isolamento, identificação e seleção de cepas de levedura sac

THAIS MARTINS GUIMARES

ISOLAMENTO, IDENTIFICAO E SELEO DE CEPAS DE LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae PARA ELABORAO DE VINHO

CURITIBA 2005

THAIS MARTINS GUIMARES

ISOLAMENTO, IDENTIFICAO E SELEO DE CEPAS DE LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae PARA ELABORAO DE VINHO

Dissertao apresentada ao Curso de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas da Universidade Federal do Paran, como pr-requisito obteno de grau de Mestre em Cincias Farmacuticas. Orientadora: Prof.a Dra. Tania Maria Bordin Bonfim Co-orientadora: Prof.a Dra. Cyntia Maria Telles F. Pichet

CURITIBA 2005

Dedicatria

Ao meu pai Luiz Alberto, a quem tanto admiro, exemplo de vida e de luta a ser sempre seguido; minha me Meire, que com sua extrema fora e garra me motiva e inspira a continuar a trilhar o meu caminho;

Agradecimentos

Coordenao do Curso de Ps Graduao em Cincias Farmacuticas e aos seus professores pelos ensinamentos ministrados, em especial ao Prof. Dr. Cid Aimbir Santos de Moraes, pelo apoio; Profa. Dra. Tania Maria Bordin Bonfim, que desde o final de minha graduao acadmica vem sabiamente guiando meus trabalhos de pesquisa, tendo seus ensinamentos e encorajamento constantes sido fundamentais para minha formao acadmica e cientfica. na qualidade de sua orientada que quero expressar o meu mais sincero agradecimento a ela que, aceitou ser minha orientadora, mostrando-me, sempre com toda a delicadeza que lhe peculiar, minhas fraquezas e como super-las, respeitando o meu estilo de pesquisa e autoria e destacando os meus saberes e competncias. Agradeo ainda pelas condies de trabalho que me proporcionou, pela disponibilidade demonstrada, pela pacincia com que combateu meu pessimismo em algumas etapas do trabalho e, sobretudo, pela amizade em todos os momentos; A Profa. Dra. Cyntia Maria Telles Fadel Pichet por ter me recebido, pela coorientao do estudo e pelas contribuies na discusso dos resultados; A Profa. Dra. Iara Pereira Machado, que mesmo estando distante mostrou-se sempre atenciosa e pronta a ajudar; Profa. Dra. Miriam Blumel Chociai, que nos permitiu espaos para discusso de algumas questes aqui desenvolvidas; Profa. Dra. Sandra Barreira o meu agradecimento pela ateno dedicada na leitura de partes do texto e ao Prof. Geraldo Pichet, pela colaborao prestada; Ao Prof. Dr. Maurcio Passos pela ajuda com as anlises de cromatografia lquida de alta eficincia; Cassyano J. Correr pela ajuda prestada no tratamento estatstico dos resultados. Valdina Celestino Rocha pela ajuda, companheirismo e amizade desfrutados no dia a dia do laboratrio;

Agradecimentos

Aos meus colegas, Juliana Negro Borges, Juliana Adelmann, Daniela Dorneles, companheiros de laboratrio e de pesquisa, pela ajuda, companheirismo e amizade desfrutados no dia a dia do laboratrio; Danilo Gomes Moriel pelo apoio sempre constante, harmoniosa convivncia e mesmo estando longe contribuiu para a realizao deste trabalho; Aos vinicultores do municpio de Colombo por toda a colaborao na cedncia das uvas e amostras para o estudo; s minhas irms Daniele e Ivy, que sempre acreditaram na concluso deste trabalho, companheiras de todas as horas, agradeo pelo carinho e amizade; Especialmente ao meu namorado Rafael Fajardo de Francisco, pelas horas que a realizao deste trabalho nos privou do convvio comum; obrigada pelo amor, pacincia e compreenso; Luiz Carlos Bordin, um especial agradecimento pela sua preciosa colaborao, sempre disposto a ajudar na realizao do trabalho laboratorial; Carlos Bonfim, pela pacincia e apoio; Aos amigos e amigas que incentivaram o trabalho e me apoiaram em momentos difceis. No vou tentar citar todos para no cometer nenhum esquecimento. No entanto quero agradecer, em especial, a Carina Rau La Rosa e Camila Guimares Moreira, que souberam ser pacientes, consoladoras e incentivadoras nos momentos certos; Agradeo a todos que estiveram ao meu lado e me ajudaram de alguma forma; E... sobretudo a Deus.

Epgrafe

"Pensar no se reduz, acredito eu, em falar, classificar em categorias,nem mesmo abstrair. Pensar agir sobre o objeto e transform-lo" ( Jean Piaget)

Sumrio

LISTA DE FIGURAS........................................................................................ LISTA DE TABELAS....................................................................................... LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS..................................... RESUMO.......................................................................................................... ABSTRACT...................................................................................................... 1. INTRODUO............................................................................................. 2. OBJETIVOS................................................................................................. 3. REVISO BIBLIOGRFICA........................................................................ 3.1 UVAS DESTINADAS ELABORAO DE VINHOS................................ 3.3 LEVEDURAS.............................................................................................. 3.3.1 Caractersticas gerais.............................................................................. 3.3.2 Importncia econmica das leveduras.................................................... 3.3.3 Saccharomyces cerevisiae...................................................................... 3.4.1 Sistema clssico de vinificao.............................................................. 3.4.2 Fermentao espontnea........................................................................ 3.4.3 Bioqumica da fermentao..................................................................... 3.4.4 Fatores que afetam o desempenho fermentativo.................................... 3.5 USO DE LEVEDURAS SELECIONADAS.................................................. 3.6 IDENTIFICAO DE LEVEDURAS DE INTERESSE ENOLGICO......... 3.7 SELEO DE LEVEDURAS......................................................................

x xii xiii xv xvi 01 05 07 08 13 13 14 15 17 18 19 21 22 25 27

3.2 PRODUO E COMERCIALIZAO DE UVAS E VINHOS NO BRASIL. 09

3.4 PROCESO FERMENTATIVO..................................................................... 17

4. MATERIAL E MTODOS............................................................................. 33 4.1 MATERIAIS................................................................................................. 34 4.2 MTODOS GERAIS................................................................................... 4.3 METODOS ANALTICOS........................................................................... 4.3.1 Carboidratos totais.................................................................................. 4.3.2 Mtodo turbidimtrico ............................................................................. 4.4 COLETA DAS AMOSTRAS PARA ISOLAMENTO DAS LEVEDURAS..... 4.5 MEIOS DE CULTURA................................................................................ 34 36 36 36 36 37

Sumrio

4.5.1 Meio YP................................................................................................... 4.5.4 Meio Agar LA........................................................................................... 4.6 ISOLAMENTO DAS LEVEDURAS.............................................................

37 38 39

4.5.3 Meio YCB................................................................................................. 38

4.7 CONSERVAO DAS LEVEDURAS......................................................... 40 4.8 PREPARO DO INCULO........................................................................... 40 4.9 TESTE DE EXCLUSO POR ESTRESSE................................................. 41 4.10 IDENTIFICAO TAXONMICA DAS LEVEDURAS.............................. 42 4.10.1 Testes de assimilao de fontes de carbono......................................... 42 4.10.2 Testes de assimilao de fontes de nitrognio...................................... 42 4.10.3 Testes de capacidade fermentativa....................................................... 4.11 OUTROS CRITRIOS DE SELEO DE LEVEDURAS......................... 4.11.2 Teste de tolerncia temperatura......................................................... 43 43 44

4.11.1 Teste de tolerncia ao etanol................................................................. 43 4.11.3 Teste de floculao................................................................................ 44 4.11.4 Teste de produo de sulfeto de hidrognio.......................................... 44 4.12 CARACTERIZAO DAS LEVEDURAS SELECIONADAS POR ENSAIOS MOLECULARES...................................................................... 45 4.12.1Cultivo das leveduras selecionadas........................................................ 45 4.12.2 Extrao do DNA genmico das leveduras........................................... 4.12.4 Amplificao do DNA genmico pela Reao em Cadeia da Polimerase................................................................................................ 4.12.5 Reao em cadeia da polimerase polimorfismo de DNA amplificado ao acaso................................................................................................. 47 4.13 EXPERIMENTOS DE MICROVINIFICAES......................................... 4.13.1 Preparo do mosto do suco de uva......................................................... 4.13.2 Microvinificao..................................................................................... 4.14 REPRODUTIBILIDADE DOS RESULTADOS.......................................... 49 49 49 51 46 45 4.12.3 Quantificao do DNA genmico........................................................... 46

Sumrio

5. RESULTADOS E DISCUSSO...................................................................... 5.1 ISOLAMENTO DAS EVEDURAS................................................................ 5.2 EXCLUSO POR ESTRESSE...................................................................... 5.3 IDENTIFICAO TAXONMICA DAS EVEDURAS................................... 5.4 OUTROS CRITRIOS D SELEO DAS LEVEDURAS.............................. 5.5 CARACTERIZAO DAS LEVEDURAS SELECIONADAS POR ENSAIOS MOLECULARES........................................................................ 5.6 EXPERIMENTOS DE MICROVINIFICAES............................................. 6. CONCLUSO................................................................................................. REFERNCIAS...................................................................................................

52 53 55 57 61 67 78 87 90

Lista de Figuras

FIGURA 1 -

PORCENTAGEM DE LEVEDURAS ISOLADAS CRESCIDAS EM CONDIO DE ESTRESSE TRMICO, ETANLICO, OSMTICO E NA PRESENA DE SACAROSE .................................................56 VERIFICAO DA PRODUO DE SULFETO DE HIDROGNIO APS CRESCIMENTO EM MEIO GAR LA DAS LEVEDURAS SELECIONADAS 24, 33, 52 E LEVEDURA CK ..............................66 AVALIAO DA ESPECIFICIDADE DOS INICIADORES SC1 E SC2...................................................................................................69 REAO EM CADEIA DA POLIMERASE REALIZADA COM INICIADORES SC1 E SC2...............................................................69 PERFIL DE RAPD-PCR UTILIZANDO INICIADOR OPB-12............71 PERFIL DE RAPD-PCR UTILIZANDO INICIADOR OPB-01............71 PERFIL DE RAPD-PCR UTILIZANDO INICIADOR OPB-10............72 PERFIL DE RAPD-PCR UTILIZANDO INICIADOR OPX-01............73 PERFIL DE RAPD-PCR UTILIZANDO INICIADOR OPX-03............74

FIGURA 2 -

FIGURA 3 FIGURA 4 FIGURA 5 FIGURA 6 FIGURA 7 FIGURA 8 FIGURA 9 -

FIGURA 10 - PERFIL DE RAPD-PCR UTILIZANDO INICIADOR OPX-06............74 FIGURA 11 - PERFIL DE RAPD-PCR UTILIZANDO INICIADOR OPX-07............75 FIGURA 12 - PERFIL DE RAPD-PCR UTILIZANDO INICIADOR P-20.................76 FIGURA 13 - PERFIL DE RAPD-PCR UTILIZANDO INICIADOR AB1-15.............76 FIGURA 14 - DENDOGRAMA CONSTRUDO A PARTIR DO PERFIL OBTIDO POR RAPD - PCR.............................................................................78 FIGURA 15 - CONCENTRAO DE ACARES TOTAIS, ETANOL E GLICEROL NO PROCESSO FERMENTATIVO, UTILIZANDO LEVEDURAS SELECIONADAS 33, 37, 49, 50, 51, CK E NA FERMENTAO ESPONTNEA APS SETE DIAS...................................................81 FIGURA 16 - CONCENTRAO DE ACARES TOTAIS, ETANOL, GLICEROL, CIDO ACTICO E CIDO SUCCNICO NO PROCESSO FERMENTATIVO UTILIZANDO A LEVEDURA SELECIONADA 49 EM FUNO DO TEMPO DE FERMENTAO (DIAS)...............................................................................................82

Lista de Figuras

FIGURA 17 - CONCENTRAO DE ETANOL NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS UTILIZANDO LEVEDURAS SELECIONADAS, LEVEDURA COMERCIAL E NA FERMENTAO ESPONTNEA, APS 20 DIAS..................................................................................83 FIGURA 18 - CONCENTRAO DE CIDO ACTICO, CIDO SUCCNICO E GLICEROL NOS PROCESSOS FERMENTATIVOS UTILIZANDO LEVEDURAS SELECIONADAS, LEVEDURA COMERCIAL E NA FERMENTAO ESPONTNEA, APS 20 DIAS...........................84 FIGURA 19 - CONTROLES DA MICROVINIFICAO: MOSTO DE UVA ESTRIL SEM INOCULAO, MOSTO DE UVA INOCULADO COM A LEVEDURA SECA ATIVA (Saccharomyces cerevisiae variedade cerevisiae - CK), MOSTO DE UVA SEM INOCULAO (FERMENTAO ESPONTNEA)...................................................87

Lista de Tabelas

TABELA 1 TABELA 2 TABELA 3 TABELA 4 TABELA 5

PRODUO DE UVAS NO BRASIL, EM TONELADAS.................11 REA DE VIDEIRAS PLANTADAS NO BRASIL, EM ECTARES...12 SEQUNCIA DOS INICIADORES UTILIZADOS NAS REAES DE PCR ..........................................................................................47 SEQUNCIA DOS INICIADORES UTILIZADOS NAS REAES DE RAPD-PCR ...............................................................................48 GRUPOS DE LEVEDURAS ISOLADAS A PARTIR DE UVAS VARIEDADE TERCI, SUCOS DAS UVAS, AMOSTRAS DA FASE TUMULTUOSA DA FERMENTAO VNICA E VINHOS SAFRA 2003, EMPREGANDO DIFERENTES MEIOS DE CULTURA .........................................................................................................54

TABELA 6

CRESCIMENTO DAS LEVEDURAS ISOLADAS E LEVEDURA CK EM MEIO DE CULTURA CONTENDO DIFERENTES FONTES DE CARBONO NA CONCENTRAO DE 2 g% .................................59

TABELA 7 TABELA 8

ASSIMILAO DE FONTES DE NITROGNIO PELAS LEVEDURAS ISOLADAS E LEVEDURA CK .................................60 CAPACIDADE FERMENTATIVA DAS LEVEDURAS ISOLADAS E DA LEVEDURA CK, UTILIZANDO MEIO YP ADICIONADO DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO ........................................61

TABELA 9

VARIAO NO CRESCIMENTO DAS LEVEDURAS SELECIONADAS E DA LEVEDURA CK EM FUNO DA CONCENTRAO DE ETANOL E DA TEMPERATURA UTILIZANDO MEIO YPG 2% .........................................................64

TABELA10

CAPACIDADE DE FLOCULAO E PRODUO DE SULFETO DE HIDROGNIO DAS LEVEDURAS SELECIONADAS E DA LEVEDURA CK ..............................................................................67

Lista de Abreviaturas

% l AB1 atm ATP BC CK C6H12O6 C2H5OH CO2 DNA DO et. al. EDTA f. g g% g/l HCl kg l M mg/l ml mM n. NADH

- por cento - mais ou menos - microlitro - Advanced Biotecnologies - atmosfera - adenosina tri fosfato - Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus - Saccharomyces cerevisiae variedade cerevisiae - glicose - etanol - gs carbnico - cido desoxiribonucleico - densidade tica - e colaboradores - cido etilenodiaminotetractico -nmero de folhas - gramas - gramas por cento - gramas por litro - cido actico - quilograma - litro - molar - miligramas por litro - mililitro - milimolar -nmero - nicotinamida adenina dinucleotdeo (forma reduzida)

Lista de Abreviaturas

ng nm OPB OPXo o o

- nanograma - nanmetro - Operon Technologies kit B - Operon Technologies kit X - gramas por cento de slidos totais - grau Celsius - grau Gay-Lussac - pgina - primer 20 - peso por volume - peso por peso - pares de base - reao em cadeia da polimerase - potencial hidrogeninico - picomol - quantidade suficiente para - analise de polimorfismo ao acaso de DNA genmico - cido ribonuclico - Saccharomyces cerevisiae - volume - volume por volume

Brix C GL

p. P - 20 p/v p/p pb PCR pH pmol qsp RAPD RNA SC v. v/v

Resumo

Entre as diferentes castas de uvas cultivadas no Paran, a variedade Terci a mais utilizada para o preparo de vinho tinto na regio de Colombo, levando a uma produo anual de 800.000 l de vinho artesanal. Desde 1999, a Universidade Federal do Paran e a comunidade de Colombo tm trabalhado juntas para melhoramento da tecnologia de produo do vinho. Dessa forma, foi realizada uma avaliao da microbiota natural de Colombo com objetivo de selecionar leveduras apropriadas para a produo de vinho. A partir de 61 leveduras isoladas, 14 foram identificadas como Saccharomyces cerevisiae e submetidas a caracterizao molecular e ensaios de microvinificao. Os ensaios de microvinificao foram realizados para avaliar a produo de etanol, glicerol, cido actico, cido succnico e assimilao de acares. Todas as leveduras foram capazes de realizar uma fermentao completa, com etanol variando entre 113 a 135 g/l, produo de glicerol em torno de 1 g/l e pouca quantidade de cido actico e cido succnico. A caracterizao molecular permitiu a classificao das leveduras em trs grupos diferentes, mas nenhuma relao entre a classificao gentica e as caractersticas fenotpicas avaliadas foram verificadas.

Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, microvinificao, vinho, RAPD-PCR

Abstrat

Amongst the different lineages of grapes cultivated in Paran, Terci variety is the most used for red wine production in Colombo, leading to an annual production of 800,000 l of artisan wine. Since 1999, the Universidade Federal do Paran and Colombo community have been working together for the improvement of its wine production technology. In this way, an evaluation of Colombo natural microbiota was performed in order to select yeasts most appropriate for wine production. Among the 61 yeasts isolated, 14 were identified as Saccharomyces cerevisiae and submitted to molecular characterization and microvinification assays. The microvinification assays were done in order to evaluate the production of ethanol, glycerol, acetic acid, succinic acid and sugar assimilation. All the yeasts were able to perform a complete fermentation, with ethanol variation between 113 and 135 g/l, glycerol production around 1 g/L and low amounts of acetic and succinic acid. The molecular characterization allowed the classification of the yeasts in three different groups, but no relationship between the genetic classification and the phenotypic characteristics evaluated were verified.

Key-words: Saccharomyces cerevisiae, microvinification, wine, RAPD-PCR

Introduo - 1

1. INTRODUO

Introduo - 2

O vinho definido como a bebida proveniente da fermentao alcolica do mosto de uva sadia, fresca e madura por leveduras vnicas naturalmente presentes neste meio de fermentao (BENASSI, 1997). Muitos estudos foram realizados sobre as leveduras vnicas desde que Pasteur, em 1866, demonstrou que elas eram responsveis pela transformao dos acares do mosto em etanol. A partir de ento, ficou claro que as fermentaes alcolicas realizadas espontaneamente no so devidas ao de uma nica levedura e sim que se trata do resultado da ao combinada de diversas espcies de leveduras que crescem em diferentes propores ao longo de uma fermentao. De qualquer maneira, dentro das espcies de leveduras que podem ser encontradas em uma fermentao alcolica, percebeu-se que a espcie Saccharomyces cerevisiae a mais apta a consumir todos os acares fermentveis e, portanto, assegurar o processo (CATALUA, 1984; JOSHI e PANDEY, 1999). Os estudos sobre a dinmica, quantificao e composio da microbiota responsvel pelas fermentaes espontneas mostram diferenas tanto qualitativas quanto quantitativas das leveduras isoladas de uma mesma rea vitivincola. As causas desta variabilidade podem estar associadas s diferenas do ecossistema como composio do solo, condies climticas e variedade das uvas, entre outros. Estas assimilaridades ocorrem no somente entre diferentes regies, mas tambm dentro da mesma regio em diferentes vindimas, prejudicando a qualidade e reprodutibilidade na obteno do vinho (LOPES et. al., 2002). Pela necessidade de assegurar a fermentao alcolica, assim como a qualidade e reprodutibilidade das caractersticas dos vinhos, muitos produtores tm utilizado culturas puras de leveduras isoladas de seu prprio vinho como cultivos iniciadores. Estas culturas, na forma de leveduras secas ativas, so fornecidas aos produtores e inoculadas no mosto a fim de conduzir a fermentao e o vinho produzido ter, em sucessivas vindimas, as propriedades sensoriais tpicas daquela regio (GONZLEZ-PEREZ, et al., 1993). Apesar da existncia de leveduras comerciais para a realizao de fermentaes, mais efetiva a utilizao de cultivos puros de leveduras que

Introduo - 3

procedam da regio vitivincola, o que se conhece como leveduras locais selecionadas. Estas leveduras so especficas de uma rea, totalmente adaptadas s condies climticas da regio e matria-prima e parcialmente responsveis, pelas caractersticas nicas do vinho a ser obtido (MARTINI e MARTINI, 1990). As leveduras selecionadas tm sido utilizadas com excelentes resultados em muitos pases, onde os produtos finais obtidos so de qualidade mais uniforme que os produzidos por fermentaes espontneas. Portanto, a seleo da levedura adequada para cada tipo de fermentao uma estratgia importante para garantir uma fermentao completa, assim como para melhorar as caractersticas finais do vinho. Ainda que seja evidente que a qualidade do vinho esteja associada variedade e qualidade da uva, as leveduras podem produzir compostos que proporcionem um toque de distino ao produto final obtido (DEQUIN, 2001). Assim, com a finalidade de melhorar os parmetros de qualidade e garantir uma melhor padronizao de suas caractersticas, sugere-se utilizar leveduras selecionadas que otimizaro o processo fermentativo e tornar o vinho obtido mais competitivo no mercado. medida que esses procedimentos so aplicados, deixa-se de lado o empirismo e permite-se obter um vinho de melhor qualidade a cada safra (Embrapa Uva e Vinho, 1987; COMI e CROATTINI, 1997; PRETORIUS; VAN DER WESTHUIZEN; AUGUSTYN, 1999; CHOCIAI et. al., 2000; LAMBRECHTS; PRETORIUS, 2000; PRETORIUS, 2000; LOPES et. al., 2002). Nos processos de seleo de leveduras, vrias metodologias de classificao taxonmica so utilizadas para a identificao, baseadas na descrio morfolgica e fisiolgica de espcies e gneros. Embora estas metodologias forneam valiosas informaes na identificao das leveduras, apresentam a desvantagem de serem demoradas e nem sempre determinantes ou concludentes, em razo de que as caractersticas morfolgicas e fisiolgicas esto fortemente influenciadas pelas condies de cultivo. Este um dos motivos que vem introduzindo erros na classificao taxonmica e originando o fenmeno de dualidade na nomenclatura (RATN, 2004).

Introduo - 4

Estas dificuldades vm sendo solucionadas com a aplicao de tcnicas moleculares baseadas nas anlises de fragmentos de cidos nuclicos, sendo as mais utilizadas a eletroforese de cariotipagem, as anlises de microsatlites, o polimorfismo do DNA mitocondrial (mtDNA), o polimorfismo de tamanho dos fragmentos de restrio do rDNA (RFLP), o polimorfismo de DNA amplificado aleatoriamente (RAPD) e as anlises de RNA de baixo peso molecular (LMW-RNA). Estas tcnicas envolvem procedimentos simples e rpidos e tm sido bastante utilizadas para identificar e diferenciar leveduras de uma mesma espcie, contribuindo com mais um parmetro no controle de qualidade e na taxonomia de leveduras (RATN, 2004). Desde 1999, um projeto de extenso firmado entre a Universidade Federal do Paran e a comunidade de Colombo visa a observao criteriosa do processo artesanal utilizado pelos produtores da regio para caracterizar as principais dificuldades tcnicas e apresentar propostas alternativas de melhoramento da tecnologia de produo do vinho (BONFIM et. al., 2002). O fato de que safras distintas produzem vinhos com composio e caractersticas diferentes associado busca por espao no mercado nacional so fatores que reforam a necessidade de se garantir a qualidade do vinho. Entretanto, para que um tecnlogo de bebidas possa modificar estas caractersticas e/ou controlar a qualidade de um produto, necessria a incorporao de leveduras selecionadas que contribuam para a manuteno da identidade e da qualidade do vinho produzido. Assim sendo, o presente trabalho visa o isolamento de leveduras nativas do municpio de Colombo localizado nordeste da regio metropolitana de Curitiba, no Estado do Paran, adaptadas s condies de clima e solo, e possuidoras de caractersticas desejveis para obteno de um bom vinho, com a finalidade de melhorar os parmetros de qualidade e garantir melhor padronizao das caractersticas do vinho da regio.

Objetivos - 5

2. OBJETIVOS

Objetivos - 6

2.1. OBJETIVO GERAL Isolar, identificar e selecionar leveduras vnicas do gnero Saccharomyces, a partir da microflora presente nas uvas Terci cultivadas e de etapas do processo fermentativo, com caractersticas apropriadas para atender s condies empregadas no processo artesanal de produo de vinho. 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS isolamento e seleo de leveduras Saccharomyces; caracterizar as leveduras selecionadas utilizando RAPD-PCR (Reao em cadeia da polimerase - anlises de Polimorfismo de DNA amplificado ao Acaso); avaliar as leveduras selecionadas em um processo de microvinificao onde o produto ser submetido a anlises de concentrao de acares (glicose, sacarose e frutose), etanol, glicerol, cidos actico e succnico.

Reviso Bibliogrfica - 7

3. REVISO BIBLIOGRFICA


3.1 UVAS DESTINADAS ELABORAO DE VINHOS A matria-prima da indstria vincola a uva, a partir da qual se elabora o mosto para a produo de vinho. A composio das uvas influencia a estrutura do vinho no simplesmente pelo teor de acar fornecido para a fermentao, como tambm pelo seu teor de nitrognio, potssio, acidez, seus aromas vegetativos e seu estado sanitrio (ZOECKLEIN et. al., 2001). As uvas destinadas ao processo de elaborao de vinhos podem ser divididas em duas categorias: Vitis vinifera, utilizada para a fabricao de vinhos finos e Vitis labrusca, empregada na obteno de vinhos comuns. No Brasil, as variedades de uvas da espcie Vitis vinifera tm seu cultivo praticamente limitado aos Estados mais frios do pas, Rio Grande do Sul e Santa Catarina, e sua produo tem sido experimentada tambm em Pernambuco, ao longo do rio So Francisco. As uvas da espcie Vitis labrusca devido a sua rusticidade e resistncia, so cultivadas nos demais Estados onde a indstria vincola se instalou, como Minas Gerais, So Paulo e Paran (COBRA, 2003). Os principais acares presentes nas uvas dos cultivares de Vitis vinifera so glicose e frutose que, geralmente so responsveis por 99% dos carboidratos no mosto e por 12 a 27% ou mais do peso das uvas maduras. A sacarose o principal acar translocado das folhas para os frutos em videiras, mas glicose e frutose predominam nos gros de uvas em todos os estgios do desenvolvimento. A relao glicose/frutose nos gros de uva muda consideravelmente desde a frutificao at a maturao. Geralmente, na fase de crescimento do gro predomina a glicose. Na maturao, glicose e frutose esto presentes em quantidades semelhantes. Na fase de sobrematurao geralmente a frutose excede a glicose. Em climas frios, nos quais o teor de acares totais mais baixo, h uma tendncia de se desenvolverem cultivares com maior teor de frutose; o contrrio ocorre em climas quentes (DAUDT; SIMON, 2001). Para elaborao de vinhos de qualidade, todo lcool deve ser formado via fermentativa, pelas leveduras, sem adio exgena. A legislao brasileira determina que os vinhos de mesa devem ter entre 10 e 13 GL de lcool


(PORTARIA n. 229 do Ministrio da Agricultura, 1988). Para a obteno de 1 GL de lcool na fermentao, so necessrios cerca de 18 g/l de acar na uva. Assim, se a uva no contiver o teor necessrio de acar, deve se adicionar acar de cana, no incio da fermentao. Essa prtica, denominada chaptalizao, legalmente autorizada e empregada quando as condies climticas da safra no permitem o acmulo de quantidade adequada de acar na uva. Alm da concentrao de acares, outro critrio de medida da maturao da uva e, portanto, do seu potencial em produzir vinhos de qualidade, o teor em cidos. Este critrio normalmente empregado juntamente com a medida do teor de acar, pois o balano entre acar e acidez confere ao vinho um equilbrio gustativo determinante para sua qualidade geral. A uva convenientemente avaliada ao longo da maturao ser colhida no momento mais adequado mxima expresso do seu potencial de qualidade em determinada safra ou regio. Desse modo, os procedimentos a serem adotados na colheita devem levar em considerao a preservao desse potencial (GUERRA, 2003). Por exemplo, no sul do Brasil, e particularmente na regio metropolitana de Curitiba, a colheita da uva determinada pelo vinicultor o qual geralmente utiliza como critrio o teor de acar (BONFIM et. al., 2002) o mesmo adotado pelos produtores de vinho na serra gacha (RIZZON et. al., 1992).

3.2 PRODUO E COMERCIALIZAO DE UVAS E VINHOS NO BRASIL No Rio Grande do Sul concentra-se mais de 90% da produo de vinho do pas e l esto as melhores vincolas brasileiras. A maior parte destas vincolas est localizada na Serra Gacha, regio de montanha a nordeste no estado, destacandose as cidades de Bento Gonalves, Garibaldi e Caxias do Sul, e vrios outros municpios menores; em Erexim, no noroeste do estado; Jaguari, no sudoeste; Viamo e So Jernimo, no centro-leste; Bag, Don Pedrito, Pinheiro Machado e Santana do Livramento, na Campanha, no extremo sul. Uma pequena parte restante dos vinhos brasileiros proveniente de diminutas regies vitivincolas situadas nos


estados de Minas Gerais (municpios de Andradas, Caldas, Poos de Caldas e Santa Rita de Caldas), Paran (Colombo), Pernambuco (Santa Maria da Boa Vista e Santo Anto), Santa Catarina (Urussanga), So Paulo (Jundia e So Roque) e o promissor Vale do rio So Francisco, especialmente na cidade de Santa Maria da Boa Vista, prxima de Petrolina e Juazeiro, na fronteira de Pernambuco e Bahia (MARASCHIN et.al., 2004) O municpio de Colombo, na regio metropolitana de Curitiba, produz 1,3 mil tonelada de uva por ano e 800 mil litros de vinho artesanal, segundo dados da Secretaria Municipal de Agricultura, Abastecimento e Meio Ambiente dessa localidade. interessante ressaltar que a produo artesanal dos vinhos de Colombo ultrapassou significativamente a produo total de vinhos de mesa registrados no estado do Paran, 570.773 litros, segundo dados do Ministrio da Agricultura referentes ao ano de 2002. Desse total, 77,55% so de vinhos tinto de mesa, registrando um aumento de 43,69% de representatividade dos vinhos tintos em relao ao ano de 1999. No entanto, essas regies vitivincolas cultivam quase que exclusivamente uvas americanas que originam apenas vinhos de categoria inferior. As uvas americanas so assim chamadas por terem sua origem na Amrica do Norte e Amrica Central, embora, posteriormente, tenham sido cultivadas em vrios pases pela tcnica da enxertia. So mais resistentes que as vinferas, produzem maior quantidade de gros, mas sua qualidade muito inferior (baixo teor de acar e elevada acidez) entre as mais destacadas esto a Bord, Concord, Herbemont e Isabel (PACHECO, 1999). No Paran, podemos destacar a uva Bord (V. labrusca), de origem americana e conhecida em nosso Estado como Terci, sendo classificada como comum superior. Foi cultivada pela primeira vez em 1840 por Henry Ives em Ohio, Estados Unidos, justificando seu nome original como Ives ou Ives Seedling (CAMARGO, 1989, PACHECO, 1999). A vitivinicultura brasileira, embora recente no Brasil, tem avanado tanto nos produtos elaborados como vinhos e sucos, quanto na produo de uvas para consumo in natura. Em 2003 foram produzidas 1.054.934 toneladas de uvas, sendo


o Rio Grande do Sul o maior produtor com 489.012 toneladas (TABELA 1). Alm disso, em 2003, 40,38% da uva produzida no Brasil foi destinada elaborao de vinhos, sucos, destilados e outros derivados (MELLO, 2003 (b)).TABELA 1 PRODUO DE UVAS NO BRASIL, EM TONELADAS ESTADO / ANO 2003 Pernambuco 104.506 Bahia 87.435 Minas Gerais 13.455 So Paulo 224.468 Paran 94.250 Santa Catarina 41.709 Rio Grande do Sul 489.012 Brasil 1.054.934 FONTE : MELLO, L.M.R. Produo e comercializao de uvas e vinhos panorama 2003. Disponvel em < http://www.cnpuv.embrapa.br > Acesso em 25 jul. 2004.

Considerando-se que no se dispe de dados estatsticos sobre a produo e comercializao nacional de vinhos, podem-se utilizar dados referentes ao Estado do Rio Grande do Sul para situar o vinho nacional. Segundo o IBGE, a rea de cultivo de uvas no Brasil no ano de 2003, foi de 68.323 hectares (TABELA 2), destacando-se novamente o Estado do Rio Grande do Sul como principal produtor, com 56,37% da rea total do pas. Embora a produo de vinhos, suco de uva e derivados da uva e do vinho tambm ocorra em outras regies, a maior concentrao est no Rio Grande do Sul, onde so elaborados, em mdia anual, 330 milhes de litros de vinhos e mostos, representando 95% da produo nacional (PROTAS; CAMARGO; MELLO, 2003). Ainda que sejam plantados mais de cem cultivares no Rio Grande do Sul, aproximadamente 20 so expressivos para elaborao de vinhos e sucos de uvas (MELLO, 2003 (b)).

Reviso Bibliogrfica - 12 TABELA 2 REA DE VIDEIRAS PLANTADAS NO BRASIL, EM HECTARES ESTADO / ANO 2002 2003 Pernambuco 3.365 3.423 Bahia 2.732 2.911 Minas Gerais 950 903 So Paulo 12.152 12.398 Paran 6.000 6.500 Santa Catarina 3.514 3.671 Rio Grande do Sul 36.668 38.517 Brasil 65.381 68.323 FONTE : MELLO, L.M.R. Produo e comercializao de uvas e vinhos panorama 2003. Disponvel em < http://www.cnpuv.embrapa.br > Acesso em 25 jul. 2004.

A populao brasileira est consumindo mais vinho e de melhor qualidade, devido a profundas alteraes estruturais no parque vincola brasileiro, fruto de esforos que permitiram um grau de evoluo satisfatrio em relao s exigncias do mercado nacional. Aspectos como qualidade e preo so compatveis com a dimenso do mercado e com as exigncias da maioria dos consumidores. Entretanto, mesmo empenhando todos os esforos, a produo nacional de vinhos finos no supre a demanda interna. A participao dos vinhos importados em relao aos vinhos finos (de vinferas) comercializados no pas representou 53,6% do total consumido, em 2003. Visando alcanar um mercado promissor, os produtores brasileiros descobriram que uma das maneiras de conseguir qualidade com produtividade melhorar a base da vinicultura: os vinhedos (MELLO, 2003 (a)). O nvel tecnolgico atingido pelo setor agro-industrial nacional para vinhos finos comparvel ao existente nos pases de avanada vitivinicultura. Todavia, contraditoriamente, mesmo utilizando tecnologias avanadas de vinificao, as cantinas no tm conseguido atingir os nveis de qualidade e produtividade esperados. Em decorrncia disto, como estratgia para se alcanar este objetivo, decidiu-se por investir no cultivo da videira com maior tecnificao, o que j realidade em algumas vincolas do Sul do pas. Todavia, o mesmo no se pode dizer para a tecnologia empregada na elaborao de vinhos de consumo corrente. Como conseqncia disso, os vinhos finos nacionais so considerados de boa qualidade, enquanto os vinhos de consumo corrente apresentam qualidade regular. Para estes


ltimos, h maior necessidade de investimentos em tecnologia de produo, tanto da matria-prima quanto no processamento (MELLO, 2000). 3.3 LEVEDURAS 3.3.1 Caractersticas gerais As clulas de leveduras podem ser esfricas, ovais ou elpticas podendo ainda apresentar-se bastante alargadas. Porm, a forma da levedura no indcio para identificao de espcies e nem a variedade de formas em um mesmo cultivo pode ser considerado contaminao do mesmo. As leveduras no possuem flagelo e, em conseqncia disso, so imveis. Suas dimenses variam consideravelmente em funo da espcie, nutrio e idade entre outros fatores. As leveduras caracterizam-se por uma forma de reproduo vegetativa conhecida como brotamento ou gemulao. A esporulao em leveduras um fator importante por constituir a base de um mtodo de reproduo, desempenhar uma funo de produo de novos hbridos e por manter a viabilidade das espcies durante as variaes do meio ambiente. Quanto composio qumica das leveduras, elas apresentam de 68% a 83% de gua alm de substncias nitrogenadas, carboidratos, lipdios, vitaminas, minerais entre outros. Assim como qualquer forma de vida, as leveduras necessitam de fatores fsicos e qumicos importantes indispensveis para seu crescimento e reproduo. Alguns elementos so basicamente necessrios, como gua, fontes de carbono e nitrognio, oxignio e minerais (TORTORA; FUNKE; CASE, 2002). Estudos demonstraram que as leveduras dependem de fontes de carbono orgnico para seu crescimento e obteno de energia, sendo os carboidratos os nutrientes de maior importncia. Alguns acares simples como a glicose, frutose e manose so assimiladas pela maioria das espcies estudadas, enquanto alguns oligossacardeos, polissacardeos, lcoois primrios, poliis, cidos orgnicos, pentoses, tetroses, hidrocarbonetos e lipdeos so utilizados seletivamente por


algumas espcies. O carbono pode ser fornecido s leveduras na forma de acar, aldedos, sais de alguns cidos orgnicos, glicerina ou etanol, e ocasionalmente de alguma outra forma, dependendo do tipo da levedura. Ao considerar os acares como fonte de carbono, importante lembrar a diferena que existe entre a capacidade de uma levedura em assimilar um acar e sua capacidade de fermentar o mesmo acar (MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 1997). Diferenas na fermentao e assimilao de compostos de carbono so critrios importantes na taxonomia e identificao de leveduras, pois estes microrganismos apresentam uma variao na habilidade de fermentao de acares. Alguns grupos apresentam fermentao vigorosa da glicose como Kluyveromyces, Saccharomyces, Torulaspora e Zygosaccharomyces, enquanto outros, como Lipomyces e Sterigmatomyces so estritamente no-fermentativos (WALT YARROW, 1984). 3.3.2 Importncia econmica das leveduras A importncia industrial das leveduras vem se estendendo alm da fermentao tradicional. Atualmente, os produtos da biotecnologia a partir de leveduras afetam muitos setores comerciais importantes, como as indstrias de alimentos, bebidas, biocombustveis, produtos qumicos, enzimas industriais, produtos farmacuticos, produtos agrcolas e o ambiente. Tem-se a previso de que a produo tradicional de lcool etlico, por indstrias cervejeiras, vincolas, indstrias de bebidas destiladas e de combustveis, e a produo de biomassa, pela indstria alimentcia, iro continuar a fornecer a maior quantidade de produtos fermentados do mundo. Esta suposio est baseada no fato de que a levedura Saccharomyces cerevisiae responsvel pela produo dos principais produtos de fermentao (em termos de tonelagem mundial por ano), isto , 60 milhes de toneladas de cerveja, 30 milhes de toneladas de vinho, 800.000 toneladas de protena microbiana (SCP single cell protein) e 600.000 toneladas de fermento de po (PRETORIUS; TOIT; RENSBURG, 2003).


O consumo de alimentos fermentados vem aumentando desde a dcada de 1970, e inclui alimentos como produtos lcteos (iogurtes, queijos, soro de leite), salsichas, bebidas fermentadas alcolicas, vegetais, frutas, molhos, entre outros. Um dos motivos do aumento do consumo que estes alimentos so considerados naturais e saudveis (GIRAFFA, 2004). Devido importncia econmica dos processos biotecnolgicos envolvendo a levedura Saccharomyces cerevisiae, quer na panificao, na produo de cerveja, vinho e outras bebidas alcolicas ou ainda na produo de um combustvel alternativo e renovvel, tal microrganismo pode ser considerado o eucarioto mais estudado e cujo metabolismo o mais conhecido (AQUARONE; LIMA; BORZANI, 2001). 3.3.3 Saccharomyces cerevisiae O gnero Saccharomyces tem passado por inmeras mudanas desde a sua descoberta, h 150 anos. Quando a primeira publicao sobre taxonomia de leveduras foi compilada por Guilliermond, em 1912, o gnero Saccharomyces compreendia 46 espcies divididas em 06 grupos separados de acordo com a atividade fermentativa sobre os acares. Em 1952, o nmero total de espcies deste gnero foi reduzido a 30, uma vez que vrias espcies foram agrupadas como sinnimos em Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae variedade elipsoideus, Saccharomyces carlsbergensis ou Saccharomyces willianus, enquanto novas espcies foram introduzidas ao gnero. Entretanto, vrias outras divises ocorreram e outras novas espcies foram descritas, principalmente o grupo Saccharomyces sensu stricto, obtendo-se como resultado, em 1970, 41 espcies dentro do gnero Saccharomyces. WALT e YARROW3, citado por VAUGHAN-

3

WALT, J.P. van der; YARROW, D. Methods for isolation maintenance, classification and identification

of yeasts. In: KREGER-VAN RIJ, NJW (Ed.). The Yeasts: a taxonomy study. Amsterdam: Elselvier Science, 1984.


MARTINI; MARTINI (1993), reduziram drasticamente o gnero Saccharomyces em 7 espcies. Saccharomyces sensu stricto, previamente com 21 espcies, tornou-se a espcie Saccharomyces cerevisiae, e outras espcies previamente agrupadas por Van der Walt, em 1970, foram introduzidas a outros gneros como Zygossacharomyces e Toluraspora. Esta classificao de Yarrow, mais tarde foi tanto confirmada por alguns autores, quanto contraditria segundo outros (VAUGHAN-MARTINI; MARTINI, 1993). O gnero Saccharomyces vem tendo inmeras mudanas taxonmicas ao longo dos anos. Atualmente, de acordo com a ltima reviso taxonmica, 14 espcies so aceitas dentro do gnero Saccharomyces, as quais esto classificadas em trs grupos previamente estabelecidos por van der Walt. O complexo Saccharomyces senso lato inclui Saccharomyces barnettii, Saccharomyces castellii, Saccharomyces dairenensis, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces rosinii, Saccharomyces servazzii, Saccharomyces spencerorum, Saccharomyces transvaalensis e Saccharomyces unisporus. O segundo grupo Saccharomyces kluyveri. O terceiro grupo, o qual inclui espcies de interesse biotecnolgico, consiste do complexo Saccharomyces senso stricto, compreendendo Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces pastorianus, todos associados com fermentao industrial, e Saccharomyces paradoxus, a nica espcie Saccharomyces senso stricto tipicamente isolada a partir de habitat natural (insetos, rvores e exsudatos). Recentemente, trs novas espcies isoladas a partir de habitat natural, Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces kudriavzvii e Saccharomyces mikatae, tm sido includas dentro do grupo Saccharomyces senso stricto (QUEROL; BELLOCH, 2003 (b)) A levedura Saccharomyces cerevisiae um microrganismo atrativo de se trabalhar por ser no-patognico, e devido a sua longa histria de aplicao na produo de produtos consumveis como o etanol e o po, ela foi classificada como microrganismo geralmente considerado seguro (GRAS generally regarded as safe) (OSTERGAARD; OLSSON; NIELSEN, 2000). Alm disso, os processos fermentativo e tecnolgico bem estabelecidos para a produo em larga escala com a levedura Saccharomyces cerevisiae, fazem este


microrganismo ser bastante atrativo para muitos processos biotecnolgicos. Outra importante razo para a aplicabilidade da levedura Saccharomyces cerevisiae dentro do campo da biotecnologia a sua susceptibilidade a modificaes genticas pela tecnologia do DNA recombinante, que vem sendo bastante facilitado pela publicao, em 1996, do genoma completo da levedura (OSTERGAARD; OLSSON; NIELSEN, 2000).

3.4 PROCESSO FERMENTATIVO 3.4.1 Fermentao Espontnea As fermentaes espontneas so aquelas produzidas de maneira natural, ou seja, realizadas pelas leveduras provenientes das cascas das uvas, sem nenhum tipo de inoculao externa. Isto faz com que as fermentaes espontneas no sejam produto da ao de uma nica espcie de levedura, e sim uma sucesso de espcies de leveduras diferentes ao longo da fermentao (TORIJA, 2002). As leveduras podem ter a sua origem nas uvas e/ou no material que entra em contato com o mosto. Em uma uva s e madura que seja prensada assepticamente, a populao total de leveduras no mosto pode variar entre 103 105 unidades formadoras de colnias por mililitros de mosto (UFC/mL). Tradicionalmente, leveduras associadas a uvas so conhecidas pela fermentao de acares a etanol, gs carbnico e outros metablitos secundrios tambm de importncia para o processo. A espcie majoritria na superfcie do gro da uva a levedura apiculada Hanseniaspora uvarum e sua forma anamrfica, Kloeckera apiculata, que representam aproximadamente entre 50 75% da populao total. Juntamente com a Candida, elas dominam os primeiros estgios da fermentao espontnea, seguidas por muitas espcies de Cryptococcus, Kluyveromyces, Metschnikowia e Pichia, quando o nvel de etanol aumenta de 3 para 4% (JIMENEZ-CLEMENTE, et. al., 2004; ROSINI, G., FEDERICI e MARTINI, 1982; PARISH, CARROL, 1985).


Assim, embora muitos gneros e espcies de leveduras sejam encontrados no mosto de fermentao, o gnero Saccharomyces, e principalmente a espcie Saccharomyces cerevisiae, a principal responsvel pela fermentao alcolica (QUEROL et. al., 2003 (a)). O estgio final da fermentao espontnea , invariavelmente, dominado pelo grupo de leveduras lcool-tolerantes de leveduras Saccharomyces sensu stricto. Este grupo consiste de quatro espcies, a saber, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces paradoxus e Saccharomyces pastorianus. Uma vez que a levedura Saccharomyces cerevisiae encontrada quase que exclusivamente nos ambientes fermentativos e universalmente preferida como iniciadora de fermentaes, ela tornou-se conhecida como levedura vnica, sendo a principal responsvel pela fermentao alcolica. Entretanto, outras leveduras presentes no-Saccharomyces, durante a assim e como podem espcies ocorrer de no Bretanomyces, vinho resultante Schyzosaccharomyces, Torulaspora e Zygosaccharomyces, tambm podem estar fermentao (REDZEPOVC et. al., 2002). As diferentes e dinmicas atividades destas leveduras apresentam grande impacto sobre muitos aspectos no processo fermentativo vnico. Algumas espcies so benficas para a produo do vinho; outras atuam prejudicialmente como microrganismos deteriorantes. A contribuio individual e coletiva destas leveduras selvagens varia de acordo com o nmero e diversidade de espcies presentes no mosto de fermentao (PRETORIUS, 2000). 3.4.2 Bioqumica da Fermentao Na fermentao vnica, os principais acares presentes no mosto, glucose e frutose, so co-fermentados levando produo de etanol e gs carbnico, assim como outros metablitos de menor importncia (BERTHELS, 2004).


As leveduras do vinho durante a fermentao do mosto produzem, como resultado do seu metabolismo, uma grande variedade de compostos ao lado do etanol, o principal produto. Os principais fatores que afetam estes produtos so a espcie da levedura, o tipo de mosto e as condies de fermentao. Estes produtos so liberados durante a fermentao e contribuem para o sabor do vinho, de maneira que a qualidade do vinho depende do tipo destes compostos e suas concentraes. Estes compostos compreendem lcoois superiores, cetonas, aldedos, cidos graxos, acetatos e steres (MAURICIO, 1997). A transformao do acar at resultar etanol e gs carbnico envolve 12 reaes em seqncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especfica. Tais enzimas sofrem a ao de diversos fatores (nutrientes minerais, vitaminas, inibidores, substncias do prprio metabolismo, pH, temperatura, etc.) alguns que estimulam, outros que reprimem a ao enzimtica, afetando assim o desempenho do processo. O objetivo primordial da levedura ao metabolizar o acar, gerar uma forma de energia qumica (ATP) que ser empregada na realizao dos diversos trabalhos fisiolgicos e biossnteses, necessrios manuteno da vida, crescimento e multiplicao, perpetuando desta forma a espcie. O etanol e CO2 resultantes se constituem em produtos de excreo, sem utilidade metablica para a clula em anaerobiose. Entretanto, o etanol e outros produtos de excreo podem ser oxidados metabolicamente gerando mais ATP e biomassa, mas apenas em condies de aerobiose. Durante a fermentao, na seqncia de reaes de produo de ATP, rotas metablicas alternativas aparecem para propiciar a formao de materiais necessrios produo de biomassa (polissacardeos, protenas, cidos nuclicos) bem como para a formao de outros produtos de interesse metablico, relacionados direta ou indiretamente com a adaptao e sobrevivncia, o que pode vir a reduzir a produo de etanol. So eles, o glicerol, os cidos orgnicos, principalmente o succnico e o actico, que conjuntamente com a biomassa so quantitativamente os principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilbrio redox celular em anaerobiose. A fermentao alcolica um processo no oxidativo, sem a participao do oxignio molecular, e portanto, para se manter o equilbrio de redox celular, todo o NADH formado (em reaes de


oxidao) deve ser consumido (em reaes de reduo) estas acopladas produo de etanol e glicerol (AMORIM; BASSO; ALVES, 1996). 3.4.3 Fatores que afetam o desempenho fermentativo Obviamente, a fermentao alcolica fortemente afetada por alguns fatores como a clarificao do suco de uva, os nveis de dixido de enxofre, a temperatura de fermentao e a composio do suco de uva entre outros. Um destes fatores, a temperatura de fermentao, afeta diretamente a flora microbiana do mosto e as reaes bioqumicas das leveduras. Alm disso, o nmero de diferentes espcies assim como suas resistncias durante a fermentao alcolica so condicionadas tanto pela temperatura do mosto quanto pela temperatura durante a fermentao. Estas alteraes determinam qumica e organolepticamente a qualidade do vinho. A temperatura tambm afeta o metabolismo da levedura, e como resultado disso, a formao de metablitos secundrios como o glicerol, cido actico e cido succnico (TORIJA, et. al., 2003). A temperatura mais adequada para a realizao da fermentao alcolica situase entre 18-23 C e esta a temperatura geralmente empregada para a elaborao de vinhos brancos. Para a elaborao de vinhos tintos necessria uma macerao das bagas das uvas com a finalidade de se extrair compostos como antocianinas e taninos de forma que a fermentao seja ento conduzida a temperaturas mais elevadas, entre 24 31 C, para maior extrao destes compostos. Acima de 33-35 C o risco de trmino da fermentao muito elevado assim como de contaminao bacteriana, uma vez que em temperaturas elevadas as membranas celulares das leveduras tornam-se menos seletivas, liberando substratos mais adequados para as bactrias (COLLADO, 2001). A produo de glicerol tambm outro fator que afeta o desempenho fermentativo, uma vez que parte do glicerol formado est acoplado manuteno do equilbrio redox intracelular. Como a biossntese de glicerol utiliza o poder redutor (NADH), a produo do mesmo aumentada quando h excesso de NADH na clula. Isto ocorre quando processos oxidativos se desenvolvem, sejam decorrentes


da produo de biomassa ou formao de cidos orgnicos. Outros fatores como o cido succnico, cido actico, produo de biomassa e carboidratos de reserva tambm podem vir a afetar o desempenho da fermentao, uma vez que, ao serem produzidos ou consumidos, iro alterar o equilbrio redox da clula (AMORIM; BASSO; ALVES, 1996). Para a formao de um mol de succinato h conseqentemente formao de 5 moles de NADH (redutor). Para se restabelecer o equilbrio redox da clula necessrio consumo deste NADH, que feito atravs da produo do glicerol. A produo de um mol de glicerol consome um mol de NADH. Para a formao de um mol de cido actico ocorre a produo de dois moles de NADH (MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 1997).

3.5 USO DE LEVEDURAS SELECIONADAS O conceito de inoculao em fermentaes vnicas com culturas puras como iniciadoras datam de 1890 quando Muller-Thurgau convenceu alguns alemes vinicultores do benefcio concomitante do ritmo e rapidez da fermentao. Cerca de 75 anos depois, duas leveduras comercias secas ativas foram produzidas e oferecidas a todo o mundo como leveduras para todos os propsitos. Seu sucesso foi limitado e logo se percebeu a necessidade de separar leveduras Saccharomyces cerevisiae com caractersticas especficas para diferentes tipos e estilos de vinhos. Os produtores de vinhos utilizam culturas iniciadoras com ampla variao de propriedades fermentativas, tecnolgicas e metablicas especializadas, como por exemplo: rpida iniciao do processo fermentativo, alta tolerncia a etanol, osmotolerncia, baixa produo de biomassa, alta estabilidade gentica, baixa formao de espuma, pouca quantidade de sulfeto de hidrognio, entre outros (PRETORIUS, 2000). Estas leveduras tambm devem ter outras caractersticas desejveis como tolerncia ao dixido de enxofre, habilidade de fermentar acares eficientemente a uma concentrao em torno de 20% (p/v) e produzir grandes quantidades de glicerol (CARRASCO; QUEROL, 2001).


No caso de fermentaes de vinho conduzidas por leveduras secas ativas, a principal levedura responsvel pela fermentao a levedura inoculada no processo, mas isto no diminui significantemente o desenvolvimento de leveduras naturais durante os primeiros estgios da fermentao, as quais tm um importante efeito no sabor do vinho (GONZLEZ-PEREZ, et. al., 1993). Atualmente, na maioria das vincolas, so utilizadas leveduras selecionadas as quais so inoculadas no mosto de fermentao como leveduras secas ativas, simplificando microbiologicamente o processo de fermentao alcolica. A levedura inoculada geralmente responsvel pela fermentao e constitui a maioria da populao de levedura ao final do processo. Esta prtica de inoculao de leveduras tem algumas vantagens como a diminuio da fase lag, reduo significante da influncia de leveduras que naturalmente ocorrem, rpida e completa fermentao do mosto e ainda permite um alto grau de reprodutibilidade de produo do vinho (ZUZUARREGUI; OLMO, 2004 (b)). Tecnologistas do vinho definem as qualidades requeridas para a definio de levedura Saccharomyces cerevisiae como iniciadora seletiva para elaborao de vinho em duas categorias: primrias, quelas estruturalmente associadas formao do etanol pela fermentao; e secundrias, quelas relacionadas produo de compostos que afetam outros parmetros como o corpo do vinho, o buqu e o aparecimento de sabores desagradveis. Convencionalmente, as condies primrias envolvem o alto vigor fermentativo, ou seja, a alta concentrao de etanol obtida a partir de grandes quantidades de acares; a alta pureza fermentativa, que expressa a relao entre a acidez voltil (em g de cido actico/l) e etanol (% volume) ao final do processo fermentativo e a alta taxa fermentativa, a qual mede a capacidade de uma levedura em completar rapidamente o processo fermentativo. Esta representada em gramas de gs carbnico desenvolvidas no perodo de 24 horas, calculadas como a mdia medies em 3 dias consecutivos. As condies secundrias afetam outro nvel de qualidade do vinho, ou seja, as caractersticas organolpticas, as quais so mais difceis de serem representadas em termos analticos devido ao fato de que resultam das interaes de inmeros sub-produtos da fermentao primria (MARTINI, 2003).


O uso de leveduras selecionadas no processo de produo do vinho requer o desenvolvimento de tcnicas que possam claramente diferenciar as leveduras inoculadas do restante das leveduras selvagens presentes no mosto. Isto ir proporcionar um conveniente teste para assegurar que a fermentao est sendo conduzida pelas leveduras inoculadas. Como a maioria das leveduras pertence mesma espcie, Saccharomyces cerevisiae, elas no podem ser diferenciadas pelos mtodos clssicos microbiolgicos. Para resolver este problema, muitas tcnicas baseadas em polimorfismos moleculares tm sido utilizadas recentemente para caracterizao de leveduras de vinhos (TORRIANI et.al., 2004). O melhoramento gentico, baseado em tcnicas genticas clssicas (mutagnese, hibridizao, fuso de protoplastos) aliado posteriormente biologia molecular, aumentou substancialmente as possibilidades de modificar leveduras industriais em funo das caractersticas desejveis no produto final. Nos ltimos 20 anos, os principais alvos para o desenvolvimento de diferentes variedades de Saccharomyces cerevisiae esto voltados para o melhoramento da performance fermentativa e simplificao do processo, aliado ao aumento da qualidade do produto, como as caractersticas sensoriais e higinicas (VILANOVA et. al., 2000; DEQUIN, 2001). H considervel controvrsia sobre uso de leveduras puras selecionadas em fermentaes vnicas. Segundo QUEROL; JIMENEZ; HUERTA (1990), na fermentao natural, uma sucesso de gneros de leveduras observada durante os primeiros estgios do processo, seguido de certas espcies de Saccharomyces, as quais ento dominam os estgios mais ativos at o final da fermentao. Sugerese que esta sucesso de espcies permite a obteno de um aroma mais complexo do vinho. Alguns pesquisadores alegam que o uso de leveduras selecionadas pode suprimir significativamente o desenvolvimento de leveduras naturais durante a fermentao. Por outro lado, HEARD e FLEET (1985) postularam que as variedades de S. cerevisiae inoculadas podem influenciar beneficamente o desenvolvimento de variedades de Saccharomyces selvagens pela inibio do crescimento de leveduras no-Saccharomyces.


3.6 IDENTIFICAO DE LEVEDURAS DE INTERESSE ENOLGICO Um dos avanos chave da enologia moderna o reconhecimento da importncia da levedura como um agente imprescindvel para a adequada obteno do vinho. Deste reconhecimento nasce, de maneira imediata, a necessidade de controlar as propriedades metablicas e genticas das leveduras empregadas nos processos fermentativos enolgicos, assim como de desenvolver sistemas analticos capazes de distinguir entre as diferentes leveduras, tanto pelas desejadas quanto pelas contaminantes. PHAFF1, citado por MATIENZO (2002), afirmou que o crescimento em temperaturas elevadas, em meios com altos teores de acares ou cloreto de sdio, o requerimento de vitaminas, a susceptibilidade a certas drogas como a ciclohexamida e a produo de determinados metablitos so critrios utilizados na descrio e classificao das leveduras, e so importantes, uma vez que auxiliam no agrupamento das linhagens de acordo com o habitat da levedura. Segundo KRIEGER-VAN RIJ2, tambm citado por MATIENZO (2002), as metodologias aplicadas identificao de leveduras envolvem procedimentos como o isolamento da levedura do ambiente, determinao de propriedades morfolgicas e fisiolgicas, descrio e comparao com microrganismos padro e ocasionalmente, avaliao de propriedades tecnolgicas. O conjunto de dados obtidos, obedecendo rigorosamente a protocolos padronizados, resulta na identificao e posicionamento taxonmicos das leveduras Alm disso, a classificao ideal deve estar baseada na filogenia dos microrganismos, uma vez que a relao classificao-filogenia permite predizer similaridades genticas entre os microrganismos, fornecendo informaes necessrias para a descoberta e avaliao de parentescos entre linhagens e1

PHAFF, H.J. Isolation of yeasts from natural sources. In: LABEDA, D.P. (Ed.). Isolation of

biotechnological organisms from nature. New York: McGraw-Hill, 1990.2

KRIEGER-VAN RIJ, N.J.W. Classification of yeasts. In: ROSE, A.H.; HARISSON, J.S. (Ed.). The

Yeasts. London: Academic Press, v.1, 1987


espcies, resultando em maior compreenso da evoluo das leveduras (MATIENZO, 2002). Atualmente existem vrios mtodos de identificao de leveduras de interesse enolgico. O maior desafio ao se identificar leveduras recai na necessidade de diferenciar gneros e espcies que taxonomicamente esto muito prximos, mas que tm propriedades muito diferentes no que se refere s suas caractersticas fermentativas e organolpticas. Durante as primeiras fases da fermentao vnica aparecem no mosto as leveduras dos gneros Kloeckera, Candida, Rhodothorula, Pichia, Kluyveromyces, entre outras. A presena destas espcies pode dar lugar a metablitos secundrios que modificam as propriedades organolpticas do produto final, e, portanto, importante dispor de mtodos eficazes de deteco para seu controle. Finalmente, tambm possvel utilizar as tcnicas de identificao molecular para as anlises e comprovao da estabilidade gentica das leveduras, um aspecto importante quando se manejam grandes volumes de cultivo (CARRO; PIA, 2000). A dificuldade de identificao de leveduras pela utilizao de tcnicas microbiolgicas usuais, tem induzido o desenvolvimento de um grande nmero de diferentes caminhos taxonmicos. A biologia molecular tem providenciado novas tcnicas para a determinao taxonmica de leveduras vnicas. Estas tcnicas incluem a anlise de restrio do DNA genmico e mitocondrial, caritipo molecular com eletroforese de campo pulsado e a reao em cadeia da Polimerase (PCR). A caracterizao de espcies de leveduras a partir de PCR utilizando iniciadores especficos vem sendo adotada (SABAT; GUILLAMON; CANO, 2000). Recentemente, uma variante da tcnica de PCR, a RAPD-PCR (Reao em cadeia da polimerase - anlises de Polimorfismo de DNA amplificado ao Acaso) tem sido aplicada ao estudo das leveduras. A RAPD-PCR baseia-se na amplificao seletiva de seqncias que, ao acaso, so circundadas por regies complementares ao iniciador escolhido arbitrariamente. Os iniciadores tm seqncia especfica, mas escolhida arbitrariamente. Esta tcnica est baseada na utilizao de iniciadores curtos, geralmente cerca de 10 nucleotdeos, que em temperatura baixa de anelamento hibridizam em regies distribudas aleatoriamente ao longo do genoma,


permitindo a amplificao de fragmentos de DNA cujas extremidades sejam complementares ao iniciador. Os produtos da reao so analisados por eletroforese. Esta tcnica tem a vantagem adicional de que nenhum conhecimento especfico do genoma a ser amplificado necessrio (QUESADA; CENIS, 1995). Diferenas no padro de amplificao refletem polimorfismos que se acumularam durante a evoluo, sendo a RAPD-PCR til para mapeamento gentico, taxonomia, filogentica e para deteco de mutaes (WELSH; RALPH; McCLELLAND, 1995). Um dos problemas da tcnica de RAPD-PCR, freqentemente citado, a sua reprodutibilidade. Existem muitas variveis dentro da reao que contribuem para isto; dentre os mais importantes esto o termociclador utilizado, a DNA-polimerase, a concentrao de DNA, seqncia de nucleotdeos dos iniciadores empregados e a composio do tampo utilizado (QUESADA; CENIS, 1995). 3.7 SELEO DE LEVEDURAS Uma vez que linhagens de leveduras isoladas de produes artesanais mostram-se bem adaptadas s condies ambientais encontradas nas dornas de fermentao, a simulao destas condies utilizada como critrio para seleo de leveduras (PATARO et. al., 2000). Durante a fermentao alcolica as clulas de leveduras so submetidas a diversas condies de estresse e, desta maneira, tm que desenvolver mecanismos moleculares para que resistam a estas situaes adversas. Qualquer fator do meio que possa vir a produzir um efeito adverso sobre o crescimento celular considerado uma condio de estresse e a sobrevivncia celular depende da sua habilidade em se adaptar rapidamente s mudanas do meio (IVORRA; PREZORTIN; OLMO, 1999). As clulas de leveduras possuem sistemas para sentir e responder s condies de estresse. Tanto o dano provocado pelo estresse quanto a resposta da levedura ao mesmo, depende do tipo e grau do estresse e o estado de desenvolvimento que se encontra a levedura no momento do estmulo. Em geral, as


condies adversas que as leveduras enfrentam afetam principalmente as estruturas celulares, como as membranas, e as diferentes macromolculas, especialmente os lipdios, protenas e cidos nuclicos, os quais sofrem modificaes estruturais que afetam seu funcionamento (FOLCH-MALLOL; GARAY-ARROYO; LLEDIAS, 2004). Estes sistemas de resposta envolvem a rpida sntese de molculas de proteo e a ativao de sinais que induzem eventos secundrios como o engatilhamento de atividades enzimticas pr-existentes e a transcrio de genes que codificam para fatores de proteo. As diferentes habilidades que as leveduras apresentam de resistir s condies de estresse durante a produo de vinho, podem determinar suas propriedades fermentativas e estabelecer critrios para a seleo de futuras leveduras de vinhos (IVORRA; PREZ-ORTIN; OLMO, 1999; CARRASCO; QUEROL, 2001). Existem muitos tipos de condies de estresse que afetam as leveduras durante o processo de fermentao vnica. O estresse trmico uma condio que vem sendo largamente estudada. Nos processos artesanais, onde no h controle de temperatura, a temperatura de fermentao importante porque afeta diretamente os microrganismos presentes e o metabolismo das leveduras (TORIJA et. al., 2003). Embora a condio de temperaturas elevadas no seja usualmente encontrada durante a fermentao, em virtude dos sistemas de controle de temperatura utilizados nos dias de hoje, altas temperaturas podem ocorrer durante o processo de produo de biomassa e secagem das leveduras, estgios requeridos para a preparao industrial de leveduras vnicas (FOLCH-MALLOL; GARAY-ARROYO; LLEDIAS, 2004). O estresse hiperosmtico uma condio de estresse importante para as leveduras vnicas, pois a alta concentrao de acares no mosto de fermentao produz um estresse osmtico nas clulas da levedura ao qual elas devem resistir para conduzirem eficientemente a fermentao. Uma condio de estresse hiperosmtico se define como uma diminuio no potencial hdrico do ambiente no qual se est desenvolvendo o microrganismo. A resposta imediata uma sada de gua intracelular, seguida de um processo adaptativo amplo a fim de levar a um ajuste osmtico. Devido ao movimento de gua, as concentraes intracelulares de ons e


biomolculas aumentam resultando em diminuio da atividade celular; uma vez que o microrganismo se adaptou, retoma o crescimento (FOLCH-MALLOL; GARAYARROYO; LLEDIAS, 2004). Um dos aspectos da resposta ao estresse osmtico inclui o aumento da produo e reteno intracelular do glicerol, que parcialmente envolve o aumento da expresso do gene que codifica para a enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase. Leveduras osmotolerantes so aptas a reter o glicerol sintetizado para atuar como um soluto compatvel ou osmoregulador. Qualquer que seja o mecanismo, a habilidade da levedura Saccharomyces cerevisiae em resistir a condies hiperosmticas de estresse ir depender tanto da produo quanto da reteno intracelular de glicerol (MYERS; LAWLOR; ATTFIELD, 1997). A biossntese e acmulo de glicerol tm relevncia comercial nos processos fermentativos para produo de cerveja e vinho, e tambm importante para bebidas como saqu que tem neste composto um fator importante para suas caractersticas organolpticas (OMORI et. al., 1995; MAGER e SIDERIUS, 2002) Durante a fermentao ocorre um aumento da concentrao de etanol e, desta maneira, as leveduras precisam desenvolver um mecanismo para proteger-se da toxicidade desta molcula. Isto tem mostrado que o etanol induz um estresse aquoso nas leveduras vnicas (IVORRA; PREZ-ORTIN; OLMO, 1999). Para a seleo de leveduras essencial estabelecer suas propriedades enolgicas. Existem diferentes critrios de seleo que podem ser divididos em: favorveis, como tolerncia ao etanol, bom rendimento na transformao dos acares em etanol, capacidade de crescer em altas concentraes de acares; e desfavorveis, como a produo de sulfeto de hidrognio, produo de espuma e acidez voltil (ESTEVE-ZARZOZO, et. al., 2000). Quando se deseja selecionar uma levedura Saccharomyces cerevisiae para utiliz-la como iniciadora de um processo fermentativo e parte-se de um nmero elevado de leveduras diferentes, pode-se aplicar o que conhecido como seleo massiva por competio. Este mtodo de seleo similar ao que ocorre nas fermentaes espontneas, e se baseia na prpria competio entre as leveduras pelos nutrientes do meio de cultivo, para eleger aquelas que tenham melhor capacidade


fermentativa. Este critrio pode ser suficiente, mas h necessidade de se utilizar outros mtodos como, por exemplo, a temperatura de fermentao, a finalizao correta do processo e as anlises organolpticas dos vinhos produzidos (TORIJA, 2002). Entre as propriedades enolgicas mais importantes que devem estar presentes em uma levedura vnica esto o completo e rpido consumo de acar do mosto com contnua transformao destes acares em etanol; a no produo de sulfeto de hidrognio (H2S); a alta capacidade de floculao principalmente ao final da fermentao; a alta tolerncia ao dixido de enxofre (SO2) e ao etanol e a resistncia a altas presses osmticas e capacidade da cepa em degradar substncias pcticas (IRANZO; BRIONEZ-PREZ; IZQUIERDO-CAAS, 1998). Segundo FINN e STEWART (2002), a floculao pode ser definida por uma agregao de clulas de leveduras em grumos, dispersveis por cido etilenodiaminotetractico (EDTA) ou por acares especficos, e que podem ser removidos do meio. A floculao tem considervel importncia na indstria cervejeira, uma vez que diminui custos, produz um meio com caractersticas desejveis ao processo, e um efetivo caminho para separar as leveduras do produto. Mesmo quando a centrifugao aplicada no processo de fabricao para retirar as clulas suspensas; a floculao importante para a remoo das leveduras (JIN e SPEERS, 1998; VERSTREPEN et. al., 2001; FINN e STEWART, 2002). Microbiologistas tm proposto algumas hipteses para explicar os mecanismos de floculao, como a teoria coloidal e a ponte de clcio. Estudos mais recentes apontam para a teoria da lectina-like. As lectinas (ou zymolectina, como so conhecidas nas leveduras), so protenas da parede celular que reconhecem e aderem carboidratos (-mananas) da superfcie das clulas vizinhas. O clcio um importante co-fator nessas ligaes (JIN et. al., 2001;FINN e STEWART, 2002). Outras variaes de parmetros que ocorrem durante a fermentao tambm influenciam na floculao: pH, agitao e na presena de acares. Na floculao h participao do controle gentico e molecular do processo (JIRANECK; LANGRIDGE; HENSCHKE, 1995).


O aroma e o sabor so parmetros fundamentais na qualidade sensorial de alimentos e bebidas. Estudos sugerem que aproximadamente 10% dos compostos volteis de alimentos e bebidas apresentam grupos contendo enxofre e, em alguns casos a presena de um nico composto suficiente para dar identidade a um produto. Os grupos contendo enxofre tm grande impacto no aroma do vinho, sendo classificados em cinco diferentes famlias de acordo com a sua estrutura: sulfdricos, tioster, tiis, polisulfdricos e heterocclicos. As diferentes concentraes destes compostos podem influir na produo de odores agradveis ou desagradveis. Compostos como a cistina, cistena, metionina, glutationa e algumas vitaminas formam diferentes compostos contendo enxofre. Estas converses podem ocorrer enzimaticamente como produtos da fermentao, ou no enzimaticamente, devido ao da luz, temperatura ou outras reaes dos compostos de enxofre durante a fabricao e a estocagem do vinho (MESTRES; BUSTO; GUASCH, 2000). Devido ao odor repugnante a presena de sulfeto de hidrognio totalmente dispensvel nas bebidas. Na fermentao da cerveja, o sulfeto de hidrognio produzido pelas leveduras removido durante a fermentao (RIBEIRO e HORII, 1999). As enzimas pcticas de grande interesse na vinicultura so as poligalacturonases e liases. Quando no produzidas pela cepa, estas enzimas podem ser adicionadas separadamente ao mosto. Entretanto, as preparaes comerciais encontram-se geralmente contaminadas com arabinofuranidases e pectinesterases, que produzem e liberam metanol no mosto (BLANCO et al., 1997). As enzimas pcticas degradam as substncias pcticas do mosto, aumentando a taxa de clarificao e evitando o desaparecimento de substncias importantes tais como as antocianinas e alguns outros precursores (IRANZO et al., 1998). Facilita a compresso das uvas, aumenta a extrao de substncias que contribuem na cor e aroma durante o tempo em que o mosto permanece em contato com as cascas, alm de melhorar a filtrao dos vinhos em funo da diminuio na viscosidade (FERNNDEZ; BEDA; BRIONES, 2000). Alm disto, aumenta a extrao dos pigmentos e a velocidade do processo fermentativo. A economia no tempo de fermentao pode variar entre 30-50%.


Tambm reduzem a extrao de cido tnico e aumentam a maturao da uva. Aumenta a quantidade de acares fermentveis, aumentando o rendimento do processo (WARD, 1985). Nem todas as cepas de S. cerevisiae apresentam a habilidade de produzir enzimas pcticas. BLANCO et al. (1997) determinou que apenas 75% de suas cepas de S. cerevisiae tinham esta habilidade. IRANZO et al. (1998) determinou que apenas 33% de suas cepas de S. cerevisiae mostraram a capacidade de hidrolisar o cido poligalacturnico. Alm disso, S. cerevisiae no reconhecido como um grande produtor de enzimas extracelulares, embora alguns trabalhos indiquem a degradao de poligalacturonatos (STRAUSS et al., 2001).

3.8 Elaborao de Vinho Tinto A metodologia de elaborao para vinhos tintos descrito por CHOCIAI et. al., 2000 e DORNELES, 2003. A metodologia de elaborao para vinhos tintos utilizada pela maioria dos vinicultores na regio metropolitana de Curitiba segue o sistema clssico de vinificao conforme descrito por PATO, 1978; MENEGUZZO, 1990; CHOCIAI et.al., 2000. Aps a colheita das uvas, realizada a lavagem e seleo dos bagos maduros e sadios, desengaamento utilizando maquinrio apropriado e os gros so mecanicamente esmagados para liberao da polpa e sumo. O suco de uva obtido e so realizadas correes no mosto como correo da maturao da uva pela adio de acar (processo chamado chaptalizao) ou com o mosto concentrado, ou ainda diminui-se a acidez por desacidificao. Por outro lado, quando a uva acusa acidez insuficiente, efetua-se a acidificao com cido tartrico. Em seguida realizada a sulfitagem que consiste na adio de anidrido sulfuroso, na forma de metabissulfito de potssio, visando evitar o crescimento de microrganismos indesejveis na fermentao. Realizadas as correes, o mosto juntamente com as casacas levado para as cubas de fermentao, abertas ou fechadas.


A fermentao alcolica ocorre em duas fases distintas: a primeira, rpida e tumultuosa, aquela que se efetua logo aps a vindima, durante poucos dias; a segunda fase, denominada complementar, realiza-se mais suavemente, durante mais tempo que a primeira. A fermentao tumultuosa inicia-se pela transformao dos acares fermentveis em lcool etlico e gs carbnico. O gs carbnico provoca a formao do chapu, sendo necessrio misturar este chapu com o suco em fermentao, com auxlio de misturadores, ou em caso de grandes tanques, com auxlio de bombas, processo conhecido como remontagem e que consiste em bombear o mosto da parte inferior sobre o chapu, pelo menos trs vezes ao dia. No trmino desta fase, que est relacionado diminuio na intensidade de desprendimento de gs carbnico, o bagao do suco parcialmente fermentado separado, processo conhecido como descuba. Com a descuba, inicia-se a fase complementar da fermentao alcolica, onde os acares que no foram fermentados so lenta e totalmente transformados em lcool e onde sero formadas as substncias responsveis pelo aroma e buqu do vinho. O gs carbnico formado borbulha em um batoque hidrulico adaptado ao recipiente de fermentao para evitar o contato com o oxignio durante a fase complementar. Quando cessa o borbulhamento realizada a primeira trasfega com o objetivo de separar o vinho das substncias slidas acumuladas no fundo do recipiente (leveduras, cremor trtaro e outros constituintes que podem vir a alterar o vinho). O vinho transferido para outro recipiente devidamente limpo e desinfetado inicia a maturao. O volume do recipiente totalmente preenchido para evitar contaminao por bactrias. No final do perodo de maturao realizada a segunda trasfega para continuar a separar o material indesejvel que precipita no fundo do recipiente. Em seguida ocorre a estabilizao, terceira trasfega, clarificao, filtrao e engarrafamento dos vinhos.

Material e Mtodos - 33

4. MATERIAL E MTODOS


4.1 MATERIAIS Relao de matrias utilizados nos experimentos e sua procedncia: a) meios de cultura, solues e reagentes obtidos da Merck do Brasil, Difco, Riede-de-Han e Invitrogen; b) Leveduras comerciais Saccharomyces cerevisiae variedade cerevisiae (CK) e Saccharomyces cerevisiae variedade bayanus (BC), na forma seca ativa, proveniente do fabricante Danster Ferment AG, localizado na Sua; e as leveduras Schyzosaccharomyces pombe, Kluyveromyces marxianus, Phaffia rhodozyma, adquiridas da American Type Culture Collection. c) Iniciadores SC1, SC2, OPB-01, OPB-10, OPB-12, OPB-14, OPX-01, OPX-03, OPX-06, OPX-07, ABI-15 e P-20, sintetizados Invitrogen Brazil Ltda; d) Marcadores de tamanho molecular 1 kb Plus DNA Ladder e 100 pares de base (pb) DNA Ladder, fornecedor Invitrogen Brazil Ltda.

4.2 MTODOS GERAIS Mtodos gerais utilizados nos experimentos: a) as medidas de pH foram realizadas em aparelho Micronal, modelo B-374 (Departamento de Farmcia, UFPR); b) as medidas de massas foram realizadas em balana digital analtica GEHAKA modelo AG 200 (Departamento de Farmcia, UFPR); c) microscopia, em microscpio tico modelo Olympus CX 41 (Departamento de Farmcia, UFPR); d) as contagens de clulas foram feitas em cmara de Neubauer (CARVALHO, 1994). e) os procedimentos de semeaduras dos microrganismos, extrao de DNA e preparo das reaes de PCR e RAPD foram realizadas em fluxo laminar TROX do Brasil, modelo FLV classe I (Departamento de Farmcia, UFPR);


f) a

determinao

espectrofotomtrica

foi

efetuada

em

aparelho

espectrofotmetro UV/VIS Shimadzu modelo UV-1601PC (Departamento de Farmcia, UFPR); g) as centrifugaes foram realizadas em centrfuga Janetzk, modelo T-23 (Departamento de Farmcia, UFPR) e centrfuga Eppendorf, modelo 5410 (Departamento de Patologia Mdica, UFPR); h) as esterilizaes dos materiais foram feitas em autoclave Phoenix (Departamento de Farmcia, UFPR), a 1 atm de presso e a 121oC durante 20 minutos; i) as esterilizaes dos meios de cultivo, solues e tampes foram feitas em autoclave Fabbe, modelo 103 (Departamento de Farmcia, UFPR), durante 40 minutos sob vapor fluente; j) as incubaes foram feitas em estufa microbiolgica Fabbe, BOD Tecnal modelo TE-391 (Departamento de Farmcia, UFPR); k) incubao, em incubadora com agitao orbital Marconi, modelo MA-420 (Departamento de Farmcia, UFPR) a 30oC e 150 rotaes por minuto (rpm); l) As solues utilizadas nos ensaios de biologia molecular foram preparadas como descrito por SAMBROOK; FRITSCH; MANIATTIS (1989) e XUFRE, et. al., 2000. m) as reaes de PCR e RAPD foram realizadas em aparelho termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient (Departamento de Patologia Mdica, UFPR); n) as eletroforeses foram feitas em cubas Horizon 58 Life Technologies (Departamento de Patologia Mdica, UFPR); o) os produtos das reaes de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etdio, observado em transiluminador de luz ultravioleta Ultra-Lum, modelo EB-20E. Os gis foram fotografados com cmara digital Sony Cyber Shot P-100 (Departamento de Patologia Mdica, UFPR);


p) os cromatogramas de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) foram obtidos em aparelho Shimadzu modelo LC-10AVP, mdulo RID 10-A (Detector de ndice de Refrao), coluna Phenomenex Rezek ROA-Organic Acid OOH-0138-KO, tamanho 300 x 7.8mm (Departamento de Farmcia, UFPR).

4.3 MTODOS ANALTICOS 4.3.1 Carboidratos totais Os carboidratos totais foram determinados pelo mtodo Oficial de EynonLane, descrito na Portaria n. 076, de 27 de novembro de 1986 do Ministrio da Agricultura. 4.3.2 Mtodo turbidimtrico A avaliao da concentrao celular foi feita por turbidimetria, aps diluio adequada de uma alquota das suspenses de clulas, com gua destilada estril, de modo a obter a densidade tica (DO) no superior a 0,60 de absorbncia (onde h linearidade entre a densidade tica e a concentrao celular) a 650 nm (SLININGER et al., 1982).

4.4 COLETA DAS AMOSTRAS PARA ISOLAMENTO DAS LEVEDURAS Para o isolamento das leveduras vnicas os cachos de uvas foram coletados no ms de janeiro de 2003 em diferentes regies dos vinhedos, previamente demarcadas, localizados no municpio de Colombo e colocados em sacos plsticos esterilizados. Os sacos plsticos foram acondicionados em gelo e transportados at o laboratrio de Enzimologia e Tecnologia das Fermentaes.


Os sucos das uvas e as amostras provenientes de diferentes fases da fermentao foram coletados em frascos de vidro limpos e estreis, pelos produtores de vinho de cantinas localizadas no municpio de Colombo- Paran. As amostras de vinhos safra 2003 e as coletas realizadas pelos vinicultores foram transportadas em caixas de isopor e encaminhadas ao laboratrio de Enzimologia e Tecnologia das Fermentaes pela Secretaria da Agricultura, Abastecimento e Meio Ambiente do Municpio de Colombo.

4.5 MEIOS DE CULTURA 4.5.1 Meio YP (meio bsico) O meio de cultura bsico apresenta a seguinte composio: Extrato de levedura................................... 1,0 g Peptona..................................................... 1,0 g gua destilada........................................... qsp 100 ml O meio bsico de cultura foi utilizado nos experimentos com variveis na fonte de carbono e concentrao: glicose 2 g% (p/v), sacarose 2 g% (p/v), galactose 2 g% (p/v), maltose 2 g% (p/v), rafinose 2 g% (p/v), manitol 2 g% (p/v), lactose 2 g% (p/v), celobiose 2 g% (p/v), xilose 2 g% (p/v), glicose 20 g% (p/v), sacarose 20 g% (p/v) sem e com adio de 8% (v/v) de etanol. A este meio com 2 g% (p/v) de glicose, tambm foram adicionados antibiticos e soluo aquosa de cido tartrico 10 g% (p/v) estril para os experimentos de isolamento das leveduras. Nos experimentos onde foram usados os antibiticos (eritromicina e cloranfenicol) e o etanol, os mesmos no sofreram nenhum processo de esterilizao e foram adicionados no momento do plaqueamento.


4.5.2 Meio YNB (Yeast Nitrogen Base DIFCO) O meio Yeast Nitrogen Base (DIFCO Laboratories) foi preparado conforme indicado pelo fabricante. As fontes de carbono utilizadas foram: glicose, sacarose, galactose, maltose, rafinose, manitol, lactose, celobiose e xilose. 4.5.3 Meio YCB (Yeast Carbon Base DIFCO) O meio Yeast Carbon Base (DIFCO Laboratories) foi preparado conforme indicado pelo fabricante. As fontes de nitrognio utilizadas foram: nitrato de potssio, nitrito de sdio e lisina. 4.5.4 Meio Agar LA (ONO, et.al., 1991) O meio Agar LA composto por: Glicose..................................................... 4g Extrato de levedura................................... 0,5 g Peptona..................................................... 0,3 g Sulfato de amnio..................................... 0,02 g Acetato de chumbo neutro........................ 0,1 g Agar 2,0 g gua destilada........................................... qsp 100 ml Os meios descritos nos itens 4.5.1 a 4.5.4 foram preparados separando-se a fonte de nitrognio da fonte de carbono. Para isso, a fonte de nitrognio foi dissolvida em erlenmeyer contendo uma poro da gua destilada a ser empregada no meio. A fonte de carbono utilizada foi dissolvida em outro erlenmeyer contendo o restante da gua destilada e a este frasco quando necessrio foram acrescidos 2 g% de gar para tornar o meio slido. Os frascos foram esterilizados em autoclave sob vapor fluente durante 40 minutos e em seguida e assepticamente procedeu-se


mistura e posterior distribuio em placas estreis, tubos ou erlenmeyers dependendo do experimento. Quando necessrio o pH do meio de cultura foi corrigido para 5,5, com soluo de hidrxido de sdio 2 M.

4.6 ISOLAMENTO DAS LEVEDURAS Os gros de uva, com auxlio de uma pina foram colocados em contato, em forma de zigue-zague, com o meio slido YP suplementado com 2 g% (p/v) de glicose (YPG 2%) contido em placas de Petri. Em seguida as placas foram colocadas em estufa a 30 C durante 72 horas. Para a obteno das leveduras provenientes do suco das uvas e das amostras coletadas em diferentes fases da fermentao vnica, estas amostras foram semeadas em placa de Petri contendo meio slido YPG 2% de maneira que 1 ml de cada amostra foi assepticamente colocado no centro da placa e espalhado com auxlio de ala de Drigalski (espalhadores). As placas foram deixadas em estufa a 30 C durante 72 horas. Em seguida, em virtude de que no foram obtidas colnias isoladas, foram realizadas diluies em srie destas amostras (10-1, 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5) e 1 ml de cada diluio foi assepticamente transferida para o centro da placa contendo meio slido YPG 2%, procedendo-se semeadura com os espalhadores. Para cada diluio foram empregadas trs placas de Petri contendo o meio YPG 2%. As colnias isoladas crescidas, com caractersticas macroscpicas e microscpicas de levedura foram semeadas, com auxlio de uma ala estril, por esgotamento em placas de Petri contendo meio slido YPG 2% adicionado do antibitico eritromicina na concentrao de 30 g/ml de meio. As placas foram colocadas em estufa a 30 C durante 72 horas. Visando a obteno de leveduras puras, as colnias isoladas crescidas aps observao em microscpio, utilizando tcnica a fresco, foram semeadas em placas de Petri contendo o meio slido YPG 2% adicionado de 0,6% (v/v) de uma soluo


aquosa de cido tartrico 10% (p/v). As placas foram colocadas em estufa a 30 C durante 72 horas. As colnias de leveduras isoladas crescidas foram observadas em microscpio tico e ento semeadas em placas de Petri contendo meio slido YPG 2% adicionado de cloranfenicol a uma concentrao de 30 g/ml de meio. As placas foram deixadas em estufa a 30 C durante 72 horas. As colnias puras obtidas, ou seja, isentas de qualquer contaminao, com caractersticas morfolgicas de Saccharomyces cerevisiae, foram identificadas utilizando nmeros cardinais e transferidas para tubos de ensaio contendo meio slido inclinado YPG 2% e colocadas em estufa a 30 C durante 24 horas. Para o isolamento, em cada meio de cultura utilizado os microrganismos foram semeados cinco vezes.

4.7 CONSERVAO DAS LEVEDURAS Uma colnia representativa de cada levedura pura isolada e a levedura comercial CK UVAFERM (Saccharomyces cerevisiae, variedade cerevisiae), utilizada nos experimentos como controle, foram semeadas em tubo de ensaio contendo meio slido inclinado YPG 2% e aps crescimento foram mantidas a 4 C, fazendo-se transferncias bimestrais.

4.8 PREPARO DO INCULO As leveduras isoladas e a levedura comercial CK foram semeadas em tubo de ensaio contendo o meio slido inclinado YPG 2%, colocadas em estufa a 30 C, durante 12 horas. Aps o perodo de crescimento, em balo volumtrico de 10 ml de capacidade, previamente esterilizado, foi preparado uma suspenso de clulas de cada levedura com gua destilada estril, e realizada a leitura da turbidez a fim de se avaliar a concentrao celular. Em seguida, uma alquota de 200 l destas suspenses, com densidade tica em torno de 0,100 de absorbncia a 650 nm, foi


semeada em placas de Petri contendo o meio a ser empregado nos testes de excluso por estresse, assimilao de fonte de carbono e fonte de nitrognio, testes de tolerncia temperatura e testes de produo de sulfeto de hidrognio. Para os experimentos de capacidade fermentativa, capacidade de floculao e tolerncia ao etanol o volume de suspenso de clulas de cada levedura inoculado nos 10 ml de meio lquido, contidos em tubos de ensaio, foi aquele que forneceu uma densidade tica (DO) entre 0,01 e 0,02 de absorbncia a 650 nm, nos mililitros de meio empregado. Foi verificada a pureza das suspenses de clulas utilizando colorao de Gram e anlise do material a fresco (BIER, 1980).

4.9 TESTE DE EXCLUSO POR ESTRESSE A cada condio de estresse empregada, o volume de inculo das leveduras isoladas e da levedura controle CK semeado nas placas de Petri contendo os meios de cultura foi preparado como descrito no item (4.8). Para verificar o efeito de cada condio de estresse no crescimento dos microrganismos, as leveduras isoladas e a levedura CK foram semeadas no meio slido YPG 2% e colocadas em estufa a 30 C durante 72 horas como controle. Primeiramente as leveduras foram crescidas em meio slido YPG 2% a 37 C durante 72 horas. As leveduras que cresceram nesta temperatura foram transferidas para o meio slido YPG 2% contendo 8% (v/v) de etanol e colocadas em estufa a 30 C durante 72 horas. As leveduras crescidas na presena de etanol foram semeadas em meio bsico slido contendo 20 g% (p/v) de glicose e colocadas em estufa a 30 C durante 72 horas. As leveduras resistentes a esta concentrao de fonte de carbono foram crescidas em meio bsico sli

isolamento, identificação e seleção de cepas de levedura sac

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