Fig. 1.1 Micrótomo para cortar tecidos incluídos em parafina ou em resina. Acionando-se a manivela (à direita da figura), o blococontendo o fragmento de tecido sobe e desce. Após cada volta da manivela, o bloco avança uma distância definida (geralmente 1-10�m) e, ao passar pela navalha, deixa uma fatia do tecido. (Cortesia de Microm.)

Manivela

Suporte do bloco

Bloco de parafina

Fragmento de tecido

Navalha

Fig. 1.2 Desenho esquemático de um microscópio de luz mostran-do seus componentes principais e o trajeto da luz desde a fonteluminosa até o olho do observador. (Cortesia de Carl Zeiss Co.)

Lâmpada

Lente ocular

Prisma

Lenteobjetiva

Espécime

Platina

Condensador

Filtro de luz

Controles demovimento da platina

Controles de ajustede foco

Espelho

Fig. 1.3 Células da crista neural foram cultivadas e examinadas pormeio de três sistemas ópticos diferentes. O preparado não estácorado e as mesmas células aparecem em todas as fotografias – useas duas células pigmentadas para orientar-se em cada imagem. A:Microscopia de luz convencional. B: Microscopia de contraste defase. C: Microscopia de diferença interferencial de contraste segun-do Nomarski. Grande aumento. (Cortesia de S Rogers.)

A B

C

Fig. 1.4 Microscopia de luz polarizada. Um fragmento de mesen-tério de rato foi corado com o método de picro-sirius, que corafibras de colágeno. O mesentério foi colocado sobre a lâmina eobservado por transparência. Sob luz polarizada, as fibras decolágeno exibem intensa birrefringência e aparecem brilhantes ouem amarelo. Médio aumento.

Fig. 1.5 Princípio da microscopia confocal. Luz originada de umplano do corte cruza o pequeno orifício existente em um obstá-culo e alcança um detector; no entanto, raios originados de ou-tros planos são bloqueados pelo obstáculo. Desta maneira, só umplano muito delgado do espécime é analisado de cada vez.

Planofocalizado

Detector

Obstáculocom orifício

Lente

Alguns planosfocais possíveis

Espécime

Fig. 1.6 Arranjo usual de um microscópio confocal. A ilumina-ção de uma fonte de laser atinge o espécime e é refletida. Um es-pelho dirige a luz refletida a um obstáculo que possui um peque-no orifício. A luz proveniente de planos do espécime que estão àfrente ou atrás do plano focalizado é bloqueada pelo obstáculo.O laser varre o espécime para que uma área maior do corte possaser observada.

Detector

Obstáculocom orifício

Fontede laser

Rastreador dailuminação

Divisor de feixe

Lente

Espécime

Planofocalizado

Fig. 1.7 Fotomicrografia de células de rim de hamster em cultu-ra, coradas com alaranjado de acridina. Por meio de um micros-cópio de fluorescência, o DNA (no interior dos núcleos) emite luzamarela, enquanto o citoplasma rico em RNA aparece de coravermelhada ou laranja. Grande aumento. (Cortesia de AGeraldes e JMV Costa.)

Fig. 1.8 Fotografia do microscópio eletrônico de transmissão 906E.(Cortesia de Carl Zeiss.)

Canhão eletrônico

Catodo

Anodo

Bobinaelétrica

Lente objetiva

Lente projetora

Placa fluorescente

Filme fotográfico

Câmera CCD

Coluna

Janelade vidro

Porta-espécimeMalha de cobrecom três cortes

Lente condensadora

Lente intermediária

Fig. 1.9 Desenho esquemático de um microscópio de transmis-são com seus principais componentes.

Fig. 1.10 Desenho esquemático de um microscópio eletrônico devarredura com seus principais componentes.

Catodo

Anodo

Lente condensadora

Bobina elétrica

Lente

Rastreador

EspécimeMonitor

Amplificadorde sinal

Detectorde elétrons

Canhãoeletrônico

Lente

Coluna

Fig. 1.11 Radioautogramas de glândulas salivares submandibulares de um camundongo que foi injetado com 3H-fucose 8 horasantes do sacrifício. Em cima: ao microscópio de luz se observam grãos negros de prata (setas), que indicam as regiões celulares queestão radioativas. A maior parte da radioatividade está localizada nos grânulos citoplasmáticos das células dos ductos glandulares.Aumento médio. Embaixo: tecido preparado para observação em microscópio eletrônico de transmissão. Observe os grãos de prataque aparecem como estruturas enoveladas (setas) localizadas principalmente sobre os grânulos citoplasmáticos (G) e no lúmen (L)dos túbulos. Grande aumento. (Cortesia de T.G. Lima e A. Haddad.)

Fig. 1.12 Radioautogramas de cortes de órgãos de um rato quefoi injetado com 3H-timidina. Os radioautogramas foram expos-tos durante um tempo muito longo e por esta razão os núcleosradioativos se tornaram fortemente marcados e aparecem cober-tos por uma grande quantidade de grânulos escuros. A: Muitascélulas epiteliais estavam se dividindo na base das glândulasintestinais, mas nenhuma no restante das vilosidades. B: Um cortede linfonodo mostra que a divisão de sua célula ocorre principal-mente nos centros germinativos desta estrutura. (Cortesia deTelma MT Zorn, Mauricio Soto-Suazo, Cleusa MR Pellegrini e WEStumpf.)

Fig. 1.13 Fotomicrografia de fibroblastos de galinha que foramcultivados e infectados com Trypanosoma cruzi, que são as peque-nas partículas espalhadas pelo citoplasma (setas). Embora a se-paração entre as células não seja visível, os seus núcleos são fa-cilmente observados (N). Coloração pelo método de Giemsa.Médio aumento. (Cortesia de S. Yoneda.)

Fig. 1.14 O fracionamento celular permite o isolamento de compo-nentes da célula através de centrifugação diferencial. A coluna dedesenhos na porção direita da figura mostra as organelas celularesobtidas ao fundo de cada tubo após cada centrifugação. A forçacentrífuga é expressa em unidades g, equivalentes à força da gravi-dade. (1) Um fragmento de tecido é picado com uma navalha debarbear ou com tesoura e depois dissociado com um homogeniza-dor ou por ultra-som. (2) O tecido dissociado permanece em repou-so durante cerca de 20 min para que grumos não dissociados e fi-bras da matriz extracelular precipitem. (3) O sobrenadante écentrifugado a 1.000 g por 20 min. Os núcleos são precipitados nofundo do tubo. (4) O sobrenadante é centrifugado a 10.000 g por 20min. Mitocôndrias e lisossomos precipitam. (5) O sobrenadante écentrifugado a 105.000 g por 120 min. Os microssomos precipitam.(6) Se o sobrenadante é tratado com desoxicolato de sódio antes dacentrifugação, os microssomos se dissociam e precipitam separada-mente como ribossomos e membranas do retículo endoplasmáticogranuloso. (Redesenhado e reproduzido, com permissão, de BloomW, Fawcett DW: A Textbook of Histology, 9a ed. Saunders, 1968.)

Célula intacta

Célulasdissociadas

Núcleos

Mitocôndriase lisossomos

Microssomos

Membranasdo retículo

endoplasmático

Ribossomos

1

2

4

3

5

6

Fig. 1.15 Micrografias eletrônicas de três frações celulares isoladas por centrifugação em gradiente de densidade. A: Fração de mito-côndrias, contaminada com retículo endoplasmático. B: Fração de microssomos. C: Fração de lisossomos. Grande aumento. (Corte-sia de P. Baudhuin.)

Fig. 1.16 Fotomicrografia de um corte de osso tratado por umatécnica histoquímica para demonstrar íons cálcio. O precipitadoescuro indica a presença de fosfato de cálcio no osso e na cartila-gem calcificada. Tecido cartilaginoso não calcificado (corado emmarrom) está na metade superior da figura. Médio aumento.(Fotomicrografia obtida por P.A. Abrahamsohn.)

Fig. 1.17 Fotomicrografia de corte de rim tratado pelo método deGomori para demonstrar a enzima fosfatase alcalina. Os locaisonde esta enzima está presente (superfícies celulares) estão es-curos devido ao precipitado de sais de chumbo (setas). Médioaumento.

Fig. 1.18 Detecção de fosfatase ácida. Micrografia eletrônica de uma célula de rim de rato que mostra três lisossomos (L) junto de umnúcleo (N). O depósito escuro no interior destas organelas é fosfato de chumbo que precipitou nos locais onde havia fosfatase ácida.Grande aumento. (Cortesia de E Katchburian.)

Fig. 1.19 Fotomicrografia de uma vilosidade intestinal corada pelatécnica de ácido periódico-Schiff. A intensa coloração nabordadura em escova da superfície celular (setas curtas) e noproduto de secreção das células caliciformes (setas longas) é de-vida ao alto conteúdo de polissacarídeos nestas estruturas. Cor-te contracorado com hematoxilina. Grande aumento.

Fig. 1.20 Substâncias que têm grande afinidade por uma molé-cula podem ser marcadas e usadas para identificar esta molécu-la. (1) A molécula A tem uma afinidade intensa e específica poruma porção da molécula B. (2) Se A e B são colocadas em contacto,A se liga com a porção de B que ela reconhece. (3) Um marcador,visível em microscopia de luz ou eletrônica, pode ser ligado àmolécula A. O marcador pode ser um composto fluorescente, umaenzima como a peroxidase, uma partícula de ouro ou um átomoradioativo. (4) A molécula B pode ser detectada se estiver pre-sente em uma célula ou na matriz extracelular que forem incu-badas com a molécula A.

Fig. 1.21 Alguns métodos de separação de proteínas: ultracentrifugação (A) e cromatografia (B). A: Umamistura de proteínas obtida de células ou de tecidos homogeneizados é submetida a centrifugação emalta velocidade por várias horas. As proteínas se separam em bandas, de acordo com o tamanho e a den-sidade das moléculas. Em seguida, o meio em que foi feita a centrifugação é drenado e dividido em váriasfrações que contêm as diferentes proteínas, que podem então ser analisadas separadamente. B: Uma solu-ção contendo uma mistura de proteínas é colocada em uma coluna preenchida por partículas dotadas dediferentes propriedades. As partículas podem, por exemplo, ter diferentes cargas eletrostáticas (atraindoproteínas de acordo com suas cargas) ou podem ter poros (agindo como peneiras para moléculas de dife-rentes tamanhos). Durante a migração das proteínas pela coluna, seu movimento é retardado pela intera-ção com as partículas. Quando o líquido da coluna é recolhido, diferentes grupos de proteínas podem sercoletados separadamente.

Fig. 1.22 Separação de proteínas por eletroforese em gel. A: Isolamento das proteínas. (1) Misturas deproteínas são obtidas de células e tecidos homogeneizados. Elas são freqüentemente tratadas com umdetergente (dodecil sulfato de sódio) e com mercaptoetanol para desenovelar e separar as cadeias esubunidades de proteínas. (2) As amostras são colocadas na porção superior de uma placa de gel depoliacrilamida, a qual é submetida a uma corrente elétrica contínua. (3) As proteínas migram ao longodo gel de acordo com seu tamanho e forma. Uma mistura de proteínas conhecidas também é colocadano gel para servir como padrão de pesos moleculares. B: Detecção e identificação das proteínas. (1)Coloração. As proteínas são coradas e a intensidade de coloração é proporcional à concentração dasproteínas. (2) Radioautografia. Se algumas proteínas forem radioativas, elas poderão ser reconhecidaspor radioautografia. Para isto, um filme de raios X é colocado sobre o gel durante algum tempo e de-pois revelado. Proteínas radioativas serão denunciadas por manchas escuras no filme de raio X. (3)Immunoblotting. As proteínas podem ser transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose.Esta é incubada com um anticorpo que reconhece proteínas que podem estar presentes nas amostras.

Proteínas demassamolecularconhecida

Amostras

Gel

Gel

Fonte deenergia

1

2

3

A

Gel

Gel

Gel

Filme de raio X

1

2

3

B

Membrana denitrocelulose

Fig. 1.23 Técnica direta de imunocitoquímica. (1) Molécula deimunoglobulina (Ig). (2) Produção de anticorpo policlonal. Aproteína X de um rato é injetada em um animal de outra espécie,por exemplo, um coelho. Várias Igs de coelho são produzidascontra a proteína X. (3) Marcação do anticorpo. As Igs de coelhosão acopladas a um marcador. (4) Reação imunocitoquímica. AsIgs marcadas reconhecem e se ligam a diferentes porções da pro-teína X presentes em um corte, que pode ser observado no mi-croscópio.

Proteína X

Proteína X

Fig. 1.24 Técnica indireta de imunocitoquímica. (1) Produção deum anticorpo policlonal primário. A proteína X de um rato é in-jetada em um animal de outra espécie, por exemplo, um coelho.Várias Igs de coelho são produzidas contra a proteína X. (2) Pro-dução de um anticorpo secundário. Ig de um outro coelho, nor-mal e não imunizado, é isolada e injetada em um animal de umaterceira espécie, por exemplo, uma cabra. São produzidas Igs decabra contra Igs de coelho. As Igs de cabra são purificadas eacopladas a um marcador. (3) Primeira etapa da reação imunoci-toquímica. As Igs de coelho reconhecem e se ligam a diferentesporções da proteína X. (4) Segunda etapa da reação imunocito-química. As Igs de cabra marcadas reconhecem e se ligam às Igsde coelho, indicando a presença da proteína X.

Proteína X

Proteína X

Proteína X

Fig. 1.25 Fotomicrografia de uma célula decidual de camundongo cultivada in vitro. A proteína desmina, que forma filamentos in-termediários que fazem parte do citoesqueleto, foi detectada com uma técnica de imunofluorescência (imunocitoquímica) indireta.Uma malha de filamentos intermediários fluorescentes ocupa a maior parte do citoplasma. O núcleo (N) está corado em azul. Gran-de aumento. (Cortesia de Fabiano G Costa e P.A. Abrahamsohn.)

Fig. 1.26 Fotomicrografia de um corte de in-testino delgado no qual um anticorpo contraa enzima lisozima foi aplicado para demons-trar lisossomos em macrófagos e em célulasde Paneth. A cor marrom é o resultado dareação feita para demonstrar a enzima pero-xidase, marcador acoplado ao anticorpo se-cundário. Núcleos contracorados com hema-toxilina. Médio aumento.

Fig. 1.27 Antígeno carcinoembriônico éuma proteína presente em vários tumoresmalignos, principalmente da mama e intes-tinos. Esta fotomicrografia é uma demons-tração imunocitoquímica de antígenocarcinoembriônico em uma secção de umadenocarcinoma de intestino grosso. O an-ticorpo estava marcado com peroxidase,evidenciada pela cor marrom. Contracolo-ração: hematoxilina. Médio aumento.

Fig. 1.28 Secção de uma célula acinosa do pâncreas que foi incubada com anticorpo antiamilase e em seguida incubada com prote-ína A marcada com partículas de ouro. A proteína A tem uma alta afinidade por moléculas de anticorpo. As partículas de ouro sãovistas como pequenos pontos pretos sobre os grânulos de secreção maduros e sobre os grânulos imaturos em formação no complexode Golgi. Eletromicrografia. Grande aumento. (Cortesia de M Bendayan.)

Fig. 1.29 Corte de um tumor epitelial benigno (condiloma) sub-metido a hibridização in situ. As áreas marrons são locais onde oDNA de vírus de papiloma humano tipo 2 (HPVII) está presen-te. Contracoloração: hematoxilina. Médio aumento. (Cortesia deJE Levi.)

Fig. 1.30 Como diferentes estruturas tridimensionais são obser-vadas após serem cortadas em secções delgadas. A: Diferentessecções de uma esfera oca e de um tubo oco. B: Um corte ao lon-go de um único tubo enovelado pode ser visto como cortes devários tubos. C: Cortes através de uma esfera sólida e através deum cilindro sólido podem ser semelhantes.