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Comissão Nacional de Energia NuclearCENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR

Programa de pós-graduação em Ciência e Tecnologia dasRadiações, Minerais e Materiais

AVALIAÇÃO DA PROTEÇÃO INDUZIDA PELAIMUNIZAÇÃO COM LEVEDURAS RADIOATENUADAS

DE Paracoccidioides brasiliensis EM MODELO ANIMAL

Estefânia Mara do Nascimento Martins

Dissertação apresentada ao Curso de pós-graduação em Ciênciae Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, comorequisito parcial à obtenção do grau de Mestre

Área de concentração: Aplicações de técnicas nucleares

Orientador: Dr. Antero Silva Ribeiro de AndradeCo-orientador: Dr Alfredo Miranda Góes

Comissão Nacional de Energia NuclearCENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR

Programa de pós-graduação em Ciência e Tecnologia dasRadiações, Minerais e Materiais

AVALIAÇÃO DA PROTEÇÃO INDUZIDA PELAIMUNIZAÇÃO COM LEVEDURAS RADIOATENUADAS

DE Paracoccidioides brasiliensis EM MODELO ANIMAL


Dissertação apresentada ao Curso de pós-graduação em Ciênciae Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, comorequisito parcial à obtenção do grau de Mestre

2007

´'HXV�FULRX�R�KRPHP�VLPSOHV�H�LJQRUDQWH��PDV�FRORFRX�GHQWUR�GH�VHX�(VStULWR�FRPR�XPD�VHPHQWH��WXGR�R�TXH�HOH�SUHFLVD�SDUD�GHVHQYROYHU�VXD�FRQVFLrQFLD�

HYROXLU�H�DOFDQoDU�D�IHOLFLGDGHµ��/LYUR�GRV�(VStULWRV��

DEDICOAo meu pai, com todo amor e carinho,

pelo grande homem que ele foie por tudo que eu sou.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me conceder a serenidade, perseverança e humildade nos momentos mais

difíceis da vida.

Ao meu orientador e amigo, Antero, pelos ensinamentos, pela disponibilidade, ajuda e

orientação diária, pelos puxões de orelha também! Obrigada!

Ao meu Co-orientador, Alfredo Góes, pela receptividade, atenção e carinho. Como você

mesmo diz: “A macaca está evoluindo!!!”

Ao Bê, pela ajuda, disponibilidade e alegria contagiante.

À todos do CDTN pela convivência agradável, pelo carinho e constante ajuda. Em especial

ao Lameiras, Eduardo, Ana Maria, Vilma, Wilmar, Adelina, Gino, Tiaozinho, Donizete,

Wagner, Dona Geralda, Nívia, Virgínia, Machado, Fausto às companheiras da ginástica, ao

prof. Edgar e aos colegas do espanhol, ao pessoal do LIG, ao pessoal da gráfica e aos

bolsistas Alisson, Paulinho, Vanessa R., Fabiano, Marcus e Tiago. Ai que saudade!!!!

Ao grande amigo Vlamir sempre presente e pronto para ajudar. Obrigada demais!

Às professoras Raquel e Maria José pelos ensinamentos.

Ao Zacarias e ao Geraldinho pelo apoio técnico.

Ao pessoal do laboratório de radiobiologia, Paulo, Juliana Soprani, Juliana Lage, Thaíssa,

Rômulo, Sidney, Fred, Karine, Bárbara, Priscila, Edinho, em especial às amigas Marcella

sempre tão sensata, pé no chão, econôoooooooomica, à Marina pelo apoio, ajuda e carinho

constante e a Lu Tchurururu, pela amizade, companheirismo, alegria....Some da minha vida

não, viu!

Aos colegas do Mestrado, em especial à Val, Carol, Karine, Vanessa, Andreza, Daniel,

Léo, Paul, Nelson, Tiago, Bruno, Cíntia etc....

Aos amigos do LICM Dri, Tiago, Nath, Luiza, Carol, Cris, Mário, Paula, Luara, Gui,

Inácio, Karine, Ana, Cris Torres, Marina, Tércio, Ju, Susana, Peu e Bete, em especial à

Vivi, pela ajuda, pelos conselhos, almoços, desabafos.....

À Rogéria, Natália e Jankerle pela ajuda nas histologias.

À Mirinha pela simpatia, disponibilidade e ajuda. Muito Obrigada!

Aos primões Evandro e Conrado pela amizade, presença e pelas palhaçadas e trapalhadas.

Ao amigo do coração, Kinho, pelos anos de convivência, inúmeras noites de conversa,

conselhos e trocas de experiência.

Aos amigos da faculdade Raquel, Ciça, Giancarlo, Andréa, Michele, Patrícia, Fernando....

Aos professores da faculdade Hudson, Esther, Sandra, Márcia e Ricardo.

Aos Deuses e aos meninos da Casablanca pelas confusões que me fazem esquecer o

estresse do dia a dia.

À vovó pela paciência, carinho, pelas marmitinhas gostosas.....

À Cacá pela amizade, pelas conversas, conselhos, incentivo e apoio.

Ao Cláudio pelo carinho com a nossa família e por fazer a Cacá feliz.

Aos meus irmãos, Rafa e Kikinha, pela amizade e alegria. Amo vocês!

À Camila, cunhadinha, pelo cuidado, carinho e amor dedicado ao meu irmão.

Às amigas Lu, Flavinha, Camila, Jackie e Edinha sempre presentes em minha vida.

À mamãe, pelas orações, pelo amor incondicional e por respeitar e entender a minha

ausência. Amo você!

Ao Pedro, Geni e Dani pelos momentos agradáveis.

Ao PETECA, meu gostoso, mais uma vez por todos os abraços e bjinhos e carinhos sem ter

fim. Obrigada pelo apoio, presença....com você eu enfrentei esta etapa com mais

perseverança e tranqüilidade. Te amo!

Ao CNEM pela bolsa e apoio financeiro.

À FAPEMIG e IAEA pelo apoio financeiro.

À Andreia, Roseli e Fulgêncio pela disponibilidade.

À pós graduação pelas oportunidades.

AVALIAÇÃO DA PROTEÇÃO INDUZIDA PELA IMUNIZAÇÃO COMLEVEDURAS RADIOATENUADAS DE Paracoccidioides brasiliensis EM MODELO

ANIMAL


RESUMO

Paracoccidioides brasiliensis é o agente da paracoccidioidomicose (PCM), uma doença

sistêmica crônica prevalente na América Latina. Até o momento, não existe uma vacina

eficaz para esta enfermidade. O potencial da radiação gama para a atenuação de patógenos

e desenvolvimento de uma vacina foi explorado neste trabalho. Em nosso laboratório

desenvolvemos leveduras de P. brasiliensis atenuadas por irradiação gama. Estas perderam

a capacidade de reprodução, mas mantiveram a sua morfologia, a síntese e secreção de

proteínas, o metabolismo oxidativo e o seu perfil antigênico. O objetivo deste trabalho foi

avaliar a capacidade protetora induzida pela imunização com as leveduras radioatenuadas

em modelo animal. A atenuação da virulência das leveduras radioatenuadas foi avaliada em

camundongos BALB/c e Nude-Nude. O efeito protetor foi avaliado em grupos de

camundongos BALB/c submetidos a uma ou duas imunizações. Cada grupo foi dividido em

três subgrupos, que foram desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização. Os camundongos

foram sacrificados 30 e 90 dias após o desafio. Os órgãos removidos foram usados para

recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs), análise histológica e

determinação de citocinas. Os soros foram coletados semanalmente para avaliar os títulos

de IgG e o padrão de IgG1 e IgG2a produzido no curso da infecção. Para avaliar o tipo de

resposta imune desencadeada, as citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-5 foram determinadas

por PCR em tempo real. As leveduras radioatenuadas perderam a sua virulência, pois não

foram capazes de provocar infecção em camundongos BALB/c e Nu/Nu. Nenhuma UFC

foi recuperada nem foram observadas alterações histopatológicas nos camundongos

infectados com o fungo radioatenuado. Os camundongos infectados com P. brasiliensis não

irradiado mostraram altos níveis de produção do anticorpo IgG, enquanto a infecção com as

leveduras radioatenuadas não estimulou alterações significativas destes níveis. Os

camundongos infectados com a levedura radioatenuada apresentaram um aumento na

produção de IFN-γ e TNF-α, indicando uma estimulação da imunidade celular. O ensaio de

proteção realizado com camundongos imunizados uma vez mostrou uma redução

significativa na recuperação das UFCs avaliadas 30 dias após o desafio. Entretanto, foi

verificado um aumento na recuperação das UFCs dos tecidos 90 dias após o desafio.

Apesar de um grau significativo de proteção ter sido alcançado, estes resultados mostram

que somente uma imunização não foi suficiente para conferir uma proteção a longo prazo,

uma vez que alguns focos do fungo não foram eliminados. Uma proteção eficiente foi

desenvolvida no grupo dos camundongos imunizados duas vezes. A imunização foi capaz

de reduzir a infecção inicial e desencadear uma proteção a longo prazo. Uma proteção de

99,5% foi obtida nos camundongos analisados 90 dias após desafio. Neste mesmo período

os níveis de IFN-γ e TNF-α aumentaram significativamente, enquanto os de IL-10 e IL-5

diminuíram. Quando analisados 30 dias após o desafio os camundongos não desenvolveram

um padrão totalmente polarizado de resposta Th1/Th2, mas uma tendência para um padrão

Th1 foi evidente após 90 dias. Os níveis de IgG aumentaram em ambos os grupos após o

desafio. Concluímos que a imunização com as leveduras radioatenuadas foi capaz de

desencadear uma resposta imune protetora a longo prazo. Estas células são uma ferramenta

valiosa em estudos da imunidade protetora e na pesquisa de vacina para a PCM.

Palavras - chave: Paracoccidioides brasiliensis; Paracoccidioidomicose; irradiação gama;

proteção; vacina.

EVALUATION OF THE PROTECTION INDUCED BY THE IMMUNIZATION

WITH RADIOATTENUATED YEAST CELLS OF Paracoccidioides brasiliensis IN

ANIMAL MODEL


ABSTRACT

Paracoccidioides brasiliensis is fungus agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a chronic

systemic disease prevalent in Latin American. To date, there is no effective vaccine. The

potential of gamma radiation for pathogens attenuation and vaccine development was

explored in this work. In our laboratory were developed yeast cells of P. brasiliensis

attenuated by gamma radiation, which lose the reproductive ability, while retaining the

morphology, the synthesis and secretion of proteins, the oxidative metabolism and the

expression of the antigens present in the native yeast. The aim of the present work was to

evaluate the protection elicited by the immunization with this cells in animal model. The

virulence attenuated was evaluated in BALB/c and Nude-Nude mice. The protector effect

was evaluated in BALB/c mice groups immunized once or twice. Each group was divided

in three sub groups that were challenge 30, 45 or 60 days after the immunization. The mice

were sacrificed 30 and 90 days after challenge. The removed organs were used for colony-

forming units (CFU’s) recover, histopathological analysis and cytokine determination. The

sera were collected weekly to evaluate the IgG antibody titers and the IgG1 and IgG2a

pattern in the course of infection. To evaluate the type of elicited immune response the

cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-10 and IL-5 were determined by real time PCR. The

radioattenuated yeast loses its virulence since fails in producing infection in BALB/c and

Nude-Nude mice. No CFU’s were recovered neither histological changes observed in the

mice infected with the radioattenuated cells. The mice infected with the not irradiated P.

brasiliensis showed a high level of antibody production while the infection with the

radioattenuated yeast did not significantly change the antibody level. The mice infected

with the radioattenuated yeast presented an increase in the IFN-γ and TNF-α production

and an inhibition of the IL-10 synthesis, indicating a stimulation of the cellular response.

The protection assay performed with mice immunized once showed a significant reduction

in the CFU’s recovery evaluated 30 days after the challenge. However, when examined 90

days after the challenge the CFU’s recovered from organs increased. Even so a significant

degree of protection has been reached these results point that only one immunization was

not enough to confer a long lasting protection, since some focus of the fungi were not

eliminated. An efficient protection against highly infective forms of P. brasiliensis was

developed in the mice group immunized twice. The immunization was able to reduce the

initial infection and elicited a long lasting protection. A 99,5 % protection was obtained in

the mice analyzed 90 days post challenge. At the same time the levels of IFN-γ�DQG�71)�.increased significantly while the IL-10 and IL-5 decreased. When analyzed after 30 days,

the mice had not developed a totally polarized pattern of Th1/Th2 response but, a trend to a

Th1 response was evident after 90 days. The level of IgG increased in both immunized

groups after the challenge. We concluded that the immunization with the radioattenuated

yeast cells was able to elicit a long lasting protective immune response and these cells are

valuable tool for protective immunity studies and vaccine research for PCM.

Key Words: Paracoccidioides brasiliensis; Paracoccidioidomycosis; gamma irradiation;

protection; vaccine.

SUMÁRIO Pág.

RESUMO VIII

ABSTRACT X

LISTA DE FIGURAS XV

LISTA DE GRÁFICOS XVI

LISTA DE TABELAS XVIII

LISTA DE ABREVIATURAS XIX

I – INTRODUÇÃO 22

I.1 – Paracoccidioidomicose: Um Breve Histórico 23

I.2 – Epidemiologia 24

I.3 – Paracoccidioides brasiliensis 25

I.4 – Fatores de virulência envolvidos no estabelecimento da PCM 27

I.5 – Patologia da PCM 29

I.6 – Mecanismos de defesa do organismo contra a PCM

I.6.1 - Imunidade Inata

I.6.1.1 - Neutrófilos e Macrófagos

I.6.1.2 - Células Natural Killer

I.6.1.3 - Sistema Complemento

I.6.2 - Imunidade Humoral

I.6.3 - Imunidade Celular

31

31

31

32

32

33

34

I.7 – Reação granulomatosa 35

I.8 – Diagnóstico 36

I.9 – Tratamento 38

II – JUSTIFICATIVA 40

III – OBJETIVO

III.1 - Objetivo geral

III.2 - Objetivos específicos

44

45

45

IV – METODOLOGIA 46

IV.1 - Camundongos 47

IV.2 - Microrganismos 47

IV.3 – Avaliação da viabilidade celular 48

IV.4 - Recuperação da virulência do P. brasiliensis 48

IV.5 - Preparação do exoantígeno Mexo 49

IV.6 - Dosagem de proteínas - Método de Bradford 49

IV.7 - Infecção e imunização experimental nos camundongos utilizados nos ensaios

de virulência e proteção

50

IV.8 - Ensaio de virulência 50

IV.9 - Ensaio de proteção em PCM experimental 51

IV.10 - Recuperação de UFCs 53

IV.11 - Histologia 53

IV.12 - Obtenção dos soros de camundongos 53

IV.13 - Ensaio de ELISA 54

IV.14 - Análise do perfil de citocinas

IV.14.1 - Extração do RNA total

IV.14.2 - Síntese de cDNA por transcriptase reversa

IV.14.3 - PCR em tempo real

55

55

55

55

IV.15 - Análise estatística 57

V – RESULTADOS 58

V.1 - Avaliação da virulência 59

V.1.1 - Recuperação de UFCs 59

V.1.2 - Análises histopatológicas dos órgãos de camundongos infectados 61

V.1.3 - Reatividade de IgG anti-Mexo induzida pelo P. brasiliensis não irradiado e e

radioatenuado

65

V.1.4 - Perfil da produção de IgG anti-Mexo nos soros de camundongos

BALB/c induzidos pelo P. brasiliensis radioatenuado e não irradiado

67

V.1.5 - Perfil de imunoglobulinas IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros de

camundongos BALB/c induzidos pelo P. brasiliensis radioatenuado e não irradiado

69

V.1.6 - Dosagem de citocinas por PCR em tempo real 72

V.2 - Avaliação da atividade protetora 78

V.2.1 - Recuperação de UFCs 78

V.2.2 - Análise histopatológica dos órgãos de camundongos imunizados 85

V.2.3 - Produção de IgG anti–Mexo nos soros dos camundongos BALB/c

imunizados e desafiados

93

V.2.4 - Perfil de imunoglobulinas IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros de

camundongos BALB/c imunizados

96

V.2.5 - Dosagem de citocinas por PCR em tempo real nos camundongos imunizados

duas vezes

100

VI – DISCUSSÃO 105

VII – CONCLUSÃO 117

VIII – PERSPECTIVAS 120

IX - REFERÊNCIA 122

X - ANEXOS 139

X.1 - Certificado do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG) 140

X.2 - Trabalho aceito para publicação 141

XV

LISTA DE FIGURAS Pág.

FIGURA 1: Micélio filamentoso do P. brasiliensis. 27

FIGURA 2: Células leveduriformes multinucleadas do P. brasiliensis. 27

FIGURA 3: Histopatologia representativa das lesões causadas pelo P. brasiliensis

não irradiado (G1) nos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos camundongos BALB/c.

63

FIGURA 4: Histopatologia representativa dos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos

camundongos BALB/c infectados com o P. brasiliensis radioatenuado e não

infectados.

64


camundongos BALB/c, imunizados uma única vez (subgrupo G3A), removidos 30

e 90 dias após infecção desafio.

89


camundongos BALB/c, imunizados uma única vez (subgrupo G3C), removidos 30

e 90 dias após infecção desafio.

90


camundongos BALB/c, imunizados duas vezes (subgrupo G4A), removidos após

as infecções desafio com o P. brasiliensis não irradiado.

91


camundongos BALB/c, imunizados duas vezes (subgrupo G4C), removidos 30

dias após o desafio.

92

XVI

LISTA DE GRÁFICOS Pág.

GRÁFICO 1: Reatividade de IgG presente nos soros dos camundongos BALB/c

frente ao antígeno Mexo.

66

GRÁFICO 2: Perfil de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c. 68

GRÁFICO 3: Perfil de IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros dos camundongos

BALB/c infectados com P. brasiliensis não irradiado.

70


BALB/c infectados com P. brasiliensis radioatenuado.

71

GRÁFICO 5: Quantificação por PCR em tempo real de IFN-γ no pulmão dos

camundongos BALB/c.

73

GRÁFICO 6: Quantificação por PCR em tempo real de TNF-α no pulmão dos

camundongos BALB/c.

74

GRÁFICO 7: Quantificação por PCR em tempo real de IL–10 no pulmão dos

camundongos BALB/c.

75

GRÁFICO 8: Quantificação por PCR em tempo real de IL–5 no pulmão dos

camundongos BALB/c.

76

GRÁFICO 9: Recuperação de UFCs verificada após 30 dias nos órgãos do

camundongo BALB/c imunizados uma única vez com a levedura radioatenuada de

P. brasiliensis.

80


camundongo BALB/c imunizados uma única vez com a levedura radioatenuada de

P. brasiliensis.

81


camundongo BALB/c imunizados duas vezes com a levedura radioatenuada de P.

brasiliensis.

82


camundongo BALB/c imunizados duas vezes com a levedura radioatenuada de P.

brasiliensis.

83

GRÁFICO 13: Perfil de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c

imunizados uma única vez com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados 30, 45 e

60 dias após a imunização.

94

XVII

GRÁFICO 14: Perfil de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c

imunizados duas vezes com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados 30, 45 e 60

dias após a imunização.

95


BALB/c imunizados uma única vez com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados

com o fungo não irradiado 30, 45 e 60 dias após imunização.

97


BALB/c imunizados duas vezes com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados com

o fungo não irradiado 30, 45 e 60 dias após imunização.

99

GRÁFICO 17: Quantificação por PCR em tempo real IFN-γ no pulmão dos

camundongos BALB/c imunizados duas vezes.

101

GRÁFICO 18: Quantificação por PCR em tempo real de TNF-α no pulmão dos


102

GRÁFICO 19: Quantificação por PCR em tempo real de IL-10 no pulmão dos


103

GRÁFICO 20: Quantificação por PCR em tempo real de IL-5 no pulmão dos


104

XVIII

LISTA DE TABELAS Pág.

TABELA 1 : Unidade formadora de colônia (UFCs) recuperadas dos tecidos de

camundongos BALB/c após 30 dias de infecção com P. brasiliensis não irradiado

(G1) e radioatenuado (G2) e dos camundongos Nude–Nude infectados com a

levedura radioatenuada

60

TABELA 2 : Unidade formadora de colônia (UFCs) recuperadas dos tecidos de

camundongos machos BALB/c após 90 dias de infecção com P. brasiliensis não

irradiado (G1) e radioatenuado (G2)

60

TABELA 3: Número de granulomas encontrados, nos cortes histológicos dos

órgãos (pulmão, baço e fígado) de camundongos BALB/c, 30 e 90 dias após a

infecção com P. brasiliensis não irradiado e radioatenuado

62

TABELA 4: Proteção obtida pelas imunizações com a levedura radioatenuada de P.

brasiliensis

84


órgãos (pulmão, baço e fígado) de camundongos BALB/c imunizados uma única

vez, 30 e 90 dias após a infecção desafio com P. brasiliensis não irradiado (G1)

87


órgãos (pulmão, baço e fígado) de camundongos BALB/c imunizados duas vezes

consecutivas, 30 e 90 dias após a infecção desafio com P. brasiliensis não irradiado

88

LISTA DE QUADROS Pág.

QUADRO 1: Grupos experimentais utilizados no ensaio de virulência 51

QUADRO 2: Grupos experimentais utilizados no ensaio de proteção 52

INTRODUÇÃO

XIX

LISTA DE ABREVIATURAS

Abs. Absorbância

BHI "Brain heart infusion" - Infuso cérebro coração

BSA “Bovine seric albumin” - Albumina sérica bovina

CD(4/8)++ “cluster of differentiation” – Grupo de diferenciação

cDNA DNA complementar

CDTN Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear

CETEA Comitê de ética em pesquisa animal

Co Cobalto

Ct “Threshold cycle” – Ciclo limiar

DNA Ácido Desoxirribonucléico

D.O Densidade ótica

DTH “delayed-type hipersensitivity” - Hipersensibilidade do tipo tardia

EDTA "Ethylenediaminetetraacetic Acid" - Ácido etilenodiamino tetra-acético

MEC Matriz extracelular

ELISA “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” - Ensaio imunoenzimático

gp43 Glicoproteína de 43 kDa

H2O2 Água oxigenada

HCl Ácido Clorídrico

GAPDH Gliceraldeído -3-fosfato-desidrogenase

IFN-γγ Interferon gama

IgG Imunoglobulinas gama

IgG1 Imunoglobulina gama 1

IgG2a Imunoglobulina gama 2a

IgG2b Imunoglobulina gama 2b

IgG3 Imunoglobulina gama 3

IgA Imunoglobulina alfa

IgE Imunoglobulina E

IgM Imunoglobulina M

INTRODUÇÃO

XX

IL Interleucina

IL-2 Interleucina 2

IL-4 Interleucina 4

IL-5 Interleucina 5

IL-6 Interleucina 6

IL-10 Interleucina 10

kGy Kilo Gray

KDa Kilo Dalton

LIG Laboratório de irradiação gama

Min minuto

MEXO Antígenos de membrana e secretados

NK “Natural killer cells”- Célula matadora natural

NO Óxido nítrico

NaOH Hidróxido de sódio

NCM Membrana de Nitrocelulose

OPD Ortofenilenodiamino

Pb Paracoccidioides brasiliensis

Pb 18 Amostra de P. brasiliensis de um isolado virulento humano

PbAg Antígeno somático das leveduras do P. brasiliensis

PBMC “peripheral Blood mononuclear cells” – Células mononucleares do sangue

periférico

PBS “Phosphate buffer solution” – Tampão fosfato

PBS-C “Phosphate buffer solution”- caseina – Tampão fosfato - caseína

PCM Paracoccidioidomicose

PMSF “Phenylmethylsulphonylfluoride"

q.s.p quantidade suficiente para

RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro

r.p.m Rotação por minuto

SDS Dodecilsulfato de Sódio

INTRODUÇÃO

XXI

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de duodecilsulfato de

sódio

TEMED N, N, N’, N’- tetrametiletilenodiamino

7*)�� “Transforming growth factor beta” – Fator beta de crescimento e

transformação

TH Células T auxiliares

Th1 Células T auxiliares do tipo 1

Th2 Células T auxiliares do tipo 2

TNF-αα Fator de necrose tumoral alfa

UFCs Unidades formadoras de colônia

YPD “Yeast peptone D-glucose” – Extrato de Levedura

INTRODUÇÃO

22

I – INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO

23

I.1 - Paracoccidioidomicose: Um Breve Histórico

A paracoccidioidomicose (PCM), ou blastomicose sul americana, é uma infecção

fúngica granulomatosa e sistêmica causada pelo Paracoccidioides brasiliensis (Almeida,

1930).

A descrição inicial da PCM e do seu agente etiológico foi realizada em 1908, na cidade

de São Paulo, Brasil, por Adolf Lutz.

Em 1912 Afonso Splendore cultivou o fungo e a partir de estudos micológicos e

histológicos, associados aos novos dados clínicos sobre a doença, o caracterizou

morfológica e biologicamente.

Floriano Paulo de Almeida (1930), em estudo comparativo, demonstrou a diferença

entre a paracoccidioidomicose e a coccidioidomicose, estabelecendo um novo gênero

dentro do reino dos fungos, Paracoccidioides. O agente etiológico da PCM foi então

denominado como P. brasiliensis de acordo com as regras de nomenclatura de Linneu.

Essa micose profunda recebeu várias denominações (blastomicose brasileira,

blastomicose sul-americana, granuloma paracoccidióidico, granulomatose

paracoccidióidica, granuloma ganglionar maligno de origem blastomicética, adenomicose,

doença de Lutz, doença de Lutz Splendore-Almeida), porém a expressão

paracoccidioidomicose foi oficialmente consagrada em 1971, em Medellin (Colômbia).

Segundo Coutinho (2002), a doença pode ser considerada um problema de saúde

pública no Brasil devido à taxa de mortalidade média anual de 1,45/milhão de habitantes e

a distribuição espacial não homogênea entre as diferentes regiões e estados. Além disso,

sua importância em saúde coletiva relaciona-se aos custos sociais e econômicos derivados,

não apenas da doença em atividade, que ocorre em indivíduos na sua fase mais produtiva de

vida, mas também das freqüentes seqüelas secundárias a essa micose, motivo comum da

INTRODUÇÃO

24

incapacitação para o trabalho. Neste contexto, justificam-se os esforços científicos

realizados a fim de se conhecer o micro habitat exato do P. brasiliensis, o modo de viver

saprofítico na natureza e a relação do fungo com o seu ambiente e com seu hospedeiro, bem

como as respostas imunológicas e as alterações fisiológicas desencadeadas durante a

doença (Restrepo, 1985a). Essas questões são importantes e, até que elas se esclareçam, a

prevenção da paracoccidioidomicose continuará sendo uma tarefa difícil.

I.2 - Epidemiologia

A Paracoccidioidomicose é uma micose profunda, de distribuição geográfica restrita

aos países latino - americanos situados entre 23º ao norte e 35º ao sul do Equador; desde o

México até a Argentina. Entretanto, esta micose não apresenta distribuição uniforme por

todo o continente, restringindo-se apenas a alguns países (Restrepo, 1985a).

Os países com alta endemicidade situam-se em regiões conhecidas como reserváreas,

com temperaturas médias entre 10 – 28ºC, umidade relativa alta e pluviosidade anual entre

800 a 2000mm/ano (Londero & Melo, 1988) com inverno curto e verão chuvoso (Restrepo,

1985a). São áreas com altitude entre 50 e 1700m, solo geralmente ácido, presença de rios e

de florestas tropicais e subtropicais ou de transição para o cerrado (Lacaz et al., 1994a).

Por não ser de notificação compulsória, não é possível estabelecer com exatidão a

prevalência e incidência da doença (Lacaz, 1982), sendo estimadas a partir de casuísticas já

publicadas e da estatística de hospitais universitários (Lacaz, 1956). A partir desses dados,

verifica-se que a micose, na sua forma ativa e progressiva, tem incidência maior no Brasil,

Venezuela, Colômbia (Restrepo, 1985a) e Guatemala (Lacaz, 1982). Segundo Restrepo e

colaboradores (2001), entre 90 milhões de habitantes residentes em áreas endêmicas da

INTRODUÇÃO

25

América Latina, aproximadamente 10 milhões poderiam estar infectados com P.

brasiliensis.

O Brasil apresenta o maior número de casos já relatados mundialmente (Retrepo,

1985a), sendo São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul, Goiás e

Mato Grosso do Sul os estados mais acometidos (Wanke & Londero, 1994). Destes

estados, São Paulo é o que possui o maior número de casos. Os casos de PCM relatados em

regiões não endêmicas são referentes aos pacientes que já haviam residido ou visitado áreas

endêmicas da micose (Greer & Restrepo, 1977; Ajello & Polonelli, 1985).

A Paracoccidioidomicose ocorre, principalmente, entre os trabalhadores rurais de todas

as faixas etárias, sendo mais freqüente em indivíduos com idade entre 30 e 60 anos (Franco

et al., 1989).

Durante a infância e puberdade, a incidência da moléstia é igual em ambos os sexos;

entretanto, na idade adulta, apesar de ambos os sexos expostos ao fungo poderem adquirir

uma infecção subclínica, a evolução ocorre com maior freqüência nos homens. Acredita-se

que este fato se deve a proteção conferida pelo estrógeno à mulher adulta; além de sua

menor exposição ao microambiente do P. brasiliensis (Restrepo et al.,1984).

I.3 - Paracoccidioides brasiliensis

P. brasiliensis é um fungo assexuado, termodimórfico causador da

paracoccidioidomicose (Almeida, 1930).

O habitat natural do P. brasiliensis ainda não está bem estabelecido, mas acredita-se

que o fungo viva, saprofiticamente, a temperatura ambiente (25ºC), sob a forma micelial

em solo úmido e ácido com vegetação abundante e clima temperado. No hospedeiro, a

INTRODUÇÃO

26

37ºC, adquire a forma leveduriforme, sendo este processo reversível (Tonelli & Freire,

2000).

Este fungo já foi isolado em solos de matas usadas para o plantio de café em áreas

endêmicas como o Brasil, Argentina e Venezuela, e tem sido isolado de tatus que vivem em

áreas de alta incidência da doença (Bagagli et al., 1998; Silva Vergara et al., 2000). Além

disso, a PCM infecção foi recentemente detectada em exames histopatológicos e

sorológicos de cadelas adultas da raça Doberman (Ricci et al., 2004; Farias et al., 2005).

No solo e em detritos vegetais, o fungo sob condições de stress celular, principalmente

devido à privação nutricional, produz conídeas que, quando separados do micélio parental,

exibem dimorfismo dependendo da temperatura em que se encontram (Bustamante-Simon

et al., 1985; Restrepo et al., 1986; Restrepo et al., 1988).

No hospedeiro infectado ou em meio de cultura enriquecido com nutrientes são

encontradas leveduras arredondadas, com 5 a 25 µm de diâmetro, dupla parede refringente,

com ou sem gemulação, isoladas ou agrupadas ao redor da célula mãe (Figura 2). Esta

esporulação múltipla que caracteriza o P. brasiliensis em sua vida parasitária, se assemelha

ao aspecto típico de “roda de leme”. A 25ºC, o fungo apresenta-se sob a forma de micélio

filamentoso do tipo conídeas intercalares, pedunculado e com hifas terminais ou

artroconídeos septatos em dimensões que possibilitam sua chegada ao alvéolo pulmonar

(Figura 1). As conídeas, células uninucleadas, quando incubadas à 37ºC transformam – se

em células leveduriformes multinucleadas (Tonelli & Freire, 2000).

INTRODUÇÃO

27

O P. brasiliensis sintetiza um complexo de substâncias antigênicas (polissacarídeos,

peptídeos e lipídeos) que interagem com o sistema imune do hospedeiro. Vários desses

componentes estão localizados na parede do fungo (antígenos de superfície), enquanto

outros são sintetizados e liberados pelo fungo no meio (exoantígenos). Há ainda os

antígenos somáticos ou celulares que são obtidos de células lisadas intra e

extracelularmente (Franco, 1986; Diniz et al.,2001; Reis et al., 2005).

I.4 – Fatores de virulência envolvidos no estabelecimento da PCM

Muitos fatores de virulência, associados tanto ao agente quanto ao hospedeiro, estão

envolvidos no estabelecimento da infecção ou doença causada pelo P. brasiliensis. Entre os

principais fatores podemos destacar os efeitos hormonais, os constituintes da parede celular

(α-(1,3)-glucana e β-(1,3)-glucana) e as glicoproteínas gp43, GAPDH e serina – tiol (San

Blas & San Blas 1993; Hogan et al., 1996; Puccia et al., 1999).

Durante a fase da puberdade, onde há imaturidade sexual, a doença é equivalente

em ambos os sexos (Franco, 1986). Porém, na fase adulta, a paracoccidioidomicose é mais

FIGURA.2: Células leveduriformesmultinucleadas do P. brasiliensis –Fonte: Demicheli et al., 2007.

FIGURA.1: Micélio filamentoso do P.

brasiliensis - Fonte: http:/mycology.ivic.ve/weobjetivos.html

INTRODUÇÃO

28

freqüente no sexo masculino. A resistência das mulheres à doença parece estar relacionada

a fatores hormonais (Brummer et al., 1990). Hormônios femininos, como o estrógeno 17 -

β - estradiol (E2), se ligam com alta afinidade e especificidade às proteínas citosólicas do

P. brasiliensis inibindo a transformação do micélio em levedura (Hogan et al., 1996;

Restrepo et al., 1988)

A variação morfológica do P. brasiliensis, dependente da temperatura, é

acompanhada da variação na proporção e no arranjo espacial entre os polissacarídeos (α-

(1,3)-glucana e β-(1,3)-glucana) presentes em sua parede celular (Restrepo et al., 1984; San

Blas et al., 1987). Na forma saprofítica do fungo, a parede celular possui principalmente o

polímero de glicose β-(1,3)-glucana, enquanto que na sua forma parasitária há uma

predominância de α-(1,3)-glucana (San Blas et al.,1977; Franco, 1986; Hogan et al., 1996).

Segundo San-Blas & San Blas (1982) a existência de grande quantidade de α-(1,3)-glucana

na parede celular está associada com a virulência do fungo, a qual é atenuada quando o

microrganismo é subcultivado por um longo período de tempo. Por outro lado, a passagem

da amostra atenuada em animais ou o seu cultivo em meio suplementado com soro fetal

bovino restabelece os níveis de α-(1,3)-glucana e o fungo readquire sua virulência inicial

(Franco, 1986). A glicoproteína β-(1,3)-glucana, presente em maior proporção em amostras

de baixa virulência como a P265, é capaz de induzir uma reação inflamatória

granulomatosa maior do que as amostras virulentas (Figueiredo et al., 1993; Silva et al.,

1994).

A adesão de microrganismos patogênicos às células do hospedeiro e à superfície da

mucosa é outro passo fundamental no estabelecimento da infecção (Vicentini et al., 1994).

Os componentes da membrana basal da matriz extracelular (MEC) de tecidos de

INTRODUÇÃO

29

mamíferos, tais como laminina, fibronectinas e colágeno têm sido identificados como alvos

para adesão do P. brasiliensis (Mendes-Giannini et al., 2000). A glicoproteína de superfície

celular (gp43), principal antígeno secretado pelo fungo, é uma molécula mediadora na

ligação do fungo à laminina (Vicentini et al., 1994). Essa interação entre os receptores

específicos localizados na membrana das células do hospedeiro e seu ligante complementar

presente na superfície do microrganismo favorece a adesão e invasão de macrófagos pelo P.

brasiliensis, bem como estimula a sua replicação e disseminação nos tecidos (Franco, 1986;

Vicentini et al., 1994). Além disso, de acordo com Popi e colaboradores (2002), a gp43

inibe, in vitro, a fagocitose do fungo pela não ativação dos macrófagos peritoneais de

camundongos e a liberação de NO e H2O2. Desta forma, acredita-se que esta glicoproteína

media um mecanismo de escape do fungo, pois facilita o estabelecimento e

desencadeamento de infecção primária em hospedeiros susceptíveis (Popi et al., 2002).

Recentemente, Barbosa e colaboradores (2005) demonstraram que a proteína

GAPDH, expressa pelo P. brasiliensis, também é capaz de se ligar à componentes da

matriz extracelular mediando o processo de aderência e internalização do fungo.

A protease extracelular produzida pelo P. brasiliensis, serina – tiol, é mais um

provável fator de virulência que pode hidrolizar componentes da membrana basal, como a

fibronectina, laminina, colágeno IV e proteoglicanas (Carmona et al., 1995; Puccia et al.,

1998; Puccia et al., 1999). Esta atividade enzimática, em colaboração com a gp43 e

GAPDH, poderia aumentar a capacidade de disseminação do fungo (Soares et al., 1998).

I.5 - Patologia da PCM

A infecção é adquirida pela inalação das conídeas infectantes presentes no meio

ambiente. Estes propágulos, devido às suas dimensões pequenas, alcançam os alvéolos

INTRODUÇÃO

30

pulmonares e transformam - se em células leveduriformes, estabelecendo assim o complexo

primário da infecção (McEwen et al., 1987).

O foco primário geralmente é assintomático podendo regredir espontaneamente com a

destruição do fungo e formação de cicatrizes estéreis. Eventualmente pode desenvolver a

doença ativa e causar lesões pulmonares localizadas ou benignas com subsequente

disseminação para outros órgãos e tecidos com estabelecimento de foco de latência após a

involução das lesões primárias (Bazan et al., 1991). Este quadro assintomático e as várias

manifestações clínicas da doença – aguda e crônica - são dependentes tanto das condições

genéticas, imunológicas, ocupacionais e sócio econômicas em que o hospedeiro se encontra

quanto da virulência das amostras de P. brasiliensis (Tonelli & Freire, 2000).

Clinicamente, a PCM pode se manifestar sob duas formas distintas, a forma juvenil

aguda (subaguda) e a forma crônica (adulta).

A forma aguda ou subaguda ocorre em menos de 10% dos casos de

paracoccidioidomicose. A maioria dos doentes são crianças e adolescentes de ambos os

sexos, e ocasionalmente pode ocorrer em adultos jovens. Há uma progressão rápida do

fungo com o acometimento do sistema reticuloendotelial (linfonodos, baço, fígado e

medula óssea) (Tonelli & Freire, 2000) conduzindo a um grave comprometimento da

imunidade celular, diminuição dos linfócitos T e a presença de altos níveis de anticorpos

específicos (Calich et al.,1998).

Já a forma crônica corresponde a mais de 90% dos casos diagnosticados, sendo mais

freqüente em adultos do sexo masculino com idade entre 30 e 50 anos (Tonelli & Freire,

2000). Geralmente os casos são provenientes de recidivas do foco primário pulmonar

quiescente por longo período de tempo (Bazan et al., 1991).

INTRODUÇÃO

31

I.6 - Mecanismos de defesa do organismo contra a PCM

Tanto a resposta imune humoral quanto a mediada por células representam um

importante papel nos mecanismos de defesa do hospedeiro contra o P. brasiliensis. No

entanto, esses mecanismos dependem largamente da imunidade inata e da ativação de

células T helper (TH) no controle inicial da infecção (Yoneto et al., 1999).

Como dito anteriormente, a doença apresenta um amplo espectro de manifestações

imunológicas e clínicas, que varia desde as formas benignas até as mais graves dependendo

da resistência do indivíduo (Pina et al., 2004). Entre os pacientes com PCM, os altos níveis

de anticorpos específicos, a ativação policlonal e a resposta imune celular deprimida estão

associados com as formas mais graves da doença, enquanto que a imunidade mediada por

células está fortemente envolvida na resistência ao fungo (Cano et al., 1998; Calich, 1998).

I.6.1 - Imunidade Inata

I.6.1.1 - Neutrófilos e Macrófagos

A fagocitose, realizada por neutrófilos e macrófagos, é considerada um importante

mecanismo efetor no controle da PCM. Quando o P. brasiliensis alcança os alvéolos

pulmonares, há inicialmente uma interação com os macrófagos alveolares com posterior

indução de compostos quimiotáticos, os quais estimulam a migração de neutrófilos em

direção ao local de liberação desses mediadores, fortalecendo com isso os mecanismos de

defesa do organismo (Franco, 1986). Em pacientes com as formas disseminadas e nos

infectados com as amostras mais virulentas do fungo, os neutrófilos fagocitam

normalmente, porém apresentam deficiência na digestão do microrganismo (Franco, 1986).

Entretanto, os neutrófilos contribuem para a morte do fungo através da liberação de

metabólitos de oxigênio e degranulação após a ligação do fungo à sua superfície (Dias et

al., 2005).

INTRODUÇÃO

32

Em macrófagos não ativados, foi demonstrado que há multiplicação dos fungos

internalizados, porém estas células quando ativadas pelo IFN - �� DSUHVHQWDP� XPDhabilidade fungicida importante na proteção contra a infecção (Cano et al., 1998; Popi et

al., 2002). Além disso, estas células ativadas produzem espécies reativas de nitrogênio

(NOs) que inibem o dimorfismo do fungo auxiliando no controle da infecção (Gonzalez et

al.,� �� 7DQWR� R� ,)1� �� TXDQWR� R� 71)� �� .� FRQIHUHP� UHVLVWência ao indivíduo pela

formação de granulomas e produção de NO (Soares et al., 2001).

I.6.1.2 - Células Natural Killer

As células Natural Killer (NK) limitam o crescimento em cultura do P. brasiliensis

(Franco, 1986). Entretanto, apesar destas células terem se mostrado importantes no

desencadeamento de resposta imune inata contra uma variedade de patógenos, devido a sua

atividade citotóxica e produção de citocinas (especialmente IFN - ��Yoneto et al., 1999),

em pacientes com PCM, foi observada uma atividade reduzida destas células em relação a

dos indivíduos normais (Peraçoli et al., 2003).

Estes dados sugerem que as células NK não exercem um papel crucial contra o P.

brasiliensis, sendo incapazes de controlar a sua disseminação após infecção inicial

(Peraçoli et al., 2003).

I.6.1.3 - Sistema Complemento

O sistema complemento pode ser ativado pelo P. brasiliensis, o qual desencadeia uma

fagocitose mais eficiente pelos macrófagos devido à atuação dos componentes do

complemento na opsonização do microrganismo (Calich et al., 1985). Entretanto, Burger e

colaboradores (1985) sugeriram que a presença do componente do complemento C5 não

está associada a proteção contra a doença, uma vez que as linhagens de camundongos

INTRODUÇÃO

33

isogênicos, com e sem deficiência de C5, exibiram a mesma suscetibilidade à infecção

experimental com o fungo patogênico.

I.6.2 - Imunidade Humoral

Como relatado anteriormente, é importante considerar a resposta imune humoral

envolvida na proteção contra o P. brasiliensis. Os anticorpos contribuem para a proteção do

hospedeiro contra o microrganismo que se encontra extracelularmente, através de

mecanismos tais como opsonização, ativação do sistema complemento, neutralização de

toxinas e inibição da aderência do fungo à célula do hospedeiro. Intracelularmente, o agente

infeccioso produz estímulos antigênicos capazes de induzir a produção específica de

anticorpos anti - P. brasiliensis (Restrepo, 1975; Restrepo, 1982). Este fato é observado na

paracoccidioidomicose, onde os altos níveis de anticorpos específicos estão associados com

as formas mais severas da doença (Calich,1998). A análise dos títulos de anticorpos em

soros de pacientes é utilizada para auxiliar no diagnóstico, acompanhamento da evolução

da doença e resposta ao tratamento da PCM (Franco,1986).

Todas as classes de imunoglobulinas podem ser detectadas em pacientes infectados,

com predomínio da classe IgG. Há uma ativação policlonal com aumento nos níveis de

IgG, IgA e IgE, que provavelmente atuam na opsonização do agente infeccioso juntamente

com os componentes do complemento (Calich,1985). Os níveis de IgG e IgE aumentam

com a disseminação da doença e severidade de suas formas clínicas (Franco,1986), sendo

que na fase crônica localizada, seus níveis são baixos. Os níveis de IgA mostraram – se

elevados principalmente na fase crônica e os níveis de IgM se mantiveram dentro dos

limites normais em todas as fases da PCM (Baida et al., 1999).

INTRODUÇÃO

34

I.6.3 - Imunidade Celular

A imunidade celular é considerada o principal mecanismo de defesa contra o P.

brasiliensis (Franco, 1986; Cano et al., 1998; Souto et al., 2000). A importância dos

linfócitos T na doença foi demonstrada em estudos utilizando – se camundongos atímicos,

Nude (Nu/Nu), que são desprovidos de timo e, portanto deficientes de imunidade mediada

por células T (Kerr et al., 1988; Burger et al., 1996). Segundo Burger e colaboradores

(1996), estes animais desenvolveram infecção severa e generalizada com intenso

parasitismo e apresentaram sobrevida menor do que os normais. Entretanto, os animais

conservaram a habilidade de controlar a disseminação fúngica durante as fases iniciais da

infecção (Calich et al., 1998). Estes fatos demonstram a importância dos linfócitos T e da

imunidade inata no estabelecimento da imunidade protetora contra a infecção por P.

brasiliensis (Calich et al., 1998).

Como em várias doenças crônicas, os fatores responsáveis pela depressão da imunidade

celular estão presentes na paracoccidioidomicose. A natureza destes fatores inibitórios

ainda não está bem elucidada, mas acredita-se que anticorpos específicos, complexos

imunes, produtos do próprio fungo e outras substâncias podem exercer um efeito

imunossupressor (Franco,1986).

Os linfócitos T podem se diferenciar em linfócito T citotóxico e linfócito T auxiliar

(Th1 e Th2). Segundo Calich e colaboradores (1998), a resistência à PCM está associada a

ativação progressiva e equilibrada de células T CD4+ do tipo Th1, enquanto que a

susceptibilidade refere-se a ativação precoce e intensa de células CD4+ do tipo Th2 e CD8+.

Os linfócitos do tipo Th1 e Th2, apesar de não serem distinguidos fenotipicamente ,

apresentam diferenças quanto ao tipo de resposta imunológica desencadeada e o padrão e

citocinas liberadas (Calich & Kashino, 1998). Apesar de não haver um padrão de resposta

INTRODUÇÃO

35

imune Th1/Th2 totalmente polarizado (Calich, 1998) os linfócitos do tipo Th1 produzem

FLWRFLQDV�,/��,)1��H�71)��.�H�HVWLPXODP�D�UHVSRVWD�LPXQH�FHOXODU��HQTXDQWR�R�WLSRTh2 favorece a produção de IL - 4, IL - 5, IL – 6 e IL - 10 e desencadeiam a imunidade

humoral (Arruda et al., 2004; Pina et al., 2004). As células TCD8+ são necessárias para a

remoção eficiente de fungos dos tecidos de camundongos infectados com P. brasiliensis,

pois possuem uma atividade protetora precoce e eficaz na resposta imune desencadeada

pelos animais suscetíveis (Calich et al., 1998; Cano et al., 2000).

I.7 – Reação granulomatosa

A resposta tecidual do hospedeiro ao P. brasiliensis é caracterizada pela reação de

hipersensibilidade do tipo granulomatosa, com participação ativa de células T, atuando no

recrutamento e na ativação dos macrófagos. Evidências diretas e indiretas indicam que o

granuloma esta intimamente relacionado à resposta imune do hospedeiro, podendo

representar uma resposta tecidual imunoespecífica destinada a destruir, bloquear e impedir

a multiplicação do fungo (Franco, 1986).

Os granulomas causados pela reação ao P. brasiliensis são constituídos por macrófagos

e linfócitos, sendo que os primeiros estão localizados na parte central e os últimos na

periferia destes. As células gigantes, formadas a partir da fusão de macrófagos, são

encontrados no interior dos granulomas. As células viáveis do fungo podem ser observadas

no interior das células gigantes ou livres apresentando brotamento simples ou múltiplo

(Franco, 1989).

Os linfócitos T sensibilizados pelos antígenos fúngicos concentram – se no sítio de

interação com o microrganismo. Quando ativados secretam diferentes linfocinas, as quais

atuam na resposta imune celular. Concomitante a secreção, há formação de edema local e

INTRODUÇÃO

36

vasodilatação, ativação de macrófagos, diferenciação e maturação em células epitelioides,

ativação de fibroblatos e aumento na síntese de colágeno (Franco, 1986).

É importante salientar que, em pacientes com a doença benigna, a resposta imune induz

a formação de granulomas compactos e densos com níveis baixos de células fúngicas

enquanto que nos pacientes que desenvolvem a doença severa, há geralmente, a formação

de granulomas frouxos, associados com grandes quantidades de células fúngicas viáveis

(Moscardi-Bacchi et al., 1994).

I.8 - Diagnóstico

O diagnóstico conclusivo da paracoccidioidomicose é obtido laboratorialmente através

da demonstração e do reconhecimento do agente em preparados histológicos, exame a

fresco ou em cultivo. Tais procedimentos são conhecidos como técnicas diretas de

diagnóstico (Londero & Melo, 1998).

A microscopia direta permite a visualização de células leveduriformes arredondadas,

isoladas ou agrupadas, apresentando dupla parede refringente; com brotamentos simples ou

múltiplos (Lacaz, 1994b).

Os exames histológicos revelam formação granulomatosa, com presença de células

epitelióides e células gigantes multinucleadas. Células fúngicas viáveis podem ser

encontradas no interior destas últimas ou livres nos tecidos (Faria, 1971; Bogliolo, 1976).

Nem sempre os procedimentos de observação microscópica e isolamento fúngico são

acessíveis. Neste caso métodos indiretos auxiliam no diagnóstico de pacientes com sinais

ou sintomas clínicos sugestivos da PCM.

INTRODUÇÃO

37

A sorologia permite o acompanhamento do paciente durante e após o tratamento,

através do exame de amostras seriadas do soro (Restrepo, 1984; Mendes et al., 1994;

Marques, 2003).

Vários são os testes sorológicos freqüentemente utilizados para detecção de anticorpos

específicos: imunodifusão dupla (ID), contra – imunoeletroforese (CIE), reação de fixação

de complemento (FC), Imunofluorescência indireta (IF), ensaio imunoenzimático (ELISA)

e immunoblotting (Restrepo, 1992). A técnica de escolha utilizada deve aliar sensibilidade

à especificidade, para que o valor preditivo seja máximo e reproduzível (Marques, 2003).

Os resultados destes testes, no entanto, devem ser criteriosamente interpretados e

correlacionados com os achados clínicos, dados epidemiológicos e outros exames

laboratoriais, para um diagnóstico definitivo (Marques, 2003).

O uso de testes sorológicos na rotina de diagnóstico da paracoccidioidomicose é

limitado devido, principalmente, as dificuldades na obtenção de antígenos purificados do P.

brasiliensis, na padronização dos testes sorológicos e reatividade cruzada (Puccia,1986).

Além disso, tratam – se de técnicas ainda restrita a poucos serviços e mais utilizadas na

área da pesquisa.

A reação intradérmica com a paracoccidioidina é utilizada na determinação de áreas

endêmicas da paracoccidioidomicose através de inquéritos epidemiológicos, não sendo

adequada para diagnosticar a doença (Lacaz, 1956; Fava Netto, 1976). Devido à depressão

da imunidade celular, a reação pode ser negativa nas formas graves da doença enquanto

pode – se observar positivação do teste em grande número de casos tratados com sucesso e

em pacientes sensíveis à paracoccidioidina (Fava Netto et al., 1969). Além disso,

indivíduos não portadores da PCM, que residem ou residiram em zonas endêmicas da

doença, podem desenvolver reação positiva ao antígeno (Lacaz,1951)

INTRODUÇÃO

38

Outros exames complementares como hemograma, dosagem de proteína C reativa e

exame de imagens são utilizados com freqüência para diagnóstico da extensão do

acometimento da micose.

I.9 - Tratamento

A eficácia do tratamento da PCM depende não somente da droga anti-fúngica

escolhida, mas também da implementação de medidas que melhorem as condições gerais

do paciente e do acompanhamento pós terapêutico prolongado, para evitar recidivas da

doença (Veronesi, 1997; Tonelli & Freire, 2000).

O paciente, antes de iniciar a terapêutica anti–fúngica específica, necessita de medidas

para o melhoramento do seu quadro nutricional e da imunodepressão celular associada a

infecção pelo P. brasiliensis. Além disso, devem-se diagnosticar e tratar infecções

concorrentes como enteroparasitoses e co-infecções bacterianas (Marques, 2003).

A escolha da melhor opção terapêutica tem que levar em consideração não apenas a

eficácia e segurança da droga anti-fúngica, mas também o acesso do paciente ao

medicamento durante todo o tratamento. Uma vez que a maioria dos indivíduos acometidos

por esta micose apresenta condição sócio econômica precária e, portanto são incapazes de

custear o tratamento prolongado. Desta forma, a medicação prescrita deve ser

preferencialmente fornecida gratuitamente pelo sistema de saúde público (Veronesi, 1997).

Atualmente, as drogas mais utilizadas no tratamento da PCM pertencem ao grupo dos

sulfanamídicos (Restrepo et al., 1990), dos antibióticos poliênicos, particularmente a

anfotericina B (Lacaz & Sampaio, 1958) e dos derivados de imidazol (Restrepo, 1990).

O tratamento é prolongado e apesar de não haver um consenso quanto a um esquema

terapêutico deve-se considerar os critério de cura (clínico, micológico, radiológico e

INTRODUÇÃO

39

imunológico) e acompanhamento periódico após a interrupção do tratamento para reduzir

as chances de recidivas da doença (Del Negro,1974).

A suspensão precoce do tratamento causa altos índices de reativação da doença e isso

tem feito com que o tratamento seja demorado (em média, de seis meses a dois anos).

Atualmente, sugere-se que o tratamento seja dividido em duas fases: (1) ataque - que visa

ao controle dos sinais clínicos e (2) manutenção - que visa reduzir as chances de recidiva da

\doença (Mendes et al., 1994; Reis & Colombo, 1999).

JUSTIFICATIVA

40

II – JUSTIFICATIVA

JUSTIFICATIVA

41

Até o momento não há vacina efetiva contra a PCM, nem para qualquer outra micose de

importância médica. Apenas uma vacina profilática baseada em esférulas de Coccidioides

immitis inativadas por formalina foi testada em humanos, mas esta não conferiu proteção

em uma triagem randomizada (Pappagianis, 1993; Cole et al., 2004). Dessa forma, torna-se

necessário pesquisar novas alternativas na busca de uma vacina preventiva ou terapêutica

contra a paracoccidioidomicose, tendo em vista as dificuldades encontradas no tratamento

prolongado e nas constantes recidivas da doença.

Muitas vacinas vivas, obtidas a partir de patógenos atenuados, tem sido utilizadas com

sucesso na prevenção de muitas doenças. A grande vantagem atribuída a este tipo de

imunização é devida à capacidade dos microrganismos atenuados de apresentarem seus

antígenos seqüencialmente ao hospedeiro e poderem até mesmo sintetizar antígenos que só

são produzidos durante a infecção. Estes mimetizam a infecção natural sendo capazes de

desencadear uma resposta imune protetora duradoura, devido ao estabelecimento de uma

memória imunológica, mas sem o risco uma infecção progressiva (Hiramoto et al., 2002).

Um exemplo bem sucedido e bastante conhecido é a vacina BCG utilizada na

prevenção da tuberculose. O microrganismo, Mycobacterium bovis, foi atenuado

acidentalmente após o cultivo da bactéria, in vitro, por um período prolongado de 13 anos.

Após sucessivas passagens da amostra em cultura, foi observada perda gradual da

virulência e alterações da sua morfologia sem alteração da sua imunogenicidade. A BCG

tem sido utilizada com êxito sem registros de grandes complicações (Andrade, et al., 2005).

A vacina tríplice viral, constituída de vírus vivos atenuados, contra sarampo, caxumba e

rubéola, também tem se mostrado eficaz desde seu licenciamento no início da década de 70.

Os eventos imediatos de hipersensibilidade após a administração da vacina viva são

extremamente raros, sendo contra - indicada apenas em pessoas com história de reação

JUSTIFICATIVA

42

anafilática após ingestão de ovo ou da neomicina contida na formulação da vacina

(Andrade et al., 2005).

As vacinas utilizando microrganismos vivos atenuados por radiação ionizante têm sido

estudadas desde 1950 (Walles & Kusel, 1992). Porém, a utilização de fungos

radioatenuados nunca foi explorada para este propósito.

As irradiações com raios gama e raios X se apresentaram de forma consistente como

bons agentes de atenuação para uma variedade de patógenos. Os microrganismos

radioatenuados, freqüentemente, perdem a sua capacidade patogênica, mantendo seus

aspectos morfológicos, e estimulam uma resposta imune específica. Em alguns casos os

patógenos atenuados por radiação ionizante, por razões ainda não esclarecidos, são mais

imunogênicos que os controles não irradiados (Walles & Kusel, 1992).

Vacinas radioatenuadas contra o Dictyocaulus viviparus, causador da bronquite

parasitária em bovinos, tem sido utilizadas com êxito desde 1958 (Taylor et al., 1986). Em

adição, larvas irradiadas utilizadas no controle da bronquite parasitária provocada por D.

filaria sp. em carneiros e cabras (Sharma et al.,1988), e na imunização de cães contra

Ancylostoma caninum (Vinayak et al., 1981) têm sido empregadas em escala comercial.

Imunizações efetivas em animais de laboratório têm sido alcançadas utilizando vários

protozoários irradiados, incluindo espécies de Plasmodium (Herrington et al.,1990;

Clyde,1990), Leishmania (Yang et al.,1991; Rivier et al., 1993; Bonetti et al., 1993),

Trypanosoma (Vos & Gardiner, 1990) e Toxoplasma gondii (Duquesne et al.,1991).

Estudos em modelos animais utilizando cercárias radioatenuadas de Schistosoma mansoni

também conferiram alto grau de proteção, contra a esquistossomose (Coulson, 1997).

Em adição, Hiramoto e colaboradores (2002) imunizaram camundongos com

taquizoítos de Toxoplasma gondii atenuados por irradiação. Após a infecção desafio com os

JUSTIFICATIVA

43

cistos do parasita, houve um aumento da sobrevivência dos animais imunizados. Os

taquizoítos irradiados perderam a capacidade de reprodução, mas mantiveram seu

metabolismo respiratório, a capacidade de invadir células e de sintetizar proteínas.

Além dos exemplos citados acima, resultados satisfatórios foram obtidos nos estudos de

muitos helmintos e nematódeos, incluindo Onchocerca volvulus (Prince et al., 1992),

Brugia malayi (Yates & Higashi, 1986), Brugia pahangi (Chusattayanond & Denham,

1986), Toxocara canis (ABO-Shehada et al., 1991), Nippostrongylus brasiliensis

(Wedrychowicz et al., 1984), Trichinella spiralis (Agyei-Frempong & Catty, 1983) e

Ascaris suum (Urban & Tromba, 1982) e várias espécies de Schistosoma (Dean, 1983).

Em humanos, uma vacina obtida a partir de esporozoítos irradiados de Plasmodium

falciparum foi testada em voluntários. Esta foi capaz de estimular uma resposta imune

protetora contra a malária (Hoffman et al., 2002).

Em nosso laboratório desenvolvemos leveduras de P. brasiliensis atenuadas por

irradiação gama. Demonstramos que estas leveduras perderam a capacidade de produzir

infecção e de se multiplicar, porém mantiveram preservadas sua viabilidade, atividade

metabólica e conservaram também a capacidade de sintetizar os mesmos antígenos

presentes nas leveduras nativas (Demicheli et al., 2006). Demostramos ainda que as

leveduras radioatenuadas conservam seus aspectos ultraestruturais fundamentais, embora

uma extensiva degradação do DNA tenha sido verificada (Demicheli et al., 2007). A partir

disso, iniciamos uma nova etapa da nossa pesquisa com o propósito de verificar se as

leveduras radioatenuadas seriam um imunógeno eficaz, capaz de estimular uma reposta

imune protetora contra a PCM em modelos animais.

OBJETIVOS

44

III – OBJETIVO

OBJETIVOS

45

III.1 - Objetivo geral

• Avaliar a capacidade das leveduras radioatenuadas do P. brasiliensis de induzir uma

resposta imune protetora em modelo animal.

III.2 - Objetivos específicos

• Avaliar a perda da virulência da levedura radioatenuada em camundongos susceptíveis

e imunodeficientes.

• Realizar ensaios de proteção, em modelo animal, utilizando as leveduras radioatenuadas

para imunização.

• Avaliar a influência do número de imunizações no estabelecimento da resposta.

• Avaliar a influência do tempo no estabelecimento da resposta imune.

• Avaliar a resposta protetora de curto e longo prazo.

• Analisar a resposta imune humoral induzida pelas leveduras radioatenuadas.

• Analisar a dinâmica da produção dos isotipos de IgG (IgG1 e IgG2a) nos animais

imunizados e infectados.

• Analisar a dinâmica da produção de citocinas IFN - γ, TNF - α, IL - 10 e IL - 5 nos

animais infectados e imunizados.

METODOLOGIA

46

IV – METODOLOGIA

METODOLOGIA

47

IV.1 - Camundongos

Camundongos machos susceptíveis (BALB/c), com 6 a 8 semanas de idade, foram

cedidos pelo centro de bioterismo do ICB/UFMG. Camundongos machos imunodeprimido

(Nude - Nude), também com 6 a 8 semanas de idade, foram cedidos pelo centro de

bioterismo da UFOP. Os animais foram mantidos sob condições livres de patógenos

específicos.

Os protocolos, utilizados neste trabalho para os experimentos realizados com animais,

foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG),

número do protocolo 132/2006 (anexo 1).

IV.2 - Microrganismos

A amostra de P. brasiliensis (Pb18), utilizada na infecção dos camundongos, foi obtida

de um isolado virulento humano e mantida em meio de cultura YPD (extrato de levedura

0,5%, peptona 0,5% e dextrose 1,5%) - ágar, à temperatura de 35ºC, com repiques

semanais.

A cultura de P. brasiliensis, crescida em meio sólido, foi radioatenuada no laboratório

de irradiação gama do CDTN/CNEN, em fonte uniforme de 60Co, na presença de oxigênio

e a temperatura ambiente. A dose utilizada para atenuação do microrganismo foi de 6,5kGy

a uma taxa de dose de 1000 Gy/h (Demicheli et al., 2006).

METODOLOGIA

48

IV.3 – Avaliação da viabilidade celular

A viabilidade celular foi determinada pelo método modificado de coloração com verde

Janus. O extrato de células de P. brasiliensis (20µL) foi incubada 20µL do corante verde

Janus 0,05%. Após 8 minutos de incubação a proporção de células viáveis foi determinada

por contagem em câmera de Neubauer. Por este método as células viáveis permanecem

descoradas e as células mortas se coram em azul.

IV.4 - Recuperação da virulência do P. brasiliensis

Como mencionado anteriormente, o P. brasiliensis perde a sua virulência após o seu

cultivo prolongado em meio de cultura. Passagens sucessivas da amostra atenuada em

animais regeneram os polímeros constituintes da parede celular do fungo recuperando a sua

virulência inicial (Castañeda et al., 1987; Brummer et al., 1990; Kashino et al., 1990; San-

Blas & Vernet, 1977).

Camundongos machos BALB/c sadios foram infectados pelo plexo orbital com 107

células viáveis de P. brasiliensis. Após 30 dias de infecção, os animais foram sacrificados e

seus pulmões homogeneizados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,5M, pH

7,2. Em seguida, 300 µL do macerado foi plaqueado em meio BHI (infuso cérebro-

coração) – ágar suplementado com soro fetal bovino 4%, sobrenadante de cultura 5% e

gentamicina 1µL/mL. A virulência do fungo foi recuperada em camundongos BALB/c

após duas infecções sucessivas, com intervalo de 30 dias cada.

METODOLOGIA

49

IV.5 - Preparação do exoantígeno MEXO

As colônias não irradiadas de P. brasiliensis, crescidas em meio YPD-ágar durante 7

dias foram ressuspendidas em PBS 0,15M, vortexadas por 30 seg. e centrifugadas em uma

rotação de 12000 rpm por 30 min, a 4ºC. O sobrenadante coletado foi filtrado (filtro estéril

0.45mm) e armazenado em glicerol 10% a – 20º C(Reis et al., 2005). A dosagem da

proteína foi feita pelo método de Bradford (Bradford, 1976).

IV. 6 - Dosagem de proteínas - Método de Bradford

Primeiramente, uma curva padrão de diluição 0,5 a 1,5 µg de proteína/20µL de H2O

foi realizada utilizando-se uma solução padrão de albumina bovina (BSA) 1 mg/mL.

Concomitantemente a essa curva, 20µL da amostra a ser dosada foi adicionada, em

duplicata, a cada poço da placa de microtitulação, juntamente com 180 µL do reagente de

Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250 0,1% em solução aquosa contendo etanol 5% e

ácido fosfórico 10%, filtrado em papel de filtro número 1). A placa foi mantida por 5 a 10

minutos à temperatura ambiente ao abrigo da luz e os valores de absorbância determinados

a 595nm em leitor de Elisa (Elx800, Bio-Tek Instruments. Inc.). Os valores obtidos foram

comparados com a curva padrão de BSA conforme a fórmula:

Concentração de proteína = Abs x Fc x Fd x Cv. No qual:

- Abs: média das leituras das amostras em duplicata

- Fc: fator de conversão = concentração de proteína para cada ponto da curva de BSA.

- Fd: fator de diluição

- Cv: fator de correção de volume para obter-se a concentração em �J�mL.

METODOLOGIA

50

IV.7 - Infecção e imunização experimental nos camundongos utilizados nos ensaios de

virulência e proteção

Para a infecção e imunização, os camundongos machos BALB/c e Nude/Nude foram

anestesiados intraperitonealmente com uma solução contendo quetamina 20% e xilazina

20% em 60% de PBS 0,15M. Em seguida, os animais foram infectados e imunizados pelo

plexo orbital, via endovenosa, com 1x105 células viáveis de P. brasiliensis não irradiado e

radioatenuado.

IV.8 - Ensaio de virulência

A atenuação da virulência de P. brasiliensis foi avaliada a partir das unidades

formadoras de colônias (UFCs) recuperadas em camundongos infectados com a levedura

radioatenuada e análise histológica dos órgãos dos animais infectados.

Os camundongos utilizados no teste de virulência foram infectados com P. brasiliensis

não irradiado ou radioatenuado. Os camundongos BALB/c e Nude/Nude foram divididos

em quatro grupos experimentais; Grupo controle positivo (G1-não irradiado), composto por

6 camundongos machos BALB/c infectados com o P. brasiliensis não irradiado; Grupo 2

(G2-radioatenuado), composto por 6 camundongos machos BALB/c infectados com P.

brasiliensis radioatenuado; Grupo 5 (G5-Nude infectado), composto por 3 camundongos

machos Nude-Nude infectados com a levedura radioatenuada e Grupo 6 (G6-Nude

controle), composto por 2 camundongos Nude-Nude que não sofreram qualquer

intervenção. Os órgãos (pulmão, baço e fígado) removidos dos animais sacrificados 30 e 90

dias após a infecção foram utilizados para contagem de UFCs (unidade formadora de

colônia), análise histológica e dosagem de citocinas.

METODOLOGIA

51

Quadro 1: Grupos experimentais utilizados no ensaio de virulência

G1-não

irradiado

Grupo dos camundongos BALB/c infectados com P. brasiliensis não

irradiado e sacrificados 30 e 90 dias após a infecção.

G2-

radioatenuado

Grupo dos camundongos BALB/c infectados com P. brasiliensis

radioatenuado e sacrificados 30 e 90 dias após a infecção.

G5-Nude

infectado

Grupo dos camundongos Nude-Nude infectados com P. brasiliensis

radioatenuado, sacrificados 30 dias após a infecção.

G6-Nude

controle

Grupo dos camundongos Nude–Nude não infectados.

IV.9 - Ensaio de proteção em PCM experimental

Para checar o efeito protetor conferido pelas leveduras radioatenuadas de P.

brasiliensis, os camundongos BALB/c foram divididos em cinco grupos experimentais;

Grupo dos animais não infectados (Controle negativo), composto por 3 camundongos

sadios, que não sofreram qualquer intervenção; Grupo controle positivo (G1-não irradiado),

composto por 6 camundongos infectados com P. brasiliensis não irradiado; Grupo 2 (G2-

radioatenuado), composto por 6 camundongos machos BALB/c imunizados com P.

brasiliensis radioatenuado; Grupo dos animais imunizados (G3), composto por 18

camundongos imunizados, uma única vez, com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis.

Este grupo foi dividido em três subgrupos que foram desafiados com o P. brasiliensis não

irradiado 30 (G3A), 45 (G3B) e 60 (G3C) dias após a imunização e sacrificados 30 e 90

dias após o desafio; Grupo dos animais imunizados (G4), composto de 18 camundongos

imunizados duas vezes consecutivas, com intervalo de 15 dias, com a levedura

METODOLOGIA

52

radioatenuada de P. brasiliensis. De forma semelhante ao grupo anterior este foi dividido

em três subgrupos que foram desafiados com P. brasiliensis não irradiado 30 (G4A), 45

(G4B) e 60 (G4C) dias após a segunda imunização e sacrificados 30 e 90 dias depois.

Os órgãos (baço, fígado e pulmão) removidos dos animais sacrificados foram utilizados

para contagem de UFCs, análise histológica e dosagem de citocinas.

Quadro 2: Grupos experimentais utilizados no ensaio de proteção

G1- não irradiada Grupo dos animais controle infectados com P. brasiliensis não

irradiado.

G2-radioatenuado Grupo dos camundongos BALB/c imunizados com P. brasiliensis

radioatenuado e sacrificados 30 e 90 dias após a infecção.

G3 – imunizados 1x Grupo dos animais imunizados, uma única vez, com a levedura

radioatenuada de P. brasiliensis, desafiados 30 (G3A), 45 (G3B) e 60

(G3C) dias após a imunização e sacrificados 30 e 90 dias após o desafio.

G4 – imunizados 2x Grupo dos animais imunizados duas vezes consecutivas, com intervalo

de 15 dias, com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis, desafiados

30 (G4A), 45 (G4B) e 60 (G4C) dias após a segunda imunização e

sacrificados 30 e 90 dias após o desafio.

Controle negativo Grupo dos camundongos não infectados.

A eficiência da atividade protetora, conferida pela levedura radioatenuada, foi analisada

comparando-se a diferença entre o número total de UFCs recuperadas após a infecção

desafio (NI), com o número total recuperado do grupo controle (NC), conforme a fórmula

descrita abaixo:

METODOLOGIA

53

%imunidade = 100 – (N.I / N.C) x 100 (Góes & Ramalho – Pinto, 1991).

IV. 10 - Recuperação de UFCs

Parte dos órgãos (pulmão, baço e fígado) removidos dos camundongos sacrificados

foram pesados e depois macerados em 1 mL da solução de PBS 0,15M estéril. Em seguida,

100 µl da solução foram espalhados, homogeneamente, em meio BHI – ágar suplementado

com soro fetal bovino 4%, sobrenadante de cultura 5% e gentamicina 1µL/mL. Após 30

dias de incubação das placas à 37ºC, as colônias foram contadas e os resultados expressos

em número de UFCs por grama de tecido por camundongo (UFCs/g).

IV.11 - Histologia

Outra parte dos órgãos (pulmão, baço e fígado) removidos dos animais sacrificados foi

preservada em solução de formaldeído 10% e utilizados para confecção de lâminas coradas

com hematoxilina-eosina. Os cortes histológicos foram examinados ao microscópio óptico

em aumento de 50X, 100X e 200X.

IV.12 - Obtenção dos soros de camundongos

Amostras de sangue dos camundongos infectados, com P. brasiliensis não irradiado e

radioatenuado, foram coletados semanalmente. Da mesma forma, o sangue dos animais

imunizados e, posteriormente desafiados foi coletado semanalmente antes e após a infecção

desafio. O sangue dos camundongos não infectados foi coletado com a mesma freqüência.

As amostras foram armazenadas por 1 hora a 37ºC e, posteriormente centrifugadas a 4000

rpm por 5 minutos. Os soros obtidos foram estocados a –20ºC para posterior realização de

ensaios imunoenzimáticos de ELISA.

METODOLOGIA

54

IV.13 – Ensaio de ELISA

As reações imunoenzimáticas (Lunde et al., 1979) foram realizadas em placas de

microtitulação MaxiSorpTM Surface (NUNCTM Brand Products) de 96 poços sensibilizadas

com 0,5 µg/100µL de MEXO em tampão carbonato/bicarbonato 0,05M pH 9.6, por 1h a

37ºC. O bloqueio dos sítios livres foi feito com 150 µL de PBS 0,15M/Caseína 1,6% por 1h

a 37ºC e, então, as placas foram lavadas 5 vezes com tampão PBS 0,005M/Tween 0,5%.

Em seguida os soros dos camundongos foram diluídos em PBS 0,15M, caseína 0,25%

(PBS-C) e incubados, em duplicata, por 1h a 37ºC. Os poços foram novamente lavados,

como descrito anteriormente, e posteriormente incubados com 100µL do anticorpo

secundário conjugado a peroxidase (Anti-mouse IgG – whole molecule – peroxidase

conjugate, diluído 1:5000 em PBS-C, Goat anti-mouse IgG1 peroxidase conjugate diluído

em 1:4000 em PBS-C e Goat anti-mouse IgG2a peroxidase conjugate também diluído

1:4000 em PBS - C), por 1h a 37ºC. Após a última lavagem, as placas foram reveladas com

100µL de solução reveladora (4mg de 3,4 ortofenilenodiamino (OPD) e 2 µL de peróxido

de hidrogênio (H2O2) em 10 mL de tampão citrato/fosfato 0,15M pH 5,0). A reação foi

interrompida após 10 minutos com 20µL de solução de ácido sulfúrico (2N) e a

absorbância foi determinada a 490 nm em leitor de Elisa (Elx800, Bio-Tek, instruments.

Inc.).

METODOLOGIA

55

IV.14 - Análise do perfil de citocinas

A dosagem quantitativa das citocinas foi determinada pela técnica de PCR em tempo

real.

IV.14.1 – Extração do RNA total

O RNA total presente no pulmão dos camundongos dos grupos 1, 2, 3, 4 e 5 foi

extraído utilizando-se Trizol LS Reagent (Invitrogen Life Technologies) de acordo com as

instruções do fabricante. Após as extrações, as amostras foram tratadas por 30 minutos com

Dnase livre Rnase (Promega). A concentração e a qualidade do RNA foi avaliada em

espectrofotômetro a 260nm (Eppendorf Biophotometer). A fórmula utilizada para a

quantificação foi: Concentração do RNA = absorção medidax40ugxdiluição/mL. A

qualidade do material nucléico extraído foi avaliada pela relação OD260/OD280 > 1.6. As

concentrações finais das amostras extraídas foram padronizadas em 0,2 µg/µL.

IV.14.2 – Síntese de cDNA por transcriptase reversa

O RNA extraído foi utilizado para a produção de cDNA com o Kit SuperScript II

(Invitrogen Life Technologies) seguindo as recomendações do fabricante.

IV.14.3 – PCR em tempo real

A reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT – PCR) em tempo real é

uma modificação da técnica de PCR através da amplificação de uma seqüência de RNAm

que foi convertido previamente em cDNA pela enzima transcriptase reversa. O método é

quantitativo, pois permite estimar a quantidade de DNA presente na amostra e,

consequentemente de RNAm em tempo real (Heid et al, 1996).

As reações de PCR em tempo real foram realizadas e analisadas utilizando-se o sistema

de detecção ABIPrism 7900 (Applied Biosystems). Após síntese de cDNA, as reações de

METODOLOGIA

56

PCR foram realizadas utilizando o kit Platinum syber green qPCR SUPER MIX UDG

(Invitrogen life technologia), segundo as instruções do fabricante. As condições de

termociclagem iniciaram-se com a incubação da placa (Applied Biosystem) a 50ºC por 2

minutos e, posteriormente 95ºC por 10 minutos, seguidos por 45 ciclos de 95ºC por 15

segundos e 60ºC por 1 minuto. As curvas de dissociação ocorreram a uma temperatura de

95ºC por 15 segundos e 60ºC por 15 segundos.

As seqüências dos primers específicos para as citocinas IL - 5, IL - 10, IFN - γ, TNF - α e

para o gene constitutivo β - actina foram obtidos a partir do trabalho de Giullieti e

colaboradores, 2001.

Os resultados foram expressos em ∆Rn indicando a quantidade da fluorescência emitida

em tempo real em conseqüência da seqüência de interesse amplificada (Rn+) menos a

fluorescência emitida da baseline (Rn-), sendo ∆Rn = Rn+- Rn-. Os valores de ∆Rn são

plotados versus os valores de “threshold cycle” (Ct) em um programa de software. Os

valores de Ct são calculados pela determinação do ponto o qual a fluorescência emitida

excede o threshold. O Ct é apresentado como o número de ciclo, neste ponto, que o gene de

interesse foi amplificado (Livak, K. J & Schmittgen, T. D., 2001; Giulietti, A. et al, 2001).

O método de Ct comparativo foi utilizado para a quantificação relativa dos níveis de

expressão do gene alvo em questão em relação a um calibrador (amostra dos animais não

infectados), a partir da equação 2-∆∆Ct, onde ∆∆Ct = ∆Ct(amostra) - ∆Ct(calibrador), e ∆Ct

é o Ct do gene alvo subtraído do Ct do gene constitutivo. O gene constitutivo, β-actina, foi

utilizado para normalizar as reações (Livak, K. J & Schmittgen, T. D., 2001; Giulietti, A. et

al, 2001).

METODOLOGIA

57

IV.15 – Análise estatística

Os dados obtidos nos ensaios de ELISA foram analisados através do teste ”one way

ANOVA” (análise de variância) utilizando o teste posterior de Bonferroni, realizado pelo

programa estatístico Prism 3.0 (GraphPad, CA – USA). Os resultados de UFCs e Real time

foram analisadas pelo teste T e quando necessário seguido pelo teste Mann Whitney,

realizado pelo programa estatístico Sigma stat 3.5. Foram considerados significativos os

valores onde o p < 0,05 e p < 0,001 e utilizados um n= 3 animais por grupo.

RESULTADOS

58

V - RESULTADOS

PARTE I – ENSAIO DE VIRULÊNCIA

RESULTADOS

59

V.1 - Avaliação da virulência

Neste experimento a perda da virulência da levedura radioatenuada foi avaliada a

partir da recuperação de UFCs e análise histológica dos tecidos dos animais infectados. A

produção de anticorpos e citocinas em resposta à infecção com a levedura radioatenuada foi

também avaliada.

V.1.1 – Recuperação de UFCs

A atenuação da virulência do P. brasiliensis foi inicialmente avaliada a partir da

contagem de UFCs/g em tecidos dos camundongos BALB/c (susceptível) e Nude-Nude

(imunodeprimido), sacrificados 30 e 90 dias após a infecção com a forma leveduriforme do

P. brasiliensis radioatenuado. Os camundongos infectados com o fungo não irradiado

foram utilizados como controle positivo.

Os resultados apresentados nas tabelas 1 e 2 demonstraram que as leveduras

radioatenuadas perderam a capacidade de produzir infecção, pois não houve recuperação de

colônias em nenhum dos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos camundongos infectados.

Mesmo nos camundongos Nude-Nude que são destituídos de timo e, portanto não

apresentam imunidade dependente de linfócitos T, não houve recuperação de UFCs quando

infectados. Ao contrário, os animais controle positivo apresentaram UFCs disseminadas em

todos os órgãos examinados.

Estes resultados demonstram a inabilidade das leveduras radioatenuadas de

provocar infecção, comprovando assim a perda da virulência.

RESULTADOS

60

TABELA 1 : Unidades formadoras de colônia (UFCs) recuperadas dos tecidos de

camundongos BALB/c após 30 dias de infecção com P. brasiliensis não irradiado (G1) e

radioatenuado (G2) e dos camundongos Nude–Nude infectados com a levedura

radioatenuada

Órgãos

G1-30dias G2-30dias Nude-Nude/30dias

Pulmão 4434,3 ± (2484,3) 0 0

Baço 1351,6 ± (707,4) 0 0

Fígado 85,1 ± (17,5) 0 0

TABELA 2 : Unidades formadoras de colônia recuperadas dos tecidos de camundongos

machos BALB/c após 90 dias de infecção com P. brasiliensis não irradiado (G1) e

radioatenuado (G2)

Órgãos

G1-90dias G2-90dias

Pulmão 16712,7 ± (12735,7) 0

Baço 3434,9 ± (2031,5) 0

Fígado 33,6± (21,5) 0

UFCs recuperadas de camundongos machos BALB/c eNude - Nude

UFCs recuperadas de camundongos machos BALB/c

RESULTADOS

61

V.1.2 - Análises histopatológicas dos órgãos de camundongos infectados

Os órgãos dos camundongos BALB/c (pulmão, baço e fígado) infectados com P.

brasiliensis não irradiado e radioatenuado, foram removidos 30 e 90 dias após infecção

para análise das alterações histopatológicas baseadas no tamanho, morfologia, presença de

células fúngicas e intensidade dos infiltrados inflamatórios. A tabela 3 mostra os

granulomas encontrados nos órgãos destes camundongos infectados.

Os cortes histológicos dos órgãos (pulmão e fígado) removidos 30 dias após

infecção com P. brasiliensis não irradiado (G1) apresentaram lesões múltiplas e intensas,

com formação de granulomas epitelióide pequenos bem organizados e compactos, contendo

células fúngicas em seu interior (Figuras 3A, 3C e 3G). Nos cortes do baço foram

observados células fúngicas no interior de granulomas frouxos (Figura 3E).

Após 90 dias de infecção, houve aumento no número de fungos e formação de

granulomas confluentes no pulmão caracterizado por extensa destruição do tecido pulmonar

(Figuras 3B e 3D). Os demais órgãos analisados (baço e fígado) não apresentaram

alterações em relação às observadas anteriormente (Figuras 3F e 3H).

Os animais infectados com P. brasiliensis radioatenuado (G2) e os não infectados

não apresentaram lesões granulomatosas ou formação de focos inflamatórios em nenhum

dos órgãos analisados 30 (dados não mostrados) e 90 (Figura 4) dias após a infecção.

RESULTADOS

62

TABELA 3: Número de granulomas encontrados, nos cortes histológicos dos órgãos

(pulmão, baço e fígado) de camundongos BALB/c, 30 e 90 dias após a infecção com P.

brasiliensis não irradiado (G1) e radioatenuado (G2)

Órgãos G1-30 G1-90 G2-30 G2-90

Pulmão Incontáveis Incontáveis 0 0

Baço 13,33 ± 12,94 4,33 ± 3.93 0 0

Fígado 75,33 ± 12,85 4,3 ± 3.50 0 0

G1-30 = Grupo dos camundongos infectados com P. brasiliensis não irradiado sacrificados

30 dias após a infecção; G1-90 = Grupo dos camundongos infectados com P. brasiliensis

não irradiado sacrificados 90 dias após a infecção; G2-30 = Grupo dos camundongos

infectados com P. brasiliensis radioatenuado sacrificados 30 dias após a infecção; G2-90 =

Grupo dos camundongos infectados com P. brasiliensis radioatenuado sacrificados 90 dias

após a infecção.

RESULTADOS

63

30 DIAS 90 DIAS

PULMÃO A B

C D

PULMÃO

E F

BAÇO

G H

FÍGADO

FIGURA 3: Histopatologia representativa das lesões causadas pelo P. brasiliensis não

irradiado (G1) nos órgãos (pulmão, baço e fígado) dos camundongos BALB/c. Os órgãos

dos animais foram removidos 30 e 90 dias após infecção e analisados por histologia. Em A e

C – Pulmões mostrando lesões múltiplas intensas com formação de granulomas pequenos

compactos e células fúngicas em seu interior (HE; aumento 200X e 50X); B e D – Pulmão

mostrando lesões granulomatosas pulmonares confluentes com grande número de células

fúngicas em seu interior (HE; aumento 200X e 50X); E e F – Baço mostrando granuloma

pequeno do tipo frouxo com poucas células fúngicas (HE; aumento 200X); G e H – Fígado

mostrando granuloma compacto bem organizado com poucas células fúngicas (HE; aumento

200X).

RESULTADOS

64

Controle negativo Radioatenuado (G1)

A B

PULMÃO

C D

BAÇO

E F

FÍGADO


camundongos BALB/c infectados com o P. brasiliensis radioatenuado e não infectados. As

figuras representam os órgãos dos animais foram removidos 90 dias após infecção e analisados por

histologia. Não houve formação de lesões granulomatosas ou focos inflamatórios com presença de

células fúngicas em nenhum dos órgãos analisados. Os órgãos dos animais não infectados foram

utilizados como controle negativo. Em A – Pulmão dos camundongos não infectados (HE; aumento

63X); B – Pulmão dos camundongos infectados com a levedura radioatenuada (HE; aumento 25X);

C - Baço dos camundongos não infectados (HE; aumento 63X); D – Baço dos camundongos

infectados com a levedura radioatenuada (HE; aumento 25X); E – Fígado dos camundongos não

infectados (HE; aumento 63X); F – Fígado dos camundongos infectados com a levedura

radioatenuada (HE; aumento 25X).

RESULTADOS

65

V.1.3 - Reatividade de IgG anti-mexo induzida pelo P. brasiliensis não irradiado e

radioatenuado

Para avaliar a reatividade de IgG presente nos soros dos camundongos BALB/c

infectados com P. brasiliensis não irradiado ou radioatenuado frente ao antígeno Mexo,

foram realizados ensaios de ELISA em diluições que variaram de 1/50 a 1/3200. Soros dos

camundongos não infectados foram utilizados como controle nas mesmas condições.

Os resultados demonstraram que a imunoglobulina IgG presente nos soros dos

animais infectados com o fungo não irradiado foram capazes de reconhecer

significativamente o antígeno Mexo 30 e 90 dias após a infecção (p<0,001 e p<0,05,

respectivamente) (gráfico 1). Nas mesmas condições os soros dos animais infectados com a

levedura radioatenuada e o controle negativo não reagiram.

RESULTADOS

66

GRÁFICO 1: Reatividade de IgG presente nos soros dos camundongos BALB/c frente ao

antígeno Mexo. Os soros dos camundongos infectados com o fungo não irradiado (G1) ou

radioatenuado (G2) foram testados em ensaio de ELISA na presença do antígeno Mexo. Os

resultados foram expressos em densidade óptica a 490 nm. G1-30dias = Soros dos camundongos

infectados com P. brasiliensis não irradiado sacrificados 30 dias após a infecção; G1-90dias =

Soros dos camundongos infectados com P. brasiliensis não irradiado sacrificados 90 dias após a

infecção; G2-30dias = Soros dos camundongos infectados com P. brasiliensis radioatenuado

sacrificados 30 dias após a infecção; G2-90dias = Soros dos camundongos infectados com P.

brasiliensis radioatenuado sacrificados 90 dias após a infecção; Controle negativo: Soros dos

camundongos que não sofreram qualquer intervenção.

1/400 1/800 1/1600

1/320

RESULTADOS

67

V.1.4 – Perfil da produção de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c

induzidos pelo P. brasiliensis radioatenuado e não irradiado

Para avaliar a dinâmica da produção de anticorpos do tipo IgG frente ao antígeno

Mexo, os soros dos camundongos infectados com P. brasiliensis não irradiado ou

radioatenuado, foi testado semanalmente em ensaio de ELISA na diluição de 1:50. Os soros

dos camundongos não infectados foi testado nas mesmas condições.

Os testes revelaram que os soros dos camundongos infectados com o fungo não

irradiado foi capaz de reconhecer o antígeno Mexo. Este reconhecimento foi significativo

em relação ao controle negativo (p<0,001) (gráfico 2). O mesmo não foi observado nos

soros dos animais infectados com a levedura radioatenuada.

RESULTADOS

68

GRÁFICO 2: Perfil de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c. Os soros dos

camundongos infectados, respectivamente, com P. brasiliensis não irradiado e radioatenuado,

coletados semanalmente, foram testados por ELISA quanto a presença de IgG anti–Mexo. Os

resultados expressos em densidade óptica a 490 nm demonstraram que os soros do grupo não

irradiado (G1) reagiram com o Mexo, sendo esta reatividade significativa em relação ao controle

(p<0,001). Nas mesmas condições os soros dos animais radioatenuados (G2) e controle negativo

não reagiram. G1-não irradiado = Soros dos camundongos infectados com P. brasiliensis não

irradiado; G2-radioatenuado = Soros dos camundongos infectados com P. brasiliensis

radioatenuado; Controle negativo = Soro dos camundongos que não sofreram qualquer intervenção.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10

Sem anas

Ab

s. 490n

m

Controle

G1

G2

RESULTADOS

69

V.1.5 – Perfil de imunoglobulinas IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros dos

camundongos BALB/c induzidos pelo P. brasiliensis radioatenuado e não

irradiado

A fim de demonstrar a produção de diferentes subclasses de IgG e sua relação com

o estabelecimento de uma resposta imune protetora, foram realizados ensaios de ELISA

para obtenção do perfil de imunoglobulinas dos isotipos IgG1 e IgG2a, presente nos soros

dos camundongos infectados com P. brasiliensis não irradiado e radioatenuado.

Os gráficos 3 e 4 mostram a produção de IgG1 e IgG2a nos soros dos camundongos

infectados com P. brasiliensis não irradiado e radioatenuado. Soros de animais não

infectados foram utilizados como controle.

Os resultados observados no gráfico 3 demonstraram uma diferença significativa

em relação ao controle entre os isotipos IgG1 e IgG2a presentes nos soros dos

camundongos coletados 30 e 90 dias após a infecção com o fungo não irradiado (p<0,05 e

p<0,001, respectivamente), indicando uma maior produção de IgG1 em relação a IgG2a.

Em contrapartida, nos soros dos camundongos infectados com a levedura radioatenuada

não houve produção e nem diferença significativa dos isotipos de IgG (gráfico 4).

RESULTADOS

70

GRÁFICO 3: Perfil de IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c

infectados com P. brasiliensis não irradiado. Os soros dos camundongos coletados antes e 30 e 90

dias após a infecção foram testados em ensaio de ELISA na presença do antígeno Mexo. Os

resultados expressos em densidade óptica a 490 nm demonstraram uma maior produção de IgG1 em

relação a IgG2a. O aumento dos isotipos de IgG foram significativos em relação ao controle

(p<0,05 e p<0,001, respectivamente).

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0,0 30,0 90,0

Dias

Ab

s. 490 n

mIgG1

IgG2a

RESULTADOS

71


infectados com P. brasiliensis radioatenuado. Os soros dos camundongos coletados antes e 30 e

90 dias após a infecção foram testados em ensaio de ELISA na presença do antígeno Mexo. Os

resultados expressos em densidade óptica a 490 nm demonstraram que não houve diferença na

produção dos isotipos de IgG.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0,0 30,0 90,0

Dias

Ab

s. 490 n

m

IgG1

IgG2a

RESULTADOS

72

V.1.6 – Dosagem de citocinas por PCR em tempo real

Para verificar o perfil de citocinas produzidos em resposta à infecção pelo P.

brasiliensis radioatenuado foram realizados ensaios de PCR em tempo real. Os

camundongos BALB/c infectados com o fungo não irradiado foram utilizados como o

controle positivo.

A expressão do RNA total das citocinas quantificadas no pulmão dos animais

coletados 30 e 90 dias após a infeção pelo P. brasiliensis radioatenuado revelou uma

produção significativa em relação ao controle positivo de IFN-γ e TNF- α (p<0,05) (gráfico

5 e 6) e baixos níveis de IL-10 nestes animais (gráfico7). Apesar da produção de IL-5 ter

sido significativamente baixa após 30 dias de infeção (p<0,05), observamos um aumento de

seus níveis 90 dias depois (gráfico 8).

RESULTADOS

73

GRÁFICO 5: Quantificação por PCR em tempo real de IFN-γγ no pulmão dos camundongos

BALB/c. Os resultados expressos em ∆Rn, mostraram um aumento significativo da produção de

IFN-γ em animais analisados 30 e 90 dias após a infeção com a levedura radioatenuada (G2) em

relação ao controle positivo (p<0,05). Os animais infectados com o fungo não irradiado (G1) foram

utilizados como controle positivo. Experimento realizado com n=3.

0

0.5

1

1.5

Não Irradiado Radioatenuado

Rn

0

0.5

1

1.5


Rn

30 dias

90 dias

RESULTADOS

74

GRÁFICO 6: Quantificação por PCR em tempo real de TNF-αα no pulmão dos camundongos

BALB/c. Os resultados expressos em ∆Rn, mostraram um aumento significativo da produção de

TNF-α em animais analisados 30 e 90 dias após a infeção com a levedura radioatenuada (G2) em

relação ao controle positivo (p<0,05). Os animais infectados com o fungo não irradiado (G1) foram

utilizados como controle positivo. Experimento realizado com n=3.

0

150000

300000

450000


∆∆R

n

0

10

20

30

40

50

60


∆∆R

n

30 dias

90 dias

RESULTADOS

75

GRÁFICO 7: Quantificação por PCR em tempo real de IL – 10 no pulmão dos camundongos

BALB/c. Os resultados expressos em ∆Rn, mostraram uma diminuição significativa da produção de

IL-10 em animais analisados 30 e 90 dias após a infeção com a levedura radioatenuada (G2) em

relação ao controle positivo (p<0,001). Os animais infectados com o fungo não irradiado (G1)

foram utilizados como controle positivo. Experimento realizado com n=3.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Não irradiado Radioatenuado

Rn

0

10

20

30

40

50

60

70

Não irradiado Radioatenuado

Rn

30 dias

90 dias

RESULTADOS

76


BALB/c. Os resultados expressos em ∆Rn, mostram uma diminuição significativa da produção IL-5

em animais analisados 30 dias após a infeção com a levedura radioatenuada (G2) em relação ao

controle positivo (p<0,05), porém após 90 dias houve um aumento significativo de seus níveis

(p<0,05). Os animais infectados com o fungo não irradiado (G1) foram utilizados como controle

positivo. Experimento realizado com n=3.

0

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008


∆∆R

n30 dias

90 dias

0

0.0001

0.0002

0.0003


∆∆R

n

RESULTADOS

77

PARTE II – ENSAIO DE PROTEÇÃO

RESULTADOS

78

V.2 - Avaliação da atividade protetora

Neste experimento a atividade protetora desencadeada pela imunização com a

levedura radioatenuada foi avaliada a partir da recuperação de UFCs e análise histológica

dos tecidos dos animais imunizados. A produção de anticorpos e citocinas foi determinada

para a caracterização do tipo de resposta imune induzida.

V.2.1 – Recuperação de UFCs

A avaliação do efeito protetor conferido pela imunização com leveduras de P.

brasiliensis radioatenuadas foi inicialmente investigada em camundongos BALB/c a partir

da contagem de UFCs recuperadas por grama de tecido dos animais. Os camundongos

infectados com a amostra não irradiada foram utilizados como controle.

Os animais imunizados uma única vez, ao entrarem em contato com o fungo não

irradiado 30, 45 e 60 dias após a imunização apresentaram inicialmente um efeito protetor

significativo em relação ao controle (p<0,05) (gráfico 9). Porém, após um período

prolongado de exposição ao fungo (90dias) pode-se verificar que houve aumento na

recuperação de UFCs, principalmente nos grupos G3A e G3C (gráfico 10). A proteção

estabelecida foi de 82,7% (Tabela 4).

No grupo dos camundongos imunizados duas vezes consecutivas e desafiados com

o fungo não irradiado 30, 45 e 60 dias após a imunização não houve recuperação

significativa, em relação ao controle, de colônias nos órgãos analisados após 30 dias nos

subgrupos G3A e G3B (gráfico 11). Apenas no pulmão dos animais coletados 30 dias após

a infeção desafio realizada 60 dias após a segunda imunização (G4C), houve recuperação

significativa de colônias. Todavia, quando analisados após 90 dias, não houve recuperação

RESULTADOS

79

de UFCs em nenhum dos subgrupos (G4A, G4B e G4C). A proteção estabelecida pelas

duas imunização foi de 99,5% (Tabela 4). Este resultado indica que as duas imunizações

com as leveduras radioatenuadas intensificaram o efeito protetor contra um desafio

subsequente com P. brasiliensis não irradiado.

RESULTADOS

80

GRÁFICO 9: Recuperação de UFCs verificada após 30 dias nos órgãos dos camundongos BALB/c

imunizados uma única vez com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis. Os animais foram

desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização com o fungo não irradiado. Os controles foram

infectados com P. brasiliensis não irradiado. Todos os animais foram sacrificados 30 dias após as

infeções desafios. G3A = camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a imunização. G3B =

camundongos imunizados e desafiados 45 dias após a imunização. G3C = camundongos

imunizados e desafiados 60 dias após imunização. Estatisticamente foi considerado significativo

p<0,05. Experimento realizado com n=3.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Controle G3A G3B G3C

Grupos

UF

Cs

/g d

e t

ec

ido

s

Pulmão

Baço

Fígado

RESULTADOS

81

GRÁFICO 10: Recuperação de UFCs verificada após 90 dias nos órgãos dos camundongos

BALB/c imunizados uma única vez com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis. Os animais

foram desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização com o fungo não irradiado. Os controles foram

infectados com o P. brasiliensis não irradiado. Todos os animais foram sacrificados 90 dias após o

desafio. G3A = camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a imunização. G3B =

camundongos imunizados e desafiados 45 dias após a imunização. G3C = camundongos imunizados e

desafiados 60 dias após imunização. Experimento realizado com n=3.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000


Grupos

UF

Cs

/g d

e t

ec

ido

s

Pulmão

Baço

Fígado

RESULTADOS

82


BALB/c imunizados duas vezes com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis. Os animais foram

desafiados 30, 45 e 60 dias com o fungo não irradiado. Os controles foram infectados com o P.

brasiliensis não irradiado. Todos os animais foram sacrificados 30 dias após cada desafio. G4A =

camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a imunização. G4B = camundongos imunizados e

desafiados 45 dias após a imunização. G4C = camundongos imunizados e desafiados 60 dias após

imunização. Experimento realizado com n=3.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000


Grupos

UF

Cs/g

de t

ecid

os

Pulmão

Baço

Fígado

RESULTADOS

83


BALB/c imunizados duas vezes com a levedura radioatenuada do P. brasiliensis. Os animais

foram desafiados 30, 45 e 60 dias com o fungo não irradiado. Os controles foram infectados com o P.

brasiliensis não irradiado. Todos os animais foram sacrificados 90 dias após o desafio. G4A =

camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a imunização. G4B = camundongos imunizados e

desafiados 45 dias após a imunização. G4C = camundongos imunizados e desafiados 60 dias após

imunização. Experimento realizado com n=3.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000


Grupos

UF

Cs /g

de t

ecid

os

Pulmão

Baço

Fígado

RESULTADOS

84

TABELA 4: Proteção obtida pelas imunizações com as leveduras radioatenuadasde P. brasiliensis.

IMUNIZAÇÕES SUBGRUPOS 30 DIAS

(%)

90 DIAS

(%)

1 IMUNIZAÇÃO G3A

G3B

G3C

64,7

100

100

73

99

76,3

Média* 88,2 82,7

2 IMUNIZAÇÕES G4A

G4B

G4C

100

92

51,3

98,6

100

100

Média* 81,1 99,%

*Valor médio considerando-se os três subgrupos

G3A = Camundongos imunizados uma vez e desafiados 30 dias após a imunização; G3B =

Camundongos imunizados uma vez e desafiados 45 dias após a imunização; G3C = Camundongos

imunizados uma vez e desafiados 60 dias após a imunização; G4A = Camundongos imunizados

duas vezes e desafiados 30 dias após a imunização; G4B = Camundongos imunizados duas vezes e

desafiados 45 dias após a imunização; G4C= Camundongos imunizados duas vezes e desafiados 60

dias após a imunização.

RESULTADOS

85

V.2.2 – Análise histopatológica dos órgãos de camundongos imunizados

Nas figuras 5 e 6 temos os cortes histológicos representativos dos órgãos (pulmão,

baço e fígado) removidos dos animais imunizados uma única vez e desafiados com P.

brasiliensis não irradiado 30 (G3A) e 60 (G3C) dias após. Foi possível observar a presença

de granulomas nos pulmões dos animais imunizados (G3) e não imunizados (G1), porém a

quantidade, o tamanho e a intensidade diferiram entre eles (Tabelas 5).

O pulmão dos camundongos coletados 30 dias após as infeções desafio dos

subgrupos G3A, G3B e G3C, apresentaram lesões multifocais discretas com formação de

granulomas grandes compactos e bem definidos, com poucas células fúngicas em seu

interior (Figuras 5A e 6A). No fígado foram observadas lesões granulomatosas discretas e

menores que as observadas nos animais não imunizados (Figuras 5E e 6E). Não foram

observadas alterações no baços destes animais (Figura 5C e 6C). Os dados do subgrupo

G3B não foram mostrados, pois apresentaram as mesmas alterações observadas nos demais

grupos.

Após 90 dias de infecção, foi observado nos pulmões removidos dos animais do

subgrupo G3A um intenso infiltrado inflamatório bronquiopulmonar (Figura 5B). Nos

pulmões obtidos dos animais do grupo G3C houve produção multifocal intensa de

granulomas exsudativos do tipo frouxo em toda extensão analisada (Figura 6B). Os fígados

apresentaram lesões múltiplas pequenas e discretas com formação de granulomas do tipo

frouxo contendo poucas células fúngicas em seu interior (Figuras 5F e 6F). No baço dos

animais do subgrupo G3C, coletados 30 dias após o desafio, não foi observado lesões

granulomatosas ou infiltrados inflamatórios. Porém, 90 dias após a infecção desafio houve

presença de lesões intensas com formação de granulomas exsudativos do tipo frouxo

(Figura 6E). Não foram observadas alterações histopatológicas no baço dos demais animais

RESULTADOS

86

coletados 30 e 90 dias após o desafio dos subgrupos G3A e G3B (Figuras 5C e 6C). Nos

órgãos (pulmão, baço e fígado) dos animais do grupo G3B, analisados 90 dias após desafio,

não foram observadas alterações histopatológicas diferentes das descritas nos animais

analisados com 30 dias (dados não mostrados).

A Tabela 6 mostra o número de granulomas encontrados nos órgão dos

camundongos imunizados duas vezes, analisados 30 e 90 dias após as infecções desafio.

Não foram observadas reações granulomatosas ou infiltrados inflamatórios nos órgãos dos

animais dos subgrupos G4A (Figuras 7A, 7B e 7C) e G4B (dados não mostrados). Os

órgãos (pulmão e fígado) do subgrupo G4C, analisados 30 dias após o desafio,

apresentaram lesões mutifocais discretas com formação de granulomas grandes e

compactos contendo poucas células fúngicas em seu interior (Figuras 8A, 8C e 8E), porém

após 90 dias não foram observadas alterações histopatológicas em nenhum dos órgãos

(Figuras 8B, 8D e 8F).

RESULTADOS

87

TABELA 5: Número de granulomas encontrados, nos cortes histológicos dos órgãos

(pulmão, baço e fígado) de camundongos BALB/c imunizados uma única vez, 30 e 90 dias

após as infecções desafio com P. brasiliensis não irradiado (G1).

30 dias 90 dias

Órgão G3A G3B G3C G3A G3B G3C

Pulmão

2,3±1,8 0 3,3±2,5 2±2 12,02±8,5 Incontáveis

Baço 0 0 0 0 0 Incontáveis

Fígado 1,6±1.2 1,6 2,6±1,05 5,3±3,21 4,24±3 42,5±24,7

G3A = Grupo dos camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a imunização;

G3B = Grupo dos camundongos imunizados e desafiados 45 dias após a imunização;

G3C = Grupo dos camundongos imunizados e desafiados 60 dias após a imunização.

RESULTADOS

88

TABELA 6: Número de granulomas encontrados, nos cortes histológicos dos tecidos

(pulmão, baço e fígado) de camundongos BALB/c imunizados duas vezes, 30 e 90 dias

após cada infecção desafio com P. brasiliensis não irradiado.

30 dias 90 dias

Órgão G4A G4B G4C G4A G4B G4C

Pulmão

0 0 0 0 0,5 0

Baço 0 0 0 0 0 0

Fígado 0 0 0 0 5 0

G4A = Grupo dos camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a imunização;

G4B = Grupo dos camundongos imunizados e desafiados 45 dias após a imunização;

G4C = Grupo dos camundongos imunizados e desafiados 60 dias após a imunização.

RESULTADOS

89

30 DIAS 90 DIAS

A BPULMÃO

C DBAÇO

E FFÍGADO


camundongos BALB/c, imunizados uma única vez (subgrupo G3A), removidos 30 e 90 dias

após infecção desafio. Os órgãos dos animais imunizados e desafiados 30 dias (G3A) após a

imunização foram analisados por histologia. Em A= Pulmão mostrando granuloma compacto

grande com muitas células fúngicas em seu interior (HE; aumento 200X); B= Pulmão com intenso

infiltrado inflamatório (HE; aumento 100X); C= Baço sem nenhuma alteração (HE; aumento 50X);

D= Baço com infiltrado inflamatório intenso (HE; aumento 100X); E= Fígado mostrando

granuloma pequeno com poucas células fúngicas (HE; aumento 200X);.F= Fígado com granuloma

frouxo pequeno contendo poucas células fúngicas (HE; aumento 100X).

RESULTADOS

90

30 DIAS 90 DIAS

A BPULMÃO

C DBAÇO

E FFÍGADO


camundongos BALB/c, imunizados uma única vez (subgrupo G3C), removidos 30 e 90 dias

após infecção desafio. Os órgãos dos animais imunizados e desafiados 60 dias (G3C) após a

imunização foram analisados por histologia.. Em A = Pulmão mostrando granuloma grande

compacto com poucas células fúngicas em seu interior (HE; aumento 200X); B = Pulmão com

granulomas exsudativos do tipo frouxo (HE; aumento 50X); C = Baço sem nenhuma alteração (HE;

aumento 50X); D = Baço com lesões multifocais intensas e formação de granulomas exsudativos do

tipo frouxo (HE; aumento 50X); E = Fígado mostrando granuloma pequeno compacto com poucas

células fúngicas (HE; aumento 200X); F = Fígado com lesões multifocais pequenas e discretas com

granulomas do tipo frouxo (HE; aumento 100X).

RESULTADOS

91

APULMÃO

BBAÇO

CFÍGADO


camundongos BALB/c imunizados duas vezes (subgrupo G4A), removidos após as infecções

desafio com P. brasiliensis não irradiado. Não foram observadas alterações histopatológicas nos

órgãos analisados 30 e 90 dias após as infecções desafio. Em A = Pulmão sem alterações (HE;

aumento 100X); B = Baço sem alterações (HE; aumento 100X); C = Fígado (HE; aumento 100X).

RESULTADOS

92

30 DIAS 90 DIAS

A BPULMÃO

C DBAÇO

E FFÍGADO


camundongos BALB/c imunizados duas vezes (subgrupo G4C) removidos 30 e 90 dias após o

desafio. Em A = Pulmão mostrando granulomas grandes e compactos contendo poucas células

fúngicas (HE; aumento 200X); B = Pulmão sem alterações (HE; aumento 100X); C = Baço sem

alterações (HE; aumento 100X); D = Baço sem alterações (HE; aumento 100X); F = Fígado

mostrando granulomas grandes e compactos (HE; aumento 100X); G = Fígado sem alterações (HE;

aumento 100X)

RESULTADOS

93

V.2.3 - Produção de IgG anti–Mexo nos soros dos camundongos BALB/c imunizados e

desafiados

Os camundongos imunizados, uma ou duas vezes, com a levedura radioatenuada

foram submetidos a infecção desafio com P. brasiliensis não irradiado 30, 45 e 60 dias

após a imunização. Os soros obtidos, semanalmente, após cada desafio foram utilizados em

ensaios de ELISA. Soros de animais não infectados foram utilizados como controle.

Os resultados demonstrados no gráfico 13 mostram a produção elevada, ao longo de

toda infecção, de anticorpos IgG anti-Mexo nos soros dos animais imunizados uma vez e

desafiados 30, 45 e 60 dias após. Esse aumento foi significativo em relação ao controle

negativo (p<0,001, p<0,001 e p<0,05, respectivamente). A resposta observada nos soros

dos animais imunizados duas vezes, G4B e G4C, também apresentou – se

significativamente elevada em relação ao controle (gráfico 14) (p<0,05 e p<0,001,

respectivamente). Nas mesmas condições a imunoglobulina IgG presente nos soros dos

animais imune não reagiram como o Mexo.

RESULTADOS

94

GRÁFICO 13: Perfil de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c imunizados uma

única vez, com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização.

Os soros dos camundongos imunizados, coletado semanalmente após as infecções desafios, foram

testados por ELISA quanto a presença de IgG anti – Mexo. Os resultados expressos em densidade

óptica a 490 nm demonstraram que a imunoglobulina IgG presente nos soros dos grupos G3A, G3B

e G3C reagiu com o Mexo, sendo esta reatividade significativa em relação ao controle negativo

(p<0,001, p<0,001 e p<0,05, respectivamente). Nas mesmas condições a imunoglobulina IgG nos

soros dos animais imune não reagiu com o antígeno Mexo. G3A = Soros dos camundongos

imunizados e desafiados 30 dias após a imunização; G3B = Soros dos camundongos imunizados e

desafiados 45 dias após a imunização; G3C = Soros dos camundongos imunizados e desafiados 60

dias após a imunização; Imune = Soros dos camundongos imunizados; G5 - Controle negativo.

Experimento realizado com n=3.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8

Semanas

Ab

s. 490n

m

G3A

G3B

G3C

IMUNE

G5

RESULTADOS

95

GRÁFICO 14: Perfil de IgG anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c imunizados duas

vezes consecutivas com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados 30, 45 e 60 dias após a

imunização. Os soros dos camundongos imunizados, coletados semanalmente após as infecções

desafios, foram testados por ELISA quanto a presença de IgG anti – Mexo. Os resultados expressos

em densidade óptica a 490 nm demonstraram que a imunoglobulina IgG presente nos soros dos

grupos G4A, G4B e G4C reagiu com o Mexo, sendo a reatividade dos grupos G4B e G4C

significativa em relação ao controle negativo (p<0,05 e p<0,001, respectivamente). Nas mesmas

condições a imunoglobulina IgG presente nos soros dos animais pré-imune e imune não reagiram.

G4A = Soros dos camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a imunização; G4B = Soros

dos camundongos imunizados e desafiados 45 dias após a imunização; G4C = Soros dos

camundongos imunizados e desafiados 60 dias após a imunização; Imune = Soros dos

camundongos imunizados; Controle negativo = Soros dos camundongos que não sofreram qualquer

intervenção. G5 - Controle negativo. Experimento realizado com n=3.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Semanas

Ab

s. 490n

mG4A

G4B

G4C

Imune

G5

RESULTADOS

96

V.2.4 - Perfil de imunoglobulinas IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros de camundongos

imunizados

Os resultados observados no gráfico 15, relativo ao grupo imunizado uma vez (G3),

demonstra que há uma diferença no perfil da produção dos isotipos de IgG, indicando um

aumento significativo na produção de IgG1 em relação a IgG2a nos soros dos animais do

grupo G3A analisados 90 dias após a infecção desafio (p<0,001). O mesmo foi observado

nos soros dos animais do grupo G3B analisados 30 e 90 dias após o desafio (p<0,05).

Todavia, houve produção significativa de IgG2a em relação a IgG1, nos soros dos animais

do grupo G3C analisados 30 dias após o desafio (p<0,001).

A resposta para IgG1 e IgG2a nos soros dos animais analisados 30 e 90 dias após a

infecção foi significativa em relação ao controle em todos os grupos analisados (G3A após

30 dias p<0,05; G3A após 90dias p<0,001; G3B e G3C p<0,05).

RESULTADOS

97


imunizados uma única vez com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados com fungo não

irradiado 30, 45 e 60 dias após a imunização. Os soros dos camundongos, coletados 30 e 90 dias

após a infecção desafio, e do grupo controle negativo (0,0) foram testados em ensaio de ELISA na

presença do antígeno Mexo. Os resultados foram expressos em densidade óptica a 490 nm. A –

soros dos animais imunizados e desafiados 30 dias após. B – soros dos animais imunizados e

desafiados 45 dias após. C – soros dos animais imunizados e desafiados 60 dias após. Experimento

realizado com n=3.

0

0 . 1

0 . 2

0 . 3

0 . 4

0 . 5

0 , 0 3 0 , 0 9 0 , 0

D ia s

Ab

s. 490 n

m

Ig G 1

Ig G 2 a

0

0 . 1

0 . 2

0 . 3

0 . 4

0 . 5

0 , 0 3 0 , 0 9 0 , 0

D i a s

Ab

s. 490 n

m

Ig G 1

Ig G 2 a

0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

0 ,0 3 0 ,0 9 0 ,0

D ia s

Ab

s. 490 n

m

Ig G 1

Ig G 2 a

A

B

C

RESULTADOS

98

O gráfico 16 mostra a diferença no perfil de IgG1 e IgG2a presentes nos soros

de camundongos imunizados duas vezes consecutivas, desafiados 30, 45 e 60 dias após

a segunda imunização. Os soros analisados foram coletados 30 e 90 dias após o

desafio. Soros de animais não infectados foram utilizados como controle.

Os resultados demonstraram uma maior produção de IgG1 em relação a IgG2a

nos soros dos animais do grupo G4C coletados 30 dias após a infecção desafio

(P<0,05). Nos soros dos demais grupos analisados 90 dias após o desafio houve uma

maior produção de IgG2a em relação a IgG1. A produção de IgG1 e IgG2a foi

significativa em relação ao controle em todos os pontos analisados (G4A - p<0,05;

G4B após 30 dias - p<0,05; G4B após 90 dias - p<0,05; G4C após 30 dias - p<0,001 e

G4C após 90 dias p<0,05)

RESULTADOS

99

GRÁFICO 16: Perfil de IgG1 e IgG2a anti-Mexo nos soros dos camundongos BALB/c,

imunizados duas vezes com P. brasiliensis radioatenuado e desafiados com o fungo não

irradiado 30, 45 e 60 dias após a imunização. Os soros dos camundongos, coletados 30 e 90 dias

após a infecção desafio, e do grupo controle não imunizado (0,0) foi testado em ensaio de ELISA na

presença do antígeno Mexo. Os resultados foram expressos em densidade óptica a 490 nm. A –

soros dos animais imunizados e desafiados 30 dias após. B – soros dos animais imunizados e

desafiados 45 dias após. C – soros dos animais imunizados e desafiados 60 dias após. Experimento

realizado com n=3.

0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

0 ,0 3 0 ,0 9 0 ,0

D ia s

Ab

s. 490 n

m

Ig G 1

Ig G 2 a

0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

0 ,0 3 0 ,0 9 0 ,0

D ia s

Ab

s. 490 n

m

Ig G 1

Ig G 2 a

0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

0 ,0 3 0 ,0 9 0 ,0

D ia s

Ab

s. 490 n

m

Ig G 1

Ig G 2 a

A

C

B

RESULTADOS

100

V.2.5 – Dosagem de citocinas por PCR em tempo real em camundongos imunizados

duas vezes

Para verificar o perfil de citocinas produzidos em camundongos imunizados duas

vezes com a levedura radioatenuada de P. brasiliensis (G4) e, posteriormente desafiados

com o fungo não irradiado foram realizados ensaios de PCR em tempo real. Os

camundongos BALB/c infectados com o fungo não irradiado foram utilizados como o

controle positivo. As análises de citocinas não foram realizadas nos grupos dos animais

imunizados uma única vez (G3).

A expressão do RNA total de IFN - γ no pulmão dos animais imunizados com P.

brasiliensis radioatenuado apresentou-se significativamente aumentada 30 e 90 dias após as

infeções desafio em todos os subgrupos (p<0,05) (gráfico 19).

Os níveis de TNF - α apresentaram-se significativamente aumentados em relação ao

controle positivo nos animais analisados 30 dias após as infeções desafio realizadas 45 e 60

dias após a segunda imunização (p<0,05). Esses níveis foram baixos em animais desafiados

30 dias após a segunda imunização (G4A).Quando analisados 90 dias após as infeções

desafio houve uma diminuição significativa da sua produção em todos os subgrupos

quando comparados aos animais não imunizados (p<0,05) (gráfico 20).

A produção da IL - 10 foi significativamente baixa em relação ao controle positivo para

todos os subgrupos 30 e 90 dias após o desafio (p<0,05) (gráfico 21).

Os níveis de IL - 5 se apresentaram elevados nos subgrupos G4B e G4C 30 dias após o

desafio. Porém, diminuíram fortemente quando analisados após 90 dias.

RESULTADOS

101

GRÁFICO 17: Quantificação por PCR em tempo real de IFN - γγ no pulmão dos

camundongos BALB/c imunizados duas vezes. Os resultados expressos em ∆Rn, mostram um

aumento significativo da produção de IFN - γ nos animais analisados 30 e 90 dias após a segunda

imunização em relação ao controle positivo (p<0,05). Os animais infectados com o fungo não

irradiado (G1) foram utilizados como controle positivo. G2 = camundongos inoculados com P.

brasiliensis radioatenuado. G4A = camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a

imunização. G4B = camundongos imunizados e desafiados 45 dias após a imunização. G4C =

camundongos imunizados e desafiados 60 dias após imunização. Experimento realizado com n=3.

0

1

2

3

4

5

G1 G2 G4A G4B G4C

∆

∆ R

n30 dias

90 dias

RESULTADOS

102

GRÁFICO 18: Quantificação por PCR em tempo real de TNF - αα no pulmão dos

camundongos BALB/c imunizados duas vezes. Os resultados expressos em ∆Rn, mostram um

aumento significativo, em relação ao controle positivo, da produção de TNF - α em animais

analisados 30 dias após as infecções desafios realizadas 45 e 60 dias após a segunda imunização

(p<0,05) e menor produção nos animais desafiados 30 dias depois. Em animais analisados 90 dias

após as infecções desafio houve uma diminuição significativa da sua produção quando comparados

ao controle positivo (p<0.05).Os animais infectados com o fungo não irradiado (G1) foram

utilizados como controle positivo. G2 = camundongos inoculados com P. brasiliensis radioatenuado

G4A = camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a imunização. G4B = camundongos

imunizados e desafiados 45 dias após a imunização. G4C = camundongos imunizados e desafiados

60 dias após imunização. Experimento realizado com n=3.

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

G1 G2 G4A G4B G4C

∆∆R

n30 DIAS

90 DIAS

RESULTADOS

103

GRÁFICO 19: Quantificação por PCR em tempo real de IL - 10 no pulmão dos camundongos

BALB/c imunizados duas vezes. Os resultados expressos em ∆Rn, mostram uma diminuição

significativa da produção de IL - 10 em animais analisados 30 e 90 dias após a infecção com a

levedura radioatenuada em relação ao controle positivo (p<0,05). Os animais infectados com o

fungo não irradiado (G1) foram utilizados como controle positivo. G2 = camundongos inoculados

com P. brasiliensis radioatenuado G4A = camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a

imunização. G4B = camundongos imunizados e desafiados 45 dias após a imunização. G4C =

camundongos imunizados e desafiados 60 dias após imunização. Experimento realizado com n=3.

0

10

20

30

40

50

60

70

G1 G2 G4A G4B G4C

∆∆R

n30 DIAS

90 DIAS

RESULTADOS

104


BALB/c imunizados duas vezes. Os resultados foram expressos em ∆Rn. G1 = camundongos

inoculados com P. brasiliensis não irradiado, G2 = camundongos inoculados com P. brasiliensis

radioatenuado G4A = camundongos imunizados e desafiados 30 dias após a imunização. G4B =

camundongos imunizados e desafiados 45 dias após a imunização. G4C = camundongos

imunizados e desafiados 60 dias após imunização. Experimento realizado com n=3.

0

0.01

0.02

0.03

0.04

G1 G2 G4A G4B G4C

∆∆R

n30 DIAS

90 DIAS

DISCUSSÃO

105

VI – DISCUSSÃO

DISCUSSÃO

106

Até o momento não existem vacinas profiláticas ou terapêuticas eficazes contra a PCM

ou contra outras micoses de importância médica. Na PCM, bem como em outras micoses

profundas, o principal mecanismo de defesa do hospedeiro contra o fungo patogênico é a

resposta imune mediada por células (Silva et al., 1981; Singer-Vermes et al., 1993).

Em relação ao P. brasiliensis, existem poucas publicações descrevendo a importância

dos antígenos do fungo na modulação da resposta imune. O principal componente

antigênico de P. brasiliensis, uma glicoproteína de 43 kDa (gp43), apresentou eficácia

como antígeno protetor. Indivíduos saudáveis, sensíveis ao fungo, quando imunizados com

a gp43, produziram níveis substanciais de IFN-γ, IL-2 e IL-10, refletindo em um bom

equilíbrio na secreção de citocinas com conseqüente estabelecimento de uma resposta

imune efetiva. Ao contrário, os pacientes com PCM produziram baixos níveis de IL-2, IFN-

γ e TNF-α, porém quantidades substanciais de IL-10. Este desequilíbrio na produção de

citocinas parece comprometer a resposta imune do hospedeiro com a diminuição da

atividade microbicida e habilidade da apresentação do antígeno pelos macrófagos (Bava et

al., 1991; Deepe, 2004). Além disso, imunizações com um peptídeo de 15 aminoácidos

identificado na molécula gp43, induziu proteção vigorosa contra subsequente desafio

intratraqueal por leveduras virulentas de P. brasiliensis, com grande diminuição da carga

fúngica do pulmão e menor ou nenhuma disseminação para o baço e fígado, quando

comparado com os animais controle (Taborda et al., 1998; Taborda et al., 2004). Uma

vacina de DNA contra a paracoccidioidomicose em murinos, construída a partir do gene da

gp43, também foi protetora contra desafios intratraqueais com a levedura virulenta (Pinto et

al., 2000).

DISCUSSÃO

107

Em adição, antígenos solúveis de P. brasiliensis (PbAg) e as frações obtidas por

cromatografia de troca iônica de extrato de P. brasiliensis (F0, FII e FIII), apresentaram

variações na indução da resposta celular. Camundongos imunizados com a F0 e FII

desenvolveram PCM benigna crônica restrita ao pulmão, associada a baixas taxas de

mortalidade e presença de granulomas compactos com poucas células fúngicas. Os animais

imunizados com a F0 apresentaram significativa produção de IFN-γ e altos níveis dos

isotipos IgG2a e IgG3. As imunizações com FII induziram produção significativa de IFN-γ

e IL-10 associada aos altos níveis de IgG1 e IgG2a. Tanto F0 quanto a FII promoveram

uma diminuição significativa das unidades formadoras de colônias (UFCs) recuperadas do

pulmão, após a infecção desafio, sem disseminação para o baço e o fígado. Por outro lado,

os camundongos imunizados com a FIII desenvolveram uma doença disseminada e

progressiva no baço e fígado resultando em alta produção de IgG1 e IgG2a, e baixa

produção de IgG2b e IgG3 após o desafio. Estes animais não foram capazes de controlar a

infecção desafio apresentando disseminação do fungo, altos níveis de anticorpos

específicos e lesões granulomatosas com alto número de células fúngicas viáveis. (Diniz et

al., 2004).

Como já salientado, muitas vacinas vivas bem sucedidas foram obtidas a partir de

microrganismos atenuados pelo tratamento térmico, cultivo prolongado ou radiação

ionizante. Neste trabalho foi explorado, pela primeira vez, a utilização de leveduras do P.

brasiliensis atenuadas por radiação gama, com o intuito de avaliar a sua capacidade de

desencadear uma resposta imune protetora na PCM experimental.

Inicialmente, as amostras de Pb18 foram atenuadas por irradiação gama a uma dose

de 6,5 kGy. Esta dose foi definida a partir de estudos realizados em nosso laboratório, os

DISCUSSÃO

108

quais demonstraram que as leveduras radioatenuadas perderam a capacidade de se

reproduzir, provavelmente devido as duplas quebras provocadas pela radiação ionizante na

molécula de DNA (Frankenberg et al., 1981; Rhind et al., 1998).

Além disso, a perda da virulência, também averiguada em estudos preliminares,

parece ter sido irreversível, pois nenhuma colônia foi recuperada dos órgãos dos

camundongos infectados com P. brasiliensis radioatenuado. Contudo, vários cuidados

devem ser tomados durante o estudo de uma vacina constituída de microrganismo vivo.

Entre eles, destacam-se a preocupação com a estabilidade da perda da virulência e, no caso

de micoses profundas, a garantia da eliminação do microrganismo vivo atenuado pelo

hospedeiro, pois caso contrário podem se formar focos de reativação da doença (Deepe,

1997). Estes riscos podem limitar a utilização da vacina, caso estudos criteriosos de

virulência e proteção não forem realizados em modelos animais.

Sabendo – se disso, novos ensaios de virulência foram realizados com o propósito

de confirmar a perda da capacidade do P. brasiliensis de provocar infecção. Para isso,

camundongos machos suscetíveis BALB/c e camundongos imunodeprimidos NUDE-

NUDE foram inicialmente infectados pela via endovenosa com células fúngicas viáveis

radioatenuadas de um isolado altamente infeccioso (Pb18). O desenvolvimento da doença

nos animais infectados foi analisada 30 e 90 dias após a infecção.

Os resultados obtidos no ensaio de virulência confirmaram a perda da virulência do

fungo radioatenuado, uma vez que nenhuma colônia foi recuperada dos órgãos dos

camundongos BALB/c 30 e 90 dias após a infecção. Mesmo nos camundongos Nude-Nude

que são destituídos de timo e, portanto não apresentam imunidade dependente de célula T,

não houve recuperação de colônias após 30 dias. Este resultado foi consolidado através do

ensaio de histologia, onde não foram observadas alterações histopatológicas em nenhum

DISCUSSÃO

109

dos órgãos analisados dos camundongos infectados com a levedura radioatenuada. Além

disso, os resultados do teste de ELISA mostraram uma baixa reatividade de IgG nos soros

dos camundongos infectados com o P. brasiliensis radioatenuado frente ao antígeno Mexo,

comprovando a atenuação dessas leveduras. Estes resultados estão de acordo com os dados

já reportados na literatura, onde os altos títulos de anticorpos específicos contra os

componentes do fungo são geralmente correlacionados com a infecção progressiva e o

desenvolvimento da doença. Enquanto que os baixos níveis estão relacionados com um

quadro de infecção controlada (Franco et al., 1989).

Infecções experimentais obtidas pela inoculação de patógenos em animais de

laboratório tem sido amplamente desenvolvidas a fim de melhor entender a sua interação

com o hospedeiro. O modelo murino em PCM, descrito por Calich e colaboradores (1998),

destacou diferenças quanto ao padrão de susceptibilidade em diferentes espécies de

camundongos isogênicos. Além disso, dependendo da dose inoculada, da via de inoculação,

da virulência da amostra utilizada ou ainda de alterações individuais, podem ocorrer

variações comportamentais em uma mesma espécie animal (Lacaz, 1949; Brito & Fava

Netto, 1963).

Mackinnom (1959), em estudos utilizando camundongos inoculados por 7 vias

diferentes (broncoalveolar, endovenosa, peritoneal, intramuscular, lingual, subcutânea, e

intestinal), demonstrou que houve infecção e estabelecimento de doença em todos os

animais inoculados por via broncopulmonar (instilação nasal) e via endovenosa. Em adição,

Linares & Friedman (1972), analisando diferentes amostras de P. brasiliensis

demonstraram que elas eram mais virulentas por via endovenosa do que por via intranasal.

Apenas uma amostra foi mais virulenta por inoculação intranasal. Portanto neste trabalhos

DISCUSSÃO

110

optamos pela via endovenosa por ser mais prática do ponto vista experimental e altamente

infecciosa.

O antígeno extracelular e de membrana (Mexo) utilizado neste trabalho pode ser

utilizado alternativamente nos métodos de diagnósticos de imunocromatografia em PCM

devido a sua alta imunogenicidade (Reis et al., 2005). Esta tem se mostrado maior que a do

PbAg (antígeno somático), provavelmente devido ao contato primário do hospedeiro com

as proteínas secretadas do fungo.

A dosagem de citocinas realizadas por PCR em tempo real em animais infectados

com P. brasiliensis não irradiado (G1) e radioatenuado (G2), foram coerentes com os

resultados obtidos nos ensaios de virulência. Os testes revelaram uma produção

significativa em relação ao controle positivo de citocinas pró-inflamatórias como IFN-γ e

TNF-α, e baixos níveis de IL-10 nos camundongos BALB/c analisados 30 e 90 dias após a

infecção com as leveduras radioatenuadas. Porém, a citocina IL-5 apresentou um resultado

paradoxal apresentando-se elevada após 90 dias.

Como já documentado, o IFN-γ exerce um papel relevante na resistência do

hospedeiro a infecção pelo P. brasiliensis devido a sua capacidade de ativar macrófagos a

eliminar o fungo, favorecendo com isso a não disseminação e progressão da doença (Cano

et al., 1998). A depleção de IFN-γ em camundongos suscetíveis ou resistentes usando

anticorpos monoclonais anti - IFN-γ exacerbou a infecção pulmonar, com disseminação

precoce do fungo para outros tecidos (Cano et al., 1998). Além disso, o IFN-γ estimula

macrófagos a secretarem TNF-α. Os altos níveis destas duas citocinas agem sinergicamente

na ativação da resposta imune (Mamoni et al., 2005) através da formação do granuloma e

produção de óxido nítrico (Gonzalez et al., 2000).

DISCUSSÃO

111

Os altos níveis de IFN-γ e TNF-α, observados em resposta a infecção com a

levedura radioatenuada sugerem que uma vacina baseada nestas leveduras dispensaria a

utilização de adjuvantes, pois esta se mostrou capaz de ativar satisfatoriamente a imunidade

inata.

Os altos níveis de IL-10 observados em camundongos infectados com o fungo não

irradiado parecem estar favorecendo o estabelecimento da doença progressiva, uma vez que

não foi observado desenvolvimento de doença em camundongos que apresentaram níveis

baixos desta citocina. De fato a IL-10 inibe a ativação e as funções efetoras de células T,

monócitos e macrófagos, além de limitar e finalizar as respostas inflamatórias (Yssel et al.,

1992; Mamoni et al., 2005). Em adição, esta citocina esta relacionada com a estimulação da

proliferação e diferenciação de células B, aumentando a secreção de anticorpos (Powrie,

Bean & Moore, 1997).

Em resumo, as análises de citocinas dos grupos infectados indicam que um perfil de

resposta do tipo Th1, verificada a partir dos altos níveis de IFN-γ e TNF-α acompanhados

de uma baixa produção de IL-10, foi estimulada pela inoculação das leveduras

radioatenuadas. No grupo dos animais infectados com a levedura não irradiada um perfil

Th2 foi estabelecido com baixa produção de IFN-γ e TNF-α, e alta produção de IL-10.

Esses resultados estão de acordo com o que foi observado nos ensaios de recuperação de

UFCs e análise histológicas.

Comprovada a inabilidade de P brasiliensis atenuado de provocar infecção,

partimos para os ensaios de proteção. As leveduras radioatenuadas foram utilizadas com o

intuito de desencadear uma resposta imune protetora em camundongos suscetíveis à

infecção pelo P. brasiliensis.

DISCUSSÃO

112

Inicialmente, camundongos machos suscetíveis BALB/c foram imunizados pela via

endovenosa com células viáveis da levedura radioatenuada e, em seguida desafiados com o

fungo não irradiado 30, 45 e 60 dias após a imunização. Os animais foram analisados

quanto a capacidade de desenvolver a doença 30 e 90 dias após as infecções desafio. Esses

camundongos, conforme descrito por Benard e colaboradores (2001), são suscetíveis à

infecção pelo P. brasiliensis, apresentando alta produção de IL-10 e um perfil de resposta

imune preferencial do tipo Th2. Apresentam a formação de numerosos granulomas

disseminados, pobremente organizados, ricos em fungos, caracterizando uma doença

progressiva e letal (Calich, 1998).

O granuloma causado pelo P. brasiliensis está intimamente relacionado com a

resposta imune do hospedeiro. Assim, ele representa uma resposta tecidual imune-

específica contra antígenos do P. brasiliensis, visando destruí-lo, bloqueá-lo, circunscrevê-

lo, impedindo sua multiplicação e disseminação no organismo. Esta resposta tecidual

granulomatosa seria predominantemente ligada à imunidade celular, podendo então ser

conceitualmente classificada como uma reação de hipersensibilidade do tipo V ou

granulomatosa (Adams, 1976).

As alterações morfológicas da PCM seguem os padrões observados nas micoses

profundas e, em geral não diferem essencialmente daquelas observadas em infecções por

outro tipo de microrganismo. O único achado do quadro histológico que distingue a

infecção pelo P. brasiliensis de outras condições inflamatórias crônicas granulomatosas, é o

encontro de células fúngicas nas lesões (Lacaz & Ramos, 1956).

Os resultados obtidos nos ensaios de proteção demonstraram que as leveduras

radioatenuadas foram capazes de proteger os animais contra a infecção por amostras de P.

brasiliensis altamente infecciosas, pois a recuperação de unidades formadoras de colônias

DISCUSSÃO

113

nos órgãos analisados foi significativamente menor em relação ao controle positivo. Apesar

disso, observamos que uma única dose de imunização não foi suficiente para eliminar os

focos resistentes do fungo, resultando no desenvolvimento tardio da PCM. Um notável

aumento da proteção foi obtido em camundongos imunizados duas vezes consecutivas,

analisados 90 dias após o contato com o agente infeccioso. A proteção estabelecida foi de

99,5%. Como não foram observadas diferenças significativas quanto a recuperação de

colônias nos animais imunizados duas vezes, consideramos todos os subgrupos como um

único grupo e calculamos a proteção baseada na média geral. Este resultado foi confirmado

em ensaios histopatológicos, os quais mostraram a presença de tecidos sadios sem a

formação de lesões granulomatosas e presença de células fúngicas, caracterizando um

quadro de infecção controlada provavelmente devido a participação efetiva da imunidade

celular.

Este alto nível de proteção verificado após um período prolongado de exposição ao

fungo não irradiado é um aspecto relevante na proteção contra a PCM devido a capacidade

de P. brasiliensis de iniciar uma infecção após um longo período de dormência. Como

abordado por Brummer e colaboradores (1993), é comum pacientes desenvolverem a

doença mais de uma década depois de abandonar uma região endêmica.

A resposta humoral desencadeada pela imunização com a levedura radioatenuada

em camundongos BALB/c foi analisada em ensaio de ELISA, utilizando o conjugado para

IgG total. Os soros dos camundongos coletados semanalmente após as infecções desafio

reconheceram de forma significativa o antígeno Mexo. Este resultado demonstra que apesar

da imunidade celular ser considerada o principal mecanismo de defesa envolvido na

paracoccidioidomicose, a produção de certos isotipos do anticorpo IgG, tal como IgG2a

(Calich, 1998), exercem um importante papel no estabelecimento da proteção. São potentes

DISCUSSÃO

114

agentes opsonizadores que em conjunto com o sistema complemento promovem a

destruição e eliminação das células fúngicas (Restrepo & Moreno, 1993).

Após observado a produção dos altos níveis de IgG anti-Mexo nos soros dos

camundongos imunizados e, posteriormente desafiados, iniciamos novos ensaios de

ELISA, afim de verificar se havia diferenças quanto ao perfil de anticorpos dos isotipos de

IgG (IgG1 e IgG2a) e a sua correlação com o estabelecimento do quadro de proteção

observado em nossos experimentos.

Os resultados obtidos em relação a produção dos isotipos de IgG frente o antígeno

Mexo, revelaram que os camundongos submetidos à uma única imunização produziram

preferencialmente IgG1 em relação a IgG2a, provavelmente devido a ação de citocinas

típicas das respostas linfocitárias Th2.

Nos animais submetidos a duas imunizações a produção de IgG2a e IgG1 foi

semelhantes no soro dos camundongos analisados 30 dias após os desafios. Porém, quando

analisados 90 dias após a segunda imunização houve aparentemente uma maior resposta

para IgG2a, característica do estabelecimento do perfil Th1. Interessantemente, este

resultado esta de acordo com o quadro de proteção verificado 90 dias após o desafio em

camundongos imunizados duas vezes.

A resposta celular envolvida no quadro de proteção estabelecido em camundongos

imunizados duas vezes consecutivas, principalmente após 90 dias das infecções desafio foi

analisada através da dosagem de citocinas por PCR em tempo real.

As citocinas possuem um importante papel na regulação da resposta imune e na

mudança de isotipos das imunoglobulinas (Snapper et al., 1997). Na PCM experimental, o

perfil Th1 está relacionado com a produção de citocinas IL-2 e IFN-γ, as quais estimulam a

DISCUSSÃO

115

resposta imune mediada por células, com a ativação de macrófagos e linfócitos T (Calich et

al., 1998; Cano et al, 1987 & Kashino et al., 2000). Além disso elas estão envolvidas na

mudança da subclasse de IgG, a qual favorecer a fixação de complemento e opsonização, e

consequentemente o controle da infecção e progressão da doença (Cano et al., 1995). Ao

contrário, o perfil Th2 favorece a produção preferencial de citocinas IL-4, IL-5 e IL-10 e o

desencadeamento de uma resposta humoral, não essencialmente protetora na PCM (Calich

et al., 1998; Cano et al, 1987; Kashino et al., 2000).

Este padrão polarizado descrito na PCM não foi observado entre camundongos

suscetíveis (B10.A) e resistentes (A/Sn). Os camundongos suscetíveis em resposta à

infecção secretaram inicialmente baixos níveis de citocinas como IFN-γ e TNF-α

associadas a produção de IL-5, IL-10 e TGF-β, seguida pela produção tardia de IL-4,

caracterizando o padrão de resposta Th2. Enquanto os animais resistentes apresentaram

secreção prematura de altos níveis de TNF-α e IFN-γ, caracterizando um padrão Th1

(Calich, 1998).

Os nossos resultados revelaram a produção de altos níveis de IFN-γ nos animais

analisados 30 e 90 dias após as infeções desafios. Estes dados sugerem que o efeito protetor

conferido pelas leveduras radioatenuadas pode ser atribuído a alta produção desta citocina

em animais imunizados, provavelmente devido a seu importante papel na ativação de

macrófagos como já salientado anteriormente nesta discussão. Ao mesmo tempo, os baixos

níveis de IL-10 associados aos altos níveis de IFN-γ intensificaram a atividade fungicida e a

apresentação de antígenos pelos macrófagos.

A produção de TNF-α foi elevada em camundongos imunizados, analisados 30 dias

após as infecções desafio. Estes níveis se mantiveram após 90 dias, apesar de terem sido

DISCUSSÃO

116

inferiores quando comparados com o controle positivo e no grupo dos camundongos apenas

imunizados (G2).

Nos grupos dos camundongos imunizados a produção de IL-5 apresentou- se

aumentada em relação ao controle no início da infecção (30 dias), porém houve uma

diminuição acentuada de seu níveis após 90 dias, se igualando ao patamar encontrado no

controle positivo (G1).

Em síntese, os resultados de citocina analisados nos grupos dos animais imunizados

duas vezes consecutivas, sugerem que após 30 dias do desafio não houve um

estabelecimento de resposta imune polarizada, visto a produção concomitante de citocinas

do tipo Th1 e Th2. Após 90 dias, uma resposta do tipo Th1 parece ter se definindo com o

predomínio da produção de IFN-γ e TNF-α e baixos níveis de IL-10 e IL-5. Os resultados

das análises de IgG1 e IgG2a, recuperação de UFCs e histológica, comentados

anteriormente, são coerentes e reforçam esta conclusão.

Concluíndo, os resultados apresentados nesta dissertação demonstraram a

capacidade das leveduras radioatenuadas de induzir uma resposta imune protetora, abrindo

com isso, um leque de perspectivas na busca de novas alternativas profiláticas e

terapêuticas contra a PCM.

As leveduras radioatenuadas são também uma poderosa ferramenta experimental

para o estudos da imunidade protetora e vem somar-se aos esforços para aumentar os

conhecimentos sobre os mecanismos imunopatogênicos emvolvidos nesta enfermidade.

CONCLUSÕES

117

VII – CONCLUSÕES

CONCLUSÕES

118

• As leveduras radioatenuadas de P. brasiliensis perderam sua capacidade de provocar

infecção, tendo assim sua virulência atenuada.

• Os resultados sugerem que a infecção dos animais com o fungo não irradiado provocou

uma supressão da resposta celular (Th1).

• Os resultados indicam que as leveduras radioatenuadas foram capazes de desencadear

uma resposta imune celular e uma conseqüente supressão da resposta humoral.

• As leveduras radioatenuadas de P. brasiliensis foram capazes de induzir proteção em

camundongos BALB/c desafiados 30, 45 e 60 dias após a imunização.

• Não foram verificadas variações significativas quanto ao efeito protetor variando-se o

tempo para o desafio após as imunizações.

• A utilização de uma única imunização, embora tenha apresentado um significativo

efeito protetor, não foi capaz de conter o desenvolvimento tardio da infecção.

• Um notável efeito protetor foi verificado no grupo submetido a duas imunizações,

quando analisado 90 dias após as infecções desafio.

• A imunoglobulina IgG presente nos soros dos camundongos imunizados com as

leveduras radioatenuadas e, posteriormente desafiados foi capaz de reconhecer o

antígeno Mexo em todos os subgrupos analisados. Sugerindo a participação da resposta

humoral no estabelecimento da proteção em PCM experimental.

• No grupo dos animais imunizados duas vezes, analisados 30 dias após as infecções

desafio, não foi identificada uma resposta polarizada, ocorrendo a produção de citocinas

CONCLUSÕES

119

relacionadas às respostas Th1 e Th2 e a produção predominante do isotipo IgG1 em

relação ao IgG2a.

• Após 90 dias, em paralelo ao quadro de proteção observado, ocorreu uma maior

produção do isotipo IgG2 em relação a IgG1, e um predomínio da produção das

citocinas IFN-γ e TNF-α, configurando-se o estabelecimento de uma resposta Th1.

PERSPECTIVAS

120

VIII – PERSPECTIVAS

PERSPECTIVAS

121

Os resultados satisfatórios obtidos neste trabalho abrem perspectivas para aprofundar

nossos estudos na busca de um vacina em modelos animais. Muitos parâmetros podem ser

estudados para melhorar a eficácia da vacina. As seguintes abordagens são sugeridas:

• Tendo em vista o aumento na proteção verificado em camundongos imunizados

duas vezes em relação aos imunizados uma única vez, um número maior de

imunizações deverá ser avaliado.

• Sabendo-se que as respostas podem variar em função da via de imunização,

diferentes vias também serão testadas.

• Será avaliado também a influência da utilização de adjuvantes no efeito protetor.

• O efeito terapêutico da vacina e a sua associação com drogas anti fúngicas será

analisado.

.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

122

IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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ANEXO I

139

X – ANEXOS

comissão nacional de energia nuclear centro de ... · centro de desenvolvimento da tecnologia...

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