Cepas causadoras de doenças Moko de Ralstonia

solanacearum do Brasil ampliando a diversidade

conhecida no filotipo parafiléticos IIGreecy M. R. Albuquerque, et al

Apresentação: Lourdes Regina Lopes Batista

INTRODUÇÃO

Fonte: C

ellier e Prior (2011)

Fonte: E

MB

RA

PA

Fonte: E

MB

RA

PA

Ralstonia solanacearum

INTRODUÇÃO

Cepas R. solanacearum raça 2 biovar 1

Praga quarentenária : - Amazonas,

Presente (A2) - Pará,

-

Rondônia,

- Roraima,

- Pernambuco

- Sergipe

Fonte: E

MB

RA

PA

INTRODUÇÃO

Cosmopolita + Diversidade genética

classificados características fenotípicas e propriedades genéticas

Raça e biovar

INTRODUÇÃO

PORÉM...

COMPLEXO

Ralstonia solanacearum

R. syzygii Doença Bactéria Sangue (BDB)

INTRODUÇÃO

2000 - Fegan e Priore : Classificação hierárquica

quatro filotipos e 52 sequevars

- Fiotipo I = linhagens da Ásia,

- Fiotipo II = cepas da América

- Fiotipo III = cepas da África e do Oceano Índico

- Fiotipo IV = cepas da Indonésia, Japão e Austrália

INTRODUÇÃO

Moko :

- Filotipo II e subdivididos em linhagens IIA e IIB

- Quatro sequevars distintas:

II-6,

II-24,

II-B

II-B-3-4

INTRODUÇÃO

SINTOMAS

amarelecimento e murcha das folhas

Frutos deformado

polpa podridão seca

Fonte: E

MB

RA

PA

OBJETIVO

Explorar a diversidade patogênica e

filogenética de linhagens de R.

solanacearum que se origina no Brasil

MATERIAIS E MÉTODOS

Cepas

QUANTIDADE ORIGEM LOCAL

27 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia MANAUS

7 Coleção de Culturas de Fitobacterias do Instituto Biológico SÃO PAULO

2Coleção de Culturas do Laboratório

Fitobacteriologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco

RECIFE

1 Embrapa Tabuleiros Costeiros ARACAJU

TIPAGEM DE DNA

Culturas bacterianas cultivadas em meio

Kelman a 29 º C durante 48 h

Fonte: E

MB

RA

PA

EXTRAÇÃO

Kit AxyPrep bacteriana Genomic DNA Miniprep

reação em cadeia da polimerase multiplex específico-

phylotype (Pmx-PCR):

- Espécie do complexo de R. solanacearum e

filotipos

- Estirpes pertencentes ao Filotipo II causadoras

do Moko

TIPAGEM DE DNA

DNA parcial da endoglucanase (EGL)

Amplificação da região de 750 bp do gene EGL:

- Endo-F (5'-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3 ')

- Endo-R (5'-GCGTTGCCCGGCACGAACACC-3')

A mistura de reação:

- Aquecidas durante 9 min a 96 º C, seguido de 30 ciclos de (95 º C

durante 1 min, 55 º C durante 40 s e 72 º C durante 2 min), com um passo de

extensão final de 10 min a 72 º C.

TIPAGEM DE DNA

A amplificação do fragmento de 758 bp do gene mutS

primers mutS:

- RsF1570-(5'--ACAGCGCCTTGAGCCGTACA 3 ')

-RsR1926 (5'-GCTGATCACCGGCCCGAACAT-3')

As misturas de reação:

-Aquecidas durante 5 min a 96 º C, seguido de 35 ciclos de (94 º C durante 1

min, 66 º C durante 1 min e 72 º C durante 90 s) com um passo de extensão final de

5 min a 72 º C.

TIPAGEM DE DNA

TIPAGEM DE DNA

electroforese sobre um gel de agarose

Sequenciamento por Macrogen (Seul, Coreia do Sul).

TIPAGEM DE DNA

Árvores filogenéticas: software ARB

A reconstrução filogenética das linhagens: software PhyML

GenBank

Teste de patogenicidade

BANANA

Micropropagação

As mudas foram cultivadas em vasos de plástico de 500 ml

Inoculadas por injecção de 1 ml de uma suspensão de R. solanacearum

Temperatura média de 36 ± 2 º C e umidade relativa média de 85%

Observações por 40 dias

Teste de patogenicidade

TOMATE

mudas da cultivar Santa Clara

Cultivadas em potes de plástico 500 ml

inoculados pelo método ferida raiz

temperatura média 38 ± 2 º C e umidade relativa de 88%,

avaliadas durante 30 dias.

A patogenicidade do isolado foi gravado utilizando um

critério qualitativo, ou seja, (-) para as plantas livres de

sintomas e (+) para murcha ou plantas mortas.

RESULTADOS

282 bp e 372 bp

IIB-25 : Batata (Peru)

IIA-53

IIA-41: Tomate (Camarões)

mutS: IIA-24EGL: IIA-53

Distinto no cluster IIB – Banana (Indonesia, Honduras e Costa Rica

1= IIA-6

5= IIA-24

6= IIA-41

CONCLUSÃO

Todas as cepas de R. solanacearum brasileira causadoras da doença do

Moko testados neste estudo foram patogênicos a plantas de banana e

apresentaram sintomas característicos da doença

Estes resultados salientam a grande diversidade de estirpes de Moko no

Brasil,

reforçar a eficiência do gene EGL ao revelar as relações de diversidade

genética causadoras da doença do Moko de R. solanacearum onde os

grupos genéticos distintos foram descritos