PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEIO AMBIENTE

E DESENVOLVIMENTO REGIONAL

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CLASTOGÊNICO DE AMOSTRAS DE ÁGUAS FLUVIAIS EM ÁREA URBANA DO MUNICÍPIO DE PRESIDENTE PRUDENTE-SP

ATRAVÉS DO TESTE DE Allium cepa L.

ANA CAROLINA PRETO MALAMAN

Projeto de pesquisa apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Meio Ambiente e Desenvolvimento Regional, Pró-Reitoria e Pós-Graduação da Universidade do Oeste Paulista, como parte dos requisitos para a sua admissão ao curso de Mestrado.

Orientador: Dr. Paulo Antonio da SilvaCo-orientador: Dr. Antonio Fluminhan JúniorIniciação Científica: Gabriela Araújo LourençoIniciação Científica: Iago Fernandes SantosIniciação Científica: Nathália Caetano Tagliati

Presidente Prudente - SP

2017

RESUMO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CLASTOGÊNICO DE AMOSTRAS DE ÁGUAS FLUVIAIS EM ÁREA URBANA DO MUNICÍPIO DE PRESIDENTE PRUDENTE –SP

ATRAVÉS DO TESTE DE Allium cepa L.

Muitos problemas de saúde em humanos são atribuídos à contaminação do meio ambiente por resíduos decorrentes das atividades antrópicas. Para a avaliação de riscos mutagênicos, a detecção de agentes contaminantes e o biomonitoramento ambiental, os bioensaios com plantas superiores têm sido amplamente utilizados, sendo que uma das espécies mais empregadas é o Allium cepa L. (cebola comum). O objetivo dessa pesquisa é avaliar a citotoxicidade e a genotoxicidade da água coletada do córrego do Limoeiro, situado na cidade de Presidente Prudente, SP, por meio do sistema teste Allium cepa como bioindicador. Pretende-se verificar a ocorrência e os tipos de danos causados em células meristemáticas radiculares através dos testes de aberrações cromossômicas, índice mitótico e micronúcleo. Os testes serão realizados em amostras coletadas em cinco pontos do córrego, desde a sua nascente, ao longo do percurso do curso d’água dentro do município e até alguns quilômetros distantes da área urbana. Serão avaliados dois períodos do ano, sendo as primeiras amostras coletadas nos meses de junho a agosto, quando o clima é predominantemente seco. As demais amostras serão coletadas nos meses de janeiro a março, quando o clima tem predominância chuvosa. Serão utilizados 10 bulbos de Allium cepa para cada ensaio em cada um dos cinco pontos de amostragem. Serão utilizados como controle negativo bulbos mantidos sobre água destilada e, como controle positivo, bulbos mantidos em solução com peróxido de Hidrogênio a 300mM, perfazendo um total de 70 bulbos para os testes realizados em cada estação climática. Pontas de raízes em crescimento serão coletadas em fixador Carnoy e mantidos em geladeira até o preparo das lâminas. Será empregada a técnica de esmagamento de meristemas radiculares após a sua coloração pelo método de Feulgen. Configurações celulares serão observadas em microscópio óptico, através da técnica de varredura, onde serão contadas 2000 células por ponto de coleta. O índice mitótico será avaliado através da observação do número de células em cada fase da divisão celular. Será analisada a frequência dos diferentes tipos de aberrações cromossômicas, tais como: formação de anel, atraso na separação de cromátides-irmãs, presença de pontes e fragmentos cromossômicos em anáfase e telófase, formação de micronúcleos e outras anomalias que permitam a detecção de danos ao DNA a nível qualitativo. Os resultados serão submetidos à análise de variância pelo teste F e ao teste de Tukey para a comparação de médias ao nível de 5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico Assistat.

Palavras-chave: Biomonitoramento ambiental, Allium cepa L., Águas pluviais, Aberrações mitóticas, Mutagenicidade ambiental

1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

Atualmente muitos problemas de saúde em seres humanos são atribuídos à

contaminação do meio ambiente por resíduos decorrentes das atividades humanas.

Alguns tipos de câncer podem estar associados à utilização de água contaminada

por resíduos industriais que são lançados propositalmente nos cursos d’água, ou por

resíduos urbanos e agrícolas que são carregados de forma difusa através do

escoamento pluvial.

Presidente Prudente é considerada uma cidade de médio porte, sendo que a

sua população no ano de 2016 é estimada em de 223.749 habitantes (IBGE, 2016).

A sua localização geográfica compreende o paralelo 22°07’57”S e o meridiano

51°22’57”W, sendo o seu clima do tipo tropical continental sub-úmido e

caracterizado por um verão quente e chuvoso (AMORIM et al., 2009). Neste

município existe um sistema hidrográfico constituído por pequenos cursos d’água,

como o córrego do Botafogo e do Veado, formadores dos córregos do Cedro e do

Limoeiro, respectivamente. Ambos são afluentes do rio Santo Anastácio, um

importante rio do Oeste do Estado de São Paulo e que já foi o principal rio

responsável pelo abastecimento público de água da cidade de Presidente Prudente

(MARTIN, 2001; TEODORO; NUNES, 2011).

O córrego do Limoeiro é um corpo hídrico superficial que se encontra inserido

na Unidade de Gerenciamento de Recursos Hídricos do Pontal do Paranapanema

(UGRHI22) e que constitui, em parte, o limite geográfico dos municípios de

Presidente Prudente e Álvares Machado e que também é receptor de efluentes da

ETE de ambos municípios (TAKENAKA et al., 2013). Ele também constitui o

Balneário da Amizade, uma área que, ultimamente, sofre um intenso processo de

urbanização com alto índice de atividade antropogênica (BOAVENTURA et al.,

2010).

Para a avaliação, detecção de contaminantes e biomonitoramento em

ambientes de importância regional como o córrego do Limoeiro, os bioensaios com

plantas superiores têm sido amplamente utilizados, sendo que as espécies mais

comumente empregadas são: Allium cepa L. (cebola comum), Vicia faba L. (feijão-

fava), Zea mays L. (milho), Tradescantia spp (coração-roxo), Nicotiana tabacum L.

(fumo), Crepis capillaris (L.) Wallr. (barba-de-facão) e Hordeum vulgare L. (cevada)

(GRANT, 1994; 1999).

O teste de Allium cepa L. foi desenvolvido inicialmente por Levan (1938) e é

considerado uma ferramenta útil para a pesquisa básica do potencial genotóxico e

citotóxico de produtos químicos, substâncias complexas como extratos de plantas,

dejetos industriais e, principalmente, águas contaminadas.

A utilização de Allium cepa L. tem sido recomendada para análises de

efluentes devido a sua elevada sensibilidade, baixo custo, rapidez, facilidade de

manipulação e da utilização de amostras sem tratamento prévio, determinando-se a

diminuição do índice mitótico e a formação de aberrações cromossômicas (LEME;

MARIN-MORALES, 2009). Este teste é utilizado rotineiramente em laboratórios que

trabalham com testes de genética toxicológica, e é considerado uma ferramenta

valiosa quanto à determinação da contaminação ambiental, havendo um extenso

banco de dados de substâncias químicas já testadas através dele (FISKESJÖ, 1993;

CUCHIARA et al., 2012)

O teste com Allium cepa fornece dois parâmetros principais para análise de

toxidade que são classificados como: a) Parâmetros macroscópicos, que podem ser

observados através da formação de tumores, avaliação de crescimento de raízes e

presença de raízes torcidas, entre outros, e b) Parâmetros microscópicos, que

envolvem: o Índice mitótico, para a análise de taxa de divisão celular, ocorrência de

aberrações cromossômicas, como: cromossomos em anel, pontes cromossômicas,

retardo na separação de cromátides-irmãs, que ocorrem principalmente nas fases de

metáfase e anáfase, e formação de micronúcleos como indicadores de

anormalidades no DNA (MONARCA et al., 2000).

Este teste tem sido validado internacionalmente como bioindicador de amostras

ambientais (EVSEEVA et al., 2003), sendo utilizado como teste preliminar na

avaliação do potencial genotóxico e citotóxico de substâncias cancerígenas e como

bioindicador de contaminação ambiental (BARBÉRIO et al., 2009). Segundo estes

autores, devido ao crescimento da população humana, aliado ao consequente

aumento do consumo hídrico nas áreas urbanas e às notórias variações climáticas

observadas nos últimos anos, a realização de estudos com cursos d'água torna-se

necessários para o monitoramento das condições das águas dessas regiões.

Conforme descrito por Cuchiara et al. (2012), a partir de dados observados em

um grande número de estudos, pode-se concluir que o potencial mutagênico de

corpos d’água depende do contexto ao qual ele está inserido. Os autores pontuam

que locais com grande atividade industrial demonstram potencial mais elevado em

relação a locais com outros tipos de atividades, como a agropecuária e lavoura ou

regiões urbanas.

O regime de chuvas e fatores climáticos também são variáveis que devem ser

consideradas, pois estudos feitos em períodos de seca demonstraram maiores

potenciais genotóxicos se comparados aos períodos de chuva, onde há maior

diluição das amostras da água coletada (CUCHIARA et al., 2012)

No caso específico do córrego do Limoeiro, sabe-se que ele se enquadra na

classe 4, o qual deve ser destinado à navegação, harmonia paisagística e a usos

menos exigentes, de acordo com a resolução CONAMA no. 357/2005. Entretanto,

apesar desta recomendação, verifica-se que muitos efluentes são lançados ao longo

do seu percurso em área urbana, como é o caso da ETE Limoeiro, construída pela

SABESP em 1997, que despeja esgoto tratado com diversas substâncias químicas

desinfetantes de microrganismos, além das águas pluviais oriundas do córrego do

Veado, e de bairros localizados às margens do Balneário da Amizade, nos levando a

supor a existência de substâncias que podem apresentar potencial genotóxico sendo

lançadas no referido córrego.

A liberação de poluentes em corpos hídricos de forma inadequada é, muitas

vezes, clandestina, principalmente em grandes centros urbanos cuja gestão

ambiental dos resíduos e efluentes não acompanha de forma adequada o

crescimento econômico e populacional. Desta forma, justifica-se a avaliação da

mutagenicidade do córrego do Limoeiro através da realização do teste Allium cepa

L. Ressalta-se a sua recomendação devido à sua elevada sensibilidade, baixo custo,

rapidez de análise, facilidade de manipulação e da utilização de amostras sem

tratamento prévio.

Esta pesquisa possibilitará a coleta de informações de significativo valor

científico e social, em complementação aos diversos parâmetros físico-químicos de

qualidade das águas, normalmente avaliados pelas agências regulatórias oficiais.

2. OBJETIVOS

122.1. Objetivos Gerais

O objetivo dessa pesquisa é avaliar a citotoxicidade e a genotoxicidade das

amostras de água coletadas no córrego do Limoeiro, situado na cidade de

Presidente Prudente, São Paulo, por meio do sistema teste Allium cepa como

bioindicador, verificando os danos causados em células meristemáticas radiculares

através dos testes de aberrações cromossômicas, índice mitótico e de ocorrência de

micronúcleos.

2.2. Objetivos Específicos

Os testes para verificação do potencial clastogênico das águas do córrego do

Limoeiro serão realizados em amostras coletadas em cinco pontos do córrego,

desde a sua nascente, ao longo do percurso do curso d’água dentro do município e

até alguns quilômetros distante da área urbana.

Será avaliada também a sazonalidade destas observações, através da análise

em dois períodos do ano, sendo as amostras coletadas nos meses de junho a

agosto, quando o clima é predominantemente seco e entre os meses de janeiro a

março, quando o clima tem predominância chuvosa.

3. HIPÓTESES

Esta pesquisa pretende verificar as seguintes hipóteses:

1. A qualidade das águas do córrego do Limoeiro, representada pelo seu

potencial clastogênico, sofre variações devido às influências provocadas

pelas atividades antrópicas existentes nos municípios de Presidente

Prudente - SP e Álvares Machado - SP.

2. O potencial clastogênico das amostras de águas coletadas em locais mais

próximos das áreas urbanas será mais elevado do que o observado em

amostras coletadas na nascente do córrego e em locais distantes das

cidades.

3. As frequências de anormalidades cromossômicas observadas em ensaios

realizados na estação seca serão mais elevadas do que aquelas

observadas em ensaios realizados na estação chuvosa, refletindo o fato

de existir maior diluição dos agentes mutagênicos.

4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Testes com plantas superiores são reconhecidos como excelentes indicadores

de efeitos citotóxicos e mutagênicos de elementos químicos ambientais e são,

portanto, aplicados para detecção de mutagenicidade. Dois ensaios que são

considerados ideais para o monitoramento in situ e para testes de agentes

mutagênicos atmosféricos ou aquosos, envolvem a análise dos pelos estaminais de

Tradescantia e a análise de micronúcleos em Tradescantia, sendo que ambos

estudos podem ser utilizados em testes in vivo e in vitro (GRANT, 1994). Outras

plantas superiores que possuem grande número de marcadores genéticos são

Arabidopsis thaliana, Allium cepa, Hordeum vulgare, Vicia faba, e Zea mays

(GRANT, 1999). Segundo o autor, esses ensaios são recomendados como um meio

alternativo de detectar possíveis danos genéticos resultados da poluição ou do uso

de substancias químicas. Além disso, o autor menciona que, devido à facilidade de

coleta de dados e baixa exigência de infraestrutura laboratorial, todos eles são

considerados ideais para cientistas de países em desenvolvimento.

4.1 O teste Allium cepa

O teste Allium cepa é um teste muito conveniente para estimar efeitos danosos

de substâncias químicas e biológicas. Devido à sua excelente caracterização

genômica, com reduzido número de cromossomos e de grande dimensão, a cebola

é amplamente utilizada para vários propósitos desde que foi introduzida pela

primeira vez através do sistema de Levan em 1938. Posteriormente, o teste se

estendeu aos fatores de risco no monitoramento ambiental. O teste mostrou boa

correlação com outros sistemas de testes, envolvendo toxidade geral (crescimento

da raiz) e genotoxidade (aberrações cromossômicas).

O teste Allium cepa é sugerido como um padrão no monitoramento ambiental,

como parte da bateria de testes. Suas vantagens são: baixo custo, fácil manuseio,

boa condição dos cromossomos para o estudo de danos cromossômicos durante a

divisão celular incluindo a avaliação do risco de aneuploidia. O uso de series de

cebolas para cada concentração dos testes químicos permitem realizar

considerações estatísticas e a partir das curvas de crescimento os efeitos das

concentrações são obtidos. Esse teste se mostrou muito sensível em relação a

outros sistemas de testes. Os testes positivos no teste Allium cepa devem ser

considerados como alerta e também como indicação de que os químicos testados

podem causar riscos à saúde humana e ambiental (FISKESJO, 1985). Em um

estudo realizado na Suécia, os resultados do teste Allium cepa foram admitidos

como evidências em uma ação judicial contra a fábrica acusada de poluir um rio

adjacente a ela. FISKESJO, 1993).

Grant (1982) descreveu que, além do fato da cebola ser uma planta excelente

para ensaios de aberrações cromossômicas, outras espécies do mesmo gênero, tais

como: A. cepa var. proliferum, A. carinatum, A. fistulosum e A. sativum também já

foram empregados, mas com menor frequência. Ainda segundo o autor, em geral, os

protocolos foram desenvolvidos para o uso das raízes provenientes dos bulbos ou

das sementes para estudos citológicos. Mesmo assim, considera-se que ambos

tipos de divisão (meiose e mitose) podem ser igualmente utilizados, e possibilitam a

avaliação dos efeitos genotóxicos das substâncias químicas.

4.2 Estudos de mutagenicidade em efluentes e cursos d’água no Brasil e no mundo

A poluição do meio ambiente por produtos mutagênicos provoca uma elevação

nas taxas de mutagênese ambiental e afeta tanto as gerações atuais, mas também

as próximas gerações, não apenas a humana, mas também as de plantas, animais e

microrganismos. Estudos realizados para avaliar o potencial clastogênico em cursos

d’água já foram realizados em diversas localidades no Brasil e no mundo, como

descritos a seguir.

Para a caracterização do potencial mutagênico de poluentes presentes na água

do rio Paraíba do Sul, um estudo realizado na cidade de Tremembé – SP, por

Oliveira et al., (2011) avaliou as alterações cromossômicas em células

meristemáticas de Allium cepa, no verão (abril) e inverno (agosto) de 2008. Em abril,

os poluentes exerceram elevada ação mutagênica nas células meristemáticas de A.

cepa, com a ocorrência de micronúcleos e cromossomos pegajosos em frequências

maiores do que o controle negativo. Em agosto, a única alteração encontrada em

nível significativo foram as pontes cromossômicas. Segundo os autores, não houve

alteração significativa para o índice mitótico.

Em outro estudo utilizando as espécies Vigna radiate e Allium cepa como

bioindicadores para investigação de genotoxicidade e mutagenicidade de efluentes

de uma fábrica de papel e celulose, foram realiadas analises citogenéticas e físico-

químicas. As plantas foram expostas à água do efluente e mostraram redução no

comprimento das raízes e na biomassa da parte aérea, e outros dados que

indicaram a indução de citotoxicidade, sendo também possível observar aberrações

cromossômicas (HAQ et al., 2016).

Amostras de água dos ribeirões Mandacaru, Maringá, Miosótis e Nazareth em

Maringá – PR, foram analisadas por Düsman et al., (2012) através do teste A. cepa,

preparadas pela reação de Feulgen e coradas com o reativo de Schiff. Segundo os

autores, os resultados obtidos não mostraram efeito citotóxico significativo das

amostras avaliadas. Isso demonstrou que os resultados obtidos podem ser

dependentes das variações climáticas, da concentração das substâncias nocivas, e

da época e local de coleta das amostras.

Em uma pesquisa realizada por Oliveira et al. (2013) no afluente do Rio Boa

Vista, no perímetro rural e urbano do município de Ouro Preto do Oeste - RO, foi

avaliado o potencial mutagênico de efluentes de uma indústria de laticínios

despejados em seu leito. A avaliação foi realizada através do levantamento da

ocorrência de micronúcleos em células de Allium cepa, sendo também realizadas

análises físico-químicas da água, além do levantamento de coliformes. Os autores

notaram que os bulbos tratados com amostras de água coletadas nos pontos

localizados após o lançamento dos efluentes apresentaram um relevante número de

micronúcleos, além de um aumento significativo das anomalias cromossômicas

quando comparados ao controle, o que denota que nestes locais existe a presença

de poluentes com potencial mutagênico.

Em uma pesquisa que procurou avaliar, pelo sistema-teste de Allium cepa, os

potenciais genotóxico e mutagênico de águas do rio Guaecá, município de São

Sebastião-SP, que foram impactadas por vazamento de oleoduto em fevereiro de

2004, Leme e Marin-Morales (2007) coletaram amostras de águas em dois períodos

sazonais, julho de 2005 (estação seca) e fevereiro de 2006 (estação chuvosa), em

quatro pontos ao longo do rio. Análises químicas de hidrocarbonetos totais de

petróleo (TPHs) e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) foram realizadas

para as amostras coletadas, com a finalidade de dar suporte às investigações

biológicas. Sementes de A. cepa foram submetidas à germinação nas amostras

coletadas. Dos resultados obtidos, foi detectado potencial genotóxico e mutagênico

somente para a amostra de água coletada na estação seca na nascente do rio, a

qual corresponde ao local de afloramento do óleo vazado para o rio e a única

amostra a apresentar, segundo a análise química, hidrocarbonetos de petróleo. Tais

resultados levaram à conclusão que as águas impactadas por hidrocarbonetos de

petróleo podem comprometer a biota associada a este recurso, devido à indução de

efeitos genotóxicos e mutagênicos sobre organismos expostos. Concluiu-se também

que vazamentos de oleodutos em rios, se gerenciados corretamente, com a

realização de planos adequados de contingências do acidente pela empresa

poluidora, como a remoção e contenção do óleo vazado, podem levar a uma

recuperação da qualidade das águas, como foi observado no caso do rio Guaecá,

onde, após operações de limpeza do rio, hidrocarbonetos de petróleo não foram

mais detectados pelas análises químicas e, consequentemente, ausência de efeitos

danosos, como o observado pelo teste de Allium cepa para as amostras coletadas

em fevereiro de 2006 (LEME; MARIN-MORALES, 2007).

Bianchi et al. (2011) avaliaram os efeitos citotóxicos e genotóxicos através do

sistema Allium cepa em efluentes domésticos e industriais lançados no rio

Monjolinho em diferentes estações do ano. No verão e estações intermediárias

foram observadas aberrações cromossômicas, micronúcleos, morte celular e

inibição do índice mitótico. No inverno, caracterizado por ser predominantemente

chuvoso, não foram observadas alterações cromossômicas nem celulares. Através

das análises químicas da água, inferiu-se que o excesso de metais pesados como

Chumbo, Cobre e Zinco foram responsáveis pelos efeitos observados no teste.

Análises limnológicas mostraram a presença de nitrogênio e fosfato, demonstrando

que a contaminação do rio se deve também a descarga de matéria orgânica durante

o curso do rio. Notou-se também quem o rio tem alta capacidade autodepurativa no

fim do seu curso que desagua no rio Jacaré-Guaçu.

Maceda et al. (2015) avaliaram a genotoxicidade e citotoxicidade de amostras

de água provenientes do córrego Arara no município de Rio Brilhante-MS, por meio

de testes toxicológicos utilizando biomarcadores. Para a avaliação da

genotoxicidade foram empregados o teste de micronúcleo e o ensaio cometa, ambos

com Astyanax altiparanae (lambari) e, para analisar a citotoxicidade utilizou-se o

teste de Allium cepa. As coletas foram realizadas nos meses de abril e junho de

2013, em três pontos. No teste de Allium cepa, o efeito citotóxico apresentou-se

significativamente maior na coleta de abril, porém a genotoxicidade das águas não

apresentou diferença estatística entre os meses de coleta. A presença de metais

acima dos níveis permitidos nas amostras de água analisadas do córrego Arara

indica possíveis potenciais genotóxicos e citotóxicos aos organismos devido a esses

poluentes derivados ou não de ações antrópicas.

Em outra investigação conduzida na região Sul do Brasil, foram analisados os

efeitos tóxicos e genotóxicos das águas do Rio dos Sinos sujeitas às descargas

industriais e urbanas, coletadas nos municípios de Novo Hamburgo-RS e São

Leopoldo-RS. Amostras de água deste rio foram coletadas durante as estações do

verão e o outono e utilizadas para a realização do teste Allium cepa e algumas

análises físico-químicas. Segundo os autores, os resultados mostraram que as

amostras apresentaram substâncias com potencial efeito genotóxico, dependente do

período e local avaliado. O Cromo hexavalente, encontrado nas análises físico-

químicas nas amostras de água, poderia ser um dos responsáveis pela toxicidade e

genotoxicidade induzidas em células meristemáticas do A. cepa (OLIVEIRA et al.,

2012).

A avaliação do teste de anáfase - telófase de Allium, em relação à triagem de

genotoxicidade de águas residuais das indústrias, demonstrou que a sensibilidade

do teste Allium foi calculada em 82%. Conclui-se que este teste é recomendado para

triagem de aguas residuais por sua alta sensibilidade, baixo custo, rapidez, e por

que pode ser usada para testar águas sem pré-tratamento (RANK e NIELSEN,

1994). Amostras de água mais poluídas, contendo efluentes industriais, causaram

inibição do crescimento das raízes acima de 50% e diminuição do índice mitótico

acima de 40% e considerável aumento na frequência de aberrações cromossômicas,

em comparação ao controle experimental (RADIC et al., 2010). Os autores

mencionam que os resultados foram corroborados através da realização de análises

físico-químicas.

Em uma pesquisa para a avaliação do potencial mutagênico de esgotos

tratados, através do teste em células meristemáticas de Allium cepa, foram

analisadas amostras de onze efluentes tratados provenientes de indústrias e

despejados em um curso d’água. Os resultados revelaram um aumento no índice de

aberrações de metáfase nas células expostas e o decréscimo de seu índice mitótico

à medida que o ponto analisado se encontrava mais próximo à jusante do curso

d’água. Tais resultados, conjuntamente com a análise química das amostras,

revelaram que, mesmo após o tratamento do efluente proveniente das indústrias,

substâncias com potencial citotóxico e genotóxico estão sendo despejadas no meio

ambiente, comprometendo a qualidade do ambiente aquático, principalmente porque

esses recursos hídricos são utilizados pela população ribeirinha, assim como pela

fauna e flora da região ciliar desses mananciais (PEREIRA et al., 2005).

Uma análise do potencial mutagênico em afluentes do rio Ji-Paraná

influenciados pela emissão de rejeitos de uma indústria de laticínios e um curtume

no município de Presidente Médici-RO, foi conduzida por Vanuchi et al. (2015)

utilizando o teste de micronúcleo em Allium cepa. Foi realizada a coleta de água em

oito pontos ao longo do Rio Machado, sendo que nas proximidades dos pontos de

coleta estão localizados um laticínio e um curtume. Os autores mencionam que, ao

final do estudo, foi possível averiguar que os lotes 01, 02, 04, 05 e 07 analisados

demonstraram um relevante número de micronúcleos, apresentando um aumento

significativo das anomalias quando comparados ao controle, o que denota que

nestes locais existe a presença de poluentes com potencial mutagênico.

Finalmente, em uma pesquisa para verificar a ocorrência de compostos anti-

inflamatórios não esteróides em águas naturais, Stelato et al., (2016) avaliaram a

presença de naproxeno, paracetamol, diclofenaco e ibuprofeno ao longo dos

córregos do Veado / Limoeiro e do Cedro, em Presidente Prudente-SP, tanto no

período de chuvas quanto de estiagem. Segundo os autores, o diclofenaco e o

ibuprofeno foram os compostos que apresentaram maiores concentrações, 11 e 42

mg.L-1, respectivamente, indicando a contaminação por esgoto doméstico. Os

maiores níveis de concentração foram observados nos períodos chuvosos,

provavelmente devido à formação geológica do município ou a mecanismos de

dessorção dos fármacos a partir dos sedimentos de rios (STELATO et al., 2016).

5. MATERIAIS E MÉTODOS

5.1. Materiais

5.1.1. Amostras de água

As amostras de água serão coletadas com auxílio de frascos de vidro na

superfície e em 5 pontos ao longo do curso do córrego do Limoeiro, conforme

descritos a seguir e apresentados na Figura 1:

Ponto 1 – localizado próximo à nascente do córrego, onde há pouca atividade

antrópica.

Ponto 2 – localizado próximo à barragem do Balneário da Amizade, onde há

atividades recreativas e grande frequência de banhistas.

Ponto 3 – localizado dentro do Campus II da Universidade do Oeste Paulista –

UNOESTE, e situada imediatamente à jusante do local de deságue do córrego

do Veado. Esse córrego possui sua nascente dentro de área urbana e percorre

toda a cidade de Presidente Prudente, carregando significativa parcela do

escoamento pluvial da área urbana e efluentes de várias industrias (TAKENAKA

et al., 2013).

Ponto 4 – localizado imediatamente após o despejo do esgoto tratado pela

Estação de Tratamento de Esgoto do Limoeiro – ETE/SABESP, que atende aos

municípios de Presidente Prudente e Álvares Machado.

Ponto 5 – localizado cerca de seis quilômetros de distância do despejo do

esgoto tratado pela ETE do Limoeiro, antes de sua confluência com o rio Santo

Anastácio.

Figura 1 – Mapa da região de Presidente Prudente-SP, onde está situado o córrego

do Limoeiro, apresentando os cinco pontos de coleta de amostras de água a serem

avaliadas no presente estudo.

Fonte: Google Maps, 2016

5.1.2. Bulbos de Allium cepa L.

Serão utilizados 6 bulbos de Allium cepa para cada ensaio, perfazendo um total

de 42 bulbos para os testes realizados no período chuvoso e 42 bulbos para os

testes realizados no período de estiagem.

Todos os bulbos deverão ser do mesmo cultivar, e adquiridos a partir de um

único produtor em uma mesma colheita para cada estação avaliada. Serão

escolhidos bulbos com características morfológicas similares entre si, com mesmo

diâmetro e sem sinais de doenças ou anomalias.

Os bulbos serão acondicionados em recipientes de vidro preenchidos com as

amostras de água coletadas e os controles, de forma que apenas a região radicular

da cebola fique submersa.

5.1.3. Controle Positivo e Controle Negativo

Como controle positivo, serão utilizados bulbos de cebola em contato com uma

solução de MMS (metil metanosulfonato) 4x10-4 M. Como controle negativo serão

utilizados bulbos de cebola em contato apenas com água destilada.

5.2. Métodos de análise do material

5.2.1. Análises físico-química da água

Antes da coleta das amostras de água serão medidos os valores de oxigênio

dissolvido (OD) e da temperatura (ºC) com uso do oxímetro e pHmetro portátil. As

amostras de água que utilizadas nas análises físico-química serão coletadas em

recipientes de vidro âmbar de 500 mL, devidamente etiquetados, a uma

profundidade de aproximadamente 50 cm da superfície. Em seguida, será

adicionado 1 mL de Ácido Nítrico Ultrapuro (ANU) em cada amostra que deverá ser

armazenada em caixa térmica com gelo durante o período de coleta amostral e

transporte ao laboratório.

No laboratório as amostras ficarão armazenadas sob refrigeração de 4°C até o

preparo para as análises. Os métodos de preservação de amostras para

determinação dos parâmetros físico-químicosestão preconizados no Standard

Methods for Examination of Water and WasteWater, 21ª Edition (APHA, 2012).

Para preparo para análise de metais pesados, as amostras de água serão

filtradas em membrana de celulose em um sistema de bomba a vácuo e

posteriormente transferidas para um recipiente onde será feita a adição de 0,5 mL

de Ácido Nítrico Ultrapuro para sua conservação até a leitura.

A leitura das concentrações dos metais pesados Cd, Cr, Cu, Pb e Zn serão

realizadas em um Espectrofotômetro de Absorção Atômica com Chama (AAS) que

realiza a análise de metais em níveis de parte por milhão (ppm).

Será também avaliada a possibilidade de análise da presença de agrotóxicos

diluídos nas amostras através do mesmo procedimento.

5.2.2. Análises de genotoxicidade da água

Os recipientes com os bulbos de Allium cepa serão dispostos dentro da estufa

B.O.D., sob temperatura controlada de 25ºC e fotoperíodo de 12h escuro, 12h claro.

A água testada será trocada a cada 24h e ao final de 72h, as raízes dos bulbos de

cebola serão observadas e medidas para a análise de morfologia e do comprimento

radicular (GRANT, 1982).

Para as análises citogenéticas, as raízes dos bulbos serão escolhidas

aleatoriamente e retiradas, após 48h de tratamento, com o auxílio de pinças. Serão

então fixadas em Carnoy (3:1, álcool etílico absoluto: ácido acético glacial) por um

período de 24h à temperatura ambiente e, posteriormente, acondicionadas em

frascos contendo solução de etanol a 70% e conservadas sob refrigeração a 4°C por

pelo menos 1 hora para posterior análise. As amostras das raízes serão então

hidrolisadas em solução de ácido clorídrico (HCl) 1N por 6 minutos em banho maria

a 60°C e lavadas em água destilada. Em seguida, as pontas das raízes serão

coradas com reativo de Schiff, através da técnica de coloração de Feulgen, e

intensificadas com solução de Carmin acético a 2%.

5.2.2.1. Métodos de preparo de lâminas, coloração e observação

As lâminas serão preparadas através da técnica de esmagamento (GUERRA;

SOUZA, 2002) e observadas em microscópio óptico sob objetiva de 40x, através da

técnica de varredura, onde serão contadas 2000 células por ponto de coleta,

observando-se o número de células em cada fase da mitose. Desta forma, o índice

mitótico será avaliado através da observação do número de células em cada fase da

divisão celular.

Em adição, será analisada a frequência dos diferentes tipos de aberrações

cromossômicas observáveis, tais como: formação de anel, cromossomos pegajosos,

atraso na separação de cromátides-irmãs, presença de pontes e fragmentos

cromossômicos em anáfase e telófase, formação de micronúcleos e outras

anomalias que permitam a detecção de danos ao DNA a nível qualitativo.

Para o teste de micronúcleo os meristemas hidrolisados serão lavados em

água destilada e serão utilizados para produção de esfregaços em lâminas. Estas

serão colocadas em Nitrogênio líquido por 30 segundos para retirada da lamínula e

aguardarão 30 minutos em temperatura ambiente para secagem. Posteriormente

será realizada a coloração das lâminas com solução de Giemsa a 1% por cinco

minutos e o enxague em água deionizada com pH 7,0. Depois de secas em

temperatura ambiente, será realizada observação ao microscópio óptico sob objetiva

de 40x, através da técnica de varredura para contagem de micronúcleos em 1000

células por ponto de coleta (FISKEJÖ, 1985).

5.2.3. Análises estatísticas

Os dados serão anotados em fichas individuais para cada um dos grupos de

tratamento, e submetidos à avaliação estatística através da análise de variância pelo

teste F e ao teste de Tukey para a avaliação de contrastes de médias ao nível de

5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico Assistat.

6. CRONOGRAMA

Atividades

2017 2018 2019

Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev

Revisão Bibliográfica X X X

Treinamento com metodologias

X X X

Implantação da técnica X X X

Coleta das amostras de água X X X X

Coleta de dados X X X X X X

Analise dos dados X X X X X X X

Elaboração de artigos X X X

Redação da Dissertação X X X X

Exame Geral de Qualificação X

Revisão final X

Defesa da Dissertação X

REFERÊNCIAS

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