre controlados e não controlados.
2)Determinar os níveis de Hp nos controlos e asmáticos.3) Estabelecer a relação entre o genótipo
da Hp e fenótipo intermédio/endótipo (níveis de Hp) no doente asmático e compará-lo com o
grupo controlo.4) Verificar se a relação genótipo de Hp e fenótipo intermédio/endótipo (níveis de
Hp) está relacionada com a gravidade da asma (comparar asmáticos controlados com não
controlados).
Material e Métodos: 114 doentes asmáticos e 50 controlos. Níveis de Hp ,determinados por
nefelometria e genótipos por electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) . A análise estatística
foi realizada com o software estatístico PASW versão 18, tendo-se estabelecido um nivel de
significância de p< 0.05.
Resultados: A distribuição das frequência alélicas Hp*1 e Hp*2 e das frequências genotípicas (Hp
1-1 , Hp 2-1 , Hp 2-2 ) não apresenta diferenças estatísticamente siginificativas entre o grupo de
doentes asmáticos e grupo controlo (p>0,05).
Os diferentes genótipos também não parecem estar associados ao risco de se ter asma brônquica
quando comparados com o grupo controlo , ou da asma poder estar ou não controlada, e
portanto ser de maior gravidade dentro do grupo de asmáticos (p>0,05).
Dentro dos asmáticos,na distribuição de frequências de genótipos também não há diferenças
estatísticamente significativas entre sexo masculino e feminino , por grupo etário , alérgicos e não
alérgicos, não-controlados e controlados e por raça (p>0,05).
No grupo controlo não há diferenças estatísticamente significativa dos níveis de Haptoglobina por
genótipo e por grupo etário (p>0,05).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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Em comparação com o grupo controlo verificou-se que os asmáticos têm sempre níveis mais
baixos (125,13±50,95vs137,86±51,39mg/dL) de Hp quando comparados com o grupo controlo
sendo essa diferença apenas significativa nos genótipos Hp2-2 (95,60±41,43 vs
128,40±51,48mg/dL) (p<0,05).
Nos asmáticos os níveis de Hp não apresentam diferenças estatísticamente significativas entre
asma controlada e não controlada , alérgicos e não alérgicos, sexo masculino e feminino e por
raça (p>0,05), mas é estatísticamente diferente entre idade> 30 anos e <15 anos (135.6±50.05 vs
87.45± 38.89 mg/dL) ( p<0.05).
Nos asmáticos os níveis de Hp apresentam diferenças estatísticamente significativas por genótipo
(p=0,000).
Os Hp 2-2 apresentam níveis mais baixos de proteína circulante quando comparados com Hp 2-1
e Hp 1-1(95,6 ± 41,93 vs 137,37±49,58 vs 146,09±47,37mg/dL) , e a diferença é estatísticamente
significativa (p=0.000 ). Em doentes com idade ≥15 anos os níveis de Hp são diferentes por
genótipo (p<0.05): 1-1 e 2-1 diferem do 2-2. Em doentes com idade <15 anos os níveis de Hp não
são diferentes entre os genótipos(p>0,05). Numa análise pos-hoc o genótipo Hp 2-2 mostrou-se
um factor independente associado aos níveis mais baixos de Hp, assim como a idade< 15 anos.
Conclusão: Apesar de não termos encontrado diferenças estatísticamente significativas entre a
distribuição alélica e genotipica da Hp no grupo de doentes asmáticos quando comparados com o
grupo controlo, verificámos que os asmáticos têm níveis mais baixos da Hp circulante quando
comparados com controlo e que essa diferença está associada ao genótipo Hp2-2. Nos asmáticos
os níveis de Hp são diferentes por genótipo( com idade ≥15 anos) devido aos níveis mais baixos de
Hp associados ao Hp2-2 quando comparado com os outros genótipos. Dado que os níveis de Hp
são mais baixos no grupo etário com menos de 15 anos, sugere-se que estudos futuros sejam
controlados em relação à idade. Os dados obtidos sugerem diferenças entre grupos que poderão
estar relacionadas com os genótipos da Hp, e possívelmente com diferentes perfis imunológicos .
Palavras-Chave : POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA; ASMA BRONQUICA.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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4.ABSTRACT
Background: Haptoglobin (Hp), an alfa2-sialoglycoprotein known to bind free hemoglobin (Hb)
has been implicated in modulation of Th1/Th2 response ,intervening in innate and adaptive
immune response.The Hp locus is situated at 16q22 chromosome, being in humans ,
polymorphic for the αchain . The α chain of Hp has 2 major co-dominant alleles Hp*1 and Hp*2,
with 3 genotype variants, Hp1-1, Hp2-1, Hp2-2.
Aims: In asthmatic patients (controlled and uncontrolled) when compared with control group:1)
Determine genotype and allelic frequencies of Hp between control group and asthmatics, and in
this group: between controlled and uncontrolled asthma. 2) Determine Hp levels in control group
and make a comparison with asthmatics.3) Establish a relation between genotype of Hp and
intermediate phenotype/endotype (Hp levels) in asthmatics and compare with control-group.4) To
verify if the relation between Hp genotype and intermediate phenotype/endotype (Hp levels) is
related with the severity of asthma ( compare controlled and uncontrolled asthma).
Material and Methods: 114 asthmatic patients and 50 controls were studied. The Hp levels were
determined by nephelometry and genotypes by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
Statistical analysis was performed with statistical software PASW version 18, having established
a level of significance of p< 0.05.
Results: Allelic (Hp*1 e Hp*2 ) and Hp genotype (Hp 1-1 , Hp 2-1 , Hp 2-2 ) distribution in
asthmatics, are not statistical different from control group (p> 0.05). The different genotypes
seem not to be related with an increased risk of having asthma when compared with the control
group, or that the asthma could be controlled or uncontrolled among asthma patients (p>0,05).
There is no statistical differences in the asthmatics between, gender, age-group, atopics and non-
atopics, controlled and uncontrolled and by ethnic group (p>0,05).
In control group there is no statistical differences in Hp levels by genotype and age-group (p>0,05).
When we compare asthmatics with control group we verified that in asthma , the levels of Hp are
always lower than in the control group (125,13±50,95vs137,86±51,39mg/dL) and there was a
statistical difference in Hp2-2 genotype (95,60±41,43 vs 128,40±51,48mg/dL) (p<0,05).
In asthmatics Hp levels, were no different between controlled and uncontrolled asthma, atopics
and non-atopics, gender and ethnic group (p>0,05).But is statistical different between ages >30
years and <15 years (135.6±50.05 vs 87.45± 38.89 mg/dL) ( p<0.05).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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In asthmatics Hp levels, present statistical differences by genotype (p=0,000).
Those who express Hp 2-2 had the lower levels of the circulating protein when compared with
Hp 2-1 and Hp 1-1(95,6 ± 41,93 vs 137,37±49,58 vs 146,09±47,37mg/dL) ,and it is statistical
different (p=0.000 ).In those asthmatics with age ≥15 years Hp levels are different by genotype
(p<0.05): 1-1 and 2-1 differ from 2-2. Those patients with age <15 years, Hp levels were no
different between genotypes (p>0,05). In a pos-Hoc analysis Hp 2-2 is an independent factor, as
age <15 years, associated with lower levels of Hp.
Conclusion: Although no statistical differences were find between Hp genotype and allelic
distribution in the group of asthmatics when compared to control group we verified that
asthmatics had lower levels of the circulating Hp when compared to the control-group and that
this difference is associated with Hp 2-2 genotype. In asthmatics, Hp levels are different between
genotypes (with age ≥15 years) because Hp levels are lower in the Hp2-2 genotype when
compared with the other genotypes.In the future, studies done with Hp should be controlled by
age , because the Hp levels are lower in the pediatric group. These data point to differences
among groups that could be related to Hp genotypes , and possibly with different immunological
profiles.
Keywords: HAPTOGLOBIN POLYMORPHISM; BRONCHIAL ASTHMA.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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INTRODUÇÃO A haptoglobina (Hp)é uma alfa 2-sialoglicoproteina (proteina de fase aguda) que tem como
funções básicas: a ligação à hemoglobia (Hb); anti-inflamatória/anti-oxidante; activação dos
neutrófilos; regulação do transporte do colesterol através da HDL( lipoproteina de alta densidade),
inibição da lipoxigenase(LO) e cicloxigenase (COX), imunomodulação; angiogénese (proliferação e
diferenciação das células endoteliais); remodelação; interação com CD11/CD18 e CD22; adipocina;
interfere com a atopia IgE mediada e inflamação eosinofílica1,2.
O complexo Hp-Hb leva a uma reciclagem da globina e grupo heme. A Hb livre pode ser altamente
lesiva através da acumulação de radicais hidroxilo: H2O2+Fe2+→Fe3++OH-+OH → Reacção de
Fenton.
Há duas formas de metabolizar o complexo Hp-Hb, uma é no hepatócito e outra nos monócitos-
macrófagos através do receptor CD1633 (Figura 1)
Figura 1: Receptor do complexo Hp-Hb
Macrófago
Bilirrubina
Biliverdina
Endocitose
Hp-Hb degradado
Macrófago
Bilirrubina
Biliverdina
Endocitose
Hp-Hb degradado
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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A haptoglobina é composta de 2 subunidades: cadeias leves alfa(9-18kDa) e cadeias pesadas beta
(38-42kDa), sendo o locus da Hp nos humanos localizado no braço longo do cromossoma 16q22
polimórfico para a cadeia alfa.
A Hp é constituida por 2 tipos de cadeias polipeptídicas: beta (pesadas :de 40 kD) e alfa(leves:
alfa1 de 8.9kD e alfa2 de 16kD ). As cadeias beta são idênticas em todos os fenótipos de Hp e as
variantes devem-se à presença das cadeias alfa.
A cadeia alfa da Hp é polimórfica com dois alelos co-dominantes Hp*1 e Hp*2 que dão origem a 3
variantes genotípicas/fenotípicas:Hp1 -1(dímero)86 kDa, Hp2-1(polímero linear) e Hp2-2 (polímero
cíclico) 170-900 kDa.
O alelo1 contém 5 exões , o alelo2 terá sido originado provávelmente a partir de 2 alelos 1 e como
resultado tem uma duplicação dos exões 3 e 4 do alelo1.
A frequência do alelo Hp*1(alelo selvagem) varia muito com a região geográfica, sendo no sudeste
Asiático de 0,10, na América do sul 0,80 e na Europa 0,384.(Figura 2)
Figura 2: Frequência do alelo 1 na Europa
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Cada um dos fenótipos tem diferente afinidade para a Hb, diferente resistência ao stress oxidativo,
e diferente papel imunoregulador5,6.
O Hp*1 é mais eficiente a lidar com a Hb e é mais eficiente na resposta ao stress oxidativo do que
Hp*2.
Cada genótipo/fenótipo tem diferente afinidade para a Hb, diferente resistência ao stress
oxidativo e diferente papel imunoregulador e angiogénico/remodelação vascular e muscular
(Figura 3).
A Hp actua como anti-oxidante não só por se ligar à Hb e estabilizar o ferro contido nas bolsas da
Hb , mas também porque promove a sua captura através do receptor CD163.
Figura 3: Fenótipos da Haptoglobina7
A existência de vias comuns às doenças com factores de susceptibilidade individual/genéticos
(polimorfismo da Hp) associados a marcadores subclínicos/fenótipos intermédios/endótipo
(níveis de Hp pex.) tendo como alvo o fenótipo distante :doença (ASMA neste caso) permite uma
abordagem translacional da Medicina .
Subunidade 1
Subunidade
Subunidade 2
Subunidade 1
Subunidade
Subunidade 2
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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Por seu lado a prevalência da doença alérgica tem vindo a aumentar de forma alarmante nos
últimos 50 anos.Sabe-se que 80 milhões de europeus sofrem de doença alérgica e 30 milhões têm
asma. Em Portugal 20% têm alergia, sendo actualmente uma probabilidade de 1 em cada 5 ter
alergia.
Pensa-se que em 2015: 1 em cada 2 Europeus terá doença alérgica.
Os alérgénios são normalmente proteínas ou derivados proteicos que em indivíduos susceptíveis
podem provocar uma reacção imunológica alérgica mediada por IgE.Os mais conhecidos são:
ácaros, pólens, faneras de animais, fármacos, latex, alimentos.
A biotecnologia veio permitir a caracterização molecular dos alergénios (Figura 4).
Figura 4: Alergénio recombinante purificado da ambrosia
As alergias,e a asma alérgica são doenças mediadas imunológicamente em que a resposta Th2 é
um pré-requisito para a reacção de hipersensibilidade de tipo I com produção de IgE8-12.
No caso dos pólens, há libertação de proteínas alergénicas e não alergénicas/bioactivas com
capacidade pró-inflamatória e imunomoduladora (Figura 5).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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Figura 5: Pólens e proteína bioactivas com capacidade pró-inflamatória e imunomoduladora
Tal como nos pólens, nos ácaros, a inflamação alérgica é o resultado da polarização Th2, e da
activação do sistema imune inato. Esta activação é feita através do alergénio ele próprio e dos
sinais de perigo presentes no ambiente ou associados ao alergénio:em que intervêm os
PRRs(receptores de reconhecimento de patogénicos ou padrão): PRRs sinalizadores (Toll-Like-
Receptors membranares; citoplasmáticos NodLikeReceptors )ePRRs endociticos( destaca-se o
receptor da Hp-CD163).PAMPs(padrões moleculares associados a patogénios (LPS e beta glucans)
e DAMPs(padrões moleculares associados a lesão)que são reconhecidos pelos PRRs.
O receptor de captura da Hp dos macrófagos CD163 (HbSR) é um membro da família de
receptores de captura ricos em cisteína (SRCR). Este tipo de receptores foram inicialmente
estudados pela sua capacidade de se ligar e internalizar lipoproteínas modificadas, pelo que se
pensou que poderiam ter um papel na aterosclerose. Os receptores capturadores também
Alergénio CofactoresAntropogénicos
ComplexoParticula
-alergénio
Adjuvantes Th2
Activação das células T
Resposta imune alergénio-específica
Lesão epitelial
FitoprostanosOxilipinas
Quimiotaxia
Proinflamatório Imunomodulador
DC-IL12 baixoCCL22 alto
Nitração proteica
Coexposição
“Neo”-alergénios
Alergénio CofactoresAntropogénicos
ComplexoParticula
-alergénio
Adjuvantes Th2
Activação das células T
Resposta imune alergénio-específica
Lesão epitelial
FitoprostanosOxilipinas
Quimiotaxia
Proinflamatório Imunomodulador
DC-IL12 baixoCCL22 alto
Nitração proteica
Coexposição
“Neo”-alergénios
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
22
funcionam como receptores de reconhecimento padrão para uma série de agentes patogénicos,
podendo interferir na resposta a estes e potenciar/associar-se à resposta ao alergénio. O CD163
estando envolvido na endocitose do complexo Hp/Hb controla o stress oxidativo associado à
hemólise, assim como através de vias efectoras monócito/macrofágica tem um papel
imunoregulador importante13.
A resposta alérgica é o resultado de uma complexa interacção entre a predisposição genética, a
exposição alergénica e factores ambienciais (Figura 6).
adjuvante causa
Alergénios
Tamanho e PM
Hidrofobicidade
Pregueamento
proteico
Estabilidade
Solubilidade
Oligomerização
Modificação pós-
translacional da função
PREDISPOSIÇÃO GENÉTICA
P.EX.: DISFUNÇÃO DE BARREIRA;
DESREGULAÇÃO DE CITOCINAS
Ausência de
factores
protectores.
Cofactores
biogénicos e
antropogénicos
p. Ex.: PALMs; LPS;
NADPH oxidase;
DEP; NO2; O3;
compostos voláteis
orgãnicos.
Irritantes: emissão
de partículas;
exposição a
tabagismo; NO2;
O3; infecção;
exercício.
Sensibilização alérgica
Hiperreactividade das vias aéreas
Asma Alérgica
Figura 6: Predisposição genética - exposição alergénica e factores ambienciais
O resultado final da sensibilização alergénica é a inflamação, aqui documentada com as vias aéreas
de um asmático (Figura 7).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
23
Figura 7: Vias aéreas do asmático
A resposta imune adaptativa divide-se em dois grandes grupos:Th1 e Th210,estando os primeiros
relacionados com as doenças autoimunes e os segundos com a atopia.Quando o papel das Treg (
naturais ou induzidas)falha haverá emergência de um perfil Th1 ou Th2, havendo aumento da
expressão dos factores de transcrição correspondentes à diferenciação celular a partir das células
T naive.Tendo no entanto as células Treg um papel importante na inflamação crónica e
remodelação tal como os diferentes polimorfismos da Hp. Quando há falência da regulação T
(Th1eTh2) há perda de tolerância e emergência de doença- neste caso doença alérgica (Figura 8).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
24
Figura 8: Resposta imune inata e adaptativa
Figura 9: Resposta imune inata e adaptativa
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
25
Na resposta alérgica a proteínas ambientais, a imunidade inata aparece como orquestrador da
resposta adaptativa Th2, através da interacção das células APCs, na presença do MHC classe II ao
TCR das células Th0 (Figura 9). Os alergénios (Figura 10) podem activar a imunidade inata através
de actividade proteolítica, ligação a receptores de reconhecimento padrão, mimetismo molecular,
ou complexos de sinalização dos Tol like receptor (TLR), actividade ligante com lípidos e potencial
oxidativo14.
Figura 10: Alergénios e resposta imune inata
Tal como as células Th também os macrófagos se polarizam em M1 e M2 (Figura 11), em resposta
a uma série de estímulos ambientais. Os M1 são activados pela via clássica: IFN gama, LPS e levam
a uma polarização Th1 enquanto os macrófagos M2 são activados pela via alterna: IL-4,10,13 e
expressam o receptor CD163 para a Hp nos macrófagos e o receptor para a IgE (CD23-macrófagos
M2a).
Alergia Tolerância
Activação da PAR-2
Clivagem do Sp-D e SP-A
Mais alergénio disponivel
Aumento da permeabilidade epitelial
Polen
-glucano
Alergia Tolerância
Activação da PAR-2
Clivagem do Sp-D e SP-A
Mais alergénio disponivel
Aumento da permeabilidade epitelial
Polen
-glucano
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
26
Figura 11: Polarização M1/M2
A Hp é também um excelente suppressor da proliferação T. Os macrófagos activados pela
endocitose do complexo Hp2-2:Hb através do receptor CD163 desviam a respostaT helper para um
perfil Th1 enquanto que os macrófagos activados pela endocitose do complexo Hp1-1:Hb
produzem citocinas Th2 .Este balanço na resposta T, é particularmente importante no espaço
extravascular, através da expressão local de Hp, minimizando a lesão tecidular.No espaço
extravascular as células dendríticas, respondem a sinais de alerta (stress oxidativo, etc..) e
interagem com antigénios/alergénios10,15.
O polimorfismo genetico para a cadeia alfa da Hp pode levar a uma diferente activação e
polarização dos macrófagos M1(IL-12 alto,IL-23 alto,IL-10 baixo) ou M2(IL-12 baixo,IL-23 baixo, IL-
10 alto; elevada expressão do receptor da manose CD206 e do receptor para o complexo Hp-Hb
CD163), na imunidade inata, derivando daí uma activação preferencial M2 e consequentemente
uma resposta adaptativa Th2.
Polarização M1 Polarização M2
Inflamação Tipo IDestruição tecidular
Morte de parasitas intracelularesResistência tumoral
Inflamação Tipo IIRemodelação tecidular e
angiogéneseEncapsulação de parasitas
Crescimento tumoral
Quimiocinas M1 (CXCL10)ROI; RNI
Quimiocinas M2 (CCL22)Receptores: CD163, CD23, manose e
galactose
IL4/IL13, glucocorticoides, TGF
Polarização M1 Polarização M2
Inflamação Tipo IDestruição tecidular
Morte de parasitas intracelularesResistência tumoral
Inflamação Tipo IIRemodelação tecidular e
angiogéneseEncapsulação de parasitas
Crescimento tumoral
Quimiocinas M1 (CXCL10)ROI; RNI
Quimiocinas M2 (CCL22)Receptores: CD163, CD23, manose e
galactose
IL4/IL13, glucocorticoides, TGF
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
27
6.REVISÃO DA LITERATURA
6.1.DESCRIÇÃO DA HAPTOGLOBINA ,DA HEMOGLOBINA E DO METABOLISMO DO FERRO
DERIVADO DA HEMOGLOBINA
O Ferro16 derivado da Hb, pode catalizar um certo número de reacções oxidativas que podem ser
inibidas pela Hp.Primeiro o Ferro ferroso (Fe2+) do heme pode reagir com o peróxido de
hidrogénio e originar Ferro férrico (Fe3+) e espécies altamente reactivas de radicais hidroxilo. Este
tipo de radicais podem iniciar o processo de peroxidação lipídica.
O ferro ferroso (Fe2+) pode também reagir com o peróxido de hidrogénio e produzir
ferrilhemoglobina, que é uma molécula altamente instável e que reage em seguida com uma
segunda molécula de peróxido de hidrogénio para originar Ferro férrico (Fe3+) e anião superóxido.
A capacidade lesiva do anião superóxido por um lado deve-se a : redução do Ferro férrico da Hb
(Fe3+) a ferro ferroso (Fe2+) levando a mais radicais hidroxilo e dismutação do anião superóxido
para produzir peróxido de hidrogénio e ROS-espécies reactivas de oxigénio.
Em todas estas reacções, o ferro derivado do heme continua na bolsa heme da molécula de
globina. No entanto o ferro férrico com Fe3+, também conhecido como metahemoglobina, pode
expontâneamente transferir a metade heme, que passaria para ambientes lipofílicos como as LDL
ou as membranas celulares. Uma vez no “novo” ambiente lipídico, o ferro do heme pode reagir
com o peróxido de hidrogénio ou com os lípidos peróxidos adjacentes gerando uma cascata de
radicais livres e extensa oxidação lipídica.
O Ferro17 é capaz de gerar radicais livres de Oxigénio altamente reactivos como os radicais
superóxido e hidroxilo sob circunstâncias fisiológicas.No entanto a maioria do ferro do nosso
organismo está armazenado ligado a proteínas como a transferrina e ferritina, nas quais o ferro
esta redox inactivo e incapaz de oxidar substractos. Nos últimos 10 anos, ficou claro que existe um
pool de ferro que não está ligado a estas proteínas e que é redox activo(NTBI-ferro lábil plasmático
não ligado à transferrina). O NTBI representa um número de espécies moleculares, entre as quais
o complexo Hp-Hb.
A Hp é uma proteína plasmática que se liga com alta afinidade à Hb.Enquanto que o ferro heme da
Hb é um potente oxidante, a ligação à Hp diminui a capacidade oxidativa.No homem o fenótipo
Hp2-2 é incompetente no bloqueio da capacidade oxidativa mediada pelo ferro derivado da Hb,
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
28
enquanto que o complexo Hp1-1Hb é redox-inactivo.Pelo contrário o complexo Hp2-2Hb contém
ferro não ligado à transferrina redox-activo.Foi verificado que na placa aterosclerótica há mais
ferro extracelular no fenótipo Hp2-2, assim como o tráfego intracelular do complexo Hp2-2Hb
também está comprometido.
A Hp18 surge como anti-oxidante porque previne a oxidação que deriva da Hb. A ligação
estoiquiométrica da Hp à Hb só estabiliza a metade de ferro-heme e promove a sua captura pelo
receptor CD163 dos macrófagos, através da endocitose receptor-mediada.Esta mesma capacidade
da Hp proteger contra a oxidação produzida pela Hb fica comprometida na Diabetes com a
glicosilação da Hb.Mais uma vez a depuração do complexo Hp-Hb que na Diabetes assume vital
importância está mais acelerada nos Hp1-1Hb do que nos Hp2-2Hb, o que conduz nestes últimos a
maior stress oxidativo e doença cardiovascular.
Como 75% do ferro total está ligado à Hb, as diferenças genéticamente determinadas na
disponibilização e metabolismo do ferro derivado da Hb vão ter profundas consequências no
metabolismo do ferro e no potencial oxidativo induzido pelo ferro.
A Hp19 que é abundante no plasma liga-se à Hb formando um complexo estável, acelerando a sua
clepuração .O complexo Hp1-1Hb é eliminado 2x mais rapidamente que o Hp2-2, derivando deste
um maior risco de lesão tecidular oxidativa associada à Hb livre.Uma das consequências deletérias
da Hb livre é a captura do óxido nítrico pela Hb através da reacção de dioxigenação envolvendo Hb
oxigenada em que HbO2 representa o O2 ligado à Hb e MetHb refere-se a methemoglobina com
heme férrico (oxidado).
A afinidade com que a Hb se liga à Hp é de aproximadamente (Kd ~ 10−12 M) . As proteínas de Hp
que provêm dos alelos 1 e 2 diferem nas propriedades bioquímicas e biofísicas e podem ser
eliminadas através do complexo Hp-Hb via receptor CD163 dos monócitos/macrófagos.
6.2.SÍNTESE DA HAPTOGLOBINA
A Hp é na sua maioria sintetizada1,16 no fígado, e parte no pulmão, pele, baço, rim e tecido
adiposo.É uma proteína de fase aguda. A Hp é importante em muitas doença pulmonares, tendo
um importante papel imunoregulador. A Hp expressa-se em níveis elevados em células específicas
incluindo os macrófagos alveolares e eosinófilos no pulmão com inflamação e com doença, mas
não no pulmão saudável.A síntese da Hp aumenta com a hormona de crescimento, insulina, LPS,
prostaglandinas e citocinas como a IL-6.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
29
A semi-vida da Hp é 3,5 dias, e a semi-vida do complexo Hp-Hb é de 10 minutos, O complexo Hp-
Hb é removido por ligação ao receptor CD163 da superfície de monócito-macrófagos. A expressão
de CD163 está aumentada pelos glucocorticoides, IL-6, IL-10. Além de ser detectada no plasma,
também pode ser detectada na urina, fluido sinovial, líquido ascítico, líquor e líquido pleural.
A Hp é uma glicoproteína de fase aguda plasmática20, composta por duas cadeias alfa : alfa1 e
alfa2 e uma cadeia beta (15, 20 e 40b kDa).
Jayle e Polonovski-1º trabalho sobre Hp em 1938- descrevendo a Hp como uma substância
plasmática que interage com a Hb.O gene da Hp está localizado no braço longo do cromossoma
16q22. A função primária da Hp é a sua ligação à Hb livre para protecção contra o stress oxidativo
ou espécies reactivas de O2(ROS) e facilitar a sua captação por receptores como o CD163.
Após mais de 60 anos de investigação ligada à Hp, ela é reconhecida como proteína multifuncional
envolvida na regulação de múltiplos processos tais como: resposta imunológica, angiogénese,
síntese de prostaglandinas e transporte de colesterol.
Devido ao polimorfismo genético, tem sido alvo de interesse no campo da genética e bioquímica.
O gene humano da Hp existe em 2 formas alélicas Hp*1 e Hp*2. O Hp*2 vem de uma duplicação
intragénica de um fragmento de 1,7 kb deDNA do gene Hp*1.
O polimorfismo genético da Hp com os 3 genótipos Hp1-1, Hp2-1, Hp2-2 resulta da expressão dos
2 alelos Hp*1e Hp*2 no cromossoma 16q22. Há marcadas diferenças geográficas: os
asiáticos mostram frequências do Hp2-2 de 55% enquanto os Europeus apresentam frequências
de cerca de 30%. Na Europa Noroeste, as frequências de genótoipos são: Hp1-1:16%, Hp2-2: 36%,
Hp 2-1 :48% correspondendo a frequências alélicas de 0,4 Hp*1 e 0,6 Hp*2. No sudeste asiático a
frequência do Hp*1 é 0,1% enquanto na América do sul é 0,8%..
Os fenótipos têm grande heterogeneidade molecular, sendo os Hp1-1 pequenas moléculas de
86kDa, os Hp 2-1 são heteropolímeros (86-300kDa) e os Hp2-2 são grandes complexos
macromoleculares com 170-900kDa. As diferenças estruturais vão ter consequências funcionais
sendo os Hp1-1 associados a hipersensibilidade ao sal , HTA essencial e asma alérgica , enquanto
os Hp2-2 estão associados a progressão da doença aterosclerótica, como a doença isquémica
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
30
coronária e enfarte agudo do miocárdio, doença arterial periférica e complicações vasculares da
diabetes e doenças autoimunes4,8.
6.3.Hp COMO PROTEÍNA DE FASE AGUDA
A Hp pertence ao grupo de proteínas de fase aguda (PFAs) que aparecem durantea reacção de
fase aguda (RFA) que aumentam após libertação de IL-6, TNF- alfa, glucocorticoides e
catecolaminas. A reacção de fase aguda foi definida pela primeira vez em 1941 por Abernethy e
Avery e correspondem à resposta do organismo à lesão, infecção ou trauma tecidular, assim como
alterações imunológicas como a asma alérgica e as doenças autoimunes.Compreende uma
complexa cascata de reacções que têm como objectivo prevenir futura lesão tecidual, eliminar
organismos infecciosos e aumentar o processo de cicatrização.Este processo é iniciado pelos
macrófagos dos tecidos envolvidos ou pelos monócitos circulantes e pelas citocinas
libertadas.Estas citocinas libertadas actuam localmente sobre fibroblastos e células endoteliais
criando uma segunda vaga de citocinas e outros mediadores que vai acentuar a reacção de fase
aguda local e sistémica.Daqui resulta o recrutamento de leucócitos, e outras células para o local de
inflamação e sistémicamente actuam na resposta imunológica, medula óssea e fígado.
A síntese de proteínas de fase aguda,PFA, é controlada pelas citocinas que actuam directamente
na superfície dos hepatócitos levando à síntese de PFA. As PFA tipo 1 são reguladas pela IL-1, TNF-
alfa, enquanto as de tipo 2 são reguladas pela IL-6 . Os genes das PFA ficam activados com IL-6 e
posteriormente a resposta é amplificada pela TNF-alfa e IL-1. A Hp é uma PFA tipo 2 nos humanos
e tipo 1 no ratinho, após indução pela IL-6 a transcrição do gene é mediada por proteínas
sinalizadoras como a STAT3.Depois da ligação da IL-6 ao seu receptor, a STAT 3 é activada do lado
citoplasmático do receptor da IL-6 por fosforilação. Ao ser activada passa para o núcleo onde se
processam os 3 mecanismos reguladores mais importantes do gene promotor da Hp.
A Hp existe sobretudo no plasma, mas também pode ser encontrada noutros fluídos como: leite,
urina, LCR (líquor), fluido amniótico e saliva.
O mRNA da Hp pode ser encontrado no baço, timo, coração, pulmão, rim, exsudado vaginal, pele,
adipócitos após estimulação com LPS .Assim como nas células epiteliais do pulmão e do tecido
reprodutor.
Adicionalmente, macrófagos, eosinófilos e queratinócitos da epiderme expressam Hp.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
31
Para além do seu efeito regulador, as citocinas podem também actuar através do eixo
hipótalámo-hipófise-supra-renal na produção de PFA. Ao aumentar a produção de
glucocorticoides, através da ACTH (Hormona adrenocorticotrópica) que aumenta durante a fase
aguda. Os glucocorticóides por sua vez, aumentam a produção de PFA no hepatócito, e diminuem
a produção de citocinas pelos monócitos e macrófagos por outro.No entanto a expressão de Hp
nos hepatócitos é baixa quando comparada com a via directa.Suspeita-se que poderá haver um
receptor para os glucocorticoides no gene promotor (região reguladora que está a uma curta
distância da extremidade 5’ de um gene e que actua para ligação da RNA polimerase) da Hp e que
seria a via sinalizadora (Figura 12).
Figura 12: Mecanismos reguladores da produção de PFA
Há várias proteínas consideradas PFA, nos humanos a PCR, a proteína sérica amiloide A são as que
mais aumentam ea Hp aumenta apenas de forma moderada.
6.4.ASPECTOS ESTRUTURAIS E FENÓTIPOS
A heterogeneidade molecular da Hp humana relacionada com os dois alelos Hp*1 e Hp*2 foi pela
primeira vez referida por Smithies em 1955, que distinguiu 3 fenótipos: Hp 1-1, Hp 2-1; Hp 2-2
baseado nos padrões de migração electroforética. Os homozigóticos para o alelo 1 :Hp1-1 têm
uma só banda proteica de migração rápida, os homozigóticos para o alelo 2 : Hp2-2 têm várias
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
32
bandas migratórias lentas, os heterozigóticos Hp 2-1 têm várias bandas migratórias lentas e uma
banda adicional mais fraca que Hp1-11,21.
As Hp são proteínas com subunidades alfa e beta tendo um domínio proteico de controlo do
complemento(alfa) e um domínio serino-protease(beta).
A cadeia beta (40 kDa)não varia nos humanos e contém 4 locais de glicosilação do tipo(Asn-X-
Thr/Ser). Por outro lado, a cadeia alfa ocorre em 2 variantes: a cadeia alfa Hp1: 15 kDa, a cadeia
alfa Hp2: 20 kDa) codificada pelas 2 formas alélicas do gene Hp: Hp*1 e Hp*2. Comparada com a
cadeia alfa, a cadeia beta está mais conservada entre as diferentes espécies-Hp GenBank P00738-
1.
Através do microscópio electrónico Wejman et al22analizaram a molécula de Hp: a Hp1-1 foi
descrita como um alter (dímero)com 2 estruturas esféricas de cadeias beta conectadas por um
fino filamento com um nó central. Apesar a sua natureza polimórfica, a Hp é interessante como
proteína do ponto de vista da evolução devido à semelhança entre a cadeia beta e membros da
família de serina-proteases com acção anti-inflamatória como a tripsina, quimotripsina e
elastase.A Hp 2-1é um polímero linear ligada por pontes dissulfito assim como a Hp 2-2 que é um
polímero cíclico .
6.5.O COMPLEXO Hp-Hb
A ligação entre Hp-Hb é uma das interacções fisiológicas não-covalentes mais fortes que se
conhece8,2-é uma interacção irreversível e não-covalente.
A estrutura tetramérica da Hb composta por duas cadeias alfa e duas beta, tem sido estudada por
métodos de cristalografia. As 4 subunidades da Hb interagem através de interacções não
covalentes e cada sub-unidade liga-se a uma molécula de heme. Quando se liberta dos eritrócitos
a Hb rapidamente se dissocia em dímeros alfa e beta que se ligam à Hp numa relação de 1:1
estoiquiométrica. Um dímero de Hb por unidade alfa-beta de Hp.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
33
6.6. FUNÇÕES FISIOLÓGICAS DA Hp EM GERAL
Os principais papéis da Hp são1: transporte e captura da Hb, imunomodulação, regulação da
resposta ao sress oxidativo,interferência na inflamação,activação dos neutrófilos,regulação do
transporte do colesterol através da HDL, angiogénese, inibição da lipoxigenase e cicloxigenase,
remodelação, adipocina.
A função mais reconhecida é a ligação à Hb livre plasmática resultante da hemólise ou da
apoptose dos eritrócitos, e consequente transporte até ao fígado, no entanto também tem
expressão no espaço extravascular através da Hp que aí está presente.Desta forma a Hp minimiza
a peroxidação lipídica dependente da Hb, proteje o DNA assim como tecidos contra o stress
oxidativo, podendo ser considerada como anti-oxidante5.2O complexo Hp-Hb não passa a filtração
glomerular. Tal como a hemopexina a Hp converge no efeito protector contra a hemólise
intravascular.
Na sua função como anti-oxidante/anti-inflamatória, sabe-se que em condições de hipoxia, como
na lesão, infecção ou neoplasias podem-se gerar espécies reactivas de oxigénio com electrões
desemparelhados, durante o transporte mitocondrial (ROS) - espécies reactivas de Oxigénio ou
radicais livres de Oxigénio.A Hp tem uma actividade anti-oxidante, fenotípico-dependente,
contribuindo para este processo sobretudo no espaço extravascular. Os Hp 1-1 resistem mais ao
stress oxidativo celular, que os Hp 2-2, sendo os Hp 2-1 um fenótipo intermédio2.
Durante a lesão tecidular ou infecção, os neutrófilos activados, que são a primeira linha de defesa
ajudam no recrutamento de outras células inflamatórias.Podem gerar ROS, assim como recrutar
outras células como os monócitos-macrófagos. A Hp, é sintetizada durante a diferenciação dos
neutrófilos, e armazenada para ser libertada quando estes são activados. O fenótipo Hp2-2,
continua a ser um factor de risco para as doenças inflamatórias.
A Hp também se liga à Apo A1 (Apolipoproteina A1), protegendo da acção dos radicais livres, e
prevenindo a HDL de fazer complexos com outras lipoproteínas.
O complexo Hp-Hb liga-se ao Óxido Nítrico-NO, havendo vantagem do complexo Hp1-1:Hb, que é
removido mais fácilmente da circulação.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
34
A Hp tem capacidade de inibir a Lipoxigenase (LO) e cicloxigenase (COX), interferindo na síntese de
prostaglandinas e leucotrienos.
A Hp tem também outras propriedades anti-oxidantes, como seja a de impedir a associação de
proteínas induzida pelo stress oxidativo ou pelo calor, estando elevada em situações como a
gravidez, obesidade e enfarte do miocárdio.
A Hemogolobina quando está fora do eritrócito é altamente tóxica.O grupo prostético (heme) é
lipofílico e pode destruir a membrana das células; o Ferro do heme cataliza a formação de ROS
através da reacção de Fenton e Haber-Weiss, adicionalmente a Hb liga-se àvidamente ao óxido
nítrico, que é um modulador do tónus vascular. A remoção da hemoglobina que se liberta da
hemólise intra-vascular e extravasclar, envolve a Haptoglobina, Hemopexina e receptor CD163 dos
macrófagos. Tanto a capacidade de ligação à Hb como a afinidade para o CD 163 dos macrófagos,
é fenótipo dependente. A protecção contra um evento hemolítico é a seguinte: Hp1-1>Hp2-
1>Hp2-21.
6.7.Hp COMO INIBIDORA DA LIPOXIGENASE E CICLOXIGENASE
A Hp liga-se à Hb23, específica e estoiquiométricamente. Como a Hb estimula a síntese de
prostaglandinas(PGs), tem particular relevância o efeito que a Hp possa ter na via do ácido
araquidónico(AA). Aparentemente apenas 50-250 microgramas de Hp chegam para inibir a síntese
de PG pela cicloxigenase(COX) e 12-HETE pela lipoxigenase (LO) nas plaquetas.Dos 3 genótipos a
Hp1-1 é a mais eficiente na remoção da Hb, tendo maior papel protector. Estes dados vêm
reforçar o papel da Hp na regulação das vias da COX( PGs :E2,F2α e TxA2) e LO, envolvendo a Hp
no sistema de defesa do organismo contra a inflamação.
A Hp, circula no plasma como um polímero cujas propriedades estoiquiométricas e biofísicas
dependem do genótipo (Hp 1-1, Hp 2-1, ou Hp 2-2 ). Muitas diferenças têm sido observadas
quanto às suas funções. A Hp1-1 protege melhor a LDL contra a oxidação induzida pela Hb, do que
a Hp 2-224-28. Apesar do Hp2-2 se ligar com maior afinidade (10x) ao receptor CD163 é menos
eficiente do que o Hp1-1 e Hp2-1, estando associado nos homens a níveis mais elevados de Ferro ,
saturação mais elevada da transferrina, e ferritina mais alta.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
35
O Hp2-2 também está associado a pior prognóstico na infecção por HIV1 ao contrário do Hp1-1.A
razão pela qual os Hp1-1 estarão mais protegidos em relação `a inflamação poderá dever-se ao
facto de que a maior capacidade de captação do Ferro (3x) associado ao Hp1-1 em relação ao Hp2-
2. Estas características da Hp ligadas ao genótipo e disponibilidade do ferro da Hb e estão
indissociadas do controlo endógeno da inflamação também através do controlo do metabolismo
do AA através da COX e LO.
6.8.Hp COMO ADIPOCINA NA INFLAMAÇÃO NA OBESIDADE
O tecido adiposo branco é agora reconhecido como um órgão multifuncional, capaz de armazenar
lípidos , e ter uma função endócrina major secretando várias hormonas, nomeadamente Leptina e
adiponectina, e vários outros factores proteicos. A estes sinais proteicos tem sido dado o nome de
adipocinas, por não serem nem citocinas nem “citocina-like”. As adipocinas são proteínas
secretadas e sintetizadas nos adipócitos.
O adipocinoma: ácidos gordos, PGs-secretoma das células gordas, incluem outras proteínas
envolvidas no metabolismo lipídico, sensibilidade à Insulina, activação da via alterna do
complemento, hemostase, regulação da Pressão Arterial, angiogénese e balanço energético.
Há também uma lista crescente de adipocinas envolvidas na inflamação (TNFalfa; IL-1beta; IL-6; IL-
8; IL-10; TGF-beta; factor de crescimento neuronal) e resposta de fase aguda ( inibidor1 do
activador do plasminogénio; Hp; amiloide sérica A). A produção destas proteínas pelo tecido
adiposo, aumenta na obesidade, e os níveis elevados de citocinas inflamatórias e de PFA , leva à
conclusão que a obesidade é caracterizada por uma inflamação ligeira e crónica podendo levar à
resistência à insulina e ao síndrome metabólico (Figuras 13 e 14), entre outras funções autócrinas,
parácrinas,endócrinas ou envolvendo múltiplos níveis.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
36
Figura 13: Adipocinas caracterizadas por papel functional
Figura 14: Proteínas inflamatórias e de fase aguda secretadas pelos adipócitos
Proteínas inflamatórias e de fase aguda secretadas pelos adipócitos. A vermelho estão as que
foram claramente identificadas como adipocinas e a azul as prováveis adipocinas (PCR-proteína C
reactiva, IL- Interleucina, NGF- factor de crescimento neuronal, PAI-1- inibidor 1 do activador do
plasminogénio, TGF-beta-factor transformador do crescimento-beta, TNF-alfa-factor de necrose
tumoral alfa, MCP1-proteína quimioatractiva de monócitos)29,30.
Balanço energético e apetite
Imunidade
Angiogénese
Sensibilidade à insulina
Inflamação e resposta de fase aguda
Pressão arterial
Hemostase
Metabolismo lipídico
Balanço energético e apetite
Imunidade
Angiogénese
Sensibilidade à insulina
Inflamação e resposta de fase aguda
Pressão arterial
Hemostase
Metabolismo lipídico
Proteinas de fase agudaPAI-1HaptoglobinaAmilóide A séricoA1-glicoproteína ácida24p3PCR?
Proteínas relacionadas com a inflamação
AdiponectinaNGF
MCP-1
CitocinasTNFIL-1IL-6IL-8IL-10TGB(leptina)IL-17DIL-18
Proteinas de fase agudaPAI-1HaptoglobinaAmilóide A séricoA1-glicoproteína ácida24p3PCR?
Proteínas relacionadas com a inflamação
AdiponectinaNGF
MCP-1
CitocinasTNFIL-1IL-6IL-8IL-10TGB(leptina)IL-17DIL-18
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
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6.9.Hp COMO LIGANDO DO CD11/CD18
A Hp é uma PFA com presumíveis propriedades anti-inflamatórias, com capacidade de se ligar a
monócitos, neutrófilos, células CD8, NK, por um processo dependente de cálcio e ADP. A Hp é um
ligando de baixa afinidade para as integrinas nomeadamente CD11/CD18 que são responsáveis
pela ligação ao ICAM-1 das células endoteliais inibindo a adesão e extravasão dos neutrófilos.
6.10.Hp COMO LIGANDO DO CD22
A Hp31 é uma glicoproteína que se liga especificamente ao CD22 dos linfócitos B podendo modular
a sinalização do BCR assim como a migração das células B. O CD22 é um receptor multifuncional
transmembranar que é um regulador da sinalização do receptor de antigénio das células B (BCR) e
molécula de adesão lectina-like que se liga a ligandos com alfa2,6 ácido siálico.Das inúmeras
proteínas plasmáticas com alfa2,6 ácido siálico, só a Hp e a IgM são ligandos de alta afinidade para
o CD22.
Tem sido sugerida uma relação entre os polimorfismos da Hp e os níveis de linfócitos B periféricos
sendo positiva para Hp2-2 e negativa para Hp1-1.
Os Hp 2-2 dada a grande afinidade para os receptores CD163 dão origem a macrófagos
sobrecarregados de ferro e fontes de ROS, Os Hp1-1 levam os macrófagos a secretar IL-10 e outras
citocinas anti-inflamatórias e heme-oxigenase1(HO1)
6.11.POLARIZAÇÃO DOS MACRÓFAGOS ASSOCIADO À HIPÓXIA ,SINTASE DO ÓXIDO
NÍTRICO(NOS),ARGINASE E POLIMORFISMO DA Hp
A resposta à hipoxia e32,33 à inflamação envolve o HIF1α e HIF-2 α -factores de transcrição
indútiveis pela hipoxia, e são ambos similarmente regulados pós-traducionalmente, embora a
relação funcional destas duas isoformas não seja clara.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
38
A polarização de macrófagos deve-se a diferentes processos: um deles é o NO-óxido nítrico que
em parte é controlado pelo HIF. As isoformas de HIf α podem ser activadas de forma diferente: o
HIF1α é induzido pelas citocinas Th1 na resposta M1 e o HIF-2 α é induzida pelas citocinas Th2
durante a resposta M2.
Esta diferente resposta é mais evidente nos macrófagos polarizados durante a regulação específica
das isoformas HIF- α sobre o gene da sintetase indutível do NO- para o HIF-1 α - e no gene da
arginase 1 pelo HIF-2 α . O HIF1α aumenta e o HIF2 α suprime a síntese de NO.
A caracterização funcional dos macrófagos em M1-activados pela via clássica- em resposta a
liposscáridos (LPS) ou citocinas Th1 como IFN gama, por oposição aos da via alterna M2, activados
por citocinas Th2 IL-4 e IL-13 e em que interfere o receptor CD163 para a Hp. Estes macrófagos
polarizados tmbém originam populações Th1 e Th2 respectivamente.
Os macrófagos34 estão frequentemente presentes em tecidos hipóxicos, sendo que a hipoxia
afecta fortemente a função dos macrófagos. Muita da resposta transcricional à hipoxia é mediada
por factores de transcrição conhecidos como HIF(hipoxia-inducible factors). Um destes o HIF-1α, é
expresso de forma ubiquitária, e está muito ligado à resposta inflamatória e microbicida. Outro
componente da família HIF:HIF-2α, é expresso de forma mais limitada . De entre os alvos
transcricionais do HIF-1α, o gene da sintase do NO indutível (iNOS) é regulado pela hipoxia além
de outros factores.Também se exprime primáriamente nos macrófagos polarizados M1 .A iNOS
produz NO- mensageiro aerócrino entre as vias aéreas superiores e inferiores- ao metabolizar o
seu substrato, o amino ácido L-arginina .Os macrófagos têm outro enzima metabolizador da
arginina a arginase 1-que origina ornitina e ureia.. A Arginase1 está altamente expressa nos
macrófagos M2 , e compete com a iNOS para um substracto comum, L-arginina . Arginase1pode
assim regular a produção de NO através da limitação da disponibilidade de arginina no ambiente
extracelular . A expressão do gene da Arginase1 também é induzido pela hipoxia . A regulação na
hipoxia destes 2 destinos da Arginina: sintese de NO e arginase1, depende dos factores de
transcrição HIF -1α e HIF-2α que estão expressos de forma diferente nos macrófagos M1 e M2,
devido ao ambiente de citocinas Th1 ou Th2.O HIF -1α e HIF-2α actuam de forma cooperante para
manter a homeostasia do NO através de um antagonismo funcional em dois genes alvo: iNOS e
Arginase1.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
39
6.12.HAPTOGLOBINA, IMUNIDADE INATA E ATOPIA
Os macrófagos 35caracterizados por elevada expressão do receptor da manose CD206 e CD163
existem nas placas ateroscleróticas em zonas de hemorragia intraplaca. A subunidade heme do
complexo Hp-Hb é degradada pela heme-oxigenase.Esta ligação do complexo Hp-Hb ao receptor
CD163 assim como o aumento da IL-10 pode ter um papel importante na polarização M1/M2
(Figura 15).
Figura 15: Classificação dos macrófagos
Propriedades dos macrófagos polarizados: os macrófagos activados pela via clássica (M1) são
induzidos pelo LPS e/ou estimulação por produtos microbianos. O seu repertório inflamatório é
caracterizado pela secreção de mediadores pró-inflamatórios, e libertação de intermediários
reactivos de oxigénio (ROI) e intermediários reactivos azotados (RNI). Pelo contrário a activação
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
40
alterna dos macrófagos (M2) confere um continuum de estados funcionais classificados como M2a
induzidos pela IL4/IL-13, M2b induzido por complexos imunes e agonistas dos toll like receptors
(TLRs), e M2c induzidos pelos glucocorticoides e IL-1036.
Os macrófagos são células do sistema immune que estão distribuídas pelo organismo e são
indispensáveis na homeostasia e defesa.Podem ser polarizados fenótipicamente pelo
microambiente. Assim os macrófagos activados pela via clássica-M1- cujos factores de activação
são: IFN gama e LPS. Os macrófagos M2 ou da via alterna, subdivididos em M2a( após exposição a
IL-4 ou IL13); M2b (complexos imunes em combinação com IL1beta ou LPS) e M2c (IL-10, TGF beta
ou glucocorticóides). Os M1 têm uma potente acção anti-microbiana e promovem respostas Th1 ,
IL-12 mediadas. Os M2 suportam as funções efectoras Th2. Estes últimos estão relacionados com a
alergia os M2, têm um papel na resolução da inflamação. Os TAM-tumor associated macrophages
têm um fenótipo semelhante aos M2 e acção anti-tumor.
Os macrófagos activados pelo LPS ou citocinas Th1 como IFN gama, são macrófagos M1 e
constituem a via clássica. Os M2 são activados pels citocinas Th2 incluindo Il-4 e IL-13 e constituem
a via alterna. A polarização M1 é importante na depuração e fagocitose dos patogénios
intracelulares, isto é mediado pela produção de citocinas pró-inflamatórias, ROS e NO. Os
macrófagos M2, activados pelas citocinas M2 da via alterna são importantes na imunidade
humoral e reparação tecidular.
Os monócitos ao passarem a parede vascular, polarizam-se de modo diferente de acordo com o
ambiente envolvente.M-DC: células dendríticas por acção do GM-CSF granulócito-macrófago
factor estimulante de colónias e IL-4; M-ox, células esponjosas, indutível por oxLDL; M-HA:
macrófagos associados à hemorragia indutível pelos complexos Hp-Hb; M4-indutíveis pela
quimocina plaquetária CXCL4;M2a indutível pelas IL-4, IL-13; M2b- indutível pelos Complexos
imunes; M2c indutível pela IL-10; M1-indutíveis pelo GM-CSF e LPS-lipopolissacárido/ IFN
gama35,37.
Os macrófagos têm um papel fundamental na imunidade inata, e orquestram a inflamação numa
série de doenças inflamatórias mediadas imunológicamente. Derivam dos monócitos circulantes,
diferenciam-se em macrófagos nos tecidos e podem ser activados por derivados dos
microorganismos e antigénios.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
41
Existe evidência de que a resposta macrofágica não depende tão sómente do tipo de activação,
mas também do micro-ambiente em que as células se diferenciam antes da activação.O exemplo
mais frequente é o da activação dos macrófagos pelo LPS através do TLR dependendo de um pré-
estimulação pelo IFN gama ou Complexos imunes(CIC) levando a perfis diferentes:M1 e M2.O IFN
gama, polariza no sentido M1-via clássica- que secreta altos níveis de TNF, IL-12, IL-1β e baixos de
IL-10 e tem um papel importante no combate a patógénios intracelulares. Em contraste, a IL-4 , IL-
10, glucocorticóides, TGFbeta e CIC,induz os macrófagos da via alterna-M2- que se caracterizam
por citocinas de baixo poder pro-inflamatório e aumento de IL-10 ,e estão envolvidos na reparação
tecidular, reacções alérgicas e anti-parasitárias
Além desta diferença nas citocinas, o conceito de polarização foi confirmado por diferenças na
produção de qumioquinas, metabolismo do NO , fagocitose, trancricional , morfologia celular e
fenótipo . Alterações fenotípicas são o receptor da manose CD206 e o receptor capturador da Hp
CD163, cuja expressão aumenta com a IL-4 e IL-10 respectivamente. Os TAM-tumor associated
macrophage- são um fenótipo à parte que partilham propriedades pro e anti-inflamatórias.
Outro é o ATM-adipose tissue macrophage- que inclui macrófagos M1, M2 e M1/M238-41.
A Hp interfere de diferentes formas nas actividades celulares e humorais, tanto no sistema Imune
inato como adaptativo, incluindo síntese de prostaglandinas e leucotrienos, recrutamento e
migração de leucócitos, perfis de citocinas e reparação tecidular.
A Hp é um excelente supressor da proliferação de células T. Os macrófagos activados pela
fagocitose do complexo Hp2-2:Hb através do receptor CD163, desviam a resposta Th-T helper para
um perfil Th1, enquanto os macrófagos activados pelo complexo Hp1-1:Hb geram citocinas Th2. O
balanço desta resposta T parece ser particularmente importante no espaço extravascular, através
da expressão local de Hp, reduzindo a lesão dos tecidos circulantes.
Nos espaço extravascular as células dendriticas respondem a sinais de alarme (metabolitos
biomoleculares, ROS, RNI-compostos reactivos azotados, etc.)5 e interagem com
antigénios/alergénios. Estas células dendríticas diferenciam-se em células maduras e migram para
os gânglios linfáticos onde interagem com células T naive-Th0. Sendo a Hp um ligando para os
macrófagos pode ter um papel importante no processo de activação destas células (Hp1- perfil
Th2 e Hp2 -perfil Th1).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
42
A asma alérgica é uma doença inflamatória Th2 das vias aéreas. A asma aparece como uma falha
nos mecanismos imunoreguladores a nível do epitélio respiratório.
Na hipótese da higiene a ausência de estimulação da via Th1 da resposta imune adaptativa, iria
implicar uma prevalência Th2. No entanto, dados actuais, em que se verifica haver um aumento
das doenças autoimunes Th1 como a Diabetes tipo1 e esclerose múltipla nas sociedades
ocidentais, veio sugerir que os 2 grupos de doenças Th1 e Th2 podem coexistir no mesmo
doente.Estes dados contrariam a prevalência de um tipo de ambiente imunológico- Th1 ou Th2
sobre o outro- como defende a hipótese da higiene.
Estes novos dados apontam para a existência de uma regulação (papel das células Tregs- células T
reguladoras) deficiente em ambas as doenças. No entanto os defensores da hipótese da higiene,
continuam a defender, que a “higiene” privaria o sistema imunológico dos sinais necessários para
o desenvolvimento das vias reguladoras capazes de controlar tanto a resposta Th1 como a Th2.
Simultaneamente, os avanços na imunologia vêm focalizar a atenção no papel central da
Imunidade inata como grande orquestrador da resposta imunológica e manutenção da tolerância.
A Imunidade Inata é em geral não específica, de curta duração, depende de células da linhagem
mielóide (como: monócitos, macrófagos, mastócitos, células dendríticas e neutrófilos) e células da
linhagem linfóide (como as células NK-natural killer).
As células do sistema imune adaptativo, são activadas mais tardiamente e induzem uma resposta
duradoura e específica mediada pelas células T helper CD4+, células T citotóxicas CD8+ e células B.
Uma sequência de citocinas produzidas após activação do sistema imune inato leva à
diferenciação das células T naive CD4+ Th0, em células Th efectoras: Th1, Th2, Th17 e Tregs.
Em particular as células APCs-células apresentadoras de Antigénio- como as células dendríticas,
expressam TLRs (Toll-like receptors), levando à activação do sistema imune adaptativo e indução
das células Treg e mediadores. Por seu lado as Tregs, que ocorrem naturalmente ou induzidas
pela imunidade inata, regulam todos os tipos de resposta adaptativa assim como as células
macrofágicas e a sua activação e regulação.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
43
As célula dendrítica e macrofágica (APC) modulam o balanço dinâmico entre a resposta Th2 e os
mecanismos reguladores influenciando todas as fases da inflamação das vias aéreas (iniciação e
efectora).
As doenças alérgicas são doenças inflamatórias que se desenvolvem numa complexa interacção
entre os genes e o ambiente. A prevalência das alergias está aumentar e parece estar associada a
diferentes estilos de vida. O balanço entre células Th1, Th2 e Treg, é desencadeado por um
sistema imune inato activo ou alterado.
Esta activação da imunidade inata através das células Apresentadoras do Antigénio(APCs) em que
intervém a Hp e o seu receptor CD163 no macrófago ( marcador dos macrófagos M2), pode ser um
factor adicional na polarização Th2 da resposta alérgica tal como o fazem os alergénios3. Estes,
conseguem activar o sistema Imune inato das mucosas , provocando um influxo celular que vai ter
uma resposta adaptativa polarizada no sentido Th2. Esta activação do sistema imune inato pelos
alergénios é feita através de: actividade proteolítica; ligação a receptores de reconhecimento
padrão; mimetismo molecular com os complexos moleculares sinalizadores dos TLRs; actividade
ligante com lípidos e potencial oxidativo.
Tal como a nomenclatura Th1/Th2, os macrófagos polarizados são referidos como M1 e M29.
Durante a resposta imune inata, os macrófagos activados formam um contínuo entre M1 e M2,
produzindo diferentes citocinas e receptores para citocinas. Os macrófagos M1 estimulam as
respostas mediadas por células, através da produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6, IL-
12, IL-23, Factor de necrose tumoral α-TNF α, IL1RI-receptor tipo I da IL-1. Os macrófagos M2
estimulam a resposta humoral, remodelção tecidular e angiogénese, através da produção de
citocinas anti-inflamatórias(IL-10, TGFβ (Factor de transformação de crescimento β), IL1RII e
antagonistas dos receptores de IL1.
Os M1 são também designados como activados pela via clássica, e podem ser induzidos pelo IFNγ,
LPS, TNF-α e GM-CSF. Este tipo de macrófagos, actua na fase inicial da inflamação, e produz
grandes quantidades de citocinas pró-inflamatórias(IL1-β, TNFα, IL-6) , radicais livres de oxigénio ,
compostos intermédios de azoto e participa como inductor e efector nas reacções polarizadas
Th1.A fase de resolução é caracterizada por macrófagos que produzem citocinas anti-
inflamatórias, elevada capacidade fagocítica e têm elevada expressão do receptor da manose :
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
44
CD206 e dos receptor para o complexo Hb-Hp : CD163-macrófagos M2. São macrófagos activados
pela via alterna, e podem ser induzidos pela I-4, IL-13, complexos imunes, IL-10, glucocorticoides,
activina-A (membro da família TGF-β) e IL-21.Em geral os macrófagos M1 são IL-12 alto, IL-23 alto,
IL-10 baixo. Além de participarem na resposta Th1, também são responsáveis pela resistência
contra parasitas intracelulares e actividade contra células tumorais. Em contraste as várias formas
de macrófagos M2 (M2a, M2b e M2c), são IL-12 baixo, IL-23 baixo, IL-10 alto, e têm uma
capacidade variável de produzir citocinas inflamatórias, com um perfil Th2.Estão associadas à
atopia e asma alérgica, podem promover crescimento de tumores e formação de metástases. O
controlo homeostático, dos monócitos/macrófagos, é feito também pelas células TregCD4+CD25+.
6.13.CD163 E VIAS METABOLIZADORAS DA Hp
O receptor capturador42 CD163 contém 9 domínios ricos em cisteína de receptor captador (SRCR)
e devido a esta proteína ancestral o CD163 pertence à superfamília SRCR. O CD163 está limitado
às células monócito/macrófago, sendo a sua expressão aumentada por estímulos anti-
inflamatórios, e os pro-inflamatório diminuem a sua expressão.A sua função mais conhecida é a de
se ligar e internalizar os complexos Hp-Hb.Mais tarde foi identificado como receptor de adesão
dos eritroblastos, receptor do factor-like de necrose tumoral fraco indutor de apoptose(TWEAK),
receptor para várias bactérias e vírus,de que resulta endocitose, ou despoletar sinalização e
secreção de outras moléculas podendo assim também ser considerado como imunomodulador.A
porção solúvel do CD163, que se deve a um derramamento do ectodomínio também exerce
funções anti-inflamatórias, podendo ser um marcador de algumas doenças.O facto, do seu padrão
de expressão restrito e potencial de internalização tornam-no um candidato a imunoterapia
celular- dirigida.
Os macrófagos e as suas células progenitoras, monócitos são peças chave na resposta immune, e
não só cumprem uma série de funções como são complementados por uma série de moléculas de
superfície. O receptor CD163 é uma delas e foi inicialmente identificado como RM3/1 em 1987
(Zwadlo et al., 1987)antes de receber o seu número em 1996 (Kishimoto et al., 1997) e receptor
capturador de Hb (HbSR) (Kristiansen et al., 2001). Só em 2001 foi atribuída uma função ao CD163
quando esta glicoproteína foi identificada como receptor capaz de internalizar o complex Hp-Hb.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
45
No entanto, outros ligandos foram sendo descritos indicando que o CD163 é um receptor
multifuncional envolvido não só en endocitose como em processos de sinalização após interacção
com diferentes ligandos.
ESTRUTURA
Haptoglobina
Hemoglobina
Resposta anti-
inflamatóriaBilirrubina
BilirrubinaBiliverdina
Heme
Ligandos de
proteinas
degradados
Reciclagem
de receptores
EndocitoseVia sinalizadora
Figura 16: Receptor CD163
O CD163 (Figura 16) é uma proteina transmembranar composta de 9 domínios consecutivos
extracelulares SRCR tipoB, SRCR 6 e 7 separados por um polipéptido de 35 (aa)-aminoácidos-
(PST).Após os domínios SRCR uma sequência PST conecta SRCR 9 com um domínio
transmembranar e uma cauda citoplasmática. Esta cauda intracelular está sujeita a várias
alterações resultando em várias isoformas de CD163. (Law et al., 1993; Ritter et al., 1999).A forma
mais abundante tem uma cauda de 49 aa(aminoácidos) e a menos tem 84-89aa. Os primeiros 42
aa podem ser fosforilados e a molécula do CD163 é extensamente glicosilada.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
46
EXPRESSÃO E REGULAÇÃO
A expressão do CD163 está restrita à linhagem monócito/macrófago. E é preponderante nos
macrófagos “residentes”: macrófagos da polpa vermelha esplénica, células de kupfer hepáticas e
macrófagos alveolares do pulmão.Também nos gânglios linfáticos, amígdalas e meníngeos. Estes
macrófagos “maduros” têm maior expressão de CD163 do que os monócitos circulantes, também
se observando durante a fase de resolução de um processo inflamatório .A expressão do CD163 é
regulada por uma série de factores entre eles os glucocorticóides, IL-10 e IL-6. Por outro lado, os
estímulos pró-inflamatórios como :IFN gama, LPS e TNF alfa suprimem a expressão de CD163 . No
entanto a redução observada pode-se dever (como no caso da LPS)à queda do ectodomínio do
CD163-sCD163.
PAPEL FUNCIONAL
O CD163 é um receptor que se liga à Hb ligado à depuração dos complexos Hp-Hb(2001 -
Kristiansen et al). A libertação de Hb para o plasma pode ser fisiológica no processo que ocorre
durante a senescência dos eritrócitos, ou associada a doenças como a doença hemolítica ou
mesmo na reacção alérgica e aterosclerose. A remoção da Hb livre é essencial devido ao potencial
oxidante do ferro contido no heme da Hb. Depois da libertação da Hb liga-se à Hp numa ligação
não-covalente muito forte, levando à exposição de um neo-epitopo que interage com o 3º SRCR-
domíno do CD163 de uma forma dependente do cálcio .De entre as três variantes a que tem a
cauda mais curta é a que tem maior capacidade de endocitose ligante . Após endocitose a carga é
deixada em endosomas e o CD163 volta à membrana plasmática. Depois de libertada a
subunidade heme da Hb é degradada pela hemeoxigenase-1 (HO-1), originando biliverdina, ferro
livre e CO. As funções da Hp e do CD163/HbSR podem ser avaliadas como um mecanismo eficaz de
prevenir a acumulação da Hb no plasma, e dos efeitos tóxicos do Ferro hémico.No entanto em
casos de acelerada hemólise, a deplecção de Hp pode levar a dano tecidular, em particular nos
túbulos proximais renais, que captam a Hb dos ultrafiltrados glomerulares.
Os humanos diferem de outros mamíferos, pelo facto de terem duas variantes alélicas Hp*1 e
Hp*2. O gene para Hp-2 originou-se de uma duplicação parcial da região que contém uma cisteína
envolvida na homodimerização. Este resíduo extra de cisteína, pode originar pontes dissulfito com
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
47
outras moléculas Hp-2. Os heterozigotos com genótipo/fenótipo Hp2-1, são uma mistura de
dímeros e oligómeros.O CD163/HbSR liga-se aos complexos multiméricos de Hp2-2 e Hp2-1 de
forma mais forte quando comparados com os dimérico Hp1-1, embora sejam menos eficientes na
sua função de captura plasmática da Hb. A IL-6 –mediador de fase aguda- aumenta a expressão de
CD163 e heme-oxigenase. Durante o processo inflamatório este sistema “captura-molécula-
receptor-enzima”pode estar coordenado e contribuir para a remoção da Hb do plasma.
O RECEPTOR CD163 COMO MEDIADOR DE EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIOS
Após a endocitose 41 do complexo Hp-Hb, o enzima limitante heme-oxigenase (HO) degrada a
subunidade heme da Hb.As 3 isoformas da HO(HO-1, HO-2 e HO-3) têm origem em diferentes
genes.A que é expressa constitutivamente HO-2, não responde a nenhum dos indutores da HO-1.
A isoenzima HO-3 é desprovida de actividade catalítica e serve como “sensor” do heme (Elbirt &
Bonkovsky, 1999).
A HO oxida o heme para biliverdina, que depois é convertido em bilirrubina CO e Ferro livre pela
biliverdina reductase.A HO-1, é induzida rapidamente na resposta às citocinas, NO , peroxinitrito e
ROS.O aumento da expressão de HO-1 confere protecção contra o stress oxidativo e pode ter
acção anti-inflamatória( Alcaraz et al.,2003).
CD163 COM PAPEL IMUNOREGULADOR
A regulação do CD163, pelos mediadores de fase aguda pode sugerir uma função
imunoreguladora.A via sinalizadora inclui a fosforilação da cauda citoplasmática, produção de
trifosfato inositol e mobilização lenta do cálcio.
Além de ser um marcador dos macrófagos M2, hoje ainda não se atribui um valor diagnóstico e
terapêutico ao CD163.Recentemente demonstrou-se que o CD163, existia no plasma .Devido à
constante libertação para o plasma, a sua concentração pode reflectir a sua expressão geral, como
nalgumas doenças.
O CD163 é um receptor capturador da classe B expresso nos macrófagos maduros tecidulares. Não
só é responsável pela depuração43 da Hb através da endocitose dos complexos Hp-Hb prevenindo
a lesão oxidativa, mas também activa uma cascata sinalizadora que resulta na produção de
moléculas anti-inflamatórias.Por seu lado o sCD163 solúvel é um marcador de actividade
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
48
macrofágica, pensa-se que a sua concentração poderá traduzir a quantidade de macrófagos M2,
que são os que têm maior expressão de CD163.Há neste momento numerosos estudos que
tentam relacionar o sCD163 com estados patológicos de inflamação como: infecção, doenças
autoimunes, transplante, aterosclerose, alergia e cancro.
Durante o processo de endocitose do complexo Hp-Hb, o receptor é internalizado voltando depois
à superfície, podendo este processo ser aproveitado para transporte de fármacos anti-
cancerígenos e proteínas.
CD163 é um receptor endocítico de 130 kDa para os complexos Hp-Hb e expressa-se nos
macrófagos e monócitos cuja forma solúvel sCD163 tem sido identificada como marcador de
actividade macrofágica em doenças como: sepsis, doença autoimune, doença hepática entre
outras.Enquanto que a função do CD163 membranar, como receptor do complexo Hp-Hb está
bem estabelecido, o papel do CD163 solúvel: sCD163, não é claro. A queda do sCD163 pode
interferir com a captação do ferro e inibir o crescimento de patogénios intracelulares.Tem sido
proposto que o sCD163, pode estar directamente envolvido na sequestração de ferro, ao ligar-se
aos complexos Hp-Hb circulantes.
A expressão de CD163 44,45 é induzida pela IL-6, Il-10 e glucocorticóides.
A sua função primordial é a remoção de complexos Hp-Hb do plasma. Além do efeito anti-
oxidante , a endocitose do complexo Hp-Hb através do receptor CD163, pode representar uma via
major para captação do ferro pelos macrófagos dos tecidos.A ligação entre a Hp e o receptor
CD163, que aumentam durante a inflamação, sugerem propriedades anti-inflamatórias
relacionadas com o receptor CD163 e os diferentes genótipos de Hp.
O CD163, contém 9 cópias do domínio SRCR o qual existe em 2 variantes (Classe A e B).
Os receptores capturadores ricos em cisteína-SRCR são proteínas de membrana com uma cauda
citoplásmica curta, um segmento transmembranar e uma região extracelular só com domínios
SRCR da classe B. Até agora o conhecimento estava limitado aos CD5 e CD6, que se pensa estarem
relacionados com interacções entre leucócitos. No entanto a identificação do HbSR-CD163- veio
abrir novas perspectivas nas funções dos receptores da classe B SRCR.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
49
A função combinada da Hp e do CD163 , é um mecanismo eficiente que previne a acumulação de
Hb no plasma e os efeitos tóxicos do ferro hémico46.
Law et al. (1993)identificaram o CD163,como um antigénio associado aos macrófagos com 130
kDa, pertencente à famílla de receptores capturadores ricos em cisteína (SRCR)tipo B.
O papel biológico do CD163 está relacionado por um lado com a depuração da Hb e potencial
função imunoreguladora (anti-inflamatória) (Graversen et al., 2002) que partilha com o próprio
polimorfismo da Hp.
De entre os sistemas eficientes para remoção deHb41,46 tóxica e pró-inflamatória da circulação e
dos tecidos, encontra-se o macrófago com o seu receptor CD163. Está envolvido, tanto em
processos fisiológicos como patofisiológicos: citoprotecção e inflamação.
Em quantidades moderadas a Hb liga-se ao receptor CD163, mas se for em grandes quantidades
pode aumentar o stress oxidativo e contribuir para a inflamação. O CD163, tem um papel crucial
no controlo da inflamação não só pela activação dos macrófagos M2, captação da Hb, indução da
ferritina, vias anti-inflamatórias com intervenção de citocinas como a IL-10 e o enzima HO.Desta
forma além de contribuirem para uma nova perspectiva dos processos fisiológicos e patológicos,
tanto o CD163 como o sCD163, são possíveis armas terapêuticas e diagnósticas em doenças tão
distintas como: alergia, aterosclerose, rejeição de transplantes e cancro.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
50
Figura17: Representação esquemática das principais vias de metabolização da Hb
A Hb (Figura 17) libertada na circulação ou nos tecidos liga-se à Hp, estes complexos estáveis da
Hp-Hb passam rápidamente para o sistema reticuloendotelial hepático, havendo receptores
específicos (não CD163)à superfície do hepatócito para o complexo Hp-Hb.A Hp dirige a Hb para os
sitema monócito-macrófago, no fígado e baço prevenindo a filtração glomerular, mas também
para os macrófagos tecidulares através do receptor CD163, que pertence à superfamília de
receptores capturadores ricos em cisteína tipo B(SRCR).Defenindo-se para o CD163 e complexo
Hp-Hb um papel central nas funções homeostáticas dos macrófagos a nível dos tecidos na
prevenção da toxicidade mediada pela Hb.
Os eritrócitos senescentes ou malformados, são fagócitados pelos macrófagos do baço, fígado e
medula óssea.O catabolismo normal da Hb, formação de pigmento biliar e reciclagem do ferro tem
lugar fora da circulação. A hemólise intravascular gera Hp que está estiquiométricamente ligada
com a Hp para ser removida pelos macrófagos tecidulares.No entanto se a capacidade tampão da
Hp plasmática for excedida, como acontece nos episódios de hemólise intravascular, então a Hb é
filtrada pelo rim, reabsorvida pelo epitélio tubular renal ou excretada na urina, ou ainda
formarem-se complexos de baixa afinidade com a hemopexina e albumina .
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
51
A Hp é produzida como uma proteína de fase aguda, pelos hepatócitos durante a resposta
imediata à agressão do hospedeiro.A proteína é sintetizada como uma cadeia simples, sendo
depois clivada num terminal amino : cadeia alfa e num terminal carboxil: cadeia beta(7).A
electroforese em gel de poliacrilamida desenvolvido por Oliver Smithies, levou à descoberta dos
diferentes polimorfismos a partir dos dois alelos Hp*1 e Hp*2. As variantes proteicas dos
polimorfismos diferem no comprimento da cadeia alfa designada alfa1 e 2 e os diferentes
genótipos/fenótipos:Hp(1-1) ,Hp(2-2), e Hp(2-1) .Os complexos Hp-Hb são capturados pelo CD163
dos macrófagos, que aumenta na presença de IL-10 e glucocorticoides . Tanto a Hp como o CD163
são induzidos pela citocina pro-inflamatória de fase aguda: IL-6. A coordenada indução de ligando
e receptor é um mecanismo que visa aumentar a depuração de Hb .
A terapêutica com corticosteróides induz a expressão de CD16341,47-49 à superfície dos
monócito/macrófagos, e facilita a endocitose da Hb através deste receptor e induz a síntese de
HO-1.
A HO, é um potente enzima anti-inflamatório e anti-oxidante, que está envolvido primáriamente
na degradação do heme em biliverdina, monóxido de carbono (CO) e Ferro livre. Tem sido
sugerido que a HO seja um enzima citoprotector através da actividade anti-oxidante da biliverdina
e o seu metabolito bilirrubina, assim como o CO .
.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
52
6.14.TOLERÂNCIA, DOENÇA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA Hp
Figura 18: Interacção entre o sistema imune inato e adaptativo; inflamação aguda e crónica
na asma alérgica.
Neste esquema (Figura 18) está demonstrada a interacção entre as células DCs e as células
TCD4+(Tconvencionais)50-67durante a inflamação aguda e o crescente número de iTregs na
inflamação crónica .
As iTregs e nTregs inibem a capacidade apresentadora de Ag pelas Dcs 50,52,53,54,56,58e assim
contrabalançam a polarização Th1 e Th2.
A diferenciação das células Dcs sob condições locais de infecção, inflamação (alérgica por
exemplo), ou tumoral pode originar células Dcs basais (DC1 e Dc2) diferentes em resposta aos
factores locais capazes de polarizar as células T num sentido Th1 ou Th2 (possível associação com
os polimorfismos da Hp e diferente polarização das Dcs).
A asma atópica 68resulta de uma inflamação das vias aéreas desencadeada por alergénios do
ambiente. Os sintomas incluem a sibilância, dispneia e tosse, diminuição do calibre das vias aéreas
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
53
e/ou hipereactividade brônquica.A inflamação alérgica desenvolve-se em 2 etapas: a 1ª após
exposição ao alergénio consiste na desgranulação e libertação de histamina, e mediadores pré-
formados e neo-formados, incluindo citocinas que levam à broncoconstrição e hipersecreção de
muco. As células envolvidas nesta primeira fase são sobretudo mastócitos activados pela IgE
específica do alergénio. A segunda fase mais tardia e que dura mais tempo, deve-se a diferentes
moléculas: várias citocinas, quimiocinas, derivados do ácido araquidónico, enzimas como as
metaloproteases e moléculas de adesão e envolve outros tipos de células.
A asma alérgica é uma doença multifacetada, controlada activamente por células efectoras Th2 e
Th17 que aumentam a inflamação das vias aéreas, enquanto que as Tregs são anti-inflamatórias.
As células Tregs-T reguladoras, têm como principal função o controlo das doenças auto-imunes e
doenças inflamatórias como a alergia51.
As nTregs s desenvolvem-se no timo e dão origem a células com vida longa e específicas de auto-
antigénios com o objectivo de prevenir reacções auto-imunes.As iTregs induzidas/adaptativas
desenvolvem-se em condições de exposição subóptima a antigénios e/ou co-estimulação
As células T reguladoras (Tregs) são críticas na manutenção da homeostasia imunológica. As
células Tregs mantém um controlo supressivo nas outras células do sistema imunológico.
As céluilas iTreg extratímicas geradas durante a inflamação, ajudam a limitar a progressão da
doença. Durante a inflamação causada pela doença alérgica (asma por exemplo) as iTregs (Th3,
Tr1) surgem com o objectivo de controlar as acções deletérias das Th2.As células iTreg são
originadas à periferia, são distintas das nTreg e contribuem para a tolerância imunológica.Esta
geração das iTregs pode estar condicionada por Dcs que se encontrem num ambiente mais
favorável à polarização Th2 dado pelo polimorfismo da Hp.
Tem sido demonstrado que a indução de tolerância passa também pelo aparecimento de células
Tregs. Embora nem todas as células expressem Foxp359,60 a ausência de Foxp3 compromete a
tolerância imunológica.
O entendimento progressivo da natureza e mecanismos das Tregs61-65 mudou o conceito de
tolerância imunológica, para deixar de ser a ausência de reactividade imunológica e passar a ser
um processo regulado que requer células específicas e presença de mediadores. Este conceito é
indispensável na tolerância em relação ao próprio e contra antigénios inócuos ubiquitários,
impedindo o aparecimento de doenças autoimunes e alergias respectivamente.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
54
As Tregs têm um importante papel na resposta fisiológica aos alergénios ao suprimirem as células
Th1 e Th2 específicas do alergénio, a produção de IgE pelas células B, e directa ou indirectamente
as células efectoras da alergia: eosinófilos, basófilos e mastócitos.
As células Tregs também estão envolvidas na inflamação crónica, ao interagirem com as células
residentes, tendo particular importância no remodelação que acompanha a asma.Este66 novo
entendimento sobre a tolerância aos alergénios veio inclusive abrir novas janelas terapêuticas
tendo como alvo as células Tregs, tanto na prevenção da doença alérgica como na doença alérgica
já estabelecida.
6.15.PAPEL DAS DCs NA ORIGEM DAS iTregs
O aparecimento das células iTreg depende de uma adequada apresentação pelas APCs
num ambiente rico em TGF-β e IL-2. As Dcs que são um grupo heterogénio de células com
capacidade de apresentar antigénios, estão presentes em diferentes tecidos e
condicionadas pelo ambiente em que se inserem que por sua vez está dependente de
diferentes susceptibilidades genéticas individuais entre elas o polimorfismo da Hp.As Dcs
podem adquirir ou não determinadas capacidades que as tornam capazes e gerar ou não
iTregs. A deplecçao de células Dcs, leva à diminuição de células Treg Foxp3+ e aumenta a
resposta Th1 e Th17.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
55
Figura 19: A resposta imune na asma
Após o contacto com o alergénio69 as células epiteliais libertam citocinas (Figura 19) que
recrutam eosinófilos(EO) e mastócitos (MC) assim como citocinas e mediadores proteicos como a
Hp( e seus polimorfismos genéticos/fenótipos) que activam as DCs. As DCs reconhecem,
processam e apresentam o alergénio às células Th2 e Th17 específicas do alergénio as quais
libertam citocinas que activam mais EOs, MCs, células B, neutrófilos(NU) e monócitos (MO). A
ligação cruzada entre a IgE específica do alergénio (produzido pela células B) na superfície dos Eos
e MCs que leva á libertação de citocinas e mediadores solúveis que promovem a
broncoconstrição.As Tregs específicas do alergénio libertam citocinas inibitórias que previnem a
activação das DCs, e das células Th1, Th2 e Th17.
O padrão de hereditariedade da doença alérgica é o de uma complexa doença poligénica em que
as interacções entre os genes e o ambiente, fortemente têm influenciado o desenvolvimento da
doença alérgica, e as mudanças de estilo de vida que se têm operado no mundo ocidentalizado,
em muito têm contribuído para a elevada prevalência da doença alérgica.Estudos epidemiológicos
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
56
recentes puseram em evidência que a mudança de padrão de exposição microbiana das crianças
no mundo ocidental poderá ser um factor determinante na “epidemia de alergia”-Hipótese da
Higiene- apesar da sua base imunológica ainda ser controversa.
Segundo a hipótese “da higiene”12, a ausência de estimulação da via Th1 da resposta imune
adaptativa, iria implicar uma prevalência da resposta adaptativa Th2.
A hipótese de menos estimulação adaptativa Th1 como explicação da alergia por diminuição de
patogénicos, tem por base o estilo de vida ocidentalizado com diminuição da estimulação da
imunidade inata e diminuição da IL-12 que é dos mais importantes polarizadores Th1.Sob estas
circunstâncias a resposta imune adaptativa em relação a antigénios (alergénios)”inócuos”
ambientais desvia-se para um perfil Th2.
A hipótese de diminuição da regulação, como explicação do aumento da alergia, advém de um
ambiente mais estéril durante a infância reduzir a estimulação das células Treg, levando a um
aumento das respostas Th1 e Th2 e consequente aumento das doenças autoimunes e atopia.
Será o aumento da prevalência da alergia segundo a teoria da Higiene, menos desvio Th1, menos
supressão imunológica ou ambos?
Um modelo menos simplista, ilustra os eventos imunológicos que podem ocorrer como
consequência da diminuição da sobrecarga microbiana durante a infância. Diminui a produção de
IL-12 pelas DCs, diminuindo a polarização Th1, com ausência da produção de IFN gama. No
entanto a a baixa polarização Th1 causada por baixa da IL-12 pode ser balanceada pelo aumento
da activação das células Th1 como resultado da diminuição da estimulação das Tregs.A diminuição
da IL-12 e consequente IFN-gama e diminuição da estimulação das Tregs, pode favorecer a
resposta Th2 aos alérgenos explicando a “epidemia” de alergia. Este tipo de resposta imunológica
pode ser amplificada ou não consoante os doentes expressem um fenótipo Hp1-1 ou Hp2-70-72.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
57
6.16.POLUIÇÃO E SUSCEPTIBILIDADE INDIVIDUAL ASSOCIADA AO POLIMORFISMO DA Hp
A asma alérgica 73é uma doença inflamatória crónica das via aéreas, caracterizada por uma
inflamação eosinofílica, hipersecreção de muco e hiperreactividade brônquica. Tendo uma
fisiopatologia complexa, está bem reconhecido que se trata de uma doença Th2 mediada, e que
esta polarização Th2 se deve a distintos factores, por um lado o papel importante das células APC
(células apresentadoras de antigénio) ao processarem os alergénios ambientais. A própria
poluição como 74-76 as partículas de exaustão diesel (DEP), induzem stress oxidativo nas células
dendríticas (DCs) que já pode estar ou não aumentado por uma susceptibilidade genética
individual condicionada pelo polimorfismo da Hp. Esta mudança no estado de equilíbrio redox
interfere com a capacidade dos Toll like receptors(TLRs) e seus agonistas de provocarem nas DCs a
expressão de receptores de amadurecimento (CD86,CD54 entre outros) assim como a produção
de IL-12 que faz a ligação da Imunidade inata com a adaptativa. Esta perturbação de
funcionamento das DCs é acompanhada por diminuição de IFN gama e aumento da IL-10 nas
células T específicas do Ag. A base molecular desta perturbação do funcionamento das Dcs está na
activação de uma via de sinalização do factor 2 relacionado com o factor nuclear eritróide2 (NF-E2-
related factor 2) que suprime a produção de IL-12.Esta alteração na produção de IL-12 pelas DCs é
um factor adjuvante na explicação do aumento da doença alérgica em zonas de maior poluição. O
estado pró-oxidativo dos DEP pode interferir com a polarização Th1 favorecendo tal como os
alérgenos, e o polimorfismo da Hp, uma polarização Th2.
6.17.STRESS OXIDATIVO E POLARIZAÇÃO MACROFÁGICA
Os macrófagos 77são capazes de suprimir as células T pela produção de ROS levando ao
aparecimento de células Tregs de forma ROS-dependente. Desta forma os macrófagos são cruciais
para suprimirem a resposta T em situações em que esta resposta T está exacerbada. Os
macrófagos M2 são mais eficientes a produzirem ROS que os M1.
O complexo da NADPH-oxidase dos fagócitos consiste em várias proteínas fagócito-oxidase(phox)
que geram ROS78após activação. Os ROS não só estão envolvidos na defesa contra
microorganismos como na imunoregulação. A ROS derivada dos macrófagos induz os Tregs
periféricos, como foi demonstrado em modelos com inibidores da NADPH-oxidase.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
58
As ROS, não são só lesivas e mediadoras do stress oxidativo , mas também podem ter funções
imunoreguladoras especialmente se produzidas em baixa quantidade.Sabe-se que tanto as
doenças auto-imunes como a alergia se podem dever a Tregs que não actuam de forma eficiente .
As Tregs podem ser induzidas por ROs e diminuir a resposta imunológica exacerbada Th1 ou Th2.
A cadeia α da Hp é polimórfica com dois alelos co-dominantes: Hp*1 e Hp*2 que originam 3
variantes genotípicas e fenotípicas: Hp1-1(dímero)86 kDa, Hp2-1(polímero linear) e Hp2-2 (
polímero cíclico) 170-900 kDa.
No caso do Hp*1 há uma melhor depuração da Hb e menos stress oxidativo do que com
Hp*2.Verificou-se em estudos feitos na aterosclerose de doentes diabéticos Hp2-2 , existir mais
ferro dentro e fora dos macrófagos na placa aterosclerótica também porque há diminuição da
expressão do CD163 nestes doentes (Hp2-2).O ferro derivado da Hb é redox activo, e tanto a Hb
livre como os complexos Hp-Hb podem captar NO.Todos estes factores que levam a que haja
sobrecarga de ferro podem levar a um aumento do stress oxidativo e diminuição da
disponibilidade do NO que poderá desta forma interferir na asma brônquica e favorecer
fenómenos aterotrombóticos em indivíduos Hp2-2 ( 2 a 5 x mais sobretudo se forem diabéticos).
6.18.PAPEL DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS NA RESPOSTA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA
Hp
As células dendríticas(DCs) 79representam uma população heterogénea de células APCs . as células
percursoras, movem-se na corrente sanguínea até aos tecidos periféricos. Estas DCs imaturas
podem capatar os antigénios (Ags) e migrar para os orgãos linfóides. Convertidas em DCs maduras
estão capazes de interagir com as células T naive (Th0) e iniciar uma resposta imunológica
adaptativa.
As iTregs e nTregs inibem a capacidade apresentadora de Ag pelas Dcs 50,52,53,54,56,58e assim
contrabalançam a polarização Th1 e Th2.
A diferenciação das células Dcs sob condições locais de infecção, inflamação (alérgica por
exemplo ), ou tumoral pode originar células Dcs basais diferentes em resposta aos
factores locais (possível associação com os polimorfismos da Hp e diferente polarização
das Dcs).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
59
Tanto a defesa como a resposta imune patológica residem numa interacção concertada entre os
diferentes processos imunológicos. O sistema imune inato não específico do Ag, incluindo
neutrófilos, monócitos/macrófagos, células natural killer(NK), complemento e interferão,
rápidamente intervém no reconhecimento do antigénio ou na lesão tecidular.
O sistema imune adaptativo por seu lado desenvolve células específicas do Ag: Th, linfócitos T
citotóxicos, e memória imunológica, representando grande diversidade de clones específicos do
Ag.
Este sistema altamente sofisticado tem de ser “instruído” por células capazes de reconhecer e
processar o Ag apresentando-o de forma eficiente a células T e B . Esta ligação fundamental entre
o sistema imune inato e adquirido é feita sobretudo atrvés das células DCs.
Como potentes apresentadorsa de antigénio (APCs) as células dendríticas (DCs), têm um papel
fundamental na indução da reacção alérgica. São essenciais na apresentação do Antigénio (Ag) em
células Thelper préviamente sensibilizadas, levando , no caso do pulmão, a inflamação crónica
eosinofílica das vias aéreas.
Nos doentes alérgicos ao Derp2 p,ex., a apresentação do antigénio pelas DCs derivadas dos
monócitos leva a um aumento de 4-12 vezes das células T quando comparados com controlo.Este
tipo de resposta imunológica pode ser amplificada ou não consoante os doentes expressem um
fenótipo Hp1-1 ou Hp2-2.
6.19.IgE , RECEPTOR DA IgE , RESPOSTA ALÉRGICA E POLIMORFISMO DA Hp
O receptor de baixa afinidade para a IgE CD23 80-82expressa-se em várias células incluindo células
B, macrófagos/monócitos(M2a), eosinófilos, células foliculares dendríticas e células epiteliais do
intestino.As vias sinalizadoras que decorrem da activação do CD23 nos diferentes tipos celulares é
diferente: nos monócitos está envolvido na fagocitose, enquanto que nas células B tem um papel
na regulação da IgE e associação com doença alérgica.
Os níveis de IgE elevados são comuns na resposta inflamatória da doença alérgica e em certas
parasitoses.Para haver a libertação dos mediadores da reacção alérgica, é indispensável haver a
ligação cruzada entre os receptores FcεRII/CD23 para a libertção de TNFalfa, radicais de oxigénio,
IL-6 e tromboxano B2, numa via que é dependente da produção de óxido nítrico. Desta forma
verifica-se que a libertação de citocinas pela IgE da reacção alérgica está associada à transdução
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
60
através da via do NO, L-arginina dependente, podendo também estar associado aos diferentes
genótipos de Hp.
O desenvolvimento da inflamação IgE dependente ,é feita em 3 fases sucessivas. O período inicial
está relacionado com as DCs, que está presente em qualquer tecido periférico, capazes de após
amadurecimento migrar para os gânglios linfáticos e apresentar os péptidos imunogénicos aos
linfócitos T naive. Após esta primeira etapa de sensibilização, em caso de novo contacto com
alérgenos , a fase inflamatória surge rapidamente: activação de mastócitos, influxo maciço de
eosinófilos, neutrófilos e fagócitos mononucleados. Todas estas fases estão sob a influência de
diferentes subpopulações linfocitárias: TCD4+ com perfil pró-alérgico Th2, Treg induzidas do tipo
:T CD4+CD25+FOXp3+(Tr1). A 3ª fase diz respeito ao processo de reparação, ou no caso de
repetidas exposições alergénicas, a remodelação como o que é observado nas asmas mais severas.
A alergia não é mais do que uma resposta imunológica aberrante perante alergénios ambientais,
enquanto o não-atópico, perante os mesmos alergénios desenvolve tolerância natural.
A IgE ao ligar-se aos receptores de baixa afinidade CD23 dos macrófagos M2a pode ser um factor
adicional na polarização Th2 tal como o polimorfismo da Hp.
6.20.Hp NA NEO-ANGIOGÉNESE , NA MIGRAÇÃO CELULAR E REMODELAÇÃO
Outro papel importante é a formação de neo-vasos em condições normais e patológicas.Desta
forma abrange situações variadas como embriogénese, neoplasias, cicatrização e doença
inflamatória crónica.A formação de neo-vasos envolve a dissolução da membrana basal, seguida
de migração celular, alinhamento, proliferação e diferenciação em estruturas tubulares e nova
membrana basal.A estimulação da angiogénese é outra função conhecida da Hp. Os niveis mais
elevados nas doenças inflamatórias crónicas83 pode ter um importante papel na reparação
tecidual.Surpreendentemente Hp 2-2 é mais angiogénica que os outros genótipos.
Os macrófagos são células chave reguladoras da Imunidade Inata e adaptativa, e são os
mediadores essenciais das reacções inflamatórias crónicas.Os macrófagos têm como função
primordial, a indução da tolerância, imunidade tumoral, aterosclerose, cicatrização, etc..Depois de
recrutados para o local de lesão, os macrófagos são activamente envolvidos na fagocitose dos
restos celulares, modulação da resposta inflamatória, angiogénese e proliferação dos
fibroblastos.Adicionalmente os Macrófagos produzem componentes da matriz extracelular(ECM) e
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
61
podem afectar a degradação da ECM através da produção de metaloproteinases da matriz e os
seus inibidores.Durante o seu recrutamento os macrófagos encontram vários sinais que dirigem a
sua diferenciação para distintos fenótipos. Os macrófagos activados pela via clássica (M1) surgem
na resposta a estímulos pró-inflamatórios, como as citocinas Th1(p.ex. IFN gama)e produtos
bacterianos (LPS). A activação dos M1 é caracterizada pela secreção de citocinas pró-inflamatórias
como o TNF-alfa, interleucina-1 (IL-1), IL-6 e IL-12, e a expressão de receptores Fcg, I, II, III, um
surto oxidativo e profunda actividade anti-microbiana.Os macrófagos da via alterna: M2 são
activados por citocinas Th2 como: IL-4,IL-10, IL-13 e TGF-beta, ou com mediadores anti-
inflamatórios como os glucocorticóides84,85.
Há estudos que demonstram que a Hp, se expressa na parede arterial e está envolvida no
remodelação arterial ao interferir com a matriz extracelular inibindo as gelatinases e promovendo
a migração celular86 .
A degradação proteolítica e a síntese da matriz de colagénio extracelular e migração celular, são
passos críticos do remodelação tecidular nos processos normais e patológicos, incluindo a
inflamação, invasão tumoral e metastização. A espessura da parede arterial é sobretudo
determinada pelo colagénio fibrilhar (I e III) localizado na adventícia.A migração dos fibroblastos
da adventícia e células musculares lisas da média também é importante no remodelação arterial.
Este mecanismo de migração de células da adventícia ou média para a intima, é fundamental na
aterosclerose e no remodelação.
A Hp está envolvida na migração celular e remodelação que envolvam angiogénese e
reestruturação da matriz extracelular através das gelatinases e colagenases, sendo secretada em
pequenas quantidades pela célula muscular lisa e sobretudo pelos fibroblastos da adventícia87,88,89.
No LBA (lavado bronco-alveolar) dos asmáticos foi referida a existência de uma isoforma
glicosilada Hp-galectina 8, por oposição à Hp-galectina 3 que também existe em saudáveis, que
poderia estar relacionada com os progenitores de fibroblastos90.
A Hp, é uma PFA que se considera estar envolvida na reparação tecidular, sendo produzida por
fibroblastos e células inflamatórias.Pode-se constatar que os níveis de Hp aumentam no LBA dos
doentes asmáticos quando comparados com os controlos saudáveis.Este aumento de Hp é
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
62
também acompanhado pela diferenciação dos percursores de fibroblastos em fibroblastos, dando
à Hp um papel relevante no remodelação das vias aéreas do doente asmático.
A remodelação das vias aéreas é um dado proeminente na asma brônquica, e é caracterizado por
reparação tecidular aberrante, levando a alterações estruturais e diminuição da função
respiratória.Os fibroblastos, têm um importante papel no remodelação das vias aéreas ao
modularem a reparação tecidular. Os corticóides que se utilizam para tratar a asma afectam
sobretudo a resposta imunológica associada à asma e interferem pouco no processo de
remodelação per se.Vários estudos referem que após o contacto com os alergénios no doente
asmático há recrutamento de percursores de fibroblastos circulantes-fibrócitos associados à
inflamação alérgica.
Com estes estudos veio-se por em evidência de que um estado inflamatório facilitaria a
diferenciação de células progenitoras dos fibroblastos em fibroblastos activos, pondo em
evidência o papel da Hp na remodelação das vias aéreas dos asmáticos.
A Hp como glicoproteína de fase aguda, aumenta durante a lesão tecidular, inflamação e infecção
tendo um papel relevante na modulação da resposta imunológica.A Hp é um tetrâmero com duas
cadeias alfa e duas beta.
Os domínios beta são idênticos, mas os alfa surgem em duas formas alélicas 1 e 2.É possível ser
homozigótico para estes domínios alfa, com 2 domínios alfa-1 (Hp1-1)ou alfa-2(Hp2-2) e os
heterozigotos têm um de cada domínio alfa1 e 2(Hp2-1). Os elevados níveis de Hp, fibroblastos e
eosinófilos no LBA em doentes com asma pôe em destaque o papel desta proteína e da
inflamação no recrutamento destas células. As diferentes isoformas de Hp têm diferentes
propriedades fisiológicas e anti-oxidantes. A Hp2-2 está mais associada a aterosclerose e DCV, por
um processo semelhante à remodelação da asma
Vários estudos têm estabelecido uma correlação entre níveis elevados da Hp (como aqueles que
são observados com o genótipo Hp1-1) e a inflamação das vias aéreas e a hiperreactividade
brônquica.
Também foi demonstrado que a Hp aumenta em células específicas como os macrófagos
alveolares e eosinófilos em tecidos pulmonares inflamados mas não em pulmão normal. Tem sido
atribuído à Hp papel no recrutamento dos fibroblastos derivados das vias aéreas, durante o
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
63
processo de reparação tecidual. Estes fibroblastos com elevada capacidade de produção de matriz
extracelular no lumen das vias aéreas poderá ter consequências na fibrose sub-epitelial da
doença asmática.Os possíveis factores envolvidos no recrutamento destes fibroblastos para as vias
aéreas poderão ser moléculas envolvidas na angiogénese e outras citocinas/quimioquinas
libertadas pelo epitélio respiratório e células inflamatórias dentre as quais se encontra Hp que é
um factor de migração celular envolvido na angiogénese.A descoberta destes fibroblastos e
eosinófilos no LBA que acompanham os níveis mais elevados de Hp, traduzem uma inflamação
mais grave, podendo traduzir uma fase mais evolutiva da doença91-101.
6.21.A HAPTOGLOBINA E A ASMA ALÉRGICA -DOENÇA Th2
O papel protector anti-oxidante dado pela Hp é dependente de genótipo; a proteína codificada
pelo genótipo Hp 1-1 confere poder anti-oxidante superior ao da Hp 2-2
Para além do papel anti-oxidante, a Hp tem um importante papel imunoregulador, através do
receptor CD163 nos macrófagos M2, e do perfil de citocinas libertado após endocitose do
complexo Hp-Hb.
A Hp é também um excelente supressor da proliferação T. Os macrófagos activados pela
fagocitose do complexo Hp2-2-Hb através do receptor CD163 desviam a resposta Thelper para um
perfil Th1 enquanto os macrófagos activados pela fagocitose do complexo Hp1-1-Hb produzem
citocinas Th2.
O balanço desta resposta celular T é particularmente importante no espaço extravascular, através
da expressão local de Hp, minimizando a lesão tecidular.
No espaço extravascular, as DCs, respondem a sinais de alerta (stress oxidativo entre outros) e
interagem com antigénios/alergénios8,9,11.
A imunidade inata é o grande orquestrador da resposta imunológica e manutenção da tolerância.
A activação do sistema immune inato mediado pelos alergénios é feito através de actividade
proteolítica, ligação a receptores de reconhecimento padrão, mimetismo molecular com
complexos sinalizadores moleculares dos TLRs, actividade ligante com lípidos e potencial
oxidativo.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
64
A asma alérgica é uma doença inflamatória em que predomina um tipo de resposta Th2 das vias
aéreas. A asma aparece como uma falha nos mecanismos imunoreguladores a nível do epitélio
respiratório.
Segundo a hipótese “da higiene”12, a ausência de estimulação da via Th1 da resposta imune
adaptativa, iria implicar uma prevalência da resposta adaptativa Th2.
Os avanços na área da Imunologia vêm focalizar a atenção no papel central da Imunidade inata
como grande “orquestrador” da resposta imunológica e da manutenção da tolerância11.
Esta activação do sistema immune inato através das células apresentadoras de antigénio (APCs)
em que intervêm a a Hp e o receptor CD163 ( marcador dos macrófagos M2) pode ser considerado
um factor adicional na polarizaçãoTh2 da resposta alérgica, tal como fazem os alergénios.Podendo
activar o sistema imune inato das mucosas induzindo um influxo celular que origina uma
polarização Th212.
A Hp é uma potente proteína anti-inflamatória capaz de inibir a explosão respiratória e aumentar
o cálcio intracelular nos neutrófilos. Suprime a proliferação T, B e modula os macófagos. Suprime a
função linfocitária na resposta a mitogénios.Interfere na resposta Th1 que produzem IL-2, IFN
gama e forte resposta IgG favorecendo a resposta celular, enquanto os TH2 produzem IL-4,
5,6,10, 13 e IgE predominando a resposta humoral e eosinofilica.
Para alguns autores a Hp modula o balanço Th1/Th2.Smark demonstrou o papel imunoregulador
das PFA102,103. No caso da Hp além da interacção com os macrófagos da via alterna através do
receptor CD163, também suprime a síntese de TNF alfa. Para alguns autores a Hp além de se ligar
ao CD163 também se liga a neutófilos, macrófagos, células NK, células B através do CD11b/CD18 e
CD22.
O receptor CD163 dos monócitos-macrófagos , funciona como receptor que se liga e internaliza o
complexo Hb-Hp. A Hp é um excelente supressor da proliferação das células T. Os macrófagos
activados pela fagocitosedo Hp2-2:Hb através do receptor CD163 desviam a resposta para um
perfil Th1 enquanto os macrófagos activados pela fagocitose do complexo Hp1-1:Hb, desviam para
uma resposta Th2.
O balanço desta resposta T é particularmente importante no espaço extravascular, através da
expressão local de Hp, minimizando a lesão tecidular.
No espaço extravascular as células dendríticas respondem a sinais de alerta(strees oxidativio, p
.ex.) e interagem com alergénios/antigénios.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
65
A ligação do complexo Hb-Hp ao CD163 é dependente de cálcio e de alta afinidade .A Hb liga-se
com maior afinidade a Hp 2-2 mas este é menos eficiente no clearing da Hb devido ao facto de
serem proteínas com maior peso molecular.
Após internalização do complexo Hp-Hb, a Hb é metabolizada e o heme tóxico é convertido em
metabolitos pela heme-oxigenase.
O CD163 é expresso exclusivamente em células da linhagem monócito. O CD163 é sintetizada
como um glicoproteína de 130 kDa cadeia simples, transmembranar pertencente à superfamília
dos receptores capturadores da superfamília rica em cisteína (SRCR), consistindo em 9 segmentos
capturadores extracelulares ricos em cisteína e uma pequena cauda citoplasmática existindo em 3
variantes.tem alguma homologia com CD5, CD6. O mRNa e proteina do CD163 são induzidos pelos
glucocorticoides IL6 e IL-10. Em contraste TNF alfa, IFN gama e LPS actuam como moduladores
negativos da expressão de CD163. Apesar de estarem presentes na superfície dos macrófagos, o
derramamento contínuo da porção extracelular leva a grandes quantidades de receptor solúvel no
plasma que constitui um estímulo inflamatório.
A função primordial do CD163 é a remoção dos complexos Hp-Hb, no entanto também tem um
papel na sinalização intracelular. A activação do CD163 na superfície celular leva a uma cascata
sinalizadora dependente da tirosina-cinase resultando na mobilização de cálcio, síntese de
trifosfato inositol e secreção de Il-6 e GM-CSF. Outros estudos implicam a caseina cinase II(CKII)
que leva à secreção de IL-6 e que a proteína cinase C (PKC) pode ter um papel na sinalização
mediada pelo CD163. IL-6 e IL-10 aumentam Hp e CD163. A regulação de CD163 por agentes pro-
inflamatórios e anti-inflamatórios após ligação ao CD163 sugere que este possa ter um papel na
imunomodulação e papel anti-inflamatório
Sendo a Hp um ligando para os mastócitos/macrófagos pode ter um papel importante no processo
de activação destas células (Hp1- perfil Th2 e níveis mais elevados de Hp sérica, e Hp2 -perfil Th1 e
níveis mais baixos de Hp sérica).
A haptoglobina (Hp), uma alfa2-sialoglicoproteina10 (proteína de fase aguda), conhecida pela sua
capacidade de se ligar à hemoglobina (Hb) livre, formando um complexo com a Hemoglobina,
fazendo a lise em globina e grupo heme. O grupo heme, por sua vez, dissocia-se em bilirrubina e
ferro livre. Depois da Haptoglobina se ligar à Hb, parte é captada pelo fígado que recicla o Ferro, o
heme e os aminoácidos contidos na hemoglobina. Existem duas vias de escoamento do complexo
Hp-Hb. O 1º é no hepatócito (90%) e o 2º através do receptor CD163 3nos monócitos-macrófagos .
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
66
A proteína Hp é composta de subunidades α e β , as cadeias β não sofrem variação genética, o
mesmo não se passando com as cadeias α .O locus da haptoglobina no cromossoma 16q22, é
polimórfico para a cadeia α6. Assim, a cadeia α da Hp é polimórfica com 2 alelos major, co-
dominantes: Hp*1 e Hp*2, originando 3 variantes genotípicas: Hp1-1 (dímero), Hp2-1 (polímero
linear), Hp2-2 (polímero cíclico). Cada uma das formas fenotípicas , tem diferente afinidade para a
hemoglobina, diferente resistência ao stress oxidativo e diferente papel imunoregulador. Além do
seu papel antioxidante, a haptoglobina, estabelece uma função imunoreguladora, através do
receptor CD 163 dos macrófagos, e do perfil de citocinas libertados após endocitose do complexo.
Sabe-se também que durante uma reacção alérgica, se produz muita hemoglobina livre que se liga
à haptoglobina. O alelo 1- Hp*1- tem maior poder anti-oxidante; por outro lado o alelo 2- Hp*2 -
está associado a maior stress oxidativo.
Mais recentemente, comprovou-se que o gene da Haptoglobina se expressa nos macrófagos
alveolares e nos eosinófilos do pulmão em que exista doença inflamatória.
Sabendo que o polimorfismo genético da Haptoglobina (Hp), pode ser um factor polarizador da
resposta Th2 dos doentes asmáticos atópicos, pois os macrófagos activados pela fagocitose do
complexo Hp2-2:Hb, através do receptor CD163, desviam a resposta T helper para um perfil Th1,
enquanto os macrófagos activados pelo complexo Hp1-1:Hb geram citocinas Th21, pretende-se
avaliar a relação que existe com a asma e o controlo desta doença.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
67
7.OBJECTIVOS DO ESTUDO
Em doentes asmáticos (controlados e não controlados) (com idades superiores a 7 anos)
quando comparados com o grupo controlo de dadores saudáveis de sangue:
1) Avaliar as frequências alélicas e genotípicas da Hp no grupo controlo e no grupo de
doentes asmáticos e dentro dos asmáticos entre controlados e não controlados.
2) Determinar os níveis de Hp nos controlos e asmáticos.
3) Estabelecer a relação entre o genótipo da Hp e fenótipo intermédio/endótipo
(níveis de Hp) no doente asmático e compará-lo com o grupo controlo.
4) Verificar se a relação genótipo de Hp e fenótipo intermédio/endótipo (níveis de
Hp) está relacionada com a gravidade da asma (comparar asmáticos controlados
com não controlados).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
68
8.MATERIAL E MÉTODOS
TIPO DE ESTUDO: ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO , CASO/ CONTROLO
Grupo em estudo: Doentes asmáticos da Consulta de Alergologia do CHLN- HSM; n=114
Grupo controlo: dadores de sangue saudáveis; n=50
Caracterização da amostra: A amostra é constituída por doentes asmáticos controlados e não
controlados e grupo controlo de dadores de sangue saudáveis. Para uma potência de 90% e com
p<0.05, com uma frequência alélica na população controlo de 30-40% e com OR >1.5 estima-se
uma amostra que se aproxime dos 170-180 indivíduos104.
Consentimento informado: foi assinado por todos os doentes .
Os participantes são: o grupo controlo com 50 dadores voluntários de sangue, saudáveis, e 114
doentes asmáticos do Serviço de ImunoAlergologia do Hospital de Santa Maria-CHLN. O
diagnóstico de asma foi classificado de acordo com as linhas de orientação do Global Initiative for
Asthma (GINA)105,tendo em conta a natureza episódica da dispneia, pieira, tosse, opressão
torácica, frequência dos sintomas, limitação ou não da actividade diária, existência ou não de
sintomas nocturnos, frequência das exacerbações, utilização de medicação de alívio, valor do FEV1
e PEF e variabilidade diária dos mesmos.
A definição de doentes com asma não controlada e de doentes com asma controlada foi
realizada através da avaliação do nível de controlo da asma, por um instrumento validado: Asthma
Control Questionnaire - ACQ7 O cut-point considerado é o da prática clínica 0.75 (para os que
tiverem idade> 17 anos), e PAQLQ Pediatric Asthma Quality of Life Questionnaire–VERSÃO
Portuguesa by Juniper (7-17 anos)(<4 implica asma não controlada)106 .
Esta avaliação foi realizada após a selecção dos doentes, e submissão a um período de 8 semanas
(3 consultas) de optimização terapêutica de acordo com as linhas de orientação( guidelines) do
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
69
GINA. Os doentes que ao fim destas 8 semanas mantiverem pelo menos um indicador de asma
não controlada no último mês [utilização frequente da medicação de alívio, despertares nocturnos
provocados pela asma, pieira/dispneia frequente com limitação das actividades diárias,
exacerbações que motivaram recorrer ao Serviço de Urgência, FEV1 <80% e não haver melhoria ou
piorar, o score (Asthma Control Questionnaire) - ACQ-7 ou PAQLQ], serão classificados como
tendo asma não controlada. Os restantes doentes serão considerados como controlados.
Os critérios de exclusão são: os indivíduos que não aceitem participar no estudo; a não adesão à
terapêutica anti-asmática (avaliada através do preenchimento do patient diary card-Asthma
Clinical Research Network); a existência de outras co-morbilidades que possam interferir na
gravidade da doença respiratória; a existência do diagnóstico de Doença Pulmonar Obstrutiva
Crónica ou outra doença pulmonar; tabagismo; os doentes com infecção HIV, parasitados ou com
outro tipo de infecção, com anemia, com insuficiência renal ou com doença hepática crónica.
Todos os participantes asmáticos são caracterizados relativamente a variáveis sócio-
demográficas (raça; sexo; idade; país de origem;local de residência; profissão; anos de
escolaridade;), história clínica, longevidade da doença asmática , ausência de outra patologia
pulmonar e outros critérios de exclusão; prova de provocação inalatória inespecífica com
metacolina positiva ou prova de broncodilatação positiva ; testes cutâneos, IgE total, RAST e ISAC,
FeNO
A condição de asma controlada e não controlada foi relacionada com: a) o tipo de alergenos a
que estão sensibilizados Testes cutâneos em Prick realizados de acordo com as recomendações da
Academia Europeia de Alergologia e Imunologia Clínica(EAACI) usando a bateria de alergenos da
ALK-Abello. Soro salino como controlo negativo e histamina 10 mg/ml como controlo positivo.Os
testes cutâneos são considerados positivos se pelo menos um alergeno tiver uma pápula com
mais de 3 mm de diâmetro após subtracção do controlo negativo;- b) gravidade da asma
(Intermitente e Persistente: ligeira/moderada/grave) conforme as normas do GINA para níveis de
gravidade da asma após período de optimização terapêutica (Controlada/Parcialmente
controlada/Não Controlada) ; c) classificação das exacerbações de asma segundo as normas do
GINA (ligeira, moderada, severa e paragem respiratória iminente); d) FEV1 e PD20 na prova de
provocação inalatória inespecífica com metacolina segundo as normas da ATS .A prova de
provocação inalatória é realizada com metacolina, administrada através de um dosímetro
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
70
M.E.F.A.R. MB3, com um débito de aerosol de 39μL/5 nebulizações, o doente inala cada
concentração de metacolina 5 vezes seguidas desde o volume residual até à capacidade pulmonar
total. A função respiratória é medida 3 minutos após a inalação de cada dose de metacolina
através de manobras de expiração forçada com espirómetro. Considera-se o teste terminado
quando pela primeira vez se medir uma redução de FEV1 ≥20% ou após a inalação da última dose
de metacolina. A dose de metacolina que provocar uma redução do FEV1=20%(PD20 FEV1) é
calculada através de interpolação linear dos dois últimos pontos da curva de dose-resposta.; e)
níveis de IgE total medida por imuno-ensaio fluoroenzimático(Pharmacia, Uppsala, Sweden e
específica RAST- Teste in vitro-RadioAlergoAbsorvente- para detecção de Anticorpos IgE
específicos circulantes no soro-EIA(Imunoensaio) (Pharmacia, Uppsala, Sweden) ; f) Óxido nítrico
no ar exalado-doseamento de óxido nítrico do ar exalado durante 6 segundos com Nioxmino
.ADULTOS: Feno (ppb) < 5 ;5–25(Improvável);;; 25–50(Presente mas moderada); >50(significativa);
CRIANÇAS: Feno (ppb) < 5 ;5–20(Improvável);;; 20–35(Presente mas moderada); >35(significativa)-
g) consumo de beta2 miméticos de curta(Salbutamol; Terbutalina) e longa acção (Salmeterol;
Formoterol) ; h) qual o corticóide inalado(Dipropionato de Beclometasona; Budesonido/
Budesonido suspensão prara nebulização;Fluticasona/Fluticasona nebules e dose; i) administração
de anti-colinérgicos/Parasimpaticolíticos (Brometo de ipratrópio; tiotrópio) ; j) Metilxantinas
(aminofilina; teofilina); l) antagonistas dos receptores dos leucotrienos(montelucaste;zafirlucaste)
; m)Corticóides orais(Prednisona; Prednisolona;Metilprednisolona; Deflazacort; Betametasona) ;
n)Anticorpo monoclonal anti-IgE(IgG1k)(Omalizumab) ; o)existência(activa /no passado) ou não de
imunoterapia específica;p)níveis de ECP no sangue periférico e contagem de eosinófilos.
A determinação do polimorfismo genético da haptoglobina é realizada a partir da Hp plasmática,
por electroforese em gel de poliacrialmida (PAGE) 4,7% em solucão tampão TRIS-HCl 0.504M, pH
8.9. As amostras para aplicação no gel (10μL) são preparadas utilizando sacarose 40% (p/v), Hb
28,2mg/mL e plasma, na proporção de 3:2:4, para um volume final de 45μL. Para a coloracão das
bandas resultantes da electroforese é usado o método da coloração por contacto, usando o-
dianisidina 16mM em ácido acético 50% (v/v) e, posteriormente, peróxido de hidrogénio 0,6%
(v/v).Os fenótipos de Hp são determinados por electroforese em gel de poliacrilamida, sendo-lhe
atribuído o correspondente genótipo (Figura 20).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
71
Figura 20: Fenótipos da Haptoglobina em gel de poliacrilamida
Os níveis de Haptoglobina são determinados por nefelometria- (BN ProSpec da Siemens Helthcare
Diagnostics).
Avaliação estatística: Para determinar se a diferença entre os valores médios de haptoglobina é
significativa entre os grupos, utilizou-se o teste t de Student para amostras independentes
(paramétrico) ou o equivalente não paramétrico,Man-Whitney. Para estudar a associação entre
níveis de Haptoglobina codificada e outras variáveis qualitativas, usou-se o teste do Qui-Quadrado,
assim como para avaliar as diferenças entre frequências alélicas e de genótipos entre grupos. Para
comparar os níveis de Haptoglobina entre os diferentes grupos definidos pelos genótipos utilizou-
se um teste paramétrico ANOVA depois de verificados os pressupostos da normalidade e
homogeneidade das variâncias e testes pos-hoc ou teste não paramétrico de Kruskal Wallis se os
pressupostos do teste paramétrico não se verificarem. Para avaliar o risco (Odds ratio) de
associação com os diferentes genótipos e de ter asma não controlada neste grupo de doentes, foi
utilizada a regressão logística.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
72
Foi utilizado o software estatístico PASW versão 18 para análise estatística dos dados
estabelecendo-se um nível de significância de p< 0.05.
NOME DA VARIÁVEL TIPO DE
VARIÁVEL METODOLOGIA ESTATÍSTICA
HAPTOGLOBINA QUANTITATIVA Análise Descritiva (média±sd)+boxplots.
Teste T Student para amostras independentes para
comparar grupo controlo com asmáticos , ou
equivalente não paramétrico Man-Whitney.
ANOVA para avaliar diferenças da Hp por genótipo
por grupo e por idade codificada ou equivalente
não paramétrico Kruskal Wallis
HAPTOGLOBINA
CODIFICADA
Qualitativa Teste Qui-quadrado para avaliar a associação entre
a hp e as restantes variáveis qualitativas.
Teste Qui-quadrado para avaliar as diferenças
entre frequências alélicas e de genótipos entre
grupos.
IDADE CODIFICADA Qualitativa
GÉNERO Qualitativa
ASMA
CONTROLADA/NÃO
CONTROLADA
Qualitativa
ALERGIA(SIM/NÃO) Qualitativa
GENÓTIPO Qualitativa
ASMA
CONTROLADA/NÃO
CONTROLADA
Qualitativa Regressão logística para avaliar o risco de asma
não controlada associada aos diferentes genótipos.
Quadro 1: Quadro de variáveis
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
73
9.RESULTADOS
9.1.ALELOS E GENÓTIPOS 9.1.1.CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO EM ESTUDO-Quadro 2
Conforme apresentado no Quadro-2, foram estudados 114 doentes asmáticos da consulta de
Alergologia do CHLN-HSM EPE, com asma controlada e não controlada.70 do sexo feminino e 44
sexo masculino, com idades entre 7 e 86 anos( x±SD: 41±18) 110 caucasianos e 4 não caucasianos;
98 atópicos e 16 não atópicos; 45 com asma não controlada e 69 com asma controlada.
Foram comparados com um grupo de 50 dadores de sangue saudáveis. 45 sexo feminino; 5 sexo
masculino, com idades compreendidas :19-78 anos. ( x±SD: 50±13).
CONTROLO ASMÁTICOS
GÉNERO n % n %
F 45 90,0 70 61,4
M 5 10,0 44 38,6
IDADE
<15 - 0,0 11 9,6
>=15 e <=30 5 10,0 27 23,7
>30 45 90,0 76 66,7
RAÇA
caucasiana 110 96,5
não caucasiana 4 3,5
ALERGIA
Sim 98 86,0
não 16 14,0 ASMA
ncontrol 45 39,5
control 69 60,5
Quadro 2: CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO EM ESTUDO
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
74
9.1.2. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS POR GRUPO- Quadro 3
Conforme apresentado no Quadro-3, pelo teste estatístico do Qui-Quadrado não há diferenças
estatisticamente significativas na distribuição das frequências genotípicas quando comparadas
controlos e asmáticos p=0,270.
A frequência do alelo 1 no grupo de asmáticos é de 0,43; do alelo 2 é 0,57. A frequência do alelo 1
no grupo controlo é 0,39; do alelo 2 é 0,61. Pelo teste estatístico do Qui-Quadrado não há
diferenças estatisticamente significativas na distribuição das frequências alélicas quando
comparadas controlos e asmáticos p=0,581.
Frequências genotípicas Frequências Alélicas
n(%) Hp1-1 Hp 2-1 Hp 2-2 Hp*1 Hp*2
Controlos 50 5(10%) 29(58%) 16(32%) 0,39 0,61
Asmáticos 114 22(19,3%) 54(47,4%) 38(33,3%) 0,43 0,57
Valor de p 0,270 0,581
Quadro 3: COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS POR GRUPO
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
75
9.1.3 .COMPARAÇÃO DO RISCO DE ASSOCIAÇÃO DE UM GENÓTIPO ENTRE CONTROLO E
ASMÁTICOS - Quadro 4
Conforme apresentado no Quadro-4, pelo teste estatístico de regressão logística não há diferenças
estatisticamente significativas na associação de risco (OR) com os genótipos estudados quando
comparados controlos com asmáticos p>0,05.
Genótipos Controlos
n=50(%)
Asma
n=114(%) OR IC Valor de p
2.2 16(32%) 38(33,3%) 1
2.1 29(58%) 54(47,4%) 0,784 [0,375;1,640] 0,645
1.1 5(10%) 22(19,3%) 1,853 [0,597;5,753] 0,420
Quadro 4: COMPARAÇÃO DO RISCO DE ASSOCIAÇÃO DE UM GENÓTIPO ENTRE CONTROLO E
ASMÁTICOS
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
76
9.1.4 . COMPARAÇÃO DO RISCO DE ASSOCIAÇÃO DE UM GENÓTIPO ENTRE ASMAS CONTROLADAS
E NÃO CONTROLADAS- Quadro 5
Conforme apresentado no Quadro-5, pelo teste estatístico de regressão logística não há diferenças
estatisticamente significativas na associação de risco (OR) com os genótipos estudados quando
comparados asmas controladas com não controladas p>0,05.
Genótipos Hp
Asma
controlada
n=69
Asma não
controlada
n=45
OR IC Valor de p
2.2 22 16 1
2.1 34 20 0,809 [0,346;1,889] 0,784
1.1 13 9 1,051 [0,382;3,651] 0,856
Quadro 5: GENÓTIPOS DE HAPTOGLOBINA POR NÍVEL DE CONTROLO DE ASMA.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
77
9.1.5 . COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS NOS ASMÁTICOS POR GÉNERO - Quadro
6
Conforme apresentado no Quadro-6, pelo teste estatístico do Qui-Quadrado não há diferenças
estatisticamente significativas na distribuição das frequências genotípicas quando comparados
controlos e asmáticos p=0,144.
GENÓTIPO
SEXO MASCULINO
n=44(%)
SEXO FEMININO
n=70(%) Valor de p
Hp1-1 12(27,3%) 10(14,3%)
0,144 Hp 2-1
21(47,7%) 33(47,1%)
Hp 2-2 11(25%) 27(38,6%)
Quadro 6:COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS NOS ASMÁTICOS POR GÉNERO
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
78
9.1.6 . COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS NOS ASMÁTICOS POR GRUPO ETÁRIO
- Quadro 7
Conforme apresentado no Quadro-7, pelo teste estatístico do Qui-Quadrado não há diferenças
estatisticamente significativas na distribuição das frequências genotípicas quando comparadas por
grupo etário p=0,390.
GENÓTIPO IDADE<15
n=11(%)
>=15 IDADE
<=30
n=27(%)
IDADE>30
n=76(%) Valor de p
Hp1-1 4(36,4%) 5(18,5%) 13(17,1%)
0,390 Hp 2-1
6(54,5%) 12(44,4%) 36(47,4%)
Hp 2-2 1(9,1%) 10(37,0%) 27(35,5%)
Quadro 7:COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS NOS ASMÁTICOS POR GRUPO ETÁRIO
9.1.7. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR ALERGIA NOS ASMÁTIICOS
- Quadro 8
Conforme apresentado no Quadro-8, pelo Teste estatístico do Qui-Quadrado não há diferenças
estatisticamente significativas na distribuição das frequências genotípicas quando comparadas
asmáticos alérgicos e não alérgicos p=0,091.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
79
GENÓTIPO
ALERGIA-SIM
n=98(%)
ALERGIA-NÃO
n=16(%) Valor de p
Hp1-1 22(22,4%) 0(0%)
0,091 Hp 2-1
44(44,9%) 10(62,5%)
Hp 2-2 32(32,7%) 6(37,5%)
Quadro 8:COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR ALERGIA NOS ASMÁTIICOS
9.1.8. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR ASMA CONTROLADA E NÃO
CONTROLADA - Quadro 9
Conforme apresentado no Quadro-9, pelo teste estatístico do Qui-Quadrado não há diferenças
estatisticamente significativas na distribuição das frequências genotípicas quando comparadas
asmáticos controlados e não controlados p=0,877.
GENÓTIPO
ASMA
CONTROLADA
n=69(%)
ASMA NÃO
CONTROLADA
n=45(%)
Valor de p
Hp1-1 13(20,0%) 9(18,8%)
0,877 Hp 2-1
34(44,4%) 20(49,3%)
Hp 2-2 22(35,6%) 16(31,9%)
Quadro 9: COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR ASMA CONTROLADA E NÃO
CONTROLADA
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
80
9.1.9. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR RAÇA NOS ASMÁTIICOS - Quadro 10
Conforme apresentado no Quadro-10, pelo teste estatístico do Qui-Quadrado não há diferenças
estatisticamente significativas na distribuição das frequências genotípicas quando comparadas
caucasianos e não caucasianos p=0,545.
GENÓTIPO
CAUCASIANOS
n=110(%)
NÃO-
CAUCASIANOS
n=4(%)
Valor de p
Hp1-1 22(20,0%) 0(0%)
0,545 Hp 2-1
51(46,4%) 3(75,0%)
Hp 2-2 37(33,6%) 1(25,0%)
Quadro 10: COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE GENÓTIPOS POR RAÇA NOS ASMÁTIICOS
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
81
9.2.ENDÓTIPO/FENÓTIPO INTERMÉDIO: Níveis de Haptoglobina 9.2.1.CONTROLOS
9.2.2.ASMÁTICOS
9.2.3. COMPARAÇÃO ENTRE CONTROLOS E ASMÁTICOS
9.2.CARACTERIZAÇÃO POR NÍVEIS SÉRICOS DE Hp(mg/dL) DA POPULAÇÃO EM ESTUDO-
Quadro -11
Conforme apresentado no Quadro-11, na população controlo(n=50) os níveis séricos de Hp no
grupo controlo foram : minímo :40,10, máximo: 293,00 e x± SD:137,87±51,40; os níveis séricos
de Hp no grupo de asmáticos foram : minímo :9,00, máximo: 320,00 e x± SD:125,13±50,95.
n MINIMO MÁXIMO SD
CONTROLO 50 40,10 293,00 137,87 51,40
ASMÁTICOS 114 9,00 320,00 125,13 50,95
Quadro 11: CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO EM ESTUDO POR NÍVEIS SÉRICOS DE Hp
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
82
9.2.1.a NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NO GRUPO CONTROLO - Figura 21 e Quadro 12
Conforme apresentado na Figura 21 e Quadro 12 , pelo teste estatístico de ANOVA depois de
verificados os pressupostos da normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se que,
não há diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por
genótipo no grupo controlo p=0,196.
Figura 21: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NO GRUPO CONTROLO
p= 0,196
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
83
GENÓTIPO n Minimo Máximo SD
1.1
haptoglobina
5 149,00 186,00 175,80 15,78
2.1
haptoglobina
29 40,10 293,00 136,54 53,46
2.2
haptoglobina
16 47,80 224,00 128,40 51,48
Quadro 12: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NO GRUPO CONTROLO
9.2.1.b. NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NO GRUPO CONTROLO - Figura 22 e
Quadro 13
Conforme apresentado na Figura 22 e Quadro 13, pelo teste estatístico de t de Student depois de
verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que, não há diferenças estatisticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por grupo etário no grupo controlo
p=0,338.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
84
Figura 22: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NO GRUPO CONTROLO
Idade n Minimo Máximo x SD
>=15 IDADE <=30 5 97,00 157,00 127,76 23,08
>30 45 40,00 293,00 138,99 53,67
Quadro 13: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NO GRUPO CONTROLO
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
85
9.2.2.a - NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NOS ASMÁTICOS - Figura 23 e Quadro 14
Conforme apresentado na Figura 23 e Quadro 14, pelo teste estatístico de ANOVA depois de
verificados os pressupostos da normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se
que,há diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por
grupo etário no grupo de asmáticos p=0,000. Depois de efectuados os testes pos-Hoc verificou-se
que era significativamente diferente nos níveis de Haptoglobina dos que expressam os genótipos
Hp 2-2 ( mais baixos)e os outros genótipos (Hp 1-1 e Hp2-1-mais elevados) (p=0,000).
Figura 23: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NOS ASMÁTICOS
Genótipos
p=0,000
p=0,000
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
86
Genótipo n Minimo Máximo SD
1.1 haptoglobina 22 47,00 238,00 146,09 47,36
2.1 haptoglobina 54 45,00 320,00 137,37 49,58
2.2 haptoglobina 38 9,00 209,00 95,60 41,93
Quadro 14- NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO NOS ASMÁTICOS
9.2.2.b - NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS - Figura 24 e Quadro 15
Conforme apresentado na Figura 24 e Quadro 15, pelo teste estatístico de ANOVA depois de
verificados os pressupostos da normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se
que,há diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por
grupo etário no grupo de asmáticos p=0,003. Depois de efectuados os testes pos-Hoc verificou-se
que era significativamente diferente entre o grupo etário<15 e >30anos (p=0,008).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
87
Figura 24: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS
Idade n Minimo Máximo x SD
<15 haptoglobina 11 45,00 161,00 87,45 38,89
>=15 e <=30 haptoglobina 27 9,00 238,00 111,00 48,43
>30 haptoglobina 76 27,00 320,00 135,60 50,05
Quadro 15: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS
p=0,008
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
88
9.2.2.c - NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS -
Figura 25 e Quadros 16 e,17 e 18.
Conforme apresentado na Figura 25 e Quadro 16, pelo teste estatístico de ANOVA depois de
verificados os pressupostos da normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se que,
não há diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por
genótipo no grupo etário<15 anos nos asmáticos p=0,996.
Pelo Teste estatístico de ANOVA, Figura 25 e Quadro 17, depois de verificados os pressupostos da
normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se que,há diferenças estatisticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por genótipo no grupo etário≥15 e ≤ 30
anos nos asmáticos p=0,02. Depois de efectuados os testes pos-Hoc verificou-se que era
significativamente diferente nos níveis de Haptoglobina dos que expressam os genótipos Hp 2-2 (
mais baixos)e os genótipos Hp 1-1 (p=0,002) e Hp2-1 (p=0,034) (mais elevados) .
Pelo Teste estatístico de ANOVA, Figura 25 e Quadro 18, depois de verificados os pressupostos da
normalidade e da homogeneidade das variâncias verificou-se que,há diferenças estatisticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por genótipo no grupo etário>30 anos nos
asmáticos p=0,000. Depois de efectuados os testes pos-Hoc verificou-se que era
significativamente diferente nos níveis de Haptoglobina dos que expressam os genótipos Hp 2-2 (
mais baixos)e os genótipos Hp 1-1 (p=0,001) e Hp2-1 (p=0,000) (mais elevados) .
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
89
Figura 25: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS
Idade<15 n Minimo Máximo x SD
1.1 haptoglobina 4 47,00 161,00 86,25 52,82
2.1 haptoglobina 6 45,00 160,00 100,6 46,8
2.2 haptoglobina
(89mg/dL)
1
Quadro 16 : NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS
p=0,002
p=0,029
p=0,001
p=0,000 p>0,05
Genótipo
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
90
Idade>=15 e <=30 n Minimo Máximo x SD
1.1 haptoglobina 5 109,0 238,0 158,0 55,06
2.1 haptoglobina 12 80,0 168,0 121,7 30,9
2.2 haptoglobina 10 9,00 134,0 74,7 38,18
Quadro 17: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS
Idade>30 n Minimo Máximo x SD
1.1 haptoglobina 13 110,00 200,00 159,92 27,53
2.1 haptoglobina 36 71,00 320,00 150,83 50,51
2.2 haptoglobina 27 27,00 209,00 103,59 41,97
Quadro 18: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO ETÁRIO NOS ASMÁTICOS
9.2.2.d. NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR RAÇA NOS ASMÁTICOS - Figura 26 e Quadro 19
Conforme apresentado na Figura 26 e Quadro 19, pelo teste estatístico de t de Student depois de
verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatisticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por raça no grupo de asmáticos(p=0,363).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
91
Figura 26: NÌVEIS DE HAPTOGLOBINA POR RAÇA NOS ASMÁTICOS
Raça n Minimo Máximo x SD
cauc haptoglobina 110 9,00 320,00 124,30 50,75
ncauc haptoglobina 4 71,00 209,00 148,00 58,75
Quadro 19: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR RAÇA NOS ASMÁTICOS
p>0,05
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
92
9.2.2.e. NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GÉNERO NOS ASMÁTICOS - Figura 27 e Quadro 20
Conforme apresentado na Figura 27 e Quadro 20, pelo teste estatístico de t de Student depois de
verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatísticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por género no grupo de
asmáticos(p=0,288).
Figura 27: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GÉNERO NOS ASMÁTICOS
p>0,05
Género
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
93
Género n Minimo Máximo x SD
F haptoglobina 70 9,00 320,00 129,17 53,36
M haptoglobina 44 27,00 238,00 118,70 46,73
Quadros 20: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GÉNERO NOS ASMÁTICOS
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
94
9.2.2.f. - NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR EXISTÊNCIA DE ALERGIA NOS ASMÁTICOS - Figura 28 e
Quadro 21
Conforme apresentado na Figura 28 e Quadro 21, pelo teste estatístico de t de Student depois de
verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatísticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por existência ou não de alergia no grupo
de asmáticos(p=0,388).
Figura 28: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR EXISTÊNCIA DE ALERGIA NOS ASMÁTICOS
p>0,05
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
95
Alergia n Minimo Máximo x SD
sim haptoglobina 98 9,00 320,00 126,80 51,83
não haptoglobina 16 43,00 174,00 114,87 45,27
Quadro 21: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR EXISTÊNCIA DE ALERGIA NOS ASMÁTICOS
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
96
9.2.2.g. - NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR NÍVEL DE CONTROLO DA ASMA - Figura 29 e Quadro 22
Conforme apresentado na Figura 29 e Quadro 22, pelo teste estatístico de t de Student depois de
verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatisticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina por nível de controlo da asma(p=0,264).
Figura 29: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR NÍVEL DE CONTROLO DA ASMA
p>0,05
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
97
Caso n Minimo Máximo x SD
ncontrol haptoglobina 45 33,00 320,00 131,75 56,64
control haptoglobina 69 9,00 207,00 120,81 46,79
Quadro 22: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR NÍVEL DE CONTROLO DA ASMA 9.2.3.a - COMPARAÇÃO DOS NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA ENTRE CONTROLOS E ASMÁTICOS -Figura
30 e Quadro 23
Conforme apresentado na Figura 30 e Quadro 23, pelo teste estatístico de t de Student depois de
verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatísticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina entre o grupo controlo e
asmáticos(p=0,144).
Figura 30: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO
p= 0,144
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
98
n x SD
haptoglobina CONTROLO 50 137,86 51,39
ASMATICOS 114 125,13 50,95
Quadro 23: : NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO
9.2.3.b - COMPARAÇÃO DOS NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO -Figura 31 e
Quadro 24
Conforme apresentado na Figura 31 e Quadro 24, pelo teste estatístico de t de Student depois de
verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatísticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para
o genótipo Hp1-1(p=0,184).
Pelo Teste estatístico de t de Student depois de verificados os pressupostos da normalidade
verificou-se que,não há diferenças estatísticamente significativas na distribuição dos níveis de
Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para o genótipo Hp2-1(p=0,944).
Pelo Teste estatístico de t de Student depois de verificados os pressupostos da normalidade
verificou-se que, há diferenças estatísticamente significativas na distribuição dos níveis de
Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para o genótipo Hp 2-2(p=0,018).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
99
Figura 31: NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO
Genótipo n x SD
1.1 haptoglobina CONTROLO 5 175,80 15,78
ASMATICOS 22 146,09 47,36
2.1 haptoglobina CONTROLO 29 136,54 53,46
ASMATICOS 54 137,37 49,58
2.2 haptoglobina CONTROLO 16 128,40 51,48
ASMATICOS 38 95,60 41,93
Quadro 24: : NIVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GENÓTIPO E POR GRUPO
p=0,018
p>0,05
p>0,05
Genótipos
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
100
9.2.3.c -COMPARAÇÃO DOS NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO E POR GRUPO DE
CONTROLO E ASMÁTICOS Figura 32 e Quadro 25
Conforme apresentado na Figura 32 e Quadro 25, pelo teste estatístico de t de Student depois de
verificados os pressupostos da normalidade verificou-se que,não há diferenças estatísticamente
significativas na distribuição dos níveis de Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para
o grupo etário≥15 e ≤ 30 anos(p=0,459).
Pelo Teste estatístico de t de Student depois de verificados os pressupostos da normalidade
verificou-se que,não há diferenças estatísticamente significativas na distribuição dos níveis de
Haptoglobina entre o grupo controlo e asmáticos para o grupo etário> 30 anos(p=0,727).
Figura 32: NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO E POR GRUPO DE CONTROLO E
ASMÁTICOS
p>0,05
p>0,05
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
101
Idade n x SD
>=15 e <=30 haptoglobina CONTROLO 5 127,76 23,08
ASMATICOS 27 111,00 48,43
>30 haptoglobina CONTROLO 45 138,98 53,67
ASMATICOS 76 135,60 50,05
Quadro 25: : NÍVEIS DE HAPTOGLOBINA POR GRUPO ETÁRIO E POR GRUPO DE CONTROLO E
ASMÁTICOS
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
102
10.DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
A distribuição das frequência alélicas Hp*1 e Hp*2 e das frequências genotípicas (Hp 1-1 , Hp 2-1 ,
Hp 2-2 ) não apresenta diferenças estatísticamente siginificativas entre o grupo de doentes
asmáticos e grupo controlo (p>0,05):Quadro3.
Neste grupo de doentes estudados não observámos relação entre a susceptibilidade genética dada
pelos polimorfismos da Hp e a doença asmática alérgica,como foi anteriormente referida por
outros autores10, o que pensamos poder estar relacionado com as diferenças na população de
doentes estudados ( nesse caso foi estudada uma população de 291 crianças com asma e 1956
indivíduos no grupo controlo).
Na história recente de evolução do genoma humano e a pressão exercida pela interacção agente-
hospedeiro pode levar à associação entre determinados perfis genéticos e o fenótipo distante-
doença (asma bronquica p.ex.)1.
Os diferentes genótipos também não parecem estar associados ao risco de se ter asma brônquica
quando comparados com o grupo controlo:Quadro 4 , ou da asma poder estar ou não controlada,
e portanto ser de maior gravidade dentro do grupo de asmáticos (p>0,05):Quadro 5.
Dentro dos asmáticos, a distribuição de genótipos também não é estatísticamente diferente entre
sexo masculino e feminino: Quadro 6 , por grupo etário: Quadro 7 , alérgicos e não alérgicos:
Quadro 8, não-controlados e controlados: Quadro 9 e por raça: Quadro 10 (p>0,05).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
103
A associação entre genótipo e endótipo/fenótipo intermédio, neste caso marcador bioquímico:
níveis de Hp,aproxima a susceptibilidade genética individual da doença ( Figura 33).
Figura 33: Relação genótipo com os fenótipos aos vários níveis biológicos
A Hp como proteína de fase aguda4,8,20 pode estar envolvida não só na etiopatogenia como na
resposta à terapêutica da asma bronquica.A maior parte da Hp é produzida no fígado e outra parte
tem origem tecidular, estando os seus níveis dependentes por um lado da depuração feita pelo
CD163 e por outro das variantes genotípicas ,associadas aos receptores dos glucocorticóides,
TNFα, IL-6, sintase do óxido nítrico, entre outros.
No grupo controlo não há diferenças estatísticamente significativa dos níveis de Haptoglobina por
genótipo Figura 21 e Quadro 12 e por grupo etário (p>0,05): Figura 22 Quadro 13.
Stress oxidativo
Hp 1.1
Hp2.1
Hp 2.2
Haptoglobina (Hp)
sCD163
CD163 Hiper
reactividade
bronquica
NO exalado
Inflamação
alérgica(Th2)
ASMA
BRONQUICA
ALÉRGICA
Bioquímicos
Imunogenéticos
FénótiposGenótipos
Intermédios
(marcador
subclínico/
endótipo)
Distante
Factores
ambienciaisFactores Ambientais
Asma Brônquica
Alergica e
não alergica
Stress oxidativo
Hp 1.1
Hp2.1
Hp 2.2
Haptoglobina (Hp)
sCD163
CD163 Hiper
reactividade
bronquica
NO exalado
Inflamação
alérgica(Th2)
ASMA
BRONQUICA
ALÉRGICA
Bioquímicos
Imunogenéticos
FénótiposGenótipos
Intermédios
(marcador
subclínico/
endótipo)
Distante
Factores
ambienciaisFactores Ambientais
Asma Brônquica
Alergica e
não alergica
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
104
Em comparação com o grupo controlo verificou-se que os asmáticos têm sempre níveis mais
baixos de Hp sendo essa diferença apenas significativa nos genótipos Hp2-2: Figuras 30-32
Quadros 23-25.
Este dado vem de encontro ao que outros autores107 já defenderam, de que nos asmáticos e na
doença respiratória em geral, os níveis de Hp estaria mais baixos do que nos indivíduos saudáveis ,
e que esta proteina pode actuar como antagonista natural da activação do sistema immune. Por
outro lado os macrófagos de indivíduos com genótipo Hp2-2 têm menor expressão de CD163, o
que facilita a acção oxidante do ferro-hémico e pode também condicionar os níveis de Hp
circulante.
Estando estes doentes a fazer terapêutica anti-asmática, a expressão local da Hp pode estar
alterada pela acção dos glucocorticóides108 , e outros fármacos anti-asmáticos.
Nos asmáticos os níveis de Hp não apresentam diferenças estatísticamente significativas entre
asma controlada e não controlada: Figura- 29 e Quadro- 22 (p>0,05), alérgicos e não alérgicos :
Figura-28 e Quadro- 21 (p>0,05), sexo masculino e feminino: Figura- 27 e Quadro- 20 (p>0,05), por
raça: Figura- 26 e Quadro- 19 (p>0,05), mas é estatisticamente diferente entre idade> 30 anos e
<15 anos : Figura- 24 e Quadro 15 ( p<0.05).
Nos asmáticos os níveis de Hp apresentam diferenças estatísticamente significativas por genótipo
(p=0,000) Figura-23 e Quadro14.
Os Hp 2-2 apresentam níveis mais baixos de proteína circulante quando comparados com Hp 2-1
e Hp 1-1:Figura- 25 e Quadros 16,17,18, e a diferença é estatísticamente significativa (p=0.000 ).
Em doentes com idade ≥15 anos os níveis de Hp são diferentes por genótipo (p<0.05): 1-1 e 2-1
diferem do 2-2. Em doentes com idade <15 anos os níveis de Hp não são diferentes entre os
genótipos(p>0,05). Numa análise pos-hoc o genótipo Hp 2-2 mostrou-se um factor independente
associado aos níveis mais baixos de Hp, assim como a idade. Os indivíduos mais jovens têm níveis
mais baixos , que poderá estar relacionado com a duração da doença asmática e a necessidade de
mais tempo para se expressar o endótipo/fenótipo intermédio que se associa à doença asmática.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
105
Muitos autores têm referido que o genótipo Hp1-1 está associado a níveis mais elevados de Hp e a
um perfil Th2, enquanto que os genótipo Hp2-2 se associa com níveis de Hp mais baixos e um
perfil Th11,8,10.
A Hp como proteína de fase aguda aumenta após a libertação de IL-6, TNF-α, glucocorticóides e
catecolaminas. Esta relação entre o polimorfismo genético da Hp e o fenótipo
intermédio/endótipo (níveis de Hp) nos indivíduos com mais tempo de evolução da doença,
apresentando os que expressam alelo 1, níveis mais elevados de Hp, poderá traduzir uma resposta
mais intensa ao stress, com maior produção de PFA como a Hp, que possam interferir de forma
diferente no sistema imune inato e condicionar uma diferente polarização da resposta imune
adaptativa na asma alérgica.
As células dendríticas derivam de um percursor comum às células macrofágicas, fazem parte do
sistema mononuclear fagocítico,e são responsáveis pela apresentação do antigénio às células T
naive.Durante a apresentação do Ag as Dcs perante um ambiente de citocinas e outras proteínas
polarizadoras Th2( como a Hp1-1 que polariza os macrófagos para M2, e outras citocinas como a
IL-4 polarizadoras de resposta Th2) reforçam a polarização Th2 enquanto as nTregs e iTregs
inibem a capacidade apresentadora de antigénio das Dcs e diferenciação Th2 ( associada à
presença de IL-4) ou Th1( associada à presença de IL-12)109.
As Dcs derivadas dos macrófagos, podem induzir resposta imune adaptativa mas pouco se sabe
àcerca da diferenciação e polarização a determinado ambiente pró-inflamatório110 (como aquele
que pode ser proporcionado pelos diferentes polimorfismos da Hp).
Os monócitos, são células periféricas circulantes percursoras das Dcs mieloides (DC1s)- na
presença de GM-CSF e IL-4,e percursoras de macrófagos na presença de M-CSF.As Dcs
mieloides/MDDCs /Dc1, são polarizadoras Th1( através da IL-12).
As Dcs plasmocitóides (pDc ou Dc2s) são distintas das Dcs mieloides e podem ser polarizadoras
Th0 ou Th2 quando num ambiente de citocinas pró-Th2 como a IL-4 ( eventualmente Hp1-1 que
polariza no sentido Th2 os macrófagos que a fagocitam).
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
106
No entanto a activação T após infecção viral das Dcs plasmocitóides pode levar à produção de IFN
gama e pouca IL-4. Assim se conclui que a polarização T pelas Dcs varia de acordo com os sinais
presentes na altura da activação (papel do polimorfismo da Hp e dos alergénios na polarização
Th2-ligação da susceptibilidade genética e ambiente de citocinas e outras proteínas polarizadoras
das Dcs a favorecerem a polarização Th2).
As iTregs e nTregs inibem a capacidade apresentadora de Ag pelas Dcs 50,52,53,54,56,58e assim
contrabalançam a polarização Th1 e Th2.
A diferenciação das células Dcs sob condições locais de infecção, inflamação (alérgica por
exemplo), ou tumoral pode originar células Dcs basais diferentes em resposta aos factores locais.
A diferença que se observa neste grupo de doentes asmáticos nos níveis de Hp por genótipo e que
não se verifica no grupo controlo, poderá estar relacionada com o facto da estimulação crónica
imunológica e de inflamação alérgica a ela associada permitirem estabelecer uma relação mais
directa entre génótipo/endótipo-fenótipo intermédio.
Os níveis mais baixos de Hp nos indivíduos que são homozigóticos para o alelo 2 poderá estar
associado a maior risco de doença cardiovascular e outras co-morbilidades que poderão
comprometer o prognóstico destes doentes91,93,96,97,100,101.
A Hp pode interferir de várias formas na asma alérgica se por um lado é mais ou menos eficaz na
resposta oxidativa, disponibilização de ROS18, NO19, interfere na angiogénese84-86 , com a LO e
COX23 , interfere como adipocina29,30 nos indivíduos obesos, por outro tem um papel importante
ao condicionar a tolerância que se pode estabelecer em relação aos alergénios ao favorecer a
polarização M2 1,3,6,10caso se trate de homozigóticos Hp1-1. Como à superfície dos macrófagos M2
além do receptor da Hp também existe o receptor para a IgE80-82, a polarização Th2 pode ser
“facilitada” de acordo com a maior expressão desses receptores para os alergénios. Além disso a
inflamação crónica na asma é importante e a Hp através do seu polimorfismo pode interferir
directamente na remodelação arterial e muscular e indirectamente através das Dcs pode interferir
na geração de novas células iTreg que controlam a inflamação Th2 e que também contribuem para
a remodelação das vias aéreas e inflamação crónica da asma alérgica.
CONTRIBUIÇÃO DO POLIMORFISMO DA HAPTOGLOBINA NA ATOPIA E NA ASMA
107
Esta susceptibilidade individual dada pelos polimorfismos da Hp pode condicionar a resposta
imunológica aos alergénios e à inflamação crónica que caracteriza a doença asmática, assim como
a hipereactividade brônquica68 , a progressão da doença para a cronicidade assim como o
prognóstico de outras co-morbilidades associadas como a hipertensão17 e doença cardiovascular
aterosclerótica.
As diferenças nos níveis de Hp associadas ao grupo etário e em relação ao grupo controlo vêm pôr
em destaque que esta associação genótipo/endótipo/doença necessita de um certo tempo de
progressão da doença para que se possa relacionar a susceptibilidade genética individual, com o
fenótipo intermédio/ marcador subclínico, que traduza as complexas interacções que
acompanham a progressão para a cronicidade das doenças.
Para clarificar mais detalhadamente a relação entre as vias metabólicas da doença asmática, o seu
perfil genótipico individual, associação com marcador bioquímico -fenótipo intermédio/endótipo,
e interacção com o ambiente, na convergência para um enfoque na doença asmática com
diferentes graus de gravidade/controlo, penso que seria importante aumentar o número de
doentes e de indivíduos do grupo controlo estudados e detalhar o estudo do metabolismo do
Ferro nestes doentes .
Como perspectivas futuras , por um lado o papel na resposta alérgica e associação a diferentes co-
morbilidades associadas ao polimorfismo da Hp e a sua relação genótipo/fenótipo já descrita
anteriormente, e por outro lado o possível papel na Medicina do seu receptor: CD16344,45, que
dado ser um receptor endocítico, pode ser um alvo para administração de fármacos e terapêutica
regenerativa, ligados ao complexo Hp-Hb. Durante a endocitose do complexo Hp-Hb, o receptor é
internalizado voltando depois à superfície, podendo este processo ser aproveitado para transporte
de fármacos anti-cancerígenos e proteínas. Também se associarmos a isso ,a curta semi-vida dos
macrófagos e a sua presença em muitos tecidos tornar-se-ia num alvo interessante para
terapêutica regenerativa:introduzir fármacos/genes em regiões de lesão tecidular.
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