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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA CONTRIBUIÇÃO AO DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA CRIPTOSPORIDIOSE HUMANA E LEVANTAMENTO DA PREVALÊNCIA DE OOCISTOS DE Cryptosporidium spp NAS FEZES E EM SECREÇÃO BRÔNQUICA DE PACIENTES HIV POSITIVOS. ISABEL MARTINEZ DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM ANÁLISES CLÍNICAS, ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: PARASITOLOGIA ORIENTADOR: Prof. Dr. Francisco Miguel Belda Neto ARARAQUARA 1999

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

CAMPUS DE ARARAQUARA

CONTRIBUIÇÃO AO DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA

CRIPTOSPORIDIOSE HUMANA E LEVANTAMENTO DA

PREVALÊNCIA DE OOCISTOS DE Cryptosporidium spp NAS

FEZES E EM SECREÇÃO BRÔNQUICA DE PACIENTES HIV

POSITIVOS.

ISABEL MARTINEZ

DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM ANÁLISES CLÍNICAS, ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: PARASITOLOGIA

ORIENTADOR: Prof. Dr. Francisco Miguel Belda Neto

ARARAQUARA

1999

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Ficha Catalográfica Elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP-Campus de Araraquara

Martinez, Isabel M385 Contribuição ao diagnóstico laboratorial da criptosporidiose humana e levantamento da prevalência de oocistos de Cryptosporidium spp nas fezes e em secreção brônquica de pacientes HIV positivos / Isabel Martinez. – Araraquara, 1999. . 80 p.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. Faculdade De Ciências Farmacêuticas. Departamento de Análises Clínicas. Orientador: Belda Neto, Francisco Miguel.

1. AIDS. 2. Cryptosporidium spp - Diarréia 3. Cryptosporidium spp -

Diagnóstico. I. Martinez, Isabel. II. Belda Neto, Francisco Miguel, Orientador. III. Título.

CDD: 616.9

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COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Francisco Miguel Belda Neto

Prof. Dr. João Aristeu da Rosa

Prof. Dr. Sergio Albuquerque

Prof. Dra Vera Lucy De Santi Alvarenga

Prof. Dr. Arício Xavier Linhares

Araraquara, 17 de dezembro de 1999.

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Ao Yuri,

meu filho.

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Para meus pais, Pedro e Josephina

Devo a vocês tudo que sou.

Obrigada é muito pouco.

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À minha amiga, Zenaide

que sempre me incentivou.

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Ao Prof. Dr. Francisco Miguel Belda Neto,

meu orientador, pelo incentivo, apoio e

confiança na condução desse trabalho.

ivi

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AGRADECIMENTOS

A realização deste trabalho se deve a todos que direta ou

indiretamente contribuíram para a sua elaboração.

À Profa. Dra. Arlete Scrassolo Martini pela amizade e preciosa ajuda

na confecção final do trabalho.

À Auxiliar Acadêmica Maria Zenaide Tita Fernandes pelo apoio e

colaboração.

À Auxiliar de Laboratório, Joselma Gomes Duque Ferreira, pela

colaboração.

Ao Prof. Dr. João Aristeu da Rosa, pelo incentivo e apoio.

Ao Prof. Dr. João Flávio Giazzi pelo incentivo e colaboração.

Ao Prof. Dr. Arnaldo Buainain pelo apoio, incentivo e colaboração.

Ao Dr. Oswaldo Luiz Luz Lima, responsável pela Vigilância

Epidemiológica e Programa DST/AIDS do SESA, pelo apoio e colaboração

À Dra. Volia de Carvalho Almeida, Infectologista do SESA, pelo

apoio e colaboração.

À Enfermeira, Angela Aparecida Costa, funcionária do SESA, pela

colaboração.

À Enfermeira, Marisa Marques Monteiro, funcionária do SESA, pela

inestimável ajuda no fornecimento de dados para a realização do trabalho.

Às Auxiliares de Enfermagem, Isabel Cristina Figueiredo, Palmira de

Fátima Temponi e Maria Helena Pierre, pela valiosa ajuda na

intermediação com os pacientes do Programa DST/AIDS do SESA.

Às Técnicas de Enfermagem, Neusa Eli Figueiredo, Réa Sylvia Tidei

Amaral, Silvana Lupateli e Sonia Maria dos Santos Somenzari, pelo apoio

e prestimosa ajuda no contato com os pacientes do Programa DST/AIDS do

SESA.

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Às tecnicas de laboratório, Celina Saletti Deróbio e Célia

Martins e à farmacêutica Maisa de Fátima Hortenci Coronado, do SESA,

pelo apoio e colaboração.

Ao Dr. Marcos Abdo Arbex, pela amizade e pela ajuda no contato

com o SESA.

Às funcionárias, Maria Irani Coito, Laura Odette Dorta Jardim,

Queila Simone Baraldo Leme e Ana Lúcia Minale Barbosa da Silva, pelo

auxílio na realização do levantamento bibliográfico, obtenção das separatas

e correção das bibliografias.

Ao Sr. Francisco Carlos Rocatelli, pela ajuda na elaboração das

fotografias.

Às funcionárias da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas – UNESP, Sonia Ornellas Silva, Claudia Lúcia

Molina e Laura Rosim, pela colaboração.

Ao meu irmão, Alexandre Martinez, pela amizade, carinho e

colaboração no ajuste final do trabalho.

A todos,

muito obrigada.

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SUMÁRIO

Página 1. INTRODUCÃO ...............................................................................................

1

1.1. Cryptosporidium e Cripidtosporidiose ..................................................... .

1

1.2. Recursos diagnósticos ...............................................................................

7

2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 10 3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................

11

3.1.Grupos de estudo ....................................................................................... 11

3.1.1.Grupo A .................................................................................................

11

3.1.2.Grupo B .................................................................................................

12

3.2.Entrevista ................................................................................................... 12

3.3.Coleta do material ..................................................................................... 13

3.4.Procedimento laboratorial ....................................................................... 13

3.5.Modificacões técnicas ............................................................................... 15

3.6.Procedimento para preparo das lâminas e técnicas específicas

para identificação de oocistos de Cryptosporidium spp nas fezes ......... 16

3.6.1.Método de coloração pela auramina ...................................................... 18

3.6.2.Método de coloração pelo Kinyoun modificado com alteração no procedimento............................

18

3.7.Procedimento para preparo das lâminas e técnicas específicas

para identificação de oocistos de Cryptosporidium spp em secreção brônquica ............................................................................. 19

3.8.Reagentes e soluções empregadas ........................................................... 20

3.8.1.Solução salina tamponada – PBS ..................................................... 20 3.8.2.Solução de formaldeído a 10% tamponada ........................................... 20 3.8.3.Solução corante de auramina ................................................................ 20

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3.8.4.Solução álcool-ácido clorídrico .............................................................. 21 3.8.5.Solução ácool-ácido sulfúrico ................................................................ 21 3.8.6.Solução de permanganato de potássio ................................................... 21 3.8.7.Solução de fucsina carbólica de Kinyoun ............................................. 22 3.8.8.Solução aquosa de azul de metileno ...................................................... 22 3.8.9.Solução de hidróxido de sódio a 3%...................................................... 22 3.8.10. Solução de N-acetil-L-cisteína ........................................................... 22

4. RESULTADOS ............................................................................................... 24

4.1.Resultados obtidos nas amostras fecais de pacientes

HIV positivos pertencentes ao grupo A .................................................. 24 4.2.Resultados obtidos nas amostras fecais de pacientes

HIV positivos pertencentes ao grupo B ................................................... 27 4.3.Resultados obtidos nas amostras de secreção brônquica

de pacientes HIV positivos pertencentes ao grupo B ............................. 30 4.4.Resultados obtidos com a modificação efetuada na técnica

de coloração de Kinyoun ......................................................................... 31

5. DISCUSSÃO ................................................................................................... 35

5.1. Considerações sobre as modificações técnicas

47

6. CONCLUSÕES .............................................................................................. 49 7. RESUMO ......................................................................................................... 8. SUMMARY ..................................................................................................... 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 10. ANEXOS.......................................................................................................

51 52 53 65

viiii

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Boa liderança consiste em motivar

As pessoas a darem o máximo de si próprias,

Oferecendo-lhes oportunidades.

É desta maneira que as coisas

acontecem naturalmente.

“A vida é uma

oportunidade

e não uma obrigação”

THE TAO OF LEADERSHIP – LAO TZU

ixi

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Criptosporidium e Criptosporidiose

Criptosporidiose é o termo utilizado para indicação da infecção

causada pelo parasita, Cryptosporidium spp, que é encontrado parasitando

células epiteliais do trato gastrointestinal e respiratório de vertebrados e

está relacionado, principalmente, com doenças entéricas em humanos. Foi

descrito pelo parasitologista americano E. E. Tyzzer, em 1907, que

observou o coccídio na mucosa gástrica de ratos parasitados e

assintomáticos (JANOFF e RELLER,1987).

Cryptosporidium spp é um protozoário de pequenas dimensões,

4 - 6 µm, pertencente ao filo Apicomplexa (possui complexo apical), classe

Sporozoa (reprodução assexuada e sexuada com formação de oocistos),

subclasse Coccidia (ciclo de vida apresenta merogonia, gamogonia e

esporogonia), ordem Eucoccidiida (esquizogonia), subordem Eimeriina

(macrogameta e microgameta), família Cryptosporidiidae (esporocisto -

oocisto com 4 esporozoitas) (TZIPORI e GRIFFITHS, 1998), gênero

Cryptosporidium. Apesar de terem sido nomeadas 19 espécies de

Cryptosporidium, 4 espécies são consideradas válidas (LEVINE, 1984) e

somente 2 são encontradas infectando mamíferos: C. muris e C. parvum

(FAYER e UNGAR, 1986).

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O gênero Cryptosporidium tem sido identificado em ampla

variedade de hospedeiros incluindo mamíferos, aves, peixes e répteis. A

espécie comumente relacionada ao encontro de parasitismo em mamíferos

é Cryptosporidium parvum.

Entretanto, considerando as dificuldades na identificação

específica por testes imunológicos e de biologia molecular e a efetiva

confirmação das espécies existentes até o presente, o termo

Cryptosporidium spp é o de preferência quando se trata de isolados obtidos

de humanos (LEVINE,1984; MEINHARDT et al. , 1996).

Classificação taxonômica de Cryptosporidium

Classificação Nome Características biológicas

Filo Apicomplexa Complexo apical com anéis polares, rotripias,

micronemas, conoides e microtúbulos

subpeliculares

Classe Sporozoa Locomoção por flexão do corpo, deslize ou

ondulação

Subclasse Coccidia Ciclo de vida com merogonia, gametogonia e

esporogonia

Ordem Eucoccidiida Merogonia presente, em vertebrados

Subordem Eimeriina Desenvolvimento independente de gameta

feminino e masculino

Família Cryptosporidiidae Monoxeno com desenvolvimento sob a

superfície da membrana celular do hospedeiro;

oocisto sem esporocisto com 4 esporozoitas;

microgametas sem flagelo

Gênero Cryptosporidium Parasitismo intracelular e extracitoplasmático

Espécies C. muris

C. parvum

Fonte: Adaptada de Fayer & Ungar, 1986; Tzipori, S., 1988; Tzipori & Griffiths, 1998 .

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Slavin, em 1955, associou-o, pela primeira vez, como causa

principal de morbidade e mortalidade em perus com diarréia aguda

(FAYER e UNGAR, 1986; TZIPORI e GRIFFITHIS, 1998).

Em 1976 foram descritos os primeiros casos humanos associados

à exposição a animais de fazenda e, casos subsequentes, confirmaram a

classificação de criptosporidiose como uma zoonose (JANOFF e

RELLER, 1987).

Pequenos roedores são reservatórios desse parasita e potentes

fontes de infecção para os animais domésticos e para os humanos

(CHALMERS et al., 1997). Dados obtidos em área urbana periférica no

nordeste do Brasil revelaram que 10,2% de fezes de animais domésticos

eram positivas para oocistos de Cryptosporidium (MARTINS et al.,

1995).

As espécies de Cryptosporidium têm vida parasitária intracelular

e extracitoplasmática obrigatória, com um complexo ciclo biológico: os

oocistos ingeridos pelo hospedeiro liberam esporozoitas que penetram nas

células epiteliais das microvilosidades, se diferenciam e por meio de

processos de esquizogonia, gamogonia e esporogonia, dão origem a novos

oocistos contendo esporozoitos. O protozoário é monoxeno, necessitando

apenas um hospedeiro para o seu desenvolvimento e apresenta baixa

especificidade parasitária (eurixeno). Os oocistos não necessitam de

maturação adicional, sendo excretados na forma infectante, que é resistente

aos desinfetantes habituais, resultando em potencial mecanismo de

transmissão direta por via fecal-oral (FAYER e UNGAR, 1986). Vale

ressaltar ainda, que as doses infectantes para humanos são muitos baixas,

sendo necessários cerca de 10 a 100 oocistos, variando com a fonte de

infecção e a cepa do parasita (MEINHARDT et al.,1996).

Inicialmente foi considerado como emergente patógeno

oportunista ou zoonótico restrito a pessoas imunocomprometidas ou

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àquelas que mantinham contato direto com animais; a partir de meados da

década de 80, Cryptosporidium passou a ser reconhecido como um

protozoário de patogenicidade emergente e potencial capacidade para a

produção de enterites em seres humanos (MEINHARDT et al., 1996).

Atualmente a criptosporidiose também está relacionada à

transmissão direta entre pessoas e por meio de água e alimentos

contaminados com oocistos de Cryptosporidium spp (MEINHARDT et al.,

1996).

A infecção humana tem sido descrita nos seis continentes, em

países desenvolvidos e não desenvolvidos e em áreas urbanas e rurais. Sua

prevalência é maior em regiões menos desenvolvidas e nos meses quentes e

úmidos. Atinge pessoas com idade variando de 3 dias a 95 anos. As

crianças são mais susceptíveis e a prevalência é maior em menores de 2

anos. Tanto os indivíduos do sexo masculino como do feminino são

igualmente susceptíveis (FAYER e UNGAR, 1986).

Têm maior risco de adquirir a infecção familiares e parceiros

sexuais de pacientes infectados, trabalhadores da área de saúde, usuários de

piscinas coletivas, funcionários de creches e pessoas que viajam para áreas

endêmicas (MEINHARDT et al., 1996).

A criptosporidiose assume especial importância em pessoas com

deficiência imunológica. A infecção por Cryptosporidium tem sido

relatada em pacientes sujeitos a alterações como hipogamaglobulinemia,

imunodeficiência congênita, imunossuprimidos devido a tratamentos de

câncer, transplantados, etc. Pacientes com deficiência imune reversível

geralmente se recuperam quando a causa da imunossupressão é removida.

Os sintomas clínicos característicos de criptosporidiose são

semelhantes para os pacientes imunocompetentes e os imunossuprimidos,

sendo que em imunossuprimidos esses sintomas se agravam podendo levar

à morte. Em pessoas imunocompetentes, a infecção provoca uma

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enterocolite aguda e autolimitada, com cura espontânea entre 10 e 14 dias

(REY,1991). Esses pacientes são importantes na transmissão do coccídio.

A criptosporidiose aguda desenvolve um quadro diarreico

profuso, com a emissão de fezes líquidas, mal cheirosas e de aspecto claro

ou de coloração esverdeada. Clinicamente, ela está associada com

sintomas relacionados à dor abdominal, cólica, náusea, vômitos, dor-de-

cabeça, febre discreta, mialgia, indisposição, anorexia e perda de peso

acentuada. Em pacientes imunossuprimidos este quadro se estabelece

abruptamente e é geralmente persistente. O paciente evacua em média 6

vezes ao dia e suas fezes podem conter até cerca de 106 oocistos por grama

de fezes. A excreção de oocistos em tal magnitude pode trazer sérias

dificuldades pelo potencial de transmissão, devido ao fato da dose

infectante para humanos ser muito baixa (10 a 100 oocistos), como já foi

mencionado anteriormente (FAYER e UNGAR,1986; MEINHARDT et

al.,1996).

A infecção pode também envolver todo o trato respiratório,

provavelmente pela aspiração de oocistos durante o vômito (MEINHARDT

et al.,1996). A transmissão sexual por meio de práticas envolvendo contato

oral-anal pode ocorrer (ANASTASI & CAPILI, 1997).

O trato gastrointestinal é o maior alvo de alterações em

indivíduos com imunodeficiência determinada por HIV. A infecção por

Cryptosporidium spp causa em pacientes com AIDS mal absorção e injúria

intestinal proporcional à intensidade de infecção (GOODGAME et al.,

1995).

Cerca de 30 a 97% dos indivíduos infectados com o vírus da

imunodeficiência humana (HIV) podem apresentar quadro diarreico no

decorrer dessa infecção (WUHIB et al.,1994). Estudos no sentido de

avaliar a etiologia da diarréia têm sido levados a efeito em distintas partes

do mundo e indicam a importância da infecção pelo coccídio.

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A infecção é observada nos Estados Unidos da América (EUA)

com índices variáveis entre 10 e 15% em pacientes com a síndrome da

imunodeficiência adquirida (AIDS). Em países em desenvolvimento o

índice chega a atingir 50% dos pacientes (COLFORD et al.,1996).

A taxa média de prevalência de infecção por Cryptosporidium na

população geral na Ásia e África é de 4,9% e 10,4% respectivamente

(MEINHARDT et al., 1996).

Em um estudo na Espanha, CLAVEL et al., 1995, encontraram

15,54% de positividade em pacientes infectados pelo HIV e 2,13% em

imunocompetentes. Em Dakar (Senegal), Cryptosporidium spp foi

observado em 13,9% dos pacientes com HIV (DIENG, et al., 1994). Na

Malásia, a prevalência é alta, 23%, entre os HIV positivos usuários de

droga intravenosa (KAMEL et al., 1994). Na Itália, BRANDONISIO et al.,

1993, determinaram 33,3% de positividade em um grupo de pacientes HIV

positivos com diarréia e COTTE et al., 1993, em estudos realizados na

França, avaliaram em 37,3% o índice de infecção em pacientes de grupo

semelhante.

No Brasil, MOURA et al., 1989, determinaram 18,2% de

positividade em pacientes com AIDS no Rio de Janeiro. RODRIGUES et

al., 1991, observaram prevalência de 14,3% em aidéticos com síndrome

diarreica. GUIZELINI e AMATO NETO, 1992, encontraram em São

Paulo, 10,4% de amostras com Cryptosporidium spp, sendo essas relativas

a fezes diarreicas de pacientes com AIDS e de adultos e crianças

imunocompetentes. SAUDA et al., 1993, demonstraram a presença de

oocistos de Cryptosporidium spp nas fezes de 19,1% dos pacientes com

AIDS atendidos no Centro de Referência de AIDS em Santos, SP. Em

Campinas , GARLIPP et al.,1995 encontraram 19,6% de prevalência da

criptosporidiose entre pacientes soropositivos para HIV atendidos no

Hospital Universitário da UNICAMP.

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Criptosporidiose com envolvimento pulmonar tem sido relatada

em pacientes com AIDS desde 1980 (CLAVEL et al., 1996). LOPEZ-

VELEZ et al., 1995, encontraram 16,28% dos pacientes com AIDS e

diarréia crônica apresentando além de criptosporidiose intestinal a

criptosporidiose pulmonar, com isolamento também de Cryptosporidium

do escarro desses pacientes.

1.2. Recursos diagnósticos

Os primeiros casos de criptosporidiose humana foram

diagnosticados mediante biópsias intestinais ou retais (MEISEL et al.,

1976; NIME et al., 1976).

Antes de 1978, o parasita era diagnosticado somente em cortes

histológicos de tecido e visto na superfície epitelial intestinal por

microscopia eletrônica ou pelas colorações com hematoxilina-eosina,

Giemsa, ácido periódico de Schiff ou azul de toluidina (JANOFF &

RELLER, 1987). Desde que POHLENZ e cols., 1978, descreveram o

encontro de formas (oocistos) de Cryptosporidium em material fecal de

bezerros jovens, o diagnóstico da parasitose tornou-se fundamentalmente

coprológico, ainda que apresente limitações.

Recentemente foram descritos métodos diagnósticos de detecção

de oocistos nas fezes por meio da pesquisa de coproantígenos com técnicas

de aglutinação em partículas de látex sensibilizadas com anticorpos anti-

Cryptosporidium (POHJOLA e cols., 1986), de imunofluorescência direta

(STERLING & ARROWOOD, 1986) e indireta e testes imunoenzimáticos

(ROBERT e cols., 1990). Da mesma forma, testes diagnósticos

imunosorológicos, imunofluorescência direta e indireta (IFA) e enzima

imunoensaio (EIA) têm se apresentado sensíveis e específicos (UNGAR e

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cols., 1986; VILLACORTA, 1989). Alguns disponíveis comercialmente,

são métodos que requerem habilidade técnica e equipamento sofisticado o

que muitas vezes, impede seu uso na rotina em grande parte dos

laboratórios de análises (GRACZYK et al., 1996).

O laboratório de Parasitologia da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Araraquara – UNESP tem, há muito tempo, atendido a

Secretaria Municipal de Saúde, a Secretaria Municipal de Educação e

outras, realizando avaliação parasitológica das fezes de grupos de

pacientes, crianças de escolas municipais, além de outras comunidades

solicitantes e trabalhos de extensão universitária. Habitualmente, são

utilizadas técnicas de enriquecimento e pesquisas de rotina para o

diagnóstico das principais protozooses e helmintíases intestinais.

A criptosporidiose não é diagnosticada em nosso laboratório por

tratar-se de infecção usualmente pouco diagnosticada e devido ao fato de

requerer metodologia específica para a evidenciação e conseqüente

identificação do protozoário.

Considerando nosso interesse e também da Secretaria Municipal

de Saúde e do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (Programa

DST/AIDS) na implantação de técnica adequada para o diagnóstico da

criptosporidiose, propôs-se a realização deste estudo.

Levando-se em consideração os aspectos referentes a custo,

necessidade de pessoal habilitado e equipamentos, optou-se por descartar

as técnicas imunosorológicas e direcionou-se à pesquisa de metodologias

disponíveis para a demonstração dos oocistos do parasita presentes na

matéria fecal. Este enfoque é amplamente discutido nos trabalhos

disponíveis na literatura especializada, direcionando as observações para o

diagnóstico coprológico (POHLENZ et al., 1978; GARCIA et al., 1983;

LÓPEZ-BREA et al., 1985; GUIZELINI & AMATO NETO, 1992,

CLAVEL et al., 1995; GARLIPP et al., 1995).

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Assim, por meio do estudo de trabalhos da literatura atualizada,

efetuou-se a avaliação das principais técnicas descritas e sua adaptabilidade

às nossas condições e disponibilidades laboratoriais. Ainda, considerou-se

oportuno complementar o estudo com a avaliação da prevalência de

infecção do coccídio em grupos de indivíduos HIV positivos

acompanhados no Programa DST/AIDS, da cidade de Araraquara.

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2. OBJETIVOS

1. escolha e implantação de técnica diagnóstica rápida, de fácil

execução e de baixo custo;

2. avaliação da prevalência do coccídio em indivíduos HIV

positivos, que têm seguimento regular no Programa DST/AIDS no Serviço

Especial de Saúde de Araraquara, com ou sem sintomatologia e com

presença ou ausência de quadro diarreico;

3. verificação de envolvimento pulmonar por meio da análise do

escarro desses pacientes.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

Segundo dados fornecidos pelo Serviço Especial de Saúde de

Araraquara (SESA), de 1987 a 1998 foram diagnosticados 1352 casos de

infecção por HIV, sendo que até março de 1999, 395 pacientes tinham

seguimento regular no Programa DST/AIDS do SESA.

3.1. Grupos de estudo

3.1.1 Grupo A: Constituído por 17 pacientes HIV positivos,

portadores ou não de quadro diarreico, regularmente acompanhados pelo

Programa DST/AIDS do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA).

Consultado o Centro de Processamento de Dados (CPD) do SESA para

coleta de dados, esses pacientes, conforme as diversas situações clínicas

determinadas pela infecção por HIV, foram classificados como

pertencentes ao Grupo II, pacientes assintomáticos e Grupo IV, pacientes

sintomáticos, segundo o Centro de Controle de Doenças dos Estados

Unidos (CDC ) (FARTHING et al, 1989).

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Não foram tratados com medicamentos anti-retrovirais e não

foram submetidos aos testes da contagem de linfócitos T CD4 e/ou carga

viral.

3.1.2. Grupo B: Constituido por 37 pacientes HIV positivos,

portadores ou não de quadro diarreico, regularmente acompanhados no

Programa DST/AIDS do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA).

De acordo com o prontuário de cada paciente incluído no estudo e segundo

o Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC), como no

Grupo A, foram classificados como pertencentes ao Grupo II, pacientes

assintomáticos e Grupo IV, pacientes sintomáticos (FARTHING et al,

1989).

Foram tratados com medicamentos anti-retrovirais e realizados

os testes da contagem de linfócitos T CD4 e/ou carga viral.

Pode-se entrevistar esses pacientes e solicitar-lhes amostras de

fezes e escarro.

3.2. Entrevista

Os pacientes do grupo A não foram submetidos à entrevista e

nem responderam questionário, pois foram a nós encaminhados

aleatoriamente pelos médicos do Programa DST/AIDS.

Os pacientes do grupo B, após haverem sido consultados pelo

médico e informados sobre a natureza deste estudo, foram entrevistados e

responderam a um questionário confidencial contendo dados pessoais e

outras informações importantes relacionadas à infecção por

Cryptosporidium spp. Nessa oportunidade foi feita uma rápida explanação

sobre criptosporidiose e como evitar o contágio e a transmissão.

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3.3. Coleta do material

Os pacientes do grupo A foram encaminhados pelos médicos do

Programa DST/AIDS, com o pedido para a realização de exame

coproparasitológico para pesquisa de Cryptosporidium spp.

Aos pacientes do Grupo B, após serem entrevistados, foram

entregues, coletores plásticos estéreis para acondicionamento das amostras

fecal e escarro com orientação para coleta. As fezes deveriam ser o mais

recente possível e o escarro coletado pela manhã, em jejum e após enxágüe

bucal somente com água. Duas amostras de cada material foram

solicitadas aos pacientes e essas deveriam ser entregues com intervalo de 3

dias.

3.4. Procedimento laboratorial

Foram analisadas 24 amostras fecais oriundas de 17 pacientes

HIV positivos e pertencentes ao grupo A de estudo.

Foram analisadas 70 amostras fecais e 39 amostras de escarro

provenientes de 37 pacientes infectados pelo HIV e pertencentes ao grupo

B.

No laboratório, as amostras de fezes dos pacientes, pertencentes

aos grupos A e B, foram submetidas a diversas técnicas parasitológicas

para pesquisa, concomitantemente, de outros enteroparasitas além de

Cryptosporidium spp.

Parte da amostra foi submetida a exame direto sem e com lugol,

ao método de sedimentação espontânea, método de Kato modificado e ao

método de Rugai e cols. (AMATO NETO e CÔRREA, 1980), com a

finalidade de se pesquisar a presença de cistos e trofozoítos de

protozoários, além de ovos e larvas de helmintos.

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À outra porção de fezes adicionou-se solução salina tamponada

de fosfatos com formol a 10% (formalina) e guardou-se em geladeira por

24 horas após o que realizou-se a concentração pela técnica de formalina-

acetato de etila (YOUNG et al., 1979) e preparou-se os esfregaços em

lâminas de microscopia, para posterior coloração pelas técnicas da

Auramina (LENETTE et al., 1985) e fucsina-carbólica (Método de

Kinyoun modificado) para verificar-se a presença de oocistos de

Cryptosporidium spp.

As técnicas de concentração e coloração empregadas para

visualização de oocistos de Cryptosporidium spp foram selecionadas entre

as descritas na literatura, considerando-se a sua facilidade de utilização em

nosso laboratório, baixo custo e os bons resultados verificados, aliados às

modificações efetuadas.

Como controle positivo foram usadas lâminas preparadas a partir

de fezes de suínos jovens comprovadamente positivas para

Cryptosporidium spp.

As amostras de fezes dos suínos foram homogeneizadas em

formalina, filtradas em gaze dobrada e guardadas em geladeira por 24

horas. Após esse tempo, concentrou-se o material pela técnica do formol-

éter (RITCHIE, 1948) e procedeu-se a preparação de esfregaços e

coloração pela auramina e fucsina carbólica.

3.5. Modificações técnicas

Na tentativa de evidenciar melhorias na metodologia aplicada no

decorrer do experimento, efetuou-se algumas modificações técnicas,

algumas por observações da literatura e outras por colaboração original.

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A técnica de concentração utilizada era a do formol-éter

(RITCHIE, 1948). Depois, por meio de estudo da literatura, optou-se pelo

uso do acetato de etila em substituição ao éter (YOUNG et al., 1979).

No método de coloração pelo Kinyoun, a fucsina carbólica era

deixada sobre o esfregaço por 30 minutos (LENETTE et al, 1985), lavado

com água corrente e em seguida descorado com solução álcool-ácido

sulfúrico 5% (HENRIKSEN & POHLENZ, 1981) até que todo o excesso

de corante fosse removido, cerca de 2 minutos e, novamente, lavado com

água corrente, contracorado com solução de azul de metileno a 1%, por 1

minuto, lavado com água e deixado para secar à temperatura ambiente.

A solução de fucsina carbólica passou a ser deixada sobre o

esfregaço por período de tempo de apenas 3 minutos. Passou-se a proceder

a descoloração com a mesma solução álcool-ácido usada no método de

coloração pela auramina, ou seja ácido clorídrico 0,5 % em álcool etílico

70 %, por cerca de 2 minutos.

Na literatura consultada (CLAVEL et al., 1996), as amostras de

escarro eram centrifugadas com água destilada, a 3000 rpm por 15 min., 2 a

3 vezes. O sedimento final era espalhado em lâmina de microscopia e

deixado para secar à temperatura ambiente, fixado com metanol e corado

pela técnica de Kinyoun modificada. Para amostras de escarro essa

metodologia não pareceu ser muito eficiente uma vez que o coccidio, se

presente, poderia ficar retido no muco e não sedimentar com a

centrifugação. Como não se encontrou outras citações na literatura

referentes a metodologia, as amostras de escarro foram inicialmente

submetidas a fluidificação por meio de uso de solução de N-acetil-L-

cisteína (LACAZ, 1991), comercialmente Fluimucil� e não apresentaram

aderência satisfatória à lâmina, mesmo após fixação. Por esse motivo,

passou-se a empregar solução de hidróxido de sódio a 3 % (DE CARLI,

1994) para fazer a digestão do escarro, também utilizada em partes iguais.

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Com isso, diminuiu-se o tempo de digestão do material, de 24 horas com

Fluimucil�, para cerca de 1 hora, obtendo-se dessa maneira, um material

totalmente fluidificado, o que não ocorria com o uso de Fluimucil�. Para

obtenção do esfregaço, procedeu-se a centrigugação do material a 3000

rpm por 15 minutos. O sedimento assim obtido era homogêneo e

espalhava-se com facilidade na lâmina além de ficar firmemente aderido

após secar, não se desprendendo no momento da coloração, como ocorria

com algumas amostras em que se usou o outro fluidificante.

3.6. Procedimento para preparo das lâminas e técnicas

específicas para identificação de oocistos de Cryptosporidium spp nas

fezes

Cerca de 2 g de fezes foram homogeneizadas em 10 mL de

formalina a 10% em cálice graduado de vidro com capacidade para 125 mL

com auxílio de bastão de vidro. Filtrou-se em gaze dobrada para outro

cálice e o material assim obtido foi acondicionado em frascos de vidro tipo

penicilina com tampa de borracha e guardado em geladeira por 24 horas.

Esse procedimento faz com que diminua o risco de contágio ao se

manusear o material. Após, procedeu-se a concentração do material pela

técnica de sedimentação formalina-acetato de etila, onde 7 mL do material

foram transferidos para tubo cônico graduado de centrífuga com

capacidade para 10 mL e acrescentou-se 3 mL de acetato de etila com

posterior agitação em vortex por cerca de 30 segundos para

homogeneização. Centrifugou-se o material a 1500 rpm por 8 minutos.

Desprezou-se o sobrenadante e com o sedimento foram feitos esfregaços

em lâminas de vidro (25 x 76 mm) para microscopia. Para cada amostra

tomou-se cerca de 25 µL do sedimento e fez-se 2 esfregaços de 24 x 24 mm

em cada lâmina que foi deixada para secar a temperatura ambiente, fixados

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com metanol e corados pelo método da auramina (LENETTE et al, 1985).

Essas lâminas foram observadas em microscópio de fluorescência Olympus

CBA-K empregando-se aumento de 100x e 400x. Os oocistos de

Cryptosporidium, quando presentes, apresentam-se com fluorescência

verde-amarelada intensa.

As mesmas lâminas foram posteriormente, submetidas à

coloração de Kinyoun modificada e examinadas em microscópio óptico

Jenaval, Carl Zeiss, em aumento de 250x e 1000x. Os oocistos, quando

presentes, são visualizados em destaque, com pigmentação rosa-

avermelhada intensa contrastando com a coloração de fundo azulada

(FIGURAS 1 e 2).

3.6.1. Método de coloração pela auramina

(LENETTE et al, 1985)

Procedimento:

-Fixar o esfregaço com o metanol;

-Cobrir o esfregaço com a solução de auramina O por 15 minutos;

-Lavar com água;

-Descorar com solução de álcool-ácido clorídrico, por 2 minutos;

-Lavar com água;

-Contrastar com solução de permanganato de potássio, por 3 minutos;

-Lavar com água;

-Secar em papel absorvente;

-Leitura.

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3.6.2. Método de coloração pelo Kinyoun modificado, com

alterações no procedimento

Procedimento:

-Cobrir o esfregaço com a solução de fucsina carbólica, durante 3

minutos à temperatura ambiente; não aquecer;

-Lavar com água;

-Remover todo o excesso de corante com solução álcool-ácido

clorídrico (2 minutos);

-Lavar com água;

-Cobrir toda a lâmina com solução de azul de metileno , por 1

minuto;

-Lavar com água e deixar secar a temperatura ambiente.

3.7. Procedimento para preparo das lâminas para pesquisa de

oocistos de Cryptosporidium spp em secreção brônquica (escarro)

As amostras de escarro foram submetidas a uma digestão prévia

do muco pela adição de solução de N-Acetil-L-cisteína (Fluimucil�)

(LACAZ et al, 1991) ou em solução de hidróxido de sódio a 3 % (DE

CARLI, 1994) em partes iguais, com agitação até obter líquido homogêneo.

Transferiu-se o material para tubos cônicos de centrífuga, vedou-se a

extremidade superior com Parafilm M�, centrifugou-se por 15 minutos a

3000 rpm e com auxílio de pipeta Pasteur aspirou-se o sedimento e

confeccionou-se os esfregaços em lâminas de microscopia de 25 x 76 mm.

Após secar à temperatura ambiente, as amostras foram fixadas com

metanol e coradas pelo método da auramina (LENETTE, 1985). Essas

lâminas foram observadas em microscópio de fluorescência Olympus

CBA-K empregando-se aumento de 100x e 400x.

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As mesmas lâminas foram posteriormente, submetidas à

coloração de Kinyoun modificada e examinadas em microscópio óptico

Jenaval, Carl Zeiss, em aumento de 250x e 1000x.

3.8. Reagentes e soluções empregados

3.8.1. Solução salina tamponada - PBS (phosphate buffered

solution) 0,01M pH 7,2 - 7,4

Na2 HPO4. 2 H2O.............................3,56g

NaH2PO4.2 H2O...............................0,94g

NaCl...............................................16,34g

Água destilada..............................2000 mL

3.8.2. Solução de formaldeído a 10% tamponada (formalina)

Formaldeído.............................................10 mL

Tampão fosfato pH 7,2 qsp.....................100 mL

OBS: Conservar em geladeira.

3.8.3. Solução corante de auramina

Solução A.

Auramina O...........................................0,1g

Álcool etílico 95%.................................10 mL

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Solução B.

Fenol líquido ..........................................3 mL

Água destilada.......................................87 mL

Misturar as soluções A e B, acondicionar em frasco âmbar e conservar à

temperatura ambiente.

3.8.4. Solução álcool-ácido clorídrico

Ácido Clorídrico Concentrado....................0,5 mL

Álcool Etílico 70%...................................100 mL

3.8.5. Solução álcool-ácido sulfúrico

Ácido Sulfúrico Concentrado.......................5 mL

Álcool Etílico 70%....qsp..........................100 mL

3.8.6. Solução de permanganato de potássio

Permanganato de Potássio..........................0,5 g

Água destilada.....qsp..............................100 mL

3.8.7. Solução de fucsina carbólica de Kinyoun

Fucsina básica...........................................4 g

Cristais de Fenol ......................................8 g

Álcool etílico 95%...................................20 mL

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Água destilada......................................100 mL

Dissolver a fucsina no álcool, adicionar o fenol e a água. Acondicionar em

frasco âmbar e conservar à temperatura ambiente.

3.8.8. Solução aquosa de azul de metileno

Cristais de azul de metileno ........................... 1g

Água destilada.............................................100 mL

3.8.9. Solução de hidróxido de sódio a 3%

Hidróxido de sódio .................................... 3 g

Água destilada .........................................100 mL

3.8.10. Solução de N-acetil-L-cisteína (NALC)

A. Solução de citrato de sódio 0,1 M

Citrato de sódio..................................... 29,4 g

Água destilada.......................................1000 mL

Esterilizar por autoclavagem a 120°C por 20 minutos. Estocar em

vidro escuro, a 4°C.

B. N-acetil-cisteína em pó .....................0,25 g

Preparo: 0,25 g de NALC em 25 mL de citrato de sódio 0,1 M.

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4. RESULTADOS

Estudou-se 2 grupos de pacientes HIV positivos, sendo os do

grupo A encaminhados pelos clínicos do Serviço Especial de Saúde de

Araraquara (SESA) e os do grupo B contatados pessoalmente no SESA.

4.1. Resultados obtidos nas amostras fecais de pacientes HIV positivos pertencentes ao grupo A

Foram analisadas 24 amostras fecais provenientes de 17

pacientes HIV positivos e pertencentes ao grupo A de estudo. A maioria

dos mesmos entregou apenas uma amostra de fezes para ser analisada,

mesmo havendo a requisição para a repetição de exame feita pelo médico

do SESA.

Para o exame dessas amostras foram utilizados os métodos de

coloração pela Auramina e de Kinyoun modificado, além de técnicas

rotineiras para pesquisa de outras formas de enteroparasitas.

As principais características desses pacientes como: sexo, idade,

fator de risco para aquisição do HIV e classificação , de acordo com o

Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC), bem como a

presença ou não de fezes diarreicas, estão expostas na Tabela 1.

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Tabela 1. Características clínicas de 17 pacientes HIVa positivos

pertencentes ao grupo A

Características Sexo

Masculino Feminino

13 4

Idade (anos) Fator de risco para contrair HIV

22-58 (32,5)b

Masculino Homossexual ou Bissexual 3 Uso droga intravenosa 1 Contato heterossexual Não definido

3 10

Grupo CDCc II 6 IV

Fezes

Diarreicas Não diarreicas

Total

11

8 9

17 aVírus da imunodeficiência humana bmédia cCentro de Controle de Doenças

Os parasitas entéricos encontrados nas fezes dos pacientes HIV

positivos pertencentes ao grupo A, utilizando-se os métodos parasitológicos

direto, sedimentação espontânea, Rugai e cols e Kato modificado,

considerando-se a presença ou não de diarréia, podem ser visualizados na

Tabela 2.

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Tabela 2. Parasitas entéricos encontrados nas fezes de 17

pacientes HIV positivos, pertencentes ao grupo A,

pelos diferentes métodos parasitológicos empregados,

segundo a presença ou não de diarréia.

Com diarréia (n* = 8)

%

Sem diarréia (n* = 9)

%

Protozoários Cryptosporidium spp 2 11,76 (25,00)ª - 0,00 Entamoeba coli - 0,00 1 5,88 Isospora belli 1 5,88 - 0,00 Sarcocystis sp

- 0,00 1 5,88

Helmintos Ancilostomideo 1 5,88 - 0,00 Strongyloides stercoralis 1 5,88 1 5,88

ª % referente aos pacientes com diarréia * n = número de pacientes

O exame parasitológico das amostras fecais pelas técnicas de

coloração da Auramina e Kinyoun modificada permitiu a verificação da

presença de Cryptosporidium spp em 2 amostras, sendo que estas se

apresentavam diarreicas e não apresentaram outro tipo de enteroparasita.

Os pacientes eram do sexo masculino.

As demais amostras mostraram-se negativas para o

Cryptosporidium spp.

Em uma amostra, também diarreica, observou-se a presença de

Isospora belli.

O exame parasitológico das amostras de fezes pelos métodos

direto, sedimentação espontânea, de Rugai e cols. e Kato modificado

(AMATO NETO e CÔRREA, 1980) permitiu a verificação da presença de

outros enteroparasitas.

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4.2. Resultados obtidos nas amostras fecais de pacientes HIV

positivos pertencentes ao grupo B

Foram analisadas 70 amostras fecais oriundas de 37 pacientes

infectados pelo HIV e pertencentes ao grupo B.

As principais características desse grupo de pacientes como:

sexo, idade, fator de risco para aquisição do HIV e classificação, de acordo

com o Centro de Controle de Doenças dos Estados Unidos (CDC), estão

expostas na Tabela 3.

Entre os 37 pacientes, 12 apresentaram fezes diarreicas e 25,

fezes consideradas formadas ou não diarréicas.

Todos os pacientes moravam em casas que possuíam água

encanada e tratada e rede de esgoto.

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Tabela 3. Características clínicas de 37 pacientes HIVa positivos

pertencentes ao grupo B

Características

Sexo Masculino Feminino

19 18

Idade (anos) 18 – 49 (33)b

Fator de risco para contrair HIV

Masculino Homossexual ou Bissexual 6 Uso droga intravenosa 4 Contato heterossexual 27

Grupo CDCc

II 13 IV

Fezes Diarreicas Não diarreicas

24

12 25

Total 37

aVírus da imunodeficiência humana bmédia cCentro de Controle de Doenças

O exame parasitológico das amostras fecais pelas técnicas de

coloração da Auramina e Kinyoun modificada apresentou-se negativo para

a presença de Cryptosporidium spp para todas as amostras analisadas.

O exame parasitológico das amostras de fezes pelos métodos

direto, sedimentação espontânea, de Rugai e cols. e Kato modificado

(AMATO NETO e CORRÊA, 1980) permitiu a verificação da presença de

outros enteroparasitas. Os resultados obtidos estão expressos na Tabela 4.

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Tabela 4. Parasitas entéricos encontrados nas fezes de 37 pacientes

HIV positivos, com e sem diarréia, pertencentes ao grupo

B, pelos diferentes métodos parasitológicos empregados.

Com diarréia

(n* = 12)

% Sem diarréia

(n* = 25)

% Protozoários

Entamoeba coli 1 2,70 - 0,00 Endolimax nana - 0,00 2 5,40 Isospora belli 1 2,70 - 0,00

Helmintos

Strongyloides stercoralis 1 2,70 - 0,00 * n = número de pacientes

Os resultados dos exames parasitológicos de fezes, referentes aos

54 pacientes, 17 do grupo A e 37 do grupo B, pelos diferentes métodos

empregados, são mostrados na tabela 5

Tabela 5. Parasitas entéricos encontrados nas fezes de 54 pacientes

HIV positivos com e sem diarréia pertencentes aos

grupos A e B.

Com

diarréia (n* = 21)

%

Sem diarréia

(n* = 33)

%

Total (n* = 54)

%

Protozoários Cryptosporidium spp 2 9,52 - 0,00 2 3,70 Entamoeba coli 1 4,76 1 3,03 2 3,70 Endolimax nana - 0,00 2 6,06 2 3,70 Isospora belli 2 9,52 - 0,00 2 3,70 Sarcocystis sp - 0,00 1 3,03 1 1,85

Helmintos

Ancilostomideo 1 4,76 - 0,00 1 1,85

Strongyloides stercoralis 2 9,52 1 3,03 3 5,55 * n = número de pacientes

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4.3. Resultados obtidos nas amostras de secreção brônquica de

pacientes HIV positivos pertencentes ao grupo B

Foram analisadas 39 amostras de secreção brônquica (escarro)

provenientes de 37 pacientes HIV positivos e pertencentes ao grupo B de

estudo.

Os pacientes se referiam a pouca produção de secreção e a

maioria deles entregou apenas uma amostra para análise.

Os exames das 39 amostras de escarro coradas pelas técnicas da

Auramina e Kinyoun modificada, apresentaram-se negativos para a

presença de Cryptosporidium spp.

4.4. Resultado obtido com a modificação efetuada na técnica de

coloração de Kinyoun

Nas fotomicrografias apresentadas são demonstradas as variações

na coloração do material examinado pelo método de Kinyoun, devido a

modificação efetuada. As fotomicrografias foram feitas em microscópio

Jenaval – Karl Zeiss Jena com equipamento fotográfico acoplado, de

esfregaços obtidos de material fecal humano positivo para oocistos de

Cryptosporidium spp.

Nas Figuras 1 e 2 são visualizados oocistos de Cryptosporidium

spp submetidos a descoloração com solução álcool-ácido clorídrico em

aumento de 250 x e 1000 x, respectivamente.

Nas Figuras 3 e 4 são demonstrados oocistos de Cryptosporidium

spp submetidos a descoloração com solução álcool-ácido sulfúrico em

aumento de 250 x e 1000 x, respectivamente.

As Figuras 5 e 6 exibem formas leveduriformes em aumento de

250 x e 400 x.

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FIGURA 1. Oocistos de Cryptosporidium spp observados em fezes. Coloração ácido-

resistente de Kinyoun empregando-se solução descorante álcool-ácido clorídrico

(aumento de 250 x).

FIGURA 2. Oocistos de Cryptosporidium spp observados em fezes. Coloração ácido-resistente de Kinyoun empregando-se solução descorante álcool-ácido clorídrico (aumento de 1000 x).

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FIGURA 3. . Oocistos de Cryptosporidium spp observados em fezes. Coloração ácido-resistente de Kinyoun empregando-se solução descorante álcool-ácido sulfúrico. (aumento de 250 x).

FIGURA 4. . Oocistos de Cryptosporidium spp observados em fezes. Coloração ácido-resistente de Kinyoun empregando-se solução descorante álcool-ácido sulfúrico. (aumento de 1000 x).

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FIGURA 5. Formas leveduriformes presentes em material fecal. Coloração ácido-resistente de Kinyoun com modificação proposta. (aumento de 250 x).

FIGURA 6. Formas leveduriformes presentes em material fecal. Coloração ácido-resistente de Kinyoun com modificação proposta. (aumento de 400 x).

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5. DISCUSSÃO

A criptosporidiose é uma infecção intestinal causada por um

protozoário coccídio monoxênico: Cryptosporidium spp. Apesar de

descrito em princípios do século XX, sua importância foi relevada nos anos

70 quando caracterizado como um dos agentes responsáveis por diarréias

neo-natais em animais de granja, repercutindo em aspectos econômicos em

diferentes regiões (NAVIN e JURANEK, 1984; FAYER e UNGAR, 1986;

TZIPORI e GRIFFITHIS, 1998; ARES-MAZAS e VILLACORTA, 1992 ).

Foi a partir de 1976 que o interesse pelo estudo do protozoário se

incrementou, ocasião em que apareceram os primeiros indícios de quadros

clínicos diarreicos graves em pacientes humanos. Na atualidade, pode-se

caracterizar em Saúde Pública três grupos de população, que parasitados

por Cryptosporidium spp , desenvolvem quadro clínico diarreico (ARES-

MAZAS e VILLACORTA, 1992):

− O primeiro grupo está constituído por enfermos acometidos por

síndrome da imunodeficiência adquirida em que se manifesta como um

parasita oportunista de difícil erradicação, ainda que o quadro clínico se

apresente variável, sendo considerado como agente patógeno

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gastrointestinal responsável por grande morbidade e mortalidade nestes

doentes.

− O segundo grupo é integrado por doentes submetidos a terapia

imunossupressora, que são acometidos por determinadas infecções virais,

por enfermos que apresentam deficiências imunoglobulínicas e por

população infantil com deficiência nutricional. Neste grupo, com a

supressão do tratamento, com o restabelecimento de infecções coexistentes

ou com a normalidade dos estados carênciais, geralmente, ocorre a

remissão da sintomatologia.

− Por fim, o terceiro grupo está formado por pessoas

imunologicamente sadias, principalmente crianças, em que a infecção por

Cryptosporidium se assemelha a uma toxinfecção alimentar, de remissão

espontânea.

Ao que tudo indica, a infecção é adquirida por ingestão e

possivelmente inalação dos oocistos do protozoário, que tem demonstrado

a capacidade de transmitir-se entre uma grande diversidade de hospedeiros

vertebrados, sugerindo a possibilidade de que os animais domésticos

representem importantes reservatórios zoonóticos para o homem (FAYER

& UNGAR, 1986; JANOFF & RELLER, 1987; MEINHARDT et al.,

1996).

Considerando as publicações disponíveis, são considerados

importantes meios de transmissão, os seguintes mecanismos: animal a

animal, homem a homem, animal a homem e contaminação fecal humana

e animal do meio ambiente (JANOFF & RELLER, 1987; NAVIN e

JURANEK, 1984).

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A princípio, o diagnóstico desta protozoose realizou-se

acidentalmente mediante biópsias intestinais; na atualidade, o diagnóstico é

fundamentalmente coprológico, ainda que nem todas as técnicas de rotina

se apresentem eficazes. Assim, são importantes recursos as técnicas de

coloração diferenciadas baseadas em propriedades álcool-ácido resistentes

dos oocistos do coccídio. Estas, aplicadas sobre o sedimento obtido pela

realização de técnicas de concentração, têm se apresentado de grande valia

na evidenciação dos oocistos, facilitando o trabalho de busca microscópica

e ampliando a potencialidade diagnóstica pelo exame de fezes (JANOFF &

RELLER, 1987).

Em revisão à literatura referente ao assunto, verificou-se entre as

metodologias estudadas um bom número de técnicas coprológicas

utilizando-se do exame direto de esfregaços a fresco (DELUOL e col.,

1984) ou adicionadas de substâncias com propriedades tintoriais como o

lugol ( MA & SOAVE, 1983), a fucsina fenicada (HEINE, 1982), a

metamina de prata (ANGUS e cols, 1981), a nigrosina (POHJOLA, 1984),

a auramina-rodamina (GARCIA e cols., 1983), a laranja de acridina (MA

& SOAVE, 1983); para algumas dessas técnicas se utiliza microscopia

comum e para outras, microscopia de fluorescência.

Quando os episódios diarreicos encontram-se diminuídos, ocorre

uma consequente escassez de formas do parasito dificultando a observação

das mesmas, requerendo-se o emprego de um grande número de

preparações e largo tempo de observação microscópica para a garantia e

eficácia de diagnóstico.

Levando-se em consideração alguns aspectos sobre o

protozoário, características da matéria fecal a ser examinada, interferências

na execução da rotina laboratorial entre outras, verificou-se alguns tópicos

importantes para a seleção de metodologia para o diagnóstico da

criptosporidiose:

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• os oocistos apresentam-se como formas arredondadas muito

pequenas - cerca de 5 µm - de difícil observação ao microscópio óptico.

• a maior eliminação de oocistos são coincidentes com a

ocorrência de períodos diarreicos e, por outra parte, ao produzir-se

aceleração do trato intestinal, as fezes se apresentam repletas de restos que

dificultam a busca e visualização dos oocistos.

• a presença de leveduras, cuja forma e tamanho são muito

similares às dos oocistos, induz à necessidade de conhecimento das duas

estruturas para o diagnóstico diferencial.

Ainda, considerando-se as condições particulares do laboratório

de Parasitologia, imputou-se critérios de adaptabilidade da metodologia,

tendo em vista a necessidade de utilização de técnica de concentração e

enriquecimento do material e a necessidade da realização de técnica de

coloração para melhor evidenciação dos oocistos. Foi levado em conta,

também, a facilidade de execução, rapidez e baixo custo.

Como comentado anteriormente, quando se está em presença de

infecção que tem curso com diarréia aquosa abundante, os oocistos, apesar

de seu grande número, se encontram muito diluídos. Assim, é

recomendado o emprego de técnicas de concentração físicas por flutuação:

• flutuação em sulfato de zinco (ISEKI, 1979),

• flutuação em sulfato de magnésio (PAVLASEK, 1982),

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• flutuação em sacarose (GARCIA et al., 1983),

ou métodos difásicos, com uma grande variedade de técnicas, sendo as mais utilizadas:

• técnica de Ritchie modificada (ALLEN & RIDLEY, 1970),

• técnica de Ritchie com formalina-acetato de etila (YOUNG et al., 1979;

MacNABB et al., 1985).

A inclinação para a avaliação destas técnicas que são empregadas

freqüentemente em muitos laboratórios de análises é patente, pela

facilidade de execução e também por permitirem preparar, imediatamente,

a partir do sedimento, esfregaços sobre os quais se podem realizar técnicas

de coloração diferencial de procedimento (ARES-MAZAS e

VILLACORTA, 1992).

São muitos os trabalhos que se referem a utilização de corantes

para a evidenciação dos oocistos de Cryptosporidium spp: Giemsa

(BLAKEY, 1984), azul de metileno/eosina (CROSS & MOORHEAD,

1984) entre outros. Pela coloração de Giemsa não se diferencia leveduras

de oocistos de Cryptosporidium; safranina-azul de metileno é sensível e

rápida, mas cansativa visualmente quando o número de amostra a ser

examinada for grande. Ácido periódico de Schiff modificada e prata-

metamina não são colorações eficazes (JANOFF & RELLER, 1987).

Ao se conhecer as propriedades ácido-resistentes dos oocistos, as

modificações efetuadas a partir da coloração de Ziehel Neelsen têm se

mostradas as mais eficazes (POHJOLA et al., 1985) (MA & SOAVE,

1983) (HENRIKSEN & POHLENZ, 1981) (LENETTE et al., 1985).

Um método seguro, rápido e disponível é a coloração pela

Auramina O fluorescente (JANOFF & RELLER, 1987). Nesse método não

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se visualiza estrutura interna e a morfologia é variável, mas os oocistos

emitem fluorescência amarela-esverdeada intensa e têm a aparência de um

pequeno “botão-de-camisa” sendo fácil e rápido identificá-lo.

As colorações dimetilsulfóxido-carbolfucsina (BRONSDON,

1984) e ácido-resistente de Kinyoun modificada (HENRIKSEN &

POHLENZ, 1981) eliminam a necessidade de aquecimento. Essas técnicas

são sensíveis e não confundem leveduras, devido ao seu tamanho e

morfologia, com oocistos de Cryptosporidium uma vez que aquelas se

coram em verde com o procedimento ácido resistente. Na técnica de

coloração ácido-resistente modificada, os oocistos de Cryptosporidium se

apresentam corados de rosa-avermelhado intenso contra uma coloração de

fundo verde (JANOFF & RELLER, 1987) ou azul quando se usa o azul de

metileno como corante de fundo (GARCIA et al., 1983).

No presente trabalho, utilizou-se as técnicas de formol-éter

(RITCHIE, 1948) e formalina-acetato de etila (YOUNG et al., 1979) para a

concentração do material e as técnicas tintoriais de auramina (LENETTE et

al., 1985) e fucsina carbólica (Kinyoun modificado), que apresentaram

bons resultados. Esses recursos permitiram esfregaços sem muitas

partículas fecais interferentes e uma coloração de contraste possibilitando o

diagnóstico diferencial pela evidenciação das estruturas internas dos

mesmos. Ainda, vale destacar que essas técnicas oferecem vantagem de

rápido processamento do material com agilização do diagnóstico.

Efetuada a opção pela implantação destas técnicas combinadas,

realizou-se grande número de lâminas preparadas a partir de fezes de

suínos jovens comprovadamente positivos para a presença de oocistos de

Cryptosporidium spp, apresentando boa qualidade e que foram utilizados

como controle positivo para as provas laboratoriais.

O material fecal analisado, foi oriundo de 54 pacientes HIV

positivos pertencentes aos grupos A e B, dentre os 395 pacientes

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acompanhados no Programa DST/AIDS do SESA, o que é equivalente a

13,67% de pacientes estudados.

As 94 amostras de fezes, pertencentes aos 2 grupos de estudo (A

e B), foram submetidas à metodologia específica para a identificação de

oocistos de Cryptosporidium spp e aos métodos de rotina para diagnóstico

de parasitoses intestinais.

O grupo A era composto por pacientes que não faziam uso de

medicamentos anti-retrovirais, do teste da contagem da carga viral ou

linfócios T CD4. Eram 17 pacientes HIV positivos, sendo 13 (76,5%) do

sexo masculino e 4 (23,5%) do sexo feminino, com idade média de 32,5

anos. Em relação à classificação do Centro de Controle de Doenças

(CDC), 6 (35,3%) pacientes estavam classificados no Grupo II isto é,

pacientes assintomáticos e 11 (64,7%) no Grupo IV, ou seja de pacientes

sintomáticos (TABELA 1).

Esses dados confirmam os achados da época quando a síndrome

da imunodeficiência adquirida incidia com maior freqüência no sexo

masculino e destacamos ainda os casos positivos entre o sexo feminino

ocorreram em mulheres de idade acima de 40 anos e cujos parceiros

sexuais eram soropositivos e alguns já falecidos (CPD, SESA).

O fator de risco para contrair HIV ficou prejudicado neste grupo

uma vez que a maioria foi considerado indefinido por não constarem dados

esclarecedores nos prontuários médicos dos pacientes do centro de

processamento de dados (CPD) do SESA.

Observou-se outras formas parasitárias com o emprego dos

diferentes métodos coproparasitológicos mencionados anteriormente

(TABELA 2).

Neste grupo encontramos 2 (11,76%) pacientes parasitados pelo

Cryptosporidium spp, apresentando fezes diarreicas e ausência do parasita

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nas amostras não diarreicas, concordando com os dados da literatura

consultada.

Verificou-se que 1 paciente se encontrava parasitado por

Isospora belli, protozoário freqüente em pacientes com AIDS e que pode

ser diagnósticado pelas mesmas técnicas empregadas para Cryptosporidium

spp (DIENG et al., 1994).

Embora o nosso objetivo tenha sido a pesquisa de casos de

criptosporidiose, pode-se sugerir a adoção da técnica de Kinyoun

modificada para o diagnóstico concomitante de isosporíase.

Destacamos ainda que o paciente com Isospora belli apresentava

diarréia crônica intermitente e que os exames parasitológicos com técnicas

rotineiras, como métodos direto e sedimentação espontânea (AMATO

NETO e CORRÊA, 1980), nem sempre se apresentam positivas para o

protozoário. Ao empregar-se as técnicas de concentração e coloração para

a pesquisa de Cryptosporidium spp, nesse paciente, estas sempre se

apresentaram positivas para o Isospora belli.

Pode-se também verificar que foi encontrado 1 paciente com

fezes formadas e positivas para Sarcocystis sp (TABELA 2). Esse paciente

faleceu e não se obteve outros dados no CPD – SESA (Centro de

Processamento de Dados).

Como relatado na literatura (NEVES et al., 1998) a prevalência

desse parasito é desconhecida não só no Brasil como também em outros

países.

Observou-se ainda a presença de Entamoeba coli em 1 paciente

cujas fezes se apresentavam não diarreicas.

Quanto aos demais parasitos encontrados em pacientes do grupo

A, deve-se relatar a presença de ancilostomideo em 1 paciente e

Strongyloides stercoralis em 2 pacientes, sendo que um deles apresentava

fezes diarreicas e o outro, fezes normais.

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Ressalte-se ainda que o mesmo paciente com fezes diarreicas

apresentou-se parasitado pelos dois helmintos acima citados. Isso é

perfeitamente compreensível uma vez que o mecanismo de transmissão é

semelhante para os dois parasitas (REY, 1992; NEVES et al., 1998).

Para esse grupo o total de amostras de fezes analisadas foi de 24,

sendo 12 diarreicas e 12 não diarreicas, pertencentes aos 17 pacientes do

grupo, 8 (47,1%) pacientes apresentando diarréia e 9 (52,9%) sem diarréia.

O grupo B era composto por 37 pacientes HIV positivos,

acompanhados regularmente no Programa DST/AIDS do SESA e que

usavam medicamentos anti-retrovirais e periodicamente realizavam o teste

da contagem da carga viral e /ou linfócito T CD4.

Para a maioria dos pacientes desse grupo foram examinadas 2

amostras de fezes com intervalo de 3 a 5 dias, o que não ocorreu com o

grupo A, onde grande parte dos pacientes entregou apenas 1 amostra para

análise.

Quanto à idade, foi observada menor faixa etária dos pacientes

acometidos pelo vírus quando comparado ao grupo anterior, apesar da

média de idade ter sido praticamente igual (TABELA 3).

Neste grupo B, observou-se que o fator de risco para contrair

HIV foi maior pelo contato heterossexual, isto é 27 pacientes (73%), 6

(16,2%) eram homo ou bissexual e 4 pacientes (10,8%), faziam uso de

droga endovenosa (TABELA 3).

Da mesma forma que no grupo A, os pacientes deste grupo

apresentaram-se sintomáticos pela classificação do CDC (FARTHING,

1985) em sua maioria (64,9%) (TABELA 3).

Quanto à presença ou ausência de diarréia observou-se aumento

de pacientes com fezes formadas, 25 (67,6%) (TABELA 3), se comparados

aos pacientes do grupo A que foram 9 (52,9%) (TABELA 1).

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Esses achados refletem a melhora clínica dos pacientes desse

grupo pela administração do tratamento anti-retroviral e pela realização de

exames parasitológicos de rotina, de contagem de linfócitos T CD4, carga

viral e outros, de responsabilidade do SESA.

Dos 37 pacientes do grupo B que enviaram as amostras de fezes

detectou-se a presença de 13,5% de positividade para formas parasitárias

de protozoários e helmintos (TABELA 4).

Concordando com MAGALHÃES et al., 1993, a Entamoeba coli

e a Endolimax nana não têm papel relevante na indução de diarréia em

pacientes HIV positivos. O mesmo não se pode dizer em relação aos

parasitas patogênicos como o Strongyloides stercoralis e Isospora belli,

cujo percentual de positividade foi de 5,4% para esse grupo. O paciente

com Isospora belli apresentava-se com diarréia crônica intermitente e o

paciente com Strongyloides stercoralis, com diarréia.

Levando-se em consideração os casos de diarréia entre os dois

grupos estudados (A e B) verifica-se que 2 pacientes (9,52%) (TABELA 5)

dos mesmos apresentaram infecção pelo Cryptosporidium spp.

No Brasil, o percentual encontrado para Cryptosporidium spp,

entre aidéticos com diarréia, na literatura consultada varia entre 12,1 % a

19,6 % (DIAS et al., 1988; MOURA et al. , 1989; RODRIGUES et al.,

1991; GUIZELINI et al., 1992; MAGALHÃES et al., 1993; SAUDA et al.,

1993; GARLIPP et al., 1995).

Os trabalhos dos autores acima referidos foram realizados, na sua

totalidade, com pacientes em demanda hospitalar, caracterizados por

amostragem que variaram de 48 a 157 pacientes HIV positivos e

apresentando sintomatologia clínica.

Verifica-se que o percentual de positividade encontrado neste

trabalho para o Cryptosporidium spp, encontra-se ligeiramente inferior aos

valores mencionados acima, talvez devido ao fato desses pacientes, apesar

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de condição sócio-econômica baixa, receberem acompanhamento de

Assistente Social do Programa DST/AIDS do SESA e possuírem água

encanada e tratada e rede de esgoto em suas residências.

Dos 17 pacientes pertencentes ao grupo A, pacientes não

submetidos a medicação anti-retroviral, 8 se encontravam com fezes

diarreicas e destes, 2 apresentaram diagnóstico positivo para

Cryptosporidium spp, correspondendo a 25 % de positividade quando

estudado isoladamente, o que está de acordo com dados da literatura

(ANAND et al., 1996; MERCADO e GARCIA, 1995; DIENG et al., 1994;

KAMEL et al., 1994; COTTE et al., 1993; BLANSHARD et al., 1992).

Esses autores apresentam estudos com amostragens variando de 13 a 145

pacientes HIV positivos, com diarréia, em regiões de diferentes países –

Manipur, Índia; Santiago, Chile; Dakar, Senegal; Kuala Lumpur, Malásia;

Lyon, França; Londres, Inglaterra – com índice de positividade variando de

13,9 % a 46,6%.

Ao compararmos com o total de amostras analisadas (94)

referentes ao total de pacientes (54), a positividade para Cryptosporidium

spp cai drasticamente para 3,70% dos pacientes estudados (TABELA 5).

Este valor é compatível com os encontrados nos países desenvolvidos

(SORVILLO et al., 1994; PEDERSEN et al., 1996; MEINHARDT et al.,

1996; FAYER & UNGAR, 1986).

Julgamos esses dados mais compatíveis com o nosso estudo,

considerando-se a nossa amostragem ser de pacientes acompanhados em

um Programa de Saúde e residentes em cidade com boa infra-estrutura

sanitária.

As 39 amostras de escarro, examinadas pelas técnicas da

Auramina e Kinyoun modificada, apresentaram-se negativas, em sua

totalidade, para Cryptosporidium spp.

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Cumpre-nos salientar que observando-se alguns dos esfregaços

de escarro corados pela auramina foram visualizadas estruturas que

despertaram suspeita de micobactéria. O fato foi comunicado ao SESA que

tomou as providências cabíveis.

Houve dificuldade para a obtenção de 2 amostras de escarro, que

foram solicitadas somente para os pacientes do grupo B. Os pacientes,

diziam que não conseguiam expectorar ou ficavam de entregar em outro

dia e não o faziam.

Embora tenhamos encontrado apenas 2 casos de criptosporidiose

na amostra populacional estudada, deve-se salientar que a utilização de

técnicas combinadas de concentração pela formalina-acetato de etila e

coloração de Kinyoun modificada, que foram adotadas nesta investigação,

mostrou-se eficaz, confiável e exeqüível a qualquer Laboratório de

Análises Clínicas, pela facilidade de execução, baixo custo e que permite

identificar não só o Cryptosporidium spp, objeto deste estudo, como

também o Isospora belli que freqüentemente acomete os pacientes HIV

positivos.

Deve-se destacar a importância do acompanhamento dos

pacientes HIV positivos em nível de Saúde Pública em Araraquara

realizado pelo Programa DST/AIDS do SESA.

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5.1. Considerações sobre as modificações técnicas

No decorrer do experimento efetuou-se algumas modificações na

tentativa de proporcionar melhorias nas técnicas diagnósticas. Assim, na

execução da técnica de concentração, optou-se pela substituição do éter

(RITCHIE, 1948) por acetato de etila (YOUNG et al, 1979).

O produto apresentou-se mais eficiente na remoção da gordura e

de detritos fecais e, além do acetato de etila apresentar uma maior

facilidade de aquisição, quando comparado ao éter, apresenta menor

restrição comercial e é menos perigoso para o manuseio.

Na realização da coloração das lâminas, o tempo de utilização da

fucsina carbólica foi reduzido de 30 (HENRIKSEN & POHLENZ, 1981)

para 3 minutos (LENETTE et al., 1985) e procedeu-se a substituição da

solução de álcool-ácido sulfúrico a 5% (HENRIKSEN & POHLENZ,

1981) por solução de ácido clorídrico a 0,5% em álcool etílico 70%

(contribuição original). Essas mudanças promoveram descoloração efetiva

e eficiente, removendo melhor o excesso de fucsina em mesmos tempos de

descoloração. Ao contracorar com a solução de azul de metileno os

oocistos, de coloração rosa-avermelhada, sobressaiam-se contra o fundo

azul, sendo possível visualizá-los em aumento de 250x (FIGURA 1) e

diminuindo sobremaneira o tempo de microscopia, tornando o trabalho de

análise das lâminas mais rápido e menos cansativo. As formas suspeitas

foram examinadas com o aumento de 1000x (FIGURA 2) para

confirmação.

Os esfregaços submetidos a descoloração com álcool-ácido

sulfúrico necessitaram de maior tempo de microscopia e maior acuidade

visual devido a dificuldade de visualização dos oocistos de

Cryptosporidium spp quando se utilizava aumento de 250 x (FIGURA 3).

Torna-se mais fácil visualizar o coccídio em aumento de 1000x, mas isso

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faz com que a análise da lâmina corada seja mais demorada e cansativa

(FIGURA 4).

As leveduras coradas pelo método de Kinyoun com a

modificação efetuada, são facilmente distinguíveis de oocistos de

Cryptosporidium spp, pelo fato dessas corarem-se em azul (FIGURA 5 e

6).

Na preparação das amostras de escarro, com a utilização de

Fluimucil�, não se obteve bons resultados na aderência do material às

lâminas. Os resultados foram muito bons quando substituiu-se o

Fluimucil� por solução de hidróxido de sódio a 3% para a digestão do

escarro, conforme descrito por DE CARLI, 1994. Além de redução do

tempo de digestão de 24 horas para 1 hora, agilizando o diagnóstico, o

material sedimentado por centrifugação, apresentou-se mais homogêneo,

espalhando-se com facilidade e aderindo-se mais firmemente à lâmina,

favorecendo a coloração.

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6. CONCLUSÕES

1� Sugere-se a implantação da técnica de Kinyoun, por nós

modificada em nosso trabalho, pela facilidade de execução, baixo custo e

bons resultados obtidos podendo ser utilizada em qualquer laboratório de

Análises Clínicas, de caráter institucional ou particular.

2� Na técnica de Kinyoun modificada a utilização de solução

descorante de ácido clorídrico 0,5% em álcool etílico 70% promoveu

melhor visualização dos oocistos de Cryptosporidium spp nos esfregaços

corados, devido a remoção do excesso de fucsina.

3� A substituição da solução de N-acetil-L-cisteína por hidróxido

de sódio a 3% promoveu melhor fluidificação do material, facilitando a

concentração e a confecção do esfregaço, com redução do custo de exame

de escarro, além de diminuir o tempo de preparo e o contato com o material

biológico.

4� Entre os 54 pacientes HIV positivos estudados, obteve-se

3,7% de positividade para o Cryptosporidium spp em amostras fecais.

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5� Considerando-se o total de 21 pacientes com fezes diarreicas,

o índice de positividade foi de 9,52% para o coccídio pesquisado.

6� Avaliando-se os pacientes HIV positivos, não medicados com

anti-retrovirais, obteve-se 11,76% de positividade para o Cryptosporidium

spp.

7� Considerando-se o grupo de pacientes HIV positivos não

medicados com anti-retrovirais e com presença de diarrréia, obteve-se 25%

de positividade para o Cryptosporidium spp.

8� Nos pacientes submetidos a medicação com anti-retrovirais

não se encontrou oocistos de Cryptosporidium spp nas amostras de fezes

examinadas.

9� Entre os pacientes estudados e submetidos à análise de escarro

não constatamos a presença de formas de Cryptosporidium spp no material

examinado.

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7. RESUMO

A criptosporidiose é uma infecção causada pelo

Cryptosporidium spp, um protozoário coccídio de patogenicidade

emergente e responsável por severa e prostante diarréia aquosa em

humanos. Em pacientes HIV positivos, os sintomas gastrointestinais

podem ser graves e prolongados e incluem náuseas, febre baixa, cólicas

abdominais, anorexia e diarréia aquosa. Envolvimento pulmonar também

pode ocorrer. Foram analisadas 94 amostras de fezes de 54 pacientes HIV

positivos com e sem diarréia e 39 amostras de escarro de 34 desses

pacientes. Demonstrou-se uma prevalência de 9,52% de Cryptosporidium

spp entre os pacientes com diarréia. Não se encontrou amostra de escarro

positiva para o coccídio pesquisado. O diagnóstico foi baseado na

identificação dos oocistos de Cryptosporidium spp empregando-se os

métodos de coloração pela Auramina e ácido-resistente (Kinyoun) onde

efetuou-se modificação que facilitou a visualização das formas do coccídio.

Palavras-chave: Cryptosporidium spp, AIDS, diagnóstico, diarréia

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8. SUMMARY

Cryptosporidiosis, a infection caused by Cryptosporidium spp, is

a coccidial protozoan of emergencial pathogenicity causing severe

protacted watery diarrhea in humans. In HIV seropositive patients, the

gastrointestinal symptoms may be serious and prolonged and may include

nausea, low-grade fever, abdominal cramps, anorexia and watery diarrhoea.

Cryptosporidiosis with pulmonary involvement in patients with AIDS can

occur too. It was analysed 94 stool samples from 54 patients with and

without diarrhoea, and 39 sputum samples from 34 of this patients. The

prevalence of Cryptosporidium spp among patients with diarrhea was

9,52%. The sputum samples were negative in all analysis for the coccidia

demonstration. The diagnosis was based on the recognition of

Cryptosporidium spp oocysts using an auramina staining and acid-fast

staining (Kinyoun) where was effected a modification that offered the best

results in the visualization of coccidial forms..

Key words : Cryptosporidium spp, AIDS, diagnosis, diarrhea

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10. ANEXOS

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ANEXO 1

QUESTIONÁRIO (CONFIDENCIAL) 1. NOME:............................................................................................................IDADE......................... 2. ENDEREÇO:...................................................................................................CIDADE:..................... 3. PROCEDÊNCIA:..........................................................HÁ QUANTO TEMPO:.................................. 4. USUÁRIO DE DROGA ENDOVENOSA: � SIM � NÃO 5. PREFERÊNCIA SEXUAL: � HOMO � HETERO � BISEXUAL 6. CONTATO COM ANIMAIS: � DOMÉSTICO (CÃO, GATO) � FAZENDA � PÁSSAROS 7.CONTATO COM ÁGUA: � PISCINA � REPRESAS � LAGOS � RIOS 8. VIAGEM RECENTE: � SIM � NÃO LOCAL: 9.CONTATO COM PARENTE, AMIGO, CONHECIDO COM QUADRO DIARREICO RECENTE � SIM � NÃO 10. USO MEDICAMENTO: � SIM � NÃO QUE TIPO: 11. SINTOMAS CLÍNICOS: ( ) DIARRÉIA (aquosa, volumosa) - DURAÇÃO (dias):______QUANTAS EVACUAÇÕES/DIA:____ ( ) DOR ABDOMINAL ( ) CÓLICAS ( ) PERDA DE PESO ( ) PERDA DE APETITE ( ) FLATULÊNCIA ( ) FEBRE BAIXA ( ) NAÚSEA ( ) VÔMITO ( ) PROBLEMAS RESPIRATÓRIOS: tosse, dor no peito, falta de ar ( ) DOR QUADRANTE SUPERIOR DIREITO 12. RESIDÊNCIA: ( ) água tratada ( ) rede esgoto 13. ÁGUA DE BEBER: ( ) torneira ( ) filtro ( ) fervida e/ou filtrada

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ANEXO 2

TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO

Eu, _________________________________________, residente

em _________________________, concordo em participar como voluntário do

projeto de pesquisa entitulado “CONTRIBUIÇÃO AO DIAGNÓSTICO

LABORATORIAL DA CRIPTOSPORIDIOSE HUMANA E

LEVANTAMENTO DA PREVALÊNCIA DE OOCISTOS DE Cryptosporidium

spp NAS FEZES E EM SECREÇÃO BRÔNQUICA DE PACIENTES HIV

POSITIVOS”.

Estou ciente das informações anexas a esse Termo, referente aos

objetivos da pesquisa e orientações que deverei seguir durante a fase de coleta das

amostras biológicas de secreção brônquica (escarro) e fezes.

Araraquara, ____ de ______________ de 19___.

_________________________ assinatura

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INFORMAÇÕES

Projeto: “Contribuição ao diagnóstico laboratorial da criptosporidiose humana e levantamento da prevalência de oocistos de Cryptosporidium spp nas fezes e em secreção brônquica de pacientes HIV positivos”.

Amostras: Serão analisadas amostras biológicas de: - secreção brônquica ( coletada em jejum, pela manhã, pelo próprio

paciente). - amostras de fezes, cuja coleta não é invasiva. Objetivo: Verificar a ocorrência do parasita Cryptosporidium spp em

pacientes HIV positivos.

Paralelamente, no material disponível para análise, será pesquisada a

presença de outros enteroparasitas.

Considerações sobre risco: Os indivíduos que irão participar da pesquisa

não serão submetidos a nenhum tipo de risco. Todo o material empregado para coleta das amostras biológicas de escarro e fezes são estéreis e de uso único.

OBSERVAÇÃO: DÚVIDAS - Fone: (016) 232-0200 R. 294 Isabel

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