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João Filipe Brochado Martins

Compartimento de Remodelação Óssea

Dissertação de Mestrado em Patologia Experimental,

apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra

Dezembro de 2017

Dissertação de candidatura ao grau de mestre

apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra

A Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra não aceita qualquer responsabilidade em

relação à doutrina e a forma desta dissertação (Regimento da Faculdade de Medicina de

Coimbra,1931, Art. 108, & único).

Orientadores:

Professora Doutora Maria Helena Figueiredo

Professor Doutor Francisco do Vale

“Não andes apenas pelo caminho traçado,

pois ele conduz somente até onde os outros já foram.”

Alexander Graham Bell

Agradecimentos

__________________________________________________________________________

À Professora Doutora Helena Figueiredo, pela sua constante disponibilidade, pelo seu empenho

categórico apesar de todas as adversidades (que apenas aos grandes Homens são impostas), pela

motivação e entusiasmo contagiantes que demonstrou sempre no decorrer da elaboração deste

trabalho. A realização desta tese não teria sido possível sem a sua ajuda, orientação e partilha de

conhecimento científico. Agradeço também os enormes contributos que me deu ao longo da

realização deste trabalho, fomentando sempre o rigor e o raciocínio científico. Agradeço-lhe toda a

disponibilidade para me guiar no meu percurso académico, primeiro por acreditar em mim enquanto

aluno, e durante os anos seguintes como investigador e docente. As horas passadas ao microscópio,

nunca perdidas, mas sempre cheias de partilha de saber fizeram de mim, sem dúvida, um profissional

muito mais preenchido. Não é fácil agradecer a quem, além de Professora e orientadora, se tornou

acima de tudo família – a “mãe histológica”.

Ao senhor Prof. Francisco do Vale, coorientador deste trabalho, pela cedência dos materiais de

experiência, pelos conselhos dispensados e pela preciosa ajuda facultada, e ainda por todo o

incentivo e orientação científica, que só me fez crescer ao longo deste trabalho.

Ao Senhor Prof. Paulo Palma, que desde cedo me tem acompanhado na minha caminhada não só

pela investigação, mas também pela área clínica e cuja amizade, apoio e crítica construtiva permitiu a

abertura de caminhos na reflexão e aprofundamento das metas a que me propus. Agradeço também

a prontidão em ceder-me parte dos seus materiais da tese de doutoramento para que pudesse levar

a cabo o estudo a que me propus. Além disso, agradeço-lhe pela forma como, nos momentos chave,

me motivou, de forma entusiasmada e genuína, perante cada obstáculo ou sucesso alcançado.

À Senhora Prof. Ana Luísa Maló de Abreu, agradeço-lhe o apoio e constante disponibilidade para

a discussão científica, e não só, deste projeto. É com profunda gratidão e estima que lhe agradeço a

confiança em mim colocada, disponibilidade para discutir ideias e o cuidado depositado nas correções

para que esta tese tivesse a presente conclusão.

Á Dr. Catarina Cortez Vaz, pela amizade e pela preciosa disponibilidade com que nos auxiliou na

elaboração deste trabalho, sem a qual não teria sido possível levá-lo a bom termo.

Não poderia deixar de agradecer, numa nota mais pessoal, à minha família (em especial à minha

mãe), pilares inabaláveis da minha motivação, pelo apoio incondicional com o qual sei que posso

sempre contar.

Sumário

_________________________________________________________________________________

Agradecimentos

I – Introdução

1. Justificação do tema

1.2 Planificação do trabalho

2. Ciclo de Remodelação óssea (algumas considerações)

II – Compartimento de Remodelação Óssea

1. Objetivo

2. Materiais e Métodos

2.1 Animal de experimentação

2.2 Manutenção e bem-estar animal

2.3 Colheita do material

2.4 Processamento histológico de material descalcificado

2.5 Processamento histológico de material não descalcificado

3. Resultados

3.1 Deteção de compartimentos de remodelação óssea no tecido ósseo alveolar

3.2 Identificação de diferentes etapas do ciclo de remodelação óssea

3.3 Deteção de compartimentos de remodelação no cemento e dentina

4. Discussão e considerações finais

III – Resumo

IV – Abstract

V – Bibliografia

VI – Índice

VII- Anexos

Compartimento de Remodelação Óssea 2016

7

I. Introdução, justificação do tema e planificação do

trabalho

_______________________________________________________


8

1.1 Introdução

Apesar de uma aparência inerte, quando considerados macroscopicamente, os ossos são, sob

um ponto de vista microscópico, estruturas plásticas, altamente dinâmicas, em permanente

remodelação1. A sua grande dinâmica funcional é conseguida sobretudo através de processos de

remodelação.

A remodelação óssea consiste num mecanismo de substituição ou reconstrução de áreas de

tecido ósseo de modo a preservar a sua integridade, otimizar a sua função e prevenir a sua

degradação, visando não só uma adaptação da estrutura óssea às solicitações mecânicas, como

também a remoção de áreas danificadas2. Por outro lado, a matriz óssea constitui um importante

reservatório de iões minerais (cálcio e fósforo), verificando-se um intercâmbio contínuo entre o

cálcio plasmático e o cálcio ósseo. Com efeito, a importância da homeostasia dos níveis séricos de

cálcio vem considerar também o processo de remodelação como um mecanismo de gestão do banco

de cálcio ósseo.

Deste modo, o objetivo da remodelação óssea parece incluir não só uma perspetiva mecânica,

dirigida para a reparação e adaptação da estrutura óssea ao meio, como uma perspetiva metabólica

relacionada com a homeostasia do cálcio e fosfato plasmático. É importante referir que, em

condições fisiológicas, as funções de suporte e de reserva metabólica apresentam-se num equilíbrio

estável3, 4. Porém, em situações de desequilíbrio, a função estrutural é sempre sacrificada em favor da

metabólica5-7.

Uma nota mais para sublinhar o facto de o tecido ósseo alojar e suportar, no seu interior, as

células constituintes da medula óssea, compartilhando, deste modo, um microambiente comum e

muitos dos seus fatores de regulação. Considerando a sua semelhança filogenética e proximidade

topográfica, não será difícil aceitar uma estreita comunicação e integração entre células ósseas,

células do sistema imunitário e células hematopoiéticas6, 8, 9,10. A osteoimunologia7, 11-18 assenta num

eixo de regulação que constitui uma ponte molecular entre o sistema imune e o metabolismo ósseo

e que muitas vezes resulta numa sobre-estimulação da atividade osteoclástica. Na verdade, um facto

que contribuiu enormemente para o desenvolvimento da osteoimunologia foi a constatação de uma

acelerada perda de massa óssea associada a muitos processos inflamatórios. Em situações patológicas

(doenças inflamatórias autoimunes e neoplásicas), o processo de remodelação óssea sofre, quase

sempre, um desvio para privilegiar a reabsorção óssea relativamente à formação4,11,19,20. A

remodelação óssea foi já, ela própria, considerada como um processo inflamatório ou uma forma

altamente controlada e especializada de autoimunidade sendo as áreas de tecido ósseo danificado

reconhecidas como non-self11-18.

A remodelação óssea engloba um processo pelo qual é eliminada uma área de tecido ósseo

que será substituída por outra, com pouca ou nenhuma alteração da massa óssea, constituindo a mais


9

notável resposta do tecido ósseo ao seu meio envolvente. Qualquer ciclo de remodelação

compreende uma sequência ordenada e imutável de eventos que se inicia por uma fase de

reabsorção óssea e termina com uma etapa reparadora de formação óssea.

O conjunto de células responsáveis por estas diferentes atividades é coletivamente designado

por Unidades Multicelulares Básicas (Basic Multicellular Units - BMU)21-23,28,46,98,100 e reúne uma equipa

de células da linha osteoclástica (pré-osteoclastos e osteoclastos) e uma outra de células da linha

osteoblástica (pré-osteoblastos, osteoblastos, osteócitos e células de revestimento)8,9,10,25,38,46,98.

Desta unidade fazem também parte outras populações celulares que incluem células

mesenquimatosas indiferenciadas e células do tecido conjuntivo, muitas delas pertencentes ao

sistema imunitário11-18, bem como um suplemento vascular especializado para o efeito.

De facto, a remodelação óssea tem atrás de si uma complexa maquinaria celular que, por sua

vez, está sujeita à ação de numerosos fatores de regulação, que exigem um rigoroso e apertado

sistema de sinalização e comunicação, responsável pela ação concertada de todas estas células e pela

coordenação e transição equilibrada das diferentes etapas da remodelação1,98.

Era, pois, previsível que toda esta atividade celular tivesse que ser, de certo modo, “protegida”

de interferências estranhas, vindo em 2001 a ser descrita a existência de uma estrutura visando

proteger e abrigar este complexo e delicado conjunto celular responsável pelos processos de

remodelação. Com efeito, Hauge et al. (2001)24 foram os primeiros investigadores a detetar a

presença de um compartimento de remodelação óssea, como uma entidade real, ainda que

transitória, demonstrando histologicamente a sua existência. De facto, os trabalhos de Hauge et al

(2001) concluíram que as células constituintes das BMU (mesmo no caso do tecido ósseo esponjoso),

não estão em contacto direto com o tecido conjuntivo em seu redor, mas reunidas num espaço

fechado, separado do exterior por um conjunto de células que formam uma cúpula (habitualmente

conhecida por canopy), que constitui o limite externo de uma estrutura especializada24. Esta estrutura

foi então designada por Compartimento de Remodelação Óssea (Bone Remodeling Compartment -

BRC).

Se a remodelação óssea se processasse num espaço amplamente aberto, seria difícil o controlo

dos numerosos e importantes fatores de crescimento e de regulação, necessários aos processos de

diferenciação e maturação das células das linhas osteoclástica e osteoblástica. Com efeito, a

concentração atingida por estes fatores no interior de um espaço confinado irá facilitar a boa

prossecução dos mecanismos de remodelação óssea25.

Pode considerar-se, assim, que o BRC constitui um microambiente ideal para o desempenho

da intensa atividade celular que caracteriza uma BMU, permitindo encontrar no seu interior um

apropriado gradiente de citocinas e outros fatores moleculares capazes de recrutar as populações

celulares necessárias, permitir a sua diferenciação e, deste modo, modular a ligação entre a fase de

reabsorção e a fase de formação óssea.


10

O aparecimento destes BRC, nos locais de remodelação óssea, coincide sempre com a fase de

ativação e início da fase de reabsorção do processo de remodelação24,26,99. Por outro lado, o seu

desaparecimento observa-se apenas quando já estiver completa a etapa de formação óssea82. Está

também confirmado que as situações de baixo turnover ósseo estão associadas a um decréscimo do

número de BRC, enquanto os casos de elevado turnover ósseo, são acompanhados por um aumento

do número de BRC21. De referir ainda que a perda de integridade de qualquer dos componentes

anatómicos constituintes destas estruturas, nomeadamente da canopy, está sempre relacionada com

uma paragem no processo de reconstrução óssea25-27,76,82. Estes factos reforçam bem a íntima relação

entre BRC e remodelação óssea, apontando mais uma vez para a importância crucial que esta

estrutura representa nos mecanismos de regulação coordenação e integração dos processos de

recrutamento e diferenciação das células da linha osteoclástica e osteoblástica.

Dos trabalhos de investigação realizados no âmbito da remodelação óssea, os estudos de

carácter histológico são escassos, com ilustrações de fraca qualidade e surgem quase sempre numa

posição secundária, constituindo uma base morfológica de apoio necessária à elaboração e

justificação de teorias de cariz bioquímico, conducentes ao desenvolvimento e otimização de

soluções terapêuticas relacionadas com o metabolismo ósseo. De facto, devido ao demasiado

enfoque dado à atividade das células da série osteoblástica ou osteoclástica de per si (assente em

técnicas de isolamento e culturas celulares cada vez mais sofisticadas) foi-se perdendo uma

perspetiva global da microanatomia e constituição histológica, no seu todo, da região onde se

desenrola o processo de remodelação óssea.

É realmente de admirar como só recentemente foi detetada a existência de um

compartimento de remodelação óssea e reconhecida a importância que a constituição e preservação

desta estrutura anatómica, e suas relações topográficas com o microambiente em seu redor,

nomeadamente os vasos sanguíneos, representa na funcionalidade do ciclo de remodelação óssea.

Todo o esforço que tem sido despendido visando aumentar a eficácia dos processos de

formação óssea com base em agentes anabólicos nunca será bem-sucedido se não se verificarem as

condições logísticas necessárias que assegurem o recrutamento e proteção das células

osteoprogenitoras e dos seus fatores de regulação, ou seja, a integridade do BRC.

1.2 Justificação e planificação do trabalho

O trabalho aqui apresentado pretende contribuir para um melhor conhecimento da

constituição histológica do compartimento de remodelação óssea, tendo por base uma análise em

microscopia de luz de material incluído em parafina e em metilmetacrilato.


11

Uma vez que pretendemos integrar este estudo no âmbito da medicina dentária, e

considerando que a atividade de remodelação óssea atinge no osso alveolar uma frequência

notável1,28,101, incidimos a análise microscópica em cortes histológicos provenientes do tecido ósseo

esponjoso e do tecido ósseo compacto que formam o osso alveolar. Decidimos também estender as

observações para a dentina e para o cemento, uma vez que são tecidos mineralizados capazes de

sofrer processos de remodelação30-32.

Este trabalho encontra-se organizado em três partes distintas.

Na primeira parte (Parte A), após a introdução e justificação do tema, traçamos uma perspetiva

global do ciclo de remodelação óssea e dos elementos celulares que o constituem, dando particular

destaque à fase de ativação e à fase de reversão. Pretende-se com esta revisão proporcionar uma

base geral de apoio indispensável para uma melhor compreensão das imagens apresentadas nos

resultados.

Na segunda parte (Parte B), após uma descrição dos materiais utilizados e das metodologias

aplicadas, procedemos à apresentação pormenorizada das características histológicas dos

compartimentos de remodelação observados em trabéculas do tecido ósseo esponjoso, em cones de

reabsorção presentes no tecido ósseo compacto e em áreas de reabsorção de cemento e dentina.

Finalmente apresenta-se uma discussão e interpretação global dos resultados.

A última parte (Parte C) engloba toda a bibliografia consultada.


12

1. Ciclo de remodelação óssea (algumas considerações)


tecido ósseo, de modo a otimizar a sua função ou prevenir a sua degradação34,99,100 seguindo uma

sequência imutável de etapas - ativação, reabsorção, inversão/reversão e formação (Figura 1 e 2).

Neste processo é eliminada uma área de tecido ósseo que será substituída por outra, com pouco ou

nenhuma alteração da massa óssea, englobando uma perfeita coordenação e integração de todas as

atividades celulares intervenientes22,27,33,104.

Uma característica importante da sequência de remodelação óssea é a sua especificidade de

localização. O processo de remodelação que ocorre numa determinada área não tem ligação

cronológica direta com a remodelação observada em qualquer outra área. Este facto leva a admitir

que a remodelação óssea está sobretudo sob controlo de fatores locais (com particular realce para

os estímulos mecânicos), gerados no microambiente de cada unidade ou área específica de

remodelação35,36. De facto, para além de fatores sistémicos (de natureza hormonal e não-hormonal)

as moléculas produzidas ou libertadas localmente, no compartimento de remodelação óssea,

parecem constituir os principais agentes moduladores do ciclo celular da remodelação18,25,35,26,38,46.

De registar ainda a variabilidade de duração das diferentes fases do ciclo de remodelação

óssea. Considerando o tecido ósseo esponjoso (que apresenta uma maior capacidade metabólica e

maior atividade de remodelação do que o tecido ósseo compacto), a fase de reabsorção estende-se

aproximadamente por 3 semanas101, enquanto a fase de formação demora cerca de 3-4 meses102.

Entre estas duas, observa-se uma fase intermédia mas igualmente crucial - fase de reversão - com

uma duração aproximada de 5 semanas101.

Figura 1 - Esquema representativo das diversas fases do ciclo de remodelação óssea. Adaptado de Henriksen e col. (2009)170


13

A fase de ativação (A) compreende o reconhecimento de uma área precisa da superfície

óssea e a sua preparação para o processo de remodelação. O início desta fase parece ser da

responsabilidade de citocinas pró-inflamatórias produzidas pelos osteócitos em “sofrimento” ou em

apoptose, localizados na área que irá ser sujeita a remodelação2,22,37,46,47,117-119.

Será pertinente recordar aqui que à exceção da calcitonina, todas as hormonas e muitos

fatores de crescimento e citocinas que controlam a reabsorção do tecido ósseo, têm recetores nos

osteoblastos [Vitamina D3 – (1α,25(OH)2D3); paratormona – (PTH); peptídeo relacionado com a

paratormona - (parathyroid hormone related peptide PTHrP) e IL-11, entre outros] e não nos

osteoclastos18. Tudo indica, pois, que são as células da linha osteoblástica e não os osteoclastos que

desencadeiam o processo de remodelação óssea25,45-48.

Por outro lado, para que se inicie o seu processo de diferenciação, os osteoclastos necessitam

da presença de células da linha osteoblásticas, ou de células mesenquimatosas do estroma da medula

óssea, capazes de produzir fatores de diferenciação e ativação, que incluem, entre outros, o fator

estimulador de colónias de macrófagos (macrophage colony stimulating factor – M-CSF). Os

osteoblastos expressam também uma outra proteína transmembranar, o ligando para o recetor de

ativação do fator nuclear kappa-B (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand -

RANKL)25,46,47,104,105,109.

Para que possa dar-se a ativação das células pré-osteoclásticas é necessário que estas

desenvolvam entretanto também na sua superfície um recetor transmembranar designado por RANK

(receptor activator of nuclear factor kappa-B – RANK)4,39,45,49,50. A interação do RANKL (presente na

superfície dos osteoblastos) com o RANK (presente na superfície dos pré-osteoclastos) leva à

maturação dos osteoclastos, sendo um dos principais “motores de arranque” da osteoclastogénese.

Na verdade, está hoje bem estabelecido que o contacto célula-a-célula entre células da linha

osteoblástica e osteoclástica constitui um pré-requisito necessário para a maturação e ativação dos

osteoclastos. De facto, as células de revestimento ósseo, os osteoblastos e os osteócitos, através de

um mecanismo que envolve o contacto entre estas células e os precursores osteoclásticos,

constituem os principais indutores da osteoclastogénese116.

Os osteoblastos sintetizam ainda uma outra proteína, neste caso solúvel, a osteoprotegerina

(OPG), com uma alta afinidade para o RANKL, impedindo ou bloqueando a ligação do RANKL ao

seu recetor RANK51. Por este mecanismo, a OPG regula a população funcional dos osteoclastos,

atuando localmente como um “travão” à osteoclastogénese, reduzindo, deste modo, a reabsorção

óssea.

Com efeito, as células da linha osteoblástica podem controlar o desenvolvimento e a atividade

osteoclástica, ajustando os níveis de expressão do RANKL e de OPG44,113,116. A presença de altos

níveis de RANKL promove a osteoclastogénese, enquanto uma maior expressão de OPG resulta


14

numa diminuição da osteoclastogénese, ou mesmo na apoptose dos osteoclastos52. Tradicionalmente,

o osteoblasto tem sido considerado como uma “master cell” na regulação do processo de

diferenciação, maturação e ativação dos osteoclastos (osteoclastogénese) e, deste modo, no

mecanismo de remodelação óssea. Porém, o aparecimento de um cada vez maior número de

informações leva-nos a repensar este conceito, já há muito estabelecido.

Na verdade, tem vindo a ser comprovado46,47,107,112,113 que é ao osteócito que cabe o papel

principal na orquestração de todo o mecanismo de remodelação óssea, incluindo o recrutamento e

maturação dos osteoclastos, através da produção de RANKL. A esclerostina, constituindo um

produto primário do osteócito, parece representar uma molécula chave na regulação da rácio

RANKL/OPG e, deste modo, no início, coordenação e transição equilibrada das várias etapas do

ciclo de remodelação45,46,110,111.

De notar, no entanto, que pré-osteoblastos, osteoblastos, osteócitos e células de revestimento

representam diferentes estádios de diferenciação da mesma célula. Assim sendo, é perfeitamente

compreensível que quanto mais diferenciada esteja a célula mais sofisticada e completa será a sua

atividade. Constituindo os osteócitos e as células de revestimento4,46,107,113 a etapa final do processo

de diferenciação não será de estranhar que sejam estas células as principais responsáveis pela

ativação e coordenação de todo o processo de remodelação óssea.

Devido ao seu elevado número (constituindo 90-95% do total de células óssea)105,114,115 e

complexa organização e disposição, facilmente se compreende que os osteócitos se encontrem numa

situação privilegiada para captar e transmitir quaisquer alterações existentes na matriz óssea,

formando uma rede interna capaz de “sentir” toda a estrutura óssea como uma única entidade46,47. É

já hoje, por demais evidente o papel dos osteócitos no desencadear dos processos de remodelação,

constituindo os principais mecanossensores e transdutores do tecido ósseo46,47,105,107,113,119.

O mecanismo pelo qual as forças mecânicas conseguem regular os processos celulares é

designado de uma forma global por mecanotransdução44,120-123.

A mecanotransdução pode ser entendida como a conversão de um sinal de natureza mecânica

(força) numa resposta celular de natureza bioquímica44,46,47. Por outras palavras, pode considerar-se o

mecanismo de transdução como um processo pelo qual certas células (células recetoras) detetam ou

“sentem” certos sinais mecânicos (forças ou tensões aplicadas) gerando uma resposta celular (de

natureza bioquímica) dirigida às células efetoras. Estas últimas células vão, por sua vez, ativar ou

modular os processos de remodelação. Os osteócitos constituem nestas circunstâncias as células

recetoras ou mecanossensoras (consideradas por isso como as “guardiães” do tecido ósseo), sendo

as células de revestimento ósseo, os osteoblastos e os osteoclastos considerados como células

efetoras.

A deformação da matriz óssea (que ocorre pela aplicação de uma determinada força) pode

causar diferenças de pressão no fluido que preenche os canalículos, alterando o seu fluxo, isto é, a


15

sua velocidade. É nesta interação, entre o movimento do fluido e os osteócitos, que reside a chave

da mecanotransdução. As alterações do meio extracelular (variações de pressão e velocidade dos

fluidos) são, pois, captadas pelos osteócitos que as convertem em sinais e mensagens moleculares

que serão transmitidas às células efetoras quer através dos prolongamentos celulares e gap junctions

(ativando uma rede intracelular de comunicação), quer por difusão no fluido extracelular46,47,120-123. É

cada vez mais consensual que estes mecanismos não atuam de forma isolada, mas sim em sinergia,

observando-se diversas vias alternativas em simultâneo.

Importa acentuar ainda que as forças mecânicas aplicadas na matriz óssea são fundamentais

para assegurar a vitalidade das células ósseas117-119. Com efeito, a falta de estímulos mecânicos conduz

sempre e a curto prazo à apoptose dos osteócitos e à perda de massa óssea. Esta interação, entre o

movimento do fluido e os osteócitos, constitui um estímulo poderoso e imprescindível à manutenção

da sua atividade celular.

A presença de áreas de matriz danificada ou comprometida (pela presença de microfissuras) ao

provocar uma restrição na acessibilidade dos osteócitos aos nutrientes e oxigénio conduz à sua

apoptose117-119. A apoptose dos osteócitos desencadeia quase sempre processos de remodelação

óssea, verificando-se geralmente uma forte associação, no tempo e no espaço, entre microfissuras,

apoptose dos osteócitos e remodelação óssea119.

Por outro lado, foi também recentemente demonstrado que os osteócitos através dos seus

prolongamentos citoplasmáticos e do fluido tecidular, situado no interior do sistema lacuno-

canalicular, podem estabelecer contacto direto com os vasos sanguíneos da medula óssea (no tecido

ósseo esponjoso) ou com os capilares presentes no interior dos canais de Havers (no tecido ósseo

compacto)21, 46,47 ,constituindo um sistema de sinalização capaz de fornecer a localização e dimensão

das áreas a remodelar, estimulando em paralelo os processos de angiogénese e a quimiotaxia das

células osteoclásticas28. As inúmeras conexões dos osteócitos entre si, com com os osteoblastos e

osteoclastos, bem como as suas ligações vasculares, permitem um fácil acesso e uma rápida resposta

a estímulos mecânicos e a fatores sistémicos e hormonais (como aos estrogénios, a PTH e vitamina

D3)46,47.

A esclerostina parece ser considerada um mediador major na integração dos estímulos

mecânicos, hormonais e locais, detetados pelos osteócitos, controlando, desta forma, todo o

aparelho de remodelação. As alterações nos níveis de esclerostina regulam a expressão de outras

proteínas específicas nomeadamente o RANKL e a OPG, atrás referidas, bem como a expressão de

genes (PHEX, DMP1, MEPE, FGF-23) relacionados com os processos de mineralização46.

Pode afirmar-se portanto que, na fase de ativação, os osteócitos e as células de revestimento

presentes nas áreas a remodelar são determinantes para o processo de recrutamento das células

pré-osteoclásticas, para o reforço dos mecanismos de angiogénese e para a formação do

compartimento de remodelação óssea27,104-107,116.


16

Com efeito, na fase de ativação do ciclo de remodelação verifica-se uma retração e um

destacamento das células de revestimento, afastando-se da respetiva matriz óssea, dando início ao

aparecimento de uma canopy e ao desenvolvimento de um espaço fechado correspondente ao

BRC24,38. Importa salientar, ainda nesta fase, o desenvolvimento de uma rede de capilares sanguíneos

e a sua aproximação às células da canopy, formando no seu conjunto uma plataforma de comunicação

entre estruturas vasculares e compartimentos de remodelação39,40,108. A intervenção do componente

vascular, constituindo uma estrutura sempre presente, é determinante ao longo de todo o processo

de remodelação41-44, 108.

Na fase de reabsorção (R) os osteoclastos cavam, no tecido ósseo esponjoso, lacunas de

contornos muito irregulares denominadas lacunas de Howship e no tecido ósseo compacto

cavidades cilíndricas designadas por cones de reabsorção53,54. A dimensão das áreas reabsorvidas é

diretamente proporcional às áreas danificadas ou em sofrimento.

No final desta etapa observa-se uma inversão ou reversão nesta sequência, verificando-se

um conjunto de condições responsáveis pela chamada de células osteoprogenitoras e sua

diferenciação, dando início ao processo de reparação óssea54. Esta estimulação da atividade

osteoblástica, como resposta ao processo de reabsorção osteoclástica, é habitualmente conhecido

por coupling45,55.

Um aspeto curioso, e que assinala o início da fase de reversão (Rv), prende-se com o facto de

serem, mais uma vez, as células de revestimento da canopy as células responsáveis pela “limpeza” das

lacunas de Howship, no que respeita às moléculas de colagénio não digeridas e outros detritos

decorrentes da atividade osteoclástica48. Este processo constitui um pré-requisito obrigatório para o

desenvolvimento da fase de reversão, pois só em lacunas de reabsorção, bem preparadas e

limpas48,56, é possível a formação de uma linha cimentante e a deposição de uma camada de colagénio

fibrilar (colagénio III) e de osteocalcina, permitindo, deste modo, criar um ambiente osteogénico

capaz de levar a cabo um processo de maturação osteoblástica.

Ainda que o mecanismo de diferenciação e ativação das células da linha osteoclástica esteja,

como já foi referido, muito controlado pelas células da linha osteoblástica (pré-osteoblastos,

osteoblastos, osteócitos e células de revestimento), através do eixo de regulação

RANKL/RANK/OPG52, esta via não é de sentido único, uma vez que também os osteoclastos

condicionam e modulam muitas das atividades osteoblásticas. Nesta fase estabelece-se também uma

complexa comunicação bidireccional que vai inibir a atividade dos osteoclastos e promover a dos

osteoblastos.

Parecem verificar-se pelo menos quatro classes de sistemas de sinalização25 derivados dos

osteoclastos, ou da sua atividade, responsáveis pelo início e desenvolvimento da etapa de formação

óssea mas que começam a manifestar-se na fase de reversão: a) fatores de crescimento e citocina


17

com efeito osteogénico contidos na matriz óssea e libertados durante o processo de reabsorção

osteoclástica; b) fatores de crescimento sintetizados e secretados pelos próprios osteoclastos,

exercendo um efeito parácrino nos osteoblastos; c) um contacto direto célula-célula entre

osteoclastos e osteoblastos; d) alterações deixadas pelos osteoclastos na nanotopografia da

superfície óssea reabsorvida com reconhecida ação osteoindutora25.

Com efeito, e de acordo com a alínea a), a matriz óssea representa um verdadeiro armazém

de citocinas e fatores de crescimento em fase latente (produzidos pelos osteoblastos) que são

libertados e ativados na sequência do processo de degradação osteoclástica com o principal objetivo

de estimular o recrutamento57-59, migração58,60-62 e diferenciação61,63,64 das células osteoprogenitoras.

Neste âmbito, podemos referir, entre muitos, o fator de transformação β (Transforming growth factor

β - TGFβ), os fatores de crescimento insulino-aparentados (Insulin growth factor - IGF I e II), o fator de

crescimento fibroblástico (Fibroblast growth factor - FGF), o fator de crescimento derivado das

plaquetas (Platelet derived growth factor - PDGF), fatores de crescimento das células endoteliais

(Vascular endothelial growth factor - VEGFs), as proteínas morfogenéticas ósseas (Bone morphogenic

proteins - BMP) e as metaloproteinases da matriz (Matrix metalloproteinases - MMP)65-70.

Entre os fatores de crescimento sintetizados diretamente pelos osteoclastos, e referidos na

alínea b), estão mais uma vez as TGF-βs e as PDGFs. Também o fator osteoclástico esfingosina 1-

fosfato (Sphingosine 1 phosphate - S1P) parece desempenhar um papel importante na fase de

reversão71. A síntese de S1P pelos osteoclastos estimula o recrutamento, migração e sobrevivência

das células da linha osteoblástica.

Por outro lado, e em concordância com a alínea c) está já confirmada uma sinalização direta

bidirecional entre osteoblastos e osteoclastos através de proteínas transmembranares presentes

nestas células, regulando simultaneamente a atividade de cada uma delas. Neste âmbito, encontramos

o sistema Ephrin-Eph como o principal mediador da interação entre osteoclastos e osteoblastos72, 73.

A interação entre as ephrin B2 (ligandos expressos nas membranas dos osteoclastos) e os seus

recetores EphB4 (presentes nos osteoblastos) requer um contacto físico direto célula-célula72, que

promove a diferenciação osteoblástica e, ao mesmo tempo, inibe a atividade osteoclástica. Pode

assim afirmar-se que os osteoclastos serão responsáveis, através da secreção de clastocinas, como a

S1P, pelo recrutamento das células osteoprogenitoras para os locais de reabsorção, estimulando ao

mesmo tempo a sua diferenciação através do sistema de sinalização Ehprina B2/Eph B472,73.

Compreende-se, pois, que a simples presença de osteoclastos, independentemente da sua

capacidade de reabsorção, constitua um fator essencial nos mecanismos de osteogénese, produzindo

fatores ativadores da função osteoblástica. A nova geração de agentes antirreabsorção (muito

utilizada nas situações de osteoporose) começa a ter em conta este facto, tentando não atingir a

sobrevivência dos osteoclastos, ainda que bloqueiem a sua atividade reabsortiva74.


18

Por fim, as alterações na nanotopografia da superfície óssea, efetuadas pelos osteoclastos, e

referidas na alínea d), parecem ter uma importância determinante nos processos de adesão e

diferenciação das células da linha osteoblástica24,48. A este respeito, é impossível deixar de referir que

as concavidades escavadas pelos osteoclastos (lacunas de Howship) constituem locais estratégicos e

privilegiados para a formação da matriz osteóide e sua posterior mineralização. A geometria

conformacional, dimensão, composição, microarquitectura e ainda a nanoestrutura de superfície

destas cavidades criam um microambiente propício ao aparecimento de um fenótipo

osteoblástico75,98. Estas lacunas parecem favorecer, ou mesmo contribuir, para uma sequestração de

iões (nomeadamente cálcio) e de fatores de crescimento e outras proteínas com efeitos

osteoindutores, estimulando ao mesmo tempo os processos de angiogénese21,98.Todos estes fatores

terão uma influência determinante na coordenação e transição equilibrada entre a fase de reabsorção

e formação óssea.

Importa salientar, contudo, que as células que caracterizam a fase de reversão e que vão

beneficiar da ação osteoindutora dos fatores atrás mencionados, resultantes da atividade das células

osteoclásticas, não são osteoblastos maduros mas sim percursores de osteoblastos que colonizam as

superfícies ósseas após o desaparecimento dos osteoclastos76. As células da canopy, ainda que

derivadas das células de revestimento ósseo, parecem encontrar-se, no entanto, num estádio muito

precoce de desenvolvimento, podendo dar origem a grande parte das células que nesta fase vão

diferenciar-se em osteoblastos82,100. Para além disto, é também de considerar a forte presença de

células osteoprogenitoras que chegam, nesta altura, ao compartimento de remodelação provenientes

de outras origens, nomeadamente da corrente sanguínea e da parede vascular dos capilares

sanguíneos adjacentes77-81.

A fase de reversão parece constituir uma das etapas mais delicadas do ciclo de remodelação,

reunindo um conjunto de condições essenciais para a proliferação e diferenciação osteoblástica76.

Qualquer perturbação observada nesta etapa (nomeadamente a integridade da canopy) poderá

provocar uma paragem irreversível no processo de remodelação24-27,76,82,83,99.

Por último, o preenchimento e reparação da cavidade de reabsorção é naturalmente

decorrente da atividade secretora de osteoblastos maduros com origem nas células observadas

durante a fase de reversão e que, entretanto, beneficiaram de um processo de proliferação,

maturação e ativação27.

Como nota final gostaríamos de referir mais uma vez que, para além dos sistemas de

sinalização atrás descritos, a transição entre a fase de reabsorção e a fase de reversão/formação é

ainda modulada pelo aparecimento de novos estímulos mecânicos no interior do BRC (sendo

considerado um fenómeno “strain regulated”) e pelo aumento dos níveis extracelulares de fosfatos

inorgânicos libertados quer no interior do BRC quer para a circulação sanguínea46.


19

Com efeito, estudos recentes27,46,47,117,118 têm vindo a chamar atenção para as alterações nas

forças de deformação verificadas no interior da lacuna de reabsorção que funcionariam como

importantes estímulos responsáveis pelo início da fase de reversão/formação. Assim, estes

investigadores defendem a ideia de que a transição da fase de reabsorção para a fase de reversão

seria também uma resposta adaptativa a alterações de estímulos mecânicos, ou seja, um fenómeno

regulado pelas forças de deformação levado a cabo pelos osteócitos, via esclerostina48. Assim, mais

uma vez, os osteócitos através do controlo dos níveis de esclerostina e sua repercussão no sistema

RANK/RANKL/OPG vão agora pôr termo à fase de reabsorção e desencadear o início de uma fase

osteogénica27,46,47. Esta noção faz todo o sentido tendo em conta o que referimos sobre os

fenómenos de mecanotransdução.

Em paralelo, estes trabalhos27,46,47,117,118 referem também que durante a fase de reabsorção os

cristais de hidroxiapatite são dissolvidos em iões Ca2+ e Pi (na forma de H2PO4- e HPO42-), causando

uma elevação transitória dos níveis de fosfatos quer no interior do BRC, quer na corrente sanguínea,

estando também esta situação associada ao início da fase de reversão, estimulando o

desenvolvimento dos processos de formação e mineralização da matriz óssea pela modulação da

expressão génica das células pré-osteoblásticas e osteoblásticas presentes no BRC46.

Neste contexto, o osteócito e a rede lacuno-canalicular funcionam como uma “unidade

externa” desempenhando, no entanto, e mais uma vez, um papel central no controlo da transição

adequada entre as diferentes fases do ciclo de remodelação óssea.

A fase de formação (F) consiste, pois, na síntese de matriz osteóide e na sua posterior

mineralização, tendo como resultado final a reconstrução da lacuna de Howship com novo tecido

ósseo ou de um cone de reabsorção, dando origem ao aparecimento de um novo sistema de Havers.

O término da sequência de remodelação parece ser também, tal como o seu início, da

responsabilidade dos osteócitos25,46,47,119,145. Foi já demonstrado que os osteócitos presentes na

matriz óssea recém-sintetizada e mineralizada estão também envolvidos no processo de regulação

desta fase, através da síntese de diversas moléculas como a esclerostina que determina a evolução

final dos osteoblastos secretores para células de revestimento ósseo, pondo fim ao ciclo de

remodelação46,48,65.


20

Figura 2 – Representação esquemática das relações espaciais e funcionais entre capilares sanguíneos e compartimentos de remodelação

óssea observados no tecido ósseo esponjoso (topo) e no tecido ósseo compacto (em baixo). Esta proximidade permite um fácil acesso das

células da linha osteoclástica (provenientes da corrente sanguínea) para o interior do compartimento, bem como das células

osteoprogenitoras circulantes ou resultantes da diferenciação dos pericitos. (Adaptado de Lafage-Proust e col. 2015) 25.

Em síntese, pode afirmar-se que no processo de remodelação óssea intervêm duas atividades

opostas mas complementares, a reabsorção, a cargo das células da linha osteoclástica, e a formação

do tecido ósseo, a cargo das células da linha osteoblástica, funcionando em estreita coordenação e

integração. A reabsorção e a formação óssea são fenómenos que estão intimamente acoplados, visto

que o início da primeira estimula a atividade reparadora da segunda, de modo a que a reabsorção de

uma certa quantidade de tecido ósseo seja, em princípio, substituído pela mesma quantidade de novo

osso,25-27,41,50,55,76. O controlo da rácio RANKL/OPG verificado no interior do BRC parece ser

comandado pela atividade dos osteócitos, via esclerostina. Estas células determinam o “timing”, a

dimensão, sequência, velocidade e ritmo que marcam a coordenação e integração das diferentes fases

do ciclo de remodelação46.

O tecido ósseo constitui, pois, um notável material de construção, de natureza biológica, com

a singular capacidade de edificar estruturas muito resistentes que se remodelam e reparam a si

próprias.

***


21

Ainda que a associação e alinhamento sequencial entre reabsorção (osteoclástica) e formação

(osteoblástica) raramente esteja afetada, o balanço final em termos de massa óssea pode variar

consideravelmente. No processo de remodelação óssea particularmente a fase de reabsorção pode

desenvolver-se, tendo como ponto de partida e base de sustentação o sistema imunológico7,11,12-18,35.

Muitos são os trabalhos que têm vindo a demonstrar que algumas citocinas pró-inflamatórias

(TNF- α e β; IL-1, IL-6, IL-11,IL-17)84-87 e os LPS (lipopolissacarídeos componentes da superfície da

parede de algumas bactérias Gram negativas) podem estar envolvidos na diferenciação terminal dos

osteoclastos, de uma forma independente dos osteoblastos (ou seja, sem a necessidade do contacto

direto com estas células). Tanto a IL-1, IL-6 como o TNF-α podem estimular por si só a

osteoclastogénese, sem recurso ao eixo RANKL/RANK18,88,89,90.

A maior parte das doenças metabólicas e inflamatórias que atingem o tecido ósseo

manifestam-se geralmente por perturbações na dinâmica da remodelação resultando, quase

invariavelmente, num decréscimo da massa óssea associada a processos de reabsorção osteoclástica.

Em casos patológicos como a artrite reumatóide observa-se uma forte participação de linfócitos T e

B4 e de fibroblastos sinoviais no processo de formação dos osteoclastos, traduzindo uma

contribuição determinante destas células (através da produção de RANKL) para a perda da massa

óssea e consequente deformação articular. Assim, a artrite reumatóide pode considerar-se

atualmente como uma RANKL disease. Neste contexto, a osteoporose é muitas vezes encarada como

uma “inflamm-aging”91.

Uma situação bastante semelhante parece verificar-se também com a doença periodontal140.

Os fibroblastos do ligamento periodontal podem expressar RANKL em resposta à estimulação por

bactérias periodontogénicas provocando severos processos de reabsorção no osso alveolar, bem

como lesões no cemento e na dentina88,92-94. A perda da radiopacidade típica da lâmina dura é muitas

vezes interpretada como uma imagem de marca da doença periodontal crónica, traduzindo processos

de reabsorção óssea sempre associados a uma resposta inflamatória, relacionados com uma alteração

da rácio RANKL/OPG140. É neste contexto que se insere a maior parte dos processos de reabsorção

do cemento e da dentina.


22


23

II. Constituição Histológica do Compartimento de

Remodelação Óssea

Alguns aspetos


24


25

Objetivo

Tendo em conta a participação e colaboração em diversos trabalhos experimentais

desenvolvidos na Área de Medicina Dentária da Faculdade de Medicina da Universidade de

Coimbra94,95,96 com particular incidência no tecido ósseo e dadas as limitações económicas

prementes para levar a cabo um novo estudo experimental, decidimos observar, com objetivos

completamente distintos, algumas das lâminas histológicas que estiveram na base dos trabalhos acima

referenciados e cujos resultados de índole morfológica estiveram à nossa responsabilidade. De facto,

a existência de compartimentos de remodelação óssea já tinha sido por nós detetada, aquando da

observação cuidadosa destes cortes histológicos de tecido ósseo, sem contudo ter sido descrita pois

encontrava-se fora do âmbito dos estudos experimentais em curso.

Assim, aproveitando as lâminas histológicas que constituíram os grupos controlo dos estudos

experimentais in vivo95,96 decidimos levar a cabo uma análise qualitativa em microscopia de luz no

âmbito da histologia básica, para deteção e identificação de compartimentos de remodelação óssea

(BRC) nas áreas de tecido ósseo alveolar mandibular, incidindo fundamentalmente na observação e

registo das suas características histomorfológicas. Decidimos ainda estender as observações para as

áreas de dentina e de cemento, uma vez que são também tecidos mineralizados com capacidade de

remodelação.

1. Materiais e Métodos

2.1. Animal de experimentação

Foram utilizados seis cães (Canis familiaris) da raça Beagle de origem pura, nascidos e criados

para fins de investigação, certificados pelo Colegio Official de Veterinarios da Cataluñya – Barcelona, e

adquiridos à Isoquimen, S.L. (Barcelona, Espanha), que constituíram os grupos controlo dos trabalhos

experimentais intitulados “Apexificação e revascularização em dentes permanentes imaturos –

estudo experimental in vivo”95 realizado pelo Prof. Paulo Palma e “Distração osteogénica dento-

ancorada – estudo experimental”96 realizada pelo Prof. Francisco do Vale no âmbito dos seus

respetivos trabalhos de doutoramentos.

Os animais tinham cerca de 14 meses de idade e pesos compreendidos entre os 15 e 18

quilogramas, apresentando todos uma identificação através de sistema de chips subcutâneos

localizados na zona do dorso.


26

2.2. Manutenção e bem-estar animal

A receção, observação, manutenção, manipulação, cuidados e procedimentos cirúrgicos foram

efetuados no Hospital Veterinário da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, em Vila Real,

sob supervisão do Investigador Coordenador responsável pelo Bem-estar Animal.

O estado de saúde geral dos animais, à chegada à unidade hospitalar, foi avaliado por

veterinários com experiência prévia e qualificação na área de experimentação animal. Excluídas

quaisquer patologias agudas ou crónicas, os animais foram mantidos num período de quarentena,

com observação diária, durante um intervalo de tempo nunca inferior a duas semanas. Todos os

animais permaneceram numa fase de ambientação às novas instalações, aos cuidadores e ao sistema

de controlo clínico durante aproximadamente 12 semanas, antes de qualquer intervenção.

2.3. Colheita do material

Após a eutanásia, as mandíbulas foram retirados en bloc, após dissecção meticulosa dos tecidos

moles em planos e excisados com uma serra mecanizada refrigerada. De seguida foram separadas as

hemimandíbulas de cada animal, após osteotomia da sutura sinfisária e imersas em formol neutro

tamponado e posteriormente transportadas para o laboratório.

Todo o material utilizado nos estudos histológicos foi processado no Laboratório de Tecidos

Duros da Clínica Universitária de Medicina Dentária, da Faculdade de Medicina da Universidade de

Coimbra.

2.4. Processamento histológico de material descalcificado

Depois de colocados em cassetes “histológicas” individuais, devidamente identificadas, as peças

foram novamente colocadas em formalina tamponada a 10 % a +4º C durante uma semana. Após o

processo de fixação procedeu-se à descalcificação das amostras.

A descalcificação foi efetuada por imersão das amostras numa solução de Morse (ácido

fórmico a 50 % + citrato de sódio a 20 % em partes iguais), sob agitação permanente, numa unidade

de agitação (Jkika Labortechnik HS 501), durante um período mínimo de oito semanas.

Após a descalcificação das amostras, procedeu-se à sua desidratação por sucessivas passagens

em soluções crescentes de etanol, 50 %, 70 %, 90 % e 100 %, sob agitação permanente.

Posteriormente procedeu-se à fase de diafanização em xilol (Xileno PA Panreac®), impregnação e

inclusão em parafina (Paraplast® Regular), utilizando cassetes apropriadas (Kartell® Spa). Depois do

processo de inclusão, as amostras foram cortadas num micrótomo (Leica RM 2155), num plano

proximal, em cortes sequenciais de 7 μm de espessura.

Os cortes foram em seguida secos em estufa a 37º C, durante cerca de 16h, sendo

posteriormente selecionadas e coradas com Hematoxilina e Eosina (H.E.) ou com Tricrómio Masson

(T.M.). Durante todo o processamento foi assegurada uma rigorosa identificação das amostras.


27

2.5. Processamento histológico de material não descalcificado

As amostras de material não descalcificado foram preparadas segundo o protocolo

desenvolvido por Karl Donath do Instituto de Patologia da Universidade de Hamburgo, na

Alemanha97.

As amostras individuais foram fixadas através de imersão numa solução de formaldeído a 10 %

em tampão fosfato (pH 7,4) imediatamente após a colheita e durante um período de 48 horas.

Posteriormente, e após lavagem com água corrente durante 30 minutos, iniciou-se o processo de

desidratação através do protocolo preconizado por Karl Donath. Numa primeira fase realizaram-se

passagens numa série crescente de concentrações de etanol (60 %, 80 %, 96 % e duas vezes a 100 %),

numa unidade de agitação e infiltração (Exakt® 510), com agitação contínua e com duração de 30 dias

para cada passo.

Posteriormente, procedeu-se à etapa de infiltração, utilizando-se soluções com graduações

crescentes de resina de metilmetacrilato (Technovit® 7200 VLC, Kulzer) em etanol (resina/álcool:

30/70 %, 50/50 %, 70/30 %, e duas vezes a 100 % de resina).

Finamente, incluíram-se as amostras na mesma resina de metilmetacrilato (Technovit® 7200

VLC, Kulzer) e foi realizada a fotopolimerização na unidade de polimerização (Exakt® 520), com

sistema de arrefecimento e em moldes plásticos.

As amostras incluídas nos blocos de resina sofreram de seguida um corte, na respetiva unidade

do sistema Exakt® (Exakt® 310 CP), consoante a orientação pretendida para subsequente preparação

da primeira lâmina acrílica.

De cada amostra, foram obtidos três cortes sagitais que envolviam o espaço compreendido

entre o terceiro e o quarto pré-molar, com a seguinte correspondência:

I. Corte sagital vestibular;

II. Corte sagital médio;

III. Corte sagital lingual.

A espessura final de 50 µm foi obtida através de polimento calibrado com discos de diamante

de granulometria decrescente (800, 1000, 1200, 2500 e 4000; Hermes®, Alemanha). Todas as

medições de controlo foram realizadas com micrómetro digital (Mitutoyo® 2093, Digimatic

Micrometer, Japão).

Concluiu-se a fase laboratorial efetuando uma técnica de coloração com azul de Toluidina

(A.T.) dos tecidos duros representados na lâmina final. Esta técnica, que utiliza um corante básico e

cora os componentes ácidos em diversas gradações de azul, permite estabelecer uma boa distinção

entre tecido osteóide e tecido ósseo mineralizado.


28

A observação das lâminas foi efetuadas com recurso a um microscópio de luz de campo claro

(Nikon® Eclipse 600, Tóquio, Japão) e estereomicroscópio (Nikon® SMZ 1500, Tóquio, Japão). Estes

dispositivos têm capacidade para acoplar equipamento fotográfico convencional (Nikon® FDX 35,

com sensor multiponto Nikon® U-III, Tóquio, Japão), bem como câmaras fotográficas digitais

(Optronics® DEI 750D CE, Goleta, Califórnia, Estados Unidos da América e Nikon® Digital Camera

DXM-1200 C, Tóquio, Japão) ligadas a computadores PC (Intel®Pentium™ III e Intel®Core™ 2 Duo

Core™) com software para fotografia e análise de imagem (Nikon® ACT-1C, Tóquio, Japão).


29

2. Resultados

__________________________________________________________


30


31

O trabalho aqui apresentado pretende contribuir para um melhor conhecimento da

constituição histológica de compartimentos de remodelação detetados no tecido ósseo alveolar e

ainda no cemento e dentina radicular, tecidos provenientes de mandíbulas de animais mantidos em

condições fisiológicas, tendo por base uma análise qualitativa realizada em microscopia de luz.

As imagens histológicas apresentadas compreendem cortes de material incluído em parafina,

corados com H.E. ou com o método T.M.. Apresentamos também cortes de material incluído em

metilmetacrilato, corados com A.T..

3.1 Deteção de compartimentos de remodelação óssea presentes no tecido ósseo

alveolar

O osso alveolar é constituído por áreas de tecido ósseo compacto (figuras 3 e 4) e por áreas

de tecido ósseo esponjoso (figuras 5 e 6), sendo considerado o local onde se verifica, em condições

fisiológicas, a mais alta taxa de remodelação de todo o esqueleto. Esta notável dinâmica de

remodelação está traduzida pela existência de inúmeras linhas de reversão (figuras 5 e 6). Estas linhas

de reversão são marcas indeléveis que definem uma nítida fronteira entre áreas de tecido ósseo

formadas por diferentes gerações de osteoblastos. De igual modo, e refletindo a sua intensa

capacidade de remodelação, foram também detetadas, no tecido ósseo que constitui o alvéolo

dentário, particularmente na apófise alveolar, numerosas áreas de remodelação em fase ativa.

Estas áreas em remodelação apresentam, no entanto, características bastante distintas,

considerando as regiões onde se encontram. De facto, no tecido ósseo compacto observam-se

verdadeiros túneis/cones de reabsorção (figura 7), alguns apresentando tamanho e profundidade

consideráveis. Nas trabéculas de tecido ósseo esponjoso os locais em remodelação ativa (figura 8 e

9) apresentam-se como escavações superficiais (figura 8), muitas vezes bastante discretas, observadas

junto à medula óssea ou já em fase de resolução (figura 9) apresentando uma razoável camada de

osteóide.

A identificação em microscopia de luz das regiões em remodelação baseou-se

maioritariamente na presença de nítidas lacunas de reabsorção com ou sem osteoclastos visíveis, ou

na observação de uma camada de células osteoblásticas quase sempre acompanhadas de osteóide.

Tendo em conta que os osteoclastos apresentam uma semivida bastante mais curta do que os

osteoblastos e a enorme diferença de duração das fases de reabsorção e de formação que compõem

o ciclo de remodelação óssea, foi possível encontrar a presença de osteoblastos num maior número

de vezes. Foram ainda consideradas como áreas em remodelação ativa, zonas onde as lacunas de

reabsorção estavam ocupadas por populações celulares que não apresentavam características típicas

de células osteoclásticas ou osteoblásticas, constituindo uma etapa intermédia e de ligação entre a

fase de reabsorção e a de formação, normalmente designada por fase de reversão.


32

Uma observação mais atenta das áreas em remodelação, com recurso a maiores ampliações,

permite-nos distinguir a existência de estruturas que identificamos como compartimentos de

reabsorção óssea.

***

O compartimento de remodelação óssea apresenta-se no tecido ósseo esponjoso como um

espaço fechado (figuras 10-24) onde se encontram as células constituintes de uma BMU (nem sempre

fáceis de identificar em cortes de parafina), sendo, no entanto, de salientar a presença frequente de

osteoclastos e/ou osteoblastos localizados junto à matriz óssea. Este espaço encontra-se revestido

exteriormente por uma fina camada em forma de cúpula (canopy) formada por células extremamente

achatadas (figuras 13 e 14), muito semelhantes às células de revestimento ósseo, separando este

compartimento da medula óssea adjacente (figura 15). É também possível observar a continuidade

desta canopy com as restantes células de revestimento presentes na superfície da mesma trabécula

(figuras 15 e 16), mas em estado de repouso e que, por este motivo, permanecem em íntima ligação

com a matriz óssea.

De registar também que no caso do osso alveolar, observa-se entre as trabéculas de tecido

ósseo esponjoso a existência de medula óssea amarela, com nítido predomínio de células adiposas,

não sendo visíveis áreas de hematopoiese.

Será pertinente referir a existência de uma abundante rede capilar (figuras 17-24) localizada em

estreita associação de proximidade à canopy que reveste os compartimentos de remodelação, sendo

mesmo possível verificar a presença de inúmeros pontos de contacto (figuras 18,19) entre os

capilares e as células de revestimento que a compõem.

Esta rede capilar, particularmente desenvolvida junto às superfícies ósseas em remodelação,

apresenta quase sempre um trajeto paralelo à canopy (figuras 17,19,20), acompanhando-a em quase

toda a sua extensão. Por sua vez, nas superfícies ósseas em repouso, a densidade de capilares

presente é incomparavelmente menor.

***

No tecido ósseo compacto que forma o alvéolo dentário, o compartimento de remodelação

óssea (figuras 21-24) apresenta-se também como um espaço que recobre as zonas de matriz

mineralizada (que formam as paredes de um cone de reabsorção) e que estão a ser alvo de um

processo de remodelação. Também aqui é possível observar uma canopy, formando o teto do

compartimento em questão, constituída por uma camada de células achatadas, por vezes difíceis de

distinguir das células endoteliais dos vasos sanguíneos que as acompanham. De facto a proximidade

de vasos sanguíneos é sempre uma constante, mostrando em geral um percurso paralelo à canopy. A

população celular que ocupa o compartimento de remodelação vai variando consoante a fase do

ciclo em que se encontra.


33

Figura 3- Aspeto em microscopia de luz de um corte histológico de tecido ósseo alveolar mostrando uma região de tecido

ósseo compacto onde são visíveis inúmeros sistemas de Havers e respetivos canais de Havers, bem como alguns sistemas

intersticiais e parte do sistema circunferencial externo. A.T., 20x no original.

Figura 4- Imagem semelhante à da figura anterior pondo em evidência a presença de inúmeros sistemas de Havers,

caraterísticos do tecido ósseo compacto, que forma parte do alvéolo dentário. A.T., 40x no original.


34

Figura 5 – Aspeto histológico de uma região de tecido ósseo esponjoso constituinte do osso alveolar, sendo visíveis

muitos sinais de anteriores processos de remodelação óssea, bem como a presença de zonas de tecido osteóide. A.T., 40x

no original.

Figura 6 – Presença de inúmeras linhas de reversão traduzindo uma prévia e intensa remodelação óssea, visível ao nível de

uma trabécula. A.T., 100x no original.


35

Figura 7 A, B e C – Imagens histológicas de vários cones de reabsorção, observados no tecido ósseo compacto do osso

alveolar, sendo possível identificar a presença de inúmeros vasos sanguíneos (alguns de grandes dimensões) e ainda áreas

em fase de reabsorção e áreas em fase de formação. A.T., 100x, 400x e 100x no original, respetivamente.

A

B

C


36

Figura 8 – Aspeto histológico de uma região em fase de reabsorção presente numa trabécula óssea constituinte do osso

alveolar. A.T, 20x no original.

Figura 9 - Presença de grande quantidade de osteóide e de células osteoblásticas numa tentativa de reunião de duas

trabéculas ósseas. H.E, 20x no original.


37

Figura 10 – Aspeto em microscopia de luz de um compartimento de remodelação óssea presente no tecido esponjoso do

osso alveolar. É visível a existência de um espaço fechado revestido externamente por uma camada de células achatadas em

forma de cúpula (canopy). Observa-se, ainda, a existência de numerosos osteoblastos localizados junto à matriz óssea. H.E,

400x no original.

Figura 11- Imagem histológica de um compartimento de remodelação óssea, localizado na superfície de uma trabécula

óssea, delimitado exteriormente por uma camada de células achatadas que o separam da medula óssea. É também visível a

presença de osteoblastos junto à matriz óssea. H.E., 1000x no original.

Figura 12 – Aspeto histológico de um compartimento de remodelação óssea, semelhante às figuras anteriores, pondo em

evidência para além da canopy a presença de osteoblastos ativos e de uma camada subjacente de osteóide, apresentando

uma diferente afinidade tintorial em relação à matriz óssea mineralizada. T.M., 400x no original.


38

Figura 13 – Maior ampliação de uma região representada na figura 11, mostrando as células extremamente achatadas que

constituem a canopy de um compartimento de remodelação óssea. É também possível observar a presença de osteoblastos.

H.E., 400X no original.

Figura 14 - Aspeto de uma célula de revestimento, extremamente achatada, constituinte da canopy de um compartimento

de remodelação óssea. São também visíveis osteoblastos junto à superfície em remodelação. H.E., 400X no original.


39

Figura 15 - Aspeto em microscopia de luz de um compartimento de remodelação óssea, localizado na superfície de uma

trabécula do osso alveolar, formando um espaço fechado delimitado externamente por uma camada de células achatadas,

canopy. É ainda visível a proximidade de vasos sanguíneos e a existência de medula óssea amarela. H.E., 100x no original.

Figura 16 - Maior ampliação de uma região representada na figura anterior, mostrando a continuidade das células da

canopy com as restantes células de revestimento, presentes na superfície da mesma trabécula. H.E.,1000x no original.


40

Figura 17 - Imagem de uma rede capilar localizada junto à canopy de um compartimento de remodelação óssea,

acompanhando-a em quase toda a sua extensão. H.E., 200x no original.

Figura 18 - Evidência de uma estreita proximidade entre capilares e células de revestimento da canopy. H.E., 400x no

original.


41

Figura 19 - Corte histológico mostrando, mais uma vez, um capilar sanguíneo seguindo um percurso paralelo à canopy de

um BRC. De salientar uma grande proximidade entre células endoteliais e células de revestimento (seta). T.M., 400x no

original.

Figura 20 - Imagem semelhante à anterior pondo em evidência o percurso de um vaso sanguíneo e sua íntima relação com

um BRC. T.M., 1000x no original.


42

Figura 21 - Aspeto histológico de um compartimento de remodelação óssea, situado na parede de um cone de

reabsorção, presente no tecido ósseo compacto e a proximidade de um vaso sanguíneo. A.T., 100x no original.

Figura 22 - Imagem de um compartimento de remodelação óssea, em fase de reversão, presente no tecido ósseo

compacto. É possível observar a existência de um vaso sanguíneo particularmente desenvolvido situado em íntima

associação. A.T., 400x no original.


43

Figura 23 - Corte histológico de material incluído em parafina mostrando um compartimento de remodelação óssea,

existente no tecido ósseo compacto do osso alveolar, e a sua relação com um vaso sanguíneo. T.M., 100x no original.

Figura 24 - Aspeto em microscopia de luz de um compartimento de remodelação óssea pondo em evidência uma área de

matriz mineralizada (MM), uma zona de osteóide (Os), uma camada de osteoblastos (OB) e o espaço ocupado pelo

compartimento de remodelação (CRO). É notável o estreito contacto entre as células de revestimento da canopy e as

células endoteliais do vaso sanguíneo adjacente (seta). T.M., 400x no original.

CRO

OB

Os

MM


44


45

3.2 Identificação de diferentes etapas do ciclo de remodelação óssea

Para além da deteção de numerosos compartimentos de remodelação no tecido ósseo que

compõe o alvéolo dentário, foi também possível identificar as diferentes etapas que constituem o

ciclo de remodelação óssea, tendo por base as características morfológicas das células localizadas

junto à matriz óssea em remodelação.

A fase de reversão, ainda que representando uma fase intermédia entre a reabsorção e a

formação óssea, parece assumir uma importância fundamental na integração e coordenação de todo

o processo de remodelação. Esta fase é entendida como uma etapa crucial, porém pouco esclarecida,

uma vez que é nesta fase que ocorre a criação de um microambiente osteogénico favorável para que

a transição entre a fase de reabsorção e a fase de formação, do ciclo de remodelação óssea, ocorra

sem perturbações. Assim, pareceu-nos vantajoso dar-lhe um relevo especial apresentando-a no final

e com maior número de imagens, de forma a permitir um melhor esclarecimento das características

histológicas do compartimento nesta fase.

A figura 25 mostra um BRC numa fase de reabsorção sendo possível reconhecer, na superfície

da matriz óssea que forma a parede de um cone de reabsorção, a existência de várias lacunas de

Howship, bem como a presença de vários osteoclastos. É também percetível a existência de outras

células, incluindo as células de revestimento da canopy e a proximidade de um vaso sanguíneo. Na

figura 26 observa-se, com mais detalhe, uma confluência de vários osteoclastos, formando células

gigantes multinucleadas, localizadas em cavidades por elas escavadas na superfície da matriz óssea. É

ainda possível identificar uma nítida interface, entre o osteoclasto e a matriz mineralizada,

demarcando o local onde irá surgir uma linha cimentante. Verifica-se também a existência de várias

zonas adjacentes à matriz mineralizada, contendo um material de aspeto fibrilar que deverá

corresponder a matriz orgânica (maioritariamente colagénio) ainda não completamente digerida.

***

Nas figuras 27 e 28 é possível observar em várias áreas de tecido ósseo compacto, a

diversidade celular e riqueza vascular existente num compartimento de remodelação em fase de

formação óssea. Com efeito, para além de uma zona de matriz osteóide, é visível uma extensa

camada de células osteoblásticas, uma complexa profusão celular e uma intrincada rede capilar que,

no seu conjunto, formam uma BMU.

Também as figuras 29-32 mostram, na superfície de trabéculas de tecido ósseo esponjoso, a

existência áreas de remodelação em fase de formação óssea caracterizadas pela presença de células

osteoblásticas, adjacentes à matriz osteóide por elas elaborada, recobertas por um compartimento

de remodelação. Neste compartimento, é possível observar as células de revestimento que formam a


46

canopy, para além de outras, de difícil identificação em microscopia de luz. É também possível

verificar a proximidade de capilares sanguíneos, mostrando um trajeto paralelo à canopy. Embora sem

possibilidades de recurso a métodos imunocitoquímicos parece-nos poder afirmar, com base nas suas

características morfológicas e localização, intimamente adjacentes às células endoteliais, a presença

de células (figuras 30-32) que consideramos como pericitos.

***

Ainda que o processo de reabsorção e de formação óssea sejam considerados fenómenos

intimamente ligados, visto que o mecanismo de reabsorção osteoclástica estimula a atividade

reparadora osteoblástica e que os osteoblastos, ou as suas células percursoras sejam recrutados

exatamente para os locais onde previamente se verificou um processo de reabsorção, estes dois

tipos de células raramente estão presentes em simultâneo na mesma superfície óssea. De facto,

verifica-se um intervalo de tempo de várias semanas entre o desaparecimento dos osteoclastos e o

aparecimento de osteoblastos no mesmo local. Este período intermediário, ainda mal esclarecido, é

geralmente classificado como uma fase de reversão e caracterizado pela presença de uma diferente

população celular. Assim, num compartimento de remodelação óssea em fase de reversão, podemos

identificar numerosas células alongadas com núcleo achatado, de certo modo semelhantes às células

de revestimento, porém apresentando-se mais volumosas e em maior número. As figuras 33-36

documentam bem o que acabámos de descrever, pondo em evidência vários compartimentos de

remodelação óssea em fase de reversão, muito bem definidos, contendo no seu interior inúmeras

células alongadas que nem sempre se diferenciam das células de revestimento da canopy. A

proximidade entre estas células e as células endoteliais dos vasos sanguíneos, que se situam em seu

redor, é notória (figuras 35 e 36) sendo problemática, nesta fase, e sem recurso a técnicas

imunocitoquímicas ou ultraestruturais, classificá-las como pericitos, células de revestimento da canopy

ou pré-osteoblastos.

Considerando que nesta etapa o BRC se apresenta como um importante reservatório de

citocinas, fatores de crescimento e maturação, facilmente se compreende a presença de uma grande

densidade de células, de difícil caracterização, por se encontrarem provavelmente em diferentes fases

de diferenciação e maturação osteoblástica. Uma vez que tanto os pericitos como as células da

canopy apresentam um forte potencial osteogénico, parece-nos perfeitamente aceitável a dificuldade

de identificação destas células tendo por base apenas as observações em microscopia de luz. Será

pois imprescindível avançar com outros métodos de caracterização no sentido de esclarecer a

identificação destas células.

No entanto a qualidade das imagens aqui apresentadas, decorrente do seu processamento em

metilmetacrilato, permitem, só por si, um avanço importante para um melhor conhecimento da

constituição histológica dos compartimentos de remodelação óssea em fase de reversão.


47

Figura 25 - Aspeto histológico de um compartimento de remodelação óssea, em fase de reabsorção, observado no tecido

ósseo compacto. É percetível na superfície da matriz óssea, que forma a parede de um cone de reabsorção, a existência de

várias lacunas de Howship, bem como a presença de vários osteoclastos (*). É também possível observar a proximidade de

um vaso sanguíneo. A.T., 400x no original.

Figura 26 - Imagem da confluência de vários osteoclastos, formando células gigantes multinucleadas, localizadas em lacunas

de reabsorção. Verifica-se, ainda, a existência de várias zonas adjacentes à matriz mineralizada contendo um material de

aspeto fibrilar. A.T., 1000x no original.

*

*

*


48

Figura 27 – Imagem histológica de um compartimento de remodelação, em fase de formação óssea, mostrando uma

enorme diversidade celular e uma intrincada rede capilar, sendo particularmente notaria uma extensa camada de células

osteoblásticas junto a uma zona de matriz osteóide. A.T., 20x no original.

Figura 28 – Maior ampliação de uma zona representada na figura anterior. A.T., 1000x no original.


49

Figura 29 – Aspeto da constituição histológica de um compartimento de remodelação, em fase de formação óssea,

localizado na superfície de uma trabécula. Para além de osteoblastos é possível observar algumas células de revestimento

que formam a canopy (*) e a proximidade de um capilar sanguíneo com um trajeto paralelo. A.T., 1000x no original.

Figura 30 – Imagem histológica mostrando mais uma vez a presença de um capilar sanguíneo acompanhando de perto o

compartimento de remodelação. É visível a presença de uma célula intimamente adjacente à parede endotelial que

consideramos como um pericito (*) A.T., 1000x no original.

* *

*


50

Figura 31 – Imagem semelhante à da figura anterior mostrando uma região de matriz osteóide subjacente a uma camada

de osteoblastos. É de notar a diferença de morfologia, coloração e localização entre células endoteliais (seta) e células que

consideramos como pericitos (*). A.T., 1000x no original.

Figura 32 – Imagem semelhante à da figura anterior mostrando a proximidade entre uma célula endotelial (seta) e um

pericito (*) e sua relação com um BRC. A.T., 1000x no original.

*

*


51

Figura 33 – Aspeto de um compartimento de remodelação óssea, em fase de reversão, presente no tecido ósseo

compacto contendo no seu interior uma grande densidade de células alongadas, de difícil caracterização, não sendo possível

identificar células com morfologia de osteoblastos maduros. A.T., 400x no original.

Figura 34 – Imagem semelhante à da figura anterior mostrando um compartimento de remodelação óssea, em fase de

reversão, apresentando no seu interior células com diferente morfologia. É também de notar a existência de um vaso

sanguíneo em íntima aposição ao BRC. A.T., 400x no original.

*


52

Figura 35 - Corte histológico mostrando um compartimento de remodelação óssea que contém uma população celular

difícil de definir, adjacente a uma vaso sanguíneo, sendo notável a proximidade entre células endoteliais (seta preta) e

pericitos ou células constituintes da canopy (seta vermelha). É também possível observar a presença do que consideramos

serem fibras de colagénio em redor dos vasos e no interior do compartimento. A.T., 200x no original.

Figura 36 - Aspeto semelhante ao da figura anterior pondo em evidência a morfologia e localização da população celular

presente num BRC durante uma fase de reversão. A.T., 400x no original.


53

3.3 Deteção de compartimentos de remodelação presentes na dentina e

cemento

De modo semelhante ao que observámos nas regiões de tecido ósseo em remodelação,

também nas zonas de remodelação de cemento e dentina, foi possível identificar uma estrutura em

tudo idêntica ao compartimento de remodelação óssea. Porém, as áreas de reabsorção da dentina,

adjacentes ao cemento, são reparadas apenas com formação de novo cemento, e não de dentina.

Uma vez que a constituição histológica do cemento é muito idêntica à do tecido ósseo, seria

previsível que o seu processo de remodelação apresentasse também características muito

semelhantes. Com efeito, para além de zonas de reabsorção do cemento que podem atingir a

dentina, podemos identificar a existência de compartimentos de remodelação, revestidos por uma

canopy e em estreita proximidade de vasos sanguíneos.

Na figura 37 é possível observar uma zona de reabsorção de cemento que atinge a dentina,

formando um compartimento de remodelação, revestido por uma camada de células achatadas, que

consideramos como uma canopy, muito idêntico ao que se observa no tecido ósseo.

Uma fase correspondente à fase de formação óssea foi também reconhecida no processo de

remodelação do cemento. Com efeito, as figuras 38 e 39 põem em evidência a existência de um

compartimento de remodelação junto a uma área de cemento recoberta por cementóide e por

cementoblastos. A figura 40 permite observar, com mais pormenor, as células da canopy, o espaço

ocupado pelo compartimento e uma camada de cementoblastos (muito semelhantes a osteoblastos),

adjacente a uma zona de cemento não mineralizado. É também possível observar uma faixa de matriz

mineralizada de cemento e uma zona de dentina com túbulos dentinários.

A figura 40 mostra também uma área de reabsorção na dentina e no cemento, ocupada por

um espaço onde são visíveis diferentes tipos de células, bem como um vaso sanguíneo apresentando,

no seu conjunto, um aspeto muito semelhante ao que se verifica nos cones de reabsorção,

característicos do tecido ósseo compacto. Neste corte, é no entanto difícil distinguir as células de

revestimento da canopy das células endoteliais do vaso sanguíneo. A população celular presente no

compartimento de remodelação adjacente à superfície da dentina e do cemento, sem possibilidades

de métodos imunocitoquímicos, é de difícil caracterização. Todavia, por comparação com o tecido

ósseo, pode ser classificada como um compartimento de remodelação em fase de reversão.

A existência do que consideramos ser compartimentos de remodelação no cemento e na

dentina, com características semelhantes ao que se observa no tecido ósseo, não foi ainda

demonstrada nem publicada.

De referir, no entanto, que quando em comparação com o tecido ósseo alveolar encontramos

no cemento e dentina radicular compartimentos de remodelação em muito menor número e com


54

uma constituição muito menos completa, apresentando com frequência perdas da canopy. Neste

contexto será ainda de assinalar que muitas vezes observamos áreas com uma excessiva reabsorção

e deficiente reparação.


55

Figura 37 – Imagem histológica de um compartimento de remodelação, em fase de reabsorção, observado no cemento

adjacente à dentina pondo em evidencia uma lacuna de Howship, ainda que sem a presença de osteoclastos. É também

possível observar algumas células achatadas que reconhecemos como constituintes da canopy (seta). D-dentina; C-

Cemento A.T., 400x no original.

Figura 38 - Aspeto de um compartimento de remodelação, em fase de formação, localizado no cemento adjacente à

dentina, mostrando uma área de cemento (C) recoberta por cementóide (Ct) e por cementoblastos (Cb). A.T., 400x no

original.

D

C


56

Figura 39 – Imagem semelhante à da figura anterior pondo em evidência uma área de dentina (D), cemento mineralizado

(C), cementóide (Ct), uma camada de cementoblastos (Cb), um espaço correspondente ao compartimento de remodelação

(CR) e células da canopy (seta). A.T., 1000x no original.

Figura 40 – Aspeto de uma área de reabsorção de dentina (D) que consideramos estar em fase de reversão. É notória a

semelhança com um cone de reabsorção observado no tecido ósseo incluindo a presença de um vaso sanguíneo. A.T.,

1000x no original.

Ct

D C Ct Cb CR


57

3. Discussão

__________________________________________________________


58


59

Com o presente trabalho pretendemos contribuir para uma maior compreensão dos

processos de remodelação óssea proporcionando um melhor conhecimento das características

histológicas dos compartimentos de remodelação óssea.

Considerando todo o esforço, tempo e elevado custo despendidos na preparação de cortes

histológicos realizados em tecido ósseo, no âmbito de vários estudos experimentais relacionados

com os processos de regeneração óssea95,96,97, realizados na Área de Medicina Dentária, pareceu-nos

manifestamente um desperdício não aproveitar este material para outros fins. Tendo em conta, ainda,

que muitos dos cortes histológicos efetuados eram provenientes de material incluído em

metilmetacrilato, efetuados com recurso ao sistema Exact®, que constitui um equipamento único no

país, seria imperdoável não rentabilizar este material. Para além de todas estas razões importa

sublinhar o facto de serem sobretudo pessoas com preparação em ciências morfológicas as mais

habilitadas para levar a cabo uma análise e interpretação abrangente e pormenorizada de toda a

informação presente num corte histológico. Assim, considerando toda a colaboração prestada no

desenvolvimento dos trabalhos atrás referidos, decidimos levar a cabo uma análise qualitativa em

microscopia de luz, no âmbito da histologia básica, para deteção e identificação de compartimentos

de remodelação óssea (BRC) nas áreas de tecido ósseo alveolar mandibular, incidindo

fundamentalmente na observação e registo das suas características histomorfológicas. Decidimos

ainda estender as observações para as áreas de dentina e do cemento, uma vez que são também

tecidos mineralizados com capacidade de remodelação.

Os resultados apresentados constituem, a nosso ver, um conjunto de observações únicas para

o esclarecimento da constituição histológica dos compartimentos de remodelação óssea, durante as

diferentes fases do ciclo de remodelação, que entendemos de grande utilidade didática e científica.

Ainda que não nos tivesse sido possível realizar estudos quantitativos, foi por demais evidente

que o número e variedade de imagens correspondentes a compartimentos de remodelação óssea,

que apresentamos nos resultados, demonstram bem a intensidade e frequência de aparecimento de

processos de remodelação que se verificam no osso alveolar. A dinâmica observada no osso alveolar

deve-se ao facto de apresentar uma constante e rápida formação e remodelação óssea resultante

inicialmente do crescimento radicular e erupção dentária e, posteriormente, das exigências funcionais

da mastigação1, 29, 101. Os pequenos movimentos que experimentam continuamente os dentes são as

principais causas de remodelação do osso alveolar.

A observação de um grande número de processos de remodelação verificados no osso

alveolar poderá estar ainda reforçada pela sua própria constituição estrutural. Com efeito, as áreas

de tecido ósseo adjacentes ao ligamento periodontal (osso alveolar propriamente dito) contêm


60

numerosas fibras de colagénio (osso fasciculado) provenientes do ligamento periodontal e que por

sua vez se inserem diretamente no cemento que reveste a dentina radicular1,6,28-32. Assim, qualquer

movimento dentário resultante da mastigação será fácil e rapidamente propagado a este tecido

ósseo, estimulando o desenvolvimento de processos de remodelação, visando uma constante

otimização e adaptação às suas exigências funcionais. Por outro lado, existe também um grande

número de comunicações entre o osso alveolar propriamente dito e o ligamento periodontal através

da presença de muitos canais de Volkman que transportam vasos sanguíneos estabelecendo uma

rápida e ampla ligação entre tecido ósseo e ligamento periodontal1,6,28. Qualquer variação fisiológica

verificada no órgão dentário ou qualquer situação fisiopatológica que ocorra no dente ou nas suas

estruturas de suporte e proteção (periodonto de suporte e de proteção) terão uma repercussão

direta no tecido ósseo que constitui o osso alveolar. A ortodontia aproveita toda a plasticidade que

lhe oferece o osso alveolar para, em conjunto com o ligamento periodontal, movimentar o dente

sem alterar as suas relações2, 28-32,121. O conhecimento deste jogo de forças, as suas consequências e

os mecanismos moleculares a elas subjacentes, abrem cada vez maiores perspetivas de intervenção e

eficácia na área de ortodontia e implantologia.

Uma nota mais para referir que os processos cariogénios e de periodontite101,169 são

acompanhados com grande frequência por fenómenos de remodelação óssea que na sua maioria

conduzem a uma perda de massa óssea por excesso de processos de reabsorção.

De modo semelhante ao que observamos nas regiões do tecido ósseo alveolar também nas

zonas de remodelação do cemento e dentina foi possível identificar estruturas com uma constituição

histológica em tudo idêntica ao compartimento de remodelação óssea, porém em muito menor

número e com uma constituição muito menos completa. Com efeito, detetamos com frequência

perdas da canopy e áreas com uma excessiva reabsorção e deficiente reparação. A este respeito

importa salientar que os processos de remodelação do cemento estão frequentemente associados a

processos inflamatórios e, embora partilhe grandes semelhanças morfológicas, funcionais e

bioquímicas com o tecido ósseo, é no entanto, um tecido avascular e bastante desestruturado28,124,125.

Assim, é facilmente compreensível que no cemento não estejam reunidas as condições ideais para

uma adequada formação de compartimentos de remodelação como se observam no tecido ósseo.

De qualquer modo, estes resultados, presença de compartimentos de remodelação no cemento e

dentina, tanto quanto é do nosso conhecimento, não foram ainda referidos nem publicados.

A existência de um compartimento de remodelação com características semelhantes (tanto no

tecido ósseo esponjoso como no tecido ósseo compacto como no cemento e dentina) e ainda a

manutenção do mesmo alinhamento ordenado de eventos pressupõe a existência de um mecanismo

comum a todos estes processos de remodelação. Assim, os parágrafos posteriores pretendem


61

apresentar uma breve discussão sobre os mecanismos subjacentes e a problemática associada e aos

processos de remodelação dos tecidos mineralizados, tendo em conta os resultados apresentados.

***

O envolvimento direto das estruturas vasculares no desencadear dos fenómenos de

remodelação óssea e na sua manutenção não está ainda completamente esclarecido, mas são cada

vez mais as evidências que apontam nesta direção25,40,43,100,123-129. Este facto faz todo o sentido uma

vez que os mecanismos de angiogénese desempenham um papel crucial em todos os processos de

reabsorção, formação, crescimento, reparação de fraturas e regeneração óssea25,40,126,128. O

desenvolvimento de uma rede de vasos sanguíneos surgindo como uma estrutura sempre presente

ao longo de todas as fases do ciclo de remodelação óssea demonstra bem que a íntima relação entre

estruturas vasculares e compartimentos de remodelação terá uma importância crucial no início,

manutenção e coordenação de todo o processo de remodelação25,82,100,108.

Na verdade, um reforço dos mecanismos de angiogénese e a aproximação e/ou adesão de

capilares sanguíneos às células de revestimento de uma região da superfície óssea, que vai necessitar

de um processo de remodelação, parece constituir um dos primeiros sinais de ativação de um ciclo

de remodelação25,99,100,132. Este facto, que assinala a conversão de uma superfície óssea de um estado

quiescente para um estado ativo de remodelação, é acompanhado por alterações na morfologia e

comportamento das suas células de revestimento48,82. Com efeito, a fase de ativação do ciclo de

remodelação óssea é tradicionalmente caracterizada pela digestão da fina camada de endósteo, da

responsabilidade das células de revestimento, com recurso a MMP38,48, 65-70, conduzindo a uma mais

fácil exposição da matriz mineralizada. Ao mesmo tempo, as células de revestimento presentes nesta

região destacam-se da matriz mineralizada, localizando e confinando a área a ser remodelada, dando

início à formação de uma estrutura em forma de cúpula – canopy - e ao desenvolvimento de um

compartimento de remodelação óssea - BRC. As células que constituem a canopy são,

confirmadamente27,48,133-135, células da linha osteoblástica, que expressam a maioria dos marcadores

característicos do fenótipo osteoblástico (fosfatase alcalina, osteocalcina, osteonectina, IGF, TGFβ,

FGFβ, OPG e RANKL, entre outros)24,108,131,136, mas que parecem regredir para um estádio precoce

de diferenciação, mostrando inclusive um índice de proliferação superior a 10 %82,131.

Estes processos (formação da canopy e desenvolvimento e aproximação de estruturas

vasculares) são acompanhados por uma forte migração e recrutamento de células pré-osteoclásticas,

dirigindo-se exatamente para a região em causa, e por um reforço dos mecanismos de

osteoclastogénese. A superfície da matriz óssea, desnudada e exposta, atrai fortemente as células

percursoras dos osteoclastos contribuindo ainda para a sua maturação e ativação27,38,48,130. Com

efeito, só em contacto direto com a matriz óssea mineralizada, e sob a influência das células da linha

osteoblástica, é que os pré-osteoclastos se fundem formando células multinucleadas capazes de uma


62

verdadeira atividade de reabsorção. As células pré-osteoclásticas podem alcançar o compartimento

de remodelação por diapedese, através das células da canopy, ou migrarem através de zonas livres

resultantes da retração de algumas das células da canopy38, 99,135,150. No caso das trabéculas do tecido

ósseo esponjoso, a proximidade da medula óssea deixa antever uma grande facilidade de acesso das

células percursoras dos osteoclastos e osteoblastos ao BRC. Porém, no tecido ósseo compacto

serão os capilares sanguíneos, presentes nos canais de Havers, as únicas vias capazes de conduzir

estas células para as áreas que delas necessitam.

Os pré-osteoclastos vão encontrar no BRC um ambiente ideal e uma concentração adequada

de citocinas, quimiocinas e fatores osteoclastogénicos, tendo sido atribuída às células de

revestimento da canopy (porque constituem células da linha osteoblástica) a principal

responsabilidade pela síntese de M-CSF e de RANKL27. A presença destas citocinas no interior do

BRC constitui, assim, um dos mais importantes fatores responsáveis pela diferenciação e ativação

osteoclástica.

Todavia e como já foi referido, os osteócitos não estão alheios a este processo. De facto, os

osteócitos comprometidos ou danificados119,145,166-168 podem estimular, a produção de RANKL nas

células de revestimento (através de gap junctions), ou mesmo nas células do estroma presentes em

territórios adjacentes, como é o caso da medula óssea no tecido ósseo esponjoso ou o endósteo nos

canais de Havers.

Por sua vez, os osteócitos em apoptose podem, eles próprios, para além de produzir citocinas

inflamatórias (PGE2, Il-1,4,6,11, TNF–α e TNF–β) ser também capazes de sintetizar RANKL, tendo

até sido recentemente considerados como a maior fonte de RANKL sempre que se inicia um

processo de remodelação46-48,117-119,141,142. De facto, os osteócitos em apoptose libertam corpos

apoptóticos que são apontados como os principais responsáveis pelos altos teores de RANKL

verificados nestas situações47,104,143,144. Neste contexto importa referir ainda que nas zonas que

requerem uma remodelação, ou reparação, foi detetado um aumento significativo na expressão de

VEGFs também da responsabilidade dos osteócitos, estimulando, deste modo, os mecanismos de

angiogénese nesta região109,129,139,146-148. Será também curioso registar que o RANKL não só promove

a formação, diferenciação e atividade de reabsorção osteoclástica, como estimula os processos de

angiogénese e a sobrevivência das células endoteliais109,129,139,146-149.

***

A grande densidade de capilares observada junto às canopies seguindo um percurso paralelo

representa uma ampla interface entre estas duas entidades25,40,43,100,123-129. Esta situação permite uma

grande superfície de contacto entre capilares e canopies, constituindo certamente um local

privilegiado de comunicação entre estruturas vasculares e compartimentos de remodelação. Este


63

envolvimento vascular é muito mais do que uma resposta da circulação ao aumento das necessidades

locais. O aparecimento de novas células endoteliais e perivasculares (constituintes da sua parede)

parecem exercer um papel determinante no coupling entre a etapa de reabsorção e de formação

óssea151.

Na formação e desenvolvimento dos cones de reabsorção óssea, observados no tecido ósseo

compacto, o vaso sanguíneo cresce à mesma velocidade que a BMU avança (25 µm por dia),

situando-se usualmente a não mais de 100 µm de distância quer da zona de reabsorção, quer da zona

de formação óssea54.

De facto, o BRC tem sido frequentemente considerado como uma estrutura vascular, sendo

várias as representações esquemáticas em que se propõe a comunicação directa de um capilar

sanguíneo com o espaço do compartimento19,25,38,39,76,100,104,131. Todavia, um estudo recente, realizado

com recurso a microscopia electrónica100, revelou que capilares e células de revestimento da canopy

são estruturas fisicamente independentes, mostrando, no entanto, algumas regiões onde se verifica

uma muito estreita proximidade. Foi também demonstrado nesse estudo que os capilares adjacentes

às zonas de remodelação óssea, mesmo no caso de trabéculas ósseas do tecido ósseo esponjoso, são

constituídos por uma camada contínua de células endoteliais, não podendo, por isso, ser

considerados como sinusóides. Todavia estas estruturas apresentam geralmente muito maiores

dimensões do que a maioria dos capilares (50 µm de diâmetro)152. Estes trabalhos19,40,100,109,148,153

revelaram também que a parede dos capilares em questão apresentava, em redor da camada de

células endoteliais, uma bainha de células consideradas como pericitos, que durante as fases de

remodelação se encontram expostos a uma alta concentração de fatores de crescimento

provenientes, quer do compartimento de remodelação, quer sintetizados pelas células endoteliais.

Estas células (bastante indiferenciadas) apresentam inúmeras capacidades de diferenciação,

mostrando nomeadamente um forte potencial osteogénico. Os pericitos prestam uma forte

contribuição nas respostas osteogénicas, relacionadas com estimulações eléctricas, manipulações

ortodônticas, reparações da sutura palatina148 e sobretudo nos processos de distração

osteogénica148,155,156.

Com efeito, em estudos com timidina tritiada, realizados em várias das situações atrás citadas,

foi possível demonstrar o aparecimento de osteoblastos marcados provenientes de precursores

perivasculares. Por outro lado, os pericitos em cultura podem expressar muitas características do

fenótipo osteoblástico, incluindo a formação de nódulos mineralizados. Deste modo, será

compreensível que os pericitos vasculares possam representar uma importante fonte de precursores

osteoblásticos100,109,157,158.

Os pericitos parecem, pois, representar um importante reservatório de células

osteoprogenitoras que podem facilmente ser recrutadas para a canopy ou para o interior do


64

compartimento e, consequentemente, colonizar as superfícies ósseas. Este facto poder-se-á verificar

sempre que se observe uma estreita proximidade entre capilares e canopies100,109,157,158.

Para além dos pericitos, as células endoteliais42,127,137,149 assumem também uma importância

crucial na ativação e manutenção dos processos de remodelação óssea. De facto, a íntima ligação

entre células endoteliais e osteoblastos levou mesmo à elaboração de uma teoria que afirmava que a

célula endotelial era, em si, um precursor osteoblástico46. De qualquer modo, e ainda que assim não

seja, o endotélio vascular presente no tecido ósseo parece apresentar características únicas46. De

facto, as células endoteliais vasculares são responsáveis pela secreção de numerosas moléculas de

regulação (fatores de crescimento, BMP, citocinas, endotelinas, radicais livres e prostanóides) que

vão exercer um efeito major no controlo da diferenciação, metabolismo, sobrevivência e função das

células da linha osteoblástica46.

Por sua vez, também os osteoblastos são capazes de sintetizar fatores parácrinos que atuam

sobre as células endoteliais. Durante esta “conversa” entre células endoteliais e osteoblastos, o VEGF,

que atua principalmente como um fator angiogénico, assume particular importância. Um estudo de

Crawford (2009)138 veio demonstrar ainda que o bloqueio da atividade endógena do VEGF tem como

consequência a inibição de todo o mecanismo de remodelação óssea (reabsorção e formação)138.

Pode, pois, inferir-se destes dados que o VEGF se revela como um elemento crucial nos mecanismos

de angiogénese, mas também indispensável para os processos de formação e remodelação óssea46,

109,129,139,146-148. Por outro lado, foi também demonstrado que as proteínas morfogénicas do osso 2 e 4

(BMP 2 e BMP 4) estimulam a síntese de VEGF (pelos osteoblastos), que por sua vez atuam ao nível

das células endoteliais, promovendo a síntese de mais BMP-2 e Prostaglandinas E139. Assim, o papel do

VEGF parece ser essencial, não apenas para a amplificação da estrutura vascular na área do tecido

ósseo danificado, mas também terá um desempenho fundamental na promoção do recrutamento e

diferenciação dos osteoblastos.

As alterações desta forte ligação estrutural e funcional entre tecido ósseo e vasos sanguíneos

parecem estar na base de uma forte associação entre osteoporose e ateroesclerose/calcificações

vasculares39,159,160,161. A escassez de vasos sanguíneos, redução da perfusão vascular e aumento da

medula óssea amarela, observada sobretudo em mulheres pós menopausa com idade avançada,

parece correlacionar-se diretamente com os problemas de osteoporose39,161. Compreende-se pois

que, para além de uma terapêutica de substituição de estrogénios, os vasos sanguíneos constituam

também um importante alvo terapêutico a atingir, no desenvolvimento e otimização de soluções

eficazes para muitas das doenças do metabolismo ósseo como a osteoporose.

***

Foi também detetado um alto índice de proliferação celular, acompanhando as regiões

adjacente às áreas de remodelação, ou seja, nos locais de convergência entre capilares e


65

compartimentos25. Estas regiões podem, pois, ser consideradas como verdadeiras plataformas

angio/osteogénicas. De facto, uma vez iniciada a formação do compartimento de remodelação, as

células da canopy parecem encontrar-se numa posição ideal no que respeita à exposição de fatores

mitogénicos e osteogénicos provenientes, quer do interior do BRC, quer das regiões adjacentes. Por

sua vez, será durante a fase de reversão, ou seja, durante o tempo que medeia entre o final do

processo de reabsorção e o início do processo de formação óssea que o gradiente de citocinas,

fatores de crescimento e de diferenciação deverá atingir a sua concentração máxima no interior do

BCR54,76,82. Este facto irá facilitar o recrutamento de células osteoprogenitoras para o local deixado

pelas células osteoclásticas, promovendo ao mesmo tempo a sua proliferação e permitindo a sua

maturação no sentido de osteoblastos maduros. Parece ser absolutamente necessária também a

presença de uma alta densidade celular ao nível das superfícies reabsorvidas, de modo a atingir uma

“massa crítica” de células osteoblásticas capaz de dar início à síntese de matriz óssea25,131. Neste

âmbito foi também reconhecido que as células da canopy constituem um reservatório de

progenitores osteoblásticos, prontos a ser recrutados para as superfícies em reversão. Foi ainda

demonstrada a existência de um gradiente entre as células da canopy e as superfícies ósseas em

reparação com recurso a marcadores como Ki67, Osterix e P3NP25. Com efeito verificou-se um

aumento no seu estádio de diferenciação (associada a uma elevação dos níveis de marcação com

Osterix) e uma diminuição nos índices de proliferação (acompanhando o decréscimo dos níveis de

marcação com Ki67 e P3NP)25,76,87. Este recrutamento de células osteogénicas observado entre a

canopy e as superfícies em reversão é apontado como um pré-requisito necessário ao início do

processo de formação e reparação óssea.

Considerando os resultados por nós observados durante a fase de reversão e de acordo com

tudo o que atrás foi referido (uma alta densidade celular ao nível das superfícies reabsorvidas,

apresentando diferentes estádios de desenvolvimento), facilmente se justifica a presença de uma

grande densidade de células, mas difícil caracterização, uma vez que se encontram, provavelmente,

em diferentes fases de diferenciação e maturação osteoblástica.

A este respeito, ou seja, quanto à origem das células osteoprogenitoras considerava-se, até há

bem pouco tempo, a existência na circulação periférica de apenas um reduzido número de células

pré-osteoblásticas. Todavia, a possibilidade de identificação destas células com recurso a meios

tecnológicos mais sofisticados (citometria de fluxo e cell sorter analysis), permitiu encontrar e

caracterizar uma expressiva percentagem de células da linha osteoblástica no sangue periférico19. Este

facto vem reforçar a possibilidade de acesso destas células aos BRCs, sobretudo situados no tecido

ósseo cortical (geralmente bastante distantes da medula óssea) resultante da estreita relação entre

capilares e células da canopy100, 162-164.

Pode admitir-se, pois, que o desaparecimento ou perda da canopy numa fase de reversão, para

além de perturbar drasticamente o equilíbrio dentro do compartimento (considerado como um


66

reservatório de fatores de crescimento e maturação), irá comprometer definitivamente a chamada

de células osteoprogenitoras e a sua diferenciação e, deste modo, parar o ciclo de remodelação24-

27,46,76,82,99,109,165. Nas situações em que se observa uma paragem no processo de coupling, a fase de

reversão apresenta uma baixa densidade de células (quando comparada com uma fase de reversão

ativa) que por sua vez se mostram muito mais achatadas, ou seja, muito semelhantes às células de

revestimento das superfícies em repouso27,46,82,99. As células da canopy assumem assim uma

importância crítica na reconstrução das áreas reabsorvidas. A este respeito importa referir que os

processos de reabsorção podem prosseguir mesmo sem a presença da canopy, justificando a

observação de muitas áreas onde se verifica uma excessiva reabsorção e uma deficiente ou ausência

de reparação.

Em jeito de conclusão, a figura 41 pretende ilustrar e fazer uma pequena sinopse do

envolvimento direto entre estruturas vasculares e compartimentos de remodelação óssea25,

mostrando a origem e localização das células osteogénicas e a proveniência de possíveis fatores

osteogénicos (derivados quer da corrente sanguínea e regiões perivasculares, quer inerentes aos

osteoclastos ou decorrentes da sua atividade, quer provenientes da matriz óssea a par de alterações

mecânicas - forças de deformação/estiramento geradas no interior do BRC).

Figura 41 – Representação esquemática da interligação de estruturas vasculares e perivasculares com o compartimento de

remodelação óssea e origem dos possíveis fatores de regulação das células com capacidade osteogénica. As células da

canopy encontram-se numa posição ideal para captar e responder aos inúmeros fatores osteogénicos (provenientes quer do

interior do BRC, quer das regiões adjacentes) constituindo verdadeiros reservatórios de células osteoprogenitoras. A

gradação dos tons de azul (claro para escuro) corresponde ao evoluir do processo de diferenciação das células

osteoblásticas. BLC – células de revestimento ósseo; OC – osteoclasto; Rv.Cs – células osteoblásticas características da

fase de reversão. Adaptado de JM Delaisse25


67

Em síntese pode pois afirmar-se que vasos sanguíneos, regiões perivasculares e canopies

parecem realmente funcionar em conjunto, constituindo uma importante unidade de apoio, nutrição

e abastecimento celular e metabólico ao compartimento de remodelação óssea representando, como

já foi referido, uma verdadeira plataforma angio/osteogénica.

O desenvolvimento e otimização de soluções terapêuticas relacionadas com o metabolismo

ósseo nunca serão bem-sucedidos se não se verificarem as condições logísticas necessárias que

assegurem o recrutamento e proteção das células osteoprogenitoras e dos seus fatores de regulação,

ou seja, a integridade do BRC.

Como nota final sublinhamos, mais uma vez, como nos parece importante um conhecimento

pormenorizado da constituição histológica do compartimento de remodelação óssea, de modo a

permitir uma melhor interpretação da fisiologia e patologia do ciclo de remodelação óssea. A

preservação desta estrutura anatómica e suas relações topográficas com o microambiente em seu

redor, nomeadamente os vasos sanguíneos, é crucial para a vitalidade e eficácia dos processos de

remodelação óssea.

,


68


69

III. Resumo

__________________________________________________________


70


71


tecido ósseo, de modo a otimizar a sua função ou prevenir a sua degradação, seguindo uma

sequência imutável de etapas - ativação, reabsorção, inversão/reversão e formação.

O conjunto de células responsáveis por estas diferentes atividades reúne uma equipa de células

da linha osteoclástica (pré-osteoclastos e osteoclastos) e uma outra de células da linha osteoblástica

(pré-osteoblastos, osteoblastos, osteócitos e células de revestimento). Desta unidade fazem também

parte outras populações celulares que incluem células mesenquimatosas indiferenciadas e células do

tecido conjuntivo, muitas delas pertencentes ao sistema imunitário, bem como um suplemento

vascular especializado para o efeito.

Esta complexa maquinaria celular está sujeita à ação de numerosos fatores de regulação, que

exigem um rigoroso e apertado sistema de sinalização e comunicação, responsável pela ação

concertada de todas estas células e pela coordenação e transição equilibrada das diferentes etapas da

remodelação.

Toda a atividade celular do ciclo de remodelação óssea está protegida no interior de uma

estrutura anatómica, ainda que transitória, designada por Compartimento de Remodelação Óssea

(BRC), permitindo a criação de um microambiente osteogénico favorável para que a transição da fase

de reabsorção e a fase de formação possa ocorrer. Esta entidade só recentemente foi detetada e está

ainda mal caracterizada.

Deste modo, pretendemos com o presente trabalho contribuir para uma maior compreensão

dos processos de remodelação óssea, proporcionando um melhor conhecimento das características

histológicas dos compartimentos de remodelação. Decidimos ainda estender as observações para as

áreas de dentina e de cemento, uma vez que são também tecidos mineralizados com capacidade de

remodelação.

***

O início do processo de remodelação óssea (fase de ativação) é induzido por citocinas,

produzidas pelos osteócitos lesados, e caracterizado pelo recrutamento, maturação e ativação dos

osteoclastos. Este processo é controlado pelas células da linha osteoblástica, através do eixo de

regulação RANKL/RANK/OPG. Nesta fase, verifica-se uma retração e um destacamento das células

de revestimento da área em questão, afastando-se da respetiva matriz óssea, dando início ao

aparecimento de uma camada de células em forma de cúpula (canopy) e ao desenvolvimento de um

espaço fechado correspondente ao BRC. Importa salientar, ainda, o desenvolvimento de uma rede de

capilares sanguíneos e a sua aproximação às células da canopy, formando no seu conjunto uma

plataforma de comunicação entre estruturas vasculares e compartimentos de remodelação. A

intervenção do componente vascular, constituindo uma estrutura sempre presente, é determinante

ao longo de todo o processo de remodelação.


72

Na fase de reabsorção os osteoclastos cavam, no tecido ósseo esponjoso, lacunas de contornos

muito irregulares denominadas por lacunas de Howship e no tecido ósseo compacto cavidades

cilíndricas designadas por cones de reabsorção. A dimensão das áreas reabsorvidas é diretamente

proporcional às áreas danificadas ou em sofrimento. No final desta etapa observa-se uma inversão ou

reversão nesta sequência, verificando-se um conjunto de condições responsáveis pela chamada de

células osteoprogenitoras e sua diferenciação, dando início ao processo de reparação óssea. Esta

estimulação da atividade osteoblástica, como resposta ao processo de reabsorção osteoclástica, é

habitualmente conhecido por coupling.

A fase de reversão parece constituir uma das etapas mais delicadas do ciclo de remodelação,

reunindo um conjunto de condições essenciais para a proliferação e diferenciação osteoblástica.

Qualquer perturbação observada nesta etapa (nomeadamente a integridade na canopy) poderá

provocar uma paragem irreversível no processo de remodelação. O preenchimento e reparação da

cavidade de reabsorção é naturalmente decorrente da atividade secretora de osteoblastos maduros

com origem nas células observadas durante a fase de reversão e que, entretanto, beneficiaram de um

processo de proliferação, maturação e ativação.

A fase de formação consiste, pois, na síntese de matriz osteóide e na sua posterior

mineralização, tendo como resultado final a reconstrução da lacuna de Howship com novo tecido

ósseo ou de um cone de reabsorção, dando origem ao aparecimento de um novo sistema de Havers.

***

Os resultados apresentados neste estudo comprovam que o compartimento de remodelação

óssea se apresenta como um espaço fechado que recobre as zonas de matriz mineralizada que estão

a ser alvo de um processo de remodelação. Este espaço encontra-se revestido por uma canopy

formada por células extremamente achatadas. De referir ainda a existência de uma abundante rede

capilar localizada em estreita associação de proximidade à canopy, que reveste os compartimentos de

remodelação, sendo mesmo possível verificar a presença de inúmeros pontos de contacto entre os

capilares e as células de revestimento que a compõem.

Ainda que não nos tivesse sido possível realizar estudos quantitativos, foi por demais evidente

que o número e variedade de imagens correspondentes a compartimentos de remodelação óssea,

que apresentamos nos resultados, demonstram bem a intensidade e frequência de aparecimento

destes processos no osso alveolar. De modo semelhante ao que observamos nas regiões do tecido

ósseo alveolar também nas zonas de remodelação do cemento e dentina foi possível identificar

estruturas com uma constituição histológica em tudo idêntica ao compartimento de remodelação

óssea, porém em muito menor número e com uma constituição muito menos completa.


73

***

A grande densidade de capilares observada junto às canopies, seguindo um percurso paralelo,

representa uma ampla interface entre estas duas entidades. Esta situação permite uma grande

superfície de contacto entre capilares e canopies, constituindo certamente um local privilegiado de

comunicação entre estruturas vasculares e compartimentos de remodelação.

A parede dos capilares apresenta, em redor da camada de células endoteliais, uma bainha de

células consideradas como pericitos, que durante as fases de remodelação se encontram expostos a

uma alta concentração de fatores de crescimento provenientes, quer do compartimento de

remodelação, quer sintetizados pelas células endoteliais. Estas células apresentam inúmeras

capacidades de diferenciação, mostrando nomeadamente um forte potencial osteogénico. Os

pericitos parecem, assim, representar um importante reservatório de células osteoprogenitoras que

podem facilmente ser recrutadas para a canopy ou para o interior do compartimento e,

consequentemente, colonizar as superfícies ósseas em remodelação.

Para além dos pericitos, as células endoteliais assumem também uma importância crucial na

ativação e manutenção dos processos de remodelação óssea.

Foi também detetado um alto índice de proliferação celular, acompanhando as regiões

adjacente às áreas de remodelação, ou seja, nos locais de convergência entre capilares e

compartimentos. De facto, uma vez iniciada a formação do compartimento de remodelação, as

células da canopy parecem encontrar-se numa posição ideal, no que respeita à exposição de fatores

mitogénicos e osteogénicos provenientes, quer do interior do BRC, quer das regiões adjacentes. Por

outro lado, as células da canopy, ainda que derivadas das células de revestimento ósseo, parecem ter

regredido para um estádio precoce de diferenciação, mostrando inclusive um índice de proliferação

superior a 10 %, constituindo também verdadeiros reservatórios de células osteoprogenitoras. O

BRC irá fornecer um ambiente propício para o recrutamento destas células pré-osteoblásticas para o

local deixado pelas células osteoclásticas, promovendo, ao mesmo tempo, a sua proliferação e

maturação no sentido de osteoblastos maduros.

Recentemente, a possibilidade de identificação de célula osteoprogenitoras na circulação

periférica, com recurso a meios tecnológicos mais sofisticados (citometria de fluxo e cell sorter analysis),

permitiu encontrar e caracterizar uma expressiva percentagem de células da linha osteoblástica no

sangue periférico. Este facto vem reforçar a possibilidade de acesso destas células aos BRCs,

resultante da estreita relação entre capilares e células da canopy.

Em síntese pode pois afirmar-se que vasos sanguíneos, regiões perivasculares e canopies

parecem realmente funcionar em conjunto, constituindo uma importante unidade de apoio, nutrição

e abastecimento celular e metabólico ao compartimento de remodelação óssea.

O desenvolvimento e otimização de soluções terapêuticas relacionadas com o metabolismo

ósseo nunca serão bem-sucedidos se não se verificarem as condições logísticas necessárias que


74

assegurem o recrutamento e proteção das células osteoprogenitoras e dos seus fatores de regulação,

ou seja, a integridade do BRC.

Como nota final sublinhamos, mais uma ve,z como nos parece importante um conhecimento

pormenorizado da constituição histológica do compartimento de remodelação óssea, de modo a

permitir uma melhor interpretação da fisiologia e patologia do ciclo de remodelação óssea. A

preservação desta estrutura anatómica e suas relações topográficas com o microambiente em seu

redor, nomeadamente os vasos sanguíneos, é crucial para a vitalidade e eficácia dos processos de

remodelação óssea.


75

IV. Abstract

__________________________________________________________


76


77

Bone remodelling represents the most notable response of the bone tissue, as it is supported by

complex cellular machinery which is under the influence of numerous regulation factors.

Furthermore, bone remodeling is a strictly localized process.

Bone remodeling is a continuous process during adulthood, which preserves the bone strength

through a constant renewal of the bone. This process is conducted by numerous tightly regulated

bone remodeling units (BRUs), which include four sequential events taking place on the bone surface:

activation of the precise area of bone which needs to be repair, bone resorption by osteoclasts

(OCs), a reversal phase, and bone formation by osteoblasts (OBs).

This way, it is plausible to state that bone resorption and formation are events which are closely

attached, as the beginning of the first one stimulates the repairing activity of the second, in the way

that the resorption of a certain amount os bone tissue shall be replaced by the same amount of new

bone.

Truthfully, considering the fact that in the sequence of bone remodeling the formation phase

(performed by osteoblastos) is always preceded by a resorption phase (performed by osteoclastos),

the way in which the transition ou reversion takes placed is still widely unknown. Can osteoclastos

trigger osteoblast differentiation, representingan essential factor for osteoblástica differentiation

There are multiple possibilities of answers to this question, namely: a) the presence of growth

factors produced by osteoclastos will have a paracrine effect on osteoblastos; b) the action of growth

factors and cytokines with osteogenic potential present within the bone matrix are released with the

beginning os osteoclástica resorption and c) a direct cell-to-cell contact between osteoclastos and

osteoblastos.

Despite the alignment and association between bone resorption and formation is rarely affected,

the final balance concerning the level of bone mass can vary considerably. As it is conventionally

accepted, with the aging process and in situation of bone disease, such as osteoporosis, the final

balance between bone resorption and formation tends to be negative.

Furthermore, mosto of inflammatory and metabolic diseases that hit bone tissue usually manifest

themselves by disturbances in the dynamics of the remodeling process, resulting almos invariably in a

decrease in bone mass, associated with osteoclástic resorption.

***

It is also important to stress out that all cellular activity within the bone remodeling cycle has to

be protected by a specific structure created for that matter.

Hauge et al (2001) were the first investigators to point out the existence os a bone remodeling

compartment as a real and temporary entity, demonstrating its existence histologically.

The cells which forme the canopy expresse the majority os the markers characteristic of the

osteoblástica phenotype (alkaline phosphatase, osteocalcine and osteonectine), most likely being


78

bone linning cells. These investigations also raised the hypothesis that this compartment may very

well form a specialized vascular structure

Later on, numerous investigations demonstrated as well that there is a strict association between

blood capillaries and the bone remodeling compartment’s canopy, concluding that the integrity of the

BRC itself is also a pre-requirement fundamental for bone remodeling and formation.

The marrow microenviroment surrounding the BRC is one of the main sources of cells that form

the BMU. In spite of this, it is important to state that the bone marrow is not the only origin of these

cells. In fact, multiple blood capillaries penetrate the BRC canopy and serve as a method of

transportation of the cells needed to the functioning of the BMU.

The blood vessel is a structure strategically present e located in all BMU’s, once the formations of

new blood vessels in intimately related with the processes of osteogenesis and ossification.

In another perspective, it is ever more evident the existence os a common lineage between

vascular endothelial cells and osteoblástica cells. Furthermore, the osteoblasts are always located

near endothelial cells and vascular invasion is a pre-requirement for bone formation, remodeling and

regeneration.

Concerning the osteoblástica cells, merely a low number of cells from this lineage has been

detected in the peripheral circulation until recently. However, with the possibility of identifying these

cells through technologically more sophisticated methods (flow citometry and cell sorter analysis)

allowed investigators to find a describe an expressive percentage of osteoblástica cells on the

peripheral blood.

***

In summary, these recent studies demonstrated that bone remodeling (both in cortical and

trabecular bone tissue) takes place in specialized vascular structures – the bone remodeling

compartment. According to this model, osteoblastic precursor cells arrive in the BRC not only from

the bone marrow, but also via blood capillaries which invade the BRC. Furthermore, osteoblastic

lineage cells may enter the BRC through the bloog circulation (afferent capillary), they may be

originated from perivascular structures (perycites) and also from the endothelial cells themselves.

This way, the possibility of performing the identification e harvesting of these cells and the

subsequent expansion through culture represents a promising tool for the formulation of future

therapeutics of diseases related to bone tissue metabolism.


79

V. Bibliografia _________________________________________________________________________________


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91

VI. Índice

__________________________________________________________

Agradecimentos---------------------------------------- ---- --------------------- 4

Sumário--------------------------------------------------------- ----------------- ---5

I – Introdução

1. Justificação do tema 7

1.2 Planificação do trabalho 10

2. Ciclo de Remodelação óssea (alguns aspetos) 12

II – Compartimento de Remodelação Óssea (BRC)

1. Objetivo 25

2. Materiais e Métodos 25

2.1 Animal de experimentação

2.2 Manutenção e bem-estar animal

2.3 Colheita do material

2.4 Processamento histológico de material descalcificado

2.5 Processamento histológico de material não descalcificado

3. Resultados

3.1 Deteção de BRC no tecido ósseo alveolar 31

3.2Identificação de diferentes etapas do ciclo de remodelação óssea 45

3.3 Deteção de compartimentos de remodelação no cemento e dentina 53

4. Discussão 59

III – Resumo 71

IV – Abstract 77

V – Bibliografia 83

VII- Anexos 95


92

VII. Anexos

__________________________________________________________

Listagem de Acrónimos

BMU – Basic Multicellular Unit

BRC – Bone Remodelling Compartment

LPS – Lipopolissacarídeos

RANKL – Receptor Activated of Nuclear Factor Kappa-B Ligand

RANK – Receptor Activated of Nuclear Factor Kappa-B

OPG – Osteoprotegerin

TGFβ- Tumoral Growth Factor β

PDGF – Platelet Derived Growth Factor

IGF-I – Insulin-like Growth Factor I

BMP – Bone Morphogenic Protein

S1P – Sphingosin-1-phosphate

ET-I – Endothelin I

VEGF – Vascular Endothelial Growth Factor

compartimento de remodelação Óssea - estudogeral.sib.uc.pt · concentração atingida por estes...

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